ES2595500T3 - Nuevas proteasas que pueden hidrolizar péptidos y proteínas de gluten a un pH ácido, procedentes del actinomiceto Actinoallomurus - Google Patents

Abstract

Composición enzimática que comprende por lo menos una endopeptidasa de la familia S8/S53 activa a un pH de entre 3 y 8 seleccionada de entre el grupo que consiste en: a) endopep-140 que comprende SEC ID nº 1, un fragmento biológicamente activo de la misma, una variante alélica natural de la misma, o una secuencia que presenta por lo menos 70%, 80%, 90% o 95% de identidad, b) endopep-40 que comprende SEC ID nº 2, un fragmento biológicamente activo de la misma, una variante alélica natural de la misma, o una secuencia que presenta por lo menos 70%, 80%, 90% o 10 95% de identidad, c) endopep-120 que comprende SEC ID nº 3, un fragmento biológicamente activo de la misma, una variante alélica natural de la misma, o una secuencia que presenta por lo menos 70%, 80%, 90% o 95% de identidad, d) endopep-60 que comprende SEC ID nº 4, un fragmento biológicamente activo de la misma, una variante alélica natural de la misma, o una secuencia que presenta por lo menos 70%, 80%, 90% o 95% de identidad, e) endopep-41 que comprende SEC ID nº 5, un fragmento biológicamente activo de la misma, una variante alélica natural de la misma, o una secuencia que presenta por lo menos 70%, 80%, 90% o 95% de identidad.

Description

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Las secuencias caracterizadas por identidades al nivel de nucleótido se indican en la presente memoria también como "secuencias de ácidos nucleicos homólogas" o variaciones de la misma. Las secuencias de nucleótidos homólogas codifican aquellas secuencias codificantes de isoformas de proteasas de la invención. Las isoformas pueden expresarse en el mismo organismo como resultado de, por ejemplo, el procesamiento alternativo del ARN. Alternativamente, las isoformas pueden estar codificadas por genes diferentes.

Entre las secuencias de nucleótidos homólogas se incluyen además, aunque sin limitación, variaciones alélicas naturales y mutaciones de las secuencias de nucleótidos indicadas en la presente memoria. Entre las secuencias de ácidos nucleicos homólogas se incluyen aquellas secuencias de ácidos nucleicos que codifican las sustituciones de aminoácidos conservadoras en SEC ID nº 1, 2, 3, 4 o 5.

En la invención, entre las secuencias de nucleótidos homólogas pueden incluirse secuencias de nucleótidos codificantes de una proteasa de la invención de otras especies pertenecientes a Actinoallomurus, así como de otros géneros diferentes de Actinoallomurus, tales como, por ejemplo, Catenulispora, Actinospica, Ktedonobacter, Streptomyces, Streptacidiphilus, Micromonospora y Rugosimonospora.

Los solicitantes determinaron mediante análisis de BLAST que los genomas de Catenulispora, Ktedonobacter y Streptomyces contienen genes que codifican proteínas que presentan una homología superior a 50% respecto a la proteasa correspondiente de la invención; por ejemplo, las proteínas putativas con números de acceso ACU72534 y ACU72320 de Catenulispora acidiphila presentan identidades=261/400 (65%), positivos=295/400 (74%) con endopep-40 SEC ID nº 2 e identidades=705/1.342 (53%), positivos=878/1342 (65%) con endopep-140 SEC ID nº 1, respectivamente, o la proteína putativa con número de acceso EFH81837 de Ktedonobacter racemifer presenta identidades=244/402 (61%), positivos=299/402 (74%) con endopep-40 SEC ID nº 2 o la secuencia de la proteína e14 de Streptomyces sp. con número de acceso EFF91270 también presenta identidades=230/371 (62%), positivos=274/371 (74%) con endopep-40 SEC ID nº 2. Los genes codificantes de endopeptidasa homólogos pueden encontrarse presentes en cepas pertenecientes a géneros filogenéticamente relacionados con los anteriormente indicados, las secuencias genómicas de los cuales, no se encuentran disponibles en bases de datos públicas.

Un "fragmento biológicamente activo" de la endoproteasa de la invención puede prepararse mediante aislamiento de un fragmento de ácidos nucleicos de SEC ID nº 7, 8, 9, 10 o 11 que codifica una endoproteasa con la misma actividad biológica que las endoproteasas de la invención, que expresa la parte codificada de endoproteasa (por ejemplo, mediante expresión recombinante in vitro) y evaluación de la actividad del fragmento codificado de endoproteasa. La invención comprende además moléculas de ácidos nucleicos que difieren de las secuencias de ácidos nucleicos mostradas en SEC ID nº 7, 8, 9, 10 o 11 debido a la degeneración del código genético y, de esta manera, codifican las mismas proteasas que se encuentran codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos mostradas en SEC ID nº 7, 8, 9, 10 o 11.

Las técnicas de manipulación génica y de expresión de proteínas son conocidas por el experto en la materia y también pueden encontrarse en Kriegler M., "Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual", Stockton Press, NY, 1990.

Los solicitantes indican con la expresión "actividad biológica" o "actividad funcional", la función natural o normal de las proteasas de la invención, por ejemplo la capacidad de degradar otras proteínas. Los residuos aminoácidos que se encuentran conservados entre las proteasas de la invención se predice que resultarán particularmente difíciles de alterar. Los aminoácidos para los que pueden realizarse sustituciones conservadoras son bien conocidas de la técnica. Tal como reconoce el experto en la materia, cada codón en un ácido nucleico (aparte de AUG, que habitualmente es el único codón para la metionina) puede modificarse y rendir una molécula funcionalmente idéntica mediante técnicas estándares. Además, las sustituciones, deleciones o adiciones individuales que alteran, añadir o delecionan un único aminoácido o un porcentaje reducido de aminoácidos (típicamente menos de 5%, más típicamente menos de 1%) en una secuencia codificada son "mutaciones conservadoras", en el que las alteraciones resultan en la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar.

Otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos codificantes de las proteasas de la invención que contienen cambios en residuos aminoácidos que no resultan esenciales para la actividad. Dichas proteasas de la invención difieren en secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1, 2, 3, 4 o 5, aunque conservan actividad biológica. En una forma de realización, la molécula de ácidos nucleicos aislada comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteasa, en la que la proteasa comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de por lo menos aproximadamente 50% respecto a las secuencias de aminoácidos de SEC ID nº 1, 2, 3, 4 o 5.

La expresión "ácido nucleico aislado" o "secuencia polinucleotídica aislada", tal como se utiliza en la presente memoria, identifica una molécula de ácidos nucleicos que se separa de otras moléculas de ácidos nucleicos que se encuentran presentes en la célula a partir de la cual se obtiene el ácido nucleico y se encuentra sustancialmente libre de otro material celular o material del medio de cultivo en el caso de que dicha molécula de ácidos nucleicos se obtenga de un microorganismo natural, un microorganismo derivado del mismo o de microorganismos obtenidas por medios recombinantes.

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Una molécula de ácidos nucleicos aislada codificante de una endoproteasa de la invención homóloga respecto a la proteína de SEC ID nº 1, 2, 3, 4 o 5 puede crearse mediante la introducción de una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID nº 7, 8, 9, 10 o 11, de manera que se introducen una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en la proteasa codificada. Pueden introducirse mutaciones en SEC ID nº 7, 8, 9, 10 o 11, mediante técnicas estándares, tales como la mutagénesis dirigida a sitio, la mutagénesis mediada por PCR y la transposición del ADN. Alternativamente, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de la totalidad o una parte de una secuencia codificante de la proteasa de la invención, tal como mediante mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes pueden cribarse para actividad biológica de la proteasa de la invención con el fin de identificar los mutantes que conservan actividad.

La composición de enzima glutenasa según la presente invención también puede utilizarse en forma inmovilizada y utilizarse, por ejemplo, para el tratamiento de productos alimentarios líquidos. La composición enzimática de la invención también puede utilizarse en la industria de las frutas y cervecera para la limpieza y mantenimiento de equipos. Por ejemplo, un producto alimentario líquido que contiene gluten se deja que fluya a lo largo de una matriz permeable para el gluten en el que se incluye la composición enzimática de la invención. Se extra el gluten del producto alimentario y se digiere mediante la acción de los enzimas. La composición enzimática de la invención también puede contribuir a la energía disponible del alimento. Por ejemplo, una proteína que comprende prolina parcial o totalmente digerible se degrada total o parcialmente con la composición enzimática de la invención, resultando en la disponibilidad de más alimento digerible para el ser humano o animal. Por lo tanto, se mejora la tasa de crecimiento y/o la tasa de conversión de alimento (es decir, el peso de alimento ingerido respecto a la ganancia de peso) del ser humano o animal.

Métodos de producción de las endopeptidasas y caracterización de las mismas

La presente invención se refiere además a métodos para producir los enzimas de la presente invención que comprenden cultivar (a) una cepa, que se encuentra en su forma de tipo salvaje, o (b) una forma derivada de la misma mediante técnicas comunes de mutación, por ejemplo mediante tratamiento con agentes mutagénicos o con radiaciones ionizantes, o (c) una célula hospedadora que es capaz de producir el polipéptido de la invención y recuperar dicho polipéptido a partir del lote de cultivo. En los métodos de producción de la presente invención, los medios de cultivo celular se seleccionan diferentemente entre los conocidos de la técnica de producción de proteínas según el cultivo de cepas de tipo salvaje, cepas derivadas de las mismas, o células huésped recombinantes. El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos de la técnica. Los medios adecuados se encuentran disponibles de proveedores comerciales o pueden prepararse según composiciones publicadas (por ejemplo en catálogos de la American Type Culture Collection). Por ejemplo, un medio que contiene soja es más adecuado para permitir la producción de enzimas de la invención por microorganismos de tipo salvaje.

Las células pueden cultivarse mediante cultivo en matraz de agitación, fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, por lotes, por lotes alimentados o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizada en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan que el polipéptido se exprese y/o se aísle. En el caso de que el polipéptido se secrete al medio nutritivo, el polipéptido puede recuperarse directamente del medio. En el caso de que no se secrete el polipéptido, puede recuperarse a partir de lisados celulares. Se producen varias actividades proteolíticas y el cultivo se suspende al alcanzar un máximo la producción de endopeptidasa. Tras completar el cultivo, se separa el medio de cultivo mediante filtración para separar los cuerpos microbianos, y el filtrado se procesa de la manera habitual para la recolección de endopeptidasa mediante varios procedimientos en combinación, tales como la ultrafiltración, la concentración bajo presión reducida, la precipitación en solución hipersalina ("salting out"), la precipitación con solvente orgánico, la diálisis, la filtración en gel, la cromatografía de adsorción, la cromatografía de intercambio iónico, el electroenfoque y la liofilización. Los procedimientos adecuados deberían seleccionarse considerando las propiedades físicas y químicas deseadas de las endopeptidasas.

Un ejemplo representativo de producción de endopeptidasas de la presente invención mediante el cultivo de una cepa de Actinoallomurus de tipo salvaje se proporciona en el Ejemplo 1, posteriormente en la presente memoria. La endopeptidasa o endopeptidasas de la invención pueden purificarse en el grado deseado de pureza que puede depender del uso pretendido y de la actividad específica de la endopeptidasa o endopeptidasas.

Expresión heteróloga en células hospedadoras

Pueden utilizarse células recombinantes y microorganismos para producir las endopeptidasas de la presente invención. La célula hospedadora puede ser cualquiera de las células huésped que resultarán familiares para el experto en la materia, incluyendo células procarióticas, células eucarióticas, células de mamífero, células de insecto, células fúngicas, células de levadura y/o células vegetales. La selección de un huésped apropiado se encuentra comprendido dentro de los conocimientos del experto en la materia.

Los microorganismos útiles son células bacterianas ,tales como las bacterias Gram-positivas, incluyendo, aunque sin limitación, una célula de Bacillus (por ejemplo Bacillus subtilis y Bacillus cereus) o una célula de Streptomyces,o

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un síndrome asociad a una enfermedad humana, seleccionando dicha enfermedad de entre el grupo que comprende la enfermedad celíaca, la dermatitis herpetiforme, la mala absorción en el tracto digestivo, reacciones alérgicas, deficiencias enzimáticas, infecciones fúngicas, la enfermedad de Crohn, micosis y el esprúe.

A título de ejemplo, el complemento alimenticio de la invención puede ser un producto recubierto o no con un enzima granulado que puede mezclarse fácilmente con componentes alimentarios, alternativamente, algunos complementos alimentarios de la invención pueden formar un componente de una premezcla. Alternativamente, los complementos alimentarios de la invención puede ser un líquido estabilizado, o una suspensión acuosa o de base aceitosa. La composición enzimática de la invención puede suministrarse mediante la expresión de los enzimas directamente en cultivos de alimentos transgénicos (tal como, por ejemplo, plantas transgénicas, semillas y similares), tales como granos, cereales, maíz, soja, semillas de colza y altramuz.

La composición farmacéutica o el complemento alimenticio de la invención puede proporcionarse antes de las comidas, inmediatamente antes de las comidas, con las comidas o inmediatamente después de las comidas, de manera que las endoproteasas de la composición enzimática de la presente invención sean liberadas o activadas en la luz gastrointestinal superior, en donde las endoproteasas pueden complementar los enzimas gástricos y pancreáticos para destoxificar el gluten ingerido y evitar que los péptidos dañinos pasen a la capa de enterocitos.

La composición enzimática de la presente invención presenta numerosas aplicaciones en la industria del procesamiento alimentario, en particular pueden utilizarse en la preparación de complementos alimentarios tal como se ha indicado en los documentos de la técnica anterior indicados anteriormente.

A partir de la presente descripción resulta evidente que un objetivo adicional de la presente invención consiste en proporcionar un método para degradar oligopéptidos del gluten que son resistentes al corte por enzimas gástricos y pancreáticos y cuya presente en la luz interna resulta en efectos tóxicos, que comprende poner en contacto dichos oligopéptidos del gluten con una composición enzimática o por lo menos una endopeptidasa aislada de la presente invención.

En particular, un aspecto de dicho método consiste en el tratamiento o la prevención de la enfermedad celiaca, la dermatitis herpetiforme y/o cualquier otro trastorno asociado a la intolerancia del gluten, que comprende administrar en el paciente que lo necesita, una cantidad eficaz de una composición enzimática o por lo menos una endopeptidasa aislada de la presente invención, preferentemente incorporada en una formulación farmacéutica, complemento alimenticio o bebida.

Ejemplos

Ejemplo 1: identificación y caracterización de endopeptidasas de Actinoallomurus sp. DSM 24988

1.1 Cultivo de la cepa y producción de proteínas

La cepa de Actinoallomurus utilizada según la presente invención derivada de la colección de cepas de los solicitantes.

Se mantuvo Actinoallomurus sp. DSM 24988 en medio agar ISP2 (Shirling y Gottlieb, 1966) acidificado a pH 5,5 con HCl. El contenido microbiano de una placa se raspó y se inoculó en un matraz Erlenmeyer de 50 ml que contenía 15 ml de medio AF5 que está compuesto de: (g/l) dextrosa 20, extracto de levadura 2, harina de soja 8, NaCl 1 y MES

10. El medio se preparó en agua destilada y se ajustó el pH a 5,5 antes de esterilizar a 121ºC durante 20 min. El matraz inoculado se cultivó a 28ºC, en un matraz rotatorio funcionando a 200 rpm. Tras 5 a 6 días de incubación, se inoculó 5% del cultivo en una segunda serie de matraces Erlenmeyer de 500 ml que contenían 100 ml del mismo medio de fermentación. Se llevó a cabo la producción de proteínas en matraces incubados durante 15 días a 28ºC en un agitador rotatorio funcionando a 200 rpm. Se realizó un seguimiento de la producción de la proteína mediante bioensayo tal como se indica posteriormente.

Se produjeron varias actividades proteolíticas y se suspendió el cultivo al alcanzar un máximo la producción de endopeptidasas, seguido de los ensayos indicados posteriormente. La fermentación se recolectó tras 15 días y se centrifugó el caldo a 4.000 rpm durante 15 minutos. Se separó el medio de cultivo mediante filtración para separar los cuerpos microbianos y se procesó el filtrado. Se seleccionaron procedimientos adecuados considerando las propiedades físicas y químicas deseadas de las endopeptidasas.

1.2 Determinación de las actividades proteolíticas

Se midieron las actividades enzimáticas a diferentes pH en tampón de acetato (acetato amónico-AMC, concentración final de 50 mM, pH 4,0 a 8,0; ácido acético 20 mM, pH 3,0) a 37ºC en un volumen total de 0,2 ml.

Se determinó la actividad enzimática de endopeptidasa mediante la medición de la hidrólisis de Succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC (Amino-Metil-Coumarina) como sustrato (Bachem AG, Hauptstrasse 144, 4416 Bubendorf, Suiza).

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Se llevaron a cabo los mismos análisis en todas las etapas de purificación posteriores hasta que sólo se detectase unas cuantas secuencias.

Los datos obtenidos mediante el análisis de EM de las fracciones activas sometidas a ebullición mostraron pocas secuencias de proteínas, aunque se encontraba presente una única banda en el gel de SDS-PAGE teñido con plata. Tal como se muestra en la Tabla 1, se detectó endopep-140 (SEC ID nº 1) y endopep-40 (SEC ID nº 2) como las proteínas responsables de las dos actividades indicadas. La presencia de endopep-140 en la muestra identificada como <100 kDa posiblemente se debe a la degradación parcial de la proteína en polipéptidos de menor tamaño.

El análisis in silico indicó que tanto endopep-140 como endopep-40 eran proteínas glucosiladas que contenían un péptido de señal que conducía a la secreción, sugiriendo que pueden producirse en forma de preproenzimas.

El análisis in silico agrupó la totalidad de las cinco endopeps en la familia de S8/S53 e indicó que todas eran proteínas glucosiladas. Se encontró una homología elevada entre endopep-140, endopep-40 y endopep-41 (SEC ID nº 5), permitiendo su agrupamiento en un subgrupo tal como se muestra con el árbol filogenético de la figura 1. Se detectó una secuencia de péptido de señal también para endopep-60 (SEC ID nº 4), mientras que se encontraba ausente en endopep-120 (SEC ID nº 3) y endopep-41.

El árbol filogenético mostrado en la figura 1 subraya la novedad de estas glutenasas S8/S53, que no se agrupan con el enzima cumamolisina ni con sedolisina ni con tripeptidil-peptidasa (sedA a sedD) dados a conocer en el documento nº WO2011/077359, que pertenecen a la familia de S53.

La novedad de dichos enzimas recibe respaldo adicional de la especificidad de sustrato, tal como se muestra en el Ejemplo 3. El patrón de degradación del 33-mero obtenido mediante digestión con endopep-140 o endopep-40 mostraba una actividad endoproteolítica.

Ejemplo 2: producción de endopeptidasa en células huésped recombinantes

2.1 Cepas y plásmidos

En el presente estudio se estudió Actinoallomus sp. DSM 24988. Todos los experimentos de subclonación de plásmidos se llevaron a cabo en E. coli DH10B (Invitrogen, Carlsbad, CA) utilizando el plásmido pTZ57R/T (Fermentas, UAB, Lituania).

Se utilizó Escherichia coli BL21 (DE3) Star (Novagen Italia, Podenzano, PC) para producir peptidasas heterólogas (recombinantes).

2.2 Producción de proteasas recombinantes

Se produjeron proteasas de Actinoallomurus recombinantes y se purificaron a partir de Escherichia coli BL21 (DE3) Star como el sistema de expresión.

Para construir cepas de E. coli que producían secuencias de nucleótidos de los genes de Endopep-140 y Endopep40 se amplificaron utilizando los juegos de cebadores siguientes:

Fendopep-140

5'-AAAAAGCTTCAGCTACAGGTGTGGTCGG-3' SEC ID nº 12

Rendopep-140

5'-AAAAAAACATATGCCCGATCTTCCCACCC-3' SEC ID nº 13

Fendopep-40

5'-AAAAAGCTTCAGAAGGCTCCGGTGCC-3' SEC ID n º 14

Rendopep-40

5'-AAAAAAACATATGTCACGACGCGTGACCG-3' SEC ID nº 15

Se clonaron los productos de PCR en el vector pTZ57R/T y se secuenciaron antes de la clonación en el vector de expresión con el fin de verificar que no se había introducido ninguna mutación durante las amplificaciones por PCR.

A continuación, se clonaron los genes de endopep en los sitios NdeI-HindIII del plásmido pET28b (Novagen) y se transformaron en el huésped de expresión BL21(DE3) Star.

Las células transformadas se cultivaron en cultivos de 50 ml de medio LB que contenía 30 µg/ml de canamicina a 37ºC hasta alcanzar una DO600 de entre 0,6 y 1. Se indujo la expresión de las glutenasas con la adición de isopropil-β-D-tiogalactósido 0,2 µM (Sigma) y los cultivos se incubaron adicionalmente a 22ºC durante la noche. Tal como se muestra en al figura 4, se obtuvieron bandas de proteínas correspondientes al peso molecular deseado de endopep-140 y endopep-40.

2.3 Purificación de una o más endopeptidasas producidas heterólogamente

Las células que expresaban las endopeptidasas recombinantes se centrifugaron a 5.000 g durante 20 minutos. El

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Ejemplo 4: actividad biológica de la endopeptidasa

4.1 Degradación de la glidiana y mezcla hidrolizada de gluten

5 Debido a sus características estructurales específicas, las prolil oligopeptidasas no pueden digerir los péptidos grandes, habitualmente de más de 30 aminoácidos. Además, la tripeptidil-proteasa sedolisina no puede hidrolizar la gliadina sin adición de prolil proteasa. Dicha limitación es una desventaja evidente para un enzima, que se pretende que hidrolice tan rápida y eficientemente como resulte posible todos los potenciales péptidos ricos en prolina tóxicos.

10 La endopep-140 y la endopep-40 de Actinoallomurus se incubaron con gliadinas para comprobar si las endoproteasas de Actinoallomurus eran capaces de digerir las proteínas completas. Los productos de hidrólisis formados se analizaron mediante SDS-PAGE.

Se preparó una solución de gliadina mediante disolución de gliadina en polvo (Sigma G3375) en etanol al 70% a

15 70ºC a una concentración de 10 mg/ml (20 µM). Las moléculas de gliadina intactas consisten de una mezcla de proteínas de 40 a 55 kDa. Se incubó gliadina a 37ºC con 10 µl (5 µU) de las endoproteasas de Actinoallomurus en ácido acético 20 mM, pH 3, en un volumen final de 0,3 ml. Las reacciones se llevaron a cabo en un Thermomixer (Eppendorf AG, Hamburg, Alemania) tanto en ausencia como en presencia de pepsina a una concentración de 1 mg/ml (figura 8). Se realizó un seguimiento de las reacciones en diferentes intervalos de tiempo; se extrajeron

20 muestras sde 30 µl de la mezcla de incubación en los tiempos 0 min., 30 min., 1 y 2 h y se mantuvieron a 4ºC hasta la SDS-PAGE. Todos los materiales utilizados para la SDS-PAGE y la tinción se obtuvieron de Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Se prepararon muestras utilizando tampón para muestras siguiendo las instrucciones del fabricante y se separaron en geles Bis-Tris para cualquier kd utilizando el sistema tampón SDS siguiendo las instrucciones del fabricante. La tinción se llevó a cabo utilizando Coomassie R250 o plata.

25 Tal como puede observarse en la figura 8, la gliadina es cortada por las endopeptidasas derivadas de Actinoallomurus en péptidos pequeños hasta una digestión prácticamente completa en 2 horas. La degradación del producto puede observarse como una reducción de la intensidad de la banda en el gel de SDS. El presente experimento también muestra que la pepsina no afecta a la eficacia de la digestión.

30 Tabla 1. Proteínas putativas purificadas a partir del secretoma de Actinoallomurus.

Se filtraron fracciones purificadas de Actinoallomurus en un filtro de 100 kDa de corte de peso molecular y se sometieron a análisis de EM con inyección directa. Los péptidos identificados se alinearon frente a proteínas

35 inferidas mediante traducción del genoma de Actinoallomurus (Id_proteína: código interno para la secuencia putativa de proteína) y el posterior análisis in silico mediante BLAST puso de manifiesto las proteínas conocidas homólogas (número de acceso de BLAST: código de secuencia; nota en BLAST: nombre de proteína; n.r.: ningún resultado). Los números de los espectros concordantes proporcionan una medida semicuantitativa de las cantidades de proteína, indicadas como frecuencia (F_media).

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A: datos obtenidos de la fracción >100 kDa; B: datos obtenidos de la fracción <100 kDa.

A

Id_proteína

Número de acceso de BLAST Nota de BLAST F_media Notas

Seq_48773

YP_003835151.1 Peptidasa S8/S53 101,9 Endopep-140

Seq_100531

dbjlBAJ32040.1 Lipasa putativa 20,2

Seq_293141

n.r. n.r. 10,14

B

Id_proteína

Número de acceso de BLAST Nota de BLAST F_media Notas

Seq_44766

ZP_06921971.1 Proteína secretada 40,14

Seq_72108

YP_003114375.1 Peptidasa S8/S53 30,25 Endopep-40

Seq_48773

YP_003835151.1 Peptidasa S8/S53 20,15 Endopep-140

Seq_293141

n.r. n.r. 10,15

45 Tabla 2. Péptidos liberados por la digestión de 33-mero con endopep-140.

Todos los pesos moleculares detectados mediante HPLC-EM tras la digestión del péptido gliadina 33-mero (50 µM) con endopep-140 4 µU en presencia y en ausencia de pepsina (1 mg/ml). El control se obtuvo mediante incubación del 33-mero con pepsina sola. Incubación a 37ºC, ácido acétido 20 mM, pH 3.

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Tiempo de incubación

Señal másica Estado de carga Secuencia peptídica deducida Notas

To

1306,27; 1956,64 3 [M-3H]+ ; 2 [M-2H]+ 1-33 100% residual

T30

1088,73 1 [MH]+ 25-33

1197,45

1 [MH]+ 1-10

748,45

1 [MH]+ 1-6; 8-13; 15-20; 22-27

1306,27; 1956,64

3 [M-3H]+ ; 2 [M-2H]+ 1-33 50% residual

T30 + pepsina

1088,73 1 [MH]+ 25-33

1197,45

1 [MH]+ 1-10

748,45

1 [MH]+ 1-6; 8-13; 15-20; 22-27

1306,27; 1956,64

3 [M-3H]+ ; 2 [M-2H]+ 1-33 70% residual

T2h

1088,73 1 [MH]+ 25-33

1197,45

1 [MH]+ 1-10

748,45

1 [MH]+ 1-6; 8-13; 15-20; 22-27 Pico más intenso

1068,24

1 [MH]+ 16-24

845,27

1 [MH]+ 1-7 trazas

1306,27; 1956,64

3 [M-3H]+ ; 2 [M-2H]+ 1-33 20% residual

1088,8

1 [MH]+ 25-33

1197,45

1 [MH]+ 1-10

748.45

1 [MH]+ 1-6; 8-13; 15-20; 22-27

T2h + pepsin

1068.24 1 [MH]+ 16-24

845.27

1 [MH]+ 1-7

1306.27; 1956,64

3 [M-3H]+ ; 2 [M-2H]+ 1-33 45% residual

Control T2h

1306.27; 1956,64 3 [M-3H]+ ; 2 [M-2H]+ 1-33 95% residual

Tabla 3. Péptidos liberados por la digestión del 33-mero con endopep-40.

5 Todos los pesos moleculares detectados mediante HPLC-EM tras la digestión del péptido gliadina 33-mero (50 µM) con endopep-40 2 µU en presencia y en ausencia de pepsina (1 mg/ml) en diferentes intervalos de tiempo. Se obtuvo el control mediante incubación del 33-mero con pepsina sola. Incubación a 37ºC, ácido acético 20 mM, pH 3.

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Tiempo de incubación

Señal másica Estado de carga Secuencia peptídica deducida Notas

T0

1306,27; 1956,64 3 [M-3H]+ ; 2 [M-2H]+ 1-33 100% residual

1197,45

1 [MH]+ 1-10

T30

1088,73 1 [MH]+ 25-33

748,45

1 [MH]+ 1-6; 8-13; 15-20; 22-27

1306,27;

3 [M-3H]+ ; 2 [M-2H]+ 1-33 50% residual

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2

   imagen3