JP2015500641A - アクチノミセス・アクチノアロムルス(ACTINOMYCETEACTINOALLOMURUS)由来の、酸性pHにてグルテンペプチドおよびタンパク質を加水分解できる新規プロテアーゼ - Google Patents
アクチノミセス・アクチノアロムルス(ACTINOMYCETEACTINOALLOMURUS)由来の、酸性pHにてグルテンペプチドおよびタンパク質を加水分解できる新規プロテアーゼ Download PDFInfo
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Abstract
Description
a)配列番号1、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%の同一性を有する配列を含むendopep−140、
b)配列番号2、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%の同一性を有する配列を含むendopep−40、
c)配列番号3、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%の同一性を有する配列を含むendopep−120、
d)配列番号4、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%の同一性を有する配列を含むendopep−60、
e)配列番号5、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%の同一性を有する配列を含むendopep−41
からなる群から選択される、3から8の間(含む)のpHにおいて活性な少なくとも1つのS8/S53エンドペプチダーゼを含む、酵素組成物を提供する。
A)上記に定義された少なくとも1つのS8/S53エンドペプチダーゼを産生できる天然に存在するアクチノアロムルス株を培養する工程および培養バッチからエンドペプチダーゼを回収する工程または
B)上記に定義されたエンドペプチダーゼの少なくとも1つを産生する能力を維持する、従来の変異および/もしくは選択技術により上記に定義した少なくとも1つのS8/S53エンドペプチダーゼを産生できる天然に存在するアクチノアロムルス株に由来するアクチノアロムルス株を培養する工程ならびに培養バッチからエンドペプチダーゼを回収する工程または
C)以下の工程を含む組換えDNA技術:
1)
a)配列番号1、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%の同一性を有する配列を含むendopep−140、
b)配列番号2、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%の同一性を有する配列を含むendopep−40、
c)配列番号3、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%の同一性を有する配列を含むendopep−120、
d)配列番号4、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%の同一性を有する配列を含むendopep−60ならびに
e)配列番号5、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%の同一性を有する配列を含むendopep−41
からなる群から選択されるS8/S53スブチリシン、ケキシン、セドリシンクラスの少なくとも1つのエンドペプチダーゼをコードする核酸を宿主細胞内に組み込む工程、
2)エンドペプチダーゼを産生するのに適した条件下で、培養培地中で工程1)の細胞を培養する工程および
3)培養バッチからエンドペプチダーゼを回収する工程
を含む、本発明の酵素組成物を産生する方法を提供している。
本発明はまた、(a)野生型形態である株または(b)一般的な変異技術により、例えば、変異誘発物質または電離放射線を用いた処理により、この株から誘導された形態または(c)本発明のポリペプチドを産生できる宿主細胞を培養する工程および培養バッチから前記ポリペプチドを回収する工程を含む、本発明の酵素を産生する方法に関する。本発明の産生方法において、細胞培養のための培地は、野生型株、この野生型株から誘導された株または組換え宿主細胞の培養に従うタンパク質産生のための当該技術分野において公知のものから異なって選択される。培養は、当該技術分野において公知の手順を使用して、炭素および窒素源ならびに無機塩を含む適切な栄養培地中で行われる。適切な培地は、(例えばアメリカンタイプカルチャーコレクションのカタログにおいて)商業的供給業者から入手可能であるまたは公開された組成に従って調製され得る。例えば、大豆を含有している培地は、野生型微生物により本発明の酵素の産生を可能にしやすい傾向がある。
組換え細胞および微生物は本発明のエンドペプチダーゼを産生するために使用され得る。宿主細胞は、原核細胞、真核細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、酵母細胞および/または植物細胞を含む、当業者によく知られている宿主細胞のいずれかであってもよい。適切な宿主の選択は当業者の能力の範囲内である。
本発明のエンドペプチダーゼ剤は単独で投与されてもよいまたは種々の製剤内に組み込まれて投与されてもよい。本発明の医薬組成物は、好ましくは経口投与である、その目的とする投与経路と適合するように製剤化される。例えば、本発明の酵素組成物のエンドペプチダーゼの一部は分泌されるので、アクチノアロムルスまたは限定されないが、バチルス細胞、ストレプトマイセス細胞、乳酸細菌細胞を含む、グラム陽性菌、E.コリなどのグラム陰性菌などの他の有用な単細胞組換え微生物の細胞培養培地から得られた粗調製物が経口投与されてもよい。乳酸細菌には、限定されないが、ラクトコッカス(Lactococcus)、ラクチノバチルス、ロイコノストック(Leuconostoc)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、ペディオコッカス(Pediococcus)およびエンテロコッカス(Enterococcus)の属種が含まれる。代替として、本発明の酵素組成物は精製後に経口投与されてもよい。
1.1 株培養およびタンパク質産生
本発明に従って使用されたアクチノアロムルス株は出願人の菌コレクションに由来する。
酵素活性を、0.2mlの全体積で37℃にて酢酸緩衝液(酢酸アンモニウム−AMAC、50mMの最終濃度、pH4.0−8.0;酢酸20mM、pH3.0)中で異なるpHにて測定した。
菌糸体をペーパー濾過(Calbiochem(USA)製のMiracloth)により培養培地から分離した。その後、200mlの上清を、残渣を除去するために5000rpmにて10分間遠心分離し、次いで上清を、不溶性画分を除去するために4℃にて20分間10000rpmにてさらに遠心分離した。タンパク質が、エタノール(1:4v/v)または硫酸アンモニウム20−75%飽和により上清(surnatant)から沈殿した。ペレットを再懸濁し、透析し、発生時に、5kDaのカットオフを用いてCentricon Plus−70(Millipore、Bedford、Mass.、USA)を使用して濃縮した。pH5にて試験した場合、スクシニル−Ala−Ala−Pro−Phe−AMCを加水分解できるプロテアーゼの存在が強調された。透析後のタンパク質懸濁液のアリコートを、MS−ショットガン分析に供するために煮沸した。煮沸手順は自己消化を回避するために必要である。S8/S53ファミリープロテアーゼに属している少なくとも5個のタンパク質が検出された。
今日、プロテオミクス方法は仮説指向バイオマーカーまたはタンパク質特徴付け研究にとって最重要である。
ペプチド予測アルゴリズム(Keller A.、Nesvizhskii A.I.、Kolker E.、Aebersold R.「Empirical statistical model to estimate the accuracy of peptide identifications made by MS/MS and database search」Anal.Chem.、2002年、15、5383−92頁)によって特定されるように、ペプチドが90.0%超の可能性で確立され得る場合、ペプチド同定が認められた。タンパク質が95.0%超の可能性で確立され、少なくとも1つの同定されたペプチドを含有し得る場合、タンパク質同定が認められた。50%以下の同一性がタンパク質公開データベースを用いて見られたので、アクチノアロムルスのゲノムが配列決定され、6個の可能なリーディングフレーム内に移された。アクチノアロムルス推定タンパク質に対して検出されたペプチドのBLASTによるその後のアラインメントは公知の相同タンパク質を同定した。
2.1 株およびプラスミド
アクチノアロムルス属種DSM24988をこの研究において使用した。全てのプラスミドのサブクローニング実験を、プラスミドpTZ57R/T(Fermentas、UAB、Lithuania)を使用してE.コリDH10B(Invitrogen、Carlsbad、CA)において実施した。
組換えアクチノアロムルスプロテアーゼを、発現系として使用したエシェリキア・コリBl21(DE3)Starから産生し、精製した。
組換えエンドペプチダーゼを発現している細胞を、20分間、5000gにて遠心分離した。ペレットを8mlの緩衝溶液(20mMのリン酸ナトリウム、500mMのNaCl、pH7.8)中に再懸濁し、次いでリゾチーム1mg/mlを加えて細胞を完全に溶解した。His標識タンパク質を、製造業者の指示書に従ってNi−NTA精製システム(Invitrogen)を使用して固定化Ni2+−アフィニティクロマトグラフィーにより粗細胞抽出物から精製した。溶出した画分の5マイクロリットルのアリコートをSDS−PAGEにより移動させ、ブルー−クマシーまたは銀染色で染色して発現したエンドペプチダーゼの存在および純度を検証した。図4は、誘導されていない対照株と比較して誘導後にendopep−140およびendopep−40について得られた発現レベルを示す。
3.1 酸性pHにおけるグリアジンの33量体毒性ペプチドの分解
グリアジン(50μM)の33量体免疫毒性ペプチドの溶液を、ペプシン1mg/mlの存在または非存在下で、4μUのendopep−140または2μUのendopep−40の存在下で最大2時間まで37℃にてインキュベートした。酢酸20mM、pH3、300μlの全体積中で反応を実施した。この反応を、37℃にて、0から120分の異なる時間(t0、t3、t15、t60およびt120分)にてモニターした。33量体ペプチドの消失および分解産物の出現をHPLC−MS分析によりモニターした。50μlのアリコートを得て、酵素活性を50μlのH2O:CH3CN 50:50(+0.1%ギ酸)で停止させた。試料をHPLC−MSにかけ、LTQ−XL質量分析計(Thermo Fisher Scientific、San Jose、California、USA)で分析した。endopep−140、endopep−140およびペプシン、ペプシン単独を用いて得られたHPLC−MSプロファイルを図5、6、7にそれぞれ報告している。33量体ペプチドの消失は2時間のインキュベーション後に証明された。4μUのendopep−140または2μUのendopep−40を用いて33量体ペプチドのインキュベーション後に検出された全てのペプチドを表2および3にそれぞれ報告している。
イオントラップ質量分析計を使用してHPLC分析を実施した。AccelaまたはSurveyorポンプ(Thermofisher Scientific、San Jose、CA、USA)に結合されたLTQ−XLまたはAdvantageを、酵素混合物により産生された酵素タンパク質加水分解物を特徴付けることに使用した。溶出のためにMilli Q水(Millipore、Bedford、Mass.、USA)中の0.1%のギ酸(溶液A)およびアセトニトリル中の0.1%のギ酸(溶液B)の勾配と組み合わせたThermofisher Scientific HypersilゴールドまたはC18対称カラム(Waters、Milford、Mass.、USA)を使用してペプチドを分離した。勾配は95%の溶液Aで開始して60%の溶液Bまで増加させた。個々のペプチドについての詳細な情報は、イオントラップ質量分析計についての特徴的アルゴリズムである、「スキャン依存」MS/MSアルゴリズムを使用することにより得た。完全スキャン質量範囲において最も強いイオンの荷電状態を決定するために完全スキャン分析に続いてズームスキャン分析を行った。33量体(M=3910)を使用して、MSモードにおいて最適感度に調整し、MS/MSモードにおいて最適断片化に調整し、60μg/mlの一定注入を実施し、MSモードにおいて主に二重および三重の荷電種を生じ、MS/MSモードにおいて約35%の最適な衝突エネルギーを生じた。
4.1 グリアジンおよびグルテン加水分解混合物の分解
特定の構造特徴に起因して、プロリルオリゴペプチドは、通常、30個のアミノ酸より長い大きなペプチドを消化できない。また、トリペプチジル−プロテアーゼセドリシンはプロリルプロテアーゼを添加せずにグリアジンを加水分解できない。この制限は、全ての可能性のある毒性のプロリンリッチペプチドを可能な限り迅速および効率的に加水分解することを意図する、酵素にとって明らかに不都合である。
組換えアクチノアロムルスプロテアーゼを、発現系として使用したエシェリキア・コリBL21(DE3)Starから産生し、精製した。
Claims (29)
- a)配列番号1、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%の同一性を有する配列を含むendopep−140、
b)配列番号2、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%の同一性を有する配列を含むendopep−40、
c)配列番号3、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%の同一性を有する配列を含むendopep−120、
d)配列番号4、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%の同一性を有する配列を含むendopep−60ならびに
e)配列番号5、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%の同一性を有する配列を含むendopep−41
からなる群から選択される、3から8の間のpHにおいて活性なS8/S53ファミリーの少なくとも1つのエンドペプチダーゼを含む酵素組成物。 - エンドペプチダーゼが、
a)配列番号1または少なくとも95%の同一性を有する配列を含むendopep−140、
b)配列番号2または少なくとも95%の同一性を有する配列を含むendopep−40、
c)配列番号3または少なくとも95%の同一性を有する配列を含むendopep−120、
d)配列番号4または少なくとも95%の同一性を有する配列を含むendopep−60、
e)配列番号5または少なくとも95%の同一性を有する配列を含むendopep−41
からなる群から選択される、請求項1に記載の酵素組成物。 - エンドペプチダーゼが、
a)配列番号1または少なくとも95%の同一性を有する配列を含むendopep−140、
b)配列番号2または少なくとも95%の同一性を有する配列を含むendopep−40
からなる群から選択される、請求項1または2に記載の酵素組成物。 - エンドペプチダーゼが、アクチノアロムルス(Actinoallomurus)株から得られる、請求項1から3のいずれか一項に記載の酵素組成物。
- エンドペプチダーゼが、アクチノアロムルス属種(Actinoallomurus sp.)DSM24988から得られる、請求項4に記載の酵素組成物。
- 胃および膵臓の酵素による切断に対して耐性があり、腸管腔内に存在することにより毒性作用を生じる、グルテンオリゴペプチドを加水分解できる、請求項1から5のいずれか一項に記載の酵素組成物。
- プロリル−エンドプロテアーゼ、x−プロリル−ジペプチジルアミノペプチダーゼおよびプロリル−アミノペプチダーゼから選択される1つ以上の他のタンパク質分解酵素を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の酵素組成物。
- エンドペプチダーゼが、別のポリペプチドに作動可能に融合されてキメラまたは標識(tapped)タンパク質を形成する、請求項1から7のいずれか一項に記載の酵素組成物。
- a)配列番号1または少なくとも95%の同一性を有する配列を含むendopep−140、
b)配列番号2または少なくとも95%の同一性を有する配列を含むendopep−40、
c)配列番号3または少なくとも95%の同一性を有する配列を含むendopep−120、
d)配列番号4または少なくとも95%の同一性を有する配列を含むendopep−60、
e)配列番号5または少なくとも95%の同一性を有する配列を含むendopep−41
から選択される、3から8の間のpHにおいて活性なS8/S53ファミリーの単離されたエンドペプチダーゼ。 - a)配列番号1または少なくとも95%の同一性を有する配列を含むendopep−140および
b)配列番号2または少なくとも95%の同一性を有する配列を含むendopep−40
から選択される、請求項9に記載のS8/S53ファミリーの単離されたエンドペプチダーゼ。 - セリアック病、疱疹状皮膚炎および/またはグルテン不耐性に関連する任意の他の障害を治療または予防するための医薬として使用するための請求項1から8のいずれか一項に記載の酵素組成物または請求項9もしくは10に記載のS8/S53ファミリーの単離されたエンドペプチダーゼ。
- 食品および飲み物に使用されるタンパク質加水分解物を産生するための請求項1から8のいずれか一項に記載の酵素組成物または請求項9もしくは10に記載のS8/S53ファミリーの少なくとも1つの単離されたエンドペプチダーゼの使用。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載の酵素組成物または請求項9もしくは10に記載のS8/S53ファミリーの少なくとも1つの単離されたエンドペプチダーゼを、活性タンパク質分解成分として含む、医薬製剤。
- 経口医薬製剤である、請求項13に記載の医薬製剤。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載の酵素組成物または請求項9もしくは10に記載のS8/S53ファミリーの少なくとも1つの単離されたエンドペプチダーゼを、活性タンパク質分解成分として含む、栄養補助食品。
- 配列番号7、8、9、10および11から選択される少なくとも1つのポリヌクレオチド配列または配列番号7、8、9、10および11のいずれか1つに対して少なくとも50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%の同一性を有する少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の少なくとも1つのエンドペプチダーゼをコードする単離された核酸。
- 配列番号7、8、9、10および11のいずれか1つに対して少なくとも95%の同一性を有する、少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を含む、請求項16に記載の単離された核酸。
- 配列番号7および8から選択される少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を含む、請求項16または17に記載の単離された核酸。
- A)酵素組成物を産生するのに適した条件下で培養培地中に、請求項1に定義されたS8/S53ファミリーの少なくとも1つのエンドペプチダーゼを産生できる天然に存在するアクチノアロムルス株を培養し、培養バッチから酵素組成物を回収する工程または
B)S8/S53ファミリーの少なくとも1つのエンドペプチダーゼを産生する能力を維持する、A)で定義された天然に存在する株から従来の変異および/もしくは選択手順により得られたアクチノアロムルス株を、酵素組成物を産生するのに適した条件下で培養培地中に培養し、培養バッチから酵素組成物を回収する工程または
C)
a)配列番号1、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%の同一性を有する配列を含むendopep−140、
b)配列番号2、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%の同一性を有する配列を含むendopep−40、
c)配列番号3、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%の同一性を有する配列を含むendopep−120、
d)配列番号4、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%の同一性を有する配列を含むendopep−60および
e)配列番号5、この生物学的活性断片、この天然に存在する対立遺伝子バリアントまたは少なくとも50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%の同一性を有する配列を含むendopep−41
からなる群から選択されるS8/S53ファミリーの少なくとも1つのエンドペプチダーゼをコードする核酸を宿主細胞内に組み込む工程、
エンドペプチダーゼを産生するのに適した条件下で培養培地中に細胞を培養し、培養バッチからエンドペプチダーゼを回収する工程
を含む、請求項1に記載の酵素組成物を産生する方法。 - アクチノアロムルス株が、請求項18に記載の少なくとも1つのエンドペプチダーゼを産生できるカテヌリスポラ(Catenulispora)、クテドノバクター(Ktedonobacter)またはストレプトマイセス(Streptomyces)の属に属している株により置き換えられる、請求項19の項A)またはB)に記載の方法。
- アクチノアロムルス株が、アクチノアロムルス属種DSM24988である、請求項19に記載の方法。
- 核酸が、請求項16または17において同定されたポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つを含む、請求項19の項C)に記載の方法。
- 核酸が、配列番号7および8のポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つまたは配列番号7および8のいずれか1つに対して少なくとも95%の同一性を有するポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つを含む、請求項22に記載の方法。
- 宿主細胞が、バチルス(Bacillus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、パイロコッカス(Pyrococcus)、シュードモナス(Pseudomonas)およびエシェリキア・コリ(Escherichia coli)から選択される微生物である、請求項19の項C)、請求項22または23に記載の方法。
- 宿主細胞が、エシェリキア・コリDH10Bである、請求項24に記載の方法。
- 株アクチノアロムルスDSM24988。
- 胃および膵臓の酵素による切断に対して耐性があり、腸管腔内に存在することにより毒性作用を生じる、グルテンオリゴペプチドを分解する方法であって、グルテンオリゴペプチドを、請求項1から8のいずれか一項に記載の酵素組成物または請求項9もしくは10に記載の少なくとも1つの単離されたエンドペプチダーゼと接触させる工程を含む、方法。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載の酵素組成物または請求項9もしくは10に記載の少なくとも1つの単離されたエンドペプチダーゼの有効量を、これを必要とする患者に投与する工程を含む、セリアック病、疱疹状皮膚炎および/またはグルテン不耐性に関連する任意の他の障害を治療または予防するための、請求項27に記載の方法。
- 酵素組成物または単離されたエンドペプチダーゼが、医薬製剤、栄養補助食品、飲み物または飲料内に取り込まれる、請求項28に記載の方法。
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