IT202100018254A1 - New systems for producing recombinant proteins/ nuovi sistemi di produzione di proteine ricombinanti - Google Patents

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IT202100018254A1
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recombinant protein
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Linda Cavaletti
Giacomo Enrico Carenzi
Jan Kormanec
Dagmar Homerova
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Description

Deposito della domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo:
NUOVI SISTEMI DI PRODUZIONE DI PROTEINE RICOMBINANTI
DESCRIZIONE CAMPO DELL?INVENZIONE
La presente invenzione ha a oggetto nuovi sistemi di produzione di proteine ricombinanti in un ceppo ospite Streptomyces.
Il nuovo sistema include vettori e nuovi ceppi ospiti ricombinanti, in particolare per la produzione di endopeptidasi di Actinoallomurus.
AMBITO TECNICO
La tecnologia del DNA ricombinante (rDNA) offre un set molto efficace di piattaforme tecniche per la produzione controllata e scalabile di polipeptidi di interesse mediante procedure relativamente economiche. Le proteine ricombinanti sono tipicamente ottenute mediante tecnologia di DNA ricombinante in Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, in cellule di insetti, criceti e mammiferi. Tuttavia, esiste l?esigenza di un miglioramento nella produzione di grandi quantit? di proteine ricombinanti; inoltre, sono in vigore requisiti molto severi che devono essere rispettati quando le proteine sono realizzate per un uso umano, ad esempio per l?uso come integratori alimentari e/o farmaci nella prevenzione e/o nel trattamento di patologie umane.
Gli streptomiceti sono considerati quale fonte sicura di proteine per un uso alimentare umano. Due esempi di enzimi alimentari provenienti da Streptomyces spp sono: le glucosio isomerasi usate per la produzione di sciroppo di fruttosio (Ann?, et al. Molecular Cell Research, 2014), e la transglutaminasi derivante da S. mobaraensis, ampiamente diffusa, usata nel settore alimentare per le sue propriet? nel miglioramento della consistenza e della qualit? generale di prodotti alimentari finiti, come ad esempio prodotti lavorati derivanti da carne e pesce, cos? come alimenti caseari e da forno (Kieliszek, et al. Folia Microbiologica, 2013).
Le cellule di S. lividans sono note per essere cellule ospiti efficienti nella produzione delle proteine ricombinanti, dato che le proteine ricombinanti espresse dalle dette cellule possono essere secrete e rilasciate direttamente nel terreno di coltura. Tuttavia, le diverse proteine sono ottenute con rendimenti molto diversi in S. lividans, tale risultato essendo imprevedibile (Ann?, et al. Molecular Cell Research, 2014).
Allo scopo di migliorare il rendimento delle proteine eterologhe, una raccolta di ceppi derivati di S. lividans TK24 (TK24 ID Tassonomia: 457428) ? stata generata mediante delezione sequenziale di cluster genici noti di metaboliti secondari potenzialmente interferenti. Novakova et al. (Applied Microbiology and Biotechnology, 2018) divulgano una produzione efficiente di mitramicina A, con rendimenti prossimi a 3 g/L, grazie all?uso di tale raccolta ottimizzata di ceppi.
Tuttavia, la riproducibilit? di rendimenti elevati con un qualsiasi polinucleotide codificante polipeptidi non ? garantita; inoltre, esiste ancora spazio per ulteriori miglioramenti nella fornitura di sistemi di produzione di proteine ricombinanti.
La presente invenzione ha lo scopo di fornire sistemi migliorati per la produzione efficiente di proteine ricombinanti in ceppi Streptomyces ospiti, preferibilmente Streptomyces lividans (S. lividans).
In particolare, il sistema dell?invenzione si ? rilevato particolarmente utile nella produzione di grandi quantit? di una endopeptidasi ricombinante (endopeptidasi 40 o E40) del ceppo Actinoallomurus.
La proteina nativa E40 ? composta da 398 residui di aminoacidi (vedere SEQ ID N: 3); il peptide segnale N-terminale ? stato identificato fra le posizioni 1 e 27, e si ? previsto che la forma matura della proteina (E40mat) ? un polipeptide di 32,5 kDa di sequenza SEQ ID N: 1, con inizio dalla posizione 74 della proteina nativa (vedere la Figura 1). ?E40pre-pro? sar? di seguito utilizzato per identificare la pre-pro-endopeptidasi nativa, che include il rispettivo peptide segnale nativo, consistente nella sequenza SEQ ID N: 3, o i rispettivi derivati, come ad esempio E40pre-pro taggata avente sequenza SEQ ID N: 4 (E40pre-pro con etichetta (tag) di istidina); ?E40pre? sar? di seguito utilizzato per identificare il pro-enzima E40, privo di peptide segnale, consistente nella sequenza di aminoacidi SEQ ID N: 9; ?E40mat? sar? di seguito utilizzato per identificare l?endopeptidasi matura con sequenza di aminoacidi consistente in SEQ ID N: 1, o rispettivi derivati, come ad esempio E40mat taggata avente sequenza amminoacidica SEQ ID N: 2 (E40Hismat).
Detta endopeptidasi ? stata divulgata per la prima volta in WO2013083338, e ha dimostrato di fornire una degradazione molto rapida ed efficiente dei peptidi del glutine in peptidi non tossici, essendo attiva in corrispondenza dell?intero intervallo di pH dell?ambiente gastrico e intestinale (l?attivit? enzimatica ? mostrata nell?intervallo di pH 3-6, con una situazione ottimale in corrispondenza del pH 5) ed essendo, inoltre, resistente alla degradazione da parte degli enzimi endogeni gastrointestinali. Ci? rende detta endopeptidasi di Actinoallomurus molto idonea per l?uso nel trattamento e/o nella prevenzione della Celiachia (CD) e dei disturbi associati alla CD. Pertanto, sussiste un forte interesse nello sviluppo di metodi efficienti ed economici di produzione di detta endopeptidasi di Actinoallomurus.
WO2021013553 divulga un metodo di produzione di endopeptidasi ricombinanti di Actinoallomurus in una cellula ospite S. lividans, in cui l?espressione di E40 ? preferibilmente guidata nel ceppo S. lividans TK24 mediante un vettore di espressione replicativo ad alto numero di copie (pIJ86, SEQ ID N: 7).
Sono stati utilizzati con esito positivo diversi plasmidi replicativi, in particolare grazie al loro alto numero di copie, per la sovrapproduzione di numerose proteine eterologhe biotecnologicamente rilevanti negli streptomiceti. Tuttavia, i vettori replicativi presentano alcuni inconvenienti; ad esempio, essi possono essere trasferiti agli streptomiceti solamente mediante una laboriosa trasformazione di protoplasti e necessitano di una selezione antibiotica permanente per essere mantenuti stabilmente negli streptomiceti.
I vettori integranti, contenenti un segmento di DNA che codifica funzioni di fissaggio/integrazione (Att/Int) per un?integrazione sito-specifica in siti specifici del genoma di Streptomyces (ad esempio un sito attB per una specifica integrasi), sono stati altres? impiegati per l?espressione di proteine ricombinanti negli Streptomyces. La maggior parte dei sistemi di integrazione sito-specifica si basa su diversi batteriofagi temperati di actinomiceti (actinofagi) identificati nelle specie Streptomyces. I batteriofagi temperati (e i vettori di integrazione preparati usando i rispettivi elementi funzionali) sono integrati nel cromosoma ospite in corrispondenza di un sito specifico mediante un processo di ricombinazione che richiede siti di fissaggio specializzati, attP nel fago (o nel vettore di integrazione) e attB nel cromosoma ospite.
Nonostante svariati benefici, tali sistemi Att/Int presentano altres? alcuni limiti, ad esempio il fatto che essi integrino l?intero plasmide di integrazione con il replicone di E. coli, il gene di integrasi e il gene marcatore di resistenza. Ci? pu? rappresentare un ostacolo biotecnologico significativo, in quanto pu? essere pregiudicata la stabilit? delle strutture. In effetti, l?instabilit? di diversi sistemi Att/Int ? stata riportata in diversi ceppi di Streptomyces (Kormanec J. et al., Applied Microbiology and Biotechnology 103:5463?5482, 2019). Pertanto, tali metodi a vettori integranti sono stati considerati non idonei per la realizzazione di ceppi di produzione biotecnologia stabili.
Inoltre, anche diversi altri elementi contribuiscono all?efficienza di un sistema di produzione di proteine ricombinanti, come ad esempio gli elementi di regolazione nelle cassette di espressione clonate nel vettore di espressione.
Pertanto, l?ottenimento di un rendimento soddisfacente di proteina e il fatto di evitare inconvenienti indesiderati non rappresentano mai un compito semplice e chiaro nel campo della produzione di proteine ricombinanti.
La presente invenzione prevede un sistema inaspettatamente migliorato di produzione di proteine ricombinanti, e preferibilmente di endopeptidasi ricombinanti di Actinoallomurus, nelle cellule ospiti Streptomyces, preferibilmente S. lividans.
BREVE DESCRIZIONE DELL?INVENZIONE
Il sistema dell?invenzione di produzione di proteine ricombinanti in cellule ospiti Streptomyces, preferibilmente dei ceppi S. lividans, include nuovi vettori ricombinanti che recano una cassetta di espressione comprendente un polinucleotide che codifica la proteina ricombinante di interesse sotto controllo di un promotore forte, il quale ? un promotore kasO ingegnerizzato (kasOp*), di sequenza SEQ ID N: 10, e un elemento di regolazione, il quale ? un sito legante ribosomi (RBS) SR40 variante sintetico basato sul gene per la proteina del capside di PhiC31 (Bai et al. 2015, Proc Natl Acad Sci USA 112, 12181-12186) di sequenza SEQ ID N: 11. I vettori ricombinanti dell?invenzione sono vettori integranti in singolo sito basati sul fago PhiBT1, che preferibilmente si integrano in corrispondenza del rispettivo sito attB nei genomi di Streptomyces.
Il polinucleotide che codifica la proteina ricombinante di interesse codifica una preproteina ricombinante che include un peptide segnale. In aspetti preferiti, detto peptide segnale ? un peptide segnale eterologo, pi? preferibilmente un peptide segnale vsi dell?inibitore di subtilisina di Streptomyces venezuelae (Lammertyn et al. 1997 Appl Environ Microbiol 63, 1808- 1813), avente sequenza SEQ ID N: 12.
Preferibilmente, la proteina ricombinante di interesse ? un?endopeptidasi di Actinoallomurus, preferibilmente endopeptidasi di Actinoallomurus 40 (E40), un suo frammento biologicamente attivo, una sua variante o un suo derivato.
I sistemi dell?invenzione includono altres? nuovi ceppi ospiti ricombinanti comprendenti i nuovi vettori. La presente invenzione ha altres? ad oggetto l?uso dei nuovi sistemi dell?invenzione per la produzione di proteine ricombinanti mediante la secrezione delle stesse nel terreno di coltura della cellula ospite, in particolare per la produzione di endopeptidasi di Actinoallomurus, nonch? metodi di produzione della proteina ricombinante mediante i nuovi sistemi dell?invenzione.
Inaspettatamente, nonostante l?uso di un vettore a copia singola, il sistema dell?invenzione prevede l?espressione di una proteina ricombinante stabile e in quantit? elevate.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1: Sequenza del pre-pro-enzima E40 nativo (E40pre-pro). Il suo peptide segnale ? mostrato in grassetto e l?enzima maturo ? sottolineato.
Figura 2: Schema del vettore ricombinante pIJ86/e40 della tecnica anteriore contenente il gene e40 che codifica per l?endopeptidasi E40pre (con e senza tag 6xHis), inserito fra i siti BamHI e HindIII del vettore di clonazione pIJ86. La sequenza della regione del promotore ermEp* (SEQ ID N: 30) con le regioni dei promotori -10 e -35 (in grassetto e sottolineato), TSS (in grassetto, sottolineato e evidenziato) e la fusione BamHI/BclI con e40 ? indicata sotto lo schema del plasmide. Gli aminoacidi di E40 si trovano nella seconda posizione di ogni codone.
Figura 3: Schema del vettore di espressione pMU1s-kasOpSR40vsi3mRFPA. La sequenza della fusione vsi-mRFP con siti di restrizione inseriti (in grassetto e sottolineato) ? indicata sotto lo schema del plasmide. Gli aminoacidi del peptide segnale vsi (in grassetto) e mRFP (font rosso) si trovano nella seconda posizione di ogni codone.
Figura 4: SDS-PAGE 13,5% di 20 ul di campioni di terreno dopo la secrezione di mRFP in S. lividans TK24 con pMU1s-kasOpSR40vsi3mRFPA cresciuto in terreno TSB a diversi punti temporali (due singoli cloni). Corsie: 1=LMW standard; 2-5=TK24 pMU1s-kasOpSR40vsi3mRFPA cresciuto rispettivamente per 24h, 48h, 72h, 146h; 10=TK24 cresciuto per 48h.
Figura 5: Schema del vettore di clonazione pLit-kasOpSR40vsi3mRFP contenente il promotore forte kasOp*, il RBS SR40ottimizzato forte, e il sito singolo NdeI inserito nel codone ATG del gene di fusione reporter vsi-mRFP.
Figura 6: Schema dei plasmidi ricombinanti pLit-e40 e pLit-e40His, contenenti l?intero gene e40 con la sequenza originale del suo peptide segnale (rispettivamente con e senza tag 6 x His), inseriti fra i siti NdeI e AvrII del vettore di clonazione pLitkasOpSR40vsi3mRFP. La sequenza del promotore kasOp* con le regioni del promotore -10 e -35 (in grassetto e sottolineato), il rispettivo TSS (in grassetto, sottolineato e evidenziato), RBS (in grassetto e sottolineato) e la fusione NdeI con e40 ? indicata sotto lo schema del plasmide. Gli aminoacidi di E40 si trovano nella seconda posizione di ogni codone.
Figura 7: Schema del vettore di espressione di clonazione pMU1s-kasOpSR40gusA contenente il promotore forte kasOp*, il RBS SR40 ottimizzato forte e il singolo sito NdeI inserito nel codone ATG del gene reporter gusA. La sequenza di tale promotore e della regione RBS con le regioni del promotore -10 e -35 (in grassetto e sottolineato), il rispettivo TSS (in grassetto, sottolineato ed evidenziato) e RBS (in grassetto e sottolineato) ? indicata sotto lo schema del plasmide.
Figura 8: Schema dei plasmidi ricombinanti pLit-vsie40pre, pLit-e40Hispre, pLitvsie40HQHispre, pLit-vsie40mat, pLit-vsie40Hismat, contenenti la fusione genica vsi-e40pre di Vsi con il pro-enzima E40pre e la fusione genica vsi-e40mat di Vsi con l?enzima maturo E40mat (rispettivamente con e senza tag 6 x His), inseriti fra i siti NheI e HindIII del vettore di clonazione pLit-kasOpSR40vsi3mRFP. La sequenza del promotore kasOp* con le regioni del promotore -10 e -35 (in grassetto e sottolineato), il rispettivo TSS (in grassetto, sottolineato ed evidenziato), RBS (in grassetto e sottolineato), NdeI e NheI del sito di fusione vsi-E40 ? indicata sotto il plasmide.
Figura 9: Schemi dei plasmidi ricombinanti pMU1s-e40, pMU1s-e40His, pMU1svsie40pre, pMU1s-vsie40Hispre, pMU1s-vsie40HQHispre, pMU1svsie40mat, pMU1s-vsie40Hismat, contenenti tutte le forme di fusioni geniche di e40 quali frammenti di DNA KpnI EcoRV dai plasmidi pLit (vedere Figure 6, 8) inseriti fra i siti KpnI e EcoRV del vettore di clonazione pMU1s-kasOpSR40gusA (Figura 7).
Figura 10: Schemi dei plasmidi ricombinanti pIJ86-kasOpe40, pIJ86-kasOpe40His, pIJ86-vsie40pre, pIJ86-vsie40Hispre, pIJ86-vsie40HQHispre, pIJ86-vsie40mat, pIJ86-vsie40Hismat, contenenti tutte le forme di fusioni geniche di e40 (come indicato nelle Figure 6, 8) (rispettivamente con e senza tag 6 x His) quali frammenti di DNA KpnI-EcoRV dai plasmidi pLit (Figure 6, 8) inseriti fra i siti KpnI e HindIII del vettore di clonazione pIJ86 (Figura 2).
Figura 11: Schema del plasmide ricombinante pMU1s-ermEe40, contenente la fusione ermEp*-e40His dal plasmide pIJ86/e40His contenente il gene e40 con tag 6 x His.
Figura 12: Attivit? di E40 nel ceppo di tipo selvatico (wild-type) e mutante S. lividans RedStrep 1.3 coniugato con plasmidi replicativi della tecnica nota ad alto numero di copie.
Figura 13: Attivit? di E40 nei ceppi di tipo selvatico e mutanti S. lividans RedStrep coniugati con plasmidi di integrazione a sito singolo che esprimono E40 nativa sotto il promotore ermEp*.
Figura 14: Attivit? di E40 nei ceppi di tipo selvatico S. lividans coniugati con plasmidi di integrazione a sito singolo che esprimono E40 (A) nativa o E40 (B) con tag His sotto il promotore kasOp* e il RBS SR40 ottimizzato forte conformemente all?invenzione. Figura 15: Attivit? di E40 nei ceppi di tipo selvatico S. lividans coniugati con plasmidi pIJ86 ad alto numero di copie che esprimono E40 (A) o E40 (B) con etichetta His con il promotore kasOp* promotore e il RBS SR40 ottimizzato forte.
Figura 16: Attivit? di E40 nei ceppi di tipo selvatico S. lividans coniugati con plasmidi pIJ86 ad alto numero di copie comprendenti vsi-e40pre (A), vsi-e40pre (B) con etichetta His, vsi-e40mat (C), o geni di fusione vsi-e40mat (D) con etichetta His, con il promotore kasOp* e il RBS SR40 ottimizzato forte.
Figura 17: Attivit? di E40 nei ceppi di tipo selvatico S. lividans coniugati con plasmidi di integrazione a sito singolo comprendenti vsi-e40pre (A) o vsi-e40pre (B) con tag His, con il promotore kasOp* e il RBS SR40 ottimizzato forte.
Figura 18: Attivit? di E40 nei ceppi di tipo selvatico o mutanti S. lividans RedStrep coniugati con plasmidi di integrazione a sito singolo che esprimono E40 (A) nativa o E40 (B) nativa con tag His con il promotore kasOp* e il RBS SR40 ottimizzato forte. Figura 19: Attivit? di E40 nei ceppi di tipo selvatico o mutanti S. lividans RedStrep coniugati con plasmidi di integrazione a sito singolo che esprimono vsi-e40pre (A) o vsi-e40pre (B) con tag His, con il promotore kasOp* e il RBS SR40 ottimizzato forte.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE
La presente invenzione ha anzitutto ad oggetto un vettore ricombinante che reca una cassetta di espressione per l?espressione eterologa di una proteina ricombinante in una cellula ospite Streptomyces, detta cassetta comprendente: un promotore, un elemento di regolazione a valle del detto promotore, e un polinucleotide che codifica una proteina ricombinante, a valle del detto promotore e del detto elemento di regolazione, nonch? operativamente legato ai medesimi.
I termini ?vettore?, ?vettore di espressione? e ?plasmide? sono ivi utilizzati in modo intercambiabile.
Il vettore di espressione per l?espressione eterologa di una proteina ricombinante in una cellula ospite Streptomyces dell?invenzione ? un vettore di integrazione a sito singolo contenente il sito attP e il gene di integrasi dal fago PhiBT1, pi? preferibilmente un vettore che si integra in corrispondenza del proprio sito attB di Streptomyces, avente sequenza SEQ ID N: 13.
Esempi di vettori di integrazione a sito singolo conformemente alla presente invenzione includono quelli descritti in Kormanec J. et al., Applied Microbiology and Biotechnology (2019) 103:5463?5482.
Nelle realizzazioni preferite, il vettore di integrazione a sito singolo ? un vettore avente lo scheletro del vettore pMU1 (vedere Craney et al.2007, Nucleic Acids Res 35, e46).
Il promotore di detta cassetta di espressione ? un promotore kasO modificato (kasOp*) di sequenza SEQ ID N: 10; l?elemento di regolazione della cassetta di espressione ? un sito legante ribosomi sintetico (RBS SR40) di sequenza SEQ ID N: 11; e il polinucleotide che codifica la proteina ricombinante di interesse ? un polinucleotide che codifica una proteina ricombinante che include il peptide segnale.
La cassetta di espressione dell?invenzione ? particolarmente idonea per l?espressione eterologa di proteine ricombinanti nelle cellule ospiti Streptomyces, in cui la proteina ricombinante ? espressa dalla cellula ospite, posta in coltura in un terreno con condizioni adeguate per la crescita della cellula ospite, quindi secreta in detto terreno di coltura. Il peptide segnale guida la secrezione della proteina nel terreno.
Opzionalmente, il peptide segnale ? un peptide segnale eterologo, pi? preferibilmente un peptide segnale vsi dell?inibitore di subtilisina dello Streptomyces venezuelane, avente sequenza SEQ ID N: 12. Inaspettatamente, l?uso di un peptide segnale eterologo fuso alla proteina di interesse, conformemente all?invenzione, offre una secrezione della proteina ricombinante valida tanto quanto il peptide segnale nativo della proteina medesima.
Nelle realizzazioni preferite della presente invenzione, la proteina ricombinante codificata dal polinucleotide della cassetta di espressione ? un?endopeptidasi ricombinante di Actinoallomurus con attivit? di glutenasi; pi? preferibilmente, detta endopeptidasi ? l?endopeptidasi 40 (E40) di sequenza comprendente SEQ ID N: 1, un frammento biologicamente attivo di E40, una variante allelica presente in natura di E40; o un?endopeptidasi di sequenza avente almeno il 60%, il 70%, l?80%, il 90% o il 95% di identit? con SEQ ID N: 1.
SEQ ID N: 1 ? la sequenza polipeptidica della forma matura di E40.
Pertanto, preferibilmente la cassetta di espressione comprende un polinucleotide che codifica l?endopeptidasi E40 di sequenza comprendente SEQ ID N: 1, un frammento biologicamente attivo di E40, una variante allelica presente in natura di E40, o un?endopeptidasi di sequenza avente almeno il 60%, il 70%, l?80%, il 90% o il 95% di identit? con SEQ ID N: 1.
Il termine ?frammento biologicamente attivo? di E40 si riferisce alle porzioni dell?endopeptidasi che mantengono la sua specifica attivit? di glutenasi. Un polinucleotide che codifica un " frammento biologicamente attivo? di E40 pu? essere identificato cos? come divulgato nel documento WO2021013553.
Il polinucleotide che codifica la proteina ricombinante di interesse pu? presentare una sequenza che differisce dalla sequenza di acido nucleico annotata a causa della degenerazione del codice genetico e, quindi, codifica la stessa proteina codificata da un polinucleotide avente la sequenza di acido nucleico annotata.
I termini "identit?" o ?omologia?, qualora riferiti a una sequenza di nucleotidi o di aminoacidi, sono ivi utilizzati in modo intercambiabile e si riferiscono al grado al quale due sequenze di polinucleotidi o di polipeptidi sono identiche o omologhe su base residuo-residuo, rispetto a una particolare regione di confronto. L?allineamento e l?identit? o omologia percentuale possono essere determinati usando qualsiasi idoneo programma software noto nel settore, ad esempio quelli descritti in Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel F.M. et al., "Commercially Available Software", Current Protocols in Molecular, 1987, Supplemento 30, Sezione 7.7.18, Tabella 7.7.1). I programmi preferiti includono il programma GCG Pileup, FASTA (Pearson R. e Lipman D. J. "Improved Tools for Biological Sequence Analysis? Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 1988, 85, 2444-2448), e BLAST (Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. "Basic local alignment search tool" J. Mol. Biol., 1990, 215, 403? Il termine "variante allelica" indica una qualsiasi di due o pi? forme alternative di un gene che occupa lo stesso locus genico. La variante allelica insorge naturalmente tramite mutazione, e pu? determinare polimorfismo fenotipico all?interno delle popolazioni. Le mutazioni genetiche possono essere silenziose (nessuna variazione nel polipeptide codificato) o possono codificare polipeptidi aventi una sequenza di aminoacidi alterata. Il termine variante allelica si riferisce anche a una proteina codificata da una variante allelica di un gene.
Il polinucleotide che codifica la proteina ricombinante di interesse pu? codificare una proteina operativamente fusa a un altro polipeptide, ad esempio un tag, come ad esempio il tag istidina. Ad esempio, detto polinucleotide pu? essere un polinucleotide che codifica una proteina taggata, come ad esempio per la E40 taggata di sequenza comprendente o consistente in SEQ ID N: 2. In realizzazioni preferite, detto polinucleotide che codifica la proteina di interesse ? un polinucleotide di sequenza comprendente o consistente nella sequenza SEQ ID N: 5, 6, 15, 16, 17 o 18 e la cassetta di espressione ? di sequenza SEQ ID N: 20, 21, 22 o 23.
Pertanto, in una realizzazione preferita, la presente invenzione ha a oggetto un vettore di integrazione a sito singolo, pi? preferibilmente un vettore che si integra in corrispondenza del sito attB per il fago PhiBT1 di Streptomyces, il quale reca una cassetta di espressione per l?espressione in cellule ospiti Streptomyces, preferibilmente dei ceppi S. lividans, dell?endopeptidasi di Actinoallomurus, preferibilmente dell?endopeptidasi di Actinoallomurus 40 (E40), un suo frammento biologicamente attivo, una sua variante o un suo derivato, sotto il controllo di un promotore kasO modificato (kasOp*) di sequenza SEQ ID N: 10 e di un sito legante ribosomi (RBS) di sequenza SEQ ID N: 11 (RBS SR40). Opzionalmente, la proteina ricombinante ? l?endopeptidasi di Actinoallomurus il cui peptide segnale ? sostituito con un peptide segnale vsi.
Pi? preferibilmente, il vettore di integrazione a sito singolo che reca una cassetta di espressione per l?espressione dell?endopeptidasi di Actinoallomurus 40 (E40) ? un vettore pMU1 di sequenza SEQ ID N: 25, 26, 27 o 28.
La presente invenzione ha altres? ad oggetto una cellula ospite per l?espressione eterologa di una proteina ricombinante comprendente un vettore di espressione conformemente all?invenzione, preferibilmente essendo una cellula ospite ricombinante Streptomyces, pi? preferibilmente una cellula ospite S. lividans. La cellula ospite pu? essere una cellula ospite S. lividans di tipo selvatico o una cellula ospite S. lividans mutante, come una cellula ospite S. lividans di ceppo S. lividans RedStrep 1.3 (?act, ?red, ?cda), S. lividans RedStrep 1.6 (?act,?red, ?cda, ?mel), o S. lividans RedStrep 1.9 (?act,?red,?cda, ?mel, ?matAB) (Novakova et al., 2018).
Preferibilmente, detta cellula ospite ? una cellula di ceppo DSM 33930 (S. lividans 1.3 coniugato con pMU1s-e40His), DSM 33931 (S. lividans 1.9 coniugato con pMU1se40His), depositate il 24 giugno 2021 presso il Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Inhoffenstra?e 7B 38124 Braunschweig ? GERMANIA, ai sensi delle disposizioni del Trattato di Budapest.
La presente invenzione ha poi ad oggetto anche l?uso dei vettori ricombinanti o delle cellule ospiti dell?invenzione per la produzione di una proteina ricombinante, secreta nel terreno di coltura della cellula ospite.
Vantaggiosamente, il sistema dell?invenzione prevede la produzione della proteina di interesse, la quale ? stabile e in quantit? elevate. Inoltre, la proteina ? facilmente recuperabile dal terreno di coltura della cellula ospite in cui ? secreta.
In effetti, i sistemi dell?invenzione hanno altres? a oggetto un metodo di produzione di una proteina ricombinante in una cellula ospite Streptomyces, comprendente, in sequenza: la coltura di una cellula ospite Streptomyces ricombinante, preferibilmente una cellula ospite S. lividans, pi? preferibilmente del ceppo TK24, in un terreno di coltura in condizioni di fermentazione, detta cellula ospite ricombinante comprendendo un vettore di espressione ricombinante conformemente all?invenzione; il recupero del surnatante del terreno di coltura e la depurazione da detto surnatante di una preparazione comprendente la proteina ricombinante.
Con ?condizioni di fermentazione? si indicano condizioni di coltura del ceppo della cellula ospite (composizione del terreno, parametri di agitazione, aerazione e temperatura) idonee per la crescita del ceppo e per la produzione del composto di interesse (endopeptidasi ricombinante). Idonee condizioni di fermentazione possono essere, ad esempio, quelle descritte nel documento WO2021013553 o quelle descritte negli esempi seguenti.
Si comprender? che tutte le possibili combinazioni degli aspetti preferiti della presente invenzione sono altres? descritte e, pertanto, analogamente preferite.
Di seguito sono riportati esempi di realizzazioni della presente invenzione, per finalit? illustrative e non limitative.
ESEMPI
Plasmidi
I plasmidi preparati negli esempi 1-6 che seguono sono riassunti nella Tabella 1. Per ogni plasmide sono riportati il promotore, il RBS, il peptide segnale, il gene e lo scheletro del vettore.
Tabella 1
Cellule ospiti
S. lividans di ceppo TK24 selvatico (ID Tassonomia: 457428) e S. lividans di ceppi mutanti RedStrep 1.3, 1.6, 1.9 (Novakova et al.2018) sono stati impiegati negli esempi 7-14 per testare la produzione della proteina ricombinante con diversi plasmidi.
Esempio 1
pIJ86/e40 e pIJ86/e40His (Figura 2) sono plasmidi replicativi pIJ86 ad alto numero di copie della tecnica nota (vedere WO2021013553), i quali includono il gene che codifica e40 (pre-proe40) sotto il promotore ermEp* (composto dal pi? debole ermEp2 e dal pi? forte ermEp1* mutato). Essi sono stati ottenuti dalla Fondazione Istituto Insubrico di Ricerche per la Vita (FIIRV).
Esempio 2
pMU1s-kasOpSR40gusA (Figura 7) ? un vettore integrante pMU1s su base PhiBT1 (Craney et al. 2007, Nucleic Acids Res 35, e46), il quale reca una cassetta di espressione comprendente il gene reporter gusA (Myronovskyi et al. 2011, Appl Environ Microbiol 77, 5370-5383) sotto il controllo del promotore forte kasOp* e con il RBS SR40 forte sintetico ottimizzato (Bai et al. 2015, Proc Natl Acad Sci USA 112, 12181-12186). L?attivit? di tale combinazione ? stata pari a 1897 U/g di GUS, 47 volte superiore rispetto alla stessa cassetta di espressione con promotore ermEp*.
Esempio 3
Si ? preparato un polinucleotide che codifica un polipeptide di fusione della sequenza di peptide segnale vsi col gene reporter della proteina fluorescente rossa (mRFP), col sito NheI inserito fra la sequenza del peptide segnale e mRFP. L?intera cassetta vsi-mRFP, quale frammento di DNA NdeI-NotI di 800-bp, ? stata usata per sostituire gusA in pMU1s-kasOpSR40gusA dell?Esempio 2, risultando nel vettore pMU1skasOpSR40vsi3mRFPA (Figura 3). Analogamente, esso conteneva il promotore forte kasOp*, il RBS SR40 forte sintetico ottimizzato e il peptide segnale vsi. Tale struttura presentava una secrezione elevata di mRFP (27886 FU). La SDS-PAGE ha rivelato una banda corretta di mRFP secreta in terreno TSB ricco (Figura 4).
Esempio 4
Una cassetta di espressione KpnI-NotI 900-bp, contenente il promotore kasOp*, il RBS SR40 ottimizzato, con il sito singolo NdeI inserito nel codone ATG del gene reporter di fusione vsi-mRFP, ? stata clonata nel vettore di clonazione E. coli standard pBluescript II SK (Stratagene) digerito con gli stessi enzimi, risultando nel pBS-kasOpSR40vsi3mRFP. Tale frammento ? stato successivamente clonato da tale plasmide quale frammento KpnI-SacI 900-bp nel vettore di clonazione E. coli standard LITMUS 28 (New England BioLabs) digerito con gli stessi enzimi, ottenendo pLitkasOpSR40vsi3mRFP (Figura 5). Il plasmide ? stato verificato mediante sequenziamento di nucleotidi e usato quale vettore per la clonazione di tutti i geni e40 in vettori secondo l?invenzione. L?intero gene e40 dal proprio codone di inizio ATG, unitamente alla propria sequenza di peptide segnale (e40 pre-pro), con e senza tag 6xHis ubicata a livello C-terminale, ? stato amplificato mediante PCR dal plasmide pIJ86/e40His, inserendo un sito NdeI nel codone di inizio ATG, e i siti SpeI e HindIII dopo il codone di stop di e40. I frammenti di DNA 1200-bp amplificati per PCR e purificati sono stati digeriti con NdeI e SpeI e clonati in pLit-kasOpSR40vsi3mRFP digerito con AvrII e NdeI, determinando, rispettivamente, pLit-e40 o pLit-e40His (Figura 6). Diversi cloni positivi sono stati analizzati mediante mappatura di restrizione e successivamente verificati mediante sequenziamento nucleotidico.
Allo scopo di preparare una fusione genica vsi-e40pre contenente la fusione di Vsi col pro-enzima E40pre, si ? amplificato per PCR il gene e40pre (con e senza tag 6 x His ubicata a livello C-terminale) con il plasmide pIJ86/e40His quale templato e la Pfu DNA polimerasi con correzione (proof-reading), mediante l?utilizzo di primer che hanno inserito un sito NheI nel codone Ala34, e i siti SpeI e HindIII dopo il codone di stop di e40. I frammenti di DNA 1100-bp amplificati per PCR e purificati sono stati digeriti con NheI e HindIII quindi clonati in pLitkasOpSR40vsi3mRFP digerito con NheI e HindIII, determinando, rispettivamente, pLit-vsie40pre o pLit-vsi40Hispre (Figura 8). Diversi cloni positivi sono stati analizzati mediante mappatura di restrizione e successivamente verificati mediante sequenziamento di nucleotidi. Il sequenziamento dei cloni ha rivelato un clone in cui il primer sintetizzato ha generato una mutazione, sostituendo il codone His38 CAC al codone Gln38CAA. Il plasmide ? stato altres? considerato per ulteriore analisi ed etichettato quale pLitvsi40HQHispre.
Allo scopo di preparare una fusione genica vsi-e40mat contenente la fusione di Vsi con un enzima maturo E40mat, si ? amplificato per PCR il gene e40mat (con e senza tag 6 x His ubicata al C-terminale) con il plasmide pIJ86/e40His quale templato e la Pfu DNA polimerasi proof-reading, mediante l?utilizzo di primer che hanno inserito un sito NheI nel codone Ala73 con ulteriore modifica del codone Ala74 in Ser, e i siti SpeI e HindIII dopo il codone di stop di e40. I frammenti di DNA 1000-bp amplificati per PCR e purificati sono stati digeriti con NheI e HindIII e clonati in pLit-kasOpSR40vsi3mRFP digerito con NheI e HindIII, determinando, rispettivamente, pLit-vsie40mat o pLitvsi40Hismat (Figura 8). Diversi cloni positivi sono stati analizzati mediante mappatura di restrizione e successivamente verificati mediante sequenziamento di nucleotidi.
Esempio 5
Tutte le cassette contenenti il promotore kasOp*, il RBS, ed e40 (con il rispettivo peptide segnale originale o con il peptide segnale Vsi, con e senza etichetta 6 x His alla fine), sono state clonate quali frammenti di DNA 1400-bp KpnI-EcoRV da pLit-e40, pLit-e40His, pLit-vsie40pre, pLit-e40Hispre, pLitvsie40HQHispre, pLit-vsie40mat, pLit-vsie40Hismat (Figura 6, 8) in pMU1skasOpSR40gusA (Figura 7), digerite con KpnI e EcoRV, determinando i vettori pMU1s-e40,pMU1s-e40His, pMU1s-vsie40pre, pMU1s-vsie40Hispre, pMU1s-vsie40HQHispre,pMU1s-vsie40mat, pMU1svsie40Hismat (Figura 9). Diversi cloni positivi sono stati analizzati mediante mappatura di restrizione e successivamente verificati mediante sequenziamento di nucleotidi. Tutte le strutture possono integrarsi in una singola posizione del cromosoma di S. lividans TK24 usando il sistema integrativo basato sul fago PhiBT1 dopo la coniugazione dei plasmidi in S. lividans TK24 con selezione di resistenza da apramicina (AprR). Le strutture finali sono stabili e non ? necessaria alcuna selezione AprR.
Esempio 6
Tutte le cassette contenenti il promotore kasOp*, il RBS, ed e40 (con il rispettivo peptide segnale originale o con il peptide segnale Vsi, con e senza tag 6 x His alla fine), sono state clonate quali frammenti di DNA KpnI-EcoRV di 1400-bp da pLit-e40, pLite40His, pLit-vsie40pre, pLit-e40Hispre, pLitvsie40HQHispre, pLit-vsie40mat, pLitvsie40Hismat (Figure 6, 8) in pIJ86, digerite con KpnI e HindIII, risultando nei vettori pIJ86-kasOpe40, pIJ86-kasOpe40His, pIJ86-vsie40pre, pIJ86-vsie40Hispre, pIJ86-vsie40HQHispre, pIJ86-vsie40mat, pIJ86-vsie40Hismat (Figura 10). Diversi cloni positivi sono stati analizzati mediante mappatura di restrizione e successivamente verificati mediante sequenziamento di nucleotidi. Tutte le strutture possono replicarsi in S. lividans TK24 con un alto numero di copie (circa 100-300 copie) dopo la coniugazione dei plasmidi in S. lividans TK24 con selezione AprR. Tuttavia, risulta necessaria una selezione AprR permanente e si ? riscontrata una certa instabilit?.
Infine, un frammento XbaI (riempito con Klenow) ? HindIII di 1500-bp dal plasmide navetta ad alto numero di copie pIJ86/e40His ? stato clonato nel vettore pMU1svsiRFPB tagliato con EcoRV e HindIII, determinando pMU1s-ermEe40 (Figura 11). Il plasmide ? stato verificato mediante sequenziamento.
Esempio 7
Si ? determinata l?attivit? di E40 con il ceppo della tecnica anteriore S. lividans/pIJ86/e40His. Anzitutto, si ? preparato uno stock di spore dopo la rispettiva sporulazione su terreno solido Bennett e apramicina (Apr). Spore miscelate e spore derivanti da cinque colonie sporulate indipendenti sono state testate in termini di stabilit?. La sospensione di spore, da una regione sporulata di 1 x 1 cm, composta da spore miscelate confluenti (o da 5 grandi colonie sporulate singole intere) ? stata inoculata in fiasche Erlenmeyer (100 ml) contenenti 10 ml di Terreno V (glucosio 20 g/L, estratto di lievito Difco 5 g/L, peptone di soia Sigma Aldrich 10 g/L, NaCl 1,5 g/L), con aggiunta di Apr fino a 50 ug/ml, quindi incubata in un agitatore rotante a 200 giri/min, a 30?C, per 1 giorno. Sono state aggiunte 5 biglie (3,5 mm), poi la coltura ? proseguita per un altro giorno. 2 ml di tale coltura sono stati inoculati in una fiasca Erlenmeyer (100 ml) contenente 20 ml del Terreno P (saccarosio 340 g/L, glucosio 10 g/L, estratto di lievito 3 g/L, peptone di soia 5 g/L, estratto di malto 3 g/L), con aggiunta di Apr fino a 50 ?g/ml, quindi incubati alle medesime condizioni. Nei giorni 2, 5, 6, 7, 8, 1 ml della coltura nella provetta di Eppendorf ? stato prelevato, centrifugato (10 min a 13000 giri/min), il surnatante ? stato trasferito in una nuova provetta e stoccato a ? 20 ?C. L?attivit? di E40 ? stata misurata mediante protocollo SSA (Standard Activity Assay, SSA, eseguito in piastre per microtitolazione trasparenti a 96 pozzetti nel lettore Biotec Microplate ad A405) con diluizione 40 x dei campioni. Attivit? di E40 comparabili di circa 20 AU/ml sono state determinate in tutte le cinque colonie indipendenti e nella coltura miscelata. I campioni sono stati altres? analizzati mediante SDS-PAGE, evidenziando tutti la banda di E40 a 38 kDa (non mostrata).
Esempio 8
L?attivit? di E40 ? stata testata con due ceppi S. lividans, di tipo selvatico TK24 e mutante S. lividans RedStrep 1.3, coniugati con i plasmidi della tecnica nota pIJ86, pIJ86/e40 e pIJ86/e40His. La coltura sporulata ? stata inoculata in fiasche Erlenmeyer (100 ml) contenenti 10 ml di terreno Niedercorn (3% saccarosio, 2% liquore di mais macerato, 0,2% solfato di ammonio, 0,7% CaCO3, pH 7, in acqua distillata), con aggiunta di Apr fino a 50 ug/ml, quindi incubata in un agitatore rotante a 200 giri/min a 30?C per 2 giorni.
2 ml di tale coltura sono stati inoculati in una fiasca Erlenmeyer (100 ml) contenente 20 ml del Terreno P. L?attivit? di E40 ? stata misurata mediante protocollo SSA come sopra, con diluizione 40 x dei campioni composti dal surnatante delle colture prelevate i giorni 3, 4, 5, 6, 7. Nel caso del vettore pIJ86 considerato singolarmente, in entrambi i ceppi si ? evidenziata solamente una bassa attivit? proteasica di fondo. Con entrambi i costrutti pIJ86/e40 e pIJ86/e40His, l?attivit? di E40 era pari a circa 15 AU/ml nel ceppo TK24 e a circa 20 AU/ml nel ceppo RedStrep 1.3 (Figura 12).
Esempio 9
L?attivit? di E40 ? stata misurata nel ceppo S. lividans TK24 di tipo selvatico e in tre ceppi mutanti, S. lividans RedStrep 1.3; 1.6; 1.9, usando il plasmide di controllo pMU1s-ermEe40 (Figura 11). Le colture sono state preparate come nell?Esempio 8.
Con il costrutto integrato a singola copia a livello cromosomico pMU1s-ermEe40, l?attivit? di E40 era molto inferiore rispetto all?attivit? con i vettori pIJ86 ad alto numero di copie dell?Esempio 8: 1,13 AU/ml con pMU1s-ermEe40 nel S. lividans TK24 di tipo selvatico e circa 3 volte superiore nei ceppi RedStrep 1.6 e 1.9 (Figura 13). Esempio 10
L?attivit? E40 ? stata misurata nel ceppo S. lividans TK24 di tipo selvatico coniugato con quattro cloni dei plasmidi integranti a sito singolo pMU1s-e40 e pMU1s-e40His, contenenti il promotore kasOp*, il RBS forte SR40, ed e40 con il rispettivo peptide segnale originale (senza e con tag x His C-terminale). Le colture sono state preparate come nell?Esempio 8.
In tre cloni (N. 1, 2, 3) con il plasmide pMU1s-e40, si ? rilevata un?attivit? di E40 comparabile di circa 55 AU/ml, tuttavia, nel clone N. 4, l?attivit? era molto superiore (260 AU/ml) (Figura 14 A). Analogamente, in tre cloni (N. 1, 2, 4) con il plasmide pMU1s-e40His, si ? rilevata un?attivit? di E40 comparabile di circa 45 AU/ml, tuttavia, nel clone N. 3, l?attivit? era molto superiore (180 AU/ml) (Figura 14B). Sulla base del confronto dei tre cloni simili con il plasmide integrante in copia singola pMU1sermEe40 dell?Esempio 6, pMU1s-e40 e pMU1s-e40His mostrano, rispettivamente, un aumento di circa 50 volte e 40 volte dell?attivit? di E40.
Esempio 11
L?attivit? di E40 ? stata analizzata in quattro cloni indipendenti dal ceppo S. lividans TK24 di tipo selvatico coniugato con il vettore pIJ86 ad alto numero di copie contenente il promotore kasOp*, il RBS forte SR40, ed e40 con il rispettivo peptide segnale originale o con il peptide segnale vsi, senza e con tag His C-terminale (pIJ86-kasOpe40, pIJ86-kasOpe40His, pIJ86-vsie40pre, pIJ86-vsie40Hispre, pIJ86-vsie40HQHispre, pIJ86-vsie40mat, pIJ86-vsie40Hismat). I risultati hanno indicato un?elevata instabilit? di tale vettore ad alto numero di copie contenente le cassette clonate col promotore kasOp*, RBS forte SR40 ed e40, con il rispettivo peptide segnale originale (Figura 15) o fuso al peptide segnale vsi (Figura 16), senza e con etichetta x His C-terminale. In effetti, nel caso dei quattro cloni di pIJ86-kasOpe40, uno dei quattro cloni presentava un?attivit? E40 piuttosto elevata (150 AU/ml), uno presentava un?attivit? E40 di 40 AU/ml e gli altri due cloni presentavano attivit? zero (Figura 15 A). Analogamente, nel caso dei quattro cloni di pIJ86-kasOpe40His, un clone presentava un?attivit? E40 piuttosto elevata (51 AU/ml), un altro clone presentava un?attivit? E40 di 38 AU/ml e gli altri due cloni presentavano attivit? zero (Figura 15 B).
Analogamente, nel caso di quattro cloni di plasmidi pIJ86-vsie40pre, pIJ86-vsie40Hispre, pIJ86-vsie40HQHispre, pIJ86-vsie40mat, pIJ86-vsie40Hismat in S. lividans TK24, le attivit? di E40 sono state molto basse (fra 0,5 e 2,5 AU/ml) in tutti i cloni testati (Figure 16 A-D). Tali risultati sono stati inaspettati, dal momento che le loro controparti integrate a livello cromosomico in singola copia, pMU1s-e40 e pMU1se40His, presentavano un?attivit? E40 stabile ed elevata (Figura 14).
Esempio 12
Un?attivit? di E40 elevata si ? rilevata in tutti i quattro cloni con i plasmidi pMU1svsie40pre e pMU1s-vsie40Hispre, contenenti il promotore kasOp*, il RBS forte SR40, e la parte di pro-enzima di e40 fusa al peptide segnale vsi (Figura 17). Nel caso del plasmide pMU1s-vsie40pre, era presente attivit? di E40 pari a circa 50 AU/ml, e fino a 85 AU/ml in un clone (Figura 17A). Analogamente, con il plasmide pMU1svsie40Hispre, era presente attivit? E40 comparabile di circa 30 AU/ml in tre cloni, e di 84 AU/ml in un clone (Figura 17B). Sulla base del confronto di tali attivit? E40 con quelle di E40 dalle cellule coniugate con il plasmide integrativo di controllo a singola copia pMU1s-ermEe40 dell?Esempio 9, si rileva un aumento di circa 45 volte dell?attivit? di E40 per il costrutto pMU1s-vsie40pre (75 volte nel clone con attivit? massima) e un aumento di circa 26 volte dell?attivit? E40 per il costrutto pMU1svsie40Hispre (anche di 75 volte nel clone con attivit? massima). Mediante il confronto di tali cloni con i cloni aventi il plasmide ad alto numero di copie pIJ86/e40His in TK24, i due cloni migliori evidenziano un?attivit? E40 maggiore di 5,6 volte. Inoltre, tali cloni evidenziano un?elevata stabilit?.
Il plasmide pMU1s-vsie40HisHQpre, contenente il promotore kasOp*, il RBS forte, e la parte di pro-enzima di e40 con la mutazione 38His/Gln fusa al peptide segnale vsi, ha evidenziato un?attivit? di E40 parzialmente ridotta rispetto alla sua variante di tipo selvatico (circa 27 AU/ml).
Esempio 13
pMU1s-e40 e pMU1s-e40His sono stati coniugati nei ceppi mutanti di S. lividans RedStrep 1.3, 1.6 e 1.9. L?attivit? di E40 ? stata analizzata in quattro cloni indipendenti, unitamente ai quattro cloni analizzati in precedenza dell?Esempio 10 nel ceppo di tipo selvatico S. lividans TK24. Nel caso di pMU1s-e40, le attivit? di E40 erano chiaramente superiori in RedStrep 1.3 (75 ? 13 AU/ml) rispetto a TK24 (56 ? 7 AU/ml). Le attivit? di E40 erano altres? maggiori in RedStrep 1.6 (67 ? 24 AU/ml), ma le attivit? di E40 in RedStrep 1.9 erano simili a TK24 (52 ? 7 AU/ml) (Figura 18A). Nel caso di pMU1se40His, le attivit? di E40 erano simili in tutti i quattro ceppi; in WT TK24 (33 ? 7 AU/ml), in RedStrep 1.3 (29 ? 6 AU/ml), in RedStrep 1.6 (31 ? 7 AU/ml) e in RedStrep 1.9 (31 ? 7 AU/ml) (Figura 18B)
Esempio 14
pMU1s-vsie40pre e pMU1s-vsie40Hispre (contenenti il promotore kasOp*, il RBS forte SR40, e la parte di pro-enzima di e40 fusa al peptide segnale vsi) sono stati coniugati nei ceppi mutanti RedStrep 1.3, 1.6 e 1.9 e l?attivit? di E40 ? stata analizzata nei quattro cloni indipendenti, unitamente ai quattro cloni analizzati in precedenza dell?Esempio 12 nel ceppo di tipo selvatico S. lividans TK24. Le cellule ricombinanti sono state coltivate come nell?Esempio 8.
Nel caso del vettore pMU1s-vsie40pre, le attivit? di E40 erano maggiori in RedStrep 1.3 (40 ? 13,3 AU/ml) rispetto a TK24 (28,75 ? 6.2 AU/ml). Le attivit? di E40 in RedStrep 1.6 (29,75 ? 3,8 AU/ml) erano simili al ceppo WT TK24. (Figura 19A). Nel caso del vettore pMU1s-vsie40Hispre, le attivit? di E40 erano ancora maggiori in RedStrep 1.3 (30 ? 3,5 AU/ml) e simili in RedStrep 1.6 (24,75 ? 0,9 AU/ml), in RedStrep 1.6 (31 ? 7 AU/ml), ma minori in RedStrep 1.9 (22 ? 2,9 AU/ml) (Figura 19B).
I dati sperimentali evidenziano che i vettori integranti basati sull?integrasi del fago PhiBT1 (pMU1s-e40, pMU1s-e40His, pMU1s-vsie40pre, pMU1s-vsie40Hispre, pMU1s-vsie40HQHispre, pMU1s-vsie40mat, pMU1s-vsie40Hismat) conformemente all?invenzione consentono una produzione stabile ed elevata di E40. I vettori pMU1se40 e pMU1s-e40His, contenenti il promotore kasOp*, il RBS forte SR40 ottimale, la sequenza di peptidi segnali originali seguita da e40 o e40His originali rappresentano i vettori migliori, con una produzione media rispettiva di 50 AU/ml o 35 AU/ml di enzima. Inoltre, il ceppo migliore di cellula ospite per la produzione di E40 ? S. lividans RedStrep 1.3.

Claims (13)

RIVENDICAZIONI
1. Vettore ricombinante per l?espressione eterologa di una proteina ricombinante in una cellula ospite Streptomyces recante una cassetta di espressione comprendente:
un promotore, un elemento di regolazione e un polinucleotide che codifica una proteina ricombinante operativamente legata a detti promotore ed elemento di regolazione; in cui:
- detto promotore ? un promotore kasO modificato (kasOp*) avente sequenza SEQ ID N: 10;
- detto elemento di regolazione ? un sito legante ribosomi (RBS) SR40 sintetico ottimizzato avente sequenza SEQ ID N: 11;
- il polinucleotide che codifica la proteina ricombinante di interesse codifica una proteina ricombinante che include un peptide segnale N-terminale; e - il vettore ricombinante ? un vettore integrante in singolo sito.
2. Vettore ricombinante secondo la rivendicazione 1, in cui la proteina ricombinante ? un?endopeptidasi di Actinoallomurus di sequenza comprendente o consistente in SEQ ID N: 1; un frammento biologicamente attivo di E40; una variante allelica presente in natura di E40; o un?endopeptidasi di sequenza avente almeno il 60%, il 70%, l?80%, il 90% o il 95% di identit? con SEQ ID N: 1.
3. Vettore ricombinante secondo la rivendicazione 2, in cui la proteina ricombinante ? un?endopeptidasi di Actinoallomurus con tag di istidina di sequenza comprendente SEQ ID N: 2.
4. Vettore ricombinante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 2, in cui il peptide segnale ? un peptide segnale vsi di inibitore di subtilisina di Streptomyces venezuelae, avente sequenza SEQ ID N: 12.
5. Vettore ricombinante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui il polinucleotide che codifica la proteina ricombinante ? di sequenza comprendente SEQ ID N: 5, 6, 15, 16, 17 o 18.
6. Vettore ricombinante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui la cassetta di espressione ? di sequenza SEQ ID N: 20, 21, 22 o 23.
7. Vettore ricombinante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, essendo un vettore che si integra in corrispondenza del sito attB di Streptomyces.
8. Vettore di espressione secondo la rivendicazione 7, essendo un vettore di sequenza SEQ ID N: 25, 26, 27 o 28.
9. Cellula ospite Streptomyces, preferibilmente cellula ospite S. lividans, per l?espressione eterologa di una proteina ricombinante comprendente il vettore di espressione secondo le rivendicazioni 1-8.
10. Cellula ospite secondo la rivendicazione 9, essendo una cellula ospite S. lividans di ceppo Tk24 o di ceppo RedStrep 1.3, 1.6 o 1.9.
11. Cellula ospite secondo la rivendicazione 9, essendo una cellula ospite S. lividans di ceppo DSM 33930 o DSM 33931.
12. Uso del vettore ricombinante secondo le rivendicazioni 1-8 o della cellula ospite secondo le rivendicazioni 9-11, per la produzione di una proteina ricombinante, in cui la proteina ricombinante ? secreta nel terreno di coltura della cellula ospite.
13. Metodo di produzione di una proteina ricombinante, comprendente:
i. fornire una cellula ospite ricombinante comprendente il vettore di espressione ricombinante secondo le rivendicazioni 1-8;
ii. coltivare la cellula ospite ricombinante in un terreno di coltura in idonee condizioni di crescita;
iii. recuperare la proteina ricombinante espressa dalla cellula ospite ricombinante dal terreno di coltura.
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