CN109804072A

CN109804072A - 地衣芽孢杆菌中flp介导的基因组整合

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Publication number: CN109804072A
Application number: CN201780062901.5A
Authority: CN
Inventors: S·T·约根森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2016-10-25
Filing date: 2017-10-23
Publication date: 2019-05-24
Also published as: EP3532619A1; US20190276855A1; WO2018077796A1

Abstract

本发明涉及用于使用衍生自酿酒酵母的FLP/FRT系统或其同源物或变体将至少一种目的多核苷酸以位点特异性方式整合至地衣芽孢杆菌宿主细胞的染色体中的方法。

Description

地衣芽孢杆菌中FLP介导的基因组整合

序列表的引用

本申请包含处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

背景技术

已经发现大量的天然存在的生物体产生有用的多肽产物，例如酶，希望酶的大规模生产以用于研究和商业目的。一旦鉴定出这样一种多肽产物，通常会努力开发具有改善的生产力的制造方法。一种广泛使用的基于重组DNA技术的方法是克隆编码该产物的基因并将该基因插入至合适的表达系统中，以便在有益于产物表达的条件下，在合适的宿主细胞中表达该产物(整合在染色体中或作为染色体外实体)。

不管使用哪种生产方法，通常希望提高给定多肽或蛋白质的生产水平。因此，正在做出努力以增加产量，例如，通过在强表达信号的控制下插入编码该产物的基因、增加转录的mRNA的稳定性或通过增加所讨论的生产生物体中该基因的拷贝数目。该后一种方法可以通过将该基因插入多拷贝质粒(然而，所述多拷贝质粒在所讨论的宿主细胞中通常倾向于不稳定)，或者通过将该基因的多个拷贝整合到该生产生物体的染色体中(这种方法通常被认为更有吸引力，因为构建体的稳定性倾向于更高)中来实现。

已经描述了宿主细胞的构建，其中，高表达的染色体基因被替换为位点特异性重组酶的识别序列，以通过使用识别所述序列(EP 1 405 908 A1；ProBioGen AG)的重组酶来允许随后将编码单一产物的多核苷酸插入该位点。

已经披露在基因组的已知位置插入DNA(O'Gorman等人,1991Science[科学],251:1351-55；Baubonis和Sauer,1993Nucl.,Acids Res.[核酸研究],21:2025-29；Albert等人,1995Plant J.[植物杂志],7:649-59)。这些方法利用自由可逆的位点特异性重组系统。这些可逆系统包括以下项：来自噬菌体P1的Cre-lox系统(Baubonis和Sauer,1993,见上文；Albert等人,1995Plant J.[植物杂志],7549-59)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的FLP-FRT系统(O'Gorrnan等人,1991,见上文)、鲁氏结合酵母(Zygosaccharonzycesrouxii)的R-RS系统(Onouchi等人,1995Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]247:653-660)、来自噬菌体Mu的Gin-gix系统(Maeser和Kahmann,1991 Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学],230:170-76)、来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)质粒的β-重组酶-六系统(Diaz等人,1999J.Biol.Chem[生物化学杂志].274:6634-6640)以及来自细菌转座子Tn1000的δ-γ-res系统(Schwikardi和Dorge,2000 E B S let.471:147-150)。Cre、FLP、R、Gin、β-重组酶和γ-Δ是重组酶，并且lox、FRT、RS、gix、six和res是各自的重组位点(由以下做了综述：Sadowslu,1993,FASEB J.[美国实验生物学会联合会杂志],7:750-67；Ow和Medberry,1995,Crit.Rev.Plant Sci.[植物科学评论],14:239-261)。

多重Cre/lox重组允许选择性位点特异性DNA靶向酵母基因组中的天然和工程化位点二者(Sauer,B.Nucleic Acids Research.[核酸研究]1996,卷24(23):4608-4613)。已经表明具有天然附着位点，attB，以及异位引入的attB位点的宿主细胞被链霉菌属噬菌体ΦC31的衍生物感染导致该噬菌体整合至两个attB位点中(Smith等人.2004.Switchingthe polarity of a bacteriophage integration system[切换噬菌体整合系统的极性].Mol Microbiol[分子微生物学]51(6):1719-1728)。可以使用Mx9噬菌体转化系统将基因的多个拷贝引入包含由Mx9整合酶识别的多个附着位点的细胞中(WO 2004/018635 A2)。温和乳球菌噬菌体TP901-1整合酶和识别序列是充分表征的(Breüner等人(1990)NovelOrganization of Genes Involved in Prophage Excision Identified in theTemperate Lactococcal Bacteriophage TP901-1[在温和乳球菌噬菌体TP901-1中鉴定的涉及原噬菌体切除的基因的新颖组织].J Bacteriol[细菌学杂志]181(23):7291-7297；Breüner等人.2001.Resolvase-like recombination performed by the TP901-1integrase[由TP901-1整合酶进行的分解酶样重组].Microbiology[微生物学]147:2051-2063)。

以上位点特异性重组系统的共同之处在于单一多肽重组酶催化相同或几乎相同的序列的两个位点之间的重组的属性。每个重组位点由短的不对称间隔区序列(链交换在此发生)组成，侧翼为重组酶结合处的反向重复序列。间隔区序列的不对称性给予了重组位点方向，并表明了重组反应的结果。直接或间接定向位点之间顺式重组分别切除或颠倒间插DNA。位点之间的反式重组造成两个线性DNA分子的相互易位，或者如果两个分子中的至少一个是环状则造成这两个分子的共整合。由于通过重组生成的产物位点本身是随后重组的底物，因此该反应是自由可逆的。然而，在实践中，切除基本上是不可逆的，因为两个重组位点紧密连接处的分子内相互作用的概率远高于未连接位点之间的分子间相互作用。推论是插入至基因组重组位点的DNA分子将容易地被切除。

之前已经在芽孢杆菌属宿主中示出了通过位点特异性和瞬时表达的温和乳球菌噬菌体TP901-1整合酶对无启动子可读框或操纵子的多个拷贝同时进行基因组整合(WO2006/042548)。

仍然，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是用于制造例如酶的优选的工业生产宿主之一，并且对适用于在地衣芽孢杆菌中使用的有效位点特异性重组系统仍然有高需求。

技术领域

本发明涉及用于使用衍生自酿酒酵母的FLP/FRT系统或者其同源物或变体将至少一种目的多核苷酸以位点特异性方式整合至地衣芽孢杆菌宿主细胞的染色体中的方法。

发明内容

本发明涉及用于将至少一种目的多核苷酸以位点特异性方式整合至地衣芽孢杆菌宿主细胞的染色体中的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供地衣芽孢杆菌宿主细胞，该地衣芽孢杆菌宿主细胞在其染色体中包含至少一个整合位点，每个整合位点包含一对来自酿酒酵母的位点特异性翻转酶重组酶FLP或其同源物的识别序列；

(b)向所述细胞中引入核酸构建体，该核酸构建体也包含该位点特异性重组酶的识别序列对，所述序列对位于该目的多核苷酸的侧翼；

(c)在该细胞中表达位点特异性FLP重组酶或其同源物，由此通过该FLP重组酶将该至少一个染色体识别序列对与该核酸构建体的相应识别序列对重组，以产生包含至少一种以位点特异性方式整合到该细胞的染色体中的目的多核苷酸的地衣芽孢杆菌宿主细胞。

附图说明

图1示出了实例11的DNA区段，该区段含有来自苏云金芽孢杆菌cry3A基因的mRNA稳定化元件，随后是FRT-F位点、具有核糖体结合位点的绿色荧光蛋白(gfp)CDS和FRT-F3位点；核酸序列提供于SEQ ID NO:16中。

定义

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由可读框确定，该可读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。这类控制序列包括但不限于前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、和转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制性酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，所述物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分增加物质的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组产生；编码所述物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码所述物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单-链或双链的核酸分子，所述核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或是合成的，所述核酸分子包含一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列引导该编码序列的表达。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunschalgorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：

(同一的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人,2000,见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：

(同一的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

具体实施方式

如上文已经提到的，本发明涉及用于将至少一种目的多核苷酸以位点特异性方式整合至地衣芽孢杆菌宿主细胞的染色体中的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供地衣芽孢杆菌宿主细胞，该地衣芽孢杆菌宿主细胞在其染色体中包含至少一个整合位点，每个整合位点包含一对来自酿酒酵母的位点特异性翻转酶重组酶FLP或者其同源物或变体的识别序列；

位点特异性重组酶及其识别序列对来自酿酒酵母FLP-FRT系统。在一个具体的实施例中，FLP重组酶是如描述于以下文献中的FLP重组酶变体：Buchholz,Frank,Improvedproperties of FLP recombinase evolved by cycling mutagenesis[通过循环诱变进化的FLP重组酶的改善的特性],Nature Biotechnology[自然生物技术]第16卷，第7期(1998-07-01)p.657-662。在另一个具体的实施例中，FLP重组酶是热稳定的重组酶变体，其被指定为“FLPe”，具有氨基酸改变P2S、L33S、Y108N、S294P；FLPe的核酸序列和相应的氨基酸序列分别示于WO 2012/160093的SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:107中。

在第一方面的优选的实施例中，目的多核苷酸包含编码至少一种目的多肽的操纵子或可读框。

优选地，该目的多肽包含酶，优选地是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶；更优选地是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、或β-木糖苷酶。

在另一个优选的实施例中，选择或筛选标志位于至少一个整合位点中的识别序列对之间；优选地，标志是编码荧光多肽的基因，以便实现非荧光细胞的选择，其中目的多核苷酸已经被整合到每个整合位点中。

优选地，该核酸构建体进一步包含引入的选择标志和编码FLP重组酶或其同源物的多核苷酸。

可替代地，优选的是将第二核酸构建体引入所述步骤(b)中的细胞中，该第二核酸构建体属于非复制型或温度敏感复制型，并且包含编码FLP重组酶或其同源物的多核苷酸以及选择标志，该选择标志使正选择或负选择成为可能或者是可双向选择的，并且分别通过在允许的温度下的选择压力或生长被瞬时维持在所述细胞中，使得该重组酶可以在步骤(c)中瞬时表达。

作为第三个优选的可替代实施例，步骤(a)中的细胞在其染色体中包含至少一个编码与严格调控的启动子可操作地连接的重组酶的多核苷酸的拷贝，可通过改变生长条件而开启和关闭该启动子，从而使步骤(c)中位点特异性重组酶的瞬时表达成为可能。

在优选的实施例中，该识别序列对由两种不同的识别序列组成，优选的是与其衍生物组合的野生型FRT序列，更优选的是与选自下组的识别序列变体组合的野生型FRT序列，该组由以下组成：FRT-F、FRT-F3、FRT-F10、FRT-F13、FRT-F14、FRT-F15、FRT-Fa和FRT-F3a。FRT-F和FRT-F3序列披露于WO 2012/160093中。还参见Turan等人,2010,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]402:52-69，将其全部内容结合在此。

可以清楚预期的是，本发明的方法将允许在地衣芽孢杆菌宿主细胞的几个染色体整合位点处同时进行位点特异性整合，以产生多拷贝宿主细胞。

因此，在一个优选的实施例中，步骤(a)的地衣芽孢杆菌宿主细胞在其染色体中包含两个或更多个整合位点，并且产生了包含两个或更多个以位点特异性方式整合至该细胞的染色体中的目的多核苷酸的地衣芽孢杆菌宿主细胞；优选地，步骤(a)的地衣芽孢杆菌宿主细胞在其染色体中包含三个或更多个整合位点；更优选地四个或更多个、五个或更多个、或者七个或更多个整合位点，并且其中产生了包含三个、四个、五个、六个或更多个以位点特异性方式整合至该细胞的染色体中的目的多核苷酸的地衣芽孢杆菌宿主细胞。

核酸构建体

本发明还涉及包含与一个或多个控制序列可操作地连接的目的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导所编码的目的多肽在合适的宿主细胞中的表达。

可用许多方式操作所述多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

该控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，其介导该多肽的表达。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以是从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,基因69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Useful proteins fromrecombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和在Sambrook等人,1989,同上。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。

控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。

细菌宿主细胞的优选终止子从针对以下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。

所述控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区域，它增加所述基因的表达。

合适的mRNA稳定子区的实例从以下获得：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。

控制序列也可为编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5'-端可固有地包含在翻译阅读框中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5'-端可包含对于编码序列为外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替换天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837生麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。

控制序列也可以是编码位于多肽N-末端处的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列两者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的N-末端且该信号肽序列位于紧邻该前肽序列的N-末端。

也可为希望的是添加调节序列，该调节序列调节宿主细胞生长相关的多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节序列包括lac、tac、和trp操纵子系统。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。

表达载体

本发明还涉及包含编码目的多肽的目的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可包括一个或多个便利的限制位点以允许编码该多肽的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以包含用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同包含待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。

载体优选地包含允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标志。选择性标志是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。

细菌选择性标志的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标志。

载体优选地包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可包含用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当包含足够数目的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，所述核酸与对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体还可以另外包含复制起点，所述复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。

可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标志基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标志基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。

用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,见上文)。

宿主细胞

本发明还涉及重组地衣芽孢杆菌宿主细胞，其包含一种或多种可操作地连接到一个或多个控制序列的目的多核苷酸，所述控制序列指导根据本发明的方法以位点特异性方式整合到其染色体中的目的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，从而该构建体或载体被维持为染色体整合体，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829；或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)或接合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人,1988,Nucleic AcidsRes.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人,2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、接合(参见例如，Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见例如，Burke等人，2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可以通过以下来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可以通过以下来实现：天然感受态(naturalcompetence)(参见例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见，例如，Buckley等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域中已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

产生方法

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本所得的发明的重组宿主细胞；和任选地(b)回收该多肽。

宿主细胞是在适合使用本领域已知的方法产生多肽的营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵器中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，该培养在合适的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的合适的营养介质中。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽被分泌到该营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收该多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。

可以使用本领域已知的对于多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定多肽的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规方法，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基回收多肽。在一方面，回收包含多肽的发酵液。

可以通过本领域已知的多种程序纯化多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和尺寸排阻)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如，ProteinPurification[蛋白质纯化],Janson和Ryden编辑,VCH Publishers[VCH出版公司],纽约,1989)。

在一个替代性方面，不回收多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作多肽的来源。

实例

材料与方法

用作缓冲液和底物的化学品是至少试剂级的商业产品。

使用标准教科书程序，采用商业热循环仪和来自商业供应商的Ready-To-Go PCRbeads，Phusion聚合酶或RED-TAQ聚合酶进行PCR扩增。

LB琼脂：参见EP 0 506 780。

LBPSG琼脂板含有LB琼脂，补充有磷酸盐(0.01M K3PO4)、葡萄糖(0.4％)和淀粉(0.5％)；参见EP 0 805 867B1。

TY(液体肉汤培养基；参见WO 94/14968,p16。

寡核苷酸引物获得自DNA技术(奥尔胡斯，丹麦)。用可商购的试剂盒和试剂，使用标准教科书程序进行DNA操作(质粒和基因组DNA制备、限制性消化、纯化、连接、DNA测序)。

在一些情况下，使用来自通用电气医疗集团(GE Healthcare)的TempliPhi试剂盒，在等温滚环扩增反应中扩增连接混合物。

按照教科书或制造商的程序，使用化学感受态细胞或电穿孔将DNA引入到大肠杆菌中。

使用两步式程序(Yasbin等人,1975,J.Bacteriol.[细菌学杂志]121:296-304.)或一步式程序将DNA引入到枯草芽孢杆菌经提炼的天然感受态细胞中，其中将来自琼脂板的细胞材料再悬浮于Spizisen 1培养基(12ml)(WO 2014/052630)中，在37℃以200rpm振荡约4小时，将DNA添加至400微升等分试样中，并且在选择性琼脂板上铺板之前，将这些等分试样在所希望的温度下，以150rpm振荡另外1小时。

使用含有pLS20的经修饰的枯草芽孢杆菌供体菌株PP3724，基本上如之前所描述的(EP 2029732 B1)，通过来自枯草芽孢杆菌的接合，将DNA引入到地衣芽孢杆菌中，其中甲基化酶基因M.bli1904II(US 20130177942)从在amyE基因座处的三联启动子表达，pBC16衍生的orfβ和枯草芽孢杆菌comS基因(和卡那霉素抗性基因)从在alr基因座处的三联启动子表达(使得需要D-丙氨酸菌株)，并且枯草芽孢杆菌comS基因(和cat基因)从在pel基因座处的三联启动子表达。

枯草芽孢杆菌JA1343：JA1343是PL1801的孢子形成阴性衍生物(WO 2005042750)。部分spollAC基因已经被删除，以获得孢子形成阴性表型。

大肠杆菌TG1：TG1是常用的克隆菌株并且从商业供应商获得；其具有下列基因型：F'[traD36laclq A(lacZ)M15proA+B+]glnV(supE)thi-1A(mcrB-hsdSM)5(rK-mK-McrB-)thi A(lac-proAB)。

质粒pPP4758被用作dsRED基因的来源。它是大肠杆菌/枯草芽孢杆菌穿梭载体，由pUC19和pE194载体片段组成，并携带amyL-启动子衍生物-dsRED构建体，通过PCR从该构建体克隆区段。在相关的各个实例中给出了这些片段的DNA序列。

实例1.限制性缺陷型地衣芽孢杆菌宿主菌株的构建

地衣芽孢杆菌菌株SJ8071(WO 2007/138049；实例1)被用作产生限制性缺陷型菌株的宿主。

简言之，基本上如之前所描述的(WO 2007/138049)，通过来自SJ8105(含有pMDT139的接合供体菌株PP289-5)的接合将缺失质粒pMDT139(US 7820408)引入到SJ8071中，分离TetS转移接合子，在50℃将它们铺板到具有红霉素(5微克/ml)的LBPGS板上，将在50℃形成的菌落涂布在不含抗生素的LBPGS板上，并在34℃繁殖，并且通过进一步再分离和影印铺板检查ErmS。用引物pab154和pab156以及69℃的退火温度，使用标准教科书程序，通过PCR检查红霉素敏感型菌落中是否存在Bli1904II缺失。在所测试的60个菌落中，发现4个具有该缺失。将两个缺失菌株保持为SJ12850和SJ12851。

引物Pab154：5’-ACCACTCCTTTTTCTTTTTGGCTCAT(SEQ ID NO:1)

引物Pab156：5’-ACCTCCAATCAAAATGTCCAGTTCAG(SEQ ID NO:2)

实例2.携带FRT-F–cat–FRT-F3的载体pSJ12964的构建

为了使cat基因的侧翼为FRT-F和FRT-F3位点，设计了掺入这些位点的寡核苷酸，用于cat基因的扩增。

作为cat基因的来源，菌株PP4573(最初衍生自pC194)得以使用。该菌株含有从pDN1050克隆的经染色体整合的cat基因(Diderichsen等人,1993,Plasmid[质粒]30(3):312-315)。pDN1050具有在EMBL:Z22671中给出的DNA序列，并且在如下所述的扩增后插入到FRT-F和FRT-F3位点之间的区域从Z22671中的位置444延伸至位置1334。

寡核苷酸#B438是cat基因区段的正向引物，其掺入用于克隆的FRT-F位点和限制性位点EcoRI、BamHI和SalI，而寡核苷酸#B439是cat基因区段的反向引物，其掺入用于克隆的FRT-F3位点和限制性位点HindIII、BamHI、XbaI、SalI和EspI。

引物#B438：

5’-GACTGAATTCGGATCCGTCGACGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCCTGGGACCAATAATAATGACTAG(SEQ ID NO:3)

引物#B439：

5’-GACTAAGCTTGGATCCTCTAGAGTCGACGCTTAGCGAAGTTCCTATACTATTTGAAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCGACTGTAAAAAGTACAGTCGGC(SEQ ID NO:4)

质粒pSJ8017(EP 2029732B1)是携带来自地衣芽孢杆菌cat基因座(catL)的3'和5'区段的温度敏感型复制子，并且已经被用于引入地衣杆菌cat基因的缺失。它也可用于通过双同源重组在染色体catL基因座处插入异源DNA。

为了将由FRT-F–cat–FRT-F3组成的盒插入到该质粒中(位于该地衣杆菌3'和5'catL区段之间)，使用引物B438+B439，对来自PP4573菌株的cat基因进行PCR扩增，并且用SalI消化所得的约1kb片段。将该SalI片段连接到经5.3kb SalI消化的pSJ8017上，将连接混合物引入到枯草芽孢杆菌JA1343感受态细胞中，并将所得菌株保持为SJ12964(JA1343/pSJ12964)。通过DNA测序证实PCR扩增区段的正确性。

通过将pSJ12964引入到枯草芽孢杆菌PP3724天然感受态细胞中，构建适合通过接合转移pSJ12964的菌株，进行红霉素抗性选择(2微克/ml)。将4个菌落合并并且作为SJ12989＝PP3724/pSJ12964冷冻。

实例3.在catL区段之间携带FRT-F–cat::dsRED–FRT-F3的载体pSJ13011至pSJ13015的构建

pPP4758被用作dsRED基因的来源。在一种为了使dsRED基因的侧翼为FRT-F和FRT-F3位点的方法中，将dsRED基因插入到pSJ12964中的侧翼为FRT的cat基因中并且因此使该cat基因失活。使用引物#B452+#B453，从质粒pPP4758对dsRED基因进行PCR扩增，dsRED基因在其经扩增的片段的任一端掺入NcoI位点。引物B452：5’-GACTGAATTCCATGGTATCAGTTTGAAAATTATGTATTATG(SEQ ID NO:5)引物B453：5’-GACTAAGCTTGGATCCATGGGAAGTCTGGTCTCTTAAAGAAAA(SEQ ID NO:6)

用NcoI消化约750bp经扩增的片段并连接到经NcoI消化的pSJ12964，该pSJ12964在cat基因内具有独特的NcoI位点。根据制造商的说明书，使用TempliPhi聚合酶试剂盒处理(扩增)连接混合物，并将该经扩增的连接混合物用于枯草芽孢杆菌JA1343感受态细胞的转化。分离着红色的菌落，并通过限制性消化分析它们的质粒。5个菌落保持为：SJ13011(JA1343/pSJ13011)、SJ13012(JA1343/pSJ13012)、SJ13013(JA1343/pSJ13013)、SJ13014(JA1343/pSJ13014)以及SJ13015(JA1343/pSJ13015)。

质粒pSJ13013似乎在可能的方向之一上具有双插入物，pSJ13012和pSJ13014似乎在另一个方向上具有单插入物，并且pSJ13011和pSJ13015似乎在该另一个方向上具有双插入物。

含有750bp NcoI片段的dsRED的DNA序列，如存在于pSJ13012中，示出于SEQ IDNO:7中。

通过将质粒引入到枯草芽孢杆菌PP3724感受态细胞中，构建适合通过接合对pSJ13011至pSJ13015进行转移的菌株，进行红霉素抗性选择(2微克/ml)。从每次转化中，合并4个菌落并作为如下冷冻：

·SJ13037＝PP3724/pSJ13011。

·SJ13038＝PP3724/pSJ13012。

·SJ13039＝PP3724/pSJ13013。

·SJ13040＝PP3724/pSJ13014。

·SJ13041＝PP3724/pSJ13015。

实例4.在catL区段之间携带FRT-F–cat::spc–FRT-F3的载体pSJ13016和pSJ13017的构建

在一种使spc基因(赋予大观霉素抗性)的侧翼为FRT-F和FRT-F3位点的方法中，使用cat基因内独特的MfeI和NcoI位点将spc基因插入到pSJ12964中侧翼为FRT的cat中并且因此使该cat基因失活。使用引物#B448+#B449，从质粒pSJ3358(US5882888)对spc基因进行PCR扩增，该spc基因在经扩增的片段中掺入上游MfeI和下游NcoI位点。

引物B448：5’-GACTGAATTCCATGGCAATTGCGTATAATAAAGAATAATTATTAATCT(SEQ IDNO:8)

引物B449：5’-GACTAAGCTTCAATTGGATCCATGGACTAAATTAAAGTAATAAAGCGTTCT(SEQID NO:9)

将约1.1kb经扩增的片段用MfeI+NcoI消化并连接到经MfeI+NcoI消化的pSJ12964上。根据制造商的说明书，使用TempliPhi聚合酶试剂盒处理(扩增)连接混合物，并将该经扩增的连接混合物用于枯草芽孢杆菌JA1343感受态细胞的转化。通过限制性消化分离并分析大观霉素抗性的氯霉素敏感型菌落，并将两个正确的克隆保持为SJ13016(JA1343/pSJ13016)和SJ13017(JA1343/pSJ13017)。

通过将质粒引入到枯草芽孢杆菌PP3724感受态细胞中，构建适合通过接合转移pSJ13016和pSJ13017的菌株，进行红霉素抗性选择(2微克/ml)。从每次转化中，合并4个菌落并作为如下冷冻：

·SJ13042＝PP3724/pSJ13016。

·SJ13043＝PP3724/pSJ13017。

实例5.在catL区段之间携带FRT-F–cat::kan–FRT-F3的载体pSJ13018和pSJ13019的构建。

在一种使kan基因(赋予卡那霉素抗性)的侧翼为FRT-F和FRT-F3位点的方法中，使用cat基因内独特的MfeI和NcoI位点将kan基因插入到pSJ12964中侧翼为FRT的cat基因中并且因此使该cat基因失活。使用引物#B450+#B451，从质粒pSJ3316(专利US 5882888)对kan基因进行PCR扩增，该kan基因在其扩增的片段掺入上游MfeI和下游NcoI位点。

引物B450：5’-GACTGAATTCCATGGCAATTGGGCCAGTTTGTTGAAGATTAGA(SEQ ID NO:10)

引物B451：5’-GACTAAGCTTCAATTGGATCCATGGCCAACATGATTAACAATTATTAGAG(SEQ IDNO:11)

将约1kb经扩增的片段用MfeI+NcoI消化并连接到经MfeI+NcoI消化的pSJ12964上。根据制造商的说明书，使用TempliPhi聚合酶试剂盒处理(扩增)连接混合物，并将该经扩增的连接混合物用于枯草芽孢杆菌JA1343感受态细胞的转化。通过限制性消化分离并分析卡那霉素抗性的氯霉素敏感型菌落，并将两个正确的克隆保持为SJ13018(JA1343/pSJ13018)和SJ13019(JA1343/pSJ13019)。

通过将质粒引入到枯草芽孢杆菌PP3724感受态细胞中，构建适合通过接合转移pSJ13018和pSJ13019的菌株，进行红霉素抗性选择(2微克/ml)。从每次转化中，合并4个菌落并作为如下冷冻：

·SJ13044＝PP3724/pSJ13018。

·SJ13045＝PP3724/pSJ13019。

实例6.在catL区段之间携带FRT-F–PamyL_4199-dsRED–FRT-F的载体pSJ13046和pSJ13047的构建。

质粒pPP4758被用作dsRED基因扩增的PCR模板。为了使dsRED基因的上游和下游的侧翼都为FRT-F位点，设计了掺入这些位点的寡核苷酸，用于dsRED基因的扩增。寡核苷酸#B435是dsRED基因区段的正向引物，其掺入用于克隆的FRT-F位点和限制性位点EcoRI、BamHI和SalI，而寡核苷酸#B436是dsRED基因区段的反向引物，其掺入用于克隆的FRT-F位点和限制性位点HindIII、BamHI、XbaI、SalI和EspI。

引物B435：

5’-GACTGAATTCGGATCCGTCGACGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCATAAATGAGTAGAAAGCGCCATATC(SEQ ID NO:12)

引物B436：

5’-GACTAAGCTTGGATCCTCTAGAGTCGACGCTTAGCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCCTTTAGTGTCAATTGGAAGTCTG(SEQ ID NO:13)

利用引物B435+B436，将来自质粒pPP4758的dsRED基因进行PCR扩增，并且将所得约1kb片段用SalI消化。将该SalI片段连接到经5.3kb SalI消化的pSJ8017上，将连接混合物引入到枯草芽孢杆菌JA1343感受态细胞中，并将两种所得菌株(形成红色菌落，表明dsRED蛋白质的产生)保持为SJ13046(JA1343/pSJ13046)和SJ13047(JA1343/pSJ13047)。在这些质粒上的经PCR扩增的插入物通过DNA测序被证实是正确的。

pSJ13046中含有SalI插入物的FRT-F–PamyL_4199-dsRED-FRT-F的DNA序列示出于SEQ ID NO:14中。

通过将质粒引入到枯草芽孢杆菌PP3724感受态细胞中，构建适合通过接合转移pSJ13046和pSJ13047的菌株，进行红霉素抗性选择(2微克/ml)。从每次转化中，合并4个菌落并作为如下冷冻：

·SJ13058＝PP3724/pSJ13046。

·SJ13059＝PP3724/pSJ13047。

实例7.在catL区段之间携带FRT-F–PamyL_4199-dsRED–FRT-F3的载体pSJ13048的构建

质粒pPP4758被用作dsRED基因扩增的PCR模板。为了使dsRED基因的上游和下游的侧翼为不同的FRT-F位点，设计了掺入这些位点的寡核苷酸，用于dsRED基因的扩增。寡核苷酸#B435是dsRED基因区段的正向引物，其掺入用于克隆的FRT-F位点和限制性位点EcoRI、BamHI和SalI，而寡核苷酸#B437是dsRED基因区段的反向引物，其掺入用于克隆的FRT-F3位点和限制性位点HindIII、BamHI、XbaI、SalI和EspI。

引物B435：见实例6。

引物B437：

5’-GACTAAGCTTGGATCCTCTAGAGTCGACGCTTAGCGAAGTTCCTATACTATTTGAAGAA

TAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCCTTTAGTGTCAATTGGAAGTCTG(SEQ ID NO:15)

利用引物B435+B437，将来自质粒pPP4758的dsRED基因进行PCR扩增，并且将所得约1kb片段用SalI消化。将该SalI片段连接到经5.3kb SalI消化的pSJ8017上，将连接混合物引入到枯草芽孢杆菌JA1343感受态细胞中，并将所得菌株(形成红色菌落)保持为SJ13048(JA1343/pSJ13048)。DNA测序证实了该质粒上FRT-F和FRT-F3区段的正确性。

通过将质粒引入到枯草芽孢杆菌PP3724感受态细胞中，构建适合通过接合转移pSJ13048的菌株，进行红霉素抗性选择(2微克/ml)。将4个菌落合并并且作为SJ13060＝PP3724/pSJ13048冷冻。

实例8.FRT-F–cat::标志–FRT-F3区段整合到地衣芽孢杆菌catL基因座中

供体菌株SJ13037至SJ13041(具有如下构建体，该构建体在catL区段之间具有FRT-F–cat::dsRED–FRT-F3)、SJ13042-43(具有如下构建体，该构建体在catL区段之间具有FRT-F cat::spc–FRT-F3)和SJ13044-45(具有如下构建体，该构建体在catL区段之间有FRT-F–cat::kan–FRT-F3)被用于与SJ12850和SJ12851中的每种的接合中(基本上如之前所描述的)，对红霉素抗性进行选择(2微克/ml)。

将转移接合子涂布在具有红霉素(2微克/ml)LBPGS板上，并且在50℃孵育，以便选择具有质粒染色体整合的菌株。随后，将此类菌落在34℃在LBPSG板上繁殖以进行多次转移，并进行复制，以便寻找已经丢失整合的质粒但保留了红色(表明dsRED的存在)或大观霉素或卡那霉素抗性(视情况而定)的红霉素敏感型菌株。最终，分离了多个菌株：

·SJ13049：SJ12851/SJ13037：SJ12851 3'catL、FRT-F、cat::dsRed、FRT-F3、5'catL。

·SJ13055：SJ12850/SJ13045：SJ12850 3'catL、FRT-F、cat::kan、FRT-F3、5'catL

·SJ13056：SJ12850/SJ13045：SJ12850 3'catL、FRT-F、cat::kan、FRT-F3、5'catL

·SJ13057：SJ12851/SJ13045：SJ12851 3'catL、FRT-F、cat::kan、FRT-F3、5'catL

·SJ13096：SJ12850/SJ13037：SJ12851 3'catL、FRT-F、cat::dsRed、FRT-F3、5'catL。

·SJ13097：SJ12850/SJ13041：SJ12851 3'catL、FRT-F、cat::dsRed、FRT-F3、5'catL。

·SJ13098：SJ12850/SJ13042：SJ12850 3'catL、FRT-F、cat::spc、FRT-F3、5'catL

·SJ13099：SJ12850/SJ13043：SJ12850 3'catL、FRT-F、cat::spc、FRT-F3、5'catL

·SJ13100：SJ12851/SJ13042：SJ12851 3'catL、FRT-F、cat::spc、FRT-F3、5'catL

·SJ13101：SJ12851/SJ13043：SJ12851 3'catL、FRT-F、cat::spc、FRT-F3、5'catL

实例9.FRT-F–PamyL_4199-dsRED–FRT-F区段整合到地衣芽孢杆菌catL基因座中

通过来自枯草芽孢杆菌供体菌株SJ13058和SJ13059的接合(基本上如之前所描述的)，将载体pSJ13046和pSJ13047(其在catL上游和下游片段之间携带FRT-F–PamyL_4199-dsRED–FRT-F区段)引入到地衣芽孢杆菌菌株SJ13055、SJ13056和SJ13057(其在catL上游和下游片段之间具有经染色体整合的FRT-F,cat::kan,FRT-F3区段)和地衣芽孢杆菌菌株SJ12850和SJ12851(具有经染色体整合的catL上游和下游片段)中，并且接着对引入的质粒进行染色体整合/切除(经由对质粒和宿主菌株来说是共有的catL上游和下游区段)。

在50℃，在具有红霉素(2微克/毫升)的LBPGS琼脂板上铺板和形成菌落，然后在34℃在不含抗生素的LBPGS琼脂板上繁殖此类菌落，以允许质粒复制并从染色体切除(如果对于数次转移是必需的，铺板单菌落)并分离所得的红霉素敏感型染红色的菌株后获得整合物菌株。对于衍生自SJ13055-57宿主的菌株，还测试了候选菌落的卡那霉素敏感性。

将所得菌株(在其染色体中在catL上游和下游片段之间含有FRT-F–PamyL_4199-dsRED–FRT-F区段)保持为：

·SJ13103：来自SJ13055，通过整合/切除通过来自SJ13059的接合而引入的pSJ13047。

·SJ13104：来自SJ13055，通过整合/切除通过来自SJ13059的接合而引入的pSJ13047。

·SJ13105：来自SJ13055，通过整合/切除通过来自SJ13059的接合而引入的pSJ13047。

·SJ13106：来自SJ13055，通过整合/切除通过来自SJ13059的接合而引入的pSJ13047。

·SJ13114：来自SJ12850，通过整合/切除通过来自SJ13058的接合而引入的pSJ13046。

·SJ13115：来自SJ12850，通过整合/切除通过来自SJ13058的接合而引入的pSJ13046。

·SJ13116：来自SJ12850，通过整合/切除通过来自SJ13058的接合而引入的pSJ13046。

实例10.FRT-F–PamyL_4199-dsRED–FRT-F3区段整合到地衣芽孢杆菌catL基因座中

通过来自枯草芽孢杆菌供体菌株SJ13060的接合(基本上如之前所描述的)，将载体pSJ13048(其在catL上游和下游片段之间携带FRT-F–PamyL_4199-dsRED–FRT-F3区段)引入到地衣芽孢杆菌菌株SJ13055、SJ13056和SJ13057(其在catL上游和下游片段之间具有经染色体整合的FRT-F,cat::kan,FRT-F3区段)和地衣芽孢杆菌菌株SJ12850和SJ12851(具有经染色体整合的catL上游和下游片段)中，并且接着对引入的质粒进行染色体整合/切除(经由对质粒和宿主菌株来说是共有的catL上游和下游区段)。

将所得菌株(在其染色体中在catL上游和下游片段之间含有FRT-F–PamyL_4199-dsRED–FRT-F3区段)保持为

·SJ13107：来自SJ13055，通过整合/切除通过来自SJ13060的接合而引入的pSJ13048。

·SJ13108：来自SJ13057，通过整合/切除通过来自SJ13060的接合而引入的pSJ13048。

·SJ13109：来自SJ13057，通过整合/切除通过来自SJ13060的接合而引入的pSJ13048。

·SJ13117：来自SJ12851，通过整合/切除通过来自SJ13060的接合而引入的pSJ13048。

·SJ13118：来自SJ12851，通过整合/切除通过来自SJ13060的接合而引入的pSJ13048。

实例11.强启动子下游的FRT-F-gfp-FRT-F3区段在地衣芽孢杆菌amyL基因座处的整合。

将含有来自苏云金芽孢杆菌cry3A基因的mRNA稳定化元件，随后是FRT-F位点、具有核糖体结合位点的绿色荧光蛋白(gfp)CDS和FRT-F3位点的DNA区段进行消化，如图1所示；序列提供于SEQ ID NO:16中。该区段是从商业供应商(基因艺术公司(GeneArt)，丹麦)订购的并被插入到它们的标准质粒载体pMK-RQ(赋予卡那霉素抗性)中。

合成构建体以pMK-RQ ELN16STJQ1_1的形式接受，并通过电穿孔引入到大肠杆菌TG1细胞中，以40微克/ml卡那霉素对生长进行选择。将两个菌株保持为SJ13184和SJ13185。

为了将构建体转移到使地衣芽孢杆菌中的染色体整合成为可能的载体中，用EcoRI+HindIII消化来自pSJ13184的质粒，并且凝胶纯化1.4kb片段。将该片段连接至来自pSJ5487(WO 2005123915)的以类似方式纯化的4.6kb EcoRI-HindIII载体片段，用TempliPhi(来自通用电器医疗集团(GE Healthcare)的等温滚环扩增试剂盒)处理连接混合物，并添加至枯草芽孢杆菌JA1343感受态细胞中，在34℃对红霉素抗性(2微克/ml)进行选择。在被分析的8个菌落中，基于限制性消化其中5个是正确的，并且这5个也表现出绿色荧光。将两个保持为SJ13193(JA1343/pSJ13193)和SJ13194(JA1343/pSJ13194)。

将这些质粒制剂中的每一种引入到接合供体菌株枯草芽孢杆菌PP3724中，并获得许多转化体，将这些转化体合并并保持为SJ13195(PP3724/pSJ13193)和SJ13196(PP3724/pSJ13194)。

菌株SJ13196被用作与SJ12851接合的供体，获得转移接合子并在50℃在LBPGS2Erm上再分离成单菌落。存在绿色和无色菌落的混合物，并且将三个无色菌落在34℃，在TY培养基中繁殖3天。然后将培养物在LBPGS板上铺板成单菌落，并且从一种培养物中发现主要是淀粉酶阴性菌落。将这些菌落进一步再分离，并获得红霉素敏感型、淀粉酶阴性和发强绿色荧光的菌落。使用引物#411451+#411452，对来自amyL基因座的DNA进行PCR扩增。获得证实amyL基因被FRT-F-gfp-FRT-F3构建体替换的正确大小的PCR片段，并且使用引物#411452、B539、B533、B471和B335A进行的测序证实了所希望的构建体的插入。将2个正确的菌株保持为SJ13235和SJ13236。

引物序列：

#411451 5’-GTCCGAATCCCGCTACAACG(SEQ ID NO:17)

#411452 5’-CAATGACGTGACGTGTTGCC(SEQ ID NO:18)

#B335 5’-TTCTATTGGAATGATTAAGATTCCA(SEQ ID NO:19)

#B471 5’-GCACCGTCTAATGGATTTATGAA(SEQ ID NO:20)

#B533 5’-CTTCATTGCGGAATGAACAAGC(SEQ ID NO:21)

#B539 5’-TTGCCCGAATACAACGACAGGC(SEQ ID NO:22)

实例12.FLP表达载体pSJ13052的构建

在位置5处(D已经替换了在酵母FLP(UNIPROT:P03870)中存在的G)具有一个取代的翻转酶(FLP)的氨基酸序列被用作设计针对在地衣芽孢杆菌中表达而优化的合成编码序列的基础。

设计两种不同的编码相同氨基酸序列的合成序列，其配备有所希望的侧翼序列(参考amyL RBS和amyL转录终止子)，并从商业供应商(基因艺术公司(GeneArt)，丹麦)处订购。

一个命名为P33JVS_r4_fl的合成序列以DNA链的形式接受，而另一个命名为D438GY_fl的序列以被插入到标准基因工艺公司(GeneArt)载体(赋予卡那霉素抗性标记)中的形式接受，通过电穿孔将该载体引入到大肠杆菌SJ2中，并将在含有40微克/ml卡那霉素的LBPGS板上选择的两个转化体保持为SJ12975和SJ12976。P33JVS_r4_fl的核苷酸序列示出于SEQ ID NO:23中，并且D438GY_fl的序列示出于SEQ ID NO:24中。

如下将合成的编码FLP的构建体D438GY_fl转移至可移动的温度敏感型芽孢杆菌载体中：在使用引物#B440+#B441的PCR扩增中，pSJ12975被用作模板。用MscI+MluI消化经扩增的片段，并将凝胶纯化的经消化的片段连接至来自pSJ9806的5.3kb的以类似方式消化的、凝胶纯化的载体片段。将该连接混合物转化到枯草芽孢杆菌JA1343感受态细胞中，在30℃对红霉素抗性(2微克/ml)进行选择。获得16个转化体，8个通过限制性消化分析，7个被认为是正确的，这些通过DNA测序分析，所有都证实是正确的，并且将三个保持为：

·SJ13052(JA1343/pSJ13052)

·SJ13053(JA1343/pSJ13053)

·SJ13054(JA1343/pSJ13054)

将pSJ13052引入接合供体宿主菌株PP3724中，产生SJ13063，其可用于将pSJ13052转移到地衣芽孢杆菌中。

引物序列：

#B440：5’-GACTGGATCCGAATTCCAATTG(SEQ ID NO:25)

#B441 5’-AGTCGGATCCGAATTCAAGCTTG(SEQ ID NO:26)

实例13.具有FLP和F-cat-F3的载体pSJ13216的构建

在第一步骤中，将cry3A_stab-D438GY_flp编码序列作为1.9kb EcoRI-SalI片段从pSJ13052切除，并在琼脂糖凝胶电泳后纯化。将该片段连接至来自pUC19的以类似方式纯化的2.7kb EcoRI-SalI片段。通过电穿孔将连接混合物引入到大肠杆菌TG1中，对氨苄青霉素抗性进行选择，并将如通过限制性消化物判断的正确的转化体保持为SJ13131(TG1/pSJ13131)。

在第二步骤中，将FRT-F–cat–FRT-F3区段作为1.0kb SalI片段从pSJ12964切除，并在琼脂糖凝胶电泳后纯化。将该片段连接到以类似方式纯化的4.6kb SalI线性化的pSJ13131片段上，并将其通过电穿孔引入到大肠杆菌TG1中，对氨苄青霉素抗性进行选择。随后，将具有转化体的板复制为具有10微克/ml氯霉素的板，并分离氯霉素抗性菌株。

限制性消化表明该菌株在已经以与flp基因相同的方向插入了FRT-F–cat–FRT-F3区段的cat基因处含有质粒。将该菌株保持为SJ13140(TG1/pSJ13140)。

在第三步骤中，通过切除和纯化(通过来自pSJ13140的3.0kb EcoRI–HindIII片段的凝胶电泳，并将该片段连接至以类似方式纯化的4.3kb EcoRI-HindIII片段(来自pSJ8017)上)，将cry3A_stab-D438GY_flp-FRT-F–cat–FRT-F3的组装物从大肠杆菌质粒pSJ13140转移到温度敏感型、可移动芽孢杆菌载体上。

用TempliPhi聚合酶处理该连接混合物，并在30℃将所得的经扩增的连接混合物引入到枯草芽孢杆菌JA1343感受态细胞中，对红霉素抗性(2微克/ml)进行选择。获得具有正确限制图谱的若干个转化体，并将具有EcoRI-HindIII插入物区段的正确DNA序列的转化体保持为SJ13216(JA1343/pSJ13216)。

为了稍后在地衣芽孢杆菌中使用，通过感受态细胞转化将pSJ13216引入到接合枯草芽孢杆菌PP3724供体菌株中，在含有D-丙氨酸(100微克/ml)的LBPSG板上对红霉素抗性(2微克/ml)进行选择，产生菌株SJ13217。

实例14.地衣芽孢杆菌中FLP介导的标志缺失的展示(A)

枯草芽孢杆菌菌株SJ13063是含有pSJ13052的接合供体菌株，pSJ13052是携带具有cry3A_stab-D438GY flp-dws_amyL的构建体的质粒，用于FLP蛋白表达。该菌株被用作与地衣芽孢杆菌菌株SJ13103(染色体FRT-F–PamyL_4199-dsRED–FRT-F)、SJ13107和SJ13108(FRT-F–PamyL_4199-dsRED–FRT-F3)的接合中的供体。

在34℃，在具有红霉素(2微克/毫升)的LBPGS板上选择转移接合子。受体SJ13103中的转移接合子菌落是红色和无色菌落的混合物，而SJ13107和SJ13108中的转移接合子仅是红色菌落。从这些初始转移接合子板中的每一个中随机挑取15个菌落。来自SJ13103受体的这些菌落均是无色并且来自SJ13107和SJ13108受体的均是红色。

通过PCR扩增来表征一种此类无色菌落，PCR扩增证实了dsRED基因的丧失，并将该菌落保持为SJ13123。用于PCR扩增的引物组是#B435+#B436(均在上文提供)，如果存在dsRED基因，该引物组应当给出1kb片段。

这示出了两个共定向FRT-F位点之间的FLP介导的缺失，并且示出了在地衣芽孢杆菌中以类似方式定向的FRT-F和FRT-F3位点之间没有观察到缺失。

在随后的实验中，将地衣芽孢杆菌菌株SJ13103至SJ13109和SJ13114至SJ13118在来自SJ13063的接合中用作受体，对红霉素抗性(2微克/ml)进行选择。在宿主SJ13103至SJ13106(FRT-F–PamyL_4199-dsRED–FRT-F)中的转移接合子(从每个转移接合子选择板上随机挑取15个)都是无色的，而在SJ13107-09(FRT-F–PamyL_4199-dsRED–FRT-F3)中的转移接合子都是红色的。

类似地，来自宿主SJ13114-16(FRT-F–PamyL_4199-dsRED–FRT-F)的转移接合子都是无色的，而从宿主SJ13117和SJ13118(FRT-F–PamyL_4199-dsRED–FRT-F3)中挑取的转移接合子菌落是红色的。

通过如上文的PCR扩增，证实所有的无色菌株都已丢失dsRED基因。

以下这些证实了上文的发现：两个共定向FRT-F位点之间存在成功的FLP介导的缺失，而在地衣芽孢杆菌中以类似方式定向的FRT-F和FRT-F3位点之间没有观察到缺失。

将一些示例性的转移接合子保持为

·SJ13124：SJ13104+SJ13063，无色。

·SJ13125：SJ13114+SJ13063，无色。

·SJ13126：SJ13115+SJ13063，无色。

·SJ13127：SJ13116+SJ13063，无色。

实例15.地衣芽孢杆菌中FLP介导的标志替换的展示(B)

为了在含有染色体FRT-F–PamyL_4199-dsRED–FRT-F3区段的宿主菌株中实现FLP表达，通过来自SJ13063的接合将pSJ13052引入到SJ13107和SJ13108中的每一种中，对红霉素抗性(2微克/ml)进行选择。每种宿主中的两个转移接合子保持为：

·SJ13110和SJ13111(SJ13107/pSJ13052)

·SJ13112和SJ13113(SJ13108/pSJ13052)。

菌株SJ13110至SJ13113中的每种在与SJ13042和SJ13043(对大观霉素抗性(180微克/ml)进行选择)以及与SJ13044和SJ13045(对卡那霉素抗性(40微克/ml)进行选择)的接合中被用作受体。在具有抗生素的板上重新分离若干次后，分离出一些菌株，这些菌株显现出相关的抗生素抗性，但是是无色的，表明dsRED基因的丢失，如通过PCR扩增证实的。将一些示例性菌株被保持为：

·SJ13120：SpcR，在引入pSJ13016(通过来自SJ13042的接合)后来自SJ13113的无色分离物。

·SJ13121：SpcR，在引入pSJ13016(通过来自SJ13042的接合)后来自SJ13113的无色分离物。

·SJ13122：SpcR，在引入pSJ13017(通过来自SJ13043的接合)后来自SJ13110的无色分离物。

·SJ13128：KanR，在引入pSJ13018(通过来自SJ13044的接合)后来自SJ13110的无色分离物。

实例16.地衣芽孢杆菌中FLP介导的标志替换的展示(C)

在上文实例11中所描述的宿主菌株SJ13235和SJ13236中也展示了FLP介导的标志替换，作为在amyL基因座处强三联启动子系统下游的FRT-F-gfp-FRT-F3区段整合的结果，所述菌株强烈地表达绿色荧光蛋白。高表达水平使得gfp基因的丢失易于检测。基因替换是由载体pSJ13216的引入导致的，该载体携带flp基因和FRT-F-cat-FRT-F3区段二者。

菌株SJ13235和SJ13236在与供体菌株SJ13217的接合中被用作受体，将接合板影印铺板成LBPGS+2微克/ml红霉素，并将影印板在34℃孵育2天。然后将来自每个菌株组合的4个菌落接种至TY+5微克/ml红霉素中，并在33℃振荡3天。

随后，将来自每个管的等分试样在具有6、10、20或40微克/ml氯霉素的LBPSG板(在37℃孵育)上或在LBPGS+2微克/ml红霉素(在34℃孵育)上再分离为单菌落。

两天后，在所有板上发现了无色的菌落，在含有红霉素的板上发现了许多，并且相对于绿色菌落，在含有6、10或20微克/ml氯霉素的板上甚至发现了更多。它们仅在40微克/ml氯霉素板上的应用区域生长，表明这种抗生素浓度对于合适的选择来说太高。

将来自6cam和10cam板的菌落复制成cam和erm，并且在34℃将15个无色、camR和ermS菌落进一步再分离，并通过使用cat内部引物(B321)和amyL基因座下游引物(#411452)的PCR证实了在染色体amyL基因座处的FRT-F和FRT-F3位点之间插入的是cat基因，而不是gfp基因。将一些示例性无色、camR菌株保持为SJ13242、SJ13243、SJ13244和SJ13245。

类似地，将无色菌落从LBPGS+2微克/ml红霉素板上再分离到不含红霉素的板上。随后，将这些板影印铺板成LBPSG+/-erm，并且将无色红霉素敏感型菌落进一步再分离(通过如上文的PCR证实的)，并且使用amyl上游引物(#411451)+cat内部引物(#B317)，还证实了无色红霉素敏感型菌落在染色体amyL基因座处的FRT-F和FRT-F3位点之间插入的是cat基因，而不是gfp基因。它们也被证实显现出氯霉素抗性(这些菌落之前没有对氯霉素进行选择)。将两个示例性菌株保持为SJ13246和SJ13247。

因此，这一实例展示了在地衣芽孢杆菌中非常有效的FLP介导的标志替换。

引物B317：5’-GTTTTATGTTTCGGTATAAAACAC(SEQ ID NO:27)

引物B321：5’-TATTCCATGGACTTCATTTACTG(SEQ ID NO:28)

实例17.地衣芽孢杆菌中FLP介导的标志替换的展示(D)

为了在含有染色体三联启动子FRT-F–gfp–FRT-F3区段的宿主菌株中实现FLP表达，通过来自SJ13063的接合将pSJ13052引入到SJ13235和SJ13236中的每一种中，对红霉素抗性(2微克/ml)进行选择。将每种宿主中的一个转移接合子保持为SJ13248(SJ13235/pSJ13052)和SJ13249(SJ13236/pSJ13052)。

这些转移接合子菌株在与SJ13044的接合中被用作受体菌株，其中转移接合子是使用40微克/ml卡那霉素进行选择的。获得一些无色的转移接合子，将它们进一步再分离并获得ErmS菌株，并通过PCR扩增/测序确认其中的一些，以使在染色体中插入的kanR基因替换GFP基因。将衍生自SJ13248的两个示例性菌株保持为：SJ13264和SJ13265。

实例18.在地衣芽孢杆菌中使用flp介导的标志替换构建用于插入3个目的基因拷贝的宿主菌株SJ13615

开发了地衣芽孢杆菌宿主菌株，以实现3个目的基因拷贝的插入。该菌株在与菌株SJ8071相同的菌株系中被开发，并且具有3个表达红色荧光蛋白(来自侧翼为FRT-F和FRT-F3的，在bglC、xylA和lacA2基因座处的强串联三联启动子后被整合的构建体)的盒，所述构建体设计用于实现与实例11中所描述用于在amyL基因座处插入GFP相似的结果(即，强的、三联启动子驱动的RFP标志蛋白的表达)。

在bglC基因座处整合的侧翼为FRT-F和FRT-F3的RFP表达构建体的示例性DNA序列提供于SEQ ID NO:29中。

除了上文所描述的经修饰的基因座外，该菌株还具有在amyL、aprL、mprL、catL、cypX、ggt、gntP、sacB和spoIIAC基因座处的缺失，并且在forD基因座处具有失活性突变。这些另外的修饰中没有一个与flp介导的标志替换的展示有任何关联。

实例19.在地衣芽孢杆菌中使用flp介导的标志替换插入3个目的基因拷贝

在实例63中描述了也携带FRT-F-cat-FRT-F3的flp表达载体，pSJ13216。通过用衍生自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的小启动子序列PamyQ(sc)替换存在于flp基因上游的cry3A_stab区段来改善该载体以实现更好的功能性(更高的重组频率)。这是通过“延长的重叠延伸”PCR策略进行的，该策略将使用SJ13235基因组DNA上的引物B651+B653作为模板产生的PCR片段与使用引物B622+B664(使用pSJ13216作为模板)产生的PCR片段融合。

将所得的经改善的载体(引入到枯草芽孢杆菌感受态细胞中)保持为SJ13461。引物序列：

#B651：5’-GACTAGATCTGAATTCTGCTGTCCAGACTGTCCGCTG(SEQ ID NO:30)

#B653：5’-GACTAGATCTGGCCACATTTTCTTATACAAATTATATTATACATATC(SEQ ID NO:31)

#B622：5’-AGTATCATATTGACGGCTTC(SEQ ID NO:32)

#B664：

5’-AATTTGTATAAGAAAATGTGGCCAGATCTAGTCCCACATTGAAAGGGGAGGAGA(SEQ ID NO:33)

为了使简单且通用的载体构建策略成为可能，产生携带flp和FRT-F–GOI–FRT-F3的芽孢杆菌载体，设计了合成的DNA区段，通过该区段将BspQ1位点建造到位于FRT-F和FRT-F3之间的小载体区段中，这样使得识别位点本身将提供载体消化被切除，留下一个看起来像这样的载体片段：…将芽孢杆菌载体–pAmyQ(sc)–flp–FRT-F–BspQ1消化的末端--经BspQ1消化的末端–FRT-F3–芽孢杆菌载体…

然后，可以设计合适的引物，该引物允许PCR扩增和所希望的RBS-GOI片段的BspQ1消化，该片段在BspQ1消化后可以连接至上述载体片段中。

这样一种载体是pSJ13654，其具有在SEQ ID NO:34中给出的DNA序列。

使用适合于BspQ1克隆策略的引物B692和B693，通过来自地衣芽孢杆菌的PCR扩增，使用载体pSJ13654来克隆淀粉酶基因amyL。将该连接混合物引入到枯草芽孢杆菌接合供体菌株中，保存为SJ13661，并用于向SJ13615中的接合。在具有红霉素(2微克/ml)的板上选择转移接合子，并且随后地，将悬浮液稀释并在不含红霉素的情况下铺板成单菌落。

宿主具有3个RFP表达盒，这些表达盒均被amyL基因替换。在第一轮中，分离红色强度降低的菌株，并且同时表达淀粉酶。将一种这样的菌株保持为SJ13666，其携带1个或2个淀粉酶插入物的拷贝。这一菌株被用作宿主(用于与供体菌株SJ13661的新一轮接合)，并且分离无色的淀粉酶阳性菌株，并将其保持为SJ13737和SJ13738。

跨越整合基因座(bglC、xylA、lacA2)进行的PCR和随后的DNA测序证实了在这3个基因座中的每一个处均引入了淀粉酶基因。

引物序列：

#B692：5’-GACTGCTCTTCCTTCATTGAAAGGGGAGGAGAATC(SEQ ID NO:35)

#B693：5’-GACTGCTCTTCTCCTCTATCTTTGAACATAAATTG(SEQ ID NO:36)

序列表

<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）

<120> 地衣芽孢杆菌中FLP介导的基因组整合

<130> 14128-EP-EPA

<160> 36

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Pab154

<400> 1

accactcctt tttctttttg gctcat 26

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Pab156

<400> 2

acctccaatc aaaatgtcca gttcag 26

<210> 3

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B438

<400> 3

gactgaattc ggatccgtcg acgaagttcc tattccgaag ttcctattct ctagaaagta 60

taggaacttc ctgggaccaa taataatgac tag 93

<210> 4

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B439

<400> 4

gactaagctt ggatcctcta gagtcgacgc ttagcgaagt tcctatacta tttgaagaat 60

aggaacttcg gaataggaac ttcgactgta aaaagtacag tcggc 105

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B452

<400> 5

gactgaattc catggtatca gtttgaaaat tatgtattat g 41

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B453

<400> 6

gactaagctt ggatccatgg gaagtctggt ctcttaaaga aaa 43

<210> 7

<211> 758

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含存在于pSJ13012中的750 bp NcoI片段的dsRED的序列

<400> 7

ccatgggaag tctggtctct taaagaaaaa gatgatgcct tccttcagtt cgctcatact 60

gctcaacaat tgtgtagtct tcgttgtgac tagttatgtc aagttttgaa tcaacatagt 120

agtagccagg aagctgcaca ggctttttcg ccatgtaaat gctcttgaac tcaacaagat 180

aatgccctcc atctttcaac tttaaggctt tgtgaatttc acctttcaag acaccatcac 240

gcggataaag cctctcagtt gacggctccc aacccattgt ctttttctgc attacaggac 300

catcacttgg aaagttcacg ccaatgaact ttactttgta aatgaagcaa ccgtcttgca 360

gacttgaatc ttgcgttaca gttacgacac ctccatcttc aaagttcatt acgcgctccc 420

acttgaatcc ttcaggaaaa cttaactttt tgtaatcagg aatgtcagca ggatgcttta 480

cataaacttt tgacccatac tgaaactgcg gacttaagat gtcccaagca aacggcagcg 540

gtcctccttt tgtcacttta agttttgcag tttgcgttcc ttcataaggc cttccttcac 600

cttcaccttc aatttcaaac tcatgcccgt ttacacttcc ttccattcgc actttgaagc 660

gcatgaactc tttgattacg tcttcagttg aagccattcg gttccctcct catttttata 720

gagctccata atacataatt ttcaaactga taccatgg 758

<210> 8

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B448

<400> 8

gactgaattc catggcaatt gcgtataata aagaataatt attaatct 48

<210> 9

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B449

<400> 9

gactaagctt caattggatc catggactaa attaaagtaa taaagcgttc t 51

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B450

<400> 10

gactgaattc catggcaatt gggccagttt gttgaagatt aga 43

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B451

<400> 11

gactaagctt caattggatc catggccaac atgattaaca attattagag 50

<210> 12

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B435

<400> 12

gactgaattc ggatccgtcg acgaagttcc tattccgaag ttcctattct ctagaaagta 60

taggaacttc ataaatgagt agaaagcgcc atatc 95

<210> 13

<211> 106

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B436

<400> 13

gactaagctt ggatcctcta gagtcgacgc ttagcgaagt tcctatactt tctagagaat 60

aggaacttcg gaataggaac ttcctttagt gtcaattgga agtctg 106

<210> 14

<211> 1065

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pSJ13046中含有SalI插入物的FRT-F - PamyL_4199-dsRED - FRT-F的序列

<400> 14

gtcgacgctt agcgaagttc ctatactttc tagagaatag gaacttcgga ataggaactt 60

cctttagtgt caattggaag tctggtctct taaagaaaaa gatgatgcct tccttcagtt 120

cgctcatact gctcaacaat tgtgtagtct tcgttgtgac tagttatgtc aagttttgaa 180

tcaacatagt agtagccagg aagctgcaca ggctttttcg ccatgtaaat gctcttgaac 240

tcaacaagat aatgccctcc atctttcaac tttaaggctt tgtgaatttc acctttcaag 300

acaccatcac gcggataaag cctctcagtt gacggctccc aacccattgt ctttttctgc 360

attacaggac catcacttgg aaagttcacg ccaatgaact ttactttgta aatgaagcaa 420

ccgtcttgca gacttgaatc ttgcgttaca gttacgacac ctccatcttc aaagttcatt 480

acgcgctccc acttgaatcc ttcaggaaaa cttaactttt tgtaatcagg aatgtcagca 540

ggatgcttta cataaacttt tgacccatac tgaaactgcg gacttaagat gtcccaagca 600

aacggcagcg gtcctccttt tgtcacttta agttttgcag tttgcgttcc ttcataaggc 660

cttccttcac cttcaccttc aatttcaaac tcatgcccgt ttacacttcc ttccattcgc 720

actttgaagc gcatgaactc tttgattacg tcttcagttg aagccattcg gttccctcct 780

catttttata gagctccata atacataatt ttcaaactga taaaatgatt tttcataaat 840

ccattagacg gtgcaaatat atgtttttaa tgttcttcgt ttttaggcat ccctcctttc 900

aatgtgatac atatgatatt gtataaatat tccgaatttt taacaagtac cattttccct 960

atattttctt ccaaaagaaa agcgccgata tggcgctttc tactcattta tgaagttcct 1020

atactttcta gagaatagga acttcggaat aggaacttcg tcgac 1065

<210> 15

<211> 106

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B437

<400> 15

gactaagctt ggatcctcta gagtcgacgc ttagcgaagt tcctatacta tttgaagaat 60

aggaacttcg gaataggaac ttcctttagt gtcaattgga agtctg 106

<210> 16

<211> 1386

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 含有来自苏云金芽孢杆菌cry3A基因的mRNA稳定化元件，随后是FRT-F位点、具有核糖体结合位点的绿色荧光蛋白（gfp）CDS和FRT-F3位点的DNA区段（见图1）。

<400> 16

gaattctaaa gataatatct ttgaattgta acccccctca aaagtaagaa ctacaaaaaa 60

agaatacgtt atatagaaat atgtttgaac cttcttcaga ttacaaatat attcggacgg 120

actctacctc aaatgcttat ctaactatag aatgacatac aagcacaacc ttgaaaattt 180

gaaaatataa ctaccaatga acttgttcat gtgaattatc gctgtattta attttctcaa 240

ttcaatatat aatatgccaa tacattgtta caagtagaaa ttaagacacc cttgatagcc 300

ttactatacc taacatgatg tagtattaaa tgaatatgta aatatattta tgataagaag 360

cgacttattt ataatcatta catatttttc tattggaatg attaagattc caatagaata 420

gtgtataaat tatttatctt gaaaggaggg atgcctaaaa acgaagaaca ttaaaaacat 480

atatttgcac cgtctaatgg atttatgaaa aatcatttta tcagtttgaa aattatgtat 540

tatggaagtt cctattccga agttcctatt ctctagaaag tataggaact tcaaaatgag 600

agggagagga aactcatgag taaaggagaa gaacttttca ctggagttgt cccaattctt 660

gttgaattag atggcgatgt taatgggcaa aaattctctg ttagtggaga gggtgaaggt 720

gatgcaacat acggaaaact tacccttaaa tttatttgca ctactgggaa gctacctgtt 780

ccatggccaa cgcttgtcac tactctcact tatggtgttc aatgcttttc tagataccca 840

gatcatatga aacagcatga ctttttcaag agtgccatgc ccgaaggtta tgtacaggaa 900

agaactatat tttacaaaga tgacgggaac tacaagacac gtgctgaagt caagtttgaa 960

ggtgataccc ttgttaatag aatcgagtta aaaggtattg attttaaaga agatggaaac 1020

attcttggac acaaaatgga atacaattat aactcacata atgtatacat catggcagac 1080

aaaccaaaga atggcatcaa agttaacttc aaaattagac acaacattaa agatggaagc 1140

gttcaattag cagaccatta tcaacaaaat actccaattg gcgatggccc tgtcctttta 1200

ccagacaacc attacctgtc cacgcaatct gccctttcca aagatcccaa cgaaaagaga 1260

gatcacatga tccttcttga gtttgtaaca gctgctggga ttacacatgg catggatgaa 1320

ctatacaaat aagaagttcc tattccgaag ttcctattct tcaaatagta taggaacttc 1380

aagctt 1386

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物411451

<400> 17

gtccgaatcc cgctacaacg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物411452

<400> 18

caatgacgtg acgtgttgcc 20

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B335

<400> 19

ttctattgga atgattaaga ttcca 25

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B471

<400> 20

gcaccgtcta atggatttat gaa 23

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B533

<400> 21

cttcattgcg gaatgaacaa gc 22

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B539

<400> 22

ttgcccgaat acaacgacag gc 22

<210> 23

<211> 1410

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P33JVS_r4_fl的核苷酸序列

<400> 23

gactggatcc gaattccaat tgaattatgg ccacattgaa aggggaggag aatcatgccc 60

caattcgata tcctgtgcaa gacacctccg aaggtgctgg tgaggcagtt cgtggaacgt 120

ttcgaaagac cgagtgggga aaagatcgcg ctgtgtgcag cggaactgac atatctgtgc 180

tggatgatca ctcataacgg tacagcgatc aaaagagcga ctttcatgag ctataacaca 240

atcatctcaa actcactgtc atttgatatc gtgaacaagt ccctgcagtt taagtacaag 300

acacagaagg cgacgatcct ggaagcgtcg ctgaagaagc tgattcctgc gtgggagttt 360

accatcatcc cgtactatgg acaaaagcat caaagcgaca tcacagatat cgtgtcttcc 420

ctgcaactgc aatttgaatc gagcgaagag gcggataagg gaaacagtca ctctaagaag 480

atgctgaagg cgctgctgag cgaaggcgaa agcatctggg agatcacaga aaagatcctg 540

aacagctttg agtatacgag tagatttacc aagacgaaga cgctgtatca attcctgttt 600

ctggcgacat tcatcaactg tggaaggttc tctgatatca agaacgtgga ccccaagagc 660

tttaagctgg tgcagaacaa gtacctgggg gtgatcatcc aatgtctggt gacagagaca 720

aagaccagtg tgtcacgcca catctacttc ttttcagcga gaggaaggat cgatccgctg 780

gtgtacctgg atgaatttct gcgaaacagc gaacccgtgc tgaagagagt gaaccgcaca 840

ggcaactcaa gttcgaacaa gcaagagtat caactgctga aggataacct ggtgcgttcg 900

tataacaagg cgctgaagaa gaatgcaccg tactctatct ttgcgatcaa gaacggtccg 960

aagagtcata tcggtaggca tctgatgacg agctttctga gcatgaaggg cctgacggaa 1020

ctgacgaacg tggtgggaaa ctggtccgat aagcgagcgt ctgcggtggc acggacaacg 1080

tacacacacc agatcacagc gatccctgac cactactttg cgctggtgtc caggtactat 1140

gcgtatgatc caatcagcaa ggagatgatc gcgctgaagg acgagacgaa ccccatcgaa 1200

gaatggcagc atatcgaaca actgaagggg tcagcggagg gctcgatccg ctatcctgcg 1260

tggaacggaa tcatctccca agaagtgctg gactatctga gcagctacat caacagacgc 1320

atctagaaga gcagagagga cggatttcct gaaggaaatc cgttttttta ttttgcacgc 1380

gtgctagcaa gcttgaattc ggatccgact 1410

<210> 24

<211> 1410

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> D438GY_fl的核苷酸序列

<400> 24

gactggatcc gaattccaat tgaattatgg ccacattgaa aggggaggag aatcatgccg 60

caatttgata tcctgtgcaa gacacctccg aaggtgctgg tgcggcaatt tgtggaaagg 120

tttgaaagac cgagcggtga aaagatcgcg ctgtgtgcag cggaactgac ttatctgtgc 180

tggatgatca cacataacgg aactgcgatc aaaagagcga cattcatgtc atacaacaca 240

atcatctcta acagcctgtc gtttgatatc gtgaacaagt cgctgcagtt taagtacaag 300

acgcaaaagg cgacaatcct ggaagcgtcc ctgaagaagc tgatcccagc gtgggagttt 360

acgatcatcc cgtattacgg ccagaagcac cagagcgaca tcacagatat cgtgtcttca 420

ctgcaactgc aattcgaaag ttcggaagaa gcggataagg gaaactctca ttcgaagaag 480

atgctgaagg cgctgctgag cgaaggcgaa tcgatctggg agatcacgga aaagatcctg 540

aactctttcg agtacactag ccggttcact aagactaaga cactgtatca atttctgttt 600

ctggcgacct ttatcaactg tggaagattc tcagacatca agaacgtgga cccgaagtcg 660

tttaagctgg tgcagaacaa gtatctggga gtgatcatcc aatgcctggt gacagaaact 720

aagacgtcgg tgtccaggca tatctacttt ttctccgcga gaggaagaat cgatccactg 780

gtgtatctgg atgaatttct gcggaactcc gaaccggtgc tgaagcgtgt gaaccgcaca 840

ggaaacagtt cctcaaacaa gcaggaatat cagctgctga aggataacct ggtgagatca 900

tacaacaagg cgctgaagaa gaatgcaccg tacagcatct tcgcgatcaa gaacggacct 960

aagagccata tcggacgcca tctgatgact tcctttctgt caatgaaggg tctgactgaa 1020

ctgacaaacg tggtggggaa ctggtccgac aaaagagcgt cagcggtggc acggaccact 1080

tatacccacc agatcactgc gatcccggat cactactttg cgctggtgag ccgctactat 1140

gcgtatgatc ctatcagcaa ggaaatgatc gcgctgaagg acgaaacaaa cccgatcgag 1200

gaatggcagc atatcgaaca actgaagggc tcagcggaag gatcgatcag atatcctgcg 1260

tggaacggaa tcatctcaca ggaagtgctg gattacctgt caagctatat caacagacgc 1320

atctagaaga gcagagagga cggatttcct gaaggaaatc cgttttttta ttttgcacgc 1380

gtgctagcaa gcttgaattc ggatccgact 1410

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B440

<400> 25

gactggatcc gaattccaat tg 22

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B441

<400> 26

agtcggatcc gaattcaagc ttg 23

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B317

<400> 27

gttttatgtt tcggtataaa acac 24

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B321

<400> 28

tattccatgg acttcattta ctg 23

<210> 29

<211> 3598

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 在bglC基因座处整合的侧翼为FRT-F和FRT-F3的RFP表达构建体的示例性DNA序列

<400> 29

atggagcata tatcctggct tacatttacg atgctgattc tcgccagtta ccggttaact 60

catttgattg tttttgataa gatcacggag tttatccgga aaccgttcat gaagaagaag 120

cagacgattg atgaacaagg gcatgtagaa acgaaaaaag tgccgaaatc aaacttcggc 180

tatttgctga attgctattg gtgcgcaggg atatggtgcg cgttgatcat tgctgtcgga 240

tatctgattg ccccaaaagc gatattcccg ttgattttga ttttgtcggt cgccgggggg 300

caggcgattc ttgaaacgtt tgtcggtgtc gccacaaaac ttgtcggctt tttctccgat 360

ttaaagaagt aaaccattcc aagcggatgg ttttattttt ttgtcaataa agtgatacaa 420

acagcagaga gaacgtgtca gttttatgaa cttttcacag cgatttttcc cggatgcggc 480

attttaggca gagaggaagc atctcattgt aaagatttca gtttttaaaa tttagaattg 540

agagaaaaag gatgtgcaaa gtccccggag ctcggatcca ctagtaacgg ccgccagtgt 600

gctggaattc gcccttgcgg ccgctcgctt tccaatctga aggtttcatt gtgggatgtt 660

gatccggaag attggaagta caaaaataag caaaagattg tcaatcatgt catgagccat 720

gcgggagacg gaaaaatcgt cttaatgcac gatatttatg caacgtccgc agatgctgct 780

gaagagatta ttaaaaagct gaaagcaaaa ggctatcaat tggtaactgt atctcagctt 840

gaagaagtga agaagcagag aggctattga ataaatgagt agaaagcgcc atatcggcgc 900

ttttcttttg gaagaaaata tagggaaaat ggtacttgtt aaaaattcgg aatatttata 960

caatatcata tgtatcacat tgaaaggagg ggcctgctgt ccagactgtc cgctgtgtaa 1020

aaaaaaggaa taaagggggg ttgacattat tttactgata tgtataatat aatttgtata 1080

agaaaatgga ggggccctcg aaacgtaaga tgaaacctta gataaaagtg ctttttttgt 1140

tgcaattgaa gaattattaa tgttaagctt aattaaagat aatatctttg aattgtaacg 1200

cccctcaaaa gtaagaacta caaaaaaaga atacgttata tagaaatatg tttgaacctt 1260

cttcagatta caaatatatt cggacggact ctacctcaaa tgcttatcta actatagaat 1320

gacatacaag cacaaccttg aaaatttgaa aatataacta ccaatgaact tgttcatgtg 1380

aattatcgct gtatttaatt ttctcaattc aatatataat atgccaatac attgttacaa 1440

gtagaaatta agacaccctt gatagcctta ctatacctaa catgatgtag tattaaatga 1500

atatgtaaat atatttatga taagaagcga cttatttata atcattacat atttttctat 1560

tggaatgatt aagattccaa tagaatagtg tataaattat ttatcttgaa aggagggatg 1620

cctaaaaacg aagaacatta aaaacatata tttgcaccgt ctaatggatt tatgaaaaat 1680

cattttatca gtttgaaaat tatgtattat gtggccagaa gttcctattc cgaagttcct 1740

attctctaga aagtatagga acttcttata aaaatgagga gggaaccgaa tggcttcaac 1800

tgaagacgta atcaaagagt tcatgcgctt caaagtgcga atggaaggaa gtgtaaacgg 1860

gcatgagttt gaaattgaag gtgaaggtga aggaaggcct tatgaaggaa cgcaaactgc 1920

aaaacttaaa gtgacaaaag gaggaccgct gccgtttgct tgggacatct taagtccgca 1980

gtttcagtat gggtcaaaag tttatgtaaa gcatcctgct gacattcctg attacaaaaa 2040

gttaagtttt cctgaaggat tcaagtggga gcgcgtaatg aactttgaag atggaggtgt 2100

cgtaactgta acgcaagatt caagtctgca agacggttgc ttcatttaca aagtaaagtt 2160

cattggcgtg aactttccaa gtgatggtcc tgtaatgcag aaaaagacaa tgggttggga 2220

gccgtcaact gagaggcttt atccgcgtga tggtgtcttg aaaggtgaaa ttcacaaagc 2280

cttaaagttg aaagatggag ggcattatct tgttgagttc aagagcattt acatggcgaa 2340

aaagcctgtg cagcttcctg gctactacta tgttgattca aaacttgaca taactagtca 2400

caacgaagac tacacaattg ttgagcagta tgagcgaact gaaggaaggc atcatctttt 2460

tctttaagaa gttcctattc cgaagttcct attcttcaaa tagtatagga acttcacgcg 2520

tagggcccgc ggctagcggc cgcgtcgact agaagagcag agaggacgga tttcctgaag 2580

gaaatccgtt tttttatttt gcccgtctta taaatttcgt tgtccaactc gcttaattgc 2640

gagtttttat ttcgtttatt tcaatcaagg taaatggcta gcggccgcgt cgactagaag 2700

agcagagagg acggatttcc tgaaggaaat ccgttttttt attttgcccg tcttataaat 2760

ttcgttgcca tgggatccgc ggccgcgctg cagccaacac gatagcagta caatacagag 2820

cgggggacaa caatgtaaac ggcaaccaaa tccgccctca gctcaacatt aaaaacaaca 2880

gcaaaaaaac cgtctcttta aatcgaatca ccgtccgcta ctggtataaa acgaatcgca 2940

aaggaaaaaa ttttgactgc gactatgccc aaatcggctg cagcaaaatc acgcacaaat 3000

tcgtccaatt aaaaaaagcg gtaaacggag cagacacgta tcttgaagta gggtttaaaa 3060

atggtacatt ggcgccgggt gcaagtacag gtgaaatcca gatccgtctt cacaatgacg 3120

gctggagcaa ttatgcccaa agcggcgact attcattttt aaattcaaac acgtttaaaa 3180

atacgaaaaa aatcacgttg tatgagaacg gaaagctgat ttggggcact gaacctaaat 3240

aacggcactt tgacggacac cggatttggt gtccgttttc gtatatatta taatggaagg 3300

aatgaggaat atttttgtaa acatgaaagg agatggatgt atgaatgaaa cattgcagca 3360

atacatgatg cttgtcaagg aacactatga cacgatcaat ggaccggatt acacaggcaa 3420

agaggaagac attgaaaaga gaaaagagca aatcgagctt tacgccaaaa cgctccagca 3480

aggcttttca acagatgacg actatgatga attcgcagat gccgtgatta aatgcgcata 3540

cggagatctg acgatggaag aattggaaac ggtttatcgg gaattaacgt ctccataa 3598

<210> 30

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B651

<400> 30

gactagatct gaattctgct gtccagactg tccgctg 37

<210> 31

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B653

<400> 31

gactagatct ggccacattt tcttatacaa attatattat acatatc 47

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B622

<400> 32

agtatcatat tgacggcttc 20

<210> 33

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B664

<400> 33

aatttgtata agaaaatgtg gccagatcta gtcccacatt gaaaggggag gaga 54

<210> 34

<211> 5998

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pSJ13654

<400> 34

aattcagatc tgaattctgc tgtccagact gtccgctgtg taaaaaaaag gaataaaggg 60

gggttgacat tattttactg atatgtataa tataatttgt ataagaaaat gtggccacat 120

tgaaagggga ggagaatcat gccgcaattt gatatcctgt gcaagacacc tccgaaggtg 180

ctggtgcggc aatttgtgga aaggtttgaa agaccgagcg gtgaaaagat cgcgctgtgt 240

gcagcggaac tgacttatct gtgctggatg atcacacata acggaactgc gatcaaaaga 300

gcgacattca tgtcatacaa cacaatcatc tctaacagcc tgtcgtttga tatcgtgaac 360

aagtcgctgc agtttaagta caagacgcaa aaggcgacaa tcctggaagc gtccctgaag 420

aagctgatcc cagcgtggga gtttacgatc atcccgtatt acggccagaa gcaccagagc 480

gacatcacag atatcgtgtc ttcactgcaa ctgcaattcg aaagttcgga agaagcggat 540

aagggaaact ctcattcgaa gaagatgctg aaggcgctgc tgagcgaagg cgaatcgatc 600

tgggagatca cggaaaagat cctgaactct ttcgagtaca ctagccggtt cactaagact 660

aagacactgt atcaatttct gtttctggcg acctttatca actgtggaag attctcagac 720

atcaagaacg tggacccgaa gtcgtttaag ctggtgcaga acaagtatct gggagtgatc 780

atccaatgcc tggtgacaga aactaagacg tcggtgtcca ggcatatcta ctttttctcc 840

gcgagaggaa gaatcgatcc actggtgtat ctggatgaat ttctgcggaa ctccgaaccg 900

gtgctgaagc gtgtgaaccg cacaggaaac agttcctcaa acaagcagga atatcagctg 960

ctgaaggata acctggtgag atcatacaac aaggcgctga agaagaatgc accgtacagc 1020

atcttcgcga tcaagaacgg acctaagagc catatcggac gccatctgat gacttccttt 1080

ctgtcaatga agggtctgac tgaactgaca aacgtggtgg ggaactggtc cgacaaaaga 1140

gcgtcagcgg tggcacggac cacttatacc caccagatca ctgcgatccc ggatcactac 1200

tttgcgctgg tgagccgcta ctatgcgtat gatcctatca gcaaggaaat gatcgcgctg 1260

aaggacgaaa caaacccgat cgaggaatgg cagcatatcg aacaactgaa gggctcagcg 1320

gaaggatcga tcagatatcc tgcgtggaac ggaatcatct cacaggaagt gctggattac 1380

ctgtcaagct atatcaacag acgcatctag agagaggacg gatttcctga aggaaatccg 1440

tttttttatt ttgcacgcgt gctagcggcc gcgtcgacga agttcctatt ccgaagttcc 1500

tattctctag aaagtatagg aacttcagaa gagctgcatc aaaaatcgga gccgaagttt 1560

tgaaaaaggg cgggaatgcc attgatgcag ctattgcgag ctcttccagg aagttcctat 1620

tccgaagttc ctattcttca aatagtatag gaacttcaag cttgcatgcc tgcaggtcga 1680

ttcacaaaaa ataggcacac gaaaaacaag ttaagggatg cagtttatgc atcccttaac 1740

ttacttatta aataatttat agctattgaa aagagataag aattgttcaa agctaatatt 1800

gtttaaatcg tcaattcctg catgttttaa ggaattgtta aattgatttt ttgtaaatat 1860

tttcttgtat tctttgttaa cccatttcat aacgaaataa ttatactttt gtttatcttt 1920

gtgtgatatt cttgattttt ttctacttaa tctgataagt gagctattca ctttaggttt 1980

aggatgaaaa tattctcttg gaaccatact taatatagaa atatcaactt ctgccattaa 2040

aagtaatgcc aatgagcgtt ttgtatttaa taatctttta gcaaacccgt attccacgat 2100

taaataaatc tcattagcta tactatcaaa aacaattttg cgtattatat ccgtacttat 2160

gttataaggt atattaccat atattttata ggattggttt ttaggaaatt taaactgcaa 2220

tatatccttg tttaaaactt ggaaattatc gtgatcaaca agtttatttt ctgtagtttt 2280

gcataattta tggtctattt caatggcagt tacgaaatta cacctcttta ctaattcaag 2340

ggtaaaatgg ccttttcctg agccgatttc aaagatatta tcatgttcat ttaatcttat 2400

atttgtcatt attttatcta tattatgttt tgaagtaata aagttttgac tgtgttttat 2460

atttttctcg ttcattataa ccctctttaa tttggttata tgaattttgc ttattaacga 2520

ttcattataa ccacttattt tttgtttggt tgataatgaa ctgtgctgat tacaaaaata 2580

ctaaaaatgc ccatattttt tcctccttat aaaattagta taattatagc acgagctctg 2640

ataaatatga acatgatgag tgatcgttaa atttatactg caatcggatg cgattattga 2700

ataaaagata tgagagattt atctaatttc ttttttcttg taaaaaaaga aagttcttaa 2760

aggttttata gttttggtcg tagagcacac ggtttaacga cttaattacg aagtaaataa 2820

gtctagtgtg ttagacttta tgaaatctat atacgtttat atatatttat tatccggagg 2880

tgtagcatgt ctcattcaat tttgagggtt gccagagtta aaggatcaag taatacaaac 2940

gggatacaaa gacataatca aagagagaat aaaaactata ataataaaga cataaatcat 3000

gaggaaacat ataaaaatta tgatttgatt aacgcacaaa atataaagta taaagataaa 3060

attgatgaaa cgattgatga gaattattca gggaaacgta aaattcggtc agatgcaatt 3120

cgacatgtgg acggactggt tacaagtgat aaagatttct ttgatgattt aagcggagaa 3180

gaaatagaac gattttttaa agatagcttg gagtttctag aaaatgaata cggtaaggaa 3240

aatatgctgt atgcgactgt ccatctggat gaaagagtcc cacatatgca ctttggtttt 3300

gtccctttaa cagaggacgg gagattgtct gcaaaagaac agttaggcaa caagaaagac 3360

tttactcaat tacaagatag atttaatgag tatgtgaatg agaaaggtta tgaacttgaa 3420

agaggcacgt ccaaagaggt tacagaacga gaacataaag cgatggatca gtacaagaaa 3480

gatactgtat ttcataaaca ggaactgcaa gaagttaagg atgagttaca gaaggcaaat 3540

aagcagttac agagtggaat agagcatatg aggtctacga aaccctttga ttatgaaaat 3600

gagcgtacag gtttgttctc tggacgtgaa gagactggta gaaagatatt aactgctgat 3660

gaatttgaac gcctgcaaga aacaatctct tctgcagaac ggattgttga tgattacgaa 3720

aatattaaga gcacagacta ttacacagaa aatcaagaat taaaaaaacg tagagagagt 3780

ttgaaagaag tagtgaatac atggaaagag gggtatcacg aaaaaagtaa agaggttaat 3840

aaattaaagc gagagaatga tagtttgaat gagcagttga atgtatcaga gaaatttcaa 3900

gctagtacag tgactttata tcgtgctgcg agggcgaatt tccctgggtt tgagaaaggg 3960

tttaataggc ttaaagagaa attctttaat gattccaaat ttgagcgtgt gggacagttt 4020

atggatgttg tacaggataa tgtccagaag gtcgatagaa agcgtgagaa acagcgtaca 4080

gacgatttag agatgtagag gtacttttat gccgagaaaa ctttttgcgt gtgacagtcc 4140

ttaaaatata cttagagcgt aagcgaaagt agtagcgaca gctattaact ttcggtttca 4200

aagctctagg atttttaatg gacgcagcgc atcacacgca aaaaggaaat tggaataaat 4260

gcgaaatttg agatgttaat taaagacctt tttgaggtct ttttttctta gatttttggg 4320

gttatttagg ggagaaaaca taggggggta ctacgacctc ccccctaggt gtccattgtc 4380

cattgtccaa acaaataaat aaatattggg tttttaatgt taaaaggttg ttttttatgt 4440

taaagtgaaa aaaacagatg ttgggaggta cagtgatggt tgtagataga aaagaagaga 4500

aaaaagttgc tgttacttta agacttacaa cagaagaaaa tgagatatta aatagaatca 4560

aagaaaaata taatattagc aaatcagatg caaccggtat tctaataaaa aaatatgcaa 4620

aggaggaata cggtgcattt taaacaaaaa aagatagaca gcactggcat gctgcctatc 4680

tatgactaaa ttttgttaag tgtattagca ccgttattat atcatgagcg aaaatgtaat 4740

aaaagaaact gaaaacaaga aaaattcaag aggacgtaat tggacatttg ttttatatcc 4800

agaatcagca aaagccgagt ggttagagta tttaaaagag ttacacattc aatttgtagt 4860

gtctccatta catgataggg atactgatac agaaggtagg atgaaaaaag agcattatca 4920

tattctagtg atgtatgagg gtaataaatc ttatgaacag ataaaaataa ttacagaaga 4980

attgaatgcg actattccgc agattgcagg aagtgtgaaa ggtcttgtga gatatatgct 5040

tcacatggac gatcctaata aatttaaata tcaaaaagaa gatatgatag tttatggcgg 5100

tgtagatgtt gatgaattat taaagaaaac aacaacagat agatataaat taattaaaga 5160

aatgattgag tttattgatg aacaaggaat cgtagaattt aagagtttaa tggattatgc 5220

aatgaagttt aaatttgatg attggttccc gcttttatgt gataactcgg cgtatgttat 5280

tcaagaatat ataaaatcaa atcggtataa atctgaccga tagattttga atttaggtgt 5340

cacaagacac tcttttttcg caccagcgaa aactggttta agccgactgc gcaaaagaca 5400

taatcgactc tagaggatcc ccgggtaccg agctctgcct tttagtccag ctgatttcac 5460

tttttgcatt ctacaaactg cataactcat atgtaaatcg ctccttttta ggtggcacaa 5520

atgtgaggca ttttcgctct ttccggcaac cacttccaag taaagtataa cacactatac 5580

tttatattca taaagtgtgt gctctgcgag gctgtcggca gtgccgacca aaaccataaa 5640

acctttaaga cctttctttt ttttacgaga aaaaagaaac aaaaaaacct gccctctgcc 5700

acctcagcaa aggggggttt tgctctcgtg ctcgtttaaa aatcagcaag ggacaggtag 5760

tattttttga gaagatcact caaaaaatct ccacctttaa acccttgcca atttttattt 5820

tgtccgtttt gtctagctta ccgaaagcca gactcagcaa gaataaaatt tttattgtct 5880

ttcggttttc tagtgtaacg gacaaaacca ctcaaaataa aaaagataca agagaggtct 5940

ctcgtatctt ttattcagca atcgcgcccg attgctgaac agattaataa tgagctcg 5998

<210> 35

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B692

<400> 35

gactgctctt ccttcattga aaggggagga gaatc 35

<210> 36

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B693

<400> 36

gactgctctt ctcctctatc tttgaacata aattg 35

Claims

1.一种用于将至少一种目的多核苷酸以位点特异性方式整合至地衣芽孢杆菌宿主细胞的染色体中的方法，所述方法包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其中该目的多核苷酸包含编码至少一种目的多肽的操纵子或可读框。

3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该目的多肽包含酶，优选地是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶；更优选地是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、或β-木糖苷酶。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中选择或筛选标志位于该至少一个整合位点中的识别序列对之间。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该核酸构建体进一步包含引入的选择标志和编码该FLP重组酶或其同源物的多核苷酸。

6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中将第二核酸构建体引入所述步骤(b)中的细胞中，该第二核酸构建体属于非复制型或温度敏感复制型，并且包含编码FLP重组酶或其同源物的多核苷酸以及选择标志，该选择标志使正选择或负选择成为可能或者是可双向选择的，并且分别通过在允许的温度下的选择压力或生长被瞬时维持在所述细胞中，使得该重组酶可以在步骤(c)中瞬时表达。

7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的细胞在其染色体中包含至少一个编码与严格调控的启动子可操作地连接的重组酶的多核苷酸的拷贝，可通过改变生长条件而开启和关闭该启动子，从而使步骤(c)中位点特异性重组酶的瞬时表达成为可能。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该识别序列对由两种不同的识别序列组成，优选的是与其衍生物组合的野生型FRT序列，更优选的是与选自下组的识别序列组合的野生型FRT序列，该组由以下组成：FRT-F、FRT-F3、FRT-F10、FRT-F13、FRT-F14、FRT-F15、FRT-Fa和FRT-F3a。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)的地衣芽孢杆菌宿主细胞在其染色体中包含两个或更多个整合位点，并且产生了包含两个或更多个以位点特异性方式整合至该细胞的染色体中的目的多核苷酸的地衣芽孢杆菌宿主细胞；优选地，步骤(a)的地衣芽孢杆菌宿主细胞在其染色体中包含三个或更多个整合位点；更优选地四个或更多个、五个或更多个、或者七个或更多个整合位点，并且其中产生了包含三个、四个、五个、六个或更多个以位点特异性方式整合至该细胞的染色体中的目的多核苷酸的地衣芽孢杆菌宿主细胞。

10.一种原核宿主细胞，所述原核宿主细胞在其基因组中包含至少两种编码目的多肽的多核苷酸，其中每种多核苷酸的侧翼为针对位点特异性重组酶的识别序列对。

11.如权利要求10所述的原核宿主细胞，所述原核宿主细胞是革兰氏阳性宿主细胞；优选地，该原核宿主细胞是芽孢杆菌属宿主细胞；更优选地，该原核宿主细胞选自下组，该组由以下组成：嗜碱芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、植物解淀粉芽孢杆菌亚种、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞；甚至更优选地，该原核宿主细胞是地衣芽孢杆菌宿主细胞。

12.如权利要求10-11中任一项所述的原核宿主细胞，其中该目的多肽包含酶，优选地是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶；更优选地是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷酸二酯酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、或β-木糖苷酶。

13.如权利要求10-12中任一项所述的原核宿主细胞，其中该位点特异性重组酶是来自酿酒酵母的翻转酶(FLP)，或其同源物或变体。

14.如权利要求10-13中任一项所述的原核宿主细胞，其中该识别序列对由两种不同的识别序列组成；优选的是与其衍生物组合的野生型FRT序列；更优选的是与选自下组的识别序列组合的野生型FRT序列，该组由以下组成：FRT-F、FRT-F3、FRT-F10、FRT-F13、FRT-F14、FRT-F15、FRT-Fa和FRT-F3a。