CN101611145B

CN101611145B - 用于在细菌细胞中表达基因的修饰型信使rna稳定化序列

Info

Publication number: CN101611145B
Application number: CN200780051650.7A
Authority: CN
Inventors: 迈克尔·托马斯; 格洛丽亚·埃里克森; 威廉·威德纳
Original assignee: Novozymes Biotech Inc
Current assignee: Novozymes Inc
Priority date: 2006-12-21
Filing date: 2007-12-19
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2027-12-19
Also published as: EP2104739A2; WO2008140615A3; US20100028943A1; US20120301955A1; US8268586B2; CN101611145A; DK2104739T3; EP2104739B1; WO2008140615A2

Abstract

本发明涉及在细菌细胞中产生具有生物学活性的多肽的方法，包括：(a)在有益于所述多肽产生的培养基中培养细菌宿主细胞，其中所述细菌宿主细胞包含核酸构建体，该核酸构建体包含与编码所述多肽的多核苷酸序列可操作地连接的启动子区，和位于所述启动子区下游和所述编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合位点上游的修饰型mRNA加工/稳定化序列，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高的表达；和(b)从培养基分离具有生物学活性的多肽。本发明还涉及这样的修饰型mRNA加工/稳定化序列，核酸构建体，和细菌宿主细胞，以及获得这些细菌宿主细胞的方法。

Description

用于在细菌细胞中表达基因的修饰型信使RNA稳定化序列

涉及序列表

本申请含有计算机可读形式的序列表。在此将所述计算机可读形式通过引用并入。

涉及生物材料的保藏

本申请包含对生物材料保藏的涉及，在此将所述保藏通过引用并入。

发明背景

发明领域

本发明涉及在细菌宿主细胞中产生具有生物学活性的多肽的方法。本发明还涉及分离的修饰型mRNA加工/稳定化序列(modified mRNAprocessing/stabilizing sequence)，还涉及核酸构建体、载体和宿主细胞，其包含与用于表达多核苷酸序列的启动子区可操作地连接的所述修饰型mRNA加工/稳定化序列，所述多核苷酸序列编码具有生物学活性的多肽序列。

相关技术描述

具有生物学活性的天然或异源多肽在细菌宿主细胞，特别是芽孢杆菌属(Bacillus)细胞中的重组生产可为以适合商用的量(commercially relevantquantities)生产物质提供一种更理想的手段(vehicle)。

具有生物学活性的天然或异源多肽的重组生产通过构建表达盒(expression cassette)来完成，在所述表达盒中将编码所述多肽的DNA置于启动子的表达调控之下，所述启动子是从受调节的基因切下的，适合用于所述宿主细胞。将表达盒导入宿主细胞，通常通过质粒介导的转化进行。然后多肽的产生通过在表达盒中所含启动子正确发挥功能所必需的诱导条件下培养经转化的宿主细胞来实现。

翻译起始频率、密码子选择和RNA二级结构是影响细菌中mRNA稳定性的因素(Régnier和Arraiano，2000，Bioessays 22：235-244；Steege，2000，RNA6：1079-1090)。在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中，mRNA稳定性受到在5′-非翻译区处核糖体停顿(stalling)的影响。例如，发现枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprE)的稳定性由于基因前导区中存在核糖体结合位点(Shine-Dalgarno序列)而在枯草芽孢杆菌中具有大约25分钟的长半衰期(Hambraeus等，2002，Microbiology 148：1795-1803)。在16S核糖体RNA的3′-OH端的Shine-Dalgarno序列的互补性决定了核糖体亚单位和mRNA之间的亲和力。已经报导了核糖体亚单位固定于5′-UTR是枯草芽孢杆菌中mRNA稳定性的诱导者(Sharp和Bechhofer，2003，J.Bacteriology 173：4952-4958)。已经提出被称作稳定子序列(stabilizer sequence)的Shine-Dalgarno样序列在5′-UTR中的存在是引起针对cryIIIA基因的高mRNA稳定性的原因之一(Agaisse和Lereclus，1996，Mol.Microbiol.20：633-643)。美国专利Nos.6,255,076和5,955,310描述了使用cryIIIA mRNA稳定子序列用于改进酶在芽孢杆菌属细胞中的表达的用途。Daguer等，2005，Letters in AppliedMicrobiology 41：221-226描述了增加sacB转录物的稳定性可改进枯草芽孢杆菌中的果聚糖蔗糖酶产生。

在本领域中提供新方法用于转录稳定化以改进细菌宿主菌株表达的多肽的水平将是有利的。

本发明涉及改进的在细菌宿主细胞中产生具有生物学活性的多肽的方法。

发明概述

本发明涉及在细菌宿主细胞中产生具有生物学活性的多肽的方法，包括：(a)在有益于产生所述具有生物学活性的多肽的培养基中培养细菌宿主细胞，其中所述细菌宿主细胞包含核酸构建体，该核酸构建体包含启动子区，该启动子区与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列和位于所述启动子区下游和所述编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合位点(RBS)上游的修饰型mRNA加工/稳定化序列可操作地连接，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高的表达；和(b)从培养基分离所述具有生物学活性的多肽。

本发明还涉及包含核酸构建体的细菌宿主细胞，所述核酸构建体包含启动子区，该启动子区与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列和位于所述启动子区下游和所述编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合位点上游的修饰型mRNA加工/稳定化序列可操作地连接，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高的表达。

本发明还涉及获得细菌宿主细胞的方法，包括向细菌细胞导入核酸构建体，所述核酸构建体包含启动子区，该启动子区与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列和位于所述启动子区下游和所述编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合位点上游的修饰型mRNA加工/稳定化序列可操作地连接，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高的表达。

本发明还涉及修饰型mRNA加工/稳定化序列。

本发明还涉及核酸构建体，其包含启动子区，该启动子区与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列和位于所述启动子区下游和所述编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合位点上游的修饰型mRNA加工/稳定化序列可操作地连接，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高的表达。

本发明进一步涉及产生细菌宿主细胞不含选择标记的突变体的方法，包括缺失细菌宿主细胞的选择标记基因，其中所述细菌细胞包含核酸构建体，该核酸构建体包含启动子区，该启动子与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列和位于所述启动子区下游和所述编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合位点上游的修饰型mRNA加工/稳定化序列可操作地连接，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高的表达。

附图简述

图1显示未加工的mRNA的示意图，和与所表达的基因相关的各种修饰型mRNA加工/稳定化Shine-Dalgarno(S-D)序列、所述基因的内源核糖体结合位点(RBS)和转录终止子序列的位置(茎-环)。“野生型”表示未修饰的mRNA加工/稳定化序列。“修饰型1”是实施例5中描述的mRNA加工/稳定化序列的修饰形式。“修饰型2、3和4”是多种不同的修饰型mRNA加工/稳定化序列。“修饰型2”含有一个额外的Shine-Dalgarno序列，其类似于“修饰型1”，只是所述额外的Shine-Dalgarno序列在不同的位置。“修饰型3和4”含有额外的位于不同位置的Shine-Dalgarno序列。所有额外的Shine-Dalgarno序列都位于基因的内源RBS和未加工的mRNA的5’端之间。

图2显示pGME079的限制图。

图3显示pNBT48的限制图。

图4显示pNBT55的限制图。

图5显示pNBT56的限制图。

图6显示从枯草芽孢杆菌菌株BW198(P_amyQ/cryIIIA stab/aprH表达盒)和BW199(P_amyQ/mod.cryIIIA stab/aprH表达盒)获得的摇瓶中的相对克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)碱性蛋白酶(AprH)活性。

图7显示pGME085的限制图。

图8显示pGME080的限制图。

图9显示从枯草芽孢杆菌菌株GME200(野生型P_cryIIIA/cryIIIA stab/aprH表达盒)、GME201(P_{共有cryIIIA}/cryIIIA stab/aprH表达盒)、GME202(P_cryIIIA/mod.cryIIIA stab/aprH表达盒)和GME203(P_{共有cryIIIA}/mod.cryIIIA stab/aprH表达盒)获得的摇瓶中的相对克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(AprH)活性。

图10显示pMDT131的限制图。

图11显示pMDT159的限制图。

图12显示pMDT160的限制图。

图13显示pHyGe203的限制图。

图14显示pHyGe205的限制图。

图15显示pHyGe201的限制图。

图16显示pHyGe206的限制图。

图17显示三联启动子(triple tandem promoter)变体对地衣芽孢杆菌菌株HyGe210和HyGe211中克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(AprH)生产的作用。

图18显示pKK223-3的限制图。

图19显示pNBT51的限制图。

图20显示pNBT52的限制图。

图21显示pNBT53的限制图。

图22显示pNBT54的限制图。

图23显示pNBT35的限制图。

图24显示pNBT30的限制图。

图25显示pNBT31的限制图。

图26显示pNBT36的限制图。

图27显示pMDT100的限制图。

图28显示pMDT174的限制图。

图29显示枯草芽孢杆菌菌株MDT134和MDT135的相对蛋白酶活性。

定义

信使RNA(mRNA)加工/稳定化序列：术语“mRNA加工/稳定化序列”在本文定义为这样的序列，其位于启动子区下游和编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸的翻译起始位点(即，核糖体结合位点；RBS)上游，所述启动子区与该序列可操作地连接，由此可以使从启动子区合成的所有mRNA得到加工以生成在其5′端具有稳定子序列(stabilizer sequence)的mRNA转录物。这种稳定子序列在mRNA转录物的5′端的存在使mRNA转录物的半衰期增加(Agaisse和Lereclus，1994，见上文，Hue等，1995，Journal of Bacteriology177：3465-3471)。所述mRNA加工/稳定化序列与细菌16S核糖体RNA的3′最末端互补。在优选的方面，所述mRNA加工/稳定化序列生成基本上单一大小的转录物，所述转录物在其5′端具有稳定化序列。mRNA加工/稳定化序列优选与细菌16S核糖体RNA的3′最末端互补。参见，例如，美国专利Nos.6,255,076和5,955,310。

Shine-Dalgarno序列：术语“Shine-Dalgarno序列”在本文定义为在信使RNA分子中核糖体将与之结合的核苷酸序列。这样的序列与细菌16S核糖体RNA的3’端互补。

在优选的方面，Shine-Dalgarno序列包含序列GGAG。在另一优选的方面，Shine-Dalgarno序列包含序列GGAGG。在另一优选的方面，Shine-Dalgarno序列包含序列AGAAAGGAGG(SEQ ID NO：1)。在另一优选的方面，Shine-Dalgarno序列包含序列AGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCACC(SEQ ID NO：2)。在另一优选的方面，Shine-Dalgarno序列包含序列TAGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCACCTT(SEQ ID NO：3)。

未修饰的mRNA加工/稳定化序列：术语“未修饰的mRNA加工/稳定化序列”在本文定义为包含mRNA加工/稳定化序列的野生型多核苷酸。

修饰型mRNA加工/稳定化序列：术语“修饰型mRNA加工/稳定化序列”在本文定义为经过重组修饰而包含至少一个额外的Shine-Dalgarno序列拷贝的mRNA稳定化序列，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使多核苷酸序列的更高的表达。

启动子：术语“启动子”在本文定义为这样的DNA序列，其结合RNA聚合酶并指导该聚合酶到达多核苷酸的正确下游转录起始位点以起始转录，所述多核苷酸编码具有生物学活性的多肽。RNA聚合酶有效地催化与编码区的适当DNA链互补的信使RNA装配。术语“启动子”还应理解为包括用于在转录成mRNA之后的翻译的5′非编码区(启动子和翻译起点之间)，顺式作用转录调控元件例如增强子，和/或其它能够与转录因子相互作用的核苷酸序列。启动子可以是野生型启动子、变体启动子、杂合启动子体或共有启动子(consensus promoter)。

启动子区：术语“启动子区”在本文定义为包含一个或多个(几个)启动子序列的核苷酸序列，例如串联三启动子(tandem triple promoter)。

启动子变体：术语“启动子变体”在本文定义为这样的启动子，其具有的核苷酸序列包含对亲本启动子的一个或多个(几个)核苷酸的取代、缺失和/或插入，其中所述突变启动子比相应的亲本启动子具有更高或更低的启动子活性。术语“启动子变体”还将包括天然变体和使用本领域公知的方法获得的体外生成的变体，所述方法如经典诱变、定点诱变和DNA改组。

串联启动子：术语“串联启动子”在本文定义为两个或更多个启动子序列，其中每一个都和编码序列可操作地连接并且介导所述编码序列转录成mRNA。

杂合启动子：术语“杂合启动子”在本文定义为两个或更多个启动子的部分，其融合在一起生成的序列是所述两个或更多个启动子的融合体，当与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸编码序列可操作地连接时，其介导该编码区转录成mRNA。

分离的多肽：术语“分离的多肽”如用于本文是指从某个来源分离的多肽。在优选的方面，所述多肽为至少1％纯，优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯，如通过SDS-PAGE测定的。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，所述多肽制备物按重量计含有至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的(natively orrecombinantly associated)其它多肽材料。因此，优选的是所述基本上纯的多肽是按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计至少92％纯，优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，更优选至少98％纯，甚至更优选至少99％纯，最优选至少99.5％纯，并且甚至最优选100％纯。本发明的多肽优选是基本上纯的形式，即，所述多肽制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多肽材料。这可以通过，例如，用公知的重组方法或由经典纯化方法制备多肽来实现。

分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”用于本文是指从某个来源分离的多核苷酸。在优选的方面，多核苷酸为至少1％纯，优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯，如通过琼脂糖电泳测定的。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文是指不含其它外来的或不期望的核苷酸的多核苷酸制备物，并且所述多核苷酸制备物处于适合于在遗传工程化蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸按重量计含有至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90％纯，优选至少92％纯，更优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，甚至更优选至少98％纯，最优选至少99％，并且甚至最优选至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选是基本上纯的形式，即，所述多核苷酸制备物基本上不含(essentially free of)与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。

核酸构建体：术语“核酸构建体”如用于本文是指单链或双链的核酸分子，其从天然存在的基因分离，或其经过修饰从而以本不存在于自然界的方式含有核酸的区段(segment)，或其是合成的。当核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

调控序列：术语“调控序列”在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸的表达是必需的所有成分。每个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括，但不限于，前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况下，调控序列包括启动子，以及转录和翻译的停止信号。调控序列可以与接头一起提供，所述接头的目的是引入特异性限制位点，促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列的编码区连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽的编码序列的表达。

编码序列：当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开放阅读框决定，所述开放阅读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始，并以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组核苷酸序列。

表达：术语“表达”包括多肽的产生所涉及的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

宿主细胞：如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何对于使用核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导、接合等易感的(susceptible)细胞类型。

发明详述

本发明涉及在细菌宿主细胞中产生具有生物学活性的多肽的方法，包括：(a)在有益于产生所述具有生物学活性的多肽的培养基中培养细菌宿主细胞，其中所述细菌宿主细胞包含核酸构建体，该核酸构建体包含启动子区，该启动子区与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列和位于所述启动子区下游和所述编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合位点(RBS)上游的修饰型mRNA加工/稳定化序列可操作地连接，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高的表达；和(b)从培养基分离具有生物学活性的多肽。

本发明的一个优势在于，为了获得饱和水平的mRNA而需要向宿主染色体中导入的表达盒拷贝较少，由此显著缩短构建生产菌株所需的时间长度。同样，本发明允许在当前技术不足以生成饱和水平的mRNA的情况下有更高水平的基因表达。

在优选的方面，修饰型mRNA加工/稳定化序列与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使多核苷酸序列的表达高出至少15％，优选至少25％，更优选至少50％，更优选至少75％，更优选至少100％，更优选至少150％，更优选至少200％，更优选至少250％，甚至更优选至少300％，最优选至少400％，并且甚至最优选至少500％。

信使RNA(mRNA)加工/稳定化序列

本发明还涉及修饰型mRNA加工/稳定化序列。任何mRNA加工/稳定化序列可以用作亲本来构建本发明的修饰型mRNA加工/稳定化序列。

本发明的修饰型mRNA加工/稳定化序列包含至少一个额外的Shine-Dalgarno序列，该序列为其所连接的mRNA提供增强的保护，由此，与利用野生型mRNA稳定化序列的构建体相比产生更高水平的基因表达。所述至少一个额外的Shine-Dalgarno序列可以是与所述mRNA加工/稳定化序列天然结合的或所述mRNA加工/稳定化序列固有的Shine-Dalgarno序列的副本(duplicate)，或者可以获得自不同的mRNA加工/稳定化序列。图1显示的是未加工mRNA的示意图，和与表达的基因相关的各种修饰型mRNA加工/稳定化序列、内源核糖体结合位点(RBS)和转录终止子序列的位置(茎-环)。

在优选的方面，修饰型mRNA加工/稳定化序列包含至少两个Shine-Dalgarno序列。在另一优选的方面，修饰型mRNA加工/稳定化序列包含至少三个Shine-Dalgarno序列。在另一优选的方面，修饰型mRNA加工/稳定化序列包含至少四个Shine-Dalgarno序列。在另一优选的方面，修饰型mRNA加工/稳定化序列包含至少五个Shine-Dalgarno序列。

在另一优选的方面，修饰型mRNA加工/稳定化序列包含的Shine-Dalgarno序列(a Shine-Dalgarno sequence comprising the modifiedmRNA processing/stabilizing sequence)至少为4bp。在另一优选的方面，修饰型mRNA加工/稳定化序列包含的Shine-Dalgarno序列至少为5bp。在另一优选的方面，修饰型mRNA加工/稳定化序列包含的Shine-Dalgarno序列至少为10bp。在另一优选的方面，修饰型mRNA加工/稳定化序列包含的Shine-Dalgarno序列至少为15bp。在另一优选的方面，修饰型mRNA加工/稳定化序列包含的Shine-Dalgarno序列至少为20bp。在另一优选的方面，修饰型mRNA加工/稳定化序列包含的Shine-Dalgarno序列至少为25bp。在另一优选的方面，修饰型mRNA加工/稳定化序列包含的Shine-Dalgarno序列至少为30bp。

修饰型mRNA加工/稳定化序列的构建可以(1)通过除已经存在的Shine-Delgarno/mRNA稳定化序列之外，将一个或多个(几个)Shine-Delgarno序列置于感兴趣的基因的转录起始位点和基因的RBS之间，或(2)通过将两个或更多个(几个)Shine-Delgarno序列置于感兴趣的基因的转录起始位点和基因的RBS之间，其中所述基因除了原有的RBS之外先前不含Shine-Delgarno/mRNA稳定化序列。修饰型mRNA加工/稳定化序列可以从不同于所述基因的Shine-Delgarno序列构建。修饰型mRNA加工/稳定化序列的每个Shine-Delgarno序列可以是相同的序列或一个或多个(几个)不同序列的组合。例如，如本文所述，将额外的Shine-Delgarno序列置于已经存在的Shine-Delgarno/mRNA稳定化序列和RBS之间。由于RBS本身通常也是Shine-Delgarno序列，因此在未加工的mRNA上存在最少三个Shine-Delgarno序列。前两个(从5’端起)赋予mRNA稳定性，而第三个(RBS)指导mRNA的翻译。

在优选的方面，亲本mRNA加工/稳定化序列是WO 94/25612和Agaisse和Lereclus，1994，Molecular Microbiology 13：97-107中公开的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)cryIIIA mRNA加工/稳定化序列，或其保留着mRNA加工/稳定化功能的部分。

在另一优选的方面，亲本mRNA加工/稳定化序列是Hue等，1995，见上文中公开的枯草芽孢杆菌SP82mRNA加工/稳定化序列，或其保留着mRNA加工/稳定化功能的部分。

在更优选的方面，cryIIIA mRNA加工/稳定化序列是SEQ ID NO：4，或保留着SEQ ID NO：4的mRNA稳定化功能的SEQ ID NO：4的一部分。

在另一更优选的方面，SP82mRNA加工/稳定化序列是SEQ ID NO：5，或保留着SEQ ID NO：5的mRNA稳定化功能的SEQ ID NO：5的一部分。

在优选的方面，修饰型mRNA加工/稳定化序列是SEQ ID NO：6，或保留着SEQ ID NO：6的mRNA稳定化功能的SEQ ID NO：6的一部分。

修饰型mRNA加工/稳定化序列优选位于启动子区的下游和基因的核糖体结合位点的上游。然而，修饰型mRNA加工/稳定化序列可以位于启动子区包含的任何启动子的下游(downstream of any promoter comprising thepromoter region)，和编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合位点的上游。另外，修饰型mRNA加工/稳定化序列可以位于启动子区包含的每个启动子的下游，和编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合位点的上游。修饰型mRNA加工/稳定化序列的亲本对于启动子区的一个或多个(几个)启动子可以是外源的。

编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸

由导入细菌宿主细胞中的多核苷酸编码的具有生物学活性的多肽可以是感兴趣的任何多肽。术语“多肽”在此不是指特定长度的编码产物，因此，包括肽、寡肽和蛋白质。多肽对于细菌宿主细胞可以是天然的或异源(外源)的。术语“异源多肽”在本文定义为：多肽，其对于宿主细胞不是天然的；天然多肽，其中进行过结构修饰而改变了天然多肽，例如，天然多肽的蛋白质序列；或天然多肽，由于通过重组DNA技术对编码所述多肽的DNA进行了操作(例如，较强的启动子)而使所述天然多肽的表达量改变。多肽可以是任何多肽的工程化变体。

在优选的方面，多肽是抗体、抗原、抗微生物肽、酶、生长因子、激素、免疫调节剂(immunodilator)、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白和转录因子。

在更优选的方面，多肽是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。在最优选的方面，多肽是乙酰木聚糖酯酶(acetylxylan esterase)、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、阿魏酸酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖脑苷脂酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变构酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、尿激酶或木聚糖酶。

在另一优选的方面，多肽是清蛋白、胶原、原弹性蛋白、弹性蛋白或明胶。

在另一优选的方面，多肽是杂合多肽，其包含从至少两种不同多肽获得的部分或完整多肽序列的组合，其中的一种或多种(几种)对于细菌宿主细胞可以是异源的。

在另一优选的方面，多肽是融合的多肽，其中将另一多肽融合在所述多肽或其片段的N-末端或C-末端。融合的多肽是通过将编码一种多肽的核苷酸序列(或其部分)与编码另一多肽的核苷酸序列(或其片段)融合来产生的。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括，连接编码多肽的编码序列从而使它们符合阅读框并且使所述融合的多肽的表达在相同启动子和终止子的调控下。

编码感兴趣的多肽的多核苷酸可以获得自任何原核、真核或其它来源。就本发明而言，术语“获得自”用于本文中与具体的微生物来源有关，意思应该是多肽由所述来源产生，或由其中已插入来自该来源的基因的细胞产生。

用于分离或克隆编码感兴趣多肽的多核苷酸的技术是本领域已知的，并且包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或它们的组合。从这种基因组DNA克隆感兴趣的多核苷酸可以例如通过使用公知的聚合酶链式反应(PCR)来实现。参见，例如，Innis等，1990，PCR Protocols：A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。克隆步骤可以牵涉切下和分离包含编码多肽的多核苷酸的核酸片段，将所述片段插入载体分子，和将重组载体并入细菌宿主细胞，在该细菌宿主细胞中将复制所述多核苷酸的多个拷贝或克隆。DNA可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。

可以用许多方式操作编码感兴趣的多肽的多核苷酸以提供多核苷酸在合适细菌宿主细胞中的表达。为编码感兴趣的多肽的多核苷酸构建核酸构建体和重组表达载体可以如本文关于表达具有生物学活性的多肽所描述的来进行。

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，其包含与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列可操作地连接的启动子区，和位于所述启动子区下游和所述编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合位点(RBS)上游的修饰型mRNA加工/稳定化序列。

构建包含与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列可操作地连接的启动子区和本发明的修饰型mRNA加工/稳定化序列(其位于启动子区的下游和多核苷酸序列核糖体结合位点的上游)的核酸构建体可以如下完成：通过使用本领域公知的方法修饰所述多核苷酸序列，以将启动子区和修饰型mRNA加工/稳定化序列，以及其它调控序列，与所述多核苷酸可操作地连接，将所述构建体插入载体，再将所述载体通过同源重组导入细菌细胞的染色体或作为染色体外自主复制元件(例如，质粒)导入细菌细胞。

每个调控序列对于编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列可以是天然的或外源的。这些调控序列包括，但不限于，前导序列、启动子区、信号序列和转录终止子。最少的情况下，调控序列包括启动子区，以及转录和翻译的停止信号。调控序列可以与接头一起提供，所述接头的目的是引入特异性限制位点，促进调控序列与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列编码区连接。

启动子区。启动子区可以包含单个启动子或多个启动子的组合。在启动子区包含多个启动子的组合的情况下，多个启动子优选是前后串联的(intandem)。启动子区的启动子可以是能够在感兴趣的细菌宿主细胞中起始编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸转录的任何启动子。启动子对于编码具有生物学活性的多肽的核苷酸序列可以是天然的、外源的、或它们的组合。这样的启动子可以从指导具有生物学活性的胞外或胞内多肽(对于细菌宿主细胞是同源的或异源的)合成的基因获得。

在优选的方面，启动子区包含从细菌来源获得的启动子。在更优选的方面，启动子区包含从革兰氏阳性细菌获得的启动子。在另一更优选的方面，启动子区包含从革兰氏阴性细菌获得的启动子。革兰氏阳性细菌包括，但不限于，芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)和海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)。革兰氏阴性细菌包括，但不限于，大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)和尿枝原体属(Ureaplasma)。

在最优选的方面，启动子区包含从以下菌株获得的启动子：芽孢杆菌属菌株，例如，Bacillus agaradherens、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)；或链霉菌属菌株，例如浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)。

用于在本发明的方法中指导编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、迟缓芽孢杆菌或克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprH)、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(枯草蛋白酶Carlsberg基因(subtilisin Carlsberg gene))、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyE)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌拟步行甲亚种(Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis)CryIIIA基因(cryIIIA)或其部分，原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA75：3727-3731)，和巨大芽孢杆菌xylA基因(Rygus和Hillen，1992，J.Bacteriol.174：3049-3055；Kim等，1996，Gene 181：71-76)，以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80：21-25)，质粒pUB110的orfβ启动子(Tortosa等，2000，Mol.Microbiol.35：1110-1119)，和spac启动子(Henner，1990，Methods Enzymol.185：223-228)。其它实例是spo1噬菌体启动子和tac启动子的启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 80：21-25)。另外的启动子在″Useful proteinsfrom recombinant bacteria″于Scientific American，1980，242：74-94；及Sambrook，Fritsch和Maniatus，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，New York中描述。

在另一优选的方面，启动子区包含的启动子是“共有”启动子，其具有″-35″区的序列TTGACA和″-10″区的TATAAT。共有启动子可以从能够在细菌宿主细胞例如芽孢杆菌属宿主细胞中发挥功能的任何启动子获得。可以使用本领域公知的方法通过定点诱变完成“共有”启动子的构建以创造启动子，该启动子更加完美地符合枯草芽孢杆菌营养型(vegetative)“σA型”启动子″-10″和″-35″区的已确定的共有序列(Voskuil等，1995，Molecular Microbiology17：271-279)。

在另一优选的方面，启动子包含“共有”启动子，该“共有”启动子获得自从以下获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、克劳氏芽孢杆菌或迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprH)、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(枯草蛋白酶Carlsberg基因)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyE)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌拟步行甲亚种CryIIIA基因(cryIIIA)或其部分，或原核β-内酰胺酶基因spo1细菌的噬菌体启动子。

在更优选的方面，启动子区包含获得自解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的“共有”启动子。

在另一优选的方面，启动子区包含的启动子是杂合启动子。

在另一优选的方面，启动子区包含的启动子是变体启动子。参见，例如，WO 05/098016，美国专利No.5,698,415和美国专利No.6,100,063。在优选的方面，变体启动子是P_amyL4199，其中P＝启动子。

在另一优选的方面，启动子区包含的启动子是串联启动子。参见，例如，WO 99/043835和WO 05/098016。在优选的方面，串联启动子是P_共有amyQ-P_cryIIIA-cryIIIA mRNA加工/稳定化序列。在另一优选的方面，串联启动子是P_amyL4199-P_共有amyQ-P_cryIIIA-cryIIIA mRNA加工/稳定化序列。

在本发明的方法中，杂合启动子或串联启动子将被理解为对于编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列是外源的，即使野生型启动子对于所述多核苷酸序列是天然的。例如，在由至少两个启动子组成的串联启动子中，其中一个启动子可以是编码生物学物质的多核苷酸的野生型启动子。

终止子。调控序列还可以是合适的转录终止子序列，其是由细菌细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码具有生物学活性的多肽的核苷酸序列3’末端可操作地连接。在所选细菌宿主细胞中有功能的任何终止子均可以在本发明中使用。

前导序列。调控序列还可以是合适的前导序列，其是mRNA非翻译区，对于细菌细胞的翻译是重要的。前导序列与指导具有生物学活性的多肽合成的核苷酸序列的5’末端可操作地连接。在所选细菌宿主细胞中有功能的任何前导序列可以用于本发明中。

信号肽编码区。调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基末端连接的氨基酸序列，其能够指导表达的多肽进入细胞的分泌途径。信号肽编码区对于多肽可以是天然的或可以得自外源。编码多肽的多核苷酸编码序列的5’端可以固有地(inherently)含有信号肽编码区，其天然地在翻译阅读框之内与编码所分泌多肽的编码区片段连接。或者，编码序列的5′端可以含有信号肽编码区，其对于编码所分泌多肽的编码序列部分是外源的。当编码序列天然不含信号肽编码区时，可能需要外源信号肽编码区。或者，外源信号肽编码区可以简单地代替天然信号肽编码区，以获得相对于通常与编码序列连接的天然信号肽编码区增强的多肽分泌。信号肽编码区可以从例如芽孢杆菌属菌种的淀粉酶或蛋白酶基因获得。然而，能够指导表达的多肽进入所选细菌宿主细胞分泌途径的任何信号肽编码区可以在本发明中使用。

对于细菌细胞，例如芽孢杆菌属细胞有效的信号肽编码区是获得自以下基因的信号肽编码区：来自芽孢杆菌属NCIB 11837的产麦芽淀粉酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶基因、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA基因。另外的信号肽由Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137描述。

选择标记。核酸构建体可以进一步含有一个或多个(几个)选择标记，其允许简单选择转化的细胞。选择标记是基因，其产物提供杀生物剂抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。细菌选择标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，例如氨苄青霉素、卡那霉素、红霉素、氯霉素或四环素抗性。另外，选择可以通过共转化完成，例如，如WO 91/09129中所述，其中选择标记在单独的载体上。

然后可以使用本领域已知的方法或那些在本文中描述的用于表达具有生物学活性的多肽的方法将核酸构建体导入细菌宿主细胞。细菌宿主细胞可以含有相同核酸构建体的一个或多个(几个)拷贝，或至少两种不同核酸构建体的一个或多个(几个)拷贝，其中每种构建体都如上文所述构建。

表达载体

在本发明的方法中，重组表达载体可以构建成包含与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列可操作地连接的启动子区，和本发明的修饰型mRNA加工/稳定化序列，其位于启动子区的下游和编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合位点的上游。可以将上述的多种核酸和调控序列结合在一起，产生重组表达载体，其可能包括一个或多个(几个)方便的限制位点，以允许在这些位点插入或取代多核苷酸。或者，可以通过将多核苷酸序列或包含该多核苷酸序列的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列。在创建表达载体的过程中，将编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列置于载体中，使得该编码序列与启动子区和修饰型mRNA加工/稳定化序列，以及任何其它用于表达和可能用于易位(translocation)的适当调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是能够方便地进行重组DNA方法并且在导入细菌宿主细胞时能够引起具有生物学活性的多肽表达的任何载体。载体的选择将通常依赖于载体与将导入该载体的细菌宿主细胞的相容性。载体可以是线性的或闭合环状的质粒。载体可以是自主复制的载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以含有保证自复制的任何手段。或者，载体可以是一种当被导入细菌宿主细胞中时，整合到染色体中并且与其所整合的染色体一起复制的载体。载体系统可以是单一载体或质粒，或是两个或更多个的载体或质粒，或是转座子。

“导入”是指将载体导入细菌宿主细胞从而使所述载体作为染色体整合体或作为自复制的染色体外载体保留。通常认为整合是一种优势，因为更有可能将一个或多个(几个)编码序列或基因稳定地保留在细胞中。将载体整合入染色体通过同源重组、非同源重组或转座来进行。

例如，将表达载体导入细菌宿主细胞可以通过转化、转染、转导、接合等来进行。

对于整合，载体可以依赖于任何载体元件通过同源重组将载体稳定整合入基因组。载体可以含有额外的多核苷酸序列用于指导通过同源重组向细菌宿主细胞基因组中的整合。所述额外的多核苷酸序列使得载体能够整合入细菌宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应该优选含有足够数目的与相应目标序列高度同源的核酸，如100至10,000个碱基对，优选400至10,000个碱基对，并且最优选800至10,000个碱基对，以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何多核苷酸序列，其与细菌宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码序列。

为了自主复制，载体可以进一步包含使载体能够在所述的芽孢杆菌属细胞中自主复制的复制起点。细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。复制起点可以具有突变，其使得该复制起点的功能在细菌宿主细胞中是温度敏感的(参见，例如，Ehrlich，1978，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 75：1433)。

用于连接上述元件以构建重组表达载体的方法是本领域技术人员公知的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。

细菌宿主细胞

本发明还涉及细菌宿主细胞，其包含与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列可操作地连接的启动子区，和本发明的修饰型mRNA加工/稳定化序列，该序列位于启动子区的下游和编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合位点的上游，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高的表达。在优选的方面，细菌细胞不含外源(异源)选择标记基因。

本发明还涉及获得细菌宿主细胞的方法，包括向细菌细胞导入核酸构建体，该核酸构建体包含与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列可操作地连接的启动子区，和本发明的修饰型mRNA加工/稳定化序列，该序列位于启动子区的下游和编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合位点的上游，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高的表达。

细菌宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括，但不限于，芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、梭菌属、土芽孢杆菌属和海洋芽孢杆菌属。革兰氏阴性细菌包括，但不限于，大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏球菌属和尿枝原体属。

在本发明的方法中，细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞。在本发明的实施中有用的芽孢杆菌属细胞包括，但不限于，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌(bacillus atrophaeus)、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)细胞。

在优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在更优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另一更优选的方面，细菌宿主细胞是克劳氏芽孢杆菌细胞。在另一更优选的方面，细菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一更优选的方面，细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。

在本发明的方法中，细菌宿主细胞可以是任何链球菌属细胞。在本发明的实践中有用的链球菌属细胞包括，但不限于，似马链球菌(Streptococcusequisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcusuberis)和马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)。

在另一优选的方面，细菌宿主细胞是似马链球菌细胞。在另一优选的方面中，细菌宿主细胞是酿脓链球菌细胞。在另一优选的方面中，细菌宿主细胞是乳房链球菌细胞。在另一优选的方面中，细菌宿主细胞是马链球菌兽瘟亚种细胞。

在本发明的方法中，细菌宿主细胞也可以是任何链霉菌属细胞。在本发明的实践中有用的链霉菌属细胞包括，但不限于，不产色链霉菌(Streptomycesachromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和浅青紫链霉菌。

在另一优选的方面，细菌宿主细胞是不产色链霉菌细胞。在另一优选的方面中，细菌宿主细胞是除虫链霉菌细胞。在另一优选的方面中，细菌宿主细胞是天蓝色链霉菌细胞。在另一优选的方面中，细菌宿主细胞是灰色链霉菌细胞。在另一优选的方面中，细菌宿主细胞是浅青紫链霉菌细胞。

在本发明的另一方面，细菌宿主细胞可以额外地含有对其它基因的修饰，例如，缺失或破坏(disruption)，所述其它基因可能对具有生物学活性的多肽的生产、回收和/或应用有害。在优选的方面，细菌宿主细胞是蛋白酶缺陷型细胞。在更优选的方面，细菌宿主细胞，例如，芽孢杆菌属细胞，包含对aprE和nprE的破坏或缺失。在另一优选的方面，细菌宿主细胞不产孢子。在另一更优选的方面，细菌宿主细胞，例如，芽孢杆菌属细胞，包含对spoIIAC的破坏或缺失。在另一优选的方面，细菌宿主细胞，例如，芽孢杆菌属细胞，包含对表面活性肽生物合成中涉及的基因(例如，srfA、srfB、srfC和srfD)之一的破坏或缺失。参见，例如，美国专利No.5,958,728。对具有生物学活性的多肽的生产、回收和/或应用有害的其它基因(例如，amyE基因)也可以被破坏或缺失。

可以例如通过如下方法实现将DNA导入芽孢杆菌属细胞：原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen，1961，Journal of Bacteriology81：823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology56：209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology169：5271-5278)。可以例如通过如下方法实现将DNA导入大肠杆菌细胞：原生质体转化(参见，例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166：557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等，1988，Nucleic Acids Res.16：6127-6145)。可以例如通过如下方法实现将DNA导入链霉菌属细胞：原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等，2004，Folia Microbiol.(Praha)49：399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171：3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：6289-6294)。可以例如通过如下方法实现将DNA导入假单胞菌属细胞：电穿孔(参见，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods 64：391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71：51-57)。可以例如通过如下方法实现将DNA导入链球菌属细胞：天然感受态(参见，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.32：1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios.68：189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65：3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45：409-436)。然而，可以使用任何本领域已知用于将DNA导入宿主细胞的方法。

生产

在本发明的产生方法中，使用本领域已知的方法在适合于具有生物学活性的多肽产生的营养培养基中培养细菌宿主细胞。例如，可以通过在合适的培养基中以及允许具有生物学活性的多肽表达和/或分离的条件下进行的、在实验室中或工业发酵罐中的摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。在包含碳源和氮源和无机盐的合适的营养培养基中，使用本领域已知的方法进行培养。合适的培养基可以从商业供应商获得，或可以根据已公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果具有生物学活性的多肽分泌至营养培养基中，那么能够直接从培养基中回收所述多肽。如果具有生物学活性的多肽不分泌，那么可以从细胞裂解物中回收所述多肽。

具有生物学活性的多肽可以使用本领域已知的、特别用于所述具有生物学活性的多肽的方法来检测。这些检测方法可以包括使用特异性抗体、高效液相层析、毛细管层析、酶产物的形成、酶底物的消失或SDS-PAGE。例如，可以使用酶测定法来测定酶的活性。对于许多酶用于测定酶活性的步骤是本领域已知的(参见，例如，D.Schomburg和M.Salzmann(编)，Enzyme Handbook，Springer-Verlag，New York，1990)。

得到的具有生物学活性的多肽可以使用本领域公知的方法分离。例如，可以通过常规步骤，包括但不限于，离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀从营养培养基分离具有生物学活性的多肽。然后可以通过多种本领域已知的方法进一步纯化分离的具有生物学活性的多肽，所述方法包括，但不限于，层析(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)或提取(参见，例如，ProteinPurification，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)。

在本发明的方法中，当在相同的生产条件下培养时，所述细菌宿主细胞相对于含有与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列可操作地连接的启动子区和亲本mRNA加工/稳定化序列(位于所述启动子区的下游和编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合位点的上游)的细菌宿主，优选多产生至少15％，优选至少25％，更优选至少50％，更优选至少75％，更优选至少100％，更优选至少150％，更优选至少200％，更优选至少250％，甚至更优选至少300％，最优选至少400％，并且甚至最优选至少500％的具有生物学活性的多肽。

缺失/破坏

本发明还涉及产生细菌宿主细胞不含选择标记的突变体的方法，包括将细菌宿主细胞的选择标记基因缺失，其中所述细菌细胞包含核酸构建体，该核酸构建体包含与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列可操作地连接的启动子区，和位于所述启动子区下游和所述编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合位点(RBS)上游的修饰型mRNA加工/稳定化序列，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高的表达。

可以使用基因缺失或替代技术完全去除外源或异源的选择标记基因或其它不理想的基因。在这些方法中，选择标记基因的缺失可以使用质粒通过同源重组来完成，将所述质粒构建成连续地含有侧翼为选择标记基因的5′和3′区。例如，可以将连续的5′和3′区与第二选择标记相关联导入芽孢杆菌属细胞中温度敏感型质粒例如pE194上，在允许的温度下使质粒能够在细胞中逐渐确立(become established)。然后将细胞转移至非允许温度以选择在染色体中于同源侧翼区之一整合了质粒的细胞。质粒整合的选择通过选择第二选择标记来实现。整合之后，通过将细胞转移至允许温度不进行选择地增殖几代来刺激第二同源侧翼区的重组事件。将细胞铺板以获得单菌落，并检查菌落的两种选择标记的缺失(参见，例如，Perego，1993，于A.L.Sonneshein，J.A.Hoch和R.Losick编，Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria，第42章，American Society of Microbiology，Washington，D.C.，1993)。

选择标记基因还可以如下通过同源重组去除：将包含缺陷型基因的5′和3′区但是缺乏选择标记基因的核酸片段导入突变细胞，继而在反选择培养基(counter-selection medium)上选择。通过同源重组，将含有选择标记基因的缺陷型基因用缺乏选择标记基因的核酸片段代替。也可以使用本领域已知的其它方法。

也可以使用上述步骤来缺失或破坏不理想的基因。美国专利No.5,891,701公开了用于缺失包括spoIIAC、aprE、nprE和amyE的几种基因的技术。

其它不理想的生物学化合物也可以通过上述方法去除，例如由cypX(登录号BG12580)和/或yvmC(登录号B G14121)合成的红色素。

在优选的方面，未用任何外源或异源选择标记对芽孢杆菌属宿主细胞进行标记。在另一优选的方面，芽孢杆菌属宿主细胞不产生由cypX和yvmC合成的任何红色素。

通过以下实施例进一步描述本发明，但不应将这些实施例理解为对本发明范围的限制。

实施例

DNA测序

DNA测序使用Applied Biosystems Model 3130X Genetic Analyzer(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)用染料终止剂化学(dye terminatorchemistry)(Giesecke等，1992，Journal of Virol.Methods 38：47-60)进行。使用phred/phrap/consed(University of Washington，Seattle，WA，USA)用序列特异性引物来组装序列。

菌株

在枯草芽孢杆菌168Δ4中构建了芽孢杆菌属质粒。枯草芽孢杆菌168Δ4源自枯草芽孢杆菌典型菌株168(BGSC 1A1，Bacillus Genetic Stock Center，Columbus，OH，USA)并且在spoIIAC、aprE、nprE和amyE基因中具有缺失。这四个基因的缺失基本上如针对枯草芽孢杆菌A164Δ5所描述的来进行，其在美国专利No.5,891,701中详细描述。

培养基

LB培养基每升由10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g NaCl组成。

LB平板由LB培养基和每升15g Bacto琼脂组成。

LB氨苄青霉素培养基由LB培养基和每毫升100μg氨苄青霉素组成。

LB氨苄青霉素平板由LB氨苄青霉素培养基和每升15g Bacto琼脂组成。

VY培养基每升由25g小牛肉浸出物(veal infusion)(BD Diagnostics，Franklin Lakes，NJ，USA)和5g酵母提取物组成。

2X YT培养基每升由16g胰蛋白胨、10g酵母提取物和5g NaCl组成。

2X YT氨苄青霉素培养基由2X YT培养基和每毫升100μg氨苄青霉素组成。

2X YT氨苄青霉素平板每升由2X YT氨苄青霉素培养基和15g Bacto琼脂组成。

TBAB培养基由Difco Tryptose Blood Agar Base(BD Diagnostics，Franklin Lakes，NJ，USA)组成。

TBAB氯霉素平板由TBAB培养基和每毫升5μg氯霉素组成。

TBAB新霉素平板由TBAB培养基和每毫升6μg新霉素组成。

TBAB红霉素/林可霉素平板由TBAB培养基和每毫升1μg红霉素和25μg林可霉素组成。

TBAB牛奶培养基由用牛奶覆层覆盖的TBAB培养基组成，所述覆层由0.6ml溶于去离子水的无菌10％奶粉溶液添加至6ml融化的TBAB琼脂组成。

PS-1培养基每升由100g蔗糖、40g大豆粉、3.96g磷酸氢二钠(无水)、5g CaCO₃和100μl Pluronic酸组成。

实施例1：构建共有cryIIIA启动子

构建了cryIIIA启动子的共有形式，其中将天然的-35和-10区变为共有σA依赖性启动子的-35和-10区。共有cryIIIA(cry3A)启动子是通过退火两个互补的97个核苷酸的寡聚物999555和999556来构建的。

寡聚物999555：

5′-CGGGCCTTAAGGGCCCTCGAAACGTAAGATGAAACCTTAGATAAAAGTGCTTTTTTTGTTGACATTGAAGAATTATTAATGTTATAATTAATTAAGG-3′(SEQ ID NO：7)

寡聚物999556：

5′-CCTTAATTAATTATAACATTAATAATTCTTCAATGTCAACAAAAAAAGCACTTTTATCTAAGGTTTCATCTTACGTTTCGAGGGCCCTTAAGGCCCG-3′(SEQ ID NO：8)

进行两个20μl退火反应，其分别含有10μl(500pmol)和5μl(250pmol)的每种寡聚物。将两个反应在95℃温育5分钟，然后将试管逐渐冷却至室温。从每个反应获得的退火产物为大约97bp的双链DNA片段，其包括共有-35和-10启动子区、5′端的Sfi I限制位点和3′端的Pac I位点。

将每个退火产物通过PCR扩增，所述PCR使用2μl(25或12.5pmol)退火产物作为模板连同引物999557和999558，按照制造商的说明书使用EXPAND

High Fidelity PLUS PCR System(EXPAND

高保真PLUS PCR系统)(Roche Applied Science，Indianapolis，IN，USA)。

引物999557：

5′-CGGGCCTTAAGGGCCCTCGAA-3′(SEQ ID NO：9)

引物999558：

5′-CCTTAATTAATTATAACATT-3′(SEQ ID NO：10)

将两个PCR反应的产物(它们是相同的)汇集，通过使用50mM Tris碱-50mM硼酸-1mM EDTA二钠(TBE)缓冲液的2.0％琼脂糖电泳分析，并使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit(QIAQUICK

凝胶提取试剂盒)(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)纯化。

然后使用TOPO

TA Cloning Kit(TOPO

TA克隆试剂盒)(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)将纯化的97bp PCR产物克隆入pCR2.1中，再按照制造商的说明书转化入ONE SHOT

TOP10化学感受态的大肠杆菌细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。使用BIOROBOT9600(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)从几个转化体纯化了质粒DNA，再通过用Eco RI消化继之以在TBE缓冲液中进行0.8％琼脂糖电泳来测验克隆的PCR片段的存在。将一个具有大约3.94kb和115bp的Eco RI片段的质粒命名为pCR2.1-共有cryIIIA。通过DNA测序确认了克隆的PCR片段的DNA序列。

将质粒pCR2.1-共有cryIIIA用Sfi I和Pac I消化，并且通过在TBE缓冲液中进行2.0％琼脂糖电泳来分析，再使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了含有共有cryIIIA启动子的大约82bp的片段。将质粒pNBT2(pDG268Δ-P_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV，美国专利No.6,255,076)用Sfi I和Pac I消化，并且通过在TBE缓冲液中进行2.0％琼脂糖电泳来分析，再使用QIAQUICKGel Extraction Kit纯化了含有共有cryIIIA启动子的大约7162bp的载体片段。将pNBT2载体片段和共有cryIIIA启动子片段用T4DNA连接酶(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN，USA)按照制造商的说明书连接起来，并且将大肠杆菌XL10-GOLD

Ultracompetent(超感受态)细胞(Stratagene Corporation，La Jolla，CA，USA)用所述连接物(ligation)按照制造商的说明书转化。使用BIOROBOT9600从几个转化体纯化了质粒DNA，并且通过用Eco RI和Sfi I消化继之以在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了测试。将一个具有大约5799bp和1446bp的预期片段的质粒命名为pGME079(图2)。

将质粒pGME079通过用Sca I消化来线性化。将枯草芽孢杆菌168Δ4用所述线性化的质粒按照Anagnostopoulos和Spizizen，1961，J.Bacteriol.81：741-746的步骤转化，并且在TBAB氯霉素平板上在37℃选择转化体的氯霉素抗性。将一个在amyL基因座插入了P_{共有cryIIIA}/cryIIIA stab/aprH表达盒的转化体命名为枯草芽孢杆菌GME201。

实施例2：构建修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列

构建了修饰型mRNA加工/稳定化序列，其除了天然cryIIIA mRNA加工/稳定化序列还包含第二Shine-Dalgarno序列。

通过PCR从质粒pNBT3(pDG268ΔNeo-P_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV，美国专利No.6,255,076)扩增了包含cryIIIA mRNA加工/稳定化序列的大约524bp的片段，所述PCR使用下文所示的引物999255和999254。引物999254的5′端并入了额外的Shine-Dalgarno序列的补体(complement)。

引物999255：

5′-AGCTTAATTAAAGATAATAT-3′(SEQ ID NO：11)

引物999254：

5′-GGCTGGATCACCTCCTTTCTATCCATTAGACGGTGCAAAT-3′(SEQ ID NO：12)

从质粒pNBT3使用下文所示的引物999253和999256扩增了大约596bp的片段，该片段包含克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprH)的N-末端编码区。引物999253的5′端并入了额外的Shine-Dalgarno序列并且与引物999254的5′端互补。

引物999253：

5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCACCTTATGAAAAATCATTTTATC-3′(SEQ ID NO：13)

引物999256：

5′-AAGCTTGCGCCACCACGAAT-3′(SEQ ID NO：14)

两个PCR都使用50ng质粒pNBT3模板DNA，每种引物各0.4μM，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μM，含2.5mM MgCl₂的1X PCR缓冲液II，以及2.5单位的Taq DNA聚合酶在50μl反应体积中进行。将反应在ROBOCYCLER

40热循环仪(Stratagene Corporation，Lo Jolla，CA，USA)中进行，程序设定为1个循环的95℃2分钟；30个循环，每个为95℃1分钟，55℃1分钟和72℃2分钟；和1个循环的72℃5分钟。

通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳分析了两个PCR反应，并且使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了产物。将两个纯化的PCR产物用作模板DNA进行第三PCR，其使用引物999255和999256，藉由引物999593和999594的序列提供的互补端将两个片段融合。

使用每种纯化的PCR片段50ng，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μM，含2.5mM MgCl₂的1X PCR缓冲液II，以及2.5单位的Taq DNA聚合酶进行了PCR。反应在ROBOCYCLER40热循环仪中进行，程序设定为1个循环的95℃2分钟；5个循环，每个为95℃1分钟，55℃1分钟和72℃2分钟；然后向反应中加入每种引物各0.4μM，再进行25个循环，每个为95℃1分钟，55℃1分钟和72℃2分钟；和最终1个循环的72℃5分钟。通过在TBE缓冲液中进行0.8％琼脂糖电泳使PCR产物显影(visualize)。

将获得的大约1080bp的PCR产物使用TOPO

TA Cloning Kit克隆入pCR2.1，再按照制造商的说明书转化入ONE SHOT

TOP10化学感受态大肠杆菌细胞。使用BIOROBOT

9600从几个转化体纯化了质粒DNA，并且通过DNA测序进行了分析以鉴定含有期望的修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列的那些。将一个具有预期的DNA序列的质粒命名为pCR2.1-stabx2。

实施例3：构建质粒pNBT48

将质粒pNBT3(pDG268MCSΔneo-P_cryIIIA/cryIIIA stab/SAV；美国专利5,955,310)用Sfi I和Bam HI消化，并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK

凝胶提取试剂盒纯化了大约6704bp的载体片段。将质粒pNBT8(pDG268MCS-P_amyQ/SAV；美国专利No.5,955,310)用Sfi I和Bam HI消化，并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了大约1402bp的片段，该片段包含解淀粉芽孢杆菌amyQ启动子和克劳氏芽孢杆菌aprH编码序列。将pNBT3载体片段和P_amyQ-aprH片段使用T4DNA连接酶如制造商说明书所述连接起来，并且将大肠杆菌DH5α细胞(Gibco BRL，Gaithersburg，MD，USA)用所述连接物按照制造商的说明书转化，在2X YT氨苄青霉素平板上在37℃选择氨苄青霉素抗性。

使用QIAPREP

8Plasmid Kit(质粒试剂盒)(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)从一个转化体纯化了质粒DNA，并且通过使用Nco I的限制酶消化继之以在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析。鉴定了一个产生了大约6802bp和1304bp的预期DNA片段大小的质粒并将其命名为pNBT48(图3)。

实施例4：构建amyQ启动子-修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列

构建了与修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列连接的amyQ启动子。将质粒pCR2.1-stabx2用Pac I消化，并使用标准方法用T4DNA聚合酶和dNTPs将末端平端化。然后将平端化的质粒用Hind III消化并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK

Gel ExtractionKit纯化了大约1067bp的片段，该片段含有修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列和aprHN-末端编码区。

将质粒pNBT48用Ecl 136II和Hind III消化，并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了大约7601bp的载体片段。将pNBT48载体片段和修饰型cryIIIAmRNA加工/稳定化序列使用T4DNA连接酶按照制造商的说明书连接起来，并且将大肠杆菌DH5α细胞用所述连接物按照制造商的说明书转化，在2XYT氨苄青霉素平板上在37℃选择氨苄青霉素抗性。使用BIOROBOT

9600从几个转化体纯化了质粒DNA，并且通过使用Nco I的限制酶消化继之以在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行了分析。鉴定了一个产生了大约1800bp的预期DNA片段大小的质粒并将其命名为pNBT55(pDG268ΔNeo-P_amyQ/mod.cryIIIA stab/aprH)(图4)。

实施例5：构建amyQ启动子-修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列

构建了与修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列连接的amyQ启动子。将质粒pNBT55通过用Sca I消化来线性化。将枯草芽孢杆菌168Δ4用所述线性化的质粒按照Anagnostopoulos和Spizizen，1961，见上文的方法转化，并且在TBAB氯霉素平板上在37℃选择转化体的氯霉素抗性。通过将菌落贴片(patch)到TBAB牛奶平板上并为澄清区域评分来筛选氯霉素抗性转化体的蛋白酶生产，还通过将菌落贴片到TBAB新霉素平板上在37℃筛选其新霉素敏感性以确认DNA通过双交换插入了枯草芽孢杆菌染色体的amyE基因中。鉴定了氯霉素抗性、新霉素敏感性、产蛋白酶的转化体(具有在amyE基因座插入的P_amyQ/mod.cryIIIA stab/aprH表达盒)并将其命名为枯草芽孢杆菌BW199。

实施例6：构建amyQ启动子-野生型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列

构建了与野生型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列连接的amyQ启动子。将质粒pNBT3用Pac I消化，并使用T4DNA聚合酶和dNTPs将末端平端化。然后将平端化的质粒用Hind III消化，并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了大约1067bp的片段，该片段含有野生型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列和克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprH)N-末端编码区。

将大约7601bp的pNBT48载体片段(实施例4)和大约1067bp的野生型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列片段使用T4DNA连接酶按照制造商的说明书连接起来，并且将大肠杆菌DH5α细胞用所述连接物按照制造商的说明书转化，在2X YT氨苄青霉素平板上在37℃选择氨苄青霉素抗性。使用BIOROBOT

9600从几个转化体纯化了质粒DNA，并且通过使用Nco I的限制酶消化继之以在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析。鉴定了一个生成了大约1800bp的预期DNA片段大小的质粒并将其命名为pNBT56(pDG268ΔNeo-P_amyQ/cryIIIA stab/aprH)(图5)。

实施例7：构建amyQ启动子-野生型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列

构建了与野生型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列连接的amyQ启动子。将质粒pNBT56通过用Sca I消化来线性化。将枯草芽孢杆菌168Δ4用所述线性化的质粒按照Anagnostopoulos和Spizizen，1961，见上文的方法转化，并且在TBAB氯霉素平板上在37℃选择转化体的氯霉素抗性。通过将菌落贴片到TBAB牛奶平板上并为澄清区域评分来筛选氯霉素抗性转化体的蛋白酶生产，还通过将菌落贴片到TBAB新霉素平板上在37℃筛选其新霉素敏感性，从而确认DNA通过双交换插入了枯草芽孢杆菌染色体的amyE基因中。鉴定了氯霉素抗性、新霉素敏感性、产蛋白酶的转化体(具有在amyE基因座插入的P_amyQ/cryIIIA stab/aprH表达盒)并将其命名为枯草芽孢杆菌BW198。

实施例8：评估amyQ启动子-修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列

将枯草芽孢杆菌菌株BW199的克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(AprH)生产与采用野生型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列的同基因株枯草芽孢杆菌菌株BW198比较。将两种菌株在含有25ml PS-1培养基的250ml摇瓶中在37℃培养，一式四份。在第3天(T1)、第4天(T2)和第5天(T3)取1ml样品；并且测定了澄清上清液的蛋白酶活性。

按照以下步骤测量蛋白酶活性。将培养物上清液在样品缓冲液(0.01％TWEEN

，100mM TRIS pH 8.5)中适当地稀释，其后对稀释的样品进行从1倍到1/3倍再到1/9倍的系列稀释(series dilution)。将克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶标准品(Novozymes A/S，

Denmark；4,260NPU/g)相应地在样品缓冲液中稀释以建立线性标准曲线。将总共20μl的每种稀释品(包括标准品)转移至96孔平底平板。向每孔加入200μl Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA底物溶液(每毫升DMSO 100mg Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA，按1∶55.6稀释在100mMTRIS pH 8.5中)，并且将平板在环境温度温育10分钟。在温育过程中，使用BIOMEK

3000(Beckman Coulter，Inc，Fullerton CA，USA)在405nm测量反应速率。通过从生成的标准曲线外推来确定样品浓度。

相对结果示于图6。含有修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列的枯草芽孢杆菌细胞到第5天为止平均产生了比含有野生型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列的细胞多大约65％的克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶。因此，与野生型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列相比，修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列使生产力得到显著的增加。

实施例9：构建cryIIIA启动子-修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列

构建了与修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列连接的cryIIIA启动子。将质粒pCR2.1-stabx2用Pac I和Sac I消化，并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了大约568bp的片段，该片段含有修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列。将质粒pNBT2用Pac I和Sac I消化，并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了大约6704bp的载体片段。将pNBT2载体片段和修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列片段使用T4DNA连接酶按照制造商的说明书连接起来，并且将大肠杆菌XL10-Gold

Ultracompetent细胞用所述连接物按照制造商的说明书转化，在2X YT氨苄青霉素平板上在37℃选择氨苄青霉素抗性。使用BIOROBOT

9600从几个转化体纯化了质粒DNA，并且通过使用Pac I和Eco RI的消化继之以在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了测验。将一个具有大约5882bp和1388bp的预期片段的质粒命名为pGME085(图7)。

将质粒pGME085通过用Bsa I和Sca I消化来线性化，并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK

Gel ExtractionKit纯化了大约6851bp的载体片段。将枯草芽孢杆菌168Δ4用所述纯化的质粒片段按照Anagnostopoulos和Spizizen，1961，见上文的方法转化，并且在TBAB氯霉素平板上在37℃选择转化体的氯霉素抗性。将一个在amyL基因座插入了P_cryIIIA/mod.cryIIIA stab/aprH表达盒的转化体命名为枯草芽孢杆菌GME202。

实施例10：构建共有启动子-修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列

构建了与修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列连接的包含共有-35和-10区的cryIIIA启动子。将质粒pGME079用Pac I和Sac I消化，并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICKGelExtraction Kit纯化了大约6704bp的载体片段。将pGME079载体片段和大约568bp的修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列片段(实施例9)使用T4DNA连接酶按照制造商的说明书连接起来，并且将大肠杆菌XL10-GOLD

9600从几个转化体纯化了质粒DNA，并且通过使用Pac I和Eco RI的消化继之以在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了测验。将一个具有大约6704bp和566bp的预期片段的质粒命名为pGME080(图8)。

Gel ExtractionKit纯化了大约6851bp的载体片段。将枯草芽孢杆菌168Δ4用所述纯化的质粒片段按照Anagnostopoulos和Spizizen，1961，见上文的方法转化，并且在TBAB氯霉素平板上在37℃选择转化体的氯霉素抗性。将一个在amyL基因座插入了P_{共有cryIIIA}/mod.cryIIIA stab/aprH表达盒的转化体命名为枯草芽孢杆菌GME203。

实施例11：评估枯草芽孢杆菌菌株GME201、GME202和GME203

创造了含有野生型cryIIIA启动子和未修饰的(野生型)cryIIIA mRNA加工/稳定化序列的枯草芽孢杆菌菌株充当基线对照用于与枯草芽孢杆菌菌株GME201、GME202和GME203比较。按照Pitcher等，1989，Lett.Appl.Microbiol.8：151-156的方法，从包含插入在amyE基因座的P_cryIIIA/cryIIIAstab/aprH盒的枯草芽孢杆菌PL1801spoIIE::Tn917(美国专利No.5,955,310)分离了基因组DNA。将枯草芽孢杆菌168Δ4用所述基因组DNA按照Anagnostopoulos和Spizizen，1961，见上文的方法转化，并且在TBAB氯霉素平板上在37℃选择转化体的氯霉素抗性。将一个这样的转化体命名为枯草芽孢杆菌GME200。

将枯草芽孢杆菌菌株GME200、GME201、GME202和GME203在含有25ml PS-1培养基的250ml摇瓶中在37℃培养，一式三份。在第3天(T1)、第4天(T2)和第5天(T3)取1ml样品并且测定了澄清上清液的蛋白酶活性，如实施例8中所述。

关于上述培养物的平均相对克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶产值示于图9。所述结果证明，从包含共有cryIIIA启动子和/或修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列的构建体表达蛋白酶的菌株(枯草芽孢杆菌GME201、GME202和GME203)全都产生了比枯草芽孢杆菌GME200更多的蛋白酶，在枯草芽孢杆菌GME200中蛋白酶是从与未修饰的cryIIIA mRNA加工/稳定化序列连接的野生型cryIIIA启动子表达的。枯草芽孢杆菌GME202与枯草芽孢杆菌GME200提供了73％的增加，同时枯草芽孢杆菌GME203相对于枯草芽孢杆菌GME201提供了13％的增加。枯草芽孢杆菌GME201与枯草芽孢杆菌GME200相比提供了133％的增加，而枯草芽孢杆菌GME203相对于枯草芽孢杆菌GME202提供了53％的增加。最高生产力来自启动子变体枯草芽孢杆菌GME203，其包含共有P_cryIIIA和修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列，与枯草芽孢杆菌GME200相比其提供了164％的增加。

实施例12：构建地衣芽孢杆菌宿主菌株MDT283

将地衣芽孢杆菌SJ1904(WO 94/014968)用C-组分基因缺失质粒(C-component deletion plasmid)pNBT38(美国公开申请20050221446)按照Xue等，1999，J.Microbiol.Methods 34(3)：183-191的方法通过电穿孔转化。简言之，使用1-5ml在LBS中培养的地衣芽孢杆菌过夜培养物接种50ml新鲜LBS培养基，并且在37℃和250rpm温育所述培养物。使培养物生长至稳定期，并且在缓慢生长期之后培养物经历生长速率的增加时(指数生长结束之后1-3小时)，通过在6500xg离心收获细胞。将细胞用50ml冰冷的MSG(0.5M甘露醇，0.5M山梨糖醇，10％甘油)洗涤2次，并且重悬在大约750μl MSG中。如下转化细胞或将细胞储存在-20℃。将60μl电感受态细胞与质粒DNA在具有1-mm电极间隙的电穿孔杯中混合，并使用GENEPULSER进行电脉冲，将GENE PULSER

设定为25μF，200Ω和1.0kV。然后将电穿孔的细胞转移至每毫升含有0.2μg红霉素的950μl LBSM培养基中来诱导红霉素抗性。将转化体在34℃和250rpm温育2.5-3小时，然后在TBAB红霉素/林可霉素平板上在34℃选择红霉素抗性。

将一个这样的转化体在具有红霉素选择的TBAB平板上在50℃培养，以选择pNBT38向染色体中C-组分基因处的整合。然后将一个这样的整合体在不带选择性的VY培养基中在34℃培养，以使整合的质粒切下并丢失。将培养物铺板在LB平板上，在37℃筛选红霉素敏感性的菌落，其说明了质粒的丢失。如实施例2中所述，通过PCR，使用引物991173和991176测试了几个红霉素敏感性克隆。

引物991173：

5′-GAATTCGACGGCTTCCCGTGCGCC-3’(SEQ ID NO：15)

引物991176：

5′-AAGCTTCCATTCAAACCTGGTGAGGAAG-3’(SEQ ID NO：16)

将一个用PCR扩增了大约606bp的片段的克隆(说明C-组分蛋白酶基因从染色体缺失)命名为地衣芽孢杆菌MDT283。

实施例13：构建质粒载体pMDT131和pMDT160

构建了质粒pMDT131和pMDT160以创建赋予氯霉素抗性的温度敏感质粒。

通过将氯霉素抗性基因插入质粒pMRT074(美国公开申请20030175902)构建了质粒pMDT131。将质粒pMRT074用Eco RI消化，并且通过在11℃与T4DNA聚合酶(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN，USA)和每种dNTPs各25μM一起温育20分钟将末端平端化，其后通过在75℃温育10分钟对聚合酶进行热灭活。然后将质粒用Not I消化，通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行分析，并且使用QIAQUICKGel Extraction Kit纯化了大约4355bp的载体片段。将质粒pNBT1(pDG268MCS；美国专利No.6,255,076)用Eco 47III和Not I消化，通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行分析，并且使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了大约1222bp的片段，该片段含有cat基因和多克隆位点。将pMRT074载体片段与cat片段使用T4DNA连接酶按照制造商的说明书连接，并且将枯草芽孢杆菌168Δ4用所述连接物按照Anagnostopoulos和Spizizen，1961，见上文的方法转化，在TBAB氯霉素平板上在34℃选择氯霉素抗性。使用Plasmid Midi Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)从一个转化体分离了质粒DNA，并且通过用Bam HI消化继之以在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了确认，其生成了大约3779bp和1802bp的预期的片段。将所得质粒命名为pMDT131(图10)。

通过去除pMRT074的Bam HI、Sma I和Asp 718限制位点构建了质粒pMDT159。将质粒pMRT074用Bam HI和Asp 718消化，并且通过在11℃与T4DNA聚合酶和每种dNTPs各25μM一起温育20分钟将末端平端化，其后通过在75℃温育10分钟对聚合酶进行热灭活。通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳对消化的质粒进行了分析，并且使用QIAQUICK

Gel ExtractionKit纯化了大约6022bp的载体片段。将纯化的片段用T4DNA连接酶按照制造商的说明书处理，并按照Anagnostopoulos和Spizizen，1961，见上文的方法用所述连接物转化枯草芽孢杆菌菌株168Δ4，在TBAB红霉素/林可霉素平板上在34℃选择红霉素抗性。将所得质粒命名为pMDT159(图11)。通过限制酶消化确认了Bam H、Sma I和Asp 718位点的丢失。

通过将氯霉素抗性基因引入pMDT159构建了质粒pMDT160。将质粒pMDT159用Eco RI消化，并且通过在11℃与T4DNA聚合酶和每种dNTPs各25μM一起温育20分钟将末端平端化，其后通过在75℃温育10分钟对聚合酶进行热灭活。然后将质粒用Not I消化并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了大约4354bp的载体片段。将质粒pNBT1用Eco 47III和NotI消化，通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析，并且使用QIAQUICK

GelExtraction Kit纯化了大约1222bp的片段，该片段含有cat基因和多克隆位点。如上所述使用T4DNA连接酶将pMRT074载体片段与pNBT1cat片段连接，并且将枯草芽孢杆菌168Δ4用所述连接物按照Anagnostopoulos和Spizizen，1961，见上文的方法转化，在TBAB氯霉素平板上在34℃选择氯霉素抗性。使用Plasmid Midi Kit从一个转化体分离了质粒DNA，并且通过用Xba I消化继之以在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了确认，其生成了大约2193bp、1817bp和1566bp的预期的片段。将所得质粒命名为pMDT160(图12)。

实施例14：构建质粒pHyGe204

通过将pMRT044(美国公开申请20030175902)的地衣芽孢杆菌amyL片段插入质粒载体pMDT160构建了质粒pHyGe203。将质粒pMDT160用Sma I和Hind III消化并且通过在TAE(40mM Tris-20mM乙酸钠-1mM EDTApH7.2)缓冲液中的1.0％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK

GelExtraction Kit纯化了大约5531bp的载体片段。将质粒pMRT044使用Sma I和Hind III消化并且通过在TAE缓冲液中的1.0％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了大约1072bp的片段，该片段含有amyL上游和下游片段。将pMDT160载体片段和pMRT044amyL片段使用Rapid Ligation Kit(快速连接试剂盒)(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN，USA)按照制造商的说明书连接起来，并按照Anagnostopoulos和Spizizen，1961，见上文的方法用所述连接物转化枯草芽孢杆菌菌株168Δ4，在TBAB氯霉素平板上在34℃选择氯霉素抗性。将所得质粒命名为pHyGe203(图13)。通过用Nco I消化继之以在TAE缓冲液中的1.0％琼脂糖电泳确认了所述质粒，其生成了大约5343bp和1260bp的预期的片段。

通过将cryIIIA mRNA加工/稳定化序列和pNBT18(pDG268MCSΔneo-long cryIIIA stab/SAV，美国专利No.6,255,076)的克劳氏芽孢杆菌aprH基因插入pHyGe203的amyL上游和下游片段之间构建了质粒pHyGe204。将质粒pHyGe203用Ecl 136II和Bam HI消化并且通过在TAE缓冲液中的1.0％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICKGel Extraction Kit纯化了大约6586bp的载体片段。将质粒pNBT18用Pac I消化，并且通过在11℃与T4DNA聚合酶和每种dNTPs各25μM一起温育20分钟将末端平端化。然后将所述消化的质粒用Bam HI消化并且通过在TAE缓冲液中的1.0％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICKGel Extraction Kit纯化了大约1768bp的片段，该片段含有cryIIIA mRNA加工/稳定化序列和克劳氏芽孢杆菌aprH基因。使用Rapid Ligation Kit按照制造商的说明书将pHyGe203载体片段和mRNA加工/稳定化序列/aprH片段连接，并按照Anagnostopoulos和Spizizen，1961，见上文的方法用所述连接物转化枯草芽孢杆菌菌株168Δ4，在TBAB氯霉素平板上在34℃选择氯霉素抗性。将所得质粒命名为pHyGe204。通过用Nco I和用Hind III的消化继之以在TAE缓冲液中的1.0％琼脂糖电泳确认了所述质粒，对于Nco I其生成了大约6249bp和2103bp的预期的片段，且对于HindIII其生成了大约6743bp和1609bp的预期的片段。

实施例15：构建质粒pHyGe205

通过将修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列和pGME080的克劳氏芽孢杆菌aprH基因插入pHyGe203的amyL上游和下游片段之间构建了质粒pHyGe205。将质粒pGME080用Pac I消化，并且通过在11℃与T4DNA聚合酶和每种dNTPs各25μM一起温育20分钟将末端平端化。然后将消化的质粒用Bam HI消化并且通过在TAE缓冲液中的1.0％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了大约1793bp的片段，该片段含有修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列和克劳氏芽孢杆菌aprH基因。使用Rapid Ligation Kit按照制造商的说明书将pHyGe203Ecl 136II/BamHI载体片段(上文所述)和修饰型mRNA加工/稳定化序列/aprH片段连接，并按照Anagnostopoulos和Spizizen，1961，见上文的方法用所述连接物转化枯草芽孢杆菌菌株168Δ4，在TBAB氯霉素平板上在34℃选择氯霉素抗性。将所得质粒命名为pHyGe205(图14)。通过用Nco I和用Hind III的消化继之以在TAE缓冲液中的1.0％琼脂糖电泳确认了所述质粒，对于Nco I其生成了大约6274bp和2103bp的预期的片段，且对于Hind III其生成了大约6743bp和1634bp的预期的片段。

实施例16：构建质粒pHyGe206

通过PCR从地衣芽孢杆菌菌株MDT220(美国公开申请20050221446)克隆了含有三联启动子的片段。按照Pitcher等，1989，见上文的方法从地衣芽孢杆菌菌株MDT220分离了基因组DNA。使用寡核苷酸引物994112和060762，用Expand High Fidelity PCR System(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN，USA)按照制造商的说明书，从地衣芽孢杆菌MDT220基因组DNA用PCR扩增了含有P_amyL4199/P_{短共有amyQ}/P_cryIIIA三联启动子的片段。所述PCR在Eppendorf Mastercylcer梯度热循环仪中进行，程序设定为1个循环的94℃2分钟；11个循环，每个为94℃30秒，58℃30秒，72℃1分15秒；15个循环，每个为94℃30秒，58℃30秒，72℃1分15秒(对每个连续的循环加5秒)；和1个循环的72℃7分钟。

引物994112：

5′-GCGGCCGCTCGCTTTCCAATCTGA-3’(SEQ ID NO：17)

引物060762：

5′-ATCGATAATAATTTATACACTATTCTATTGG-3’(SEQ ID NO：18)

使用QIAQUICKPCR Purification Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)按照制造商的说明书纯化了获得的大约991bp的PCR产物，使用TOPO

TACloning Kit将所述产物克隆入pCR2.1，再按照制造商的说明书转化入ONESHOTTOP10化学感受态大肠杆菌细胞。将所得质粒命名为pHyGe201(图15)。通过DNA测序确认了pHyGe201中的三联启动子序列。

通过将来自质粒pHyGe201的三联启动子插入质粒载体pMDT131构建了质粒pHyGe206。将质粒pMDT131用Cla I和Not I消化并且通过在TAE缓冲液的1.0％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK

Gel ExtractionKit纯化了大约5568bp的载体片段。将质粒pHyGe201用Cla I和Not I消化并且通过在TAE缓冲液的1.0％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了大约983bp的载体片段，该片段含有三联启动子。使用Rapid Ligation Kit按照制造商的说明书将pMDT131载体片段和三联启动子片段连接，并按照Anagnostopoulos和Spizizen，1961，见上文的方法用所述连接物转化枯草芽孢杆菌菌株168Δ4，在TBAB氯霉素平板上在34℃选择氯霉素抗性。将所得质粒命名为pHyGe206(图16)。通过用Pac I消化继之以在TAE缓冲液中的1.0％琼脂糖电泳确认了质粒，其产生了大约3187bp、2490bp和874bp的预期的片段。

实施例17：构建在amyL基因座插入了cryIIIA mRNA加工/稳定化序列和克劳氏芽孢杆菌aprH基因的地衣芽孢杆菌菌株

将地衣芽孢杆菌菌株MDT283如实施例12中所述用质粒pHyGe204转化。然后将电穿孔的细胞转移至含有0.2μg/ml红霉素的950μl LBSM培养基中来诱导红霉素抗性。将转化体在34℃和250rpm温育2.5-3小时，然后在TBAB红霉素/林可霉素平板上在34℃选择红霉素抗性。

将一个这样的转化体在具有红霉素选择的TBAB平板上在50℃培养，以选择pHyGe204向染色体中amyL基因座处的整合。然后将一个这样的整合体在不带选择的VY培养基中在34℃培养，以使整合的质粒切下并丢失。将培养物铺板在LB平板上，在37℃筛选红霉素敏感性的菌落，其说明了质粒的丢失。筛选在含有0.5％淀粉天青(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)的琼脂上不能形成澄清区域的红霉素敏感性菌落，这说明amyL基因已经由cryIIIA mRNA加工/稳定化序列和克劳氏芽孢杆菌aprH基因代替。通过PCR确认了在amyL基因座处cryIIIA mRNA加工/稳定化序列和aprH基因的插入，所述PCR使用结合amyL上游的引物950872和结合在aprH编码区内的引物950984。将一个这样的菌株命名为地衣芽孢杆菌HyGe208。

引物950872：

5′-CCAGGCCTTAAGGGCCGCATGCGTCCTTCTTTGTGCT-3′(SEQ IDNO：19)

引物950984：

5′-CGACTTCCTCTTCCTCAGAG-3′(SEQ ID NO：20)

将地衣芽孢杆菌菌株MDT283用质粒pHyGe205通过电穿孔如上所述转化，在TBAB红霉素/林可霉素平板上在34℃选择红霉素抗性。将一个这样的转化体在具有红霉素选择的TBAB平板上在50℃培养，以选择pHyGe205向染色体中amyL基因座处的整合。然后将一个这样的整合体在不带选择的VY培养基中在34℃培养，以使整合的质粒切下并丢失。将培养物在37℃铺板在LB平板上，筛选红霉素敏感性的菌落，其说明了质粒的丢失。筛选在含有0.5％淀粉天青的琼脂上不能形成澄清区域的红霉素敏感性菌落，这说明amyL基因已经由修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列和克劳氏芽孢杆菌aprH基因代替。通过PCR确认了在amyL基因座处cryIIIA mRNA加工/稳定化序列和aprH基因的插入，所述PCR使用上文所示的引物950872和950984。将一个这样的菌株命名为HyGe209。

实施例18：构建在amyL基因座插入了三联启动子和克劳氏芽孢杆菌aprH基因的地衣芽孢杆菌菌株

将地衣芽孢杆菌菌株HyGe208和HyGe209如实施例12中所述用质粒pHyGe206转化，在TBAB红霉素/林可霉素平板上在34℃选择红霉素抗性。将一个这样的转化体在具有红霉素选择的TBAB平板上在50℃培养，以选择pHyGe205向染色体中amyL基因座处的整合。然后将一个这样的整合体在不带选择的VY培养基中在34℃培养，以使整合的质粒切下并丢失。将培养物在37℃铺板在LB平板上，筛选红霉素敏感性的菌落，其说明了质粒的丢失。筛选在含有1％脱脂奶粉的琼脂上能够形成大的澄清区域的红霉素敏感性菌落，这说明三联启动子已经插入到克劳氏芽孢杆菌aprH基因上游。通过PCR确认了在amyL基因座处aprH表达盒的存在，所述PCR使用上文所示的结合amyL上游的引物950872和结合amyL下游的引物991797。将一个这样的源自地衣芽孢杆菌HyGe208并且具有大约3094bp的预期PCR产物的菌株命名为地衣芽孢杆菌HyGe210；将一个源自地衣芽孢杆菌HyGe209并且具有大约3119bp的预期PCR产物的菌株命名为地衣芽孢杆菌HyGe211。地衣芽孢杆菌菌株HyGe210在amyL基因座含有aprH表达盒，该表达盒包含P_amyL4199/P_{短共有amyQ}/P_cryIIIA/cryIIIA stab启动子。地衣芽孢杆菌菌株HyGe211在amyL基因座含有aprH表达盒，该表达盒包含P_amyL4199/P_短共有 _amyQ/P_cryIIIA/mod.cryIIIA stab启动子。通过对PCR产物进行DNA测序确认了HyGe210和HyGe211中的aprH表达盒的序列。

实施例19：评估三联启动子变体

将地衣芽孢杆菌菌株HyGe210和HyGe211在适合于劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(AprH)产生的条件下在标准小发酵罐中培养，使用的培养基包含水解马铃薯蛋白和矿物盐，及蔗糖补料(with a sucrose feed)。在发酵过程中的多个时间点测定整体培养液样品的蛋白酶活性。

，100mM TRIS pH 8.5)中适当地稀释，其后对稀释的样品进行从1倍到1/3倍再到1/9倍的系列稀释。将克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(AprH)标准品(Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)在样品缓冲液中使用2倍步骤稀释，起始于0.625NPU/ml的浓度，并以0.078NPU/ml的浓度结束。将总共20μl的每种稀释品(包括标准品)转移至96孔平底板。向每孔加入200μlSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA底物溶液(每毫升DMSO 100mgSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA，按1∶55.6稀释在100mM TRIS pH 8.5中)，并且将平板在环境温度温育10分钟。在温育过程中，使用BIOMEK

3000在405nm测量反应速率。通过从生成的标准曲线外推来确定样品浓度。

结果示于图17。所述结果证明，从包含修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列的三重启动子构建体表达蛋白酶的地衣芽孢杆菌HyGe211产生了比地衣芽孢杆菌HyGe210更多的蛋白酶，在地衣芽孢杆菌HyGe210中蛋白酶是从包含未修饰的cryIIIA mRNA加工/稳定化序列的三重启动子构建体表达的。72小时的发酵之后，地衣芽孢杆菌HyGe211与地衣芽孢杆菌HyGe210相比提供了61％的增加。

实施例20：构建pMDT100

质粒pMDT100是一种含有P_amyL4199/P_{短共有amyQ}/P_cryIIIA/cryIIIAstab三联启动子的大肠杆菌复制子，所述三联启动子驱动克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprH)的表达。这种aprH表达盒和pC194(Horinouchi和Weisblum，1982，J.Bacteriol.150：804-814)的cat基因的两侧翼为枯草芽孢杆菌α-淀粉酶(amyE)基因的片段，这允许aprH表达盒和cat基因藉由两个amyE片段通过双同源重组插入枯草芽孢杆菌染色体的amyE基因座。用另一基因替代pMDT100中的aprH基因，这允许该基因在枯草芽孢杆菌中插入染色体并表达。pMDT100的构建在下文描述。

质粒pNBT51。使用QIAGENPlasmid Kit(质粒试剂盒)(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)按照制造商的说明书从作为宿主的大肠杆菌DH5α分离了质粒pNBT10(pDG268MCS-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV；美国专利No.6,255,076)，并且将该质粒用Cla I和Sca I消化。切割发生在aprH编码序列中大约在第326密码子处的Cla I位点，而非在大约第23密码子处的Cla I位点，其因大肠杆菌Dam DNA甲基转移酶导致的甲基化而封闭。使用Klenow片段(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA，USA)和dNTPs按照制造商的说明书将Cla I末端平端化。将消化的质粒通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析，并且使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了大约6615bp的载体片段。将质粒pOS4301(Bacillus Genetic Stock Center，Ohio State University，Columbus，OH，USA)用Sal I和Sca I消化，并且将Sal I末端使用Klenow片段和dNTPs平端化，如上所述。将消化的质粒通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析，并且使用QIAQUICK

GelExtraction Kit纯化了大约840bp的片段，该片段含有大肠杆菌rrnB转录终止子。同样的840bp Sal I/Sca I片段可以从载体pKK223-3(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)(图18)分离。使用T4DNA连接酶(Roche DiagnosticsCorporation，Indianapolis，IN，USA)按照制造商的说明书将pNBT10载体片段和含终止子的片段连接起来，并且将大肠杆菌DH5α细胞用所述连接物按照制造商的说明书转化，在2X YT氨苄青霉素平板上在37℃选择氨苄青霉素抗性。将所得质粒命名为pNBT51(pDG268-P_cryIIIA/cryIIIAstab/SAVΔ)(图19)。

质粒pNBT52。将质粒pNBT51用Sfi I消化，并且通过在11℃与T4DNA聚合酶(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN，USA)和每种dNTPs各25μM一起温育20分钟将末端平端化，其后通过在75℃温育10分钟对聚合酶进行热灭活。然后将平端化的质粒用Dra III消化，并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了大约5920bp的载体片段。将质粒pNBT20(pDG268MCS-P_短共有 _amyQ/SAV；美国专利No.6,255,076)用Dra III和Ecl 136II消化，并且使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了大约1641bp的片段，该片段含有短共有amyQ启动子(P_{短共有amyQ})。如上所述将pNBT51载体片段和P_{短共有amyQ}片段连接，并且如上所述用所述连接物转化大肠杆菌DH5α细胞，在2X YT氨苄青霉素平板上在37℃选择氨苄青霉素抗性。使用QIAPREP

8MiniprepKit(小量制备试剂盒)从几个转化体分离了质粒DNA，将所述质粒DNA用Sph I消化，并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析。将一个具有大约4873bp和2688bp的预期限制片段的质粒命名为pNBT52(pDG268-P_{短共有amyQ}/P_cryIIIA/cryIIIAstab/SAVΔ)(图20)。

质粒pNBT53。将质粒pNBT6(pHP13amp-SAV；美国专利No.6,255,076)用Sfi I和Sac I消化，并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了大约6438bp的载体片段。将质粒pNBT52用Sfi I和Sac I消化，并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了大约727bp的片段，该片段含有P_{短共有amyQ}/P_cryIIIA/cryIIIAstab串联启动子。如上所述将pNBT6载体片段和P_{短共有amyQ}/P_cryIIIA/cryIIIAstab片段连接，并且如上所述用所述连接物转化大肠杆菌DH5α细胞，在2X YT氨苄青霉素平板上在37℃选择氨苄青霉素抗性。使用QIAPREP

8Miniprep Kit从几个转化体分离了质粒DNA，将所述质粒DNA用Pvu II消化，并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析。将一个具有大约4903bp、1320bp和942bp的预期限制片段的质粒命名为pNBT53(pHP13amp-P_短共有 _amyQ/P_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV)(图21)。

质粒pNBT54。将质粒pNBT1(pDG268MCS；美国专利No.6,255,076)用Sfi I和Bam HI消化，并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了大约6040bp的载体片段。将质粒pNBT53用Sfi I和Bam HI消化，并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了大约1953bp的片段，该片段含有P_{短共有amyQ}/P_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV表达盒。如上所述将pNBT1载体片段和P_{短共有amyQ}/P_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV片段连接，并且如上所述用所述连接物转化大肠杆菌DH5α细胞，在2X YT氨苄青霉素平板上在37℃选择氨苄青霉素抗性。使用QIAPREP8Miniprep Kit从几个转化体分离了质粒DNA，将所述质粒DNA用Sfi I和Bam HI同时消化，其后在TBE缓冲液中进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。将一个具有大约6040bp和1953bp的预期限制片段的质粒命名为pNBT54(pDG268MCS-P_短共有 _amyQ/P_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV)(图22)。

质粒pNBT35。将质粒pNBT2(pDG268MCSΔ-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV；美国专利No.6,255,076)用Sfi I和Bam HI消化，并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行了分析，再使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了大约5394bp的载体片段。将质粒pNBT54用Sfi I和Bam HI消化，并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行了分析，再使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了大约1953bp的片段，该片段含有P_短 _共有amyQ/P_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV表达盒。如上所述将pNBT2载体片段和P_短共有 _amyQ/P_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV片段连接，并且如上所述用所述连接物转化大肠杆菌DH5α细胞，在2X YT氨苄青霉素平板上在37℃选择氨苄青霉素抗性。使用QIAPREP

8Miniprep Kit从几个转化体分离了质粒DNA，将所述质粒DNA用Nco I消化，并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行了分析。将一个具有大约5492bp和1855bp的预期限制片段的质粒命名为pNBT35(pDG268MCSΔ-P_{短共有amyQ}/P_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV)(图23)。

质粒pNBT30。将质粒pNBT30构建成含有amyL基因启动子(美国专利No.6,100,063)的amyL4199变体的PCR克隆。按照Pitcher等，1989，见上文的方法分离了地衣芽孢杆菌SJ1904基因组DNA。使用下文所示的引物950872和991151通过PCR从地衣芽孢杆菌SJ1904基因组DNA扩增了amyL4199启动子(P_amyL4199)基因。引物950872并入了Sfi I限制位点，而引物991151并入了Sac I限制位点和P_amyL4199的变体核苷酸。

引物950872：

5′-CCAGGCCTTAAGGGCCGCATGCGTCCTTCTTTGTGCT-3′(SEQ IDNO：21)

引物991151：

5′-GAGCTCCTTTCAATGTGATACATATGA-3′(SEQ ID NO：22)

使用AMPLITAQ

Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)按照制造商的推荐进行了PCR，只是MgCl₂浓度是3mM，而非标准的1.5mM。扩增反应(50μl)由10mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mM KCl，3.0mM MgCl₂，每种dNTP各200μM，每种引物各0.5μM，0.25单位的AMPLITAQ

Gold DNA聚合酶和大约200ng模板DNA组成。所述PCR在ROBOCYCLER

40Temperature Cycler中进行，程序设定为1个循环的95℃9分钟；30个循环，每个循环95℃1分钟，55℃1分钟和72℃1分钟；和1个循环的72℃3分钟。

将获得的大约625bp的PCR产物使用TOPO

TA Cloning Kit克隆入载体pCR2.1，再按照制造商的说明书转化入ONE SHOTTOP10化学感受态大肠杆菌细胞。使用QIAPREP8Miniprep Kit从几个转化体分离了质粒DNA，并且通过用Eco RI消化继之以在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳分析了克隆的PCR片段的存在。将一个具有大约3913bp和640bp的预期的限制片段的质粒命名为pNBT30(pCR2.1-amyL4199)(图24)。通过DNA测序确认了克隆的PCR片段的DNA序列。

质粒pNBT31。将质粒pNBT3(pDG268MCSΔneo-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV；美国专利No.6,255,076)用Sfi I和Sac I消化，并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICKGel Extraction Kit纯化了大约7931bp的载体片段。将质粒pNBT30用Sfi I和Sac I消化，并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK

GelExtraction Kit纯化了大约612bp的片段，该片段含有P_amyL4199。如上所述将pNBT3载体片段和P_amyL4199片段连接，并且按照制造商的说明书用所述连接物转化大肠杆菌XL1-Blue细胞(Stratagene Corporation，La Jolla，CA，USA)，在2X YT氨苄青霉素平板上在37℃选择氨苄青霉素抗性。使用QIAPREP

8Miniprep Kit从几个转化体分离了质粒DNA，将所述质粒DNA用Nco I消化，并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析。将一个具有大约6802bp和1741bp的预期限制片段的质粒命名为pNBT31(图25)。

质粒pNBT36。将质粒pNBT35用Sfi I消化，并且使用T4DNA聚合酶和dNTPs将末端平端化，如上所述。然后将平端化的质粒用Dra III消化并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析。使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了大约5808bp的载体片段。将质粒pNBT31用Dra III和Ecl 136II消化，通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析，并且使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了大约2150bp的片段，该片段含有P_amyL4199。如上所述将pNBT35载体片段和P_amyL4199片段连接，并且按照制造商的说明书用所述连接物转化大肠杆菌SURE

细胞(StratageneCorporation，La Jolla，CA，USA)，在2X YT氨苄青霉素平板上在37℃选择氨苄青霉素抗性。使用QIAPREP

8Miniprep Kit从几个转化体分离了质粒DNA，将所述质粒DNA用Nco I消化，并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析。将一个具有大约5492bp和2466bp的预期限制片段的质粒命名为pNBT36(图26)。

质粒pMDT100。将质粒pNBT13(pDG268Δneo-P_amyL/P_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV；美国专利No.6,255,076)用Dra III和Sac I消化，并且使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了大约6395bp的载体片段。将质粒pNBT36用Dra III和Sac I消化，并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析，再使用QIAQUICK

Gel Extraction Kit纯化了大约2873bp的片段，该片段含有P_amyL4199/P_amyQ(sc)/P_cryIIIA三联启动子。如上所述将pNBT13载体片段和P_amyL4199/P_amyQ(sc)/P_cryIIIA片段连接，并且如上所述用所述连接物转化大肠杆菌SURE

细胞，在2X YT氨苄青霉素平板上在37℃选择氨苄青霉素抗性。使用QIAPREP

8Miniprep Kit从几个转化体分离了质粒DNA，将所述质粒DNA用Apa I消化，并且通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了分析。将一个具有大约4974bp和4294bp的预期限制片段的质粒命名为pMDT100(图27)。

将质粒pMDT100通过用Sca I的消化线性化。按照Anagnostopoulos和Spizizen，1961，见上文的方法用所述线性化的质粒转化枯草芽孢杆菌168Δ4，并且在TBAB氯霉素平板上在37℃选择转化体的氯霉素抗性。通过将菌落贴片到TBAB牛奶平板上并为澄清区域评分来筛选氯霉素抗性转化体的蛋白酶生产，还通过将菌落贴片到TBAB新霉素平板上在37℃筛选其新霉素敏感性以确认DNA通过双交换插入了枯草芽孢杆菌染色体的amyE基因中。鉴定了氯霉素抗性、新霉素敏感性、产蛋白酶的转化体(具有在amyE基因座插入的P_amyL4199/P_{短共有amyQ}/P_cryIIIA/cryIIIA stab/aprH盒)并将其命名为枯草芽孢杆菌MDT130。

实施例21：构建pMDT174

将质粒pMDT100和pGME080用Pac I和Sac I消化。将消化的质粒通过在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行分析，并且使用QIAQUICKGelExtraction Kit纯化了含有修饰型cryIIIA稳定物的pGME080的大约566bp的片段和pMDT100的大约8727bp的载体片段。如上所述使用T4DNA连接酶将纯化的片段连接起来，并且将大肠杆菌XL10-GOLD

Ultracompetent细胞用所述连接物按照制造商的说明书转化。使用BIOROBOT

9600从几个转化体纯化了质粒DNA，并且通过用Fnu 4HI消化继之以在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖电泳进行了测试。预期对期望的连接产物进行消化将产生大约36个片段，包括一个预期不从pMDT100产生的大约912bp的片段，并且排除一个预期从pMDT100产生的大约1045bp的片段。将一个具有这样的限制图型的质粒命名为pMDT174(图28)，其含有包含三联启动子的aprH表达盒，及修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列(P_amyL4199/P_短共有 _amyQ/P_cryIIIA/mod.cryIIIA stab)。

将质粒pMDT174通过用Sca I消化来线性化。按照Anagnostopoulos和Spizizen，1961，见上文的方法用所述线性化的质粒转化枯草芽孢杆菌168Δ4，并且在TBAB氯霉素平板上在37℃选择转化体的氯霉素抗性。通过将菌落贴片到TBAB牛奶平板上并为澄清区域评分来筛选氯霉素抗性转化体的蛋白酶生产，还通过将菌落贴片到TBAB新霉素平板上在37℃筛选其新霉素敏感性以确认DNA通过双交换插入了枯草芽孢杆菌染色体的amyE基因中。鉴定了氯霉素抗性、新霉素敏感性、产蛋白酶的转化体(具有在amyE基因座插入的P_amyL4199/P_{短共有amyQ}/P_cryIIIA/mod.cryIIIA stab/aprH盒)并将其命名为枯草芽孢杆菌MDT131。

实施例22：评估枯草芽孢杆菌中的三联启动子变体

将质粒pMDT100和pMDT174通过用Sac I消化来线性化。按照Anagnostopoulos和Spizizen，1961，见上文的方法用所述线性化的质粒转化枯草芽孢杆菌168Δ4，并且在TBAB氯霉素平板上在37℃选择转化体的氯霉素抗性。通过将菌落贴片到TBAB牛奶平板上并为澄清区域评分来筛选氯霉素抗性转化体的蛋白酶生产，还通过将菌落贴片到TBAB新霉素平板上在37℃筛选其新霉素敏感性以确认DNA通过双交换插入了枯草芽孢杆菌染色体的amyE基因中。鉴定了氯霉素抗性、新霉素敏感性、产蛋白酶的转化体；将一个源自pMDT100的转化体(具有在amyE基因座插入的P_amyL4199/P_短共有 _amyQ/P_cryIIIA/cryIIIA stab/aprH盒)命名为枯草芽孢杆菌MDT130，并且将一个源自pMDT174的转化体(具有在amyE基因座插入的P_amyL4199/P_{短共有amyQ}/P_cryIIIA/mod.cryIIIA stab/aprH盒)命名为枯草芽孢杆菌MDT131。

按照Pitcher等，1989，见上文的方法从枯草芽孢杆菌菌株MDT130和MDT131分离了基因组DNA。将枯草芽孢杆菌A164Δ5(美国专利No.5,891,701)用所述基因组DNA按照Anagnostopoulos和Spizizen，1961，见上文的方法转化，并且在TBAB氯霉素平板上在37℃选择转化体的氯霉素抗性。将一个源自MDT130DNA的转化体(具有在amyE基因座插入的P_amyL4199/P_{短共有amyQ}/P_cryIIIA/cryIIIA stab/aprH盒)命名为MDT 134；将一个源自MDT131DNA的转化体(具有在amyE基因座插入的P_amyL4199/P_短共有 _amyQ/P_cryIIIA/mod.cryIIIA stab/aprH盒)命名为MDT135。

将枯草芽孢杆菌菌株MDT134和MDT135在含有50ml PS-1培养基的250ml摇瓶中在37℃培养，一式三份。在第3天、第4天和第5天取样，并且如上所述测定了整体培养液的蛋白酶活性。

结果示于图29。所述结果证明，从包含修饰型cryIIIA mRNA加工/稳定化序列的三重启动子构建体表达蛋白酶的枯草芽孢杆菌MDT135，产生了比枯草芽孢杆菌MDT134更多的蛋白酶，在枯草芽孢杆菌MDT134中蛋白酶是从包含未修饰的cryIIIA mRNA加工/稳定化序列的三重启动子构建体表达的。与枯草芽孢杆菌MDT134相比，枯草芽孢杆菌MDT135在3天之后提供了87％的增加，在4天之后提供了100％的增加，并且在5天之后提供了58％的增加。

在本文描述并且提出权利要求的发明的范围不受本文公开的多个具体方面的限制，因为这些方面旨在例举本发明的几个方面。本发明的范围意图包括任何等同的方面。事实上，除了本文明示和描述的那些之外，本领域技术人员根据前文的描述显然能想到本发明的各种修改形式。随附权利要求书的范围也意图包括这样的修改形式。如有冲突，当以包括定义在内的本申请公开内容为准。

本申请引用了多篇参考文献，在此通过引用将它们的公开内容完全并入本申请。

Claims

1.一种在细菌宿主细胞中产生具有生物学活性的多肽的方法，包括：

(a)在有益于产生具有生物学活性的多肽的培养基中培养细菌宿主细胞，其中所述细菌宿主细胞包含核酸构建体，该核酸构建体包含与编码所述具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列可操作地连接的启动子区和位于所述启动子区下游和所述编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合位点上游的修饰型mRNA加工/稳定化序列，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列具有至少一个额外拷贝的Shine-Dalgarno序列并且与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高表达；

(b)从培养基分离具有生物学活性的多肽，

其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列为包含至少一个额外拷贝的Shine-Dalgarno序列的cryIIIA mRNA加工/稳定化序列或包含至少一个额外拷贝的Shine-Dalgarno序列的SP82mRNA加工/稳定化序列。

2.权利要求1的方法，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列是SEQID NO：6。

3.权利要求1的方法，其中所述细菌宿主细胞是芽孢杆菌属细胞。

4.权利要求1的方法，其中所述细菌宿主细胞含有一个或几个拷贝的核酸构建体。

5.权利要求1的方法，其中所述核酸构建体还包含选择标记基因。

6.权利要求1的方法，其中所述细菌宿主细胞不含外源选择标记基因。

7.一种包含核酸构建体的细菌细胞，该核酸构建体包含与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列可操作地连接的启动子区，和位于所述启动子区下游和所述编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合位点上游的修饰型mRNA加工/稳定化序列，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列包含至少一个额外拷贝的Shine-Dalgarno序列并且与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高表达，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列为包含至少一个额外拷贝的Shine-Dalgarno序列的cryIIIA mRNA加工/稳定化序列或包含至少一个额外拷贝的Shine-Dalgarno序列的SP82mRNA加工/稳定化序列。

8.权利要求7的细菌细胞，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列是SEQ ID NO：6。

9.权利要求7的细菌细胞，其是芽孢杆菌属细胞。

10.权利要求7的细菌细胞，其中所述细胞含有一个或几个拷贝的核酸构建体。

11.权利要求7的细菌细胞，其中所述核酸构建体还包含选择标记基因。

12.权利要求7的细菌细胞，其中所述细胞不含外源选择标记基因。

13.一种用于产生不含选择标记的细菌细胞突变体的方法，包括缺失细菌细胞的选择标记基因，其中所述细菌细胞包含核酸构建体，该核酸构建体包含与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列可操作地连接的启动子区，和位于所述启动子区下游和所述编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合位点上游的修饰型mRNA加工/稳定化序列，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列包含至少一个额外拷贝的Shine-Dalgarno序列并且与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高表达，

14.权利要求13的方法，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列是SEQ ID NO：6。

15.权利要求13的方法，其所述细菌细胞是芽孢杆菌属细胞。

16.权利要求13的方法，其中所述细菌细胞含有一个或几个拷贝的核酸构建体。

17.权利要求13的方法，其中所述核酸构建体还包含选择标记基因。

18.权利要求13的方法，其中所述细菌细胞不含外源选择标记基因。

19.一种通过权利要求13的方法获得的不含选择标记的芽孢杆菌属细胞突变体。

20.一种用于获得细菌宿主细胞的方法，包括向细菌宿主细胞导入核酸构建体，该核酸构建体包含与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列可操作地连接的启动子区，和位于所述启动子区下游和所述编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸序列核糖体结合位点上游的修饰型mRNA加工/稳定化序列，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列包含至少一个额外拷贝的Shine-Dalgarno序列并且与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高表达，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列为包含至少一个额外拷贝的Shine-Dalgarno序列的cryIIIA mRNA加工/稳定化序列或包含至少一个额外拷贝的Shine-Dalgarno序列的SP82mRNA加工/稳定化序列。

21.权利要求20的方法，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列是SEQ ID NO：6。

22.权利要求20的方法，其所述细菌宿主细胞是芽孢杆菌属细胞。

23.一种包含修饰型mRNA加工/稳定化序列的分离的核酸，所述修饰型mRNA加工/稳定化序列与启动子区和编码生物学物质的多核苷酸可操作地连接，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列包含至少一个额外拷贝的Shine-Dalgarno序列并且与未修饰的mRNA加工/稳定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高表达，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列为包含至少一个额外拷贝的Shine-Dalgarno序列的cryIIIA mRNA加工/稳定化序列或包含至少一个额外拷贝的Shine-Dalgarno序列的SP82mRNA加工/稳定化序列。

24.权利要求23的分离的核酸，其中所述修饰型mRNA加工/稳定化序列是SEQ ID NO：6。

25.一种核酸构建体，其包含与编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子区和权利要求23的包含修饰型mRNA加工/稳定化序列的分离的核酸，所述核酸位于启动子区的下游和所述编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸核糖体结合位点的上游。

26.一种重组表达载体，其包含权利要求25的核酸构建体。

27.权利要求1、13或20的方法，其中所述至少一个额外拷贝的Shine-Dalgarno序列为序列GGAG。

28.权利要求1、13或20的方法，其中所述至少一个额外拷贝的Shine-Dalgarno序列为序列GGAGG。

29.权利要求1、13或20的方法，其中所述至少一个额外拷贝的Shine-Dalgarno序列为SEQ ID NO：1。

30.权利要求7的细菌细胞，其中所述至少一个额外拷贝的Shine-Dalgarno序列为序列GGAG。

31.权利要求7的细菌细胞，其中所述至少一个额外拷贝的Shine-Dalgarno序列为序列GGAGG。

32.权利要求7的细菌细胞，其中所述至少一个额外拷贝的Shine-Dalgarno序列为SEQ ID NO：1。