CN101495625B

CN101495625B - 地衣芽孢杆菌中的氯霉素抗性选择

Info

Publication number: CN101495625B
Application number: CN200780027873XA
Authority: CN
Inventors: 斯蒂恩·T·乔尔根森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2006-05-31
Filing date: 2007-05-29
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2027-05-29
Also published as: CN101495625A; ATE443760T1; EP2029732B1; US20130210152A1; WO2007138049A2; US8993304B2; DE602007002568D1; DK2029732T3; WO2007138049A3; US8431382B2; US20090280569A1; EP2029732A2

Abstract

本发明涉及修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中已经使一个或多个天然存在的染色体氯霉素乙酰转移酶编码基因cat失活。染色体cat基因的失活允许将氯霉素作为有效的选择剂用于将DNA引入所述修饰的细胞的方法。

Description

地衣芽孢杆菌中的氯霉素抗性选择

序列表

本发明包含序列表。

发明领域

本发明涉及修饰的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)宿主细胞，其中已将天然存在的染色体氯霉素乙酰转移酶基因cat失活。染色体cat基因的失活允许将氯霉素作为有效的选择剂用于将DNA引入所述修饰的细胞的方法。

发明背景

在多肽的工业生产中，感兴趣的是实现尽可能高的产物收率(productyield)。增加产量(yield)的一种方式是增加编码感兴趣多肽的基因的拷贝数。这能够通过将基因置于高拷贝数质粒上来完成，但是质粒是不稳定的，并且如果在宿主细胞的培养过程中没有选择压力，则质粒常常从宿主细胞丢失。增加感兴趣基因的拷贝数的另一种方式是将该基因以多个拷贝整合入宿主细胞染色体中。

来自质粒pC194的cat基因(chloramphenicol acetyl transferase；氯霉素乙酰转移酶)在芽孢杆菌属转化中常规地用作选择标记。然而，地衣芽孢杆菌展现的氯霉素抗性程度阻碍了将氯霉素抗性基因用于选择转化体，无论是通过原生质体转化、接合(conjugation)或电穿孔。

基因组测序揭示了几种不同的地衣芽孢杆菌菌株在染色体中含有与已知氯霉素抗性基因具有一些同源性的序列。所述同源序列位于EMBL地衣芽孢杆菌ATCC14580序列条目，登录号cp000002的位置2720850-2721500。

发明概述

在EMBL地衣芽孢杆菌ATCC14580条目，登录号cp000002中鉴定了推定的cat基因连同侧翼DNA。示意图示于图1。

我们想要研究的是，从地衣芽孢杆菌的染色体缺失这种推定的cat基因是否将会使氯霉素能够用于将DNA引入这样的cat缺失型菌株的选择。

在来自多种来源的许多不同的地衣芽孢杆菌菌株中鉴定了cat基因的同源物，将那些菌株的染色体中的这些同源物失活以提供修饰的cat敏感型菌株。

本发明涉及将包含氯霉素抗性标记的遗传材料引入修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞的方法，在所述宿主细胞中已将天然存在的染色体氯霉素抗性基因cat失活。此基因以其活性形式的存在以其它方式(otherwise)阻碍氯霉素用于选择的目的。在工业生产宿主细胞中具有天然抗生素抗性编码基因也可能在某些应用，例如，用于调节目的的应用中引起担忧(concern)。

因此，在第一方面，本发明涉及用于将重组DNA构建体引入修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞的方法，所述方法包括：

a)提供修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中已将一个或多个内源基因组氯霉素乙酰转移酶编码基因失活；

b)将重组DNA构建体引入所述修饰的宿主细胞，所述构建体包含编码氯霉素乙酰转移酶的选择标记；

c)在包含抑制浓度的氯霉素的生长培养基中培养步骤(b)的宿主细胞；和

d)选择能够在步骤(c)的培养基中生长的包含所述DNA构建体的宿主细胞。

在第二方面，本发明涉及修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中已将一个或多个基因组氯霉素乙酰转移酶基因失活，所述宿主细胞包含携带编码氯霉素乙酰转移酶的选择标记的重组DNA构建体。

附图简述

图1显示来自地衣芽孢杆菌ATCC14580的cat基因区的示意图，指明了本文使用的引物。

图2显示来自地衣芽孢杆菌PL1980的cat基因区的示意图，指明了本文使用的引物。

定义

根据本发明，可以采用本领域的技术之内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有完整说明。参见，例如，Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition(分子克隆：实验手册，第二版)(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York(本文的“Sambrook等，1989”)；DNA Cloning：APractical Approach，Volumes I and II(DNA克隆：实用方法，卷I和II)(D.N.Glover编著1985)；Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)(M.J.Gait编著，1984)；Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交)(B.D.Hames和S.J.Higgins编著(1985))；Transcription And Translation(转录和翻译)(B.D.Hames和S.J.Higgins编著(1984))；Animal Cell Culture(动物细胞培养)(R.I.Freshney编著(1986))；Immobilized Cells And Enzymes(固定化细胞和酶)(IRL Press，(1986))；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(分子克隆实用指南)(1984)。

“多核苷酸”是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物，多核苷酸的序列是从聚合物5’到3’端读取的碱基的实际顺序。多核苷酸包括RNA和DNA，并且可以从天然来源分离、体外合成、或从天然和合成分子的组合制备。

“核酸分子”或“核苷酸序列”指单链形式或双链螺旋的核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式。双链的DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。术语核酸分子，特别是DNA或RNA分子，仅指分子的初级和二级结构，并且不将其限于特定的三级或四级形式。因此，该术语包括尤其是以线性或环状DNA分子(例如，限制片段)、质粒和染色体等(inter alia)存在的双链DNA。在讨论具体双链DNA分子的结构时，在本文中可以根据常规描述序列，即仅给出沿着DNA的非转录链的5’至3’方向的序列(即，具有与mRNA同源的序列的链)。“重组DNA分子”是经过分子生物学操作的DNA分子。

DNA“编码序列”或“开读框(ORF)”是双链DNA序列，当置于适当的调节序列控制下时，其在体内或体外于细胞中被转录并翻译成多肽。ORF“编码”多肽。编码序列的边界由5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子确定。编码序列可包括，但不限于原核序列，来自真核mRNA的cDNA，来自真核动物(例如，哺乳动物)DNA的基因组DNA序列，和甚至合成的DNA序列。如果意欲在真核细胞中表达编码序列，通常将聚腺苷酸化信号和转录终止序列置于编码序列的3’。

表达载体是线性或环状的DNA分子，其包含编码感兴趣的多肽的区段，该区段与提供用于其转录的其它区段可操作地连接。这些其它区段可以包括启动子和终止子序列，以及任选的一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、聚腺苷酸化信号等。表达载体通常源自质粒或病毒DNA，或者可以含有这二者的元件。

转录和翻译调控序列是DNA调节序列，如启动子、增强子、终止子等，其提供编码序列在宿主细胞中(例如在真核细胞中)的表达，聚腺苷酸化信号是调控序列。

“分泌信号序列”是编码多肽(“分泌肽”)的DNA序列，所述多肽(作为较大多肽的组分)指导较大多肽通过细胞分泌途径，所述较大多肽在所述细胞中合成。在通过分泌途径转运(transit)的过程中通常对较大多肽进行切割以去除分泌肽。

术语“启动子”在本文中用作其本领域公认的意思，表示含有提供用于结合RNA聚合酶和转录起点(initiation of transcription)的DNA序列的基因的部分。启动子序列通常，但并非总是，存在于基因的5’非编码区。

如果一个基因编码的多肽不再能以有功能的形式表达，则使该染色体基因成为“非功能性”的。这种基因的非功能性能够由本领域中已知的多种遗传操作或改变来诱导，其中的一些在Sambrook等(见上文)中描述。基因ORF中的部分缺失将通常使该基因成为非功能性的，正如突变例如取代、插入、移码等一样。

“可操作地连接”，当涉及DNA区段时，意思是安排区段而使它们协调地(in concert)发挥功能，例如转录过程通过如下发生：RNA聚合酶与启动子区段结合，并且在编码区段中进行转录，直至聚合酶在遭遇转录终止子区段时停止。

宿主细胞中的“异源”DNA在本上下文中指并非来源于所述细胞的外源DNA。

如用于本文，术语“核酸构建体”或“DNA构建体”意指cDNA、基因组DNA、合成DNA或RNA来源的任何核酸分子。术语“构建体”意指这样的核酸区段，其可以是单链或双链的，并且可以是基于编码感兴趣多肽的天然存在的核苷酸序列的整体或部分。构建体可以任选地包含其它核酸区段。

编码本发明多肽的本发明的核酸构建体可以合适地为基因组或cDNA来源的，例如通过制备基因组或cDNA文库并且通过杂交筛选编码全部或部分所述多肽的DNA序列来获得，所述杂交依照标准技术使用合成寡核苷酸探针进行(参照Sambrook等，同上)。

本发明编码多肽的核酸构建体也可以通过已经确立的标准方法合成制备，例如由Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Letters 22(1981)，1859-1869描述的亚磷酰胺方法(phosphoamidite method)，或由Matthes等，EMBO Journal 3(1984)，801-805描述的方法。根据亚磷酰胺方法，将寡核苷酸例如在自动DNA合成仪中合成，纯化，退火，连接，以及克隆到合适的载体中。

此外，核酸构建体可以是按照标准技术通过(适当地)连接合成来源、基因组来源或cDNA来源的片段而制备的合成与基因组混合来源的、合成与cDNA混合来源的、或基因组和cDNA混合来源的，所述片段对应于完整核酸构建体的多个部分。核酸构建体也可以通过聚合酶链式反应使用特异性引物制备，例如US 4,683,202或Saiki等，Science 239(1988)，487-491中所述。

当核酸构建体含有表达本发明的编码序列所必需的调控序列时，术语核酸构建体可与术语“表达盒(expression cassette)”同义。

术语“调控序列”在本文定义为包括对核酸序列的编码序列表达是必需的或有利的所有成分。每种调控序列对于编码所述多肽的核酸序列而言可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列(propeptide sequence)、启动子、信号序列和转录终止子。最少，调控序列包括启动子以及转录和翻译的终止信号。提供的调控序列可以具有用于引入特异性限制位点的接头，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核酸序列编码区的连接。

调控序列可以是适当的启动子序列，即由宿主细胞识别的用于表达核酸序列的核酸序列。启动子序列包含介导多肽表达的转录和翻译调控序列。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，并且可以从与所述宿主细胞同源或异源的编码胞外或胞内多肽的基因获得。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，即由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码多肽的核酸序列的3’末端可操作地连接。在本发明中可以使用在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，即与核酸序列的3’末端可操作地连接并且当转录时由宿主细胞识别为向转录的mRNA添加聚腺苷残基的信号的序列。在本发明中可以使用在选择的宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。

调控序列也可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基末端连接的氨基酸序列，该氨基酸序列能够指导表达的多肽进入宿主细胞的细胞分泌途径。核酸序列的编码序列的5’端可以天然地(inherently)含有信号肽编码区，其与编码分泌性多肽的编码区的区段以符合翻译读码框的方式天然连接。或者，编码序列的5’端可以含有信号肽编码区，其对于编码分泌性多肽的编码序列部分是外源的。在编码序列未正常含有信号肽编码区的情况下，外源信号肽编码区可能是需要的。或者，外源信号肽编码区可以简单地替代天然信号肽编码区，从而获得相对于与编码序列通常相连的天然信号肽编码区而言增强的多肽分泌。信号肽编码区可以获得自来自曲霉属菌种(Aspergillus species)的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因，来自根毛霉属菌种(Rhizomucor species)的脂肪酶或蛋白酶基因，来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-因子的基因，来自芽孢杆菌属菌种(Bacillus species)的淀粉酶或蛋白酶基因，或小牛前凝乳酶原(calfpreprochymosin)基因。然而，能够指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区均可以在本发明中使用。

调控序列还可以是前肽编码区，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化成成熟的活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)碱性蛋白酶基因(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT)、酿酒酵母α因子基因、或嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophilum)漆酶基因(WO 95/33836)获得前肽编码区。

也可为理想的是添加允许相对于宿主细胞的生长调节多肽表达的调节序列。调节系统的实例是导致基因表达响应于化学或物理刺激物，包括调节性化合物的存在，而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些序列包括在甲氨蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和随重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，可将编码多肽的核酸序列与调节序列串接(in tandem)放置。

用于指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、解淀粉芽孢杆菌BAN AMYLASE GENE(BAN淀粉酶基因)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 80：21-25)。另外的启动子在ScientificAmerican，1980，242：74-94的″Useful proteins from recombinant bacteria″(来自重组细菌的有用蛋白质)中；和在Sambrook等，1989，同上文中描述。

本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的核酸序列、启动子和转录和翻译终止信号。上文所述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包含一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核酸序列。或者，可以通过在适当的用于表达的载体中插入所述核酸序列或包含所述序列的核酸构建体来表达本发明的核酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，以使该编码序列与适当的用于表达(和可能用于分泌)的调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够引起核酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体(entity)存在，其复制独立于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。载体系统可以是单一的载体或质粒，或共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA(total DNA)的两个或更多个载体或质粒，或转座子(transposon)。

本发明的载体优选含有一个或多个“选择性标记”，其允许容易地选择被转化的细胞。选择性标记是基因，其产物提供对于杀生物剂、抗生素或病毒的抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

条件性必需基因(conditionally essential gene)可以作为“非抗生素选择性标记”发挥作用。细菌条件性必需选择性标记的非限制性例子是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，这些基因仅当在缺乏D-丙氨酸条件下培养细菌时是必需的。当将细胞在存在半乳糖的条件下培养或在导致半乳糖存在的培养基中培养时，编码UDP-半乳糖周转(turnover)中涉及的酶的基因同样能够在细胞中发挥条件性必需标记的功能。这些基因的非限定性实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌编码UTP依赖性磷酸化酶(EC 2.7.7.10)、UDP-葡萄糖依赖性尿苷酰基转移酶(UDP-glucose-dependent uridylyltransferase)(EC2.7.7.12)或UDP-半乳糖差向异构酶(EC 5.1.3.2)的那些基因。在以木糖为唯一碳源的基本培养基中培养的细胞中，芽孢杆菌(Bacilli)的木糖异构酶基因如xylA同样能够用作选择性标记。在以葡糖酸为唯一碳源的基本培养基中培养的细胞中，利用葡糖酸所必需的基因gntK和gntP也能够用作选择性标记。条件性必需基因的其它非限制性实例在下文提供。

抗生素选择性标记赋予对抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、新霉素、潮霉素或甲氨喋呤的抗生素抗性。

此外，选择可以通过共转化完成，例如，如WO 91/17243中所述，其中选择标记在单独的载体上。

本发明的载体优选含有允许载体(或载体的较小部分)稳定整合入宿主细胞基因组或允许载体在细胞中独立于细胞基因组自主复制的元件。

当引入宿主细胞中时，可将载体或载体的较小部分整合入宿主细胞基因组中。对于染色体整合，载体可以依赖于编码多肽的核酸序列或用于将载体通过同源或非同源重组稳定整合入基因组中的任何其它载体元件。

或者，载体可以含有额外的核酸序列，该核酸序列用于指导通过同源重组来整合入宿主细胞的基因组中。额外的核酸序列使得载体能够在染色体中的精确位置整合入宿主细胞基因组。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的与对应的靶序列具有高同源性的核酸，如100至1,500个碱基对，优选400至1,500个碱基对，并且最优选800至1,500个碱基对，以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的靶序列同源。此外，整合元件可为非编码或编码核酸序列。

载体、表达盒、扩增单元、基因或实际上任何确定的核苷酸序列的拷贝数是在任何时间存在于宿主细胞中的相同拷贝的数目。基因或另一种确定的染色体核苷酸序列可以以一个、两个或更多个拷贝存在于染色体上。自主复制的载体可以以每个宿主细胞一个或几百个拷贝存在。

为了自主复制，载体可以进一步包含使载体能够在所述的宿主细胞中自主复制的复制起点。细菌复制起点的实例是质粒pBR322、pUC19、pACYC177、pACYC184、pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。复制起点可以是一种具有突变的复制起点，所述突变使其在宿主细胞中发挥温度敏感性(参见，例如，Ehrlich，1978，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 75：1433)。

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的核酸序列，将其有利地用于多肽的重组生产中。术语“宿主细胞”包含亲本细胞的任何子代，它们由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。

优选将细胞用包含本发明的核酸序列的载体转化，其后载体整合至宿主染色体中。“转化”的意思是向宿主细胞中引入包含本发明的核酸序列的载体，从而将载体作为染色体整合体或作为自复制染色体外载体保留。通常认为整合是有利的，因为核酸序列更有可能稳定地保留在细胞中。将载体整合入宿主染色体可以通过同源或非同源重组发生，如上所述。

细菌宿主细胞的转化可以，例如，通过如下进行：原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)、使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizin，1961，Journal of Bacteriology81：823-829，或Dubnar和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology56：209-221)、电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques6：742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology169：5771-5278)。

将上述转化或转染的宿主细胞在允许表达期望的多肽的条件下在合适的营养培养基中培养，其后从细胞或培养液中回收所得多肽。

用于培养细胞的培养基可以是任何适合于培养宿主细胞的常规培养基，如含有适当补充物的基本或复合培养基。合适的培养基可从商业供应商获得，或者可根据公开的配方(例如在美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)的目录中)制备。培养基使用本领域已知的方法制备(参见，例如有关细菌和酵母的参考文件(references for bacteria and yeast)；Bennett，J.W.和LaSure，L.，editors，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，CA，1991)。

如果多肽分泌至营养培养基中，则可以从所述培养基中直接回收该多肽。如果多肽未分泌，则将其从细胞裂解物回收。通过常规方法从培养基回收多肽，所述常规方法包括：通过离心或过滤从培养基分离宿主细胞，通过盐(例如硫酸铵)的方法沉淀上清或滤出液中的蛋白成分，依赖于所述多肽的类型通过多种层析方法(例如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等)纯化。

可以使用本领域已知的对于多肽有特异性的方法检测多肽。这些检测方法可以包括特异性抗体的使用，酶产物的形成，或酶底物的消失。例如，酶测定法可以用于测定多肽的活性。

可以通过本领域已知的多种方法来纯化本发明的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)，电泳方法(例如，制备型等电聚焦(IEF))，差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)，或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)。

发明详述

如上所述，在第一方面本发明涉及用于向修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞引入重组DNA构建体的方法，所述方法包括：

a)提供修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中已将一个或多个外源基因组氯霉素乙酰转移酶编码基因失活；

b)向所述修饰的宿主细胞中引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码氯霉素乙酰转移酶的选择标记；

本发明的另一方面涉及修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中已将一个或多个基因组氯霉素乙酰转移酶基因失活，所述宿主细胞包含重组DNA构建体，该构建体携带编码氯霉素乙酰转移酶的选择标记。

应该理解的是下文列出的优选实施方案绝非穷举，它们可以以多种方式组合，正如本领域技术人员会立即认识到的。本领域技术人员将充分意识到将这些优选实施方案与其它技术特征组合的可能性，这些其它技术特征是向芽孢杆菌属细胞中引入遗传材料的领域中熟知的，而未在本文明确列出，如在多篇专利公开中描述的，例如，WO 2002/000907、WO 2001/090393、WO1993/010249、WO 1999/043835、WO 1994/019471、WO 2003/055996、WO1991/009129、WO 1994/014968和/或WO 1996/023073，将其全部通过题述并入本文。

在本发明的优选实施方式中，重组DNA构建体是质粒或线性化的质粒，优选是线性化和多联体化(concatamerized)质粒。

在本发明的另一优选实施方案中，重组DNA构建体还包含编码感兴趣的多肽的多核苷酸，所述感兴趣的多肽优选酶，更优选淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纤维素分解酶(cellulytic enzyme)、氧化还原酶或植物细胞壁降解酶，甚至更优选具有选自下组的活性的酶：氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase)、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、卤过氧化物酶(haloperoxidase)、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。

另一优选的实施方案涉及第一和第二方面，其中一个或多个基因组氯霉素乙酰转移酶基因编码包含氨基酸序列的氯霉素乙酰转移酶，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24中所示序列是至少80％同一的、85％同一的、90％同一的、92％同一的、94％同一的、96％同一的、98％同一的或至少99％同一的。

优选的实施方案涉及第一和第二方面，其中一个或多个基因组氯霉素乙酰转移酶基因包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO：1、SEQID NO：12、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：23中所示序列是至少80％同一的、85％同一的、90％同一的、92％同一的、94％同一的、96％同一的、98％同一的或至少99％同一的。

在本发明的另一优选实施方案中，DNA构建体的选择标记编码包含氨基酸序列的氯霉素乙酰转移酶，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24中所示序列是至少80％同一的、85％同一的、90％同一的、92％同一的、94％同一的、96％同一的、98％同一的或至少99％同一的。

切下DNA的部分的解离酶或特异性限制酶(如果该DNA的两侧均侧接称为解离酶位点或限制位点的特定识别序列)是本领域熟知的，参见例如WO96/23073(Novo Nordisk A/S)，将其通过引用包括在本文内。优选DNA构建体的选择标记的侧翼有解离酶位点，优选解离酶位点是res。

在第一方面优选的实施方案中，DNA构建体的选择标记的侧翼有由特异性解离酶识别的核苷酸序列，优选所述核苷酸序列是res，甚至更优选在选择在选择性条件下生长的宿主细胞之后，通过解离酶的作用将至少一个标记基因从DNA构建体切除。

优选地，本发明的DNA构建体还包含与宿主细胞的基因组DNA区充分同源的多核苷酸区，从而通过同源重组实现将所述DNA构建体整合入基因组中。

如下文所示例，同样优选的是生长培养基中氯霉素的抑制浓度是至少1微克/毫升，优选至少2微克/毫升，更优选至少3微克/毫升，6微克/毫升，9微克/毫升或至少12微克/毫升。

实施例

实施例1.地衣芽孢杆菌PL1980中的cat缺失

构建缺失质粒

基于ATCC14580基因组序列设计了引物，从而允许PCR扩增cat基因5’的0.5kb区段和cat基因3’的另一个0.5kb区段。地衣芽孢杆菌ATCC14580的cat基因区的DNA序列在SEQ ID NO：1中显示，并且在SEQ ID NO：2中显示了编码的蛋白质。

使用来自地衣芽孢杆菌PL1980的DNA作为模板，并且如供应商所述使用来自Amersham Pharmacia Biotech，Inc.的READY-TO-GO^TM PCR珠，在MJ Research的PTC-200PCR机上按照以下程序进行了PCR扩增：

·1个循环 95℃2分钟

·30个循环 94℃30秒

·退火 X℃1分钟(在此步中使用了不同的温度)

·72℃2分钟，然后是1个循环的72℃5分钟，其后将反应物冷却至10℃。

使用了以下引物：

SEQ ID NO：3(#449000)：5’cagtgaattcgtttaaccggcaattcttc

SEQ ID NO：4(#449001)：5’cagtgtcgacgtctcttaacatctctcac

SEQ ID NO：5(#448309)：5’cagtgtcgacctgcttcactgattccg

SEQ ID NO：6(#448315)：5’cagtaagcttaagattcctcgatgatttc

最初的PCR扩增没有成功，使用两引物组合#449000+#449001或

#448309+#448315中的任一种均未获得正确大小的片段。于是设计了更长的引物：

SEQ ID NO：7(#450168)：5’cagtgaattcgtttaaccggcaattcttcaaacgtc

SEQ ID NO：8(#450169)：5’cagtgtcgacgtctcttaacatctctcactgctgtg

SEQ ID NO：9(#450170)：5’cagtgtcgaccgcttcactgattccggcaatattc

SEQ ID NO：10(#450171)：5’cagtaagcttaagattcctcgatgatttccaccacac

SEQ ID NO：11(#455882)：5’cagtgaattccgctttcgtttcaaatgacgg

在PCR反应中使用了这些引物，所述PCR反应的退火温度以每步1℃从62℃斜线下降(ramp down)至53℃，然后保持在57℃再进行20个循环。

#450170+#450171反应得到了0.5kb片段，将该片段用EcoRI+SalI消化并且连接至用EcoRI+SalI消化的pUC19(Yanisch-Perron等，1985，Gene33(1)：103-119)。将连接混合物通过电穿孔转化入大肠杆菌SJ2(Diderichsen等，1990，J.Bacteriol.172(8)：4315-4321)中，然后选择氨苄青霉素抗性。分离了具有序列的克隆，发现所述序列与ATCC14580序列相比包含23处差异，将这种克隆保留并命名为SJ7905(SJ2/pSJ7905)。地衣芽孢杆菌PL1980的cat基因区的DNA序列在SEQ ID NO：12中显示，并且在SEQ ID NO：13中显示了编码的蛋白质。

使用#450168+#450169的PCR没有成功。然后使用上述引物和新引物#455882的组合尝试了横跨整个cat基因区的更多的PCR反应，使用与上述反应中相同的退火温度方案。引物组合#450171+#449000产生了约1.8kb片段；#450171+#450168产生了分别约1.7kb和1.1kb的两个片段；和#450171+#455882产生了约1.0kb的片段。

对这四个片段进行了纯化，并且将每一个片段都在使用引物#450170+#450171的反应中用作模板，采用如上的退火温度方案。所有反应均产生了0.5kb片段，当直接使用这种引物组合以染色体DNA作为模板时也有同样的发现，说明所述四个片段确实是来自cat基因区的片段。

对四个长片段进行了DNA测序。示意图在图2中提供。基于所述序列，为3’-片段设计了新的引物：

SEQ ID NO：14(#457708)：5’cagtgtcgacctgcttagcggtcttactg(对应于ATCC14580 cat 2kb位置606-588，但含有几个错配)。

将引物组合#457708+#450168用来进行扩增，使用与上文中相同的退火温度方案。将获得的0.5kb片段用SalI+EcoRI消化，并且克隆至经SalI+EcoRI消化的pUC19载体中，再将所述载体转化至大肠杆菌中。分离了两个正确的大肠杆菌SJ2转化体并且命名为SJ8003(SJ2/pSJ8003)和SJ8004(SJ2/pSJ8004)。

通过如下制备含有装配的上游和下游片段的基于pUC19的质粒：从pSJ7905切下0.5kb SalI+HindIII片段并将这个片段插入经SalI+HindIII消化的pSJ8003。分离了获得的大肠杆菌SJ2的转化体并命名为SJ8011(SJ2/pSJ8011)和SJ8012(SJ2/pSJ8012)。

然后通过从pSJ8011切下0.9kb EcoRI-HindIII片段，并且将这个片段与pSJ2739(美国专利6,100,063)的4.3kb EcoRI-HindIII片段连接，由此将5’cat-3’cat区段转移至温度敏感的、可迁移的整合载体上，从而提供所谓的缺失质粒(deletion plasmid)。

分离了包含所述缺失质粒的枯草芽孢杆菌DN1885(Diderichsen等，1990，J.Bacteriol.172(8)，4315-4321)的正确转化体，并且命名为SJ8017(DN1885/pSJ8017)和SJ8018(DN1885/pSJ8018)。

构建在cat基因中具有缺失的地衣芽孢杆菌PL1980衍生菌株

用所述缺失质粒转化枯草芽孢杆菌接合供体菌株PP289-5(PP289-5(美国专利6,066,473)，得到了SJ8039和SJ8040(含pSJ8017)，以及SJ8041和SJ8042(含pSJ8018)。

地衣芽孢杆菌菌株PP1897-3是地衣芽孢杆菌PL1980的衍生物，其在碱性蛋白酶(alcalase)基因中具有内部缺失(internal deletion)、大部分C-组分蛋白酶编码区的缺失和在amyL、xylA和gntP基因座人工插入的启动子。使用该菌株作为受体与上述两个供体菌株SJ8039和SJ8040接合。

接合基本上如美国专利6,066,473中所述的进行，选择红霉素抗性。分离了四环素敏感性的转移接合子(transconjugant)，在整合和切除所述缺失质粒之后分离了氯霉素和红霉素敏感性菌株。

将转移接合子划线接种(streak)至含红霉素(5微克/毫升)的LB PSG平板上，将平板在50℃温育过夜。在高温选择红霉素抗性，这确保形成的菌落是因缺失质粒通过在5’cat或3’cat序列处的同源重组整合到地衣芽孢杆菌宿主菌株染色体中而产生的，因为所述质粒在该温度不能作为游离质粒复制。将菌落接种到TY液体培养基(TY liquid culture)中，并且在30℃温育过夜。这个温度使得整合的质粒能够复制，这促使该质粒从染色体切除，并最终从细胞中缺失(由红霉素敏感性说明)。

可经由与用于整合的同源性区相同的同源性区来切除质粒，在这种情况下所得细胞与宿主菌株相同。或者可以经由其它同源性区来切除质粒(例如经由5’cat整合，并经由3’cat切除，或者反过来)，在这种情况下使cat基因从染色体缺失。

将过夜培养物的等分试样用于接种新鲜的TY培养基，并且铺于LB PSG平板上。将平板在30℃温育过夜，其后将平板平板复制(replica plate)到含有和不含红霉素或氯霉素的平板上。

将2个红霉素敏感性和氯霉素敏感性菌株作为SJ8071(来自供体SJ8039)和SJ8072(来自供体SJ8041)保留。当在含有10微克/毫升氯霉素的LPBSG平板上重新分离(reisolate)时，这些缺失型菌株完全没有生长，而在相同的平板上重新分离的对照菌株则有一些生长。

实施例2.ATCC14580菌株中的cat基因缺失

进行了几次尝试来将cat缺失引入ATCC14580染色体，如上文进行的一样，通过整合和切除经由接合引入的来自SJ8039-SJ8042的缺失质粒。我们获得了转移接合子和具有整合的质粒的后续菌株，但是无法分离携带cat缺失的期望的切除衍生株。由于这可能是因为两种不同的地衣芽孢杆菌菌株之间cat基因区中的序列差异，所以构建了新的缺失载体。

构建缺失质粒

在PCR反应中使用ATCC14580经煮沸的细胞悬液(boiled cell suspension)作为模板，使用引物组合#450168+#450169(以产生cat的3’的片段)，以及引物组合#450170+#450171(以产生cat的5’的片段)，使用57℃作为退火温度。

将3’片段用EcoRI+SalI消化并连接至经EcoRI+SalI消化的pUC19载体中，再通过电穿孔将连接混合物转化至大肠杆菌SJ2中。将具有正确的克隆DNA序列的转化体作为SJ8151(SJ2/pSJ8151)和SJ8152(SJ2/pSJ8152)保留。

将5’片段用SalI+HindIII消化并连接至经SalI+HindIII消化的pUC19载体中，再通过电穿孔将连接混合物转化至大肠杆菌SJ2中。将具有正确的克隆DNA序列的转化体作为SJ8153(SJ2/pSJ8153)和SJ8154(SJ2/pSJ8154)保留。

通过从pSJ8151切下0.5kb EcoRI-SalI片段，并且从pSJ8153切下0.5kbSalI-HindIII片段，再将这两个片段与pSJ2739的4.4kb EcoRI-HindIII片段连接，由此将5’cat-3’cat区段装配至温度敏感的、可迁移的整合载体中。将枯草芽孢杆菌DN1885的正确转化体作为SJ8209(DN1885/pSJ8209)和SJ8210(DN1885/pSJ8210)保留。

构建在cat基因中具有缺失的地衣芽孢杆菌ATCC 14580

用整合载体转化枯草芽孢杆菌接合供体菌株PP289-5，产生了SJ8221和SJ8222(含pSJ8209)，以及SJ8223和SJ8224(含pSJ8210)。

使用地衣芽孢杆菌菌株ATCC14580作为受体与上述供体菌株接合。如先前所述进行接合，选择红霉素抗性。

如先前所述，分离了四环素敏感性转移接合子，并且在整合并切除所述质粒后分离了氯霉素和红霉素敏感性菌株。将两个这样的菌株作为SJ8343(来自供体SJ8222)和SJ8344(来自供体SJ8223)保留。

实施例3.氯霉素抗性的测试

使菌株PP1897-3、SJ8071(＝PP1897-3Δcat)、ATCC14580和SJ8344(＝ATCC14580Δcat)在补充了0.5％葡萄糖的10ml TY(WO 94/14968，第16页)中在30℃在摇动的条件下过夜增殖。使用50微升等分试样接种另外的10mlTY+葡萄糖培养基，所述培养基补充了以下浓度的氯霉素(cam)：1微克/毫升、2微克/毫升、3微克/毫升、6微克/毫升、9微克/毫升或12微克/毫升，并且继续在30℃摇动温育。在约7小时后通过视觉观察浑浊度(turbidity)来对生长进行评分(表1)，并且在过夜温育后再进行一次(表2)。

表1.在7小时温育之后：++)良好生长，+)不良(weak)生长，-)无生长

菌株

1μg/mlcam

2μg/mlcam

3μg/mlcam

6μg/mlcam

9μg/mlcam

12μg/mlcam

PP1897-3

++

+

-

SJ8071

+

-

ATCC14580

++

+

-

SJ8344

+

-

表2.过夜温育之后：++)良好生长，+)不良生长，-)无生长

菌株

1μg/mlcam

2μg/mlcam

3μg/mlcam

6μg/mlcam

9μg/mlcam

12μg/mlcam

PP1897-3

++

+

SJ8071

++

+

ATCC14580

++

+

SJ8344

++

+

显然，如在菌株SJ8071和SJ8344中所进行的，推定的氯霉素抗性基因的缺失，显著降低了菌株的氯霉素抗性。

实施例4.氯霉素抗性用于转移接合子选择的用途

构建具有氯霉素和红霉素抗性基因的测试质粒

为了研究氯霉素用于转移接合子选择的潜在用途，使用了质粒pSJ7976。这种质粒是基于先前提到的可转移的、温度敏感的载体骨架pSJ2739，并且含有来自pE194的红霉素抗性基因。此外，其含有插入区段之间的pC194 cat基因的编码序列，所述区段在地衣芽孢杆菌C-组分蛋白酶(美国专利No.5,459,064，登录号D10060，Kakudo等，1992，J.Biol.Chem.267：23782)基因5’和3’侧翼。该质粒如下构建：

使用来自PL1980的染色体DNA作为模板和57℃的退火温度，用以下引物通过PCR扩增制备了C组分蛋白酶基因的片段5’：

SEQ ID NO：15(#448697)：5’gactaagcttagatcttcacttccttattttgttgtaagta

SEQ ID NO：16(#448698)：5’gactgaattcgtcgatcactttctgccactc

将PCR扩增出的片段用EcoRI+HindIII消化，与经EcoRI+HindIII消化的pUC19连接，并且将连接混合物通过电穿孔转化入大肠杆菌SJ2中。将两个正确的转化体作为SJ7867(SJ2/pSJ7867)和SJ7868(SJ2/pSJ7868)保留。

使用来自PL1980的染色体DNA作为模板和57℃的退火温度，用以下引物通过PCR扩增制备了C组分蛋白酶基因的片段3’：

SEQ ID NO：17(#448699)：

5’gactgaattcagatctgctagcacgcgtgcggccgcacgaagacagcccgcttc

SEQ ID NO：18(#448700)：5’gactaagcttcataaattctcggatacaacac

将PCR扩增出的片段用EcoRI+HindIII消化，与经EcoRI+HindIII消化的pUC19连接，并且将连接混合物通过电穿孔转移至大肠杆菌SJ2中。将两个正确的转化体作为SJ7869(SJ2/pSJ7869)和SJ7870(SJ2/pSJ7870)保留。

通过从pSJ7867切下0.5kb EcoRI-BglII片段并从pSJ7869切下0.5kbBglII-HindIII片段，再将这些片段与pSJ2739的4.4kb EcoRI-HindIII片段连接，由此将C组分5’-和3’-侧翼片段装配至温度敏感的、可迁移的整合载体中。将连接混合物转化至枯草芽孢杆菌DN1885的感受态细胞，在30℃选择红霉素抗性(5微克/毫升)。将两个正确的转化体作为SJ7909(DN1885/pSJ7909)和SJ7910(DN1885/pSJ7910)保留。

使用57℃的退火温度和以下引物通过PCR从质粒pDN1050(Diderichsen等，1993，Plasmid 30，312-315)扩增pC194的氯霉素抗性基因，：

SEQ ID NO：19(#448716)：5’gactggatccatgaactttaataaaattgatttagac

SEQ ID NO：20(#448718)：

5’gactgaattcgctagcacgcgttataaaagccagtcattaggcc

将PCR扩增出的片段用BamHI+EcoRI消化，与经BamHI+EcoRI消化的pUC19连接，并且将连接混合物通过电穿孔转化至大肠杆菌SJ2。将正确的转化体作为SJ7887(SJ2/pSJ7887)保留。

通过从pSJ7887切下0.7kb BamHI-MluI片段，并且将这个片段与pSJ7909的5.4kb BglII-MluI片段连接，由此将pC194cat基因插入5’和3’C组分侧翼区段之间。将连接混合物转化入感受态枯草芽孢杆菌DN1885细胞中，在30℃选择红霉素(2微克/毫升)和氯霉素(6微克/毫升)抗性。保留了两个转化体，SJ7975(DN1885/pSJ7975)和SJ7976(DN1885/pSJ7976)。

通过接合引入质粒

将同时含有氯霉素和红霉素抗性基因的测试质粒pSJ7976转化入接合供体菌株枯草芽孢杆菌PP289-5中，得到了菌株SJ8000。

使用地衣芽孢杆菌菌株PP1897-3、cat缺失型衍生株SJ8071、菌株ATCC14580和cat缺失型衍生株SJ8344作为受体与供体菌株SJ8000进行接合，基本上如前文所述。

对于每种供体/受体组合，将供体和受体菌落从过夜平板刮下，在小体积的液体TY培养基中混合，再将等体积的这种混合物铺于含有D-丙氨酸的两个LBPGS平板中的每一个上。在30℃温育6小时之后，将一个平板复制到含有红霉素(2微克/毫升)的LBPGS上，并将另一个平板复制到含有氯霉素(6微克/毫升)的LBPGS上。将这些平板在30℃过夜温育，然后在室温(20-25℃)再放置3天。

过夜温育之后，在含有红霉素的平板上观察到了全部供体/受体组合的清晰菌落(distinct colonies)。ATCC14580和SJ8344平板上的数目大约相等，而PP1897-3平板上的菌落数是SJ8071的大约两倍。

使用氯霉素选择的结果则完全不同。对于含有完整的染色体氯霉素抗性基因的两个受体菌株未观察到清晰的转移接合子菌落，但是复制平板含有均匀的成片细胞(an even smear of cells)。

对于cat缺失型受体菌株观察到了清晰的转移接合子菌落。就SJ8071受体以及SJ8344受体而言，当使用氯霉素选择时的转移接合子数与使用红霉素选择时相同。

对于每个含有清晰的转移接合子菌落的平板，无论是用红霉素或是用氯霉素进行选择的，均将10个菌落转移至含有氯霉素或红霉素的新平板，发现全部菌落均可在两种类型的平板上生长。

因此cat缺失型受体菌株的使用允许成功的采用氯霉素抗性来选择DNA向地衣芽孢杆菌中的引入。

实施例5.地衣芽孢杆菌9945A的cat基因的DNA序列

地衣芽孢杆菌菌株9945A(来自Bacillus Genetic Stock Center的菌株5A2；J.Bacteriology(1954)68：307)从Curtis B.Thorne获得，并作为JA102保存。

使用引物#450168+#450171PCR扩增了染色体cat基因区，并且使用相同的引物对扩增出的片段DNA测序。所得序列示于SEQ ID NO：21，而编码的蛋白质示于SEQ ID NO：22。

实施例6.另一地衣芽孢杆菌菌株中的cat基因DNA的DNA序列

国际专利公开WO 03/083125(Genencor Int.Inc)在文本的第21和22页公开了染色体氯霉素抗性基因的DNA和蛋白序列，并且将DNA序列作为此公开的SEQ ID NO：58而蛋白序列作为SEQ ID NO：59给出。同样这两个序列在本文分别作为SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24提供。

实施例7.百分比同一性比对

在表3中比对了四个不同的cat基因，即cat ATCC14580、cat PL1980、cat 9945A和cat WO 03/083125的DNA序列。基于对提供的序列的“全部对全部”比对(″all against all″alignments)计算了矩阵。将矩阵中第i行第j列的内容计算为：用序列i和序列j之间的比对中精确匹配的数目除以比对的总长度减去比对中缺口总长度的差。每个比对均使用EMBOSS软件包版本2.8.0的needle程序进行。程序needle执行以下两篇参考文件中描述的全局比对算法(global alignment algorithm)：

Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453.

Kruskal，J.B.(1983)An overview of sequence comparison In D.Sankoffand J.B.Kruskal，(ed.)，Time warps，string edits and macromolecules：the theoryand practice of sequence comparison，1-44页Addison Wesley.

比对使用了以下参数：

缺口开启罚分(Gap opening penalty)： 10.00

缺口延伸罚分(Gap extension penalty)：0.50

取代矩阵： EBLOSUM62

表3.四种地衣芽孢杆菌cat基因的比对

百分比同一性	ATCC14580	PL1980	9945A	WO 03/083125
					ATCC14580	100.00	96.30	93.67	99.67
PL1980		100.00	92.59	96.33
					9945A			100.00	93.32
WO 03/083125				100.00

使用相同的软件和设定还比对了由以上DNA序列编码的四种不同的蛋白序列，如表4中所示。

表4.由表3中的DNA编码的四种蛋白质的同一性比对

百分比同一性	ATCC14580	PL1980	9945A	WO 03/083125
					ATCC14580	100.00	95.37	92.13	94.39
PL1980		100.00	90.28	90.82
					9945A			100.00	87.24
WO 03/083125				100.00

序列表

<110>诺维信公司(Novozymes A/S)

<120>地衣芽孢杆菌中的氯霉素抗性选择

<130>NZ 10971.204-WO

<160>24

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>2000

<212>DNA

<213>地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC14580

<220>

<221>CDS

<222>(675)..(1322)

<223>编码氯霉素乙酰转移酶

<400>1

atttctgcga tcgatcgttc tgaatgagca agcaaatcga ccgctttctc aatccttttc 60

tgcaggatgt attctgccgg cgagacgcct ttgattcgtt taaatgtccg ctgcaggtga 120

aaagggctga tatggcacct gtcagccaaa gcttgcagag acagcggatc gcgataagat 180

tcctcgatga tttccaccac acgctgtgcc agctcttcat ccggcagcag cgccccggcc 240

ggattgcagc gtttgcaggg gcggtaccct tctgataaag catcttttgc attgaaaaag 300

atctgcacat tgtcgatttg cggaactctc gatttgcagg aagggcggca aaatatgccg 360

gtcgttttga ccgcgtaata aaaaactccg tcataggcgg aatcgttttc cgtaatcgcc 420

cgccacattt caggcgtcaa tcgtgatttg ctgttcatat cttcaccccg atctatgtca 480

gtataaccta tatgacagcc ggaggtggag aggcggagaa cggcacagca agaagacaaa 540

gaagaagaga gactgttgce tggacctccg aaacgcgcta caattcattt acaacacagg 600

atggggtgag aatattgccg gaatcagtga agcaggcctc ctaaaataaa aatctatatt 660

ttaggaggta aaac atg aat ttt caa aca atc gag ctt gac aca tgg tat 710

Met Asn Phe Gln Thr Ile Glu Leu Asp Thr Trp Tyr

1 5 10

aga aaa tct tat ttt gac cat tac atg aag gaa gcg aaa tgt tct ttc 758

Arg Lys Ser Tyr Phe Asp His Tyr Met Lys Glu Ala Lys Cys Ser Phe

15 20 25

agc atc acg gca aac gtc aat gtg aca aat ttg ctc gcc gtg ctc aag 806

Ser Ile Thr Ala Asn Val Asn Val Thr Asn Leu Leu Ala Val Leu Lys

30 35 40

aaa aag aag ctc aag ctg tat ccg gct ttt att tat atc gta tca agg 854

Lys Lys Lys Leu Lys Leu Tyr Pro Ala Phe Ile Tyr Ile Val Ser Arg

45 50 55 60

gtc att cat tcg cgc cct gag ttt aga aca acg ttt gat gac aaa gga 902

Val Ile His Ser Arg Pro Glu Phe Arg Thr Thr Phe Asp Asp Lys Gly

65 70 75

cag ctg ggt tat tgg gaa caa atg cat ccg tgc tat gcg att ttt cat 950

Gln Leu Gly Tyr Trp Glu Gln Met His Pro Cys Tyr Ala Ile Phe His

80 85 90

cag gac gac caa acg ttt tcc gcc ctc tgg acg gaa tac tca gac gat 998

Gln Asp Asp Gln Thr Phe Ser Ala Leu Trp Thr Glu Tyr Ser Asp Asp

95 100 105

ttt tcg cag ttt tat cat caa tat ctt ctg gac gcc gag cgc ttt gga 1046

Phe Ser Gln Phe Tyr His Gln Tyr Leu Leu Asp Ala Glu Arg Phe Gly

110 115 120

gac aaa agg ggc ctt tgg gct aag ccg gac atc ccg ccc aat acg ttt 1094

Asp Lys Arg Gly Leu Trp Ala Lys Pro Asp Ile Pro Pro Asn Thr Phe

125 130 135 140

tca gtt tct tct att cca tgg gtg cgc ttt tca aac ttc aat tta aac 1142

Ser Val Ser Ser Ile Pro Trp Val Arg Phe Ser Asn Phe Asn Leu Asn

145 150 155

ctt gat aac agc gaa cac ttg ctg ccg att att aca aac ggg aaa tac 1190

Leu Asp Asn Ser Glu His Leu Leu Pro Ile Ile Thr Asn Gly Lys Tyr

160 165 170

ttt tca gaa ggc agg gaa aca ttt ttg ccc gtt tcc ttg caa gtt cac 1238

Phe Ser Glu Gly Arg Glu Thr Phe Leu Pro Val Ser Leu Gln Val His

175 180 185

cat gca gtg tgt gac ggc tat cat gcc ggc gct ttt ata aac gag ttg 1286

His Ala Val Cys Asp Gly Tyr His Ala Gly Ala Phe Ile Asn Glu Leu

190 195 200

gaa cgg ctt gcc gcc gat tgt gag gag tgg ctt gtg tgacagagga 1332

Glu Arg Leu Ala Ala Asp Cys Glu Glu Trp Leu Val

205 210 215

aaggccgata tgattcggcc ttttttatat gtacttctta gcgggtctct taacatctct 1392

cactgctgtg tgattttact cacggcattt ggaacgccgg ctctcaacaa actttctgta 1452

gtgaaaatca tgaaccaaac ggatcgtcgg cctgattaac agctgaaagc tgccgatcac 1512

aaacatccat agtcccgccg gcttcagttc ctcggagaaa aagcagaagc tcccgacaag 1572

gaataaaagg ccgatgagaa aatcgtttaa tgtatgtaga actttgtatc tttttttgaa 1632

aaagagttca tatcgtttgt tattgttttg cggcattgct tgatcactcc aatcctttta 1692

tttaccctgc cggaagccgg agtgaaacgc cggtatacat aggatttatg aattaggaaa 1752

acatatgggg aaataaacca tccaggagtg aaaaatatgc ggttattcat atgtgcatcg 1812

tgcctgttcg gcttgattgt tccgtcattt gaaacgaaag cgctgacgtt tgaagaattg 1872

ccggttaaac aagcttcaaa acaatgggaa gttcaaatcg gtaaagccga agccggaaac 1932

ggaatggcga aaccggaaaa aggagcgttt catacttatg ctgtcgaaat caaaaacatt 1992

ggacacga 2000

<210>2

<211>216

<212>PRT

<213>地衣芽孢杆菌ATCC14580

<400>2

Met Asn Phe Gln Thr Ile Glu Leu Asp Thr Trp Tyr Arg Lys Ser Tyr

1 5 10 15

Phe Asp His Tyr Met Lys Glu Ala Lys Cys Ser Phe Ser Ile Thr Ala

20 25 30

Asn Val Asn Val Thr Asn Leu Leu Ala Val Leu Lys Lys Lys Lys Leu

35 40 45

Lys Leu Tyr Pro Ala Phe Ile Tyr Ile Val Ser Arg Val Ile His Ser

50 55 60

Arg Pro Glu Phe Arg Thr Thr Phe Asp Asp Lys Gly Gln Leu Gly Tyr

65 70 75 80

Trp Glu Gln Met His Pro Cys Tyr Ala Ile Phe His Gln Asp Asp Gln

85 90 95

Thr Phe Ser Ala Leu Trp Thr Glu Tyr Ser Asp Asp Phe Ser Gln Phe

100 105 110

Tyr His Gln Tyr Leu Leu Asp Ala Glu Arg Phe Gly Asp Lys Arg Gly

115 120 125

Leu Trp Ala Lys Pro Asp Ile Pro Pro Asn Thr Phe Ser Val Ser Ser

130 135 140

Ile Pro Trp Val Arg Phe Ser Asn Phe Asn Leu Asn Leu Asp Asn Ser

145 150 155 160

Glu His Leu Leu Pro Ile Ile Thr Asn Gly Lys Tyr Phe Ser Glu Gly

165 170 175

Arg Glu Thr Phe Leu Pro Val Ser Leu Gln Val His His Ala Val Cys

180 185 190

Asp Gly Tyr His Ala Gly Ala Phe Ile Asn Glu Leu Glu Arg Leu Ala

195 200 205

Ala Asp Cys Glu Glu Trp Leu Val

210 215

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物#449000

<400>3

cagtgaattc gtttaaccgg caattcttc 29

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物#449001

<400>4

cagtgtcgac gtctcttaac atctctcac 29

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物#448309

<400>5

cagtgtcgac ctgcttcact gattccg 27

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物#448315

<400>6

cagtaagctt aagattcctc gatgatttc 29

<210>7

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物#450168

<400>7

cagtgaattc gtttaaccgg caattcttca aacgtc 36

<210>8

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物#450169

<400>8

cagtgtcgac gtctcttaac atctctcact gctgtg 36

<210>9

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物#450170

<400>9

cagtgtcgac cgcttcactg attccggcaa tattc 35

<210>10

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物#450171

<400>10

cagtaagctt aagattcctc gatgatttcc accacac 37

<210>11

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物#455882

<400>11

cagtgaattc cgctttcgtt tcaaatgacg g 31

<210>12

<211>1662

<212>DNA

<213>地衣芽孢杆菌PL1980

<220>

<221>CDS

<222>(499)..(1146)

<223>编码氯霉素乙酰转移酶

<400>12

taagattcct cgatgatttc caccacacgc tgtgccagct cttcatccgg cagcagcgct 60

ccggcgggat tgcagcgttt gcaggggcgg aacccttctg ataaagcatc ttttgcattg 120

aaaaaaatct gcacattgtc gatttgcgga actctcgatt tgcaggatgg gcggcaaaat 180

atgccggtcg ttttgaccgc gtaataaaaa actccgtcat aggcggaatc gttttccgta 240

attgcccgcc acatttcagg cgtcaatcgt gatttgctgt tcatatcttc accccgatat 300

atgtcagtat aacctaaatg acagccgggg gtgagagacg gagaacggca cagcaagaat 360

acaaagaagg agggatcggt tgcttcggcc tccgaaacgc gctacaattc atttacaata 420

caggatgagg tgagaatatt gccgaaatca gtgaagcagt cctcctaaaa taaaaatcta 480

tattttagga ggtaaaac atg aat ttt caa aca atc gag ctt gac act tgg 531

Met Asn Phe Gln Thr Ile Glu Leu Asp Thr Trp

1 5 10

tat aga aaa tcc tat ttt gac cat tac atg aag gat gcg aaa tgt tct 579

Tyr Arg Lys Ser Tyr Phe Asp His Tyr Met Lys Asp Ala Lys Cys Ser

15 20 25

ttc tgc atc acg gca aac gtc aat gtg aca aat ttg ctc gcc ttg ctc 627

Phe Cys Ile Thr Ala Asn Val Asn Val Thr Asn Leu Leu Ala Leu Leu

30 35 40

aag aaa aag aag atc aag ctg tac ccg gct ttt att tat atc gta tca 675

Lys Lys Lys Lys Ile Lys Leu Tyr Pro Ala Phe Ile Tyr Ile Val Ser

45 50 55

agg gtc att cat tcg cgc cct gag ttt aga aca act ttt gat gac aaa 723

Arg Val Ile His Ser Arg Pro Glu Phe Arg Thr Thr Phe Asp Asp Lys

60 65 70 75

gga cgg ctg ggt tat tgg gaa caa atg cat ccg tgc tat gcg att ttt 771

Gly Arg Leu Gly Tyr Trp Glu Gln Met His Pro Cys Tyr Ala Ile Phe

80 85 90

cat cag gac gac caa acg ttt tcc gcc ctc tgg acg gaa tac tca gac 819

His Gln Asp Asp Gln Thr Phe Ser Ala Leu Trp Thr Glu Tyr Ser Asp

95 100 105

gat ttt tcg cag ttt tat cat caa tat ctt ctg gac gct gag cgc ttt 867

Asp Phe Ser Gln Phe Tyr His Gln Tyr Leu Leu Asp Ala Glu Arg Phe

110 115 120

gga gac aaa agg ggc ctt tgg gct aag ccg gac atc ccg ccc aat acg 915

Gly Asp Lys Arg Gly Leu Trp Ala Lys Pro Asp Ile Pro Pro Asn Thr

125 130 135

ttc tca gtt tca tct att cca tgg gtg agc ttt aca aac ttc aat tta 963

Phe Ser Val Ser Ser Ile Pro Trp Val Ser Phe Thr Asn Phe Asn Leu

140 145 150 155

aac ctt gat aac agc gaa cac ttg ctg ccg att atc aca aac ggg aaa 1011

Asn Leu Asp Asn Ser Glu His Leu Leu Pro Ile Ile Thr Asn Gly Lys

160 165 170

tac ttt tca gaa ggc cgg gaa aca ttt ttg ccc gtt tcc ctg caa gta 1059

Tyr Phe Ser Glu Gly Arg Glu Thr Phe Leu Pro Val Ser Leu Gln Val

175 180 185

cac cat gcc gtg tgt gac ggc tat cat gcc ggc gcc ttc atg aac gag 1107

His His Ala Val Cys Asp Gly Tyr His Ala Gly Ala Phe Met Asn Glu

190 195 200

ttg gca cgg ctt gcc gcc gat tgt aag gag tgg ctt gtg tgacagagga 1156

Leu Ala Arg Leu Ala Ala Asp Cys Lys Glu Trp Leu Val

205 210 215

aaggccgata tgattcggcc ttttttatat gcgctgctta gcggtcttac tgtggtgtgt 1216

ttactcccgg catttggaac gccggctctc aacaaacttt ctgtagtgaa aatcatgaac 1276

caaacggatc gtcggcctga ttaacagctg aaagctgccg atcacaaaca tccatagtcc 1336

cgccggcttc agttcctcgg agaaaaagca gaagctcccg acaaggaata aaaggccgat 1396

gagaaaatcg tttaatatat gtagaacttt gtatcttttt ttgaaaaaga gttcatatcg 1456

attgttattg ttttgcggca ttgcttgatc actccaatcc ttttatttac cctgccggaa 1516

gccggagtga aaagccggta tacataggat ttatgaatta ggaaaacata tggggaaata 1576

aaccatccag gagtgaaaaa tatgcggtta ttcatatgtg catcgtgcct gttcggcttg 1636

attgttccgt catttgaaac gaaagc 1662

<210>13

<211>216

<212>PRT

<213>地衣芽孢杆菌PL1980

<400>13

Met Asn Phe Gln Thr Ile Glu Leu Asp Thr Trp Tyr Arg Lys Ser Tyr

1 5 10 15

Phe Asp His Tyr Met Lys Asp Ala Lys Cys Ser Phe Cys Ile Thr Ala

20 25 30

Asn Val Asn Val Thr Asn Leu Leu Ala Leu Leu Lys Lys Lys Lys Ile

35 40 45

Lys Leu Tyr Pro Ala Phe Ile Tyr Ile Val Ser Arg Val Ile His Ser

50 55 60

Arg Pro Glu Phe Arg Thr Thr Phe Asp Asp Lys Gly Arg Leu Gly Tyr

65 70 75 80

Trp Glu Gln Met His Pro Cys Tyr Ala Ile Phe His Gln Asp Asp Gln

85 90 95

Thr Phe Ser Ala Leu Trp Thr Glu Tyr Ser Asp Asp Phe Ser Gln Phe

100 105 110

Tyr His Gln Tyr Leu Leu Asp Ala Glu Arg Phe Gly Asp Lys Arg Gly

115 120 125

Leu Trp Ala Lys Pro Asp Ile Pro Pro Asn Thr Phe Ser Val Ser Ser

130 135 140

Ile Pro Trp Val Ser Phe Thr Asn Phe Asn Leu Asn Leu Asp Asn Ser

145 150 155 160

Glu His Leu Leu Pro Ile Ile Thr Asn Gly Lys Tyr Phe Ser Glu Gly

165 170 175

Arg Glu Thr Phe Leu Pro Val Ser Leu Gln Val His His Ala Val Cys

180 185 190

Asp Gly Tyr His Ala Gly Ala Phe Met Asn Glu Leu Ala Arg Leu Ala

195 200 205

Ala Asp Cys Lys Glu Trp Leu Val

210 215

<210>14

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物#457708

<400>14

cagtgtcgac ctgcttagcg gtcttactg 29

<210>15

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物#448697

<400>15

gactaagctt agatcttcac ttccttattt tgttgtaagt a 41

<210>16

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物#448698

<400>16

gactgaattc gtcgatcact ttctgccact c 31

<210>17

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物#448699

<400>17

gactgaattc agatctgcta gcacgcgtgc ggccgcacga agacagcccg cttc 54

<210>18

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物#448700

<400>18

gactaagctt cataaattct cggatacaac ac 32

<210>19

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物#448716

<400>19

gactggatcc atgaacttta ataaaattga tttagac 37

<210>20

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物#448718

<400>20

gactgaattc gctagcacgc gttataaaag ccagtcatta ggcc 44

<210>21

<211>1612

<212>DNA

<213>地衣芽孢杆菌9945A

<220>

<221>CDS

<222>(457)..(1104)

<223>编码氯霉素乙酰转移酶

<400>21

tccggcagca gcatcccggc cggattgcag cgtttgcagg ggcggtaccc ttctgataaa 60

gcatcttttg cattgaaaaa gatttgcaca ttttcgattt gcggaactct cgatttgcag 120

gaagggcggc aaaatatccc ggtcgttttg accgcgtaat aaaaaactcc gtcataggcg 180

gaatcgtttt ccgtaatcgc ccgccacctt tcaggcgtca atcgtgattt gctgttcata 240

tcttcacccc gatctatgtc agtataacct aaatgacagc cggaggtgga gaggcgggga 300

atggcacagc aagaagacaa agaagaagag ggacggttgc ctgcgtctcc gaaacgcgct 360

acaattcatt tgcaatacag gatgaggtga gaatattgcc gaaatcagag aagcaggcct 420

cctaaaataa aaaagctata ttttaggagg taaaac atg aat ttt caa aca atc 474

Met Asn Phe Gln Thr Ile

1 5

gat ctc gac act tgg tat aga aaa tct tat ttt gac cat tac atg aag 522

Asp Leu Asp Thr Trp Tyr Arg Lys Ser Tyr Phe Asp His Tyr Met Lys

10 15 20

gaa gcg aaa tgt tct ttc agt ata acg aca aac gtc aat gtg acc aat 570

Glu Ala Lys Cys Ser Phe Ser Ile Thr Thr Asn Val Asn Val Thr Asn

25 30 35

ttg ctt gcc gtg ctc aag aaa aag aag atc aag ctg tac ccg gtt ttt 618

Leu Leu Ala Val Leu Lys Lys Lys Lys Ile Lys Leu Tyr Pro Val Phe

40 45 50

att tat atc gta tca agg gcc att cat tcg cgt cct gag ttt aga aca 666

Ile Tyr Ile Val Ser Arg Ala Ile His Ser Arg Pro Glu Phe Arg Thr

55 60 65 70

act ttt aac gac aaa gga cag ctg gga tat tgg gaa caa atg cac ccg 714

Thr Phe Asn Asp Lys Gly Gln Leu Gly Tyr Trp Glu Gln Met His Pro

75 80 85

tgc tat acg att ttt cat cag gac gac caa acg ttt tcc gcc ctc tgg 762

Cys Tyr Thr Ile Phe His Gln Asp Asp Gln Thr Phe Ser Ala Leu Trp

90 95 100

aca gaa tac tca aat gat ttc tcg cgg ttt tat cgt caa tat ctt cag 810

Thr Glu Tyr Ser Asn Asp Phe Ser Arg Phe Tyr Arg Gln Tyr Leu Gln

105 110 115

gat gcc gag cgc ttt gga gac aaa aag ggc tta tgg gct aag ccg gac 858

Asp Ala Glu Arg Phe Gly Asp Lys Lys Gly Leu Trp Ala Lys Pro Asp

120 125 130

atc ccg ccc aat gcg ttt tca gtt tct tct att cca tgg gtg cgc ttt 906

Ile Pro Pro Asn Ala Phe Ser Val Ser Ser Ile Pro Trp Val Arg Phe

135 140 145 150

aca aac ttt aat tta aac cta gat aac agc gaa cac ttg ctg ccg att 954

Thr Asn Phe Asn Leu Asn Leu Asp Asn Ser Glu His Leu Leu Pro Ile

155 160 165

att aca aac ggg aaa tac ttt tca gaa ggc ggt gaa aca ttt ttg ccg 1002

Ile Thr Asn Gly Lys Tyr Phe Ser Glu Gly Gly Glu Thr Phe Leu Pro

170 175 180

gtt tcc ctg caa gta cac cat gca gtg tgt gac ggc tat cat gcc ggc 1050

Val Ser Leu Gln Val His His Ala Val Cys Asp Gly Tyr His Ala Gly

185 190 195

gct ttt atg aac gag ttg gaa cgg ctt gcc gcc gat tgt gag gag tgg 1098

Ala Phe Met Asn Glu Leu Glu Arg Leu Ala Ala Asp Cys Glu Glu Trp

200 205 210

ctt atg tgacagagga aaggccgatt ggattcggcc ttttttatat gcacttctta 1154

Leu Met

215

gcgggtctcc taccatctct ccctgctgtt taaatttact cacgggattt ggaacgccgg 1214

ctctcaacaa acttccggta atgaaaatca tgaaccaaac ggatcgtcgg ectgattaac 1274

agctgaaagc tgccgatcac aaacatccat attcccgccg gcttcagttc ctcgaagaaa 1334

aaacagaagc tcccgacaag gaataaaaga ccgataagaa aatcgtttaa tgtatgaaga 1394

actttgtatc tttttttgaa aaagagttcg tatcgatcat tgtggttttg cggcattgct 1454

tgatccctcc agtcctttta ttaccctgcc ggaagcagga gtgaaacgtc ggtatgcata 1514

ggatttatga ataaggaaaa acatataggg acatcgacca tcgaggagtg aaaaatatgc 1574

ggctattcat atgtgcattg tgcctgttca gcatgatt 1612

<210>22

<211>216

<212>PRT

<213>地衣芽孢杆菌9945A

<400>22

Met Asn Phe Gln Thr Ile Asp Leu Asp Thr Trp Tyr Arg Lys Ser Tyr

1 5 10 15

Phe Asp His Tyr Met Lys Glu Ala Lys Cys Ser Phe Ser Ile Thr Thr

20 25 30

Asn Val Asn Val Thr Asn Leu Leu Ala Val Leu Lys Lys Lys Lys Ile

35 40 45

Lys Leu Tyr Pro Val Phe Ile Tyr Ile Val Ser Arg Ala Ile His Ser

50 55 60

Arg Pro Glu Phe Arg Thr Thr Phe Asn Asp Lys Gly Gln Leu Gly Tyr

65 70 75 80

Trp Glu Gln Met His Pro Cys Tyr Thr Ile Phe His Gln Asp Asp Gln

85 90 95

Thr Phe Ser Ala Leu Trp Thr Glu Tyr Ser Asn Asp Phe Ser Arg Phe

100 105 110

Tyr Arg Gln Tyr Leu Gln Asp Ala Glu Arg Phe Gly Asp Lys Lys Gly

115 120 125

Leu Trp Ala Lys Pro Asp Ile Pro Pro Asn Ala Phe Ser Val Ser Ser

130 135 140

Ile Pro Trp Val Arg Phe Thr Asn Phe Asn Leu Asn Leu Asp Asn Ser

145 150 155 160

Glu His Leu Leu Pro Ile Ile Thr Asn Gly Lys Tyr Phe Ser Glu Gly

165 170 175

Gly Glu Thr Phe Leu Pro Val Ser Leu Gln Val His His Ala Val Cys

180 185 190

Asp Gly Tyr His Ala Gly Ala Phe Met Asn Glu Leu Glu Arg Leu Ala

195 200 205

Ala Asp Cys Glu Glu Trp Leu Met

210 215

<210>23

<211>602

<212>DNA

<213>地衣芽孢杆菌

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(599)

<223>编码SEQ ID NO：24中所示的氯霉素乙酰转移酶

<400>23

atgaattttc aaacaatcga gcttgacaca tggtatagaa aatcttattt tgaccattac 60

atgaaggaag cgaaatgttc tttcagcatc acggcaaacg tcaatgtgac aaatttgctc 120

gccgtgctca agaaaaagaa gctcaagctg tatccggctt ttatttatat cgtatcaagg 180

gtcattcatt cgcgccctga gtttagaaca acgtttgatg acaaaggaag ctgggttatt 240

gggaacaaat gcatccgtgc tatgcgattt ttcatcagga cgaccaaacg ttttccgccc 300

tctggacgga atactcagac gatttttcgc agttttatca tcaatatctt ctggacgccg 360

agcgctttgg agacaaaagg ggcctttggg ctaagccgga catcccgccc aatacgtttt 420

cagtttcttc tattccatgg gtgcgctttt caacattcaa tttaaacctt gataacagcg 480

aacacttgct gccgattatt acaaacggga aatacttttc agaaggcagg gaaacatttt 540

tgcccgtttc ctgcaagttc accatgcagt gtgtgacggc tatcatgccg gcgcttttat 600

aa 602

<210>24

<211>200

<212>PRT

<213>地衣芽孢杆菌

<400>24

Met Asn Phe Gln Thr Ile Glu Leu Asp Thr Trp Tyr Arg Lys Ser Tyr

1 5 10 15

Phe Asp His Tyr Met Lys Glu Ala Lys Cys Ser Phe Ser Ile Thr Ala

20 25 30

Ash Val Asn Val Thr Asn Leu Leu Ala Val Leu Lys Lys Lys Lys Leu

35 40 45

Lys Leu Tyr Pro Ala Phe Ile Tyr Ile Val Ser Arg Val Ile His Ser

50 55 60

Arg Pro Glu Phe Arg Thr Thr Phe Asp Asp Lys Gly Gln Leu Gly Tyr

65 70 75 80

Trp Glu Gln Met His Pro Cys Tyr Ala Ile Phe His Gln Asp Asp Gln

85 90 95

Thr Phe Ser Ala Leu Trp Thr Glu Tyr Ser Asp Asp Phe Ser Gln Phe

100 105 110

Tyr His Gln Tyr Leu Leu Asp Ala Glu Arg Phe Gly Asp Lys Arg Gly

115 120 125

Leu Trp Ala Lys Pro Asp Ile Pro Pro Asn Thr Phe Ser Val Ser Ser

130 135 140

Ile Pro Trp Val Arg Phe Ser Thr Phe Asn Leu Asn Leu Asp Asn Ser

145 150 155 160

Glu His Leu Leu Pro Ile Ile Thr Asn Gly Lys Tyr Phe Ser Glu Gly

165 170 175

Arg Glu Thr Phe Leu Pro Val Ser Cys Lys Phe Thr Met Gln Cys Val

180 185 190

Thr Ala Ile Met Pro Ala Leu Leu

195 200

Claims

1.一种用于将重组DNA构建体引入修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞的方法，所述方法包括：

b)将重组DNA构建体引入所述修饰的宿主细胞，所述重组DNA构建体包含编码氯霉素乙酰转移酶的选择标记；

2.权利要求1的方法，其中所述重组DNA构建体是质粒。

3.权利要求2的方法，其中所述重组DNA构建体是线性化的质粒。

4.权利要求2的方法，其中所述重组DNA构建体是多联体化的质粒。

5.权利要求1或2的方法，其中所述重组DNA构建体还包含编码感兴趣的多肽的多核苷酸。

6.权利要求5的方法，其中所述感兴趣的多肽是酶。

7.权利要求1的方法，其中一个或多个基因组氯霉素乙酰转移酶基因编码氯霉素乙酰转移酶，所述氯霉素乙酰转移酶由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成。

8.权利要求1的方法，其中所述一个或多个基因组氯霉素乙酰转移酶基因由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：12的多核苷酸序列组成。

9.权利要求1的方法，其中所述DNA构建体的选择标记编码氯霉素乙酰转移酶，所述氯霉素乙酰转移酶由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成。

10.权利要求1的方法，其中所述DNA构建体的选择标记的侧翼有解离酶位点。

11.权利要求1的方法，其中所述DNA构建体还包含与宿主细胞的基因组DNA区充分同源的多核苷酸区，以通过同源重组实现将所述DNA构建体整合入基因组中。

12.权利要求1的方法，其中所述生长培养基中氯霉素的抑制浓度是至少1微克/毫升。

13.权利要求1的方法，其中所述生长培养基中氯霉素的抑制浓度是至少2微克/毫升。

14.权利要求1的方法，其中所述生长培养基中氯霉素的抑制浓度是至少3微克/毫升。

15.权利要求1的方法，其中所述生长培养基中氯霉素的抑制浓度是至少6微克/毫升。

16.权利要求1的方法，其中所述生长培养基中氯霉素的抑制浓度是至少9微克/毫升。

17.权利要求1的方法，其中所述生长培养基中氯霉素的抑制浓度是至少12微克/毫升。

18.一种修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中已将一个或多个基因组氯霉素乙酰转移酶基因失活，所述宿主细胞包含携带编码氯霉素乙酰转移酶的选择标记的重组DNA构建体。

19.权利要求18的宿主细胞，其中所述重组DNA构建体是质粒。

20.权利要求19的宿主细胞，其中所述重组DNA构建体是线性化的质粒。

21.权利要求19的宿主细胞，其中所述重组DNA构建体是质粒多联体化的质粒。

22.权利要求18的宿主细胞，其中所述重组DNA构建体还包含编码感兴趣的多肽的多核苷酸。

23.权利要求22的宿主细胞，其中所述感兴趣的多肽是酶。

24.权利要求18的宿主细胞，其中所述一个或多个基因组氯霉素乙酰转移酶基因编码氯霉素乙酰转移酶，所述氯霉素乙酰转移酶由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成。

25.权利要求18的宿主细胞，其中所述一个或多个基因组氯霉素乙酰转移酶基因由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：12的多核苷酸序列组成。

26.权利要求18的宿主细胞，其中所述DNA构建体的选择标记编码氯霉素乙酰转移酶，所述氯霉素乙酰转移酶由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成。

27.权利要求18的宿主细胞，其中所述DNA构建体的选择标记的侧翼有解离酶位点。

28.权利要求18的宿主细胞，其中所述DNA构建体还包含与宿主细胞的基因组DNA区充分同源的多核苷酸区，以通过同源重组实现将所述DNA构建体整合入基因组中。