ES2921623T3 - ARN modificado terminalmente - Google Patents

ARN modificado terminalmente Download PDF

Info

Publication number
ES2921623T3
ES2921623T3 ES13779667T ES13779667T ES2921623T3 ES 2921623 T3 ES2921623 T3 ES 2921623T3 ES 13779667 T ES13779667 T ES 13779667T ES 13779667 T ES13779667 T ES 13779667T ES 2921623 T3 ES2921623 T3 ES 2921623T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
mir
mrna
modified
sequence
utr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES13779667T
Other languages
English (en)
Inventor
Tirtha Chakraborty
Stephane Bancel
Stephen G Hoge
Atanu Roy
Fougerolles Antonin De
Noubar B Afeyan
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ModernaTx Inc
Original Assignee
ModernaTx Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49447811&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2921623(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by ModernaTx Inc filed Critical ModernaTx Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2921623T3 publication Critical patent/ES2921623T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection

Abstract

La invención se refiere a composiciones y métodos para la fabricación y optimización de moléculas de ARNm modificadas mediante la optimización de su arquitectura terminal. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
ARN modificado terminalmente
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
Esta solicitud reivindica la prioridad de Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No 61/729.933, depositada el 26 de noviembre de 2012, titulada Terminially Optimized Modified RNAs, Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No 61/737.224, depositada el 14 de diciembre de 2012, titulada Terminally Optimized Modified RNAs, Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No 61/758.921, depositada el 31 de emero de 2013, titulada Differential Targeting Using RNA Constructs, Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No 61/781.139, depositada el 14 de marzo de 2013, titulada Differential Targeting Using RNA Constructs, Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No 61/829.359, depositada el 31 de mayo de 2013, titulada Differential Targeting Using RNA Constructs, Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No 61/839.903, depositada el 27 de junio de 2013, titulada Differential Targeting Using RNA Constructs, Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No 61/842.709, depositada el 3 de julio de 2013, titulada Differential Targeting Using RNA Constructs, Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No 61/857.436, depositada el 23 de julio de 2013, titulada Differential Targeting Using RNA Constructs, Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No 61/775.509, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Heterologous Untranslated Regions for mRNA y Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No 61/829.372, depositada el 31 de mayo de 2013, titulada Heterologous Untranslated Regions for mRNA.
REFERENCIA AL LISTADO DE SECUENCIAS
La presente solicitud se deposita junto con un Listado de Secuencias en formato electrónico. El Listado de Secuencias se proporciona como un archivo titulado M39PCT2.txt creado el 1 de octubre de 2013, que tiene un tamaño de 3262 934 bytes.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona con composiciones y procedimientos para la fabricación y uso de ARNm modificado y/o optimizado y su uso en combinación con uno o más ARNm modificados o de tipo salvaje que codifican una proteína de unión a ARN.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los ARN naturales se sintetizan a partir de cuatro ribonucleótidos básicos: ATP, CTP, UTP y GTP, pero pueden contener nucleótidos modificados postranscripcionalmente. Además, se han identificado aproximadamente cien modificaciones de nucleósidos diferentes en el ARN (Rozenski, J, Crain, P y McCloskey, J. (1999). The RNA Modification Database: actualización 1999. Nucl Acids Res 27: 196-197).
Existen múltiples problemas con las metodologías anteriores para efectuar la expresión de proteínas. Por ejemplo, el ácido desoxirribonucleico heterólogo (ADN) introducido en una célula puede ser heredado por las células hijas (ya sea que el ADN heterólogo se haya integrado o no en el cromosoma) o por la descendencia. El ADN introducido puede integrarse en el ADN genómico de la célula huésped con cierta frecuencia, lo que resulta en alteraciones y/o daño al ADN genómico de la célula huésped. Además, deben producirse múltiples etapas antes de que se produzca una proteína. Una vez dentro de la célula, el ADN debe transportarse al núcleo donde se transcribe en ARN. El ARN transcrito a partir del ADN debe a continuación ingresar al citoplasma donde se traduce en proteína. Esta necesidad de múltiples etapas de procesamiento crea tiempos de retraso antes de la generación de una proteína de interés. Además, es difícil obtener la expresión de ADN en las células; con frecuencia, el ADN ingresa a las células pero no se expresa o no se expresa a velocidades o concentraciones razonables. Esto puede ser un problema particular cuando se introduce a Dn en células tales como células primarias o líneas celulares modificadas. El papel de las modificaciones de nucleósidos en el potencial inmunoestimulador, la estabilidad y la eficiencia de traducción del ARN, y los consiguientes beneficios para mejorar la expresión de proteínas y producir productos terapéuticos, se han explorado previamente. Dichos estudios se detallan en la Publicación Internacional de solicitud pendiente de tramitación N° WO2012019168 depositada el 5 de agosto de 201, Publicación Internacional N° WO2012045082 depositada el 3 de octubre de 2011, Publicación Internacional N° WO2012045075 depositada el 3 de octubre de 2011, Publicación Internacional N° WO2013052523 depositada el 3 de octubre de 2012, y Publicación Internacional N° WO2013090648 depositada el 14 de diciembre de 2012.
El uso de polinucleótidos modificados en los campos de anticuerpos, virus, aplicaciones veterinarias y una variedad de entornos in vivo se ha explorado y se divulga, por ejemplo, en la Solicitud Internacional N° PCT/US2013/030062, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Biologics and Proteins Associated with Human Disease; Solicitud de Patente de EE. UU. N° 13/791,922, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Biologics and Proteins Associated with Human Disease; Solicitud Internacional N° PCT/US2013/030063, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides; Solicitud Internacional N° PCT/US2013/030064, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins; Solicitud de Patente de EE. UU. N° 13/791,921, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins; Solicitud Internacional N° PCT/US2013/030059, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Membrane Proteins; Solicitud Internacional N° PCT/US2013/030066, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins; Solicitud Internacional N° PCT/US2013/030067, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins; Solicitud Internacional N° PCT/US2013/030060, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins; Solicitud Internacional N° PCT/US2013/030061, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; Solicitud de Patente de EE. UU. N° 13/791,910, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; Solicitud Internacional N° PCT/US2013/030068, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Cosmetic Proteins and Peptides; y Solicitud Internacional N° PCT/US2013/030070, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Oncology-Related Proteins and Peptides; Solicitud de Patente Internacional N° PCT/US2013/031821, depositada el 15 de marzo de 2013, titulada In Vivo Production of Proteins.
Las formulaciones y la administración de polinucleótidos modificados se describen, por ejemplo, en la Publicación Pnternacional en trámite y en copropiedad N° WO2013090648, depositada el 14 de diciembre de 2012, titulada Modified Nucleoside, Nucleotide, Nucleic Acid Compositions y Publicación de EE. UU. N° US20130156849, depositada el 14 de diiembre de 2012, titulada Modified Nucleoside, Nucleotide, Nucleic Acid Compositions.
WO 2011/012316 A2 se refiere a un polirribonucleótido con una secuencia que codifica una proteína o un fragmento de proteína, donde el polirribonucleótido comprende una combinación de nucleótidos no modificados y modificados, donde del 5 al 50 % de los nucleótidos de uridina y del 5 al 50 % de los nucleótidos de citidina son nucleótidos de uridina modificados o nucleótidos de citidina modificados.
Existe una necesidad en la técnica, por lo tanto, de modalidades biológicas para abordar la modulación de la traducción intracelular de ácidos nucleicos. La presente divulgación aborda esta necesidad proporcionando procedimientos y composiciones para la fabricación y optimización de moléculas de ARNm modificadas mediante la alteración de la arquitectura terminal de las moléculas.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona una formulación de nanopartículas lipídicas de un ARNm para la expresión dirigida de un polipéptido de interés en tipos celulares específicas, comprendiendo dicho ARNm una región no traducida en 5', una región de nucleósidos enlazados que codifican el polipéptido de interés, una región no traducida en 3' que comprende al menos un sitio de unión de microARN para un microARN expresado en un tipo celular específico de modo que la expresión de ARNm se puede reducir, donde el ARNm se degrada o reduce la traducción en presencia del microARN, y una región de descolado 3' de nucleósidos enlazados, donde el uracilo o la uridina en el ARNm se reemplaza al 100 % con un uracilo modificado o una uridina modificada, respectivamente.
La presente invención también proporciona la formulación de nanopartículas lipídicas de un ARNm de la presente invención para su uso en un procedimiento terapéutico donde la expresión del ARNm está dirigida a tipos celulares específicos.
Otros aspectos de la invención son como se definen en las reivindicaciones.
En esta invención se describen procedimientos para estabilizar o inducir una mayor expresión de proteínas a partir de un ARNm modificado. En otro procedimiento, una célula se pone en contacto con un ARNm modificado que codifica un polipéptido de interés en combinación con un ARNm modificado que codifica una o más proteínas de unión a ARN.
En un caso, en esta invención se proporciona ARNm optimizado terminalmente que comprende una primera región de nucleósidos enlazados que codifican un polipéptido de interés que está ubicado en 5' con respecto a la primera región, una segunda región terminal ubicada en 3' con respecto a la primera región terminal y una región de descolado 3'. La primera región terminal puede comprender al menos un elemento que mejora la traducción (TEE) como, entre otros, los TEE descritos en la Tabla 28, como, entre otros, TEE-001 - TEE-705.
La primera región terminal puede comprender una región 5' no traducida (UTR) que puede ser la 5'UTR nativa del polipéptido codificado de interés o puede ser heteróloga del polipéptido codificado de interés. En un aspecto, la 5'UTR puede comprender al menos una secuencia de iniciación de la traducción tal como una secuencia kozak, un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) y/o un fragmento del mismo. Como ejemplo no limitativo, la 5'UTR puede comprender al menos un fragmento de un IRES. Como otro ejemplo no limitativo, la 5'UTR puede comprender al menos 5 fragmentos de un IRES. En otro aspecto, la 5'UTR puede comprender una UTR estructurada.
La segunda región terminal puede comprender al menos un sitio de unión de microARN, una secuencia semilla o un sitio de unión de microARN sin una secuencia semilla. En un aspecto, el microARN es un microARN específico de células inmunitarias como, entre otros, mir-122, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-146a y miR-146b.
En un caso, la región de descolado 3' puede comprender un nucleósido que termina la cadena como, entre otros, 3'-desoxiadenosina (cordicepina), 3'-desoxiuridina, 3'-desoxicitosina, 3'-desoxiguanosina, 3' -desoxitimina, 2',3'-dideoxinucleósidos, 2',3'- didesoxiadenosina, 2',3'-dideoxiuridina, 2',3'-dideoxicitosina, 2',3'- didesoxiguanosina, 2',3'-didesoxitimina, un 2'-desoxinucleósido y -0-metilnucleósido. En un aspecto, la región de descolado 3' es una secuencia de horquilla (stem loop sequence) o una cola poliA.
En un caso, en esta invención se proporciona ARNm optimizado terminalmente que comprende una primera región de nucleósidos enlazados que codifican un polipéptido de interés que está ubicado en 5' con respecto a la primera región, una segunda región terminal ubicada en 3' con respecto a la primera región terminal y una región de descolado 3' de nucleósidos enlazados y al menos un nucleósido de terminación de cadena ubicado en 3' con respecto al ARNm optimizado terminalmente. En otro aspecto, la segunda región terminal puede comprender al menos un sitio de unión de microARN, una secuencia semilla o un sitio de unión de microARN sin una secuencia semilla. En un aspecto, el microARN es un microARN específico de células inmunitarias como, entre otros, mir-122, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-146a y miR-146b.
El ARNm optimizado terminalmente descrito en esta invención puede comprender al menos un nucleósido modificado En un caso, el ARNm optimizado terminalmente comprende un análogo de pseudouridina como, entre otros, 1-carboximetil-pseudouddina, 1 -propinil-pseudouridina, 1-taunnometil-pseudoundina, 1-taurinometil-4-tiopseudouridina, 1-metil-pseudouridina (m'V), 1-metil-4-tio-pseudouridina (m1s4^ ), 4-tio-1-metil-pseudouridina, 3-metilpseudouridina (m3^ ), 2-tio-1-metil-pseudouridina, 1-metil-l-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-1-deazapseudouridina, dihidropseudouridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-metoxiuridina, 2-metoxi-4-tio-uridina, 4-metoxipseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudoundina, N1-metil-pseudouridina, 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudoudd¡na(acp3Y), y 2'-0-metil-pseudouridina (^m). En otro caso, el ARNm optimizado terminalmente comprende el análogo de pseudouridina 1-metilpseudoundina. En otro caso más, el ARNm optimizado terminalmente comprende el análogo de pseudouridina 1-metilpseudouridina y comprende el nucleósido modificado 5-metilcitidina.
El ARNm optimizado terminalmente descrito en esta invención puede comprender al menos una estructura de caperuza en 5' como, entre otros, Cap0, Capí, ARCA, inosina, Nl-metil-guanosina, 2'fluoro-guanosina, 7-deazaguanosina, 8 -oxo-guanosina, 2-amino-guanosina, LNA-guanosina, 2-azido-guanosina, Cap2, Cap4 y CAP-003-CAP-225.
En un aspecto, al menos una región del ARNm optimizado terminalmente puede tener codones optimizados. Como ejemplo no limitativo, la primera región de nucleósidos enlazados puede tener codones optimizados.
También se proporcionan en esta invención procedimientos para usar el ARNm optimizado terminalmente.
En un caso, se proporciona un procedimiento para reducir la respuesta inmunitaria mediada por antígeno en un organismo poniendo en contacto el organismo con un ARNm optimizado terminalmente. El ARNm optimizado terminalmente puede comprender una primera región de nucleósidos enlazados que codifican un polipéptido de interés que está ubicado en 5' con respecto a la primera región, una segunda región terminal ubicada en 3' con respecto a la primera región terminal y una región de descolado 3'. La segunda región terminal puede comprender al menos un sitio de unión de microARN, una secuencia semilla o un sitio de unión de microARN sin una secuencia semilla. En un aspecto, el microARN es un microARN específico de células inmunitarias como, entre otros, mir-122, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-146a y miR-146b.
En otro caso, el ARNm optimizado terminalmente que reduce la respuesta inmunitaria mediada por antígeno puede comprender al menos una secuencia de elemento que mejora la traducción (TEE) como, entre otros, TEE-001 - TEE 705, un nucleósido de terminación de cadena y/o una secuencia de horquilla.
En otro caso más, el ARNm optimizado terminalmente que reduce la respuesta inmune mediada por antígeno puede comprender al menos una región que está optimizada por codones. Como ejemplo no limitativo, la primera región de nucleósidos enlazados puede tener codones optimizados.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 es un esquema de una construcción principal de la presente divulgación.
La FIG. 2 es un esquema ampliado de la segunda región flanqueante de una construcción primaria de la presente divulgación que ilustra los elementos sensores del polinucleótido.
La FIG. 3 es un mapa de clones útil en esta divulgación.
La FIG. 4 es un histograma que muestra la producción de proteína mejorada a partir de ARNm modificados de la presente divulgación que tienen colas de poli-A cada vez más largas a dos concentraciones.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
En esta invención se describen composiciones y procedimientos para la fabricación y optimización de moléculas de ARNm modificadas mediante la alteración de la arquitectura terminal de las moléculas. Específicamente se describen procedimientos para aumentar la producción de proteínas alterando las regiones terminales del ARNm. Dichas regiones terminales incluyen al menos la región no traducida (UTR) 5' y la 3'UTR. Otras características que pueden modificarse y encontrarse en 5' o 3' de la región codificante incluyen la caperuza 5' y la cola poli-A de los ARNm modificados (ARN modificados).
En general, los ácidos nucleicos exógenos, en particular los ácidos nucleicos víricos, introducidos en las células inducen una respuesta inmunitaria innata que da como resultado la producción de interferón (IFN) y la muerte celular. Sin embargo, es de gran interés para la terapia, el diagnóstico, los reactivos y los ensayos biológicos para administrar un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido ribonucleico (ARN) dentro de una célula, ya sea in vivo o ex vivo, para provocar la traducción intracelular del ácido nucleico y la producción de la proteína codificada. De particular importancia es la administración y la función de un ácido nucleico no integrador, ya que los ácidos nucleicos caracterizados por la integración en una célula diana son generalmente imprecisos en sus niveles de expresión, perjudicialmente transferibles a la progenie y a las células vecinas, y sufren el riesgo sustancial de mutación. .
La modificación terminal descrita en esta invención puede usarse en los ácidos nucleicos modificados que codifican polipéptidos de interés, como, entre otros, los polipéptidos de interés descritos en, Solicitud de Patente de EE. UU. N° 61/6l 8.953, depositada el 2 de abril de 2012, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease, Solicitud de Patente de EE. UU. N° 61/681.704, depositada el 10 de agosto de 2012, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease, Solicitud de Patente de EE. UU. N° 61/737.203, depositada el 14 de diciembre de 2012, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease, Solicitud Internacional N° PCT/US2013/030062, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Biologics and Proteins Associated with Human Disease; Solicitud Internacional N° PCT/US2013/030063, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucloetides; Solicitud Internacional N°. PCT/US2013/030064, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins; Solicitud Internacional N° PCT/US2013/030059, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Membrane Proteins; Solicitud Internacional N°. PCT/US2013/030066, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins; Solicitud Internacional N°. PCT/US2013/030067, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins; Solicitud Internacional N°. PCT/US2013/030060, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins; Solicitud Internacional N°. PCT/US2013/030061, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; Solicitud Internacional N°. PCT/US2013/030068, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Cosmetic Proteins and Peptides; Solicitud Internacional N°. PCT/US2013/030070, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Oncology-Related Proteins and Peptides; y Solicitud Internacional N°. PCT/US2013/031821, depositada el 15 de marzo de 2013, titulada In Vivo Production of Proteins, Solicitud de Patente Provisional de EE. uU. N°. 61/729.933, depositada el 26 de noviembre de 2012, titulada Terminally Optimized Modified RNAs, Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. N°. 61/737.224, depositada el 14 de diciembre de 2012, titulada Terminally Optimized Modified RNAs, Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. N°. US 61/758,921, depositada el 31 de enero de 2013, titulada Differential Targeting Using RNA Constructs, Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. N°. US 61/781.139, depositada el 14 de marzo de 2013, titulada Differential Targeting Using RNA Constructs, Solicitud Provisional de Ee. UU. N°. 61/829,359, depositada el 31 de mayo de 2013, titulada Differential Targeting Using RNA Constructs.
En esta invención se proporcionan en parte moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos capaces de modular el estado de una célula, la función y/o actividad y procedimientos para preparar y usar estos ácidos nucleicos y polipéptidos. Como se describe en esta invención y en la Publicación internacional en trámite y copropiedad N° WO2012019168 presentada el 5 de agosto de 2011, Publicación internacional N° WO2012045082 presentada el 3 de octubre de 2011, Publicación internacional N° WO2012045075 presentada el 3 de octubre de 2011, Publicación internacional N° WO2013052523 presentada el 3 de octubre de 2012, y Publicación internacional N° WO2013090648 presentada el 14 de diciembre de 2012, estas moléculas de ácido nucleico modificadas son capaces de reducir la actividad inmunitaria innata de una población de células donde se introducen, aumentando así la eficacia de la producción de proteínas en esa población celular.
Además de la utilización de nucleósidos y nucleótidos no naturales, como los descritos en la Publicación de Patente de EE. UU. N° US20130115272, depositada el 3 de octubre de 2012, en los ARN modificados de la presente divulgación, ahora se ha descubierto que el uso concomitante de arquitectura terminal alterada también puede servir para aumentar la producción de proteínas de una población celular. I.
I. Composiciones de la divulgación
Esta divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico, incluidos ARN como ARNm, que pueden ser sintéticos, que contienen uno o más nucleósidos modificados (denominados "ácidos nucleicos modificados" o "moléculas de ácido nucleico modificado") y polinucleótidos, construcciones primarias y ARNm modificado (ARNmm), que tienen propiedades útiles, incluida la falta de una inducción sustancial de la respuesta inmunitaria innata de una célula donde se introduce el ARNm. Debido a que estos ácidos nucleicos modificados mejoran la eficiencia de la producción de proteínas, la retención intracelular de ácidos nucleicos y la viabilidad de las células en contacto, además de poseer una inmunogenicidad reducida, estos ácidos nucleicos que tienen estas propiedades se denominan ácidos nucleicos "mejorados" o ARN modificados en esta invención.
En un caso, los polinucleótidos son transcritos de ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de interés que, cuando se traducen, envían una señal a la célula que resulta en un beneficio terapéutico para el organismo. Los polinucleótidos señal también pueden comprender además opcionalmente una secuencia (traducible o no) que detecta el microentorno del polinucleótido y altera (a) la función o el resultado del fenotipo asociado con el péptido o la proteína que se traduce, (b) el nivel de expresión del polinucleótido señal, y/o ambas cosas.
El término "ácido nucleico", en su sentido más amplio, incluye cualquier compuesto y/o sustancia que comprenda un polímero de nucleótidos. A menudo se hace referencia a estos polímeros como polinucleótidos.
Ácidos nucléicos ejemplares incluyen ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos treósicos (TNA), ácidos nucleicos de glicol (GNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA) o híbridos de los mismos.. También pueden incluir agentes inductores de ARNi, agentes de ARNi, siRNA, shARN, miARN, ARN antisentido, ribozimas, ADN catalítico, ARNt, ARN que inducen la formación de triple hélice, aptámeros, vectores, etc. En casos preferidos, la molécula de ácido nucleico modificada es uno o más ARN mensajeros (ARNm).
En casos preferidos, el polinucleótido o molécula de ácido nucleico es un ARN mensajero (ARNm). Tal como se usa en esta invención, el término "ARN mensajero" (ARNm) se refiere a cualquier polinucleótido que codifica al menos un péptido o polipéptido de interés y que es capaz de traducirse para producir el péptido polipéptido de interés codificado in vitro, in vivo, in situ o ex vivo.Los polinucleótidos de la divulgación pueden ser ARNm o cualquier molécula de ácido nucleico y pueden o no estar modificados químicamente.
Tradicionalmente, los componentes básicos de una molécula de ARNm incluyen al menos una región de codificación, una 5' UTR, una 3' UTR, una caperuza 5' y una cola poli-A. Sobre la base de esta estructura modular de tipo salvaje, la presente descripción amplía el alcance de la funcionalidad de las moléculas de ARNm tradicionales al proporcionar polinucleótidos o construcciones de ARN primario que mantienen una organización modular, pero que comprenden una o más modificaciones o alteraciones estructurales y/o químicas que imparten propiedades útiles al polinucleótido incluyendo, en algunos casos, la falta de una inducción sustancial de la respuesta inmunitaria innata de una célula donde se introduce el polinucleótido. Como tales, las moléculas de ARNm modificadas de la presente descripción, que pueden ser sintéticas, se denominan "ARNm". Tal como se usa en esta invención, una característica o modificación "estructural" es aquella donde dos o más nucleótidos enlazados se insertan, eliminan, duplican, invierten o aleatorizan en un polinucleótido sintético, construcción primaria o ARNmm sin modificación química significativa de los propios nucleótidos. Debido a que los enlaces químicos necesariamente se romperán y reformarán para efectuar una modificación estructural, las modificaciones estructurales son de naturaleza química y, por lo tanto, son modificaciones químicas. Sin embargo, las modificaciones estructurales darán como resultado una secuencia diferente de nucleótidos. Por ejemplo, el polinucleótido "ATCG" puede modificarse químicamente a "AT-5meC-G". El mismo polinucleótido se puede modificar estructuralmente de "ATCG" a "ATCCCG". Aquí, se ha insertado el dinucleótido "CC", dando como resultado una modificación estructural del polinucleótido.
Se proporcionan ácidos nucleicos modificados que contienen una región traducible y una, dos o más de dos modificaciones de nucleósidos diferentes. En algunos casos, el ácido nucleico modificado muestra una degradación reducida en una célula donde se introduce el ácido nucleico, en relación con un ácido nucleico no modificado correspondiente.
En algunos casos, las modificaciones químicas pueden ubicarse en la porción de azúcar del nucleótido.
En algunos casos, las modificaciones químicas pueden ubicarse en el esqueleto de fosfato del nucleótido.
En ciertos casos, es deseable degradar intracelularmente un ácido nucleico modificado introducido en la célula, por ejemplo, si se desea un tiempo preciso de la producción de proteínas. Por tanto, en algunos casos, la divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico modificada que contiene un dominio de degradación, sobre el que se puede actuar de manera dirigida dentro de una célula.
Polinucleótido, construcción primaria o arquitectura de ARNmm
Los polinucleótidos sintéticos modificados o de la presente divulgación se distinguen del ARNm de tipo natural en sus características de diseño funcional y/o estructural que sirven para, como se evidencia en esta invención, superar los problemas existentes de producción efectiva de polipéptidos usando agentes terapéuticos basados en ácidos nucleicos.
La Figura 1 muestra una construcción primaria de polinucleótidos representativa 100 de la presente divulgación. Tal como se usa en esta invención, el término "construcción primaria" o "construcción de ARNm primario" se refiere a una transcripción de polinucleótidos que codifica uno o más polipéptidos de interés y que retiene suficientes características estructurales y/o químicas para permitir la traducción del polipéptido de interés codificado en el mismo. Las construcciones primarias pueden ser polinucleótidos de la divulgación. Cuando se modifica estructural o químicamente, la construcción primaria puede denominarse polinucleótidos sintéticos modificados o ARNmm.
Volviendo a la FIG. 1, la construcción primaria 100 en esta invención contiene una primera región de nucleótidos enlazados 102 que está flanqueada por una primera región flanqueante 104 y una segunda región flanqueante 106. Tal como se usa en esta invención, la "primera región" puede denominarse "región de codificación" o "región que codifica" o simplemente la "primera región". Esta primera región puede incluir, pero no se limita, al polipéptido codificado de interés. El polipéptido de interés puede comprender en su extremo 5' una o más secuencias de péptidos de señal codificadas por una región de secuencia de péptido de señal 103. La primera región flanqueante 104 puede comprender una región de nucleótidos enlazados que comprenden una o más secuencias 5' UTR completas o incompletas. La región flanqueante 104 puede también comprender una caperuza de extremo 5' 108. La segunda región flanqueante 106 puede comprender una región de nucleótidos enlazados que comprenden una o más UTR 3' completas o incompletas. La región flanqueante 106 también puede comprender una secuencia de descolado 3' 110 y una 3'UTR 120.
Uniendo el extremo 5' de la primera región 102 y la primera región flanqueante 104 hay una primera región operativa 105. Tradicionalmente, esta región operativa comprende un codón de inicio. La región operativa puede comprender alternativamente cualquier secuencia o señal de inicio de traducción que incluya un codón de inicio.
Uniendo el extremo 3' de la primera región 102 y la segunda región flanqueante 106 es una segunda región operativa 107. Tradicionalmente, esta región operativa comprende un codón de parada. La región operativa puede comprender alternativamente cualquier secuencia o señal de inicio de traducción que incluya un codón de parada. Según la presente divulgación, también se pueden usar múltiples codones de parada en serie. En un caso, la región de operación de la presente descripción puede comprender dos codones de parada. El primer codón de parada puede ser "TGA" y el segundo codón de parada puede seleccionarse de entre el grupo que consiste en "TAA", "TGA» y "TAG". La región de operación puede comprender además tres codones de parada. El tercer codón de parada puede seleccionarse de entre el grupo que consiste en "TAA", "TGA" y "TAG".
Volviendo a la Figura 2, la 3'UTR 120 de la segunda región flanqueante 106 puede comprender una o más secuencias sensoras 130. Estas secuencias sensoras, como se discute en esta invención, operan como pseudo-receptores (o sitios de unión) para ligandos del microambiente local de la construcción circular. Por ejemplo, los sitios de unión de microARN o semillas de miARN pueden usarse como sensores de modo que funcionen como pseudorreceptores para cualquier microARN presente en el entorno del polinucleótido circular.
Generalmente, la longitud más corta de la primera región de la construcción primaria de la presente descripción puede ser la longitud de una secuencia de ácido nucleico que sea suficiente para codificar un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido, un pentapéptido, un hexapéptido, un heptapéptido, un octapéptido, un nonapéptido o un decapéptido. En otra realización, la longitud puede ser suficiente para codificar un péptido de 2 a 30 aminoácidos, por ejemplo, 5 a 30, 10 a 30, 2 a 25, 5 a 25, 10 a 25 o 10 a 20 aminoácidos. La longitud puede ser suficiente para codificar un péptido de al menos 11, 12, 13, 14, 15, 17, 20, 25 o 30 aminoácidos, o un péptido que no tenga más de 40 aminoácidos, por ejemplo, no más de 35,30, 25, 20, 17, 15, 14, 13, 12, 11 o 10 aminoácidos. Ejemplos de dipéptidos que las secuencias de polinucleótidos pueden codificar o incluyen, pero no se limitan a, carnosina y anserina.
Generalmente, la longitud de la primera región que codifica el polipéptido de interés de la presente descripción es mayor que aproximadamente 30 nucleótidos de longitud (p. ej., al menos o mayor que aproximadamente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.500 y 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000 o hasta e incluyendo 100.000 nucleótidos). Tal como se usa en esta invención, la "primera región" puede denominarse "región de codificación" o "región que codifica" o simplemente la "primera región".
En algunos casos, el polinucleótido, la construcción primaria o el ARNmm incluye de aproximadamente 30 a aproximadamente 100.000 nucleótidos (p. ej., de 30 a 50, de 30 a 100, de 30 a 250, de 30 a 500, de 30 a 1.000, de 30 a 1.500, de 30 a 3.000, de 30 a 5.000, de 30 a 7.000, de 30 a 10.000, de 30 a 25.000, de 30 a 50.000, de 30 a 70.000, de 100 a 250, de 100 a 500, de 100 a 1.000, de 100 a 1.500, de 100 a 3.000, de 100 a 5.000, de 100 a 7.000, de 100 a 10.000, de 100 a 25.000, de 100 a 50.000, de 100 a 70.000, de 100 a 100.000, de 500 a 1.000, de 500 a 1.500, de 500 a 2.000, de 500 a 3.000, de 500 a 5.000, de 500 a 7.000, de 500 a 10.000, de 500 a 25.000, de 500 a 50.000, de 500 a 70.000, de 500 a 100.000, de 1.000 a 1.500, de 1.000 a 2.000, de 1.000 a 3.000, de 1.000 a 5.000, de 1.000 a 7.000, de 1.000 a 10.000, de 1.000 a 25.000, de 1.000 a 50.000, de 1.000 a 70.000, de 1.000 a 100.000, de 1.500 a 3.000, de 1.500 a 5.000, de 1.500 a 7.000, de 1.500 a 10.000, de 1.500 a 25.000, de 1.500 a 50.000, de 1.500 a 70.000, de 1.500 a 100.000, de 2.000 a 3.000, de 2.000 a 5.000, de 2.000 a 7.000, de 2.000 a 10.000, de 2.000 a 25.000, de 2.000 a 50.000, de 2.000 a 70.000, y de 2.000 a 100.000).
Según la presente divulgación, la primera y segunda regiones flanqueantes pueden variar independientemente de 15 a 1.000 nucleótidos de longitud (por ejemplo, más de 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800 y 900 nucleótidos o al menos 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 y 1000 nucleótidos).
Según la presente divulgación, la secuencia de descolado puede variar desde ausente hasta 500 nucleótidos de longitud (por ejemplo, al menos 60, 70, 80, 90, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 nucleótidos). Cuando la secuencia de descolado es una cola poliA, la longitud puede determinarse en conjuntos de o en función de la unión de la proteína de unión de poliA. En este caso, la cola de poliA es lo suficientemente larga para unir al menos 4 monómeros de proteína de unión de poliA. Los monómeros de la proteína de unión a poliA se unen a tramos de aproximadamente 38 nucleótidos. Como tal, se ha observado que las colas de poliA de aproximadamente 80 nucleótidos y 160 nucleótidos son funcionales.
Según la presente divulgación, la región de protección de extremo puede comprender una sola caperuza o una serie de nucleótidos que forman la caperuza. En esta realización la región de protección puede tener una longitud de 1 a 10, por ejemplo, 2--9, 3--8, 4--7, 1-5, 5-10, o al menos 2, o 10 o menos nucleótidos de longitud. En algunos casos, la caperuza puede estar ausente.
Según la presente divulgación, la primera y segunda regiones operativas pueden variar de 3 a 40, por ejemplo, 5-30, 10-20, 15, o al menos 4, o 30 o menos nucleótidos de longitud y pueden comprender, además de un codón de inicio y/o parada, una o más señales y/o secuencias de restricción.
Polinucleótidos cíclicos
Según la presente descripción, un ácido nucleico, un ARN modificado o una construcción primaria pueden ciclarse o concatemerizarse para generar una molécula competente en la traducción para ayudar a las interacciones entre las proteínas de unión a poli-A y las proteínas de unión al extremo 5'. El mecanismo de ciclación o concatemerización puede producirse a través de al menos 3 rutas diferentes: 1) química, 2) enzimática y 3) catalizada por ribozimas. El enlace 5'-/3' recién formado puede ser intramolecular o intermolecular.
En la primera ruta, el extremo 5' y el extremo 3' del ácido nucleico contienen grupos químicamente reactivos que, cuando están juntos, forman un nuevo enlace covalente entre el extremo 5' y el extremo 3' de la molécula. El extremo 5' puede contener un grupo reactivo éster NHS y el extremo 3' puede contener un nucleótido terminado en 3' amino de manera que en un disolvente orgánico el nucleótido terminado en 3' amino en el extremo 3' de una molécula de ARNm sintético sufrirá un ataque nucleofílico en el resto del éster 5'-NHS formando un nuevo enlace 5'-/3'-amida.
En la segunda ruta, la ARN ligasa T4 puede usarse para enlazar enzimáticamente una molécula de ácido nucleico fosforilado en 5' al grupo hidroxilo 3' de un ácido nucleico formando un nuevo enlace fosforodiéster. En una reacción de ejemplo, se incuba 1 |jg de una molécula de ácido nucleico a 37 °C durante 1 hora con 1--10 conjuntos de ARN ligasa T4 (New England Biolabs, Ipswich, MA) según el protocolo del fabricante. La reacción de ligación puede producirse en presencia de un oligonucleótido dividido capaz de parearse con las regiones 5' y 3' en yuxtaposición para ayudar a la reacción de ligación enzimática.
En la tercera ruta, el extremo 5' o 3' de la plantilla de ADNc codifica una secuencia de ribozima ligasa de modo que durante la transcripción in vitro, la molécula de ácido nucleico resultante puede contener una secuencia de ribozima activa capaz de ligar el extremo 5' de una molécula de ácido nucleico al extremo 3' de una molécula de ácido nucleico. La ribozima ligasa puede derivarse del intrón del grupo I, virus de la hepatitis delta, ribozima de horquilla o puede seleccionarse mediante SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial). La reacción de la ribozima ligasa puede tardar de 1 a 24 horas a temperaturas entre 0 y 37 °C.
Multímeros de polinucleótidos
Según la presente divulgación, se pueden unir entre sí múltiples polinucleótidos sintéticos distintos a través del extremo 3' usando nucleótidos que se modifican en el extremo 3'. Puede usarse conjugación química para controlar la estequiometría de la administración a las células. Por ejemplo, las enzimas del ciclo del glioxilato, isocitrato liasa y malato sintasa, se pueden suministrar a las células HepG2 a una relación 1:1 para alterar el metabolismo celular de los ácidos grasos. Esta relación puede controlarse mediante la unión química de ácidos nucleicos o ARN modificado usando un nucleótido terminado en 3'-azido en un ácido nucleico o especie de ARN modificado y un nucleótido que contiene C5-etinilo o alquinilo en los ácidos nucleicos opuestos o especies de ARN modificado. El nucleótido modificado se añade postranscripcionalmente usando transferasa terminal (New England Biolabs, Ipswich, MA) según el protocolo del fabricante. Después de la adición del nucleótido modificado en 3', las dos especies de polinucleótidos pueden combinarse en una solución acuosa, en presencia o ausencia de cobre, para formar un nuevo enlace covalente a través de un mecanismo de química clic como se describe en la bibliografía.
En otro ejemplo, más de dos polinucleótidos pueden unirse entre sí usando una molécula enlazadora funcionalizada. Por ejemplo, una molécula de sacárido funcionalizada puede modificarse químicamente para contener múltiples grupos reactivos químicos (SH-, NH2-, N3 , etc.) para reaccionar con el resto afín en una molécula de ARNm funcionalizada en 3' (es decir, un éster 3'-maleimida, éster 3'-NHS, alquinilo). El número de grupos reactivos en el sacárido modificado se puede controlar de una manera estequiométrica para controlar directamente la relación estequiométrica del ácido nucléico conjugado o ARNm.
Conjugados y combinaciones de ARN modificado
Con el fin de mejorar aún más la producción de proteínas, los ácidos nucleicos, el ARN modificado, los polinucleótidos o las construcciones primarias de la presente descripción pueden diseñarse para conjugarse con otros polinucleótidos, colorantes, agentes intercalantes (p.ej. acridinas), reticuladores (p.ej. psoraleno, mitomicina C ), porfirinas (TPPC4, texafirina, Safirina), hidrocarburos aromáticos policíclicos (p. ej., fenazina, dihidrofenazina), endonucleasas artificiales (p. ej., EDTA), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (p. ej., PEG-40K), MPEG, [ MPEG]2 , poliamino, alquilo, alquilo sustituido, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (por ejemplo, biotina), facilitadores de transporte/absorción (por ejemplo, aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleasas sintéticas, proteínas, por ejemplo, glicoproteínas o péptidos, por ejemplo, moléculas que tienen una afinidad específica por un co-ligando, o anticuerpos, por ejemplo, un anticuerpo, que se une a un tipo celular específico, como una célula cancerosa, una célula endotelial o una célula ósea, hormonas y receptores de hormonas, especies no peptídicas, tal como lípidos, lectinas, carbohidratos, vitaminas, cofactores o un fármaco.
La conjugación puede resultar en una mayor estabilidad y/o semivida y puede ser particularmente útil para dirigir los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm a sitios específicos en la célula, tejido u organismo.
El ARNmm o las construcciones primarias en esta invención se pueden administrar con, o codificar además, uno o más agentes de ARNi, siRNA, ARNsh, ARNmi, sitios de unión de ARNmi, ARN antisentido, ribozimas, ADN catalítico, ARNt, ARN que inducen la formación de triple hélice, aptámeros o vectores y similares.
Polinucleótidos bifuncionales
En esta invención se describen polinucleótidos bifuncionales (por ejemplo, ácidos nucleicos bifuncionales, ARN modificado bifuncional o construcciones primarias bifuncionales). Como su nombre lo indica, los polinucleótidos bifuncionales son aquellos que tienen o son capaces de al menos dos funciones. Estas moléculas también pueden denominarse por convención multifuncionales.
Las múltiples funcionalidades de los polinucleótidos bifuncionales pueden estar codificadas por el ARN (la función puede no manifestarse hasta que se traduzca el producto codificado) o puede ser una propiedad del propio polinucleótido. Puede ser estructural o química. Los polinucleótidos modificados bifuncionales pueden comprender una función que está asociada covalente o electrostáticamente con los polinucleótidos. Además, las dos funciones pueden proporcionarse en el contexto de un complejo de un ARN modificado y otra molécula.
Los polinucleótidos bifuncionales pueden codificar péptidos que son antiproliferativos. Estos péptidos pueden ser lineales, cíclicos, restringidos o aleatorios. Pueden funcionar como aptámeros, moléculas de señalización, ligandos o imitadores o miméticos de los mismos. Los péptidos antiproliferativos pueden, traducidos, tener una longitud de 3 a 50 aminoácidos. Pueden tener 5-40, 10-30 o aproximadamente 15 aminoácidos de longitud. Pueden ser de cadena única, de cadenas múltiples o ramificadas y pueden formar complejos, agregados o cualquier estructura de conjuntos múltiples una vez traducidos.
Polinucleótidos no codificantes
Tal como se describe en esta invención, se proporcionan ácidos nucleicos, ARN modificado, polinucleótidos y construcciones primarias que tienen secuencias que son parcial o sustancialmente no traducibles, por ejemplo, que tienen una región no codificante. Estas moléculas generalmente no se traducen, pero pueden ejercer un efecto sobre la producción de proteínas mediante uno o más de la unión y el secuestro de uno o más componentes de la maquinaria de traducción, como una proteína ribosómica o un ARN de transferencia (ARNt), reduciendo así de manera efectiva la expresión de proteínas en la célula o modular una o más vías o cascadas en una célula que a su vez altera los niveles de proteína. El polinucleótido o construcción primaria puede contener o codificar uno o más ARN no codificantes largos (lncARN o lincARN) o una parte del mismo, un ARN nucleolar pequeño (sno-ARN), micro ARN (ARNmi), ARN de interferencia pequeño (siRNA) o ARN que interactúa con Piwi (ARNpi).
Polipéptidos de interés
Según la presente divulgación, el polinucleótido sintético está diseñado para codificar uno o más polipéptidos de interés o fragmentos de los mismos. Un polipéptido de interés puede incluir, entre otros, polipéptidos completos, una pluralidad de polipéptidos o fragmentos de polipéptidos, que independientemente pueden estar codificados por uno o más ácidos nucleicos, una pluralidad de ácidos nucleicos, fragmentos de ácidos nucleicos o variantes de cualquiera de los antes mencionados. Tal como se usa en esta invención, el término "polipéptidos de interés" se refiere a cualquier polipéptido que se selecciona para ser codificado en la construcción primaria de la presente divulgación. Tal como se usa en esta invención, "polipéptido" significa un polímero de residuos de aminoácidos (naturales o no naturales) unidos entre sí con mayor frecuencia mediante enlaces peptídicos. El término, como se usa en esta invención, se refiere a proteínas, polipéptidos y péptidos de cualquier tamaño, estructura o función. En algunos aspectos, el polipéptido codificado tiene menos de aproximadamente 50 aminoácidos y, a continuación, se denomina un péptido. Si el polipéptido es un péptido, tendrá una longitud de al menos aproximadamente 2, 3, 4 o al menos 5 residuos de aminoácidos. Por lo tanto, los polipéptidos incluyen productos génicos, polipéptidos de origen natural, polipéptidos sintéticos, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos y otros equivalentes, variantes y análogos de los que anteceden. Un polipéptido puede ser una única molécula o puede ser un complejo de múltiples moléculas, tal como un dímero, trímero o tetrámero. Estos también pueden comprender polipéptidos de cadena simple o de cadena múltiple, tales como anticuerpos o insulina, y pueden estar asociados o unidos. Los enlaces disulfuro más comunes se encuentran en los polipéptidos de cadena múltiple. El término polipéptido también puede aplicarse a polímeros de aminoácidos, en los cuales uno o más residuos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural.
La expresión "variante de polipéptido" se refiere a moléculas que difieren en su secuencia de aminoácidos de una secuencia de referencia o natural. Las variantes de la secuencia de aminoácidos pueden poseer sustituciones, deleciones e/o inserciones en determinadas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos, en comparación con una secuencia nativa o de referencia. Normalmente, las variantes tendrán al menos aproximadamente 50 % de identidad (homología) con una secuencia de referencia o natural y, preferentemente, serán idénticas (homólogas) en al menos aproximadamente 80 %, más preferentemente al menos aproximadamente 90 % a una secuencia de referencia o natural.
En algunas realizaciones, se proporcionan “miméticos de variantes”. Tal como se usa en esta invención, la expresión "mimético de variante" es uno que contiene uno o más aminoácidos que imitarían una secuencia activada. Por ejemplo, el glutamato puede servir como un imitador de fosforo-treonina y/o fosforo-serina. De manera alternativa, los miméticos o imitadores de variantes pueden producir la desactivación o un producto inactivado que contiene el imitador, por ejemplo, la fenilalanina puede actuar como una sustitución inactivante de la tirosina, o la alanina puede actuar como una sustitución inactivante para serina.
"Homología", tal como se aplica a las secuencias de aminoácidos, se define como el porcentaje de residuos en la secuencia de aminoácidos candidata que sean idénticos a los residuos en la secuencia de aminoácidos de una segunda secuencia a continuación de alinear las secuencias e introducir huecos, de ser necesario, para lograr el mayor porcentaje de homología. Procedimientos y programas informáticos para la alineación son bien conocidos en la técnica. Se entiende que la homología depende de un cálculo del porcentaje de identidad, pero puede diferir en valor debido a los huecos y las penalizaciones introducidas en el cálculo.
Por "homólogos", tal como se aplica a secuencias de polipéptidos, se entiende la secuencia correspondiente de otra especie que tiene una identidad sustancial con una segunda secuencia de una segunda especie.
Se pretende que "análogos" incluya variantes polipeptídicas que difieran en una o más alteraciones de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones, adiciones o deleciones de residuos aminoácidos que aún conservan una o más de las propiedades del polipéptido original o inicial.
La presente divulgación contempla varios tipos de composiciones que están basados en polipéptidos, inclusive variantes y derivados. Estos incluyen variantes y derivados de sustitución, inserción, deleción y covalentes. El término "derivado" se usa como sinónimo del término "variante", pero generalmente se refiere a una molécula que ha sido modificada y/o cambiada de cualquier manera en comparación con una molécula de referencia o molécula inicial.
Como tales, se describen polinucleótidos que codifican polipéptidos de interés que contienen sustituciones, inserciones y/o adiciones, deleciones y modificaciones covalentes con respecto a las secuencias de referencia. Por ejemplo, los marcadores de secuencia o aminoácidos, tales como una o más lisinas, pueden agregarse a las secuencias de péptidos de la descripción (por ejemplo, en los extremos N o C). Pueden usarse marcadores de secuencia para la purificación o localización de péptidos. Pueden usarse lisinas para aumentar la solubilidad de péptidos o para permitir la biotinilación. De manera alternativa, los residuos de aminoácidos ubicados en las regiones de los extremos amino y carboxi de la secuencia de aminoácidos de un péptido o proteína pueden eliminarse de manera opcional para proporcionar secuencias truncadas. Determinados aminoácidos (por ejemplo, residuos del extremo C o extremo N) pueden eliminarse de manera alternativa, dependiendo del uso de la secuencia, como, por ejemplo, expresión de la secuencia como parte de una secuencia mayor que sea soluble, o que esté unida a un soporte sólido.
"Variantes de sustitución", cuando se refieren a polipéptidos, son las que han eliminado al menos un residuo de aminoácidos en una secuencia natural o inicial y un aminoácido diferente insertado en su lugar en la misma posición.
Las sustituciones pueden ser simples, donde solo se sustituyó una molécula de aminoácido, o pueden ser múltiples, cuando se sustituyeron dos o más aminoácidos en la misma molécula.
Tal como se usa en esta invención, la expresión “sustitución de aminoácido conservadora” se refiere a la sustitución de un aminoácido que está presente normalmente en la secuencia con un aminoácido diferente de tamaño, carga o polaridad similar. Ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo no polar (hidrofóbico), tal como isoleucina, valina y leucina, por otro residuo no polar. De manera similar, ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo polar (hidrofílico) por otro, tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, y entre glicina y serina. De manera adicional, la sustitución de un residuo básico, tal como lisina, arginina o histidina, por otro, o la sustitución de un residuo ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro residuo ácido, son ejemplos adicionales de sustituciones conservadoras. Ejemplos de sustituciones no conservadoras incluyen la sustitución de un residuo de aminoácido no polar (hidrofóbico), tal como isoleucina, valina, leucina, alanina, metionina, por un residuo polar (hidrofílico), tal como, cisteína, glutamina, ácido glutámico o lisina, y/o un residuo polar por un residuo no polar.
"Variantes de inserción", cuando se refiere a polipéptidos, son las que tienen uno o más aminoácidos insertados de manera inmediatamente adyacente a un aminoácido en una posición particular en una secuencia natural o inicial. "Inmediatamente adyacente" a un aminoácido significa conectado al grupo funcional alfa-carboxi o alfa-amino del aminoácido.
"Variantes de deleción", cuando se refiere a polipéptidos, son las que tienen uno o más aminoácidos eliminados en la secuencia de aminoácidos natural o inicial. De manera común, las variantes de deleción tendrán uno o más aminoácidos eliminados en una región particular de la molécula.
"Derivados covalentes", cuando se refiere a polipéptidos, incluyen modificaciones de una proteína natural o inicial con un agente de derivación proteináceo o no proteináceo orgánico, y/o modificaciones postraduccionales. Las modificaciones covalentes se introducen tradicionalmente mediante la reacción de residuos de aminoácidos dirigidos de la proteína con un agente de derivación orgánico que es capaz de reaccionar con residuos extremos o cadenas laterales seleccionadas, o mediante mecanismos de aprovechamiento de modificaciones postraduccionales que funcionan en células hospedadoras recombinantes seleccionadas. Los derivados covalentes resultantes son útiles en programas dirigidos a identificar residuos importantes para verificar la actividad biológica, para inmunoensayos, o para la preparación de anticuerpos contra proteínas para la purificación por inmunoafinidad de la glicoproteína recombinante. Dichas modificaciones se encuentran dentro del conocimiento de la técnica y se llevan a cabo sin experimentación innecesaria.
Determinadas modificaciones postraduccionales son el resultado de la acción células hospedadoras recombinantes sobre el polipéptido expresado. Los residuos de glutaminilo y asparaginilo a menudo se desamidan de forma postraduccional y se convierten en los residuos aspartilo y glutamilo correspondientes. Alternativamente, estos residuos se desamidan en condiciones moderadamente ácidas. Cualquier forma de estos residuos puede estar presente en los polipéptidos producidos según la presente descripción.
Otras modificaciones postraduccionales incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo y treonilo, metilación de los grupos alfa-amino de cadenas laterales de histidina, lisina y arginina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79--86 (1983)).
Las "características", cuando se hace referencia a polipéptidos, son definidas como componentes distintos basados en secuencias de aminoácidos de una molécula. Las características de los polipéptidos codificados por el ARNmm de la presente descripción incluyen manifestaciones en la superficie, forma conformacional local, pliegues, bucles, semibucles, dominios, semidominios, sitios, extremos o cualquier combinación de los mismos.
Tal como se usa en esta invención al hacer referencia a polipéptidos, la expresión "manifestación en la superficie" se refiere a un componente basado en polipéptidos de una proteína que aparece en la última superficie externa.
Tal como se usa en esta invención al hacer referencia a polipéptidos, la expresión "forma conformacional local" significa una manifestación estructural basada en polipéptidos de una proteína que está ubicada dentro de un espacio definible de la proteína.
Tal como se usa en esta invención al hacer referencia a polipéptidos, el término "pliegue" se refiere a la conformación resultante de una secuencia de aminoácidos al minimizar la energía. Puede producirse un pliegue en el nivel secundario o terciario del procedimiento de plegado. Ejemplos de pliegues secundarios incluyen láminas beta y hélices alfa. Ejemplos de pliegues terciarios incluyen dominios y regiones formadas debido a la agregación o separación de fuerzas energéticas. Regiones formadas de este modo incluyen cavidades hidrofóbicas e hidrofílicas, y similares.
Tal como se usa en esta invención, el término "giro" en relación con la conformación de una proteína significa una rotación que altera la dirección de la estructura principal de un péptido o polipéptido y puede implicar uno, dos, tres o más residuos de aminoácidos.
Tal como se usa en esta invención en referencia a polipéptidos, el término "bucle" se refiere a una característica estructural de un polipéptido que puede servir para revertir la dirección de la estructura principal de un péptido o polipéptido. Cuando el bucle se encuentra en un polipéptido y solo altera la dirección de la estructura principal, puede comprender cuatro o más residuos de aminoácidos. Oliva y col. identificaron al menos 5 clases de bucles de proteínas (J. Mol Biol 266 (4): 814-830; 1997). Los bucles pueden ser abiertos o cerrados. Los bucles cerrados o "cíclicos" pueden comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos entre los restos de puenteo. Dichos restos de puenteo pueden comprender un puente cisteína-cisteína (Cys-Cys) típico en polipéptidos que tienen puentes disulfuro o, de manera alternativa, los restos de puenteo pueden no estar basados en proteínas, tal como el agente dibromocililo, tal como se usan en esta invención.
Tal como se usa en esta invención al hacer referencia a polipéptidos, el término "semibucle" se refiere a una parte de un bucle identificado que tiene al menos la mitad de la cantidad de aminoácidos que forman el bucle del cual se derivan. Se entiende que los bucles no siempre contienen una cantidad par de residuos de aminoácidos. Por lo tanto, en aquellos casos en los que un bucle contiene o se identifica que comprende un número impar de aminoácidos, un semibucle del bucle impar comprenderá la porción de número entero o la siguiente porción de número entero del bucle (número de aminoácidos del bucle/2+/- 0,5 aminoácidos). Por ejemplo, un bucle identificado como un bucle de 7 aminoácidos puede producir semibucles de 3 aminoácidos o de 4 aminoácidos (7/2=3,5+/-0,5 puede ser 3 o 4).
Tal como se usa en esta invención al hacer referencia a polipéptidos, el término "dominio" se refiere a un motivo de un polipéptido que tenga una o más características o propiedades funcionales o estructurales identificables (por ejemplo, capacidad de unión, servir como sitio para interacciones entre proteínas).
Tal como se usa en esta invención al hacer referencia a polipéptidos, el término "semidominio" se refiere a una parte de un dominio identificado que tiene al menos la mitad de la cantidad de aminoácidos que forman el dominio del cual se derivan. Se entiende que los dominios no siempre contienen una cantidad par de residuos de aminoácidos. Por lo tanto, en los casos donde un dominio contiene o se identifica que comprende una cantidad impar de aminoácidos, un semidominio de un dominio con una cantidad impar de aminoácidos comprenderá la porción de número entero, o la porción del próximo número entero del dominio (cantidad de aminoácidos en el dominio/2+/-0,5 aminoácidos). Por ejemplo, un dominio identificado como un dominio de 7 aminoácidos puede producir semidominios de 3 aminoácidos o de 4 aminoácidos (7/2=3,5+/-0,5 puede ser 3 o 4). También se entenderá que pueden identificarse subdominios dentro de dominios o semidominios, estos subdominios poseen menos que la totalidad de propiedades funcionales o estructurales identificadas en los dominios o semidominios de los cuales se derivan. También se entenderá que los aminoácidos que comprenden cualquier tipo de dominio en esta invención no necesitan ser contiguos a lo largo de la estructura principal del polipéptido (es decir, los aminoácidos no adyacentes pueden plegarse estructuralmente para producir un dominio, semidominio o subdominio).
Tal como se usa en esta invención en referencia a polipéptidos, el término “sitio”, en lo referente a realizaciones basadas en aminoácidos, se usa como sinónimo de “residuo de aminoácidos” y “cadena lateral de aminoácidos”. Un sitio representa una posición dentro de un péptido o polipéptido que puede modificarse, manipularse, alterarse, derivarse o variarse dentro de las moléculas basadas en polipéptidos de la presente descripción.
Tal como se usa en esta invención los términos "extremos" o "extremo", en referencia a polipéptidos, se refieren a una extremidad de un péptido o polipéptido. Dicha extremidad no se limita únicamente al sitio inicial o final del péptido o polipéptido, sino que puede incluir aminoácidos adicionales en las regiones de los extremos. Las moléculas basadas en polipéptidos de la presente descripción pueden caracterizarse como moléculas que tienen tanto un extremo N (terminado en un aminoácido con un grupo amino libre (NH2)) como un extremo C (terminado en un aminoácido con un grupo carboxilo libre (COOH)). En algunos casos, las proteínas de la descripción están compuestas de cadenas de polipéptidos que están unidas mediante enlaces disulfuro o mediante fuerzas no covalentes (multímeros, oligómeros). Estos tipos de proteínas tendrán múltiples extremos N y C. De manera alternativa, los extremos de los polipéptidos pueden modificarse de manera que comiencen o terminen, según sea el caso, con un resto no basado en polipéptidos, tal como un conjugado orgánico.
Una vez que cualquiera de estas características ha sido identificada o definida como componente deseado de un polipéptido a ser codificado por la construcción primaria del ARNmm de la descripción, puede llevarse a cabo cualquiera de varias manipulaciones y/o modificaciones de estas características mediante movimiento, intercambio, inversión, deleción, aleatorización o duplicación. Además, se entenderá que la manipulación de características puede producir el mismo resultado que una modificación de las moléculas de la descripción. Por ejemplo, una manipulación que implica la deleción de un dominio daría como resultado la alteración de la longitud de una molécula solamente como la modificación de un aminoácido para codificar menos de lo que lo haría una molécula de longitud completa.
Las modificaciones y manipulaciones pueden lograrse mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como, de modo no taxativo, mutagénesis dirigida a sitio. Las moléculas modificadas resultantes pueden a continuación evaluarse para verificar su actividad mediante el uso de ensayos in vitro o in vivo, tales como los descritos en esta invención o cualquier otro ensayo de selección adecuado conocido en la técnica.
Según la presente descripción, los polipéptidos pueden comprender una secuencia de consenso que se descubre a través de ciclos de experimentación. Tal como se usa en esta invención, una secuencia "de consenso" es una secuencia individual que representa una población colectiva de secuencias que permite la variabilidad en uno o más sitios.
Como reconocerán los expertos en la técnica, se describen fragmentos de proteína, dominios de proteína funcional y proteínas homólogas. Por ejemplo, se proporciona en esta invención cualquier fragmento de proteína (que significa una secuencia de polipéptidos que en su longitud tiene un residuo de aminoácidos menos que una secuencia de polipéptidos de referencia, pero idéntica en los demás aspectos) de una proteína de referencia con una longitud de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o mayor que 100 aminoácidos. En otro ejemplo, puede utilizarse según la descripción cualquier proteína que incluya una extensión de 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, o aproximadamente 100 aminoácidos que sea 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 100 % idéntica a las secuencias descritas en esta invención. En algunas realizaciones, un polipéptido incluye 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más mutaciones, según se muestra en cualquiera de las secuencias que se proporcionan o a las que se hace referencia en esta invención.
Polipéptidos codificados de interés
Las construcciones primarias, los ácidos nucleicos modificados o el ARNmm de la presente descripción pueden diseñarse para codificar polipéptidos de interés, como péptidos y proteínas.
En un caso, las construcciones primarias, los ácidos nucleicos modificados o el ARNmm de la presente descripción pueden codificar polipéptidos variantes que tienen una cierta identidad con una secuencia polipeptídica de referencia. Tal como se usa en esta invención, una "secuencia polipeptídica de referencia" se refiere a una secuencia polipeptídica de partida. Las secuencias de referencia pueden ser secuencias de tipo natural o cualquier secuencia a la que se haga referencia en el diseño de otra secuencia. Una "secuencia polipeptídica de referencia" puede ser, por ejemplo, cualquiera de las secuencias de proteínas enumeradas en la Solicitud de Patente de EE. UU. N° 61/618.953, depositada el 2 de abril de 2012, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease, Solicitud de Patente de EE. UU. N° 61/681.704, depositada el 10 de agosto de 2012, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease, Solicitud de Patente de EE. UU. N° 61/737.203, depositada el 14 de diciembre de 2012, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease, Solicitud Internacional N° PCT/US2013/030062, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Biologics and Proteins Associated with Human Disease; Solicitud Internacional N° PCT/US2013/030063, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucloetides; Solicitud Internacional N°. PCT/US2013/030064, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins; Solicitud Internacional N° PCT/US2013/030059, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Membrane Proteins; Solicitud Internacional N°. PCT/US2013/030066, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins; Solicitud Internacional N°. PCT/US2013/030067, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins; Solicitud Internacional N°. PCT/US2013/030060, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins; Solicitud Internacional N°. PCT/US2013/030061, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; Solicitud Internacional N°. PCT/US2013/030068, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Cosmetic Proteins and Peptides; Solicitud Internacional N°. PCT/US2013/030070, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Oncology-Related Proteins and Peptides; y Solicitud Internacional N°. PCT/US2013/031821, depositada el 15 de marzo de 2013, titulada In Vivo Production of Proteins.
Tal como se conoce en la técnica, el término "identidad" hace referencia a una relación entre las secuencias de dos o más polipéptidos o polinucleótidos determinada mediante la comparación de las secuencias. En la técnica, la identidad también hace referencia al grado de relación entre secuencias según se determina por la cantidad de coincidencias entre cadenas de dos o más residuos de aminoácidos. La identidad mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre la más pequeña de dos o más secuencias con alineaciones de espacios (si las hay) abordadas por un modelo matemático o programa de computadora en particular (es decir, "algoritmos"). La identidad de los péptidos relacionados se puede calcular fácilmente mediante procedimientos conocidos. . Dichos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G, Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; y Carillo y col., SIAM J. Applied Math. 48,1073 (1988).
En algunos casos, la variante de polipéptido puede tener la misma o similar actividad que el polipéptido de referencia. Alternativamente, la variante puede tener una actividad alterada (por ejemplo, aumentada o disminuida) con respecto a un polipéptido de referencia. Generalmente, las variantes de un polinucleótido o polipéptido particular de la divulgación tendrán al menos aproximadamente 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % pero menos del 100 % de identidad de secuencia con ese polinucleótido o polipéptido de referencia particular según se determina mediante programas y parámetros de alineación de secuencia descritos en esta invención y conocidos por los expertos en la técnica. Tales herramientas para la alineación incluyen las de la suite BLAST (Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller y David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and Ps I-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.) En esta invención se describen otras herramientas, específicamente en la definición de "Identidad".
Los parámetros predeterminados en el algoritmo BLAST incluyen, por ejemplo, un umbral esperado de 10, tamaño de palabra de 28, Puntuaciones Match/Mismatch 1, -2, Costos de Gap lineales. Se puede aplicar cualquier filtro, así como una selección de repeticiones específicas de especies, por ejemplo, Homo sapiens.
En un caso, los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos y/o el ARNm modificados se puede usar para tratar una enfermedad, un trastorno y/o condición en un sujeto.
En un caso, los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos y/o el ARNm modificados puede usarse para reducir, eliminar o impedir el crecimiento tumoral en un sujeto.
En un caso, los polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARNmm se puede usar para reducir y/o mejorar al menos un síntoma de cáncer en un sujeto. Un síntoma de cáncer puede incluir, entre otros, debilidad, dolores y molestias, fiebre, fatiga, pérdida de peso, coágulos de sangre, aumento de los niveles de calcio en la sangre, recuento bajo de glóbulos blancos, dificultad para respirar, mareos, dolores de cabeza, hiperpigmentación, ictericia, ertema, prurito, crecimiento excesivo de vello, cambios en los hábitos intestinales, cambios en la función de la vejiga, llagas duraderas, manchas blancas dentro de la boca, manchas blancas en la lengua, sangrado o secreción inusual, engrosamiento o bulto en partes del cuerpo , indigestión, dificultad para tragar, cambios en verrugas o lunares, cambios en la piel nueva y tos persistente o ronquera. Además, los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos modificados y/o ARNmm puede reducir un efecto secundario asociado con el cáncer como, entre otros, quimiocerebro, neuropatía periférica, fatiga, depresión, náuseas, vómitos, dolor, anemia, linfedema, infecciones, efectos secundarios sexuales, fertilidad reducida o infertilidad, ostomía, insomnio y caída del cabello.
Modificaciones de la arquitectura del terminal: Regiones no traducidas (UTR)
Las regiones no traducidas (UTR) de un gen se transcriben pero no se traducen. La UTR 5' comienza en el sitio de inicio de la transcripción y continúa hasta el codón de inicio, pero no incluye el codón de inicio; mientras que la UTR 3' comienza inmediatamente después del codón de parada y continúa hasta la señal de terminación de la transcripción. Existe un cuerpo creciente de evidencia sobre las funciones reguladoras que desempeñan las UTR en términos de estabilidad de la molécula de ácido nucleico y traducción. Las características reguladoras de una UTR se pueden incorporar en los polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARN de la presente divulgación para mejorar la estabilidad de la molécula. Las características específicas también se pueden incorporar para asegurar una regulación hacia abajo controlada de la transcripción en caso de que estén mal dirigidas a sitios de órganos no deseados. Las regiones no traducidas pueden incorporarse en un sistema de vector que puede producir ARNm y/o ser entregado a una célula, tejido y/o organismo para producir un polipéptido de interés.
5' UTR e inicio de traducción
Las UTR 5' naturales tienen características que desempeñan un papel en el inicio de la traducción. Albergan firmas como las secuencias de Kozak, que comúnmente se sabe que están involucradas en el procedimiento por el cual el ribosoma inicia la traducción de muchos genes. Las secuencias de Kozak tienen el consenso CCR(A/G)CCAUGG, donde R es una purina (adenina o guanina) tres bases corriente arriba del codón de inicio (AUG), que va seguido de otra "G". También se sabe que la UTR 5' forma estructuras secundarias que están implicadas en la unión del factor de alargamiento.
Las estructuras secundarias de 5'UTR involucradas en la unión del factor de elongación pueden interactuar con otras moléculas de unión de ARN en 5'UTR o 3'UTR para regular la expresión génica. Por ejemplo, la unión del factor de elongación EIF4A2 a un elemento estructurado secundariamente en la 5'UTR es necesaria para la represión mediada por microARN (Meijer HA y col., Science, 2013, 340, 82-85). Las diferentes estructuras secundarias en la 5'UTR se pueden incorporar en la región flanqueante para estabilizar o desestalizar selectivamente los ARNm en tejidos o células específicos.
Mediante la ingeniería de las características que se encuentran típicamente en genes abundantemente expresados de órganos diana específicos, se puede mejorar la estabilidad y la producción de proteínas de los ácidos nucleicos o ARNm de la divulgación. Por ejemplo, introducción de UTR 5' de ARNm expresado en hígado, como albúmina, amiloide A sérico, apolipoproteína A/B/E, transferrina, alfafetoproteína, eritropoyetina o factor VIII podrían usarse para mejorar la expresión de una molécula de ácido nucleico, como un ARNmm, en líneas de células hepáticas o en el hígado. Asimismo, es posible el uso de UTR 5' de otro ARNm específico de tejido para mejorar la expresión en ese tejido: para músculo (MyoD, miosina, mioglobina, miogenina, herculina), para células endoteliales (Tie-1, CD36), para células mieloides (C/EBP, AML1, G-CSF, GM-CSF, CD11b, MSR, Fr-1, i-NOS), para leucocitos (CD45, CD18), para tejido adiposo (CD36, GLUT4, ACRP30, adiponectina) y para células epiteliales pulmonares (SP-A/B/C/D).
Se pueden incorporar otras secuencias no UTR en las UTR 5' (o UTR 3'). Por ejemplo, pueden incorporarse intrones o porciones de secuencias de intrones en las regiones flanqueantes de los ácidos nucleicos o ARNm de la divulgación. La incorporación de secuencias intrónicas puede incrementar la producción de proteínas así como los niveles de ARNm.
En un caso, al menos un fragmento de secuencias IRES de un gen GTX puede incluirse en la 5'UTR. Como ejemplo no limitativo, el fragmento puede ser una secuencia de 18 nucleótidos del IRES del gen GTX. Como otro ejemplo no limitativo, un fragmento de secuencia de 18 nucleótidos de la secuencia IRES de un gen GTX puede repetirse en tándem en la 5'UTR de un polinucleótido descrito en esta invención. La secuencia de 18 nucleótidos podrá repetirse en la 5'UTR al menos una, al menos dos, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos seis veces, al menos siete veces, al menos ocho veces, al menos nueve veces o más de diez veces
En un caso, una 5'UTR puede incluir al menos cinco fragmentos de 18 nucleótidos de secuencias IRES de un gen GTX que pueden incluirse en la 5'UTR (véase, por ejemplo, el fragmento de 18 nucleótidos descrito en la Tabla 62).
Los nucleótidos pueden ser mutados, reemplazados y/o eliminado de las UTR 5' (o 3'). Por ejemplo, uno o más nucleótidos corriente arriba del codón de inicio pueden reemplazarse con otro nucleótido. El nucleótido o nucleótidos a reemplazar pueden ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 o más de 60 nucleótidos corriente arriba del codón de inicio. Como otro ejemplo, uno o más nucleótidos cadena arriba del codón de inicio pueden eliminarse de la UTR.
En un caso, al menos una purina corriente arriba del codón de inicio puede reemplazarse con una pirimidina. La purina a reemplazar pueden ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 o más de 60 nucleótidos corriente arriba del codón de inicio. Como ejemplo no limitante, una adenina que está tres nucleótidos corriente arriba del codón de inicio puede reemplazarse con una timina. Como ejemplo no limitante, una adenina que está tres nucleótidos corriente arriba del codón de inicio puede reemplazarse con una timina.
En un caso, al menos un nucleótido corriente arriba del codón de inicio puede eliminarse de la UTR. En un aspecto, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 o más de 60 nucleótidos se pueden eliminar cadena arriba del codón de inicio de la UTR de los polinucleótidos descritos en esta invención. Como ejemplo no limitativo, los nueve nucleótidos cadena arriba del codón de inicio pueden eliminarse de la UTR (véase, por ejemplo, la construcción G-CSF 9del5' descrita en la Tabla 60).
5'UTR, 3'UTR y elementos de mejora de la traducción (TEE)
En un caso, la 5'UTR de los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos modificados y/o ARNmm puede incluir al menos un polinucleótido que mejora la traducción, un elemento que mejora la traducción, elementos que mejoran la traducción (denominados colectivamente "TEE"). Como ejemplo no limitante, el TEE puede ubicarse entre el promotor de la transcripción y el codón de inicio. Los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos modificados y/o el ARNmm con al menos un TEE en la 5'UTR puede incluir una caperuza en la 5'UTR. Además, al menos un TEE puede ubicarse en la 5'UTR de polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos modificados y/o ARNmm que se somete a una traducción dependiente de caperuza o independiente de caperuza.
El término "elemento que mejora la traducción" o "elemento que mejora la traducción" (en esta invención denominados colectivamente como "TEE") se refiere a secuencias que aumentan la cantidad de polipéptido o proteína producida a partir de un ARNm.
En un aspecto, los TEE son elementos conservados en la UTR que pueden promover la actividad de traducción de un ácido nucleico tal como, entre otros, la traducción dependiente de caperuza o independiente de caperuza. La conservación de estas secuencias ha sido previamente demostrada por Panek y col (Nucleic Acids Research, 2013, 1-10) en 14 especies, incluidos los humanos.
En un caso, el TEE puede ser cualquiera de los TEE enumerados en la Tabla 32 en el Ejemplo 45, incluida porción y/o fragmentos de los mismos. La secuencia TEE puede incluir al menos 5 %, por lo menos 10 %, por lo menos 15 %, por lo menos 20 %, por lo menos 25 %, por lo menos 30 %, por lo menos 35 %, por lo menos 40 %, por lo menos 45 %, por lo menos 50 %, por lo menos 55 %, por lo menos 60 %, por lo menos 65 %, por lo menos 70 %, por lo menos 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 95 %, al menos el 99 % o más del 99 % de las secuencias TEE descritas en la Tabla 32 y/o la secuencia TEE puede incluir un fragmento de 5-30 nucleótidos, un fragmento de 5-25 nucleótidos, un fragmento de 5-20 nucleótidos, un fragmento de 5-15 nucleótidos, un fragmento de 5-10 nucleótidos de las secuencias TEE descritas en la Tabla 32.
En un ejemplo no limitativo, los TEE conocidos pueden estar en el líder 5' de la proteína del homeodominio Gtx (Chappell y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9590-9594, 2004).
En otro ejemplo no limitante, los TEE se describen como SEQ ID NO: 1-35 en la Publicación de Patente de EE. UU. N°. US20090226470, SEQ ID NOs: 1-35 en la Publicación de Patente de EE. UU. N° US20130177581, SEQ ID NOs: 1-35 en la Publicación de Patente Internacional N° WO2009075886, SEQ ID NOs: 1-5, y 7-645 en la Publicación de Patente Internacional N° WO2012009644, SEQ ID NO: 1 en la Publicación de Patente Internacional N° WO1999024595, SEQ ID NO: 1 en la Publicación de Patente de EE. UU. N° US6310197, y SEQ ID NO: 1 en la Publicación de Patente de EE. UU. N° US6849405.
En otro ejemplo no limitativo, el TEE puede ser un sitio de entrada de ribosomas internos (IRES), HCV-IRES o un elemento IRES como, entre otros, los descritos en la Patente de EE. UU. N°. US7468275, Publicación de Patente de EE. UU. N°. US20070048776 y US20110124100 y la Publicación de Patente Internacional N°. WO2007025008 y WO2001055369. Los elementos IRES pueden incluir, entre otros, las secuencias Gtx (p. ej., Gtx9-nt, Gtx8-nt, Gtx7-nt) descritas por Chappell y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 101:9590-9594, 2004) y Zhou y col. (PNAS) 102:6273-6278, 2005) y en las Publicaciones de Patentes de EE. UU. N.° US20070048776 y US20110124100 y la Publicación de Patente Internacional N.° WO2007025008.
Los "polinucleótidos que mejoran la traducción" o las "secuencias de polinucleótidos que mejoran la traducción" son polinucleótidos que incluyen uno o más de los TEE específicos ejemplificados en esta invención. y/o divulgado en la técnica (véase, por ejemplo, US6310197, US6849405, US7456273, US7183395, US20090226470, US20070048776, US20110124100, US20090093049, US20130177581, WO2009075886, WO2007025008, WO2012009644, WO2001055371 WO1999024595, y EP2610341A1 y EP2610340A1) o sus variantes, homólogos o derivados funcionales. Una o varias copias de un TEE específico pueden estar presentes en los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos modificados y/o ARNmm. Los TEE en los polinucleótidos que mejoran la traducción se pueden organizar en uno o más segmentos de secuencia. Un segmento de secuencia puede albergar uno o más de los TEE específicos ejemplificados en esta invención, estando presente cada TEE en una o más copias. Cuando están presentes múltiples segmentos de secuencia en un polinucleótido que mejora la traducción, pueden ser homogéneos o heterogéneos. Por lo tanto, los múltiples segmentos de secuencia en un polinucleótido que mejora la traducción pueden albergar tipos idénticos o diferentes de los TEE específicos ejemplificados en esta invención, un número idéntico o diferente de copias de cada uno de los TEE específicos, y/o organización idéntica o diferente de los TEE dentro de cada segmento de secuencia.
En un caso, los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos modificados y/o el ARNmm puede incluir al menos un TEE que se describe en la Publicación de Patente Internacional N°. WO1999024595, WO2012009644, WO2009075886, WO2007025008, WO1999024595, Publicación de Patente Europea N°. EP2610341A1 y EP2610340A1, Patente de EE. UU. N°. US6310197, US6849405, US7456273, US7183395, Publicación de Patente de EE. UU. N°. US20090226470, US20110124100, US20070048776, US20090093049, y US20130177581. El TEE puede estar ubicado en la 5'UTR de los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos modificados y/o ARNmm.
En otro caso, los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos modificados y/o el ARNm puede incluir al menos un TEE que tenga al menos 50 %, por lo menos 55 %, por lo menos 60 %, por lo menos 65 %, por lo menos 70 %, por lo menos 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de identidad con los TEE descritos en las Publicaciones de Patentes de EE. UU. N°. US20090226470, US20070048776, US20130177581 y US20110124100, Publicación de Patente Internacional N°. WO1999024595, WO2012009644, WO2009075886 y WO2007025008, Publicación de Patente Europea N°. EP2610341A1 y EP2610340A1, Patente EE. UU. N°. US6310197, US6849405, US7456273, US7183395.
En un caso, la 5'UTR de los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos modificados y/o el ARNmm puede incluir al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12 , al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18 al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55 o más de 60 secuencias TEE. Las secuencias TEE en la 5'UTR de los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos modificados y/o el ARNm de la presente divulgación puede ser la misma o diferentes secuencias de TEE. Las secuencias TEE pueden estar en un patrón tal como ABABAB o AABBAABBAABB o ABCABCABC o variantes de las mismas repetidas una, dos o más de tres veces. En estos patrones, cada letra, A, B o C representa una UTR diferente a nivel de nucleótidos.
En un caso, la 5'UTR puede incluir un espaciador para separar dos secuencias TEE. Como ejemplo no limitativo, el espaciador puede ser un espaciador de 15 nucleótidos y/o otros espaciadores conocidos en la técnica. Como otro ejemplo no limitativo, la 5'UTR puede incluir un módulo espaciador de secuencia TEE repetido al menos una vez, al menos dos veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces y al menos 9 veces o más de 9 veces en la 5'UTR.
En otro caso, el espaciador que separa dos secuencias de TEE puede incluir otras secuencias conocidas en la técnica que pueden regular la traducción de los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos modificados y/o ARNm de la presente descripción, como, entre otras, las secuencias de miR descritas en esta invención (p. ej., sitios de unión de miR y semillas de miR). Como ejemplo no limitativo, cada espaciador usado para separar dos secuencias TEE puede incluir una secuencia miR diferente o un componente de una secuencia miR (p. ej., secuencia semilla miR).
En un caso, el TEE en la 5'UTR de los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos modificados y/o el ARNm de la presente descripción puede incluir al menos 5 %, por lo menos 10 %, por lo menos 15 %, por lo menos 20 %, por lo menos 25 %, por lo menos 30 %, por lo menos 35 %, por lo menos 40 %, por lo menos 45 %, por lo menos 50 %, por lo menos 55 %, por lo menos 60 %, por lo menos 65 %, por lo menos 70 %, por lo menos 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 95 %, al menos el 99 % o más del 99 % de las secuencias TEE descritas en las Publicaciones de Patente de EE. UU. N° US20090226470, US20070048776, US20130177581 y US20110124100, Publicación de Patente Internacional N° WO1999024595, WO2012009644, WO2009075886 y W02007025008, Publicaciones de Patente Europea N° EP2610341A1 y EP2610340A1, Patente de EE. UU. N° US6310197, US6849405, US7456273, US7183395. En otro caso, el TEE en la 5'UTR de los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos modificados y/o el ARNmm de la presente divulgación puede incluir un fragmento de 5 a 30 nucleótidos, un fragmento de 5 a 25 nucleótidos, un fragmento de 5 a 20 nucleótidos, un fragmento de 5 a 15 nucleótidos, un fragmento de 5 a 10 nucleótidos de las secuencias TEE descritas en la Publicación de Patente de EE. UU. N° US20090226470, US20070048776, US20130177581 y US20110124100, Publicación de Patente Internacional N° WO1999024595, WO2012009644, WO2009075886 y W02007025008, Publicación de Patente Europea N° EP2610341A1 y EP2610340A1, Patente de EE. UU. N° US6310197, US6849405, US7456273, US7183395.
En un caso, el TEE en la 5'UTR de los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos modificados y/o el ARNm de la presente descripción puede incluir al menos 5 %, por lo menos 10 %, por lo menos 15 %, por lo menos 20 %, por lo menos 25 %, por lo menos 30 %, por lo menos 35 %, por lo menos 40 %, por lo menos 45 %, por lo menos 50 %, por lo menos 55 %, por lo menos 60 %, por lo menos 65 %, por lo menos 70 %, por lo menos 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 95 %, al menos el 99 % o más del 99 % de las secuencias TEE descritas en Chappell y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9590-9594, 2004) y Zhou y col. (PNAS 102:6273-6278, 2005), en la Tabla Suplementaria 1 y en la Tabla Suplementaria 2 divulgadas por Wellensiek y col (Genome-wide profiling of human cap-independent translation-enhancing elements, Nature Methods, 2013; DOI:10.1038/NMETH.2522). En otro caso, el TEE en la 5'UTR de los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos modificados y/o el ARNmm de la presente descripción puede incluir un fragmento de 5-30 nucleótidos, un fragmento de 5-25 nucleótidos, un fragmento de 5-20 nucleótidos, un fragmento de 5-15 nucleótidos, un fragmento de 5-10 nucleótidos de las secuencias TEE descritas en Chappell y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9590-9594, 2004) y Zhou y col. (PNAS 102:6273-6278, 2005), Tabla Suplementaria 1 y en la Tabla Suplementaria 2 divulgadas por Wellensiek y col (Genome-wide profiling of human cap-independent translation-enhancing elements, Nature Methods, 2013; DOI:10.1038/NMETH.2522).
En un caso, el TEE utilizado en la 5'UTR de los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos modificados y/o el ARNmm de la presente descripción es una secuencia IRES tal como, entre otras, las descritas en la Patente de EE. UU. N° US7468275 y Publicación de Patente Internacional N°. WO2001055369.
En un caso, los TEE utilizados en la 5'UTR de los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos modificados y/o el ARNmm de la presente descripción puede identificarse mediante los procedimientos descritos en la publicación de Patente de EE. Uu. N° US20070048776 y US20110124100 y Publicación de Patente Internacional N°. W02007025008 y WO2012009644.
En otro caso, los TEE utilizados en la 5'UTR de los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos modificados y/o el ARNmm de la presente descripción puede ser un elemento regulador de la transcripción descrito en la Patente de EE. UU. N° US7456273 y US7183395, Publicación de Patente de EE. UU. N°. US20090093049, y Publicación de Patente Internacional N°. WO2001055371. Los elementos reguladores de la transcripción pueden identificarse mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como, entre otros, los procedimientos descritos en la Patente de EE. UU. N° US7456273 y US7183395, la Publicación de Patente de EE. UU. N° US20090093049, y Publicación Internacional N°. WO2001055371.
En otro caso más, el TEE utilizado en la 5'UTR de los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos modificados y/o ARNmm de la presente divulgación es un oligonucleótido o una porción del mismo como se describe en la Patente de EE.UU. N° US7456273 y US7183395, Publicación de Pwetente de EE. UU. N°. US20090093049, y Publicación Internacional N°. WO2001055371.
La UTR 5' que comprende al menos un TEE descrito en esta invención puede incorporarse en una secuencia monocistrónica tal como, entre otros, un sistema de vector o un vector de ácido nucleico. Como ejemplo no limitativo, los sistemas de vectores y los vectores de ácidos nucleicos pueden incluir los descritos en las Patentes de EE. UU. N°. 7456273 y US7183395, Publicación de Patente de EE. UU. N°. US20070048776, US20090093049 y US20110124100 Publicaciones de Patentes Internacionales N°. W02007025008 y WO2001055371.
En un caso, los TEE descritos en esta invención pueden estar ubicados en la 5'UTR y/o la 3'UTR de los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos modificados y/o ARNmm. Los TEE ubicados en la 3'UTR pueden ser los mismos y/o diferentes a los TEE ubicados en y/o descritos para su incorporación en la 5'UTR.
En un caso, la 3'UTR de los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos modificados y/o el ARNmm puede incluir al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12 , al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18 al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55 o más de 60 secuencias TEE. Las secuencias TEE en la 3'UTR de los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos modificados y/o el ARNm de la presente divulgación puede ser la misma o diferentes secuencias de TEE. Las secuencias TEE pueden estar en un patrón tal como ABABAB o AABBAABBAABB o ABCABCABC o variantes de las mismas repetidas una, dos o más de tres veces. En estos patrones, cada letra, A, B o C representa una UTR diferente a nivel de nucleótidos.
En un caso, la 3'UTR puede incluir un espaciador para separar dos secuencias TEE. Como ejemplo no limitativo, el espaciador puede ser un espaciador de 15 nucleótidos y/u otros espaciadores conocidos en la técnica. Como otro ejemplo no limitativo, la 3'UTR puede incluir un módulo espaciador de secuencia TEE repetido al menos una vez, al menos dos veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces y al menos 9 veces o más de 9 veces en la 3'UTR.
En otro caso, el espaciador que separa dos secuencias de TEE puede incluir otras secuencias conocidas en la técnica que pueden regular la traducción de los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos modificados y/o ARNmm de la presente descripción, como, entre otras, las secuencias de miR descritas en esta invención (p. ej., sitios de unión de miR y semillas de miR). Como ejemplo no limitativo, cada espaciador usado para separar dos secuencias TEE puede incluir una secuencia miR diferente o un componente de una secuencia miR (p. ej., secuencia semilla miR).
En un caso, la incorporación de una secuencia miR y/o una secuencia TEE cambia la forma de la región de horquilla que puede aumentar y/o disminuir la traducción. (ver, por ejemplo, Kedde y col. A Pumilio-induced RNA structure switch in p27-3'UTR controls miR-221 and miR-22 accessibility. Nature Cell Biology. 2010).
5'UTRheterólogas
Se puede proporcionar una 5' UTR como región flanqueante a los ácidos nucleicos modificados (ARNm), ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la descripción. 5'UTR puede ser homóloga o heteróloga a la región codificante que se encuentra en los ácidos nucleicos modificados (ARNm), ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la divulgación. Pueden incluirse múltiples UTR 5' en las regiones flanqueantes y pueden ser las mismas o de secuencias diferentes. Cualquier porción de las regiones flanqueantes, incluida ninguna, puede tener codones optimizados y cualquiera puede contener independientemente una o más modificaciones estructurales o químicas diferentes, antes y/o después de la optimización de codones.
Se muestra en la Tabla Extensa 21 en la Policitud Provisional de EE. UU.N° 61/7/5,509, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Heterologous Untranslated Regions for mRNA y en la Tabla Extensa 21 y en la Tabla 22 en la Solicitud provisional de EE. UU. N°. 61/829,372, depositada el 31 de mayo de 2013, titulada Heterologous Untranslated Regions for mRNA, el contenido de cada una de las cuales se incorpora en esta invención como referencia en su totalidad, es una lista del sitio de inicio y finalización de los ácidos nucleicos modificados (ARNm), modificado mejorado ARN o ácidos ribonucleicos de la divulgación. En la Tabla 21 cada 5'UTR (5'UTR-005 a 5'UTR 68511) se identifica por su sitio de inicio y finalización en relación con su transcrito nativo o de tipo salvaje (homólogo) (ENST; el identificador utilizado en la base de datos ENSEMBL).
5'UTR adicionales que pueden usarse con los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la divulgación se muestran en esta divulgación en la Tabla 6, Tabla 38 y Tabla 41.
Para alterar una o más propiedades de los polinucleótidos, las construcciones primarias o el ARNmm de la divulgación, se diseñan 5'UTR que son heterólogos a la región codificante de los ácidos nucleicos modificados (ARNm), ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la divulgación. en compuestos de la divulgación. Los ácidos nucleicos modificados (ARNm), el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos se administran a continuación a células, tejidos u organismos y se obtienen resultados como el nivel de proteínas, la localización y/o la semivida se mide para evaluar los efectos beneficiosos que la 5'UTR heteróloga puede tener sobre los ácidos nucleicos modificados (ARNm), el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la descripción. Se pueden utilizar variantes de las 5'UTR donde se agregan o eliminan uno o más nucleótidos de los extremos, incluidos A, T, C o G. Las 5'UTR también se pueden optimizar por codones o modificar de cualquier manera descrita en esta invención.
Incorporación de sitios de unión de microARN
En un caso, los ácidos nucleicos modificados (ARNm), el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la divulgación no solo codificarían un polipéptido sino también una secuencia sensora. Las secuencias sensoras incluyen, por ejemplo, sitios de unión de microARN, sitios de unión de factores de transcripción, secuencias de ARNm estructuradas y/o Motivos, sitios de unión artificiales diseñados para actuar como pseudorreceptores para moléculas de unión de ácidos nucleicos endógenos.
En un caso, se realiza el perfilado de microARN (miARN) de las células o tejidos diana para determinar la presencia o ausencia de miARN en las células o tejidos.
Un microARN (o miARN) es un ARN no codificante de 19--25 nucleótidos de longitud que se une a la 3'UTR de las moléculas de ácido nucleico y regula negativamente la expresión génica, ya sea reduciendo la estabilidad de la molécula de ácido nucleico o inhibiendo la traducción. Los ácidos nucleicos modificados (ARNm), ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la descripción pueden comprender una o más secuencias diana de microARN, secuencias de microARN o semillas de microARN. Dichas secuencias pueden corresponder a cualquier microARN conocido, como los que se enseñan en la Publicación de EE.UU. US2005/0261218 y la Publicación de EE.UU. US2005/0059005. Como ejemplo no limitativo, los microARN conocidos, sus secuencias y secuencias de semillas en el genoma humano se enumeran a continuación en la Tabla 11.
Una secuencia de microARN comprende una región "semilla", es decir, una secuencia en la región de posiciones 2-8 del microARN maduro, cuya secuencia tiene una complementariedad de Watson-Crick perfecta con la secuencia diana de miARN. Una semilla de microARN puede comprender las posiciones 2--8 o 2--7 de un microARN maduro. Una semilla de microARN puede comprender 7 nucleótidos (p. ej., nucleótidos 2-8 del microARN maduro), donde el sitio complementario de la semilla en el correspondiente miARN diana está flanqueado por una adenina (A) opuesta a la posición 1 del microARN. Una semilla de microARN puede comprender 6 nucleótidos (p. ej., nucleótidos 2-7 del microARN maduro), donde el sitio complementario de la semilla en el miARN diana correspondiente está flanqueado por una adenina (A) opuesta a la posición 1 del microARN. Véase, por ejemplo, Grimson A, Farh KK, Johnston WK, Garrett-Engele P, Lim LP, Bartel DP; Mol Cell. 2007 Jul 6;27(1):91-105. Las bases de la semilla de microARN se complementan completamente con la secuencia diana. Mediante ingeniería de secuencias diana de microARN en la UTR 3' de polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la divulgación pueden alcanzar a la molécula para degradación o traducción reducida, siempre que el microARN en cuestión esté disponible. Este procedimiento reducirá el riesgo de efectos fuera de diana sobre el suministro de moléculas de ácido nucleico. Se ha informado sobre la identificación de microARN, regiones diana de microARN y sus patrones de expresión y función en biología (Bonauer y col., Curr Drug Targets 2010 11:943-949; Anand and Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176, Contreras and Rao Leukemia 201226:404-413 (2011 Dic 20. doi: 10.1038/leu.2011.356); Bartel Cell 2009 136:215-233; Landgraf y col, Cell, 2007 129:1401-1414; Gentner and Naldini, Tissue Antigens. 2012 80:393-403 y todas las referencias en el mismo).
Por ejemplo, si el ARNm no está destinado a ser entregado al hígado pero termina allí, entonces miR-122, un microARN abundante en el hígado, puede inhibir la expresión del gen de interés si uno o varios sitios diana de miR-122 se modifican en la 3'UTR de los ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos. La introducción de uno o múltiples sitios de unión para diferentes microARN puede diseñarse para disminuir aún más la longevidad, la estabilidad y la traducción de proteínas de ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos. Como se usa en esta invención, el término "sitio de microARN" se refiere a un sitio diana de microARN o un sitio de reconocimiento de microARN, o cualquier secuencia de nucleótidos a la que se une o se asocia un microARN. Debe entenderse que la "unión" puede seguir las reglas tradicionales de hibridación de Watson-Crick o puede reflejar cualquier asociación estable del microARN con la secuencia diana en o de manera adyacente al sitio de microARN.
Por el contrario, a los efectos de los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la presente descripción, los sitios de unión de microARN pueden diseñarse (es decir, eliminarse) de secuencias donde se encuentran de forma natural para aumentar la expresión de proteínas en tejidos específicos. . Por ejemplo, los sitios de unión de miR-122 pueden eliminarse para mejorar la expresión de proteínas en el hígado.
En un caso, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la presente divulgación pueden incluir al menos un sitio de unión de miARN en la 3'UTR para dirigir terapias de ARNm citotóxicas o citoprotectoras a células específicas tales como, pero no limitado a, normal y/o células cancerosas (p. ej., HEP3B o SNU449).
En otro caso, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la presente divulgación pueden incluir tres sitios de unión de miARN en la 3'UTR para dirigir terapias de ARNm citotóxicas o citoprotectoras a células específicas tales como, entre otras, células normales y/o cancerosas (p. ej., HEP3B o SNU449).
La regulación de la expresión en múltiples tejidos se puede lograr mediante la introducción o eliminación o uno o varios sitios de unión de microARN. A continuación, en la Tabla 12, se muestran los microARN que se expresan de manera diferencial en diferentes tejidos y células y, a menudo, se asocian con diferentes tipos de enfermedades (p. ej., células cancerosas). La decisión de eliminar o insertar sitios de unión de microARN, o cualquier combinación, depende de los patrones de expresión de microARN y sus perfiles en enfermedades.
Ejemplos de tejidos donde se sabe que los microARN regulan el ARNm y, por lo tanto, la expresión de proteínas incluyen, entre otros, hígado (miR-122), músculo (miR-133, miR-206, miR-208), células endoteliales (miR -17-92, miR-126), células mieloides (miR-142-3p, miR-142-5p, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27), tejido adiposo (deje -7, miR-30c), corazón (miR-1d, miR-149), riñón (miR-192, miR-194, miR-204) y células epiteliales de pulmón (let-7, miR-133, miR-126 ).
Específicamente, se sabe que los microARN se expresan diferencialmente en las células inmunitarias (también llamadas células hematopoyéticas), como las células presentadoras de antígenos (APC) (p. ej., células dendríticas y macrófagos), macrófagos, monocitos, linfocitos B, linfocitos T, granulocitos, células asesinas naturales , etc. Los microARN específicos de células inmunitarias están implicados en la inmunogenicidad, la autoinmunidad, la respuesta inmunitaria a la infección, la inflamación, así como la respuesta inmunitaria no deseada después de la terapia génica y el trasplante de tejidos/órganos. Los microARN específicos de las células inmunitarias también regulan muchos aspectos del desarrollo, la proliferación, la diferenciación y la apoptosis de las células hematopoyéticas (células inmunitarias). Por ejemplo, miR-142 y miR-146 se expresan exclusivamente en las células inmunitariass, particularmente abundantes en las células dendríticas mieloides. Se demostró en la técnica que la respuesta inmunitaria a las moléculas de ácido nucleico exógenas se detuvo agregando sitios de unión de miR-142 a la 3'UTR de la construcción del gen entregado, lo que permitió una transferencia de genes más estable en tejidos y células. miR-142 degrada eficientemente el ARNm exógeno en las células presentadoras de antígenos y suprime la eliminación citotóxica de las células transucadas (Annoni A y col., blood, 2009, 114,5152-5161; Brown BD, y col., Nat med. 2006, 12(5), 585-591; Brown BD, y col., sangre, 2007, 110(13): 4144-4152).
Una respuesta inmunitaria mediada por antígeno puede referirse a una respuesta inmunitaria provocada por antígenos extraños que, al entrar en un organismo, son procesados por las células presentadoras de antígenos y se muestran en la superficie de las células presentadoras de antígenos. Las células T pueden reconocer el antígeno presentado e inducir una eliminación citotóxica de las células que expresan el antígeno.
La introducción del sitio de unión de miR-142 en la 3'-UTR de un polipéptido de la presente divulgación puede reprimir selectivamente la expresión génica en las células presentadoras de antígenos a través de la degradación del ARNm mediada por miR-142, lo que limita la presentación de antígenos en APC (por ejemplo, células dendríticas) e impidiendo así la respuesta inmunitaria mediada por antígenos después de la administración de los polinucleótidos. Por lo tanto, los polinucleótidos se expresan de forma estable en tejidos o células diana sin desencadenar la eliminación citotóxica.
En un caso, los sitios de unión de los microARN que se sabe que se expresan en las células inmunitarias, en particular, las células presentadoras de antígenos, se pueden diseñar en el polinucleótido para suprimir la expresión del polinucleótido de la señal del sensor en las APC a través de la degradación del ARN mediada por microARN. , sometiendo la respuesta inmunitaria mediada por antígeno, mientras que la expresión del polinucleótido se mantiene en células no inmunitarias donde no se expresan los microARN específicos de células inmunitarias. Por ejemplo, para impedir la reacción inmunogénica causada por la expresión de una proteína específica del hígado, el sitio de unión de miR-122 puede eliminarse y el miR-142 (y/o mirR-146) los sitios de unión pueden modificarse en la 3-UTR del polinucleótido.
Para impulsar aún más la degradación selectiva y la supresión del ARNm en APC y macrófagos, el polinucleótido puede incluir otro elemento regulador negativo en la 3-UTR, ya sea solo o en combinación con mir-142 y/o sitios de unión de mir-146. Como ejemplo no limitativo, un elemento regulador son los Elementos de Desintegración Constitutivos (CDE).
Los microARN específicos de células inmunitarias incluyen, entre otros, hsa-let-7a-2-3p, hsa-let-7a-3p, hsa-7a-5p, hsa-let-7c, hsa-let-7e-3p, hsa-let-7e-5p, hsa-let-7g-3p, hsa-let-7g-5p, hsa-let-7i-3p, hsa-let-7i-5p, miR-10a-3p, miR-10a- 5p, miR-1184, hsa-let-7f-1--3p, hsa-let-7f-2--5p, hsa-let-7f-5p, miR-125b-1-3p, miR-125b-2- 3p, miR-125b-5p, miR-1279, miR-130a-3p, miR-130a-5p, miR-132-3p, miR-132-5p, miR-142-3p, miR-142-5p, miR- 143-3p, miR-143-5p, miR-146a-3p, miR-146a-5p, miR-146b-3p, miR-146b-5p, miR-147a, miR-147b, miR-148a-5p, miR- 148a-3p, miR-150-3p, miR-150-5p, miR-151b, miR-155-3p, miR-155-5p, miR-15a-3p, miR-15a-5p, miR-15b-5p, miR-15b-3p, miR-16-1-3p, miR-16-2-3p, miR-16-5p, miR-17-5p, miR-181a-3p, miR-181a-5p, miR-181a- 2-3p, miR-182-3p, miR-182-5p, miR-197-3p, miR-197-5p, miR-21-5p, miR-21-3p, miR-214-3p, miR-214- 5p, miR-223-3p, miR-223-5p, miR-221-3p, miR-221-5p, miR-23b-3p, miR-23b-5p, miR-24-1-5p, miR-24- 2-5p, miR-24-3p, miR-26a-1-3p, miR-26a-2-3p, miR-26a-5p, miR-26b-3p, miR-26b -5p, miR-27a-3p, miR-27a-5p, miR-27b-3p, miR-27b-5p, miR-28-3p, miR-28-5p, miR-2909, miR-29a-3p, miR -29a-5p, miR-29b-1-5p, miR-29b-2-5p, miR-29c-3p, miR-29c-5p" miR-30e-3p, miR-30e-5p, miR-331-5p , miR-339-3p, miR-339-5p, miR-345-3p, miR-345-5p, miR-346, miR-34a-3p, miR-34a-5p, , miR-363-3p, miR- 363-5p, miR-372, miR-377-3p, miR-377-5p, miR-493-3p, miR-493-5p, miR-542, miR-548b-5p, miR548c-5p, miR-548i, miR-548j, miR-548n, miR-574-3p, miR-598, miR-718, miR-935, miR-99a-3p, miR-99a-5p, miR-99b-3p y miR-99b-5p. Los microARN que están enriquecidos en tipos específicos de células inmunitarias se enumeran en la Tabla 13. Además, se descubren miroARN novedosos en las células inmunitarias en la técnica a través de la hibridación de micromatrices y el análisis de micrótomos (Jima DD y col, Blood, 2010, 116:e118-e127; Vaz C y col., BMC Genomics, 2010,11,288.) Los microARN que se sabe que se expresan en el hígado incluyen, entre otros, miR-107, miR-122-3p, miR-122-5p, miR-1228-3p, miR-1228-5p, miR- 1249, miR-129-5p, miR-1303, miR-151a-3p, miR-151a-5p, miR-152, miR-194-3p, miR-194-5p, miR-199a-3p, miR-199a- 5p, miR-199b-3p, miR-199b-5p, miR-296-5p, miR-557, miR-581, miR-939-3p, miR-939-5p. Los sitios de unión de microARN de cualquier microARN específico de hígado pueden introducirse o eliminarse de los polinucleótidos para regular la expresión de los polinucleótidos en el hígado. Los sitios de unión de microARN específicos del hígado pueden diseñarse solos o además en combinación con sitios de unión de microARN de células inmunitarias (por ejemplo, APC) para impedir la reacción inmunitaria contra la expresión de proteínas en el hígado.
Los microARN que se sabe que se expresan en el pulmón incluyen, entre otros, let-7a-2-3p, let-7a-3p, let-7a-5p, miR-126-3p, miR-126- 5p, miR-127-3p, miR-127-5p, miR-130a-3p, miR-130a-5p, miR-130b-3p, miR-130b-5p, miR-133a, miR-133b, miR-134, miR-18a-3p, miR-18a-5p, miR-18b-3p, miR-18b-5p, miR-24-1-5p, miR-24-2-5p, miR-24-3p, miR-296- 3p, miR-296-5p, miR-32-3p, miR-337-3p, miR-337-5p, miR-381-3p, miR-381-5p. Los sitios de unión de microARN de cualquier microARN específico de pulmón pueden introducirse o eliminarse de los polinucleótidos para regular la expresión de los polinucleótidos en el pulmón. Los sitios de unión de microARN específicos del pulmón pueden diseñarse solos o además en combinación con sitios de unión de microARN de células inmunitarias (por ejemplo, APC) para impedir la reacción inmunitaria contra la expresión de proteínas en el pulmón.
Los microARN que se sabe que se expresan en el corazón incluyen, entre otros, miR-1, miR-133a, miR-133b, miR-149-3p, miR-149-5p, miR-186-3p, miR-186-5p, miR-208a, miR-208b, miR-210, miR-296-3p, miR-320, miR-451a, miR-451b, miR-499a-3p, miR-499a-5p, miR- 499b-3p, miR-499b-5p, miR-744-3p, miR-744-5p, miR-92b-3p y miR-92b-5p. Los sitios de unión de microARN de cualquier microARN específico de corazón pueden introducirse o eliminarse de los polinucleótidos para regular la expresión de los polinucleótidos en el corazón. Los sitios de unión de microARN específicos del corazón pueden diseñarse solos o además en combinación con sitios de unión de microARN de células inmunitarias (por ejemplo, APC) para impedir la reacción inmunitaria contra la expresión de proteínas en el corazón.
Los microARN que se sabe que se expresan en el sistema nervioso incluyen, entre otros, miR-124-5p, miR-125a-3p, miR-125a-5p, miR-125b-1-3p, miR-125b -2-3p, miR-125b-5p, miR-1271-3p, miR-1271-5p, miR-128, miR-132-5p, miR-135a-3p, miR-135a-5p, miR-135b-3p , miR-135b-5p, miR-137, miR-139-5p, miR-139-3p, miR-149-3p, miR-149-5p, miR-153, miR-181c-3p, miR-181c-5p , miR-183-3p, miR-183-5p, miR-190a, miR-190b, miR-212-3p, miR-212-5p, miR-219-1-3p, miR-219-2-3p, miR -23a-3p, miR-23a-5p, miR-30a-5p, miR-30b-3p, miR-30b-5p, miR-30c-1-3p, miR-30c-2-3p, miR-30c-5p , miR-30d-3p, miR-30d-5p, miR-329, miR-342-3p, miR-3665, miR-3666, miR-380-3p, miR-380-5p, miR-383, miR-410 , miR-425-3p, miR-425-5p, miR-454-3p, miR-454-5p, miR-483, miR-510, miR-516a-3p, miR-548b-5p, miR-548c-5p , miR-571, miR-7-1-3p, miR-7-2-3p, miR-7-5p, miR-802, miR-922, miR-9-3p y miR-9-5p. Los microARN enriquecidos en el sistema nervioso incluyen además aquellos expresados específicamente en neuronas, incluidos, entre otros, miR-132-3p, miR-132-3p, miR-148b-3p, miR-148b-5p, miR-151a-3p , miR-151a-5p, miR-212-3p, miR-212-5p, miR-320b, miR-320e, miR-323a-3p, miR-323a-5p, miR-324-5p, miR-325, miR -326, miR-328, miR-922 y aquellos expresados específicamente en células gliales, incluidos, entre otros, miR-1250, miR-219-1-3p, miR-219-2-3p, miR-219-5p , miR-23a-3p, miR-23a-5p, miR-3065-3p, miR-3065-5p, miR-30e-3p, miR-30e-5p, miR-32-5p, miR-338-5p, miR -657. Los sitios de unión de microARN de cualquier microARN específico del SNC pueden introducirse o eliminarse de los polinucleótidos para regular la expresión de los polinucleótidos en el sistema nervioso. Los sitios de unión de microARN específicos del sistema nervioso pueden diseñarse solos o además en combinación con sitios de unión de microARN de células inmunitarias (por ejemplo, APC) para impedir la reacción inmunitaria contra la expresión de proteínas en el sistema nervioso.
Los microARN que se sabe que se expresan en el páncreas incluyen, entre otros, miR-105-3p, miR-105-5p, miR-184, miR-195-3p, miR-195-5p, miR- 196a-3p, miR-196a-5p, miR-214-3p, miR-214-5p, miR-216a-3p, miR-216a-5p, miR-30a-3p, miR-33a-3p, miR-33a- 5p, miR-375, miR-7-1-3p, miR-7-2-3p, miR-493-3p, miR-493-5p y miR-944. Los sitios de unión de microARN de cualquier microARN específico del páncreas pueden introducirse o eliminarse de los polinucleótidos para regular la expresión de los polinucleótidos en el páncreas. Los sitios de unión de microARN específicos del páncreas pueden diseñarse solos o además en combinación con sitios de unión de microARN de células inmunitarias (por ejemplo, APC) para impedir la reacción inmunitaria contra la expresión de proteínas en el páncreas.
Los microARN que se sabe que se expresan en el riñón incluyen, entre otros, miR-122-3p, miR-145-5p, miR-17-5p, miR-192-3p, miR-192-5p , miR-194-3p, miR-194-5p, miR-20a-3p, miR-20a-5p, miR-204-3p, miR-204-5p, miR-210, miR-216a-3p, miR-216a -5p, miR-296-3p, miR-30a-3p, miR-30a-5p, miR-30b-3p, miR-30b-5p, miR-30c-1-3p, miR-30c-2-3p, miR30c -5p, miR-324-3p, miR-335-3p, miR-335-5p, miR-363-3p, miR-363-5p y miR-562. Los sitios de unión de microARN de cualquier microARN específico del riñón pueden introducirse o eliminarse de los polinucleótidos para regular la expresión de los polinucleótidos en el riñón. Los sitios de unión de microARN específicos del riñón pueden diseñarse solos o además en combinación con sitios de unión de microARN de células inmunitarias (por ejemplo, APC) para impedir la reacción inmunitaria contra la expresión de proteínas en el riñón.
Los microARN que se sabe que se expresan en el músculo incluyen, entre otros, let-7g-3p, let-7g-5p, miR-1, miR-1286, miR-133a, miR-133b, miR -140-3p, miR-143-3p, miR-143-5p, miR-145-3p, miR-145-5p, miR-188-3p, miR-1885p, miR-206, miR-208a, miR -208b, miR-25-3p y miR-25-5p. Los sitios de unión de microARN de cualquier microARN específico del músculo pueden introducirse o eliminarse de los polinucleótidos para regular la expresión de los polinucleótidos en el músculo. Los sitios de unión de microARN específicos del músculo pueden diseñarse solos o además en combinación con sitios de unión de microARN de células inmunitarias (por ejemplo, APC) para impedir la reacción inmunitaria contra la expresión de proteínas en el músculo.
Los microARN se expresan diferencialmente en diferentes tipos celulares, como células endoteliales, células epiteliales y adipocitos. Por ejemplo, los microARN que se expresan en las células endoteliales incluyen, entre otros, let-7b-3p, let-7b-5p, miR-100-3p, miR-100-5p, miR-101-3p, miR- 101-5p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-1236-3p, miR-1236-5p, miR-130a-3p, miR-130a-5p, miR-17-5p, miR-17- 3p, miR-18a-3p, miR-18a-5p, , miR-19a-3p, miR-19a-5p, miR-19b-1-5p, miR-19b-2-5p, miR-19b-3p, miR -20a-3p, miR-20a-5p, miR-217, miR-210, miR-21-3p, miR-21-5p, miR-221-3p, miR-221-5p, miR-222-3p, miR -222-5p, miR-23a-3p, miR-23a-5p, miR-296-5p, miR-361-3p, miR-361-5p, miR-421, miR-424-3p, miR-424-5p , miR-513a-5p, miR-92a-1-5p, miR-92a-2-5p, miR-92a-3p, miR-92b-3p y miR-92b-5p. Se descubren muchos microARN nuevos en células endoteliales a partir del análisis de secuenciación profunda (Voellenkle C y col., RNA, 2012,18,472-484) Los sitios de unión de microARN de cualquier microARN específico de células endoteliales pueden introducirse o eliminarse del polinucleótido para modular la expresión del polinucleótido en las células endoteliales en diversas condiciones.
Para obtener más ejemplos, los microARN que se expresan en las células epiteliales incluyen, entre otros, let-7b-3p, let-7b-5p, miR-1246, miR-200a-3p, miR-200a-5p, miR -200b-3p, miR-200b-5p, miR-200c-3p, miR-200c-5p, miR-338-3p, miR-429, miR-451a, miR-451b, miR-494, miR-802 y miR -34a, miR-34b-5p, miR-34c-5p, miR-449a, miR-449b-3p, miR-449b-5p específicos en células epiteliales ciliadas respiratorias; familia let-7, miR-133a, miR-133b, miR-126 específicos en células epiteliales de pulmón; miR-382-3p, miR-382-5p específico en células epiteliales renales y miR-762 específico en células epiteliales corneales. Los sitios de unión de microARN de cualquier microARN específico de células epiteliales se pueden introducir o eliminar del polinucleótido para modular la expresión del polinucleótido en las células epiteliales en diversas condiciones.
Además, un gran grupo de microARN se enriquecen en células madre embrionarias, lo que controla la autorrenovación de las células madre, así como el desarrollo. y/o diferenciación de varios linajes celulares, como células neurales, cardíacas, células hematopoyéticas, células de la piel, células osteogénicas y células musculares (Kuppusamy KT y col., Curr. Mol Med, 2013, 13(5), 757-764; Vidigal JA y Ventura A, Semin Cancer Biol. 2012, 22(5-6), 428-436; Goff LA y col., PLoS One, 2009, 4:e7192; Morin RD y col., Genome Res,2008,18, 610-621; Yoo JK y col., Stem Cells Dev.
2012, 21(11), 2049-2057). Los microARN abundantes en las células madre embrionarias incluyen, entre otros, let-7a-2-3p, let-a-3p, let-7a-5p, let7d-3p, let-7d-5p, miR-103a-2- 3p, miR-103a-5p, miR-106b-3p, miR-106b-5p, miR-1246, miR-1275, miR-138-1-3p, miR-138-2-3p, miR-138-5p, miR-154-3p, miR-154-5p, miR-200c-3p, miR-200c-5p, miR-290, miR-301a-3p, miR-301a-5p, miR-302a-3p, miR-302a- 5p, miR-302b-3p, miR-302b-5p, miR-302c-3p, miR-302c-5p, miR-302d-3p, miR-302d-5p, miR-302e, miR-367-3p, miR- 367-5p, miR-369-3p, miR-369-5p, miR-370, miR-371, miR-373, miR-380-5p, miR-423-3p, miR-423-5p, miR-486- 5p, miR-520c-3p, miR-548e, miR-548f, miR-548g-3p, miR-548g-5p, miR-548i, miR-548k, miR-548l, miR-548m, miR-548n, miR- 548o-3p, miR-548o-5p, miR-548p, miR-664a-3p, miR-664a-5p, miR-664b-3p, miR-664b-5p, miR-766-3p, miR-766-5p, miR-885-3p, miR-885-5p, miR-93-3p, miR-93-5p, miR-941, miR-96-3p, miR-96-5p, miR-99b-3p y miR-99b- 5p. Muchos nuevos microARN previstos se descubren mediante secuenciación profunda en células madre embrionarias humanas (Morin RD y col., Genome Res, 2008, 18, 610-621; Goff LA y col., PLoS One, 2009, 4:e7192; Bar M y col., Stem cell, 2008, 26, 2496-2505).
En un caso, los sitios de unión de microARN específicos de células madre embrionarias pueden incluirse o eliminarse de la 3-UTR del polinucleótido para modular el desarrollo y/o diferenciación de células madre embrionarias, para inhibir la senescencia de células madre en un estado degenerativo (p. ej., enfermedades degenerativas), o para estimular la senescencia y apoptosis de células madre en un estado patológico (p. ej., células madre cancerosas).
Muchos estudios de expresión de microARN se llevan a cabo en la técnica para perfilar la expresión diferencial de microARN en diversas células cancerosas/ tejidos y otras enfermedades. Algunos microARN se sobreexpresan de forma anormal en ciertas células cancerosas y otros se subexpresan. Por ejemplo, los microARN se expresan diferencialmente en las células cancerosas (WO2008/154098, US2013/0059015, US2013/0042333, WO20111157294); células madre cancerosas (US2012/0053224); cánceres y enfermedades del páncreas (US2009/0131348, US2011/0171646, US2010/0286232, US8389210); asma e inflamación (US8415096); cáncer de próstata (US2013/0053264); carcinoma hepatocelular (WO2012/151212, US2012/0329672, WO2008/054828, US8252538); células de cáncer de pulmón (WO2011/076143, WO2013/033640, WO2009/070653, US2010/032335/); linfoma cutáneo de células T (WO2013/011378); células de cáncer colorrectal (WO2011/0281756, WO2011/076142); ganglios linfáticos positivos para cáncer (WO2009/100430, US2009/0263803); carcinoma nasofaríngeo (EP2112235); enfermedad pulmonar obstructiva crónica (US2012/0264626, US2013/0053263); cáncer de tiroides (WO2013/066678); células de cáncer de ovario ( US2012/0309645, WO2011/095623); células de cáncer de mama (WO2008/154098, WO2007/081740, US2012/0214699), leucemia y linfoma (WO2008/073915, US2009/0092974, US2012/0316081, US2012/0283310, WO2010/018563.)
Como ejemplo no limitativo, los sitios de microARN que se sobreexpresan en ciertos cánceres y/o las células tumorales se pueden eliminar de la 3-UTR del polinucleótido que codifica el polipéptido de interés, restaurando la expresión suprimida por los microARN sobreexpresados en las células cancerosas, mejorando así la función biológica correspondiente, por ejemplo, la estimulación de la transcripción y/o represión, detención del ciclo celular, apoptosis y muerte celular. Las células y los tejidos normales, donde la expresión de los microARN no está regulada al alza, no se verán afectados.
El microARN también puede regular procedimientos biológicos complejos como la angiogénesis (miR-132) (Anand and Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176). En los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la divulgación, los sitios de unión para los microARN que están involucrados en dichos procedimientos pueden eliminarse o introducirse, para adaptar la expresión de los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos. expresión a tipos celulares biológicamente relevantes o al contexto de procedimientos biológicos relevantes. En este contexto, los ARNm se definen como ARNm auxotróficos.
La regulación del gen del microARN puede verse influida por la secuencia que rodea al microARN, como, por ejemplo, la especie de la secuencia circundante, el tipo de secuencia (p. ej., heteróloga, homóloga y artificial), los elementos reguladores de la secuencia circundante. y/o elementos estructurales en la secuencia circundante. El microARN puede estar influenciado por la 5'UTR y/o la 3'UTR. Como ejemplo no limitativo, una 3'UTR no humana puede aumentar el efecto regulador de la secuencia de microARN sobre la expresión de un polipéptido de interés en comparación con una 3'UTR humana del mismo tipo de secuencia.
En un caso, otros elementos normativos y/o los elementos estructurales de la 5'-UTR pueden influir en la regulación génica mediada por microARN. Un ejemplo de un elemento regulador y/o El elemento estructural es un IRES (sitio de entrada de ribosoma interno) estructurado en la 5'UTR, que es necesario para la unión de los factores de elongación de la traducción para iniciar la traducción de proteínas. La unión de EIF4A2 a este elemento estructurado secundariamente en la 5'UTR es necesaria para la expresión génica mediada por microARN (Meijer HA y col., Science, 2013, 340, 82-85). Los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la descripción pueden modificarse adicionalmente para incluir este 5'-UTR estructurado para mejorar la regulación génica mediada por microARN.
Al menos un sitio de microARN puede diseñarse en la UTR 3' de los ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la presente descripción. En este contexto, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez o más sitios de microARN pueden modificarse en el 3' UTR de los ácidos ribonucleicos de la presente divulgación. En un caso, los sitios de microARN incorporados en los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos pueden ser los mismos o pueden ser sitios de microARN diferentes. En otro caso, los sitios de microARN incorporados en los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos pueden dirigirse al mismo oa diferentes tejidos del cuerpo. Como ejemplo no limitativo, a través de la introducción de sitios de unión de microARN específicos de tejido, tipos celulares o enfermedad en la UTR 3' de un ARNm de ácido nucleico modificado, el grado de expresión en tipos celulares específicos (por ejemplo, hepatocitos, células mieloides, células endoteliales, células cancerosas, etc.) pueden reducirse.
En un caso, se puede diseñar un sitio de microARN cerca del extremo 5' de la 3'UTR, aproximadamente a mitad de camino entre el extremo 5' y el extremo 3' de la 3'UTR. y/o cerca del extremo 3' de la 3'UTR. Como ejemplo no limitante, un sitio de microARN puede diseñarse cerca del extremo 5' de la 3'UTR y aproximadamente a medio camino entre el extremo 5' y el extremo 3' de la 3'UTR. Como otro ejemplo no limitante, un sitio de microARN puede diseñarse cerca del extremo 3' de la 3'UTR y aproximadamente a medio camino entre el extremo 5' y el extremo 3' de la 3'UTR. Como otro ejemplo no limitante más, un sitio de microARN puede diseñarse cerca del extremo 5' de la 3'UTR y cerca del extremo 3' de la 3'UTR.
En otro caso, una 3'UTR puede comprender 4 sitios de microARN. Los sitios de microARN pueden ser sitios de unión de microARN completos, secuencias semilla de microARN y/o Secuencias del sitio de unión de microARN sin la secuencia semilla.
En un caso, un ácido nucleico de la divulgación puede diseñarse para incluir al menos un microARN para amortiguar la presentación de antígenos por parte de las células presentadoras de antígenos. El microARN puede ser la secuencia de microARN completa, la secuencia semilla de microARN, la secuencia de microARN sin la semilla o una combinación de las mismas. Como ejemplo no limitativo, el microARN incorporado en el ácido nucleico puede ser específico del sistema hematopoyético. Como otro ejemplo no limitativo, el microARN incorporado en el ácido nucleico de la descripción para amortiguar la presentación de antígenos es miR-142-3p.
En un caso, un ácido nucleico puede diseñarse para incluir sitios de microARN que se expresan en diferentes tejidos de un sujeto. Como ejemplo no limitante, un ácido nucleico modificado, un a Rn modificado mejorado o un ácido ribonucleico de la presente divulgación pueden diseñarse para incluir miR-192 y miR-122 para regular la expresión del ácido nucleico modificado, el ARN modificado mejorado o el ácido ribonucleico en el hígado y los riñones de un sujeto. En otro caso, un ácido nucleico modificado, un ARN modificado mejorado o un ácido ribonucleico pueden diseñarse para incluir más de un sitio de microARN para el mismo tejido. Por ejemplo, un ácido nucleico modificado, ARN modificado mejorado o ácido ribonucleico de la presente divulgación puede diseñarse para incluir miR-17-92 y miR-126 para regular la expresión del ácido nucleico modificado, ARN modificado mejorado o ácido ribonucleico en células endoteliales. de un sujeto
En un caso, la ventana terapéutica y/o la expresión diferencial asociada con el polipéptido diana codificado por el ácido nucleico modificado, el ARN modificado mejorado o el ácido ribonucleico que codifica una señal (también denominada en esta invención como polinucleótido) de la divulgación pueden alterarse. Por ejemplo, se pueden diseñar polinucleótidos mediante los cuales una señal de muerte se exprese más en células cancerosas (o una señal de supervivencia en una célula normal) en virtud de la firma de miARN de esas células. Cuando una célula cancerosa expresa un nivel más bajo de un miARN en particular, el polinucleótido que codifica el sitio de unión para ese miARN (o miARN) se expresaría en mayor medida. Por tanto, el polipéptido diana codificado por el polinucleótido se selecciona como una proteína que desencadena o induce la muerte celular. Las células vecinas no cancerosas, que albergan una mayor expresión del mismo miARN, se verían menos afectadas por la señal de muerte codificada, ya que el polinucleótido se expresaría a un nivel más bajo debido a los efectos de la unión del miARN al sitio de unión o "sensor" codificado en el 3'UTR. Por el contrario, las señales de supervivencia celular o citoprotectoras pueden enviarse a tejidos que contienen células cancerosas y no cancerosas donde un miARN tiene una mayor expresión en las células cancerosas; el resultado es una señal de supervivencia más baja para la célula cancerosa y una firma de supervivencia más grande para la célula normal. . Pueden diseñarse y administrarse múltiples polinucleótidos que tengan diferentes señales según el paradigma anterior.
En un caso, la expresión de un ácido nucleico puede controlarse incorporando al menos una secuencia sensora en el ácido nucleico y formulando el ácido nucleico. Como ejemplo no limitante, un ácido nucleico puede dirigirse a un tumor ortotópico al tener un ácido nucleico que incorpore un sitio de unión de miR-122 y formularse en una nanopartícula lipídica que comprenda el lípido catiónico DLin-KC2-DMA (véanse, por ejemplo, los experimentos descrito en el ejemplo 49A y 49B).
Según la presente descripción, los polinucleótidos pueden modificarse para evitar las deficiencias de otras moléculas codificantes de polipéptidos de la técnica. Por tanto, en este caso los polinucleótidos se denominan polinucleótidos modificados.
Por último, mediante la comprensión de los patrones de expresión de microARN en diferentes tipos celulares, se pueden diseñar polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm para una expresión más dirigida en tipos celulares específicos o solo bajo condiciones biológicas específicas. Mediante la introducción de sitios de unión de microARN específicos de tejido, podrían diseñarse polinucleótidos que serían óptimos para la expresión de proteínas en un tejido o en el contexto de una condición biológica.
Los experimentos de transfección se pueden realizar en líneas celulares relevantes, utilizando ácidos nucleicos modificados por ingeniería, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos y la producción de proteínas se puede analizar en varios puntos de tiempo después de la transfección. Por ejemplo, las células se pueden transfectar con diferentes ácidos nucleicos de ingeniería del sitio de unión de microARN o ARNm y mediante el uso de un kit ELISA para la proteína relevante y el análisis de la proteína producida a las 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h y 7 días. posttransfección.Experimentos in vivo también pueden ser realizados utilizando moléculas diseñadas en el sitio de unión de microARN para examinar los cambios en la expresión específica de tejido de ácidos nucleicos modificados formulados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos.
Ejemplos no limitantes de líneas celulares que pueden ser útiles en estas investigaciones incluyen las de ATCC (Manassas, VA) incluyendo MRC-5, A549, T84, NCI-H2126 [H2126], NCI-H1688 [H1688], WI-38, WI-38 VA-13 sublínea 2RA, WI-26 VA4, C3A [HepG2/C3A, derivada de Hep G2 (ATCC HB-8065)], THLE-3, H69AR, NCI-H292 [H292], CFPAC-1, NTERA-2 cl.D1 [NT2/D1], DMS 79, DMS 53, DMS 153, DMS 114, MSTO-211H, SW 1573 [SW-1573, SW1573], SW 1271 [SW-1271, SW1271], SHP-77, SNU-398, SNU-449, SNU-182, SNU-475, SNU-387, SNU-423, NL20, NL20-TA [NL20T-A], THLE-2, HBE135-E6E7, HCC827, HCC4006, NCI-H23 [H23], NCI-H1299, NCI-H187 [H187], NCI-H358 [H-358, H358], NCI-H378 [H378], NCI-H522 [H522], NCI-H526 [H526], NCI-H727 [H727], NCI-H810 [H810], NCI-H889 [H889], NCI-H1155 [H1155], NCI-H1404 [H1404], NCI-N87 [N87], NCI-H196 [H196], NCI-H211 [H211], NCI-H220 [H220], NCI-H250 [H250], NCI-H524 [H524], NCI-H647 [H647], NCI-H650 [H650], NCI-H711 [H711], NCI-H719 [H719], NCI-H740 [H740], NCI-H748 [H748], NCI-H774 [H774], NCI-H838 [H838], NCI-H841 [H841], NCI-H847 [H847], NCI-H865 [H865], NCI-H920 [H920], NCI-H1048 [H1048], NCI-H1092 [H1092], NCI-H1105 [H1105], NCI-H1184 [H1184], NCI-H1238 [H1238], NCI-H1341 [H1341], NCI-H1385 [H1385], NCI-H1417 [H1417], NCI-H1435 [H1435], NCI-H1436 [H1436], NCI-H1437 [H1437], NCI-H1522 [H1522], NCI-H1563 [H1563], NCI-H1568 [H1568], NCI-H1573 [H1573], NCI-H1581 [H1581], NCI-H1618 [H1618], NCI-H1623 [H1623], NCI-H1650 [H-1650, H1650], NCI-H1651 [H1651], NCI-H1666 [H-1666, H1666], NCI-H1672 [H1672], NCI-H1693 [H1693], NCI-H1694 [H1694], NCI-H1703 [H1703], NCI-H1734 [H-1734, H1734], NCI-H1755 [H1755], NCI-H1755 [H1755], NCI-H1770 [H1770], NCI-H1793 [H1793], NCI-H1836 [H1836], NCI-H1838 [H1838], NCI-H1869 [H1869], NCI-H1876 [H1876], NCI-H1882 [H1882], NCI-H1915 [H1915], NCI-H1930 [H1930], NCI-H1944 [H1944], NCI-H1975 [H-1975, H1975], NCI-H1993 [H1993], NCI-H2023 [H2023], NCI-H2029 [H2029], NCI-H2030 [H2030], NCI-H2066 [H2066], NCI-H2073 [H2073], NCI-H2081 [H2081], NCI-H2085 [H2085], NCI-H2087 [H2087], NCI-H2106 [H2106], NCI-H2110 [H2110], NCI-H2135 [H2135], NCI-H2141 [H2141], NCI-H2171 [H2171], NCI-H2172 [H2172], NCI-H2195 [H2195], NCI-H2196 [H2196], NCI-H2198 [H2198], NCI-H2227 [H2227], NCI-H2228 [H2228], NCI-H2286 [H2286], NCI-H2291 [H2291], NCI-H2330 [H2330], NCI-H2342 [H2342], NCI-H2347 [H2347], NCI-H2405 [H2405], NCI-H2444 [H2444], UMC-11, NCI-H64 [H64], NCI-H735 [H735], NCI-H735 [H735], NCI-H1963 [H1963], NCI-H2107 [H2107], NCI-H2108 [H2108], NCI-H2122 [H2122], Hs 573.T, Hs573.Lu, PLC/PRF/5, BEAS-2B, Hep G2, Tera-1, Tera-2, NCI-H69 [H69], NCI-H128 [H128], ChaGo-K-1, NCI-H446 [H446], NCI-H209 [H209], NCI-H146 [H146], NCI-H441 [H441], NCI-H82 [H82], NCI-H460 [H460], NCI-H596 [H596], NCI-H676B [H676B], NCI-H345 [H345], NCI-H820 [H820], NCI-H520 [H520], NCI-H661 [H661], NCI-H510A [H510A, NCI-H510], SK-HEP-1, A-427, Calu-1, Calu-3, Calu-6, SK-LU-1, SK-MES-1, SW 900 [SW-900, SW900], Malme-3M, y Capan-1.
En algunos casos, el ARN mensajero modificado se puede diseñar para incorporar sitios de región de unión de microARN que tienen una identidad del 100 % con las secuencias de semillas conocidas o una identidad de menos del 100 % con las secuencias de semillas. La secuencia semilla se puede mutar parcialmente para disminuir la afinidad de unión del microARN y, como tal, dar como resultado una modulación descendente reducida de ese transcrito de ARNm. En esencia, el grado de coincidencia o discrepancia entre el ARNm diana y la semilla de microARN puede actuar como un reóstato para ajustar más finamente la capacidad del microARN para modular la expresión de proteínas. Además, la mutación en la región que no es semilla de un sitio de unión de microARN también puede afectar la capacidad de un microARN para modular la expresión de proteínas.
En un caso, se puede incorporar una secuencia de miR en el bucle de una horquilla.
En otro caso, se puede incorporar una secuencia semilla de miR en el bucle de una horquilla y se puede incorporar un sitio de unión de miR en el tallo 5' o 3' de la horquilla.
En un caso, se puede incorporar un TEE en el extremo 5' del tallo de una horquilla y se puede incorporar una semilla miR en el tallo de la horquilla. En otro caso, se puede incorporar un TEE en el extremo 5' del tallo de una horquilla, se puede incorporar una semilla de miR en el tallo de la horquilla y se puede incorporar un sitio de unión de miR en el extremo 3' del tallo o la secuencia después de la horquilla. La semilla de miR y el sitio de unión de miR pueden ser para el mismo y/o diferentes secuencias de miR.
En un caso, la incorporación de una secuencia miR y/o una secuencia TEE cambia la forma de la región de horquilla que puede aumentar y/o disminuir la traducción. (ver p.ej, Kedde y col. A Pumilio-induced RNA structure switch in p27-3'UTR controls miR-221 and miR-22 accessibility. Nature Cell Biology. 2010).
En un caso, la incorporación de una secuencia miR y/o una secuencia TEE cambia la forma de la región de horquilla que puede aumentar y/o disminuir la traducción. (ver p.ej, Kedde y col. A Pumilio-induced RNA structure switch in p27-3'UTR controls miR-221 and miR-22 accessibility. Nature Cell Biology. 2010).
En un caso, la 5'UTR puede comprender al menos una secuencia de microARN. La secuencia de microARN puede ser, pero no se limita a, una secuencia de 19 o 22 nucleótidos y/o una secuencia de microARN sin la semilla.
En un caso, la secuencia de microARN en la 5'UTR puede usarse para estabilizar el ácido nucleico y/o ARNm descrito en esta invención.
En otro caso, se puede usar una secuencia de microARN en la 5'UTR para disminuir la accesibilidad del sitio de iniciación de la traducción tal como, pero sin limitarse a, un codón de inicio.Matsuda y col (PLoS One. 2010 11(5):e15057) utilizaron oligonucleótidos de ácido nucleico bloqueado antisentido (LNA) y complejos exón-junctino (EJC) alrededor de un codón de inicio (-4 a 37 donde la A de los codones AUG es 1) para disminuir la accesibilidad al primer codón de inicio (AUG). Matsuda demostró que la alteración de la secuencia alrededor del codón de inicio con un LNA o EJC afecta la eficiencia, la longitud y la estabilidad estructural del ácido nucleico o del ARNm. Los ácidos nucleicos o ARNm de la presente descripción pueden comprender una secuencia de microARN, en lugar de la secuencia LNA o EJC descrita por Matsuda y col, cerca del sitio de inicio de la traducción para disminuir la accesibilidad al sitio de inicio de la traducción. El sitio de iniciación de la traducción puede ser anterior, posterior o dentro de la secuencia de microARN. Como ejemplo no limitante, el sitio de iniciación de la traducción puede estar ubicado dentro de una secuencia de microARN tal como una secuencia semilla o un sitio de unión. Como otro ejemplo no limitante, el sitio de iniciación de la traducción puede ubicarse dentro de una secuencia de miR-122 tal como la secuencia semilla o el sitio de unión de mir-122.
En un caso, los ácidos nucleicos o el ARNm de la presente descripción pueden incluir al menos un microARN para amortiguar la presentación de antígenos por parte de las células presentadoras de antígenos. El microARN puede ser la secuencia de microARN completa, la secuencia semilla de microARN, la secuencia de microARN sin la semilla o una combinación de las mismas. Como ejemplo no limitativo, el microARN incorporado en los ácidos nucleicos o el ARNm de la presente descripción puede ser específico del sistema hematopoyético. Como otro ejemplo no limitativo, el microARN incorporado en los ácidos nucleicos o ARNm de la presente descripción para amortiguar la presentación de antígenos es miR-142-3p.
En un caso, los ácidos nucleicos o el ARNm de la presente divulgación pueden incluir al menos un microARN para amortiguar la expresión del polipéptido codificado en una célula de interés. Como ejemplo no limitante, los ácidos nucleicos o el ARNm de la presente descripción pueden incluir al menos un sitio de unión de miR-122 para amortiguar la expresión de un polipéptido codificado de interés en el hígado. Como otro ejemplo no limitante, los ácidos nucleicos o ARNm de la presente descripción pueden incluir al menos un sitio de unión de miR-142-3p, secuencia semilla de miR-142-3p, sitio de unión de miR-142-3p sin la semilla, miR- Sitio de unión de 142-5p, secuencia de semilla de miR-142-5p, sitio de unión de miR-142-5p sin la semilla, sitio de unión de miR-146, secuencia de semilla de miR-146 y/o Sitio de unión de miR-146 sin la secuencia semilla (ver, por ejemplo, el experimento descrito en los Ejemplos 24, 25, 26, 26, 36 y 48).
En un caso, los ácidos nucleicos o el ARNm de la presente divulgación pueden comprender al menos un sitio de unión de microARN en la 3'UTR para degradar selectivamente las terapias de ARNm en las células inmunitarias para someter reacciones inmunogénicas no deseadas provocadas por la administración terapéutica. Como ejemplo no limitativo, el sitio de unión del microARN pueden ser los ácidos nucleicos modificados más inestables en las células presentadoras de antígenos. Los ejemplos no limitativos de estos microARN incluyen mir-142-5p, mir-142-3p, mir-146a-5p y mir-146-3p.
En un caso, los ácidos nucleicos o ARNm de la presente descripción comprenden al menos una secuencia de microARN en una región del ácido nucleico o ARNm que puede interactuar con una proteína de unión a ARN.
Motivos de ARN para proteínas de unión a ARN (RBP)
Las proteínas de unión a ARN (RBP) pueden regular numerosos aspectos de la expresión génica co- y post­ transcripción, como, entre otros, el empalme, la localización, la traducción, el recambio, la poliadenilación, la protección, la modificación, la exportación y la localización del ARN. Los dominios de unión a ARN (RBD), como, entre otros, el motivo de reconocimiento de ARN (RR) y los dominios de homología K (KH) de hnRNP, normalmente regulan la asociación de secuencias entre las RBP y sus dianas de ARN (Ray y col. Nature 2013. 499:172-177). En un caso, los RBD canónicos pueden unirse a secuencias cortas de ARN. En otro caso, los RBD canónicos pueden reconocer ARN de estructura.
En la Tabla 26 del Ejemplo 23 se muestran ejemplos no limitativos de proteínas de unión a ARN y secuencias de proteínas y ácidos nucleicos relacionadas.
En un caso, para aumentar la estabilidad del ARNm de interés, se puede cotransfectar o inyectar conjuntamente un ARNm que codifica HuR junto con el ARNm de interés en las células o en el tejido. Estas proteínas también pueden unirse al ARNm de interés in vitro y a continuación administrarse juntas a las células. La proteína de unión a la cola poli A, PABP, interactúa con el factor de iniciación de la traducción eucariota eIF4G para estimular la iniciación de la traducción. Co-administración de ARNm que codifican estas prácticas comerciales restrictivas junto con el fármaco de ARNm y/o unir estas proteínas al fármaco de ARNm in vitro y administrar el ARNm unido a proteínas en las células puede aumentar la eficiencia de traducción del ARNm. El mismo concepto se puede extender a la co-administración de ARNm junto con ARNm que codifican diversos factores y facilitadores de la traducción, así como con las propias proteínas para influir en la estabilidad del ARN y/o eficiencia traslacional.
En un caso, los ácidos nucleicos y/o el ARNm puede comprender al menos un motivo de unión a ARN tal como, pero sin limitación, un dominio de unión a ARN (RBD).
En un caso, el RBD puede ser cualquiera de los RBD, fragmentos o variantes del mismo descritos por Ray y col. (Nature 2013. 499:172-177).
En un caso, los ácidos nucleicos o el ARNm de la presente descripción pueden comprender una secuencia para al menos un dominio de unión a ARN (RBD). Cuando los ácidos nucleicos o el ARNm de la presente descripción comprenden más de un RBD, no es necesario que los RBD sean de la misma especie o incluso de la misma clase estructural.
En un caso, al menos una región flanqueante (p. ej., la 5'UTR y/o la 3'UTR) puede comprender al menos un RBD. En otro caso, la primera región flanqueante y la segunda región flanqueante pueden comprender ambas al menos un RBD. El RBD puede ser el mismo o cada uno de los RBD puede tener al menos un 60 % de identidad de secuencia con el otro RBD. Como ejemplo no limitativo, al menos en RBD se puede ubicar antes, después y/o dentro de la 3'UTR del ácido nucleico o ARNm de la presente divulgación. Como otro ejemplo no limitante, al menos un RBD puede ubicarse antes o dentro de los primeros 300 nucleósidos de la 3'UTR.
En otro caso, los ácidos nucleicos y/o el ARNm de la presente divulgación puede comprender al menos un RBD en la primera región de nucleósidos enlazados. El RBD puede estar ubicado antes, después o dentro de una región de codificación (por ejemplo, la ORF).
En otro caso más, la primera región de nucleósidos enlazados y/o al menos una región flanqueante puede comprender al menos un RBD. Como ejemplo no limitante, la primera región de nucleósidos enlazados puede comprender un RBD relacionado con factores de corte y empalme y al menos una región flanqueante puede comprender un RBD para la estabilidad. y/o factores de traducción.
En un caso, los ácidos nucleicos y/o el ARNm de la presente divulgación puede comprender al menos un RBD ubicado en una codificación y/o región no codificante de los ácidos nucleicos y/o ARNm.
En un caso, se puede incorporar al menos un RBD en al menos una región flanqueante para aumentar la estabilidad del ácido nucleico y/o ARNm de la presente descripción.
En un caso, se puede usar una secuencia de microARN en un motivo de proteína de unión a ARN para disminuir la accesibilidad del sitio de iniciación de la traducción como, entre otros, un codón de inicio. Los ácidos nucleicos o ARNm de la presente descripción pueden comprender una secuencia de microARN, en lugar de la secuencia LNA o EJC descrita por Matsuda y col, cerca del sitio de inicio de la traducción para disminuir la accesibilidad al sitio de inicio de la traducción. El sitio de iniciación de la traducción puede ser anterior, posterior o dentro de la secuencia de microARN. Como ejemplo no limitante, el sitio de iniciación de la traducción puede estar ubicado dentro de una secuencia de microARN tal como una secuencia semilla o un sitio de unión. Como otro ejemplo no limitante, el sitio de iniciación de la traducción puede ubicarse dentro de una secuencia de miR-122 tal como la secuencia semilla o el sitio de unión de mir-122.
En otro caso, se pueden usar oligonucleótidos de ácido nucleico bloqueado antisentido (LNA) y complejos exonjunctino (EJC) en el motivo de la proteína de unión al ARN. El LNA y los EJC pueden usarse alrededor de un codón de inicio (-4 a 37 donde la A de los codones AUG es 1) para disminuir la accesibilidad al primer codón de inicio (AUG).
Otros elementos reguladores en 3'UTR
Además de los sitios de unión de microARN, otras secuencias reguladoras en la 3'-UTR del ARNm natural, que regulan la estabilidad y la traducción del ARNm en diferentes tejidos y células, pueden eliminarse o introducirse en el ARN mensajero modificado. Dichos elementos reguladores en cis pueden incluir, entre otros, Cis-RNP (Ribonucleoproteina)/RBP (proteína de unión a ARN) elementos reguladores, elemento rico en AU (AUE), horquilla estructurada, elementos de descomposición constitutivos (CDE), riqueza en GC y otros motivos estructurados de ARNm (Parker BJ y col., Genome Research, 2011, 21, 1929-1943). Por ejemplo, los CDE son una clase de motivos reguladores que median la degradación del ARNm a través de su interacción con las proteínas Roquin. En particular, los CDE se encuentran en muchos ARNm que codifican reguladores del desarrollo y la inflamación para limitar la producción de citocinas en los macrófagos (Leppek K y col., 2013, Cell, 153, 869-881).
En un caso, se puede introducir un CDE particular en los ácidos nucleicos o el ARNm cuando se desea la degradación de polipéptidos en una célula o tejido. También se puede eliminar un CDE particular de los ácidos nucleicos o del ARNm para mantener un ARNm más estable en una célula o tejido para sostener la expresión de proteínas.
ARNm auxotrófico
En un caso, los ácidos nucleicos o el ARNm de la presente divulgación pueden ser auxotróficos. Como se usa en esta invención, el término "auxotrófico" se refiere a ARNm que comprende al menos una característica que desencadena, facilita o induce la degradación o inactivación del ARNm en respuesta a señales espaciales o temporales tales que la expresión de proteínas se impide o reduce sustancialmente. Dichas señales espaciales o temporales incluyen la ubicación del ARNm que se va a traducir, como un tejido u órgano particular o un entorno celular. También se contemplan señales que implican temperatura, pH, fuerza iónica, contenido de humedad y similares.
En un caso, la característica se ubica en una región terminal de los ácidos nucleicos o ARNm de la presente descripción. Como ejemplo no limitativo, el ARNm auxotrófico puede contener un sitio de unión de miR en la región terminal que se une a un miR expresado en un tejido seleccionado de manera que la expresión del ARNm auxotrófico se impide o reduce sustancialmente en el tejido seleccionado. Con este fin y por ejemplo, un ARNm auxotrófico que contiene un sitio de unión de miR-122 no producirá proteína si se localiza en el hígado ya que miR-122 se expresa en el hígado y la unión de miR efectuaría la destrucción del ARNm auxotrófico. Como ejemplo no limitante, las células HEK293 no expresan miR-122, por lo que habría poca o ninguna regulación a la baja de un ácido nucleico o ARNm de la presente divulgación que tenga una secuencia de miR-122 en HEK293, pero para los hepatocitos que expresan miR-122. habría una regulación a la baja de un ácido nucleico o ARNm de la presente descripción que tiene una secuencia de miR-122 en los hepatocitos (véase, por ejemplo, el estudio descrito en el Ejemplo 14). Como otro ejemplo no limitante, el nivel de miR-122 puede medirse en células HeLa, hepatocitos humanos primarios y hepatocitos de rata primarios antes de la administración con un ácido nucleico o ARNm de la presente divulgación que codifica al menos un sitio de unión de miR-122, miR -122 sitio de unión sin la secuencia semilla o un sitio de unión de miR-122 Después de la administración, se puede medir la expresión del ácido nucleico modificado con una secuencia de microARN para determinar el efecto amortiguador del miR-122 en el ácido nucleico modificado (ver, por ejemplo, los estudios descritos en los Ejemplos 28, 29, 30, 35, 45, 46 y 47). Como otro ejemplo no limitativo más, se puede evaluar la eficacia del sitio de unión de miR-122, la semilla de miR-122 o el sitio de unión de miR-122 sin la semilla en diferentes 3'UTR para determinar la UTR adecuada para el deseado. resultado tal como, pero no limitado a, el mayor efecto amortiguador (ver, por ejemplo, el estudio descrito en los Ejemplos 35 y 46).
En un caso, la degradación o inactivación del ARNm auxotrófico puede comprender una característica que responde a un cambio en el pH. Como ejemplo no limitativo, el ARNm auxotrófico puede activarse en un entorno que tenga un pH de entre 4,5 y 8,0, como un pH de 5,0 a 6,0 o un pH de 6,0 a 6,5. El cambio de pH puede ser un cambio de 0,1 unidades, 0,2 unidades, 0,3 unidades, 0,4 unidades, 0,5 unidades, 0,6 unidades, 0,7 unidades, 0,8 unidades, 0,9 unidades, 1,0 unidades, 1,1 unidades, 1,2 unidades, 1,3 unidades, 1,4 unidades , 1,5 unidades, 1,6 unidades, 1,7 unidades, 1,8 unidades, 1,9 unidades, 2,0 unidades, 2,1 unidades, 2,2 unidades, 2,3 unidades, 2,4 unidades, 2,5 unidades, 2,6 unidades, 2,7 unidades, 2,8 unidades, 2,9 unidades, 3,0 unidades, 3,1 unidades, 3,2 unidades, 3,3 unidades, 3,4 unidades, 3,5 unidades, 3,6 unidades, 3,7 unidades, 3,8 unidades, 3,9 unidades, 4,0 unidades o más.
En otro caso, la degradación o inactivación del ARNm auxotrófico puede desencadenarse o inducirse por cambios de temperatura. Como ejemplo no limitativo, un cambio de temperatura desde la temperatura ambiente a la temperatura corporal. El cambio de temperatura puede ser inferior a 1 °C, inferior a 5 °C, inferior a 10 °C, inferior a 15 °C, inferior a 20 °C, inferior a 25 °C o superior a 25 °C.
En otro caso más, la degradación o inactivación del ARNm auxotrófico puede desencadenarse o inducirse mediante un cambio en los niveles de iones en el sujeto. Los iones pueden ser cationes o aniones tales como, entre otros, iones de sodio, iones de potasio, iones de cloruro, iones de calcio, iones de magnesio e/o iones de fosfato.
3' UTR y los elementos ricos en AU
Se sabe que las UTR 3' naturales o de tipo salvaje tienen tramos de adenosinas y uridinas incrustadas en ellas. Estas firmas ricas en AU son particularmente frecuentes en genes con altas tasas de rotación. Según sus características de secuencia y propiedades funcionales, los elementos ricos en AU (ARE - AU Rich Elements) se pueden separar en tres clases (Chen y col, 1995): Los ARE de clase I contienen varias copias dispersas de un motivo AUUUA dentro de regiones ricas en U. C-Myc y MyoD contienen ARE de clase I. Los ARE de Clase II poseen dos o más nonámeros UUAUUUA(U/A)(U/A) que se solapan. Las moléculas que contienen este tipo de ARE incluyen GM-CSF y TNF-a. Los ARES de clase III están menos definidos. Estas regiones ricas en U no contienen un motivo AUUUA. c-Jun y Myogenin son dos ejemplos bien estudiados de esta clase. Se sabe que la mayoría de las proteínas que se unen a los ARE desestabilizan al mensajero, mientras que se ha documentado que los miembros de la familia ELAV, sobre todo HuR, aumentan la estabilidad del ARNm. HuR se une a los ARE de las tres clases. La ingeniería de los sitios de unión específicos de HuR en la UTR 3' de las moléculas de ácido nucleico conducirá a la unión de HuR y, por lo tanto, a la estabilización del mensaje in vivo.
La introducción, eliminación o modificación de elementos ricos en AU (ARE) de UTR 3' se puede usar para modular la estabilidad de polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la divulgación. Cuando se manipulan ácidos nucleicos o ARNm específicos, se pueden introducir una o más copias de un ARE para hacer que los ácidos nucleicos o el ARNm de la divulgación sean menos estables y, por lo tanto, restringir la traducción y disminuir la producción de la proteína resultante. Asimismo, los ARE se pueden identificar y eliminar o mutar para aumentar la estabilidad intracelular y así aumentar la traducción y producción de la proteína resultante. Experimentos de transfección se pueden realizar en líneas celulares relevantes, usando polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la divulgación y la producción de proteínas se puede ensayar en varios puntos de tiempo después de la transfección. Por ejemplo, las células se pueden transfectar con diferentes moléculas de ingeniería de ARE y usando un kit ELISA para la proteína relevante y la proteína de ensayo producida a las 6 h, 12 h, 24 h, 48 h y 7 días después de la transfección.
3' UTR y triples hélices
En un caso, los ácidos nucleicos de la presente divulgación pueden incluir una triple hélice en el extremo 3' del ácido nucleico modificado, ARN modificado mejorado o ácido ribonucleico. El extremo 3' de los ácidos nucleicos de la presente divulgación puede incluir una triple hélice sola o en combinación con una cola Poly-A.
En un caso, el ácido nucleico de la presente divulgación puede comprender al menos una primera y una segunda región rica en U, una región de bucle de tallo conservada entre la primera y la segunda región y una región rica en A. La primera y segunda región rica en U y la región rica en A pueden asociarse para formar una triple hélice en el extremo 3' del ácido nucleico. Esta triple hélice puede estabilizar el ácido nucleico, mejorar la eficiencia de traducción del ácido nucleico y/o proteger el extremo 3' de la degradación. Ejemplos de triples hélices incluyen, pero no se limitan a, la secuencia de triple hélice del transcrito 1 de adenocarcinoma de pulmón asociado a metástasis (MALAT1), MEN-p y ARN nuclear poliadenilado (PAN) (véase Wilusz y col., Genes & Development 201226:2392-2407). En un caso, el extremo 3' de los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la presente divulgación comprende una primera región rica en U que comprende TTTTTCTTTT (SEQ ID NO: 1), una segunda región rica en U que comprende TTTTGCTTTTT ( SEQ ID n O: 2) o TTTTGCTTTT (SEQ ID NO: 3), una región rica en A que comprende AAAAAGCAAAA (SEQ ID NO: 4). En otro caso, el extremo 3' de los ácidos nucleicos de la presente divulgación comprende una estructura de formación de triple hélice que comprende una primera región rica en U, una región conservada, una segunda región rica en U y una región rica en A.
En un caso, la triple hélice puede formarse a partir de la escisión de una secuencia MALAT1 antes de la estructura de hoja de trébol. Si bien no pretende limitarse a la teoría, MALAT1 es un ARN largo no codificante que, cuando se escinde, forma una triple hélice y una estructura de hoja de trébol similar al ARNt. La transcripción de MALAT1 a continuación se localiza en motas nucleares y la hoja de trébol similar a ARNt se localiza en el citoplasma (Wilusz y col. Cell 2008 135(5): 919-932).
Como ejemplo no limitativo, el extremo terminal del ácido nucleico de la presente descripción que comprende la secuencia MALAT1 puede formar una estructura de triple hélice, después de la escisión de la estructura de hoja de trébol por parte de la RNasaP, que estabiliza el ácido nucleico (Peart y col. Non-mRNA 3' end formation: how the other half lives; WIREs RNA 2013).
En un caso, los ácidos nucleicos o el ARNm descritos en esta invención comprenden una secuencia de MALAT1. En otro caso, los ácidos nucleicos o el ARNm pueden estar poliadenilados. En otro caso más, los ácidos nucleicos o el ARNm no están poliadenilados pero tienen una mayor resistencia a la degradación en comparación con los ácidos nucleicos o el ARNm no modificados.
En un caso, los ácidos nucleicos de la presente divulgación pueden comprender una secuencia MALAT 1 en la segunda región flanqueante (p. ej., la 3'UTR). Como ejemplo no limitativo, la secuencia de MALAT1 puede ser humana o de ratón (véanse, por ejemplo, los polinucleótidos descritos en la Tabla 37 en el Ejemplo 38).
En otro caso, la estructura de hoja de trébol de la secuencia MALAT1 también puede ser procesada por RNaseZ y CCA agregando enzima para formar una estructura similar a ARNt llamada mascARN (ARN citoplasmático pequeño asociado a MALAT1). Como ejemplo no limitativo, el mascARN puede codificar una proteína o un fragmento de la misma. y/o puede comprender una secuencia de microARN. El mascARN puede comprender al menos una modificación química descrita en esta invención.
Horquilla (Steem Loop)
En un caso, los ácidos nucleicos de la presente divulgación pueden incluir una horquilla tal como, pero sin limitación, una horquilla de histona. La horquilla puede ser una secuencia de nucleótidos que tiene una longitud de aproximadamente 25 o aproximadamente 26 nucleótidos, tal como, entre otros, SEQ ID NO: 7-17 como se describe en la Publicación de Patente Internacional N°. WO2013103659. La horquilla de histona puede ubicarse en 3' con respecto a la región de codificación (p. ej., en el extremo 3' de la región de codificación). Como ejemplo no limitativo, la horquilla puede ubicarse en el extremo 3' de un ácido nucleico descrito en esta invención.
En un caso, la horquilla puede estar ubicada en la segunda región terminal. Como ejemplo no limitativo, la horquilla puede ubicarse dentro de una región no traducida (p. ej., 3'UTR) en la segunda región terminal.
En un caso, el ácido nucleico tal como, pero sin limitación, el ARNm, que comprende la horquilla de la histona, puede estabilizarse mediante la adición de al menos un nucleósido que termina la cadena. Sin desear estar ligado a la teoría, la adición de al menos un nucleósido que termina la cadena puede retardar la degradación de un ácido nucleico y, por lo tanto, puede aumentar la vida media del ácido nucleico.
En un caso, el nucleósido que termina la cadena puede ser, pero no se limita a, los descritos en la Publicación de Patente Internacional N°. WO2013103659. En otro caso, los nucleósidos que terminan la cadena que se pueden usar con la presente descripción incluyen, entre otros, 3'-desoxiadenosina (cordicepina), 3'-desoxiuridina, 3'-desoxicitosina, 3'-desoxiguanosina, 3'- desoxitimina, 2',3'-didesoxinucleósidos, tales como 2',3'-dideoxiadenosina, 2',3'-didesoxiuridina, 2',3'-didesoxicitosina, 2',3'-didesoxiguanosina, 2',3'- didesoxitimina, un 2'-desoxinucleósido o un -O-metilnucleósido.
En otro caso, el ácido nucleico tal como, entre otros, el ARNm, que comprende la de la histona, puede estabilizarse mediante una modificación en la región 3' del ácido nucleico que puede impedir y/o inhibir la adición de oligo(U) (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente Internacional N° WO2013103659).
En otro caso más, el ácido nucleico tal como, entre otros, el ARNm, que comprende la horquilla de la histona, puede estabilizarse mediante la adición de un oligonucleótido que termina en un 3'-desoxinucleósido, 2',3'-didesoxinucleósido 3'-0- metilnucleósidos, 3'-0-etilnucleósidos, 3'-arabinósidos y otros nucleósidos modificados conocidos en la técnica y/o descritos en esta invención.
En un caso, los ácidos nucleicos de la presente divulgación pueden incluir una horquilla de histona, una secuencia de cola poliA y/o una estructura de 5'cap. La horquilla de la histona puede estar antes y/o después de la secuencia de la cola poliA. Los ácidos nucleicos que comprenden la horquilla de histona y una secuencia de cola de poliA pueden incluir un nucleósido de terminación de cadena descrito en esta invención.
En otro caso, los ácidos nucleicos de la presente descripción pueden incluir una horquilla de histona y una estructura 5'cap. La estructura 5'cap puede incluir, entre otras, las descritas en esta invención. y/o conocido en la técnica.
En un caso, la región de la horquilla conservada puede comprender una secuencia miR descrita en esta invención. Como ejemplo no limitante, la región de horquilla puede comprender la secuencia semilla de una secuencia miR descrita en esta invención. En otro ejemplo no limitativo, la región de horquilla puede comprender una secuencia semilla de miR-122.
En otro caso, la región de horquilla conservada puede comprender una secuencia miR descrita en esta invención y también puede incluir una secuencia TEE.
En un caso, la incorporación de una secuencia miR y/o una secuencia TEE cambia la forma de la región de horquilla que puede aumentar y/o disminuir la traducción. (ver p.ej, Kedde y col. A Pumilio-induced RNA structure switch in p27-3'UTR controls miR-221 and miR-22 accessibility. Nature Cell Biology. 2010).
En un caso, los ácidos nucleicos modificados descritos en esta invención pueden comprender al menos una horquilla de histona y una secuencia poliA o señal de poliadenilación. Ejemplos no limitativos de secuencias de ácido nucleico que codifican al menos una horquilla de histona y una secuencia poliA o una señal de poliadenilación se describen en la Publicación de Patente Internacional N° WO2013120497, WO2013120629, WO2013120500, WO2013120627, WO2013120498, WO2013120626, WO2013120499 y WO2013120628. En un caso, el ácido nucleico que codifica una horquilla de histona y una secuencia poliA o una señal de poliadenilación puede codificar un antígeno patógeno o un fragmento del mismo, como las secuencias de ácido nucleico descritas en la Publicación de Patente Internacional N° WO2013120499 y WO2013120628. En un caso, el ácido nucleico que codifica una horquilla de histona y una secuencia poliA o una señal de poliadenilación puede codificar una proteína terapéutica como las secuencias de ácido nucleico descritas en la Publicación de Patente Internacional N° WO2013120497 y WO2013120629. En un caso, el ácido nucleico que codifica una horquilla de histona y una secuencia poliA o una señal de poliadenilación puede codificar un antígeno patógeno o un fragmento del mismo, como las secuencias de ácido nucleico descritas en la Publicación de Patente Internacional N° WO2013120500 y WO2013120627. En otro caso, el ácido nucleico que codifica un bucle de tallo de histona y una secuencia poliA o una señal de poliadenilación puede codificar un antígeno alergénico o un autoantígeno autoinmune como las secuencias de ácido nucleico descritas en la Publicación de Patente Internacional N° WO2013120498 y WO2013120626.
Protección 5.
La estructura de caperuza 5' de un ARNm está involucrada en la exportación nuclear, aumentando la estabilidad del ARNm y se une a la proteína de unión a la caperuza del ARNm (CBP), que es responsable de la estabilidad del ARNm en la célula y la competencia de traducción a través de la asociación de CBP con poli(A) proteína de unión para formar la especie de ARNm cíclico maduro. La caperuza ayuda además a la eliminación de los intrones proximales 5' durante el empalme del ARNm.
Las moléculas de ARNm endógeno pueden estar protegidas en el extremo 5' generando un enlace 5'-ppp-5'-trifosfato entre un residuo terminal de la caperuza de guanosina y el nucleótido sentido transcrito en el extremo 5' de la molécula de ARNm. Esta caperuza de 5'-guanilato puede a continuación metilarse para generar un residuo de N7-metilguanilato. Los azúcares ribosa de los nucleótidos transcritos de extremo y/o unteextremos del extremo 5' del ARNm pueden opcionalmente estar también 2'-O-metilados 5' decapados mediante hidrólisis y escisión de la estructura de caperuza de guanilato puede alcanzar a una molécula de ácido nucleico, como una molécula de ARNm, para su degradación.
Las modificaciones de los polinucleótidos de la presente invención pueden generar una estructura de caperuza no hidrolizable que impide el decapado y, por lo tanto, aumenta la vida media del ARNm. Debido a que la hidrólisis de la estructura de la caperuza requiere la escisión de los enlaces fosforodiéster 5'-ppp-5', se pueden usar nucleótidos modificados durante la reacción de protección. Por ejemplo, se puede usar una enzima de protección Vaccinia de New England Biolabs (Ipswich, MA) con nucleótidos de a-tioguanosina según las instrucciones del fabricante para crear un enlace fosforotioato en la caperuza 5'-ppp-5'. Pueden usarse nucleótidos de guanosina modificados adicionales tales como nucleótidos de a-metil-fosfonato y selenofosfato.
Las modificaciones adicionales incluyen, pero no se limitan a, 2'-O-metilación de los azúcares ribosa de 5'-terminal y/o 5'-nucleótidos anteterminales del ARNm (como se mencionó anteriormente) en el grupo 2'-hidroxilo del anillo de azúcar. Se pueden usar múltiples estructuras de caperuza 5' distintas para generar la caperuza 5' de una molécula de ácido nucleico, tal como una molécula de ARNm.
Análogos de caperuza, que en esta invención también se denominan análogos de caperuza sintética, caperuzas químicas, análogos de caperuza química o análogos de caperuzas estructurales o funcionales, difieren de las caperuzas 5' naturales (es decir, endógenas, de tipo salvaje o fisiológicas) en su estructura química, manteniendo la función de caperuza. Análogos de caperuza pueden sintetizarse químicamente (es decir, no enzimáticamente) o enzimáticamente y/enlazados a una molécula de ácido nucleico.
Por ejemplo, la caperuza Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) (Análogo de Capa Anti-Inversa) contiene dos guaninas unidas por un grupo 5'-5'-trifosfato, donde una guanina contiene un grupo metilo N7 así como un grupo 3'-O-metilo (es decir, N7,3'-O-dimetil-guanosina-5'-trifosfato-5'-guanosina (m7G-3'mppp-G; que puede denominarse equivalentemente 3' O-m7G(5')ppp(5')G). El átomo 3'-O de la otra guanina, no modificada, se une al nucleótido terminal 5' de la molécula de ácido nucleico protegida (por ejemplo, un ARNm o un ARNmm). La guanina N7- y 3'-O-metilizada proporciona el resto terminal de la molécula de ácido nucleico protegida (por ejemplo, ARNm o ARNmm).
Otra caperuza ejemplar es mCAP, que es similar a ARCA pero tiene un grupo 2'-O-metilo en la guanosina (es decir, N7,2'-O-dimetil-guanosina-5'-trifosfato-5'-guanosina, m7Gm-ppp-G).
En una realización, la caperuza es un análogo de caperuza de dinucleótido. Como ejemplo no limitativo, el análogo de la caperuza de dinucleótidos puede modificarse en diferentes posiciones de fosfato con un grupo boranofosfato o un grupo fosforoselenoato, como los análogos de caperuza de dinucleótidos descritos en la patente de EE.UU. N° US 8.519.110,
En otra realización, la caperuza es un análogo de la caperuza que es una forma de dicucleótido N7-(4-clorofenoxietil) sustituido de un análogo de caperuza conocido en la técnica y/o descrito en esta invención. Ejemplos no limitantes de una forma de dinucleótido sustituido con N7-(4-clorofenoxietilo) de un análogo de caperuza incluyen un N7- (4-clorofenoxietil) -G (5') ppp (5') G y un N7-(4-clorofenoxietilo)-m3 '-°G (5') ppp (5') G análogo de caperuza (Véase, por ejemplo, los diversos análogos de caperuza y los procedimientos de síntesis de análogos de caperuza descritos en Kore y col. Bioorganic & Medicinal Chemistry 2013 21:4570-4574). En otro caso, un análogo de caperuza de la presente divulgación es un análogo de 4-cloro/bromofenoxietilo.
Mientras los análogos de caperuza permiten la protección concomitante de una molécula de ácido nucleico en una reacción de transcripción in vitro, hasta el 20 % de las transcripciones permanecen sin protección. Esto, así como las diferencias estructurales de un análogo de caperuza de las estructuras endógenas de la caperuza 5' de los ácidos nucleicos producidas por la maquinaria de transcripción celular endógena, pueden conducir a una competencia de traducción reducida y una estabilidad celular reducida.
Los polinucleótidos, las construcciones primarias y el ARNmm de la divulgación también pueden bloquearse postranscripcionalmente, utilizando enzimas, para generar estructuras de caperuza 5' más auténticas. Tal como se usa en esta invención, la frase "más auténtico" se refiere a una característica que refleja o imita, estructural o funcionalmente, una característica endógena o de tipo salvaje. Es decir, una característica "más auténtica" es mejor representativa de una función y/o estructura celular endógena, de tipo silvestre, natural o fisiológica en comparación con características sintéticas o análogas, etc., de la técnica anterior, o que supera a la característica endógena, de tipo silvestre, natural, o fisiológica correspondiente en uno o más aspectos. Ejemplos no limitantes de estructuras de capa 5' más auténticas de la presente divulgación son aquellas que, entre otras cosas, tienen una unión mejorada de las proteínas de unión a la capa, una vida media aumentada, una susceptibilidad reducida a las endonucleasas 5' y/o decapado 5' reducido, en comparación con las estructuras de capa 5' sintéticas conocidas en la técnica (o con una estructura de capa 5' de tipo silvestre, natural, o fisiológica). Por ejemplo, la enzima recombinante de protección contra el virus Vaccinia y la enzima 2'-O-metiltransferasa recombinante pueden crear un enlace 5'-5'-trifosfato canónico entre el nucleótido 5'-terminal de un ARNm y un nucleótido de caperuza de guanina donde la caperuza de guanina contiene una metilación de N7 y el nucleótido 5'-terminal del ARNm contiene un 2'-O-metilo. Esta estructura se denomina estructura Cap1. Esta caperuza da como resultado una mayor competencia traduccional y estabilidad celular y una activación reducida de citocinas proinflamatorias celulares, en comparación, por ejemplo, con otras estructuras análogas de 5'cap conocidas en la técnica. Las estructuras de caperuza incluyen 7mG(5')ppp(5')N,pN2p (cap 0), 7mG(5')ppp(5')NlmpNp (cap 1), 7mG(5')-ppp(5')NlmpN2mp (cap 2) y m(7)Gpppm(3)(6,6,2')Apm(2')Apm(2')Cpm(2)(3,2')Up (cap 4).
Debido a que los ácidos nucleicos modificados se pueden proteger después de la transcripción, y debido a que este procedimiento es más eficiente, casi el 100 % de los ácidos nucleicos modificados se pueden proteger. Esto contrasta con ~80 % cuando un análogo de caperuza se une a un ARNm en el curso de una reacción de transcripción in vitro.
Según la presente divulgación, las caperuzas terminales 5' pueden incluir caperuzas endógenas o análogos de caperuzas. Según la presente divulgación, una caperuza terminal 5' puede comprender un análogo de guanina. Análogos de guanina útiles incluyen inosina, N1-metil-guanosina, 2'fluoro-guanosina, 7-deaza-guanosina, 8-oxoguanosina, 2-amino-guanosina, LNA-guanosina y 2-azido-guanosina.
En un caso, los ácidos nucleicos descritos en esta invención pueden contener una 5'cap modificada. Una modificación en 5'cap puede aumentar la estabilidad del ARNm, aumentar la vida media del ARNm y podría aumentar la eficiencia de traducción del ARNm. La 5'cap modificada puede incluir, pero no se limita a, una o más de las siguientes modificaciones: modificación en la posición 2' y/o posición 3' de un trifosfato de guanosina (GTP) protegido, un reemplazo del oxígeno del anillo de azúcar (que produjo el anillo carbocíclico) con un resto de metileno (CH2), una modificación en el resto del puente trifosfato de la estructura de la caperuza, o una modificación en el resto de nucleobase (G).
La estructura 5'cap que se puede modificar incluye, pero no se limita a, las caperuzas descritas en esta invención, como CapO que tiene la estructura de sustrato para la traducción dependiente de la caperuza de :
Figure imgf000032_0001
o Cap1 que tiene la estructura de sustrato para la traducción dependiente de cap de:
Figure imgf000032_0002
Como ejemplo no limitativo, la 5'cap modificada puede tener la estructura de sustrato para la traducción dependiente de la caperuza de:
Figure imgf000032_0003
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
donde Ri y R2 son definidos en la Tabla 1:
Tabla 1
Figure imgf000034_0002
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000036_0002
o
Figure imgf000036_0001
donde Ri y R2 se definen en la Tabla 2:
Tabla 2
Figure imgf000036_0003
Figure imgf000037_0002
En la Tabla 1, "MOM" significa metoximetilo, "MEM" significa metoxietoximetilo, "MTM" significa metiltiometilo, "BOM" significa benciloximetilo y "MP" significa monofosfonato. En las tablas 1 y 2, "F" representa flúor, "Cl" representa cloro, "Br' representa bromo y "I" representa yodo.
En un ejemplo no limitativo, la 5'cap modificada puede tener la estructura de sustrato para la enzima de protección del ARNm de Vaccinia de:
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000038_0001
Figure imgf000039_0001
donde Ri y R2 son definidos en la Tabla 3:
Tabla 3
Figure imgf000039_0002
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000041_0002
o
Figure imgf000041_0001
donde Ri y R2 se definen en la Tabla 4:
Tabla 4
Figure imgf000041_0003
En la Tabla 3, "MOM" significa metoximetilo, "MEM" significa metoxietoximetilo, "MTM" significa metiltiometilo, "BOM" significa benciloximetilo y "MP" significa monofosfonato. En las Tablas 3 y 4, "F" representa flúor, "Cl" representa cloro, "Br' representa bromo y "I" representa yodo.
En otro ejemplo no limitante, de los sustratos de estructura de protección modificada CAP-112 - CAP-225 podría agregarse en presencia de la enzima de protección de vaccinia con un componente para crear actividad enzimática tal como, pero sin limitarse a, S-adenosilmetionina (AdoMet ), para formar una caperuza modificada para el ARNm.
En un caso, la sustitución del oxígeno del anillo de azúcar (que produjo el anillo carbocíclico) con un resto de metileno (CH2) podría crear una mayor estabilidad del enlace CN contra el fósforo, ya que el enlace CN es resistente a la hidrólisis ácida o enzimática. El resto de metileno también puede aumentar la estabilidad del resto del puente trifosfato y, por lo tanto, aumentar la estabilidad del ARNm. Como un ejemplo no limitativo, la estructura del sustrato de cap para la traducción dependiente de cap puede tener la estructura como, pero sin limitarse a, CAP-014 y CAP-015 y/o la estructura del sustrato de caperuza para la enzima de caperuza de ARNm de vaccinia tal como, pero sin limitarse a, CAP-123 y CAP-124. En otro ejemplo, CAP-112 - CAP-122 y/o CAP-125 - CAP-225, se puede modificar reemplazando el oxígeno del anillo de azúcar (que produjo el anillo carbocíclico) con un resto de metileno (CH2).
En otro caso, el puente trifosfato puede modificarse mediante la sustitución de al menos un oxígeno con azufre (tio), un resto borano (BH3) un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo metoxi y/o combinaciones de los mismos. Esta modificación podría aumentar la estabilidad del ARNm frente a las enzimas de desprotección. Como un ejemplo no limitativo, la estructura del sustrato de caperuza para la traducción dependiente de caperuza puede tener la estructura como, pero sin limitarse a, CAP-016 y CAP-021 y/o la estructura del sustrato de caperuza para la enzima de caperuza de ARNm de vaccinia tal como, pero sin limitarse a, CAP-125 y CAP-130. En otro ejemplo, CAP-003 - CAP-015, CAP-022 - CAP-124 y/o CAP-131 - CAP-225, se puede modificar en el puente trifosfato reemplazando al menos uno de los oxígenos del puente trifosfato con azufre (tio), un resto borano (BH3), un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo metoxi y/o combinaciones de los mismos.
En un caso, CAP-001 - 134 y/o CAP-136 - CAP-225 puede modificarse para ser un análogo de tioguanosina similar a CAP-135. El análogo de tioguanosina puede comprender modificaciones adicionales tales como, entre otras, una modificación en el resto trifosfato (p. ej., tio, BH3, CH3, C2H5, OCH3, S y S con OCH3), una modificación a las posiciones 2' y/o posiciones 3' de 6-tio guanosina como se describe en esta invención y/o un reemplazo del oxígeno del anillo de azúcar (que produjo el anillo carbocíclico) como se describe en esta invención.
En un caso, CAP-001-121 y/o CAP-123 - CAP-225 puede modificarse para ser un cap de 5' modificado similar al CAP-122. La 5'cap modificada puede comprender modificaciones adicionales tales como, entre otras, una modificación en el resto trifosfato (p. ej., tio, BH3, CH3, C2H5, OCH3, S y S con OCH3), una modificación a las posiciones 2' y/o posiciones 3' de 6-tio guanosina como se describe en esta invención y/o un reemplazo del oxígeno del anillo de azúcar (que produjo el anillo carbocíclico) como se describe en esta invención.
En un caso, la modificación de 5'cap puede ser la unión de biotina o conjugación en la posición 2' o 3' de un GTP.
En otro caso, la modificación de 5'cap puede incluir un resto trifosfato modificado con CF2 .
3' UTR y Secuencias Virales
Se pueden diseñar e insertar secuencias virales adicionales como, entre otras, la secuencia que mejora la traducción del virus de la enana amarilla de cebada (BYDV-PAV) en la UTR 3' de los polinucleótidos sintéticos, polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la divulgación. y puede estimular la traducción de la construcción in vitro e in vivo.Experimentos de transfección se pueden realizar en líneas celulares relevantes y la producción de proteínas se puede ensayar mediante ELISA a las 12 h, 24 h, 48 h, 72 h y el día 7 después de la transfección.
Secuencias IRES
Además, se proporcionan ácidos nucleicos que contienen un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). Identificado por primera vez como una característica del ARN del virus Picorna, el IRES desempeña un papel importante en el inicio de la síntesis de proteínas en ausencia de la estructura de la caperuza 5'. Un IRES puede actuar como el único sitio de unión al ribosoma, o puede servir como uno de los múltiples sitios de unión al ribosoma de un ARNm. Los polinucleótidos que contienen más de un sitio de unión al ribosoma funcional pueden codificar varios péptidos o polipéptidos que los ribosomas traducen de forma independiente ("moléculas de ácido nucleico multicistrónico"). Cuando los polinucleótidos se proporcionan con un IRES, además se proporciona opcionalmente una segunda región traducible. Ejemplos de secuencias de IRES que se pueden usar según la invención incluyen, sin limitación, las de picornavirus (p. ej., FMDV), virus de plagas (CFFV), virus de la polio (PV), virus de encefalomiocarditis (ECMV), virus de la fiebre aftosa (FMDV), virus de la hepatitis C (HCV), virus de la peste porcina clásica (CSFV), virus de la leucemia murina (MLV), virus de la inmunodeficiencia de los simios (VIS) o virus de la parálisis del grillo (CrPV).
Modificaciones de Arquitectura Terminal: colas Poli-A
Durante el procesamiento del ARN, normalmente se agrega una cadena larga de nucleótidos de adenina (cola poli-A) a las moléculas de ARN mensajero (ARNm) para aumentar la estabilidad de la molécula. Inmediatamente después de la transcripción, el extremo 3' del transcrito se puede escindir para liberar un hidroxilo 3'. A continuación, la polimerasa poli-A agrega una cadena de nucleótidos de adenina al ARN. El procedimiento, llamado poliadenilación, agrega una cola poli-A que puede tener entre 100 y 250 residuos de largo.
Se ha descubierto que las longitudes de cola poli-A únicas proporcionan ciertas ventajas a los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la presente divulgación.
Generalmente, la longitud de una cola poli-A de la presente divulgación es mayor de 30 nucleótidos de longitud. En otro caso, la cola poli-A tiene más de 35 nucleótidos de longitud. En otro caso, la longitud es de al menos 40 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 45 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 55 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 60 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 60 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 80 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 90 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 100 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 120 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 140 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 160 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 180 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 200 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 250 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 300 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 350 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 400 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 450 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 500 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 600 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 700 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 800 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 900 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 1000 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 1100 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 1200 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 1300 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 1400 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 1500 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 1600 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 1700 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 1800 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 1900 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 2000 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 2500 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 3000 nucleótidos.
En algunos casos, el ácido nucléico o ARNm incluye de aproximadamente 30 a aproximadamente 3000 nucleótidos (p. ej., de 30 a 50, de 30 a 100, de 30 a 250, de 30 a 500, de 30 a 750, de 30 a 1000, de 30 a 1500, de 30 a 2000, de 30 a 2500, de 50 a 100, de 50 a 250, de 50 a 500, de 50 a 750, de 50 a 1000, de 50 a 1500, de 50 a 2000, de 50 a 2500, de 50 a 3000, de 100 a 500, de 100 a 750, de 100 a 1000, de 100 a 1500, de 100 a 2000, de 100 a 2500, de 100 a 3000, de 500 a 750, de 500 a 1000, de 500 a 1500, de 500 a 2000, de 500 a 2500, de 500 a 3000, de 1000 a 1500, de 1000 a 2000, de 1000 a 2500, de 1000 a 3000, de 1500 a 2.000, de 1.500 a 2.500, de 1.500 a 3.000, de 2.000 a 3.000, de 2.000 a 2.500 y de 2.500 a 3.000).
En un caso, la cola poli-A puede tener una longitud de 80 nucleótidos, 120 nucleótidos, 160 nucleótidos en una molécula de ARN modificada descrita en esta invención tal como, entre otros, la longitud de la cola poliA en el ARN modificado descrito en el Ejemplo 13.
En otro caso, la cola poli-A puede tener una longitud de 20, 40, 80, 100, 120, 140 o 160 nucleótidos en una molécula de ARN modificada descrita en esta invención, como, entre otros, la longitud de la cola poliA en el ARN modificado. descrito en el ejemplo 44.
En un caso, la cola poli-A está diseñada en relación con la longitud de la molécula de ARN modificada en general. Este diseño puede basarse en la longitud de la región codificante del ARN modificado, la longitud de una característica o región particular del ARN modificado (como el ARNm) o en la longitud del producto final expresado a partir del ARN modificado. Cuando se relaciona con cualquier característica adicional del ARN modificado (p. ej., que no sea la porción de ARNm que incluye la cola poli-A), la cola poli-A puede ser 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 % mayor en longitud que la característica adicional. La cola poli-A también puede diseñarse como una fracción del ARNm modificado a los que pertenece. En este contexto, la cola poli-A puede ser 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 % o más de la longitud total de la construcción o la longitud total de la construcción menos la cola poli-A.
En un caso, sitios de unión diseñados y/o la conjugación de ácidos nucleicos o ARNm para la proteína de unión a poli-A puede usarse para mejorar la expresión. Los sitios de unión manipulados pueden ser secuencias sensoras que pueden operar como sitios de unión para ligandos del microambiente local de los ácidos nucleicos y/o ARNm. Como ejemplo no limitante, los ácidos nucleicos y/o el ARNm puede comprender al menos un sitio de unión diseñado para alterar la afinidad de unión de la proteína de unión a poli-A (PABP) y análogos der los mismos. La incorporación de al menos un sitio de unión diseñado puede aumentar la afinidad de unión de la PABP y análogos de los mismos.
Además, múltiples polinucleótidos distintos se pueden unir a la PABP (proteína de unión a Poli-A) a través del extremo 3' usando nucleótidos modificados en el extremo 3' de la cola poli-A. Experimentos de transfección se pueden realizar en líneas celulares relevantes y la producción de proteínas se puede ensayar mediante ELISA a las 12 h, 24 h, 48 h, 72 h y el día 7 después de la transfección. Como ejemplo no limitante, los experimentos de transfección pueden usarse para evaluar el efecto sobre la afinidad de unión de PABP o análogos de los mismos como resultado de la adición de al menos un sitio de unión diseñado.
En un caso, se puede usar una cola poliA para modular el inicio de la traducción. Si bien no se desea ceñirse a la teoría, el poliA til recluta PABP que, a su vez, puede interactuar con el complejo de iniciación de la traducción y, por lo tanto, puede ser esencial para la síntesis de proteínas.
En otro caso, también se puede usar una cola poliA en esta divulgación para proteger contra la digestión con exonucleasa 3'-5'.
En un caso, los ácidos nucleicos o el ARNm de la presente divulgación están diseñados para incluir un cuarteto poliA-G. El cuarteto G es una matriz cíclica con enlaces de hidrógeno de cuatro nucleótidos de guanina que pueden formarse mediante secuencias ricas en G tanto en el ADN como en el ARN. En este aspecto, el cuarteto G se incorpora al final de la cola poli-A. El polinucleótido resultante se analiza en cuanto a estabilidad, producción de proteínas y otros parámetros, incluida la vida media en varios puntos de tiempo. Se ha descubierto que el cuarteto poliA-G da como resultado una producción de proteínas equivalente a al menos el 75 % de la observada usando una cola poli-A de 120 nucleótidos sola.
En un caso, los ácidos nucleicos o el ARNm de la presente descripción pueden comprender una cola poliA y pueden estabilizarse mediante la adición de un nucleósido que termina la cadena. Los ácidos nucleicos y/o el ARNm con una cola de poliA puede comprender además una estructura 5'cap.
En otro caso, los ácidos nucleicos o el ARNm de la presente divulgación pueden comprender un cuarteto poliA-G. Los ácidos nucleicos y/o el ARNm con un Cuarteto PoliA-G puede comprender además una estructura 5'cap.
En un caso, el nucleósido terminador de cadena que se puede usar para estabilizar el ácido nucleico o el ARNm que comprende una cola poliA o un Cuarteto poliA-G puede ser, entre otros, los descritos en la Publicación de Patente Internacional N° WO2013103659. En otro caso, los nucleósidos que terminan la cadena que se pueden usar con la presente descripción incluyen, entre otros, 3'-desoxiadenosina (cordicepina), 3'-desoxiuridina, 3'-desoxicitosina, 3'-desoxiguanosina, 3'- desoxitimina, 2',3'-didesoxinucleósidos, tales como 2',3'- didesoxiadenosina, 2',3'-didesoxiuridina, 2',3'-didesoxicitosina, 2',3'- didesoxiguanosina, 2',3'- didesoxitimina, un 2'-desoxinucleósido o un -O-metilnucleósido.
En otro caso, el ácido nucleico tal como, pero no limitado a ARNm, que comprende una cola poliA o un Cuarteto poliA-G puede estabilizarse mediante una modificación en la región 3' del ácido nucleico que puede impedir y/o inhibir la adición de oligo(U) (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente Internacional N°. WO2013103659).
En otro caso más, el ácido nucleico tal como, entre otros, el ARNm, que comprende una cola poliA o un Cuarteto poliA-G puede estabilizarse mediante la adición de un oligonucleótido que termina en un 3'-desoxinucleósido, 2',3 '-didesoxinucleósido 3'-0-metilnucleósidos, 3'-0-etilnucleósidos, 3'-arabinósidos y otros nucleósidos modificados conocidos en la técnica y/o descritos en esta invención.
Cuantificación
Los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la presente divulgación pueden cuantificarse en exosomas derivados de uno o más fluidos corporales. Tal como se usa en esta invención, "fluidos corporales" incluye sangre periférica, suero, plasma, ascitis, orina, fluido cefalorraquídeo (LCR), esputo, saliva, médula ósea, fluido sinovial, humor acuoso, fluido amniótico, cerumen, leche materna, fluido de lavado bronqueoalveolar, semen, fluido prostático, fluido de Cowper o fluido preeyaculatorio, sudor, materia fecal, cabello, lágrimas, fluido quístico, fluido pleural y peritoneal, fluido pericárdico, linfa, quimo, quilo, bilis, fluido intersticial, menstruación, pus, sebo, vómitos, secreciones vaginales, secreciones mucosas, agua de heces, jugo pancreático, fluidos de lavado de las cavidades sinusales, aspirados broncopulmonares, fluido de la cavidad blastocilo y sangre del cordón umbilical. Alternativamente, los exosomas se pueden recuperar de un órgano seleccionado de entre el grupo que consiste en pulmón, corazón, páncreas, estómago, intestino, vejiga, riñón, ovario, testículos, piel, colon, mama, próstata, cerebro, esófago, hígado y placenta.
En el procedimiento de cuantificación, se obtiene una muestra de no más de 2 mL del sujeto y se aíslan los exosomas mediante cromatografía de exclusión por tamaño, centrifugación en gradiente de densidad, centrifugación diferencial, ultrafiltración de nanomembranas, captura inmunoabsorbente, purificación por afinidad, separación de microfluidos o combinaciones de los mismos. En el análisis, el nivel o concentración de un polinucleótido, construcción primaria o ARNmm puede ser un nivel de expresión, presencia, ausencia, truncamiento o alteración de la construcción administrada. Es ventajoso correlacionar el nivel con uno o más fenotipos clínicos o con un ensayo para un biomarcador de enfermedad humana. El ensayo se puede realizar usando sondas específicas de construcción, citometría, qRT-PCR, PCR en tiempo real, p Cr , citometría de flujo, electroforesis, espectrometría de masas o combinaciones de los mismos, mientras que los exosomas pueden aislarse usando procedimientos inmunohistoquímicos como procedimientos de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas ( ELISA). Los exosomas también pueden aislarse mediante cromatografía de exclusión por tamaño, centrifugación en gradiente de densidad, centrifugación diferencial, ultrafiltración por nanomembranas, captura inmunoabsorbente, purificación por afinidad, separación de microfluidos o combinaciones de los mismos.
Estos procedimientos brindan al investigador la capacidad de monitorear, en tiempo real, el nivel de polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm restantes o entregados. Esto es posible porque los polinucleótidos, las construcciones primarias o el ARNmm de la presente divulgación difieren de las formas endógenas debido a las modificaciones estructurales o químicas.
II. Diseño y síntesis de polinucleótidos
Los polinucleótidos, los ácidos nucleicos modificados de las construcciones primarias o el ARNm para su uso según la divulgación pueden prepararse según cualquier técnica disponible que incluye, entre otras, la síntesis química, la síntesis enzimática, que generalmente se denomina transcripción in vitro (IVT) o síntesis enzimática o química. escisión de un precursor más largo, etc. Los métodos para sintetizar ARN son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Gait, M.J. (ed.) Oligonucleotide synthesis: a practical approach, Oxford [Oxfordshire], Washington, DC: IRL Press, 1984; y Herdewijn, P. (ed.) Oligonucleotide synthesis: methods and applications, Methods in Molecular Biology, v. 288 (Clifton, N.J.) Totowa, N.J.: Humana Press, 2005).
El procedimiento de diseño y síntesis de las construcciones primarias de la descripción generalmente incluye las etapas de construcción de genes, producción de ARNm (con o sin modificaciones) y purificación. En el procedimiento de síntesis enzimática, primero se selecciona una secuencia de polinucleótidos diana que codifica el polipéptido de interés para su incorporación en un vector que se amplificará para producir una plantilla de ADNc. Opcionalmente, la secuencia de polinucleótidos diana y/o cualquier secuencia flanqueante puede ser codones optimizados. La plantilla de ADNc se usa a continuación para producir ARNm a través de la transcripción in vitro (IVT). Después de la producción, el ARNm puede someterse a procedimientos de purificación y limpieza. Cuyas etapas se proporcionan con más detalle a continuación.
Construcción de genes
La etapa de construcción de genes puede incluir, pero no se limita a, síntesis de genes, amplificación de vectores, purificación de plásmidos, linealización y limpieza de plásmidos, y síntesis y limpieza de plantillas de ADNc.
Síntesis de genes
Una vez que se selecciona un polipéptido de interés, o una diana, para la producción, se diseña una construcción primaria. Dentro de la construcción primaria, se puede construir una primera región de nucleósidos enlazados que codifican el polipéptido de interés usando un marco de lectura abierto (ORF - open reading frame) de un transcrito de ácido nucleico (a Dn o ARN) seleccionado. El ORF puede comprender el ORF de tipo natural, una isoforma, variante o un fragmento del mismo. Tal como se usa en esta invención, un "marco de lectura abierto" u "ORF" se refiere a una secuencia de ácido nucleico (ADN o ARN) que es capaz de codificar un polipéptido de interés. Los ORF a menudo comienzan con el codón de inicio, ATG y terminan con un codón o señal sin sentido o de terminación.
Además, la secuencia de nucleótidos de la primera región puede tener codones optimizados. Los procedimientos de optimización de codones se conocen en la técnica y pueden ser útiles en los esfuerzos por lograr uno o más de varios objetivos. Estos objetivos incluyen hacer coincidir las frecuencias de los codones en los organismos diana y hospedadores para garantizar un plegamiento adecuado, sesgar el contenido de GC para aumentar la estabilidad del ARNm o reducir las estructuras secundarias, minimizar los codones repetidos en tándem o las corridas de bases que pueden afectar la construcción o expresión de genes, personalizar las regiones de control de la transcripción y la traducción, insertar o eliminar secuencias de tráfico de proteínas, eliminar/agregar sitios de modificación postraducción en proteínas codificadas (por ejemplo, sitios de glicosilación), agregar, eliminar o mezclar dominios de proteínas, insertar o eliminar sitios de restricción, modificar sitios de unión de ribosomas y sitios de degradación de ARNm, ajustar las tasas de traducción para permitir que los diversos dominios de la proteína se plieguen adecuadamente, o reducir o eliminar las estructuras secundarias problemáticas dentro del ARNm. Las herramientas, algoritmos y servicios de optimización de codones son conocidos en la técnica; ejemplos no taxativos incluyen servicios de GeneArt (Life Technologies), y/o DNA2.0 (Menlo Park, CA). En algunas realizaciones, se optimiza la secuencia de marco de lectura abierto (ORF) con algoritmos de optimización. Las opciones de codones para cada aminoácido se dan en la Tabla 5.
Tabla 5. Opciones de codones
Figure imgf000045_0001
Figure imgf000046_0001
Una vez que se ha optimizado el codón de una secuencia, se puede evaluar más a fondo para las regiones que contienen sitios de restricción. Al menos un nucleótido dentro de las regiones del sitio de restricción puede reemplazarse con otro nucleótido para eliminar el sitio de restricción de la secuencia, pero el reemplazo de nucleótidos sí altera la secuencia de aminoácidos que está codificada por la secuencia de nucleótidos con codón optimizado.
Las características, que pueden considerarse beneficiosas en algunos casos de la presente descripción, pueden estar codificadas por la construcción principal y pueden flanquear el ORF como una primera o una segunda región flanqueante. Las regiones flanqueantes pueden incorporarse en la construcción primaria antes y/o después de la optimización del ORF, no se requiere que una construcción primaria contenga una región flanqueante tanto en 5' como en 3'. Ejemplos de tales características incluyen, pero no se limitan a, regiones no traducidas (UTR), secuencias de Kozak, una secuencia oligo(dT) y etiquetas detectables y pueden incluir múltiples sitios de clonación que pueden tener reconocimiento Xbal.
En algunas realizaciones, una región UTR 5' y/o UTR 3' puede proporcionarse como regiones flanqueantes. Pueden incluirse múltiples UTR 5' o 3' en las regiones flanqueantes y pueden ser las mismas o de secuencias diferentes. Cualquier porción de las regiones flanqueantes, incluida ninguna, puede tener codones optimizados y cualquiera puede contener independientemente una o más modificaciones estructurales o químicas diferentes, antes y/o después de la optimización de codones. Pueden incluirse combinaciones de características en la primera y segunda regiones flanqueantes y pueden estar contenidas dentro de otras características. Por ejemplo, el ORF puede estar flanqueado por una UTR 5' que puede contener una fuerte señal de inicio de la traducción de Kozak y/o una UTR 3' que puede incluir una secuencia oligo(dT) para la adición de plantilla de una cola poli-A.
Las Tablas 2 y 3 proporcionan una lista de ejemplos de UTR que se pueden utilizar en la construcción principal de la presente divulgación como regiones flanqueantes. En la Tabla 6 se muestra una lista de una región 5' sin traducir de la descripción. Pueden utilizarse variantes de UTR 5' donde se añaden o eliminan uno o más nucleótidos en los extremos, incluidos A, T, C o G.
Figure imgf000047_0001
 En otro caso, la UTR 5' puede comprender un primer fragmento de polinucleótido y un segundo fragmento de polinucleótido donde el primer y el segundo fragmento pueden ser del mismo gen o de un gen diferente. (Véase, por ejemplo, US20100293625 y US20110247090). Como ejemplo no limitativo, el primer polinucleótido puede ser un fragmento del gen SERCA2 canino, humano o de ratón. y/o el segundo fragmento de polinucleótido es un fragmento del gen de la beta-caseína bovina, de ratón, de rata o de oveja.
En un caso, el primer fragmento de polinucleótido puede ubicarse en el extremo 5' del segundo fragmento de polinucleótido. (Véase, por ejemplo, US20100293625 y US20110247090).
En otro caso, el primer fragmento de polinucleótido puede comprender el segundo intrón de un gen sarcoplásmico/ endoplásmico de la ATPasa de calcio del retículo y/o el segundo fragmento de polinucleótido comprende al menos una parte de la UTR 5' de un gen de caseína eucariota. (Véase, por ejemplo, US20100293625 y US20110247090). El primer fragmento de polinucleótido también puede comprender al menos una parte del exón 2 y/o exón 3 del gen sarcoplásmico/ endoplásmico de la ATPasa de calcio del retículo. (Véase, por ejemplo, US20100293625 y US20110247090).
En la Tabla 7 se muestra una lista representativa de las regiones 3' no traducidas de la descripción. Pueden utilizarse variantes de UTR 3' donde se añaden o eliminan uno o más nucleótidos en los extremos, incluidos A, T, C o G. Tabla 7. 3'-Re iones no traducidas
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000050_0001
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000053_0001
Figure imgf000054_0001
Debe entenderse que los enumerados son ejemplos y que cualquier UTR de cualquier gen puede incorporarse en la respectiva primera o segunda región flanqueante de la construcción primaria. Además, se pueden utilizar múltiples UTR de tipo salvaje de cualquier gen conocido. También está dentro del alcance de la presente invención proporcionar UTR artificiales que no sean variantes de regiones de tipo salvaje. Estas UTR o partes de las mismas pueden colocarse en la misma orientación que en la transcripción de la que fueron seleccionados o pueden estar alteradas en orientación o ubicación. Por tanto, una UTR 5' o 3' puede invertirse, acortarse, alargarse, hacerse quimérica con una o más de otras UTR 5' o UTR 3'. Tal como se usa en esta invención, el término "alterado" en lo que se refiere a una secuencia UTR, significa que la UTR se ha cambiado de alguna manera en relación con una secuencia de referencia. Por ejemplo, una uTr 3' o 5' puede alterarse con respecto a una UTR de tipo natural o nativa por el cambio en la orientación o ubicación como se enseñó anteriormente o puede ser alterada por la inclusión de nucleótidos adicionales, deleción de nucleótidos, intercambio o transposición de nucleótidos. Cualquiera de estos cambios que produzcan una UTR "alterada" (ya sea 3' o 5') comprende una UTR variante.
En una realización, se puede utilizar una UTR doble, triple o cuádruple, como una UTR 5' o 3'. Tal como se usa en esta invención, una u Tr "doble" es aquella donde dos copias de la misma UTR están codificadas en serie o sustancialmente en serie. Por ejemplo, se puede usar una UTR 3' doble beta-globina como se describe en la Publicación de Patente de EE.UU. 20100129877.
También está dentro del alcance de la presente invención tener UTR con patrones. Tal como se usa en esta invención, "UTR con patrón" son aquellas UTR que reflejan un patrón repetido o alterno, como ABABAB o AABBAABBAABB o ABCABCABC o variantes de los mismos repetidos una, dos o más de 3 veces. En estos patrones, cada letra, A, B o C representa una UTR diferente a nivel de nucleótidos.
En otra realización, las regiones flanqueantes pueden seleccionarse de entre una familia de transcripciones cuyas proteínas comparten una función, estructura y característica de propiedad comunes. Por ejemplo, polipéptidos de interés pueden pertenecer a una familia de proteínas que se expresan en una célula, tejido particular o en algún momento durante el desarrollo. Las UTR de cualquiera de estos genes pueden intercambiarse por cualquier otra UTR de la misma familia de proteínas o de una diferente para crear una nueva transcripción primaria quimérica. Tal como se usa en esta invención, una "familia de proteínas" se usa en el sentido más amplio para referirse a un grupo de dos o más polipéptidos de interés que comparten al menos una función, estructura, característica, localización, origen o patrón de expresión.
Después de la optimización (si se desea), los componentes de la construcción primaria se reconstituyen y se transforman en un vector como, entre otros, plásmidos, virus, cósmidos y cromosomas artificiales. Por ejemplo, la construcción optimizada se puede reconstituir y transformar en E. coli químicamente competente, levadura, neurospora, maíz, drosophila, etc., donde se producen estructuras cromosómicas o similares a plásmidos de alto número de copias mediante los procedimientos descritos en esta invención. Codones de parada
Las construcciones primarias de la presente divulgación pueden incluir al menos dos codones de parada antes de la región no traducida 3' (UTR). El codón de parada puede ser seleccionado de entre TGA, TAA y t Ag . En un aspecto, las construcciones primarias de la presente divulgación incluyen el codón de parada TGA y un codón de parada adicional. En un aspecto adicional, el codón de parada de la adición puede ser TAA.
Amplificación de vector
A continuación, se amplifica el vector que contiene la construcción primaria y se aísla y purifica el plásmido usando procedimientos conocidos en la técnica, como, entre otros, una preparación maxi usando el kit Invitrogen PURELINK™ HiPure Maxiprep (Carlsbad, CA).
Linealización de plásmidos
A continuación, el plásmido puede linealizarse usando procedimientos conocidos en la técnica tales como, pero sin limitarse a, el uso de enzimas de restricción y tampones. La reacción de linealización se puede purificar utilizando procedimientos que incluyen, por ejemplo, el micro kit PURELINK™ PCR (Carlsbad, CA), y procedimientos de purificación basados en HPLC como, entre otros, HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) y HPLC de interacción hidrofóbica (HIC-HPLC) y el kit de PCR estándar PURELINK™ (Carlsbad, CA). El procedimiento de purificación puede modificarse dependiendo del tamaño de la reacción de linealización que se llevó a cabo. El plásmido linealizado se usa a continuación para generar ADNc para reacciones de transcripción in vitro (IVT).
Síntesis de plantilla de ADNc
Se puede sintetizar una plantilla de ADNc haciendo que un plásmido linealizado se someta a la reacción en cadena de polimerasa (PCR). La Tabla 8 es una lista de cebadores y sondas que pueden ser útiles en las reacciones de PCR de la presente divulgación. Debe entenderse que la lista no es exhaustiva y que el diseño de cebador-sonda para cualquier amplificación está dentro de la experiencia de los expertos en la técnica. Las sondas también pueden contener bases modificadas químicamente para aumentar la fidelidad del emparejamiento de bases con la molécula diana y la fuerza del emparejamiento de bases. Dichas modificaciones pueden incluir 5-metil-citidina, 2, 6-di-aminopurina, 2'-fluoro, fosforo-tioato o ácidos nucleicos bloqueados.
Tabla 8. Cebadores sondas
Figure imgf000055_0001
Figure imgf000056_0001
El ADNc puede presentarse para un análisis de secuenciación antes de proceder a la transcripción.
Producción de polinucleótidos
El procedimiento de producción de polinucleótidos sintéticos puede incluir, entre otros, transcripción in vitro, eliminación de plantillas de ADNc y limpieza de ARN, y reacciones de protección y/o de descolado.
Transcripción in vitro
El ADNc producido en el etapa anterior se puede transcribir utilizando un sistema de transcripción in vitro (IVT). El sistema típicamente comprende un tampón de transcripción, nucleótidos trifosfatos (NTP), un inhibidor de RNasa y una polimerasa. Los NTP se pueden fabricar internamente, se pueden seleccionar de un proveedor o se pueden sintetizar como se describe en esta invención. Los NTP pueden seleccionarse, pero no se limitan a, los descritos en esta invención, incluidos los NTP naturales y no naturales (modificados). La polimerasa puede seleccionarse de entre, pero no se limita a, ARN polimerasa T7, ARN polimerasa T3 y polimerasas mutantes tales como, pero sin limitarse a, polimerasas capaces de incorporar ácidos nucleicos modificados.
Polimerasas de ARN
Puede usarse cualquier número de ARN polimerasas o variantes en el diseño de las construcciones primarias de la presente divulgación.
Las ARN polimerasas se pueden modificar por inserción o deleción de aminoácidos de la secuencia de ARN polimerasa. Como ejemplo no limitante, la ARN polimerasa puede modificarse para mostrar una mayor capacidad para incorporar un nucleótido trifosfato modificado en 2' en comparación con una ARN polimerasa no modificada (véase la Publicación Internacional WO2008078180 y la Patente de EE. UU. 8.101.385;).
Las variantes pueden obtenerse desarrollando una ARN polimerasa, optimizando la secuencia de aminoácidos y/o de ácido nucleico de la ARN polimerasa y/o usando otros procedimientos conocidos en la técnica. Como ejemplo no limitativo, las variantes de la ARN polimerasa T7 pueden evolucionar utilizando el sistema de evolución dirigida continua establecido por Esvelt y col. (Nature (2011) 472(7344):499-503) donde los clones de la polimerasa de ARN T7 pueden codificar al menos una mutación como, entre otras, lisina en la posición 93 sustituida por treonina (K93T), 14M, A7T, E63V, V64D, A65E, D66Y, T76N, C125R, S128R, A136T, N165S, G175R, H176L, Y178H, F182L, L196F, G198V, D208Y, E222K, S228A, Q239R, T243N, G259D, M2671, G280C, H300R, D351A, A354S, E356D, L360P, A383V, Y385C, D388Y, S397R, M401T, N410S, K450R, P451T, G452V, E484A, H523L, H524N, G542V, E565K, K577E, K577M, N601S, S684Y, L699l, K713E, N748D, Q754R, E775K, A827V, D851N o L864F. Como otro ejemplo no limitante, las variantes de la ARN polimerasa T7 pueden codificar al menos una mutación como se describe en las Pub. EE. UU. No. 20100120024 y 20070117112. Las variantes de la ARN polimerasa también pueden incluir, entre otras, variantes de sustitución, sustitución conservativa de aminoácidos, variantes de inserción, variantes de deleción y/o derivados covalentes.
La construcción primaria puede diseñarse para ser reconocida por las ARN polimerasas de tipo salvaje o variantes. Al hacerlo, la construcción primaria puede modificarse para contener sitios o regiones de cambios de secuencia de la construcción primaria original o de tipo salvaje.
La construcción primaria puede diseñarse para incluir al menos una sustitución y/o inserción corriente arriba de un sitio de unión o reconocimiento de ARN polimerasa, corriente abajo del sitio de unión o reconocimiento de ARN polimerasa, corriente arriba de la secuencia de la caja TATA, corriente abajo de la secuencia de la caja TATA de la construcción primaria pero corriente arriba de la región codificante de la construcción primaria, dentro de la UTR 5', antes de la UTR 5' y/o después de la UTR 5'.
Una UTR 5' de una construcción primaria descrita en esta invención puede reemplazarse por la inserción de al menos una región y/o cadena de nucleótidos de la misma base. La región y/o la cadena de nucleótidos puede incluir, pero no se limita a, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 o al menos 8 nucleótidos y los nucleótidos pueden ser naturales y/o antinatural. Como ejemplo no limitante, el grupo de nucleótidos puede incluir 5-8 adenina, citosina, timina, una cadena de cualquiera de los otros nucleótidos descritos en esta invención y/o combinaciones de los mismos.
En una realización, la 5'UTR del polinucleótido puede reemplazarse por la inserción de al menos dos regiones y/o cadenas de nucleótidos de dos bases diferentes tales como, entre otras, adenina, citosina, timina, cualquiera de las otras nucleótidos descritos en esta invención y/o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, la 5'UTR puede reemplazarse insertando de 5 a 8 bases de adenina seguidas de la inserción de 5 a 8 bases de citosina. En otro ejemplo, la 5'UTR puede reemplazarse insertando de 5 a 8 bases de citosina seguidas de la inserción de 5 a 8 bases de adenina.
La construcción primaria puede incluir al menos una sustitución y/o inserción corriente abajo del sitio de inicio de la transcripción que puede ser reconocido por una ARN polimerasa. Como ejemplo no limitativo, al menos una sustitución y/o la inserción puede producirse corriente abajo del sitio de inicio de la transcripción mediante la sustitución de al menos un ácido nucleico en la región justo debajo del sitio de inicio de la transcripción (tales como, pero no limitado a, 1 a 6). Los cambios en la región de nucleótidos justo debajo del sitio de inicio de la transcripción pueden afectar las tasas de inicio, aumentar los valores constantes de reacción de nucleótido trifosfato (NTP) aparente y aumentar la disociación de transcripciones cortas del complejo de transcripción que cura la transcripción inicial (Brieba y col, Biochemistry (2002) 41: 5144-5149). La modificación, sustitución y/o la inserción de al menos un ácido nucleico puede provocar una mutación silenciosa de la secuencia de ácido nucleico o puede provocar una mutación en la secuencia de aminoácidos.
La construcción primaria puede incluir la sustitución de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12 o al menos 13 bases de guanina corriente abajo del sitio de inicio de la transcripción.
La construcción primaria puede incluir la sustitución de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 bases de guanina en la región inmediatamente corriente abajo del sitio de inicio de la transcripción. Como ejemplo no limitativo, si los nucleótidos de la región son GGGAGA, las bases de guanina pueden estar sustituidas por al menos 1, al menos 2, al menos 3 o al menos 4 nucleótidos de adenina. En otro ejemplo no limitante, si los nucleótidos en la región son GGGAGA, las bases de guanina pueden estar sustituidas por al menos 1, al menos 2, al menos 3 o al menos 4 bases de citosina. En otro ejemplo no limitante, si los nucleótidos en la región son GGGAGA, las bases de guanina pueden estar sustituidas por al menos 1, al menos 2, al menos 3 o al menos 4 timina y/o cualquiera de los nucleótidos descritos en esta invención.
La construcción primaria puede incluir al menos una sustitución y/o inserción corriente arriba del codón de inicio. En aras de la claridad, un experto en la técnica apreciaría que el codón de inicio es el primer codón de la región codificante de la proteína, mientras que el sitio de inicio de la transcripción es el sitio donde comienza la transcripción. La construcción primaria puede incluir, pero no se limita a, al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 o al menos 8 sustituciones y/o inserciones de bases de nucleótidos. Las bases de nucleótidos pueden insertarse o sustituirse en 1, al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 ubicaciones corriente arriba del codón de inicio. Los nucleótidos insertados y/o sustituido puede ser la misma base (por ejemplo, todo A o todo C o todo T o todo G), dos bases diferentes (por ejemplo, A y C, A y T, o C y T), tres bases diferentes (por ejemplo, A, C y T o A, C y T) o al menos cuatro bases diferentes. Como ejemplo no limitante, la base de guanina corriente arriba de la región codificante en la construcción primaria puede sustituirse con adenina, citosina, timina o cualquiera de los nucleótidos descritos en esta invención. En otro ejemplo no limitante, la sustitución de bases de guanina en la construcción primaria puede diseñarse para dejar una base de guanina en la región corriente abajo del sitio de inicio de la transcripción y antes del codón de inicio (ver Esvelt y col. Nature (2011) ) 472(7344):499-503). Como ejemplo no limitante, se pueden insertar al menos 5 nucleótidos en 1 ubicación corriente abajo del sitio de inicio de la transcripción pero corriente arriba del codón de inicio y los al menos 5 nucleótidos pueden ser del mismo tipo de base.
Eliminación y limpieza de plantillas de ADNc
La plantilla de ADNc puede eliminarse usando procedimientos conocidos en la técnica tales como, pero sin limitarse a, el tratamiento con desoxirribonucleasa I (DNasa I). La limpieza del ARN también puede incluir un procedimiento de purificación como, entre otros, el sistema AGENCOURT® CLEANSEQ® de Beckman Coulter (Danvers, MA), procedimientos de purificación basados en HPLC como, entre otros, HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) y HPLC de interacción hidrofóbica (HIC-HPLC).
Reacciones de protección y/o descolado
La construcción primaria o el ARNmm también pueden someterse a reacciones de protección y/o de descolado. Puede realizarse una reacción de protección mediante procedimientos conocidos en la técnica para añadir una caperuza 5' al extremo 5' de la construcción primaria. Los procedimientos para la protección incluyen, pero no se limitan a, el uso de una enzima de protección contra Vaccinia (New England Biolabs, Ipswich, MA).
Se puede realizar una reacción de descolado de poli-A mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como, pero sin limitarse a, 2' O-metiltransferasa y mediante procedimientos como se describe en esta invención. Si la construcción primaria generada a partir de ADNc no incluye un poli-T, puede ser beneficioso realizar la reacción de descolado de poli-A antes de limpiar la construcción primaria.
Purificación
La construcción primaria o la purificación de ARNmm puede incluir, entre otros, limpieza de ARNm o ARNmm, garantía de calidad y control de calidad. La limpieza de ARNm o ARNmm puede realizarse mediante métodos conocidos en la técnica, como, entre otros, perlas AGENCOURT® (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA), perlas poli-T, sondas de captura LNA™ oligo-T (EXIQON® Inc, Vedbaek, Denmark) o procedimientos de purificación basados en HPLC como, entre otros, HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) y HPLC de interacción hidrofóbica (HIC-HPLC). El término "purificado" cuando se usa en relación con un polinucleótido tal como un "ARN purificado o ARNmm" se refiere a uno que está separado de al menos un contaminante. Tal como se usa en esta invención, un "contaminante" es cualquier sustancia que hace que otra sea inadecuada, impura o inferior. Por lo tanto, un polinucleótido purificado (p. ej., ADN y ARN) está presente en una forma o entorno diferente de aquel donde se encuentra en la naturaleza, o en una forma o entorno diferente del que existía antes de someterlo a un tratamiento o procedimiento de purificación. .
Una garantía de calidad y/o verificación del control de calidad se puede realizar utilizando procedimientos como, entre otros, electroforesis en gel, absorbancia UV o HPLC analítica.
El ARNm o ARNmm pueden secuenciarse mediante procedimientos que incluyen, pero no se limitan a, PCR con transcriptasa inversa.
En un caso, el ARNm o ARNmm se puede cuantificar utilizando procedimientos como, entre otros, espectroscopia ultravioleta visible (UV/Vis). Un ejemplo no limitativo de espectrómetro UV/Vis es un espectrómetro NANODROP® (ThermoFisher, Waltham, MA). El ARNm o ARNmm cuantificado puede analizarse para determinar si el ARNm o ARNmm puede ser del tamaño adecuado, comprobar que no se ha producido degradación del ARNm o ARNmm. La degradación del ARNm y/o ARNmm se puede comprobar mediante procedimientos como, entre otros, electroforesis en gel de agarosa, procedimientos de purificación basados en HPLC como, entre otros, HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) y HPLC de interacción hidrofóbica (HIC-HPLC), cromatografía líquida-espectrometría de masas (LCMS), electroforesis capilar (CE) y electroforesis capilar en gel (CGE).
Péptidos o Proteínas Señal
Las construcciones primarias o ARNmm también pueden codificar características adicionales que facilitan el tráfico de los polipéptidos a sitios terapéuticamente relevantes. Una de esas características que ayuda en el tráfico de proteínas es la secuencia señal. Tal como se usa en esta invención, una "secuencia señal" o "péptido señal" es un polinucleótido o polipéptido, respectivamente, que tiene una longitud de aproximadamente 9 a 200 nucleótidos (3-60 aminoácidos) que se incorpora en el extremo 5' (o extremo N) de la región codificante o polipéptido codificado, respectivamente. La adición de estas secuencias da como resultado el tráfico del polipéptido codificado al retículo endoplásmico a través de una o más vías secretoras. Algunos péptidos señal son escindidos de la proteína por la peptidasa señal después de que se transportan las proteínas.
La Tabla 9 es una lista representativa de proteínas señal o péptidos que pueden incorporarse para codificar los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la divulgación.
Figure imgf000059_0001

Figure imgf000060_0001
Figure imgf000061_0001
Figure imgf000062_0001
Figure imgf000063_0001
Figure imgf000064_0001
En la tabla 9, SS es la señal de secreción y MLS es la señal líder mitocondrial. Las construcciones primarias o ARNmm de la presente divulgación pueden diseñarse para codificar cualquiera de las secuencias de péptido señal de SEQ ID NO 98-159, o fragmentos o variantes de las mismas. Estas secuencias se pueden incluir al comienzo de la región codificante del polipéptido, en el medio o en el extremo o alternativamente en una región flanqueante. Además, cualquiera de las construcciones primarias de polinucleótidos de la presente divulgación también puede comprender una o más de las secuencias definidas por SEQ ID NO 36-97. Estos pueden estar en la primera región o en cualquiera de las regiones flanqueantes.
Las secuencias de señal adicionales que pueden utilizarse en esta divulgación incluyen las enseñadas, por ejemplo, en bases de datos como las que se encuentran en http://www.signalpeptide.de/ o http://proline.bic.nus.edu.sg/spdb Las descritas en Patentes de Ee . UU. 8.124.379; 7.413.875 y 7.385.034 también son adecuadas.
En un caso, las moléculas de ácido nucleico modificadas pueden incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal de localización nuclear (NLS) y/o una señal de exportación nuclear (NES). En un aspecto, las moléculas de ácido nucleico modificadas pueden incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal de localización nuclear (NLS). Las moléculas de ácido nucleico modificadas que codifican un NLS podrían transportar un polipéptido al núcleo y enviar una señal de supervivencia o muerte al microambiente nuclear. En otro aspecto, las moléculas de ácido nucleico modificadas pueden incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal de exportación nuclear como NES1 y/o NES2. Como ejemplo no limitativo, las moléculas de ácido nucleico modificadas pueden codificar una señal n ES1, NES2 y NLS y un polipéptido relacionado con oncología o una secuencia codificada que no es traducible para interactuar con HIF1-alfa para alterar el transcriptoma de las células cancerosas.
Selección de dianas
Según la presente divulgación, las construcciones primarias comprenden al menos una primera región de nucleósidos enlazados que codifican al menos un polipéptido de interés. Los polipéptidos de interés o "dianas" o proteínas y péptidos de la presente descripción se enumeran en la Solicitud Internacional N° PCT/US2013/030062, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Biologics and Proteins Associated with Human Disease; Solicitud Internacional N° PCT/US2013/030063, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucloetides; Solicitud Internacional N°. PCT/US2013/030064, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins; Solicitud Internacional N° PCT/US2013/030059, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Membrane Proteins; Solicitud Internacional N°. PCT/US2013/030066, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins; Solicitud Internacional N°. PCT/US2013/030067, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins; Solicitud Internacional N°. PCT/US2013/030060, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins; Solicitud Internacional N°. PCT/US2013/030061, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; Solicitud Internacional N°. PCT/US2013/030068, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Cosmetic Proteins and Peptides; Solicitud Internacional N°. PCT/US2013/030070, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Oncology-Related Proteins and Peptides; y Solicitud Internacional N°. PCT/US2013/031821, depositada el 15 de marzo de 2013, titulada In Vivo Production of Proteins.
Señales y sitios de escisión de proteínas
Los polipéptidos de la presente divulgación pueden incluir al menos una señal de escisión de proteínas que contiene al menos un sitio de escisión de proteínas. El sitio de escisión de la proteína puede estar ubicado en el extremo N, el extremo C, en cualquier espacio entre los extremos N y C tales como, pero no limitado a, a mitad de camino entre los extremos N y C, entre el extremo N y el punto medio, entre el punto medio y el extremo C, y combinaciones de los mismos.
Los polipéptidos de la presente divulgación pueden incluir, pero no se limitan a, una proproteína convertasa (o prohormona convertasa), trombina o señal de escisión de proteína del factor Xa. Las proproteínas convertasas son una familia de nueve proteinasas, que comprenden siete serina proteinasas similares a las subtilisinas específicas de aminoácidos básicos relacionadas con la cexina de levadura, conocida como prohormona convertasa 1/3 (PC1/3), PC2, furina, PC4, PC5/6, enzima de escisión de aminoácidos básicos pareados 4 (PACE4) y PC7, y otras dos subtilasas que se escinden en residuos no básicos, llamadas subtilisina cexina isoenzima 1 (SKI-1) y proproteinconvertasa subtilisina cexina 9 (PCSK9). En la Tabla 10 se enumeran ejemplos no limitativos de secuencias de aminoácidos señal de escisión de proteínas. En la Tabla 10, "X" se refiere a cualquier aminoácido, "n" puede ser 0, 2, 4 o 6 aminoácidos y "*" se refiere al sitio de escisión de la proteína. En la Tabla 10, SEQ ID NO: 162 se refiere a cuando n=4 y SEQ ID NO:163 se refiere a cuando n=6.
Tabla 10. Secuencias de sitios de escisión de proteínas
Figure imgf000066_0001
En un caso, las construcciones primarias, los ácidos nucleicos modificados y el ARNmm de la presente descripción pueden diseñarse de manera que la construcción primaria, el ácido nucleico modificado o el ARNmm contengan al menos una señal de escisión de proteína codificada. La señal de escisión de la proteína codificada se puede ubicar antes del codón de inicio, después del codón de inicio, antes de la región codificante, dentro de la región codificante como, entre otros, a la mitad de la región codificante, entre el codón de inicio y el punto medio, entre el punto medio y el codón de parada, después de la región codificante, antes del codón de parada, entre dos codones de parada, después del codón de parada y combinaciones de los mismos.
En un caso, las construcciones primarias, los ácidos nucleicos modificados o el ARNmm de la presente divulgación pueden incluir al menos una señal de escisión de proteína codificada que contiene al menos un sitio de escisión de proteína. La señal de escisión de proteína codificada puede incluir, pero no se limita a, una proproteína convertasa (o prohormona convertasa), trombina y/o señal de escisión de proteína del factor Xa. Un experto en la técnica puede usar la Tabla 5 a continuación u otros procedimientos conocidos para determinar la señal de escisión de proteína codificada apropiada para incluir en las construcciones primarias o ARNmm de la presente divulgación. Por ejemplo, comenzando con la señal de la Tabla 10 y considerando los codones de la Tabla 5, se puede diseñar una señal para la construcción primaria que puede producir una señal de proteína en el polipéptido resultante.
En un caso, los polipéptidos de la presente divulgación incluyen al menos una señal y/o sitio de escisión de proteína.
Como ejemplo no limitativo, la Pat. EE. UU. N° 7.374.930 y la Pub. EE. UU. N° 20090227660, usan un sitio de escisión de furina para escindir la metionina del extremo N de GLP-1 en el producto de expresión del aparato de Golgi de las células. En un caso, los polipéptidos de la presente divulgación incluyen al menos una señal y/o sitio de escisión de proteínas con la condición de que el polipéptido no sea GLP-1.
En un caso, las construcciones primarias, los ácidos nucleicos modificados o el ARNmm de la presente divulgación incluyen al menos una señal y/o sitio de escisión de proteína codificada.
En algunos casos, las construcciones primarias o ARNmm de la presente divulgación incluyen al menos una señal y/o sitio de escisión de proteína codificada con la condición de que la construcción primaria o el ARNmm no codifique GLP-1.
En un caso, las construcciones primarias, el ácido nucleico modificado o el ARNmm de la presente descripción pueden incluir más de una región codificante. Cuando están presentes múltiples regiones codificantes en la construcción primaria o ARNmm de la presente divulgación, las múltiples regiones codificantes pueden separarse mediante sitios de escisión de proteínas codificadas. Como ejemplo no limitativo, la construcción primaria, el ácido nucleico modificado o el ARNmm pueden firmarse en un patrón ordenado. En tal patrón sigue la forma AXBY donde A y B son regiones codificantes que pueden ser regiones codificantes iguales o diferentes y/o pueden codificar polipéptidos iguales o diferentes, y X e Y son señales de escisión de proteínas codificadas que pueden codificar señales de escisión de proteínas iguales o diferentes. Un segundo tal patrón sigue la forma AXYBZ donde A y B son regiones codificantes que pueden ser regiones codificantes iguales o diferentes y/o pueden codificar polipéptidos iguales o diferentes, y X, Y y Z son señales de escisión de proteínas codificadas que pueden codificar señales de escisión de proteínas iguales o diferentes. Un tercer patrón sigue la forma ABXCY donde A, B y C son regiones codificantes que pueden ser regiones codificantes iguales o diferentes y/o pueden codificar polipéptidos iguales o diferentes, y X e Y son señales de escisión de proteínas codificadas que pueden codificar señales de escisión de proteínas iguales o diferentes.
En un caso, los polipéptidos, las construcciones primarias, los ácidos nucleicos modificados y el ARNmm también pueden contener secuencias que codifican sitios de escisión de proteínas para que los polipéptidos, las construcciones primarias, los ácidos nucleicos modificados y el ARNmm puedan liberarse de una región transportadora o un compañero de fusión mediante tratamiento. con una proteasa específica para dicho sitio de escisión de proteína. La Tabla 11 es una lista no exhaustiva de miRs y sitios de unión de miR (miR BS) y sus secuencias que pueden usarse con la presente descripción.
Tabla 11. Sitios de unión Mirs mir
Figure imgf000067_0001
Figure imgf000068_0001
Figure imgf000069_0001
Figure imgf000070_0001
Figure imgf000071_0001
Figure imgf000072_0001
Figure imgf000073_0001
Figure imgf000074_0001
Figure imgf000075_0001
Figure imgf000076_0001
Figure imgf000077_0001
Figure imgf000078_0001
Figure imgf000079_0001
Figure imgf000080_0001
Figure imgf000081_0001
Figure imgf000082_0001
Figure imgf000083_0001
Figure imgf000084_0001
Figure imgf000085_0001
Figure imgf000086_0001
Figure imgf000087_0001
Figure imgf000088_0001
Figure imgf000089_0001
Figure imgf000090_0001
Figure imgf000091_0001
Figure imgf000092_0001
Figure imgf000093_0001
Figure imgf000094_0001
Figure imgf000095_0001
Figure imgf000096_0001
Figure imgf000097_0001
Figure imgf000098_0001
Figure imgf000099_0001
Figure imgf000100_0001
Figure imgf000101_0001
Como se muestra en la Tabla 12, los microARN se expresan de manera diferencial en diferentes tejidos y células, y a menudo se asocian con diferentes tipos de enfermedades (p. ej., células cancerosas). La decisión de eliminar o insertar sitios de unión de microARN, o cualquier combinación, depende de los patrones de expresión de microARN y sus perfiles en las células cancerosas. En la Tabla 12, "HCC" representa carcinoma hepatocelular, "LLA" significa leucemia linfoblástica aguda, "RCC" significa carcinoma de células renales, "LLC" significa leucemia linfocítica crominca y "MALT" significa tejido linfoide asociado a mucosas.
T l 12 mir x r i n i l l nf rm
Figure imgf000102_0001
Figure imgf000103_0001
Figure imgf000104_0001
Figure imgf000105_0001
Figure imgf000106_0001
Figure imgf000107_0001
Figure imgf000108_0001
Figure imgf000109_0001
Figure imgf000110_0001
Figure imgf000111_0001
Figure imgf000112_0001
Figure imgf000113_0001
Figure imgf000114_0001
Figure imgf000115_0001
Figure imgf000116_0001
Figure imgf000117_0001
Figure imgf000118_0001
Figure imgf000119_0001
Figure imgf000120_0001
Figure imgf000121_0001
Figure imgf000122_0001
Figure imgf000123_0001
Figure imgf000124_0001
Figure imgf000125_0001
Figure imgf000126_0001
Figure imgf000127_0001
Figure imgf000128_0001
Figure imgf000129_0001
Figure imgf000130_0001
Figure imgf000131_0001
Figure imgf000132_0001
Figure imgf000133_0001
Figure imgf000134_0001
Figure imgf000135_0001
Figure imgf000136_0001
Figure imgf000137_0001
Figure imgf000138_0001
Figure imgf000139_0001
Figure imgf000140_0001
Figure imgf000141_0001
Figure imgf000142_0001
Figure imgf000143_0001
Figure imgf000144_0001
Figure imgf000145_0001
Figure imgf000146_0001
Figure imgf000147_0001
Figure imgf000148_0001
Figure imgf000149_0001
Figure imgf000150_0001
Figure imgf000151_0001
Figure imgf000152_0001
Figure imgf000153_0001
Figure imgf000154_0001
Figure imgf000155_0001
Figure imgf000156_0001
Figure imgf000157_0001
Figure imgf000158_0001
Figure imgf000159_0001
Figure imgf000160_0001
Figure imgf000161_0001
Figure imgf000162_0001
Figure imgf000163_0001
Figure imgf000164_0001
Figure imgf000165_0001
Figure imgf000166_0001
Figure imgf000167_0001
Figure imgf000168_0001
Figure imgf000169_0001
Figure imgf000170_0001
Figure imgf000171_0001
Figure imgf000172_0001
Figure imgf000173_0001
Figure imgf000174_0001
Figure imgf000175_0001
Figure imgf000176_0001
Figure imgf000177_0001
Figure imgf000178_0001
Figure imgf000179_0001
Figure imgf000180_0001
Figure imgf000181_0001
Figure imgf000182_0001
Figure imgf000183_0001
Figure imgf000184_0001
Figure imgf000185_0001
Figure imgf000186_0001
Figure imgf000187_0001
Figure imgf000188_0001
Figure imgf000189_0001
Figure imgf000190_0001
Figure imgf000191_0001
Figure imgf000192_0001
Los microARN que están enriquecidos en tipos específicos de células inmunitarias se enumeran en la Tabla 13. Además, se descubren miroARN novedosos en las células inmunitarias en la técnica a través de la hibridación de micromatrices y el análisis de micrótomos (Jima DD y col, Blood, 2010, 116:e118-e127; Vaz C y col., BMC Genomics, 2010,11.288). En la Tabla 13, "HCC" representa carcinoma hepatocelular, "LLA" representa leucemia linfoblástica aguda y "LLC" representa leucemia linfocítica crominc.
T l 1 . mi r ARN n l l inm ni ri
Figure imgf000192_0002
Figure imgf000193_0001
Figure imgf000194_0001
Figure imgf000195_0001
Figure imgf000196_0001
Figure imgf000197_0001
Figure imgf000198_0001
III. Modificaciones
En esta invención, en un nucleótido, polinucleótido nucleósido (como los ácidos nucleicos de la descripción, por ejemplo, ARN modificado, molécula de ácido nucleico modificado, ARN modificado, ácido nucleico y ácidos nucleicos modificados), los términos "modificación" o, según corresponda, "modificado" se refiere a la modificación con respecto a los ribonucleótidos A, G, U o C. En general, en esta invención, estas expresiones no hacen referencia a las modificaciones de ribonucleótidos en restos de caperuza de ARNm de extremo 5' de origen natural. En un polipéptido, el término “modificación” se refiere a una modificación respecto al conjunto canónico de 20 aminoácidos.
Las modificaciones pueden ser varias modificaciones distintas. En algunos casos, donde los ácidos nucleicos o el ARN modificado, la región codificante, las regiones flanqueantes y/o las regiones terminales pueden contener una, dos o más (opcionalmente diferentes) modificaciones de nucleósidos o nucleótidos. En algunos casos, un ácido nucleico modificado o un ARN modificado introducido en una célula puede presentar una degradación reducida en la célula, en comparación con un ácido nucleico no modificado o un ARN modificado.
El polinucleótido, la construcción primaria, los ácidos nucleicos o el ARN modificado pueden incluir cualquier modificación útil, como el azúcar, la nucleobase o el enlace internucleósido (p. ej., a un enlace fosfato/a un enlace fosfodiéster/al esqueleto del fosfodiéster). Uno o más átomos de una nucleobase de pirimidina pueden reemplazarse o sustituirse con amino opcionalmente sustituido, tiol opcionalmente sustituido, alquilo opcionalmente sustituido (por ejemplo, metilo o etilo) o halo (por ejemplo, cloro o flúor). En ciertos casos, están presentes modificaciones (por ejemplo, una o más modificaciones) en cada uno de los enlaces de azúcar y entre nucleósidos. Las modificaciones según la presente descripción pueden ser modificaciones de ácidos ribonucleicos (ARN) a ácidos desoxirribonucleicos (ADN), por ejemplo, la sustitución del 2'OH del anillo de ribofuranisil por 2'H, ácidos nucleicos de treosa (TNA), ácidos nucleicos de glicol (GNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA) o híbridos de los mismos). En esta invención se describen modificaciones adicionales.
Como se describe en esta invención, los polinucleótidos, la construcción primaria, los ácidos nucleicos o el ARN modificado de la divulgación no inducen sustancialmente una respuesta inmunitaria innata de una célula donde se introducen los polinucleótidos, las construcciones primarias, los ácidos nucleicos o el ARN modificado (p. ej., ARNm). Las características de una respuesta inmune innata inducida incluyen 1) aumento de la expresión de citocinas proinflamatorias, 2) activación de PRR intracelulares (RIG-I, MDA5, etc. y/o 3) terminación o reducción de la traducción de proteínas.
En ciertos casos, puede ser deseable que una molécula de ácido nucleico modificada introducida en la célula se degrade intracelularmente. Por ejemplo, puede ser preferible la degradación de una molécula de ácido nucleico modificada si se desea un tiempo preciso de la producción de proteínas. Por tanto, en algunos casos, la divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico modificada que contiene un dominio de degradación, sobre el que se puede actuar de manera dirigida dentro de una célula. En otro aspecto, la presente descripción proporciona polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos o ARN modificado que comprenden un nucleósido o nucleótido que puede interrumpir la unión de un surco principal que interactúa, por ejemplo, unión, pareja con los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos o ARN modificado. (p. ej., cuando el nucleótido modificado ha disminuido la afinidad de unión a la pareja de interacción del surco principal, en comparación con un nucleótido no modificado).
Los polinucleótidos, las construcciones primarias los ácidos nucéicos y el ARNm pueden incluir opcionalmente otros agentes (p. ej., agentes inductores de ARNi, agentes ARNi, siRNA, ARNsh, ARNmi, ARN antisentido, ribozimas, ADN catalítico, ARNt, ARN que inducen la formación de triple hélice, aptámeros, vectores, etc.). En algunos casos, los polinucleótidos, las construcciones primarias, los ácidos nucleicos o el ARN modificado pueden incluir uno o más ARN mensajeros (ARNm) que tienen uno o más nucleósidos o nucleótidos modificados (es decir, moléculas de ARNm modificadas). A continuación se detallan los detalles de estos ácidos nucleicos o ARN modificado.
Moléculas de ARNm modificadas
Los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos o ARN modificado de la divulgación incluyen una primera región de nucleósidos enlazados que codifican un polipéptido de interés, una primera región flanqueante ubicada en el extremo 5' de la primera región y una segunda región flanqueante ubicada en el extremo 3' de la primera región. La primera región de nucleósidos enlazados puede ser una región traducible.
En algunos casos, el polinucleótido, construcción primaria o ARNmm (p. ej., la primera región, la primera región flanqueante o la segunda región flanqueante) incluye un número n de nucleósidos enlazados que tienen cualquier base, azúcar, estructura principal, bloque de construcción u otra estructura o fórmula, incluidos, entre otros, los de Fórmula I a IX o cualquier subestructura de los mismos como se describe en la Solicitud Internacional PCT/US12/58519 depositada el 3 de octubre de 2012 (Número de Expediente de Abogado: M009.20). Tales estructuras incluyen modificaciones del azúcar, nucleobase, enlace internucleosídico o combinaciones de los mismos.
Combinaciones de modificaciones químicas incluyen en las que se enseñan, incluidas, entre otras, las descritas en la Solicitud internacional PCT/US12/58519 depositada el 3 se octubre de 2012 (Número de Expediente de Abogado: M009.20).
La síntesis de polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la presente descripción puede realizarse según los procedimientos descritos en la Solicitud Internacional PCT/US12/58519 depositada el 3 de octubre de 2012 (Número de Expediente de Abogado: M009.20).
La nucleobase puede seleccionarse de entre el grupo que consiste en citosina, guanina, adenina y uracilo.
En algunos casos, la nucleobase modificada es un uracilo modificado. Nucleobases y nucleósidos ejemplares que tienen un uracilo modificado incluyen pseudouridina (y ), ribonucleósido de piridin-4-ona, 5-aza-uridina, 6-aza-uridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-uridina (s2u), 4-tio-uridina (s4U), 4-tio-pseudouridina, 2-tio-pseudouridina, 5-hidroxiuridina (ho5U), 5-aminoallil-uridina, 5-halo-uridina (p.ej., 5-yodo-uridina o 5-bromo-uridina), 3-metiluridina (m3U), 5-metoxiuridina (mo5U), uridina ácido 5-oxiacético (cmo5U), uridina ácido 5-oxiacético metil éster (mcmo5U), 5-carboximetiluridina (cm5U), 1-carboximetil-pseudouridina, 5-carboxihidroximetil-uridina (chm5U), 5-carboxihidroximetil-uridina metil ester (mchm5U), 5-metoxicarbonilmetil-uridina (mcm5U), 5-metoxicarbonilmetil-2-tio-uridina (mcm5s2U), 5-aminometil-2-tio-uridina (nm5s2U), 5-metilaminometil-uridina (mnm5U), 5-metilaminometil-2-tio-uridina (mnm5s2U), 5-metilaminometil-2-seleno-uridina (mnm5se2U), 5-carbamoilmetil-uridina (ncm5U), 5-carboximetilaminometil-uridina (cmnm5U), 5-carboximetilaminometil-2-tio-uridina (cmnm5s2U), 5-propinil-uridina, 1-propinil-pseudouridina, 5-taurinometiluridina (Tm5U), 1-taurinometil-pseudouridina, 5-taurinometil-2-tio-uridina (Tm5s2U), 1-taurinometil-4-tiopseudouridina, 5-metil-uridina (m5U, i.e., teniendo la nucleobase deoxitimina), 1-metil-pseudouridina (m1^ ), 5-metil-2-tio-uridina (m5s2U), 1-metil-4-tio-pseudouridina (m1s4^ ), 4-tio-1-metil-pseudouridina, 3-metil-pseudouridina (m3^ ), 2-tio-1-metil-pseudouridina, 1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, dihidrouridina (D), dihidropseudouridina, 5,6-dihidrouridina, 5-metil-dihidrouridina (m5D), 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-metoxiuridina, 2-metoxi-4-tio-uridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, N1-metilpseudouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina (acp3U), 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina (acp3^ ), 5-(isopentenilaminometil)uridina (inm5U), 5-(isopentenilaminometil)-2-tio-uridina (inm5s2U), a-tio-uridina, 2'-O-metiluridina (Um), 5,2'-O-dimetil-uridina (m5Um), 2'-O-metil-pseudouridina (^m), 2-tio-2'-O-metil-uridina (s2Um), 5-metoxicarbonilmetil-2'-O-metil-uridina (mcm5Um), 5-carbamoilmetil-2'-O-metil-uridina (ncm5Um), 5-carboximetilaminometil-2'-O-metil-uridina (cmnm5Um), 3,2'-O-dimetil-uridina (m3Um), y 5-(isopentenilaminometil)-2'-O-metil-uridina (inm5Um), 1 -tio-uridina, deoxitimidina, 2'-F-ara-uridina, 2'-F-uridina, 2'-OH-ara-uridina, 5-(2-carbometoxivinil) uridina, y 5-[3-(1-E-propenilamino)uridina.
En algunos casos, la nucleobase modificada es una citosina modificada. Nucleobases y nucleósidos ejemplares que tienen una citosina modificada incluyen 5-aza-citidina, 6-aza-citidina, pseudoisocitidina, 3-metil-citidina (m3C), N4-acetil-citidina (ac4C), 5-formil-citidina (f®C), N4-metil-citidina (m4C), 5-metil-citidina (m5C), 5-halo-citidina (p.ej., 5-yodocitidina), 5-hidroximetil-citidina (hm5C), 1-metil-pseudoisocitidina, pirrolo-citidina, pirrolo-pseudoisocitidina, 2-tiocitidina (s2C), 2-tio-5-metil-citidina, 4-tio-pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-1-deazapseudoisocitidina, 1-metil-1-deaza-pseudoisocitidina, zebularina, 5-aza-zebularina, 5-metil-zebularina, 5-aza-2-tiozebularina, 2-tio-zebularina, 2-metoxi-citidina, 2-metoxi-5-metil-citidina, 4-metoxi-pseudoisocitidina, 4-metoxi-1-metilpseudoisocitidina, lisidina (k2C), a-tio-citidina, 2'-O-metil-citidina (Cm), 5,2'-O-dimetil-citidina (m5Cm), N4-acetil-2'-O-metil-citidina (ac4Cm), N4,2'-O-dimetil-citidina (m4Cm), 5-formil-2'-O-metil-citidina (f®Cm), N4,N4,2'-O-trimetil-citidina (m42Cm), 1-tio-citidina, 2'-F-ara-citidina, 2'-F-citidina, y 2'-OH-ara-citidina.
En algunos casos, la nucleobase modificada es una adenina modificada. Nucleobases y nucleósidos ejemplares que tienen una adenina modificada incluyen 2-amino-purina, 2, 6-diaminopurina, 2-amino-6-halo-purina (por ejemplo, 2-amino-6-cloro-purina), 6-halo-purina (por ejemplo, 6-cloro-purina), 2-amino-6-metil-purina, 8-azido-adenosina, 7-deaza-adenina, 7-deaza-8-aza-adenina, 7-deaza-2-amino-purina, 7-deaza-8-aza-2-amino-purina, 7-deaza-2,6-diaminopurina, 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurina, 1-metil-adenosina (m1A), 2-metil-adenina (m2A), N6-metiladenosina (m6A), 2-metiltio-N6-metil-adenosina (ms2m6A), N6-isopenteniladenosina (i6A), 2-metiltio-N6-isopentenil-adenosina (ms2i6A), N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina (io6A), 2-metiltio-N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina (ms2io6A), N6 glicinilcarbamoiladenosina (g6A), N6-treonilcarbamoiladenosina (M), N6-metil-N6-treonilcarbamoil-adenosina (m6t6A), 2-metiltio-N6-treonil carbamoiladenosina (ms2g6A), N6,N6-dimetil-adenosina (m62A), N6-hidroxinorvalilcarbamoiladenosina (hn6A), 2-metiltio-N6-hidroxinorvalilcarbamoil-adenosina (ms2hn6A), N6-acetil-adenosina (ac6A), 7-metiladenina, 2-metiltio-adenina, 2-metoxi-adenina, a-tio-adenosina, 2'-O-metil-adenosina (Am), N6,2'-O-dimetiladenosina (m6Am), N6,N6,2'-O-trimetil-adenosina (m62Am), 1,2'-O-dimetil-adenosina (m1Am), 2'-O-ribosiladenosina (fosfato) (Ar(p)), 2-amino-N6-metil-purina, 1-tio-adenosina, 8-azido-adenosina, 2'-F-ara-adenosina, 2'-F-adenosina, 2'-OH-ara-adenosina, y N6-(19-amino-pentaoxanonadecil)-adenosina.
En algunos casos, la nucleobase modificada es una guanina modificada. Nucleobases y nucleósidos ejemplares que tienen una guanina modificada incluyen inosina (I), 1-metil-inosina (m1l), wiosina (imG), metilwiosina (mimG), 4-demetil-wiosina (imG-14), isowiosina (imG2), wibutosina (yW), peroxiwibutosina (o2yW), hidroxiwibutosina (OHyW), hidroxiwibutosina submodificada (OHyW*), 7-deaza-guanosina, queuosina (Q), epoxiqueuosina (oQ), galactosilqueuosina (galQ), mannosil-queuosina (manQ), 7-ciano-7-deaza-guanosina (preQo), 7-aminometil-7-deaza-guanosina (preQ1), arcaeosina (G+), 7-deaza-8-aza-guanosina, 6-tio-guanosina, 6-tio-7-deaza-guanosina, 6-tio-7-deaza-8-azaguanosina, 7-metilguanosina (m7G), 6-tio-7-metil-guanosina, 7-metil-inosine, 6-metoxi-guanosina, 1-metilguanosina (m1G), N2-metil-guanosina (m2G), N2,N2-dimetil-guanosina (m22G), N2,7-dimetil-guanosina (m2'7G), N2, N2,7-dimetilguanosina (m2'2'7G), 8-oxo-guanosina, 7-metil-8-oxo-guanosina, 1-metil-6-tio-guanosina, N2-metil-6-tio-guanosina, N2,N2-dimetil-6-tio-guanosina, a-tio-guanosina, 2'-O-metil-guanosina (Gm), N2-metil-2'-O-metil-guanosina (m2Gm), N2,N2-dimetil-2'-O-metil-guanosina (m22Gm), 1-metil-2'-O-metil-guanosina (m1Gm), N2,7-dimetil-2'-O-metil-guanosina (m2'7Gm), 2'-O-metil-inosina (lm), 1,2'-O-dimetil-inosina (m1lm), 2'-O-ribosilguanosina (fosfato) (Gr(p)), 1-tioguanosina, O6-metil-guanosina, 2'-F-ara-guanosina, y 2'-F-guanosina.
El ADN y el ARN de fosforotioato tienen una mayor resistencia a las nucleasas y, posteriormente, una vida media más larga en un entorno celular. Se espera que los ácidos nucleicos unidos a fosforotioato también reduzcan la respuesta inmunitaria innata a través de unión a/activación de moléculas inmunes innatas celulares.
La nucleobase del nucleótido puede seleccionarse independientemente de entre una purina, una pirimidina, una purina o un análogo de pirimidina. Por ejemplo, cada nucleobase puede seleccionarse independientemente de entre adenina, citosina, guanina, uracilo o hipoxantina. La nucleobase también puede incluir, por ejemplo, derivados naturales y sintéticos de una base, incluidas pirazolo[3,4-d] pirimidinas, 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros alquil derivados de adenina y guanina, 2-propil y otros alquil derivados de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo (p. ej., 8-bromo), 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas 8-sustituidas y guaninas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometil y otros uracilos y citosinas 5-sustituidas, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, deazaguanina, 7-deazaguanina, 3-deazaguanina, deazaadenina, 7-deazaadenina, 3-deazaadenina, pirazolo [3,4-d] pirimidina, imidazo [1,5-a] 1,3,5 triazinonas, 9-deazapurinas, imidazo [4,5-d] pirazinas, tiazolo [4, 5-d] pirimidinas, pirazin-2-onas, 1,2,4-triazina, piridazina; y 1,3,5 triazina. Cuando los nucleótidos se representan usando la abreviatura A, G, C, T o U, cada letra se refiere a la base representativa y/o derivados de las mismas, por ejemplo, A incluye adenina o análogos de adenina, por ejemplo, 7-deaza adenina).
Modificaciones en el enlace internucleósido
Los nucleótidos modificados, que se pueden incorporar en un ácido nucleico o en una molécula de ARN modificada, se pueden modificar en el enlace internucleósido (p. ej., el esqueleto de fosfato). En esta invención, en el contexto de los polinucleótidos, construcciones primarias, ácidos nucleicos o cadena principal de ARN modificado, las frases "fosfato" y "fosfodiéster" se usan indistintamente. Los grupos fosfato del esqueleto se pueden modificar reemplazando uno o más de los átomos de oxígeno con un sustituyente diferente. Además, los nucleósidos y nucleótidos modificados pueden incluir la sustitución total de un resto fosfato no modificado con otro enlace internucleósido como se describe en esta invención. Los ejemplos de grupos fosfato modificados incluyen, pero no se limitan a, fosforotioato, fosforoselenatos, boranofosfatos, ésteres de boranofosfato, hidrógeno fosfonatos, fosforamidatos, fosforodiamidatos, fosfonatos de alquilo o arilo y fosfotriésteres. Los fosforoditioatos tienen ambos oxígenos no enlazantes reemplazados por azufre. El enlazador de fosfato también se puede modificar mediante la sustitución de un enlace de oxígeno con nitrógeno (fosforamidatos en puente), azufre (fosforotioatos en puente) y carbono (fosfonatos de metileno en puente).
El resto de fosfato sustituido con a-tio se proporciona para conferir estabilidad a los polímeros de ARN y ADN a través de los enlaces del esqueleto de fosforotioato no naturales. El ADN y el ARN de fosforotioato tienen una mayor resistencia a las nucleasas y, posteriormente, una vida media más larga en un entorno celular. Si bien no deseamos limitarnos a la teoría, se espera que los polinucleótidos unidos a fosforotioato, las construcciones primarias, los ácidos nucleicos o las moléculas de ARN modificadas también reduzcan la respuesta inmunitaria innata a través de una unión/activación más débil de moléculas inmunes innatas celulares.
En casos específicos, un nucleósido modificado incluye un alfa-tio-nucleósido (p. ej., 5'-O-(1-tiofosfato)-adenosina, 5'-O-(1-tiofosfato)-citidina (a-tio-citidina), 5'-O-(1-tiofosfato)-guanosina, 5'-O-(1-tiofosfato)-uridina o 5'-O-(1-tiofosfato)-pseudouridina).
Otros enlaces intemucleósidos que pueden emplearse según la presente descripción, incluidos los enlaces internucleósidos que no contienen un átomo de fósforo, se describen a continuación en esta invención.
Combinaciones de azúcares modificados, nucleobases y enlaces internucleosídicos
Los ácidos nucleicos o el ARN modificado de la descripción pueden incluir una combinación de modificaciones en el azúcar, la nucleobase y/o el enlace internucleósido. Estas combinaciones pueden incluir una o más modificaciones descritas en esta invención. Por ejemplo, cualquiera de los nucleótidos descritos en esta invención en las Fórmulas (Ia), (Ia-1)-(Ia-3), (Ib)-(If), (iia)-(Mp), (IIb-1), ( IIb-2), (Mc-1)-(Mc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVI) y (IXa)-(IXr) se pueden combinar con cualquier de las nucleobases descritas en esta invención (p. ej., en las Fórmulas (b1)-(b43) o cualquier otra descrita en esta invención).
Síntesis de Ácidos Nucleicos o Moléculas de ARN Modificado (ARN modificados)
Los ácidos nucleicos para su uso según la divulgación pueden prepararse según cualquier técnica útil como se describe en esta invención o cualquier técnica disponible que incluye, entre otras, síntesis química, síntesis enzimática, que generalmente se denomina transcripción in vitro, escisión enzimática o química de un precursor más largo, etc. Los procedimientos para sintetizar ARN son conocidos en la técnica (ver, p.ej., Gait, M.J. (ed.) Oligonucleotide synthesis: a practical approach, Oxford [Oxfordshire], Washington, DC: IRL Press, 1984; y Herdewijn, P. (ed.) Oligonucleotide synthesis: methods and applications, Methods in Molecular Biology, v. 288 (Clifton, N.J.) Totowa, N.J.: Humana Press, 2005).
Los nucleósidos y nucleótidos modificados utilizados en la síntesis de los ARN modificados descritos en esta invención pueden prepararse a partir de materiales de partida fácilmente disponibles utilizando los siguientes procedimientos generales. Se apreciará que cuando se dan condiciones de procedimiento típicas o preferidas (es decir, temperaturas de reacción, tiempos, relaciones molares de reactivos, disolventes, presiones, etc.), también se pueden utilizar otras condiciones de procedimiento a menos que se indique lo contrario. Las condiciones de reacción óptimas pueden variar con los reactivos particulares o el disolvente utilizado, pero un experto en la técnica puede determinar dichas condiciones mediante procedimientos de optimización de rutina.
Los procedimientos descritos en esta invención pueden controlarse según cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, la formación de productos se puede controlar por medios espectroscópicos, como la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (por ejemplo, 1H o 13C) espectroscopia infrarroja, espectrofotometría (por ejemplo, UV-visible) o espectrometría de masas, o mediante cromatografía, como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) o cromatografía en capa fina.
La preparación de nucleósidos y nucleótidos modificados utilizados en la fabricación o síntesis de ARN modificados de la presente invención puede implicar la protección y desprotección de diversos grupos químicos. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente la necesidad de protección y desprotección y la selección de grupos protectores apropiados.
La química de los grupos protectores se puede encontrar, por ejemplo, en Greene, y col., Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., Wiley & Sons, 1991.
Las reacciones de los procedimientos descritos en esta invención se pueden desarrollar en solventes adecuados que un experto en la técnica de síntesis orgánica puede seleccionar. Los solventes adecuados pueden ser sustancialmente no reactivos con los materiales de partida (reactivos), los intermedios o los productos a las temperaturas a las que se desarrollan las reacciones, es decir, temperaturas que varían entre la temperatura de congelamiento del solvente y la temperatura de ebullición del solvente. Se puede realizar determinada reacción en un solvente o en una mezcla de más de un solvente. Según la etapa de reacción particular, un experto puede seleccionar solventes adecuados para una etapa de reacción particular.
La resolución de mezclas racémicas de nucleósidos y nucleótidos modificados se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los numerosos procedimientos conocidos en la técnica. Un procedimiento de ejemplo incluye la recristalización fraccionada usando un "ácido de resolución quiral" que es un ácido orgánico formador de sal ópticamente activo. Por ejemplo, los agentes de resolución adecuados para los procedimientos de recristalización fraccionada son ácidos ópticamente activos, tales como las formas D y L de ácido tartárico, ácido d iacetiltartárico, ácido dibenzoiltartárico, ácido mandélico, ácido málico, ácido láctico o los diversos ácidos camforsulfónicos ópticamente activos. La resolución de mezclas racémicas también puede llevarse a cabo mediante la elución en una columna con un agente de resolución ópticamente activado (por ejemplo, dinitrobenzoilfenilglicina). La composición de disolvente de elución adecuada puede ser determinada por un experto en la técnica.
Se pueden preparar nucleósidos y nucleótidos modificados (por ejemplo, moléculas de bloques de construcción) según los procedimientos sintéticos descritos en Ogata y col., J. Org. Chem. 74:2585-2588 (2009); Purmal y col., Nucl. Acids Res. 22(1): 72-78, (1994); Fukuhara y col., Biochemistry, 1(4): 563-568 (1962); y Xu y col., Tetrahedron, 48(9): 1729­ 1740 (1992).
Se pueden preparar nucleósidos y nucleótidos modificados (por ejemplo, moléculas de bloques de construcción) según los procedimientos sintéticos descritos en Ogata y col., J. Org. Chem. 74:2585-2588 (2009); Purmal y col., Nucl. Acids Res. 22(1): 72-78, (1994); Fukuhara y col., Biochemistry, 1(4): 563-568 (1962); y Xu y col., Tetrahedron, 48(9): 1729­ 1740 (1992).
Los ácidos nucleicos modificados no tienen por qué ser modificados en forma uniforme en toda la longitud de la molécula. Pueden existir diferentes modificacione de nucleótidos y/o estructuras principales en diversas posiciones en el ácido nucleico. Un experto en la técnica entenderá que los análogos de nucleótidos u otra modificación o modificaciones se pueden encontrar en cualquier posición de un ácido nucleico de manera que la función del ácido nucleico no se vea sustancialmente afectada. La modificación puede ser una modificación en el extremo 5' o 3'. Los ácidos nucleicos pueden contener como mínimo uno y como máximo 100 % de nucleótidos modificados, o cualquier porcentaje intermedio, tal como al menos 50 % de nucleótidos modificados, al menos 80 % de nucleótidos modificados o al menos 90 % de nucleótidos modificados. Por ejemplo, uno o más o todos los tipos de nucleótidos (p.ej., purina o pirimidina, o cualquiera o más o todos los A, G, U, C) pueden o no estar uniformemente modificados en un ácido nucleico o ARN modificado del divulgación, o en una región de secuencia predeterminada dada de la misma. En algunos casos, todos los nucleótidos X en un ácido nucleico o ARN modificado de la descripción (o en una región de secuencia dada del mismo) están modificados, donde X puede ser cualquiera de los nucleótidos A, G, U, C o cualquiera de las combinaciones. A+G, A+U, A+C, G+U, G+C, U+C, A+G+U, A+G+C, G+U+C o A+G+C.
Pueden existir diferentes modificaciones de azúcar, modificaciones de nucleótidos y/o enlaces internucleósidos (p. ej., estructuras de la columna vertebral) en diversas posiciones en los ácidos nucleicos o el ARN modificado. Un experto en la técnica entenderá que los análogos de nucleótidos u otra modificación o modificaciones se pueden encontrar en cualquier posición de un ácido nucleico o ARN modificado de manera que la función del ácido nucleico o del ARN modificado no se vea sustancialmente afectada. La modificación puede ser una modificación en el extremo 5' o 3'. Los ácidos nucleicos o ARN modificado puede contener entre aproximadamente el 1 % y aproximadamente el 100 % de nucleótidos modificados (ya sea con relación al contenido de nucleótidos general, o en relación con uno o más tipos de nucleótidos, es decir, uno o más de A, G, U o C) o cualquier porcentaje interviniente (por ejemplo, de 1 % a 20 %, de 1 % a 25 %, de 1 % a 50 %, de 1 % a 60 %, de 1 % a 70 %, de 1 % a 80 %, de 1 % a 90 %, de 1 % a 95 %, de 10 % a 20 %, de 10 % a 25 %, de 10 % a 50 %, de 10 % a 60 %, de 10 % a 70 %, de 10 % a 80 %, de 10 % a 90 %, de 10 % a 95 %, de 10 % a 100 %, de 20 % a 25 %, de 20 % a 50 %, de 20 % a 60 %, de 20 % a 70 %, de 20 % a 80 %, de 20 % a 90 %, de 20 % a 95 %, de 20 % a 100 %, de 50 % a 60 %, de 50 % a 70 %, de 50 % a 80 %, de 50 % a 90 %, de 50 % a 95 %, de 50 % a 100 %, de 70 % a 80 %, de 70 % a 90 %, de 70 % a 95 %, de 70 % a 100 %, de 80 % a 90 %, de 80 % a 95 %, de 80 % a 100 %, de 90 % a 95 %, de 90 % a 100 % y de 95 % a 100 %).
En algunos casos, los ácidos nucleicos o el ARN modificado incluyen una pirimidina modificada (por ejemplo, un uracilo/uridina/U modificado o una citosina/citidina/C modificada). En algunos casos, el uracilo o la uridina (generalmente: U) en los ácidos nucleicos o la molécula de ARN modificada se puede reemplazar con aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 100 % de un uracilo modificado o una uridina modificada (por ejemplo, del 1 % al 20 %, del 1 % al 25 %, del 1 % al 50 %, del 1 % al 60 %, del 1 % al 70 %, del 1 % al 80 %, del 1 % al 90 %, del 1 % al 95 %, del 10 % al 20 %, del 10 % al 25 %, del 10 % al 50 %, del 10 % al 60 %, del 10 % al 70 %, del 10 % al 80 %, del 10 % al 90 %, del 10 % al 95 %, del 10 % al 100 %, del 20 % al 25 %, del 20 % al 50 %, del 20 % al 60 %, del 20 % al 70 %, del 20 % al 80 %, del 20 % al 90 %, del 20 % al 95 %, del 20 % al 100 %, del 50 % al 60 %, del 50 % al 70 %, del 50 % al 80 %, del 50 % al 90 %, del 50 % al 95 %, del 50 % al 100 %, del 70 % al 80 %, del 70 % al 90 %, del 70 % al 95 %, del 70 % al 100 %, del 80 % al 90 %, del 80 % al 95 %, del 80 % al 100 %, del 90 % al 95 %, del 90 % al 100 % y del 95 % al 100 % de un uracilo modificado o de una uridina modificada). El uracilo o la uridina modificados se pueden reemplazar por un compuesto que tiene una estructura única simple o por una pluralidad de compuestos que tienen estructuras diferentes (por ejemplo, 2, 3, 4 o más estructuras únicas, como se describe en esta invención). En algunos casos, la citosina o citidina (generalmente: C) en el ácido nucléico o molécula de ARN modificada se puede reemplazar con de aproximadamente 1 % a aproximadamente 100 % de una citosina modificada o citidina modificada (p. ej., de 1 % a 20 %, del 1 % al 25 %, del 1 % al 50 %, del 1 % al 60 %, del 1 % al 70 %, del 1 % al 80 %, del 1 % al 90 %, del 1 % al 95 %, del 10 % al 20 %, del 10 % al 25 %, del 10 % al 50 %, del 10 % al 60 %, del 10 % al 70 %, del 10 % al 80 %, del 10 % al 90 %, del 10 % al 95 %, del 10 % al 100 %, del 20 % al 25 %, del 20 % al 50 %, del 20 % al 60 %, del 20 % al 70 %, del 20 % al 80 %, del 20 % al 90 %, del 20 % al 95 %, del 20 % al 100 %, del 50 % al 60 %, del 50 % al 70 %, del 50 % al 80 %, del 50 % al 90 %, del 50 % al 95 %, del 50 % al 100 %, del 70 % al 80 %, del 70 % al 90 %, del 70 % al 95 %, del 70 % al 100 %, del 80 % al 90 %, del 80 % al 95 %, del 80 % al 100 %, del 90 % al 95 %, del 90 % al 100 % y del 95 % al 100 % de una citosina modificada o citidina modificada). La citosina o citidina modificada se puede reemplazar por un compuesto que tiene una estructura simple única o por una pluralidad de compuestos que tienen estructuras diferentes (por ejemplo, 2, 3, 4 o más estructuras únicas, como se describe en esta invención).
Otros componentes del ácido nucleico son opcionales y son beneficiosos en algunos casos. Por ejemplo, una región no traducida (UTR) 5' y/o se proporciona una 3'UTR, donde uno o ambos pueden contener independientemente una o más modificaciones de nucleótidos diferentes. En tales casos, también pueden estar presentes modificaciones de nucleótidos en la región traducible. También se proporcionan ácidos nucleicos que contienen una secuencia Kozak que puede incluir una secuencia IRES o no incluir una secuencia IRES (ver, por ejemplo, los polinucleótidos descritos en la Tabla 30 en el Ejemplo 31).
Además, se proporcionan ácidos nucleicos que contienen una o más secuencias de nucleótidos intrónicos capaces de escindirse del ácido nucleico.
Combinaciones de nucleótidos
Ejemplos de nucleótidos modificados y combinaciones de nucleótidos modificados se proporcionan a continuación en la Tabla 14. Estas combinaciones de nucleótidos modificados pueden usarse para formar los polinucleótidos o ARN modificado de la invención. A menos que se indique lo contrario, los nucleótidos modificados pueden sustituirse completamente por los nucleótidos naturales de los ácidos nucleicos o el ARN modificado de la divulgación. Como ejemplo no limitante, el nucleótido natural uridina puede sustituirse con un nucleósido modificado descrito en esta invención. En otro ejemplo no limitante, el nucleótido uridina natural puede estar parcialmente sustituido (p. ej., aproximadamente 0,1 %, 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99,9 %) con al menos uno de los nucleósidos modificados descritos en esta invención.
Tabla 14. Modificaciones químicas
Figure imgf000203_0001
Figure imgf000204_0001
Ciertos nucleótidos modificados y combinaciones de nucleótidos han sido explorados por los actuales inventores. Estos hallazgos se describen en Solicitud de Patente de EE. UU. N° 13/251,840, depositada el 3 de octubre de 2011, titulada Modified Nucleotides, and Nucleic Acids, and Uses Thereof, ahora abandonada, Solicitud de Patente de EE. UU. N° 13/481,127, depositada el 25 de mayo de 2012, titulada Modified Nucleotides, and Nucleic Acids, and Uses Thereof, Publicación de Patente Internacional N° WO2012045075, depositada el 3 de octubre de 2011, titulada Modified Nucleosides, Nucleotides, And Nucleic Acids, and Uses Thereof, Publicación de Patente de EE. UU. N° US20120237975 depositada el 3 de octubre de 2011, titulada Engineered Nucleic Acids and Method of Use Thereof, y Publicación de Patente Internacional N° WO2012045082.
A continuación, en la Tabla 15, se proporcionan más ejemplos de combinaciones de nucleótidos modificadas. Estas combinaciones de nucleótidos modificados pueden usarse para formar los ácidos nucleicos de la descripción.
Tabla 15. Modificaciones químicas
Figure imgf000205_0001
En algunos casos, al menos el 25 % de las citosinas se reemplazan por un compuesto de fórmula (b10)-(b14), (b24), (b25) o (b32)-(b35) (por ejemplo, al menos alrededor del 30 % , al menos alrededor del 35 %, al menos alrededor del 40 %, al menos alrededor del 45 %, al menos alrededor del 50 %, al menos alrededor del 55 %, al menos alrededor del 60 %, al menos alrededor del 65 %, al menos alrededor del 70 %, al menos al menos alrededor del 75 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 85 %, al menos alrededor del 90 %, al menos alrededor del 95 % o alrededor del 100 % de, por ejemplo, un compuesto de Fórmula (b10) o (b32)).
En algunos casos, al menos el 25 % de los uracilos se reemplazan por un compuesto de fórmula (b1)-(b9), (b21)-(b23) o (b28)-(b31) (por ejemplo, al menos alrededor del 30 % , al menos alrededor del 35 %, al menos alrededor del 40 %, al menos alrededor del 45 %, al menos alrededor del 50 %, al menos alrededor del 55 %, al menos alrededor del 60 %, al menos alrededor del 65 %, al menos alrededor del 70 %, al menos alrededor del 75 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 85 %, al menos alrededor del 90 %, al menos alrededor del 95 % o alrededor del 100 % de, por ejemplo, un compuesto de Fórmula (b1), (b8), ( b28), (b29) o (b30)).
En algunos casos, al menos el 25 % de las citosinas se reemplazan por un compuesto de Fórmula (b1 0)-(b14), (b24), (b25) o (b32)-(b35) (por ejemplo, Fórmula (b10) o (b32)), y al menos el 25 % de los uracilos se sustituyen por un compuesto de Fórmula (b1)-(b9), (b21)-(b23) o (b28)-(b31) (por ejemplo, Fórmula (b1) , (b8), (b28), (b29) o (b30)) (por ejemplo, al menos alrededor del 30 %, al menos alrededor del 35 %, al menos alrededor del 40 %, al menos alrededor del 45 %, al menos alrededor del 50 % , al menos alrededor del 55 %, al menos alrededor del 60 %, al menos alrededor del 65 %, al menos alrededor del 70 %, al menos alrededor del 75 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 85 %, al menos alrededor del 90 %, al menos menos alrededor del 95 %, o alrededor del 100 %).
Modificaciones que incluyen Enlazador y Carga Útil
Carga útil
Los procedimientos y composiciones descritos en esta invención son útiles para administrar una carga útil a una diana biológica. La carga útil se puede utilizar, por ejemplo, para marcar (por ejemplo, un agente detectable como un fluoróforo) o con fines terapéuticos (por ejemplo, una citotoxina u otro agente terapéutico).
Carga útil: Agentes terapéuticos
La carga útil puede ser un agente terapéutico como una citotoxina, un ion radiactivo, un agente quimioterapéutico u otro agente terapéutico. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenipósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracinadiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidraminicinidiona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, maitansinoides, p.ej., maitansinol (ver Pat. EE. UU. N° 5.208.020), CC-1065, (ver Pat. e E. UU. N° 5.475.092, 5.585.499, 5.846.545), y análogos u homólogos de los mismos. Los iones radiactivos incluyen, pero no se limitan a, yodo (p.ej., yodo 125 o yodo 131), estroncio 89, fósforo, paladio, cesio, iridio, fosfato, cobalto, itrio 90, samario 153 y praseodimio. Otros agentes terapéuticos incluyen, entre otros, antimetabolitos (p.ej., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (p.ej., mecloretamina, tioepa clorambucilo, CC-1065, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (p.ej., daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (p.ej., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (p.ej., vincristina, vinblastina, taxol y maitansinoides).
Carga útil: Detectable Agentes
Ejemplos de sustancias detectables incluyen varias moléculas orgánicas pequeñas, compuestos inorgánicos, nanopartículas, enzimas o sustratos de enzimas, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales quimioluminiscentes, materiales radiactivos y agentes de contraste. Dichos marcadores ópticamente detectables incluyen, por ejemplo, sin limitación, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'disulfónico; acridina y derivados: acridina, isotiocianato de acridina; ácido 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfónico (EDANS); disulfonato de 4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5; N-(4-anilino-I-naftil)maleimida; antranilamida; BODIPY; Amarillo brillante; cumarina y derivados; cumarina, 7-amino-4-metilcumarina (AMC, Coumarin 120), 7-amino-4-trifluorometilculuarina (Coumaran 151); colorantes de cianina; cianosina; 4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI); 5'5"-dibromopirogalol-sulfonaftaleína (Rojo de bromopirogalol); 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina; pentaacetato de dietilentriamina; ácido 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2'-disulfónico; ácido 4,4'-diisotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico; cloruro de 5-[dimetilamino]-naftaleno-1-sulfonilo (DNS, dansilcloruro); 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC); eosina y derivados; eosina , isotiocianato de eosina, eritrosina y derivados, eritrosina B, eritrosina, isotiocianato, etidio, fluoresceína y derivados; 5-carboxifluoresceína (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceína (DTAF), 2',7'-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, QFITC , (XRITC); fluorescamina; IR144; IR1446; isotiocianato de verde de malaquita; 4-metilumbeliferonaortocresolftaleína; nitrotirosina; pararosanilina; Fenol rojo; B-ficoeritrina; o-ftaldialdehído; pireno y derivados: pireno, butirato de pireno, succinimidil 1-pireno; puntos cuánticos de butirato; Rojo reactivo 4 (CibacronTM Brilliant Red 3B-A) rodamina y derivados: 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirrodamina (R6G), lisamina rodamina B cloruro de sulfonilo rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, rodamina isotiocianato de X, sulforrodamina B, sulforrodamina 101, cloruro de sulfonilo derivado de sulforrodamina 101 (Texas Red); N,N,N',N'tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA); tetrametil rodamina; isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC); riboflavina; ácido rosólico; derivados de quelatos de terbio; cianina-3 (Cy3); cianina-5 (Cy5); cianina-5,5 (Cy5,5), cianina-7 (Cy7); IRD 700; IRD 800; Alexa647; La Jolta Azul; ftalocianina; y naftalocianina. En algunos casos, la etiqueta detectable es un colorante fluorescente, como Cy5 y Cy3.
Ejemplos de material luminiscente incluyen luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina.
Ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 18F, 67Ga, 81mKr, 82Rb, 111In, 123I, 133Xe, 2°1TI, 125I, 35S, 14C, or 3H, 99mTc (p. ej., como pertecnetato (tecnetato(VII), TcO4-) ya sea directa o indirectamente, u otro radioisótopo detectable por conteo directo de radioemisión o por conteo de centelleo.
Además, se pueden usar agentes de contraste, p.ej., agentes de contraste para MRI o NMR, para CT de rayos X, formación de imágenes Raman, tomografía de coherencia óptica, formación de imágenes por absorción, formación de imágenes por ultrasonidos o formación de imágenes térmicas Ejemplos de agentes de contraste incluyen oro (p.ej., nanopartículas de oro), gadolinio (p.ej., Gd quelado), óxidos de hierro (p.ej., óxido de hierro superparamagnético (SPIO), nanopartículas de óxido de hierro monocristalino (MION) y óxido de hierro superparamagnético ultrapequeño (USPIO )), quelatos de manganeso (p.ej., Mn-DPDP), sulfato de bario, medios de contraste yodados (iohexol), microburbujas o perfluorocarbonos.
En algunos casos, el agente detectable es un precursor no detectable que se vuelve detectable tras la activación. Ejemplos incluyen construcciones fluorogénicas de tetrazina-fluoróforo (p.ej, tetrazina-BODIPY FL, tetrazina-Oregon Green 488 o tetrazina-BODIPY TMR-X) o agentes fluorogénicos activables por enzimas (p.ej, PROSENSE (VisEn Medical)).
Cuando los compuestos se marcan enzimáticamente con, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o luciferasa, el marcador enzimático se detecta mediante la determinación de la conversión de un sustrato apropiado en producto.
Ensayos in vitro donde se pueden usar las composiciones marcadas con enzimas incluyen, entre otros, ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), ensayos de inmunoprecipitación, inmunofluorescencia, inmunoensayos enzimáticos (EIA), radioinmunoensayos (RIA) y análisis de transferencia Western.
La presente descripción contempla etiquetas distintas de las descritas en esta invención, incluidas otras etiquetas detectables ópticamente. Las etiquetas se pueden unir al nucleótido modificado de la presente descripción en cualquier posición usando química estándar de manera que la etiqueta se pueda eliminar de la base incorporada tras la escisión del enlazador escindible.
Carga útil: Cargas útiles que penetran las células
En algunos casos, los nucleótidos modificados y los ácidos nucleicos modificados también pueden incluir una carga útil que puede ser un resto que penetra en las células o un agente que mejora la administración intracelular de las composiciones. Por ejemplo, las composiciones pueden incluir una secuencia peptídica de penetración celular que facilita el suministro al espacio intracelular, p.ej., péptido TAT derivado de VIH, penetratinas, transportadores o péptidos de penetración celular derivados de hCT, véase, por ejemplo, Caron y col., (2001) Mol Ther. 3(3):310-8; Langel, Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications (CRC Press, Boca Raton FL 2002); El-Andaloussi y col., (2005) Curr Pharm Des. 11(28):3597-611; y Deshayes y col., (2005) Cell Mol Life Sci. 62(16):1839-49. Las composiciones también se pueden formular para incluir un agente de penetración celular, por ejemplo, liposomas, que mejoran la administración de las composiciones al espacio intracelular.
Carga útil: Dianas Biológicas
Los nucleótidos modificados y los ácidos nucleicos modificados descritos en esta invención se pueden usar para administrar una carga útil a cualquier diana biológica para la que exista o se pueda generar un ligando específico. El ligando puede unirse a la diana biológica de forma covalente o no covalente.
Dianas biológicas ejemplares incluyen biopolímeros, p.ej., anticuerpos, ácidos nucleicos tales como ARN y ADN, proteínas, enzimas; ejemplos de proteínas incluyen enzimas, receptores y canales iónicos. En algunos casos, la diana es un marcador específico de tejido o tipo celular, por ejemplo, una proteína que se expresa específicamente en un tejido o tipo celular seleccionado. En algunos casos, la diana es un receptor, tal como, entre otros, receptores de membrana plasmática y receptores nucleares; ejemplos más específicos incluyen receptores acoplados a proteína G, proteínas de poros celulares, proteínas transportadoras, anticuerpos expresados en superficie, proteínas HLA, proteínas MHC y receptores de factores de crecimiento.
Síntesis de Nucleótidos Modificados
Los nucleósidos y nucleótidos modificados descritos en esta invención pueden prepararse a partir de materiales de partida fácilmente disponibles utilizando los siguientes procedimientos generales. Se apreciará que cuando se dan condiciones de procedimiento típicas o preferidas (es decir, temperaturas de reacción, tiempos, relaciones molares de reactivos, disolventes, presiones, etc.), también se pueden utilizar otras condiciones de procedimiento a menos que se indique lo contrario. Las condiciones de reacción óptimas pueden variar con los reactivos particulares o el disolvente utilizado, pero un experto en la técnica puede determinar dichas condiciones mediante procedimientos de optimización de rutina.
Los procedimientos descritos en esta invención pueden controlarse según cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, la formación de productos se puede controlar por medios espectroscópicos, como la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (p.ej., 1H or 13C) espectroscopia infrarroja, espectrofotometría (p.ej., UV-visible) o la espectrometría de masas, o mediante cromatografía, como la cromatografía líquida de alta resolución. (HPLC) o cromatografía en capa fina.
La preparación de nucleósidos y nucleótidos modificados puede implicar la protección y desprotección de diversos grupos químicos. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente las condiciones de protección y desprotección y la selección de los grupos protectores apropiados. La química de los grupos protectores se puede encontrar y/o está descrita, por ejemplo, en Greene, y col. (Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., Wiley & Sons, 1991.
Las reacciones de los procedimientos descritos en esta invención se pueden desarrollar en solventes adecuados que un experto en la técnica de síntesis orgánica puede seleccionar. Los solventes adecuados pueden ser sustancialmente no reactivos con los materiales de partida (reactivos), los intermedios o los productos a las temperaturas a las que se desarrollan las reacciones, es decir, temperaturas que varían entre la temperatura de congelamiento del solvente y la temperatura de ebullición del solvente. Se puede realizar determinada reacción en un solvente o en una mezcla de más de un solvente. Según la etapa de reacción particular, un experto puede seleccionar solventes adecuados para una etapa de reacción particular.
La resolución de mezclas racémicas de nucleósidos y nucleótidos modificados se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los numerosos procedimientos conocidos en la técnica. Un procedimiento de ejemplo incluye la recristalización fraccionada usando un "ácido de resolución quiral" que es un ácido orgánico formador de sal ópticamente activo. Por ejemplo, los agentes de resolución adecuados para los procedimientos de recristalización fraccionada son ácidos ópticamente activos, tales como las formas D y L de ácido tartárico, ácido diacetiltartárico, ácido dibenzoiltartárico, ácido mandélico, ácido málico, ácido láctico o los diversos ácidos camforsulfónicos ópticamente activos. La resolución de mezclas racémicas también puede llevarse a cabo mediante la elución en una columna con un agente de resolución ópticamente activado (por ejemplo, dinitrobenzoilfenilglicina). Un experto en la materia podrá determinar fácilmente las concentraciones y posología adecuadas.
Longitud
Generalmente, la longitud de un ARNm modificado de la presente divulgación es mayor de 30 nucleótidos de longitud. En otro caso, la molécula de ARN tiene más de 35 nucleótidos de longitud. En otro caso, la longitud es de al menos 40 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 45 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 55 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 60 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 60 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 80 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 90 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 100 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 120 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 140 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 160 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 180 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 200 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 250 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 300 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 350 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 400 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 450 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 500 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 600 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 700 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 800 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 900 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 1000 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 1100 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 1200 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 1300 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 1400 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 1500 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 1600 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 1800 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 2000 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 2500 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 3000 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 4000 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 5000 nucleótidos, o superior a 5000 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 5000 nucleótidos, o superior a 6000 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 7000 nucleótidos, o superior a 7000 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 8000 nucleótidos, o superior a 8000 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 9000 nucleótidos, o superior a 9000 nucleótidos. En otro caso, la longitud es de al menos 10000 nucleótidos, o superior a 10000 nucleótidos.
Uso de ARN modificados
Prevención o reducción de la activación de la respuesta inmunitaria celular innata
El término "respuesta inmunitaria innata" incluye una respuesta celular a ácidos nucleicos monocatenarios exógenos, generalmente de origen viral o bacteriano, que implica la inducción de la expresión y liberación de citoquinas, particularmente los interferones, y la muerte celular. La síntesis de proteínas también se reduce durante la respuesta inmunitaria celular innata. Si bien es ventajoso eliminar la respuesta inmunitaria innata en una célula, la descripción proporciona ARNm modificados que reducen sustancialmente la respuesta inmunitaria, incluida la señalización de interferón, sin eliminar por completo dicha respuesta. En algunos casos, la respuesta inmunitaria se reduce en 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, 99,9 %, o superior al 99,9 % en comparación con la respuesta inmunitaria inducida por un ácido nucleico no modificado correspondiente. Tal reducción se puede medir por la expresión o el nivel de actividad de los interferones de tipo 1 o la expresión de genes regulados por interferones, como los receptores tipo toll (p. ej., TLR7 y TLR8). La reducción de la respuesta inmunitaria innata también puede medirse por la disminución de la muerte celular después de una o más administraciones de ARN modificados a una población celular; por ejemplo, la muerte celular es 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 85 %, 90 %, 95 %, o más del 95 % menor que la frecuencia de muerte celular observada con un ácido nucleico no modificado correspondiente. Además, la muerte celular puede afectar a menos de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, 1 %, 0,1 %, 0,01 % o menos de 0,01 % de células en contacto con los ácidos nucleicos modificados.
La descripción proporciona la introducción repetida (p. ej., transfección) de ácidos nucleicos modificados en una población de células diana, p. ej., in vitro, ex vivo, o in vivo.La etapa de contactar con la población de células puede repetirse una o más veces (tal como dos, tres, cuatro, cinco o más de cinco veces). En algunos casos, la etapa de poner en contacto la población celular con los ácidos nucleicos modificados se repite un número de veces suficiente para lograr una eficiencia predeterminada de traducción de proteínas en la población celular. Dada la citotoxicidad reducida de la población de células diana proporcionada por las modificaciones del ácido nucleico, dichas transfecciones repetidas se pueden lograr en un conjunto diverso de tipos celulares.
Compañero de interacción con el surco principal
Como se describe en esta invención, la frase "compañero de interacción con el surco principal" se refiere a receptores de reconocimiento de ARN que detectan y responden a ligandos de ARN a través de interacciones, p.ej. unión, con la cara del surco principal de un nucleótido o ácido nucleico. Como tales, los ligandos de ARN que comprenden nucleótidos modificados o ácidos nucleicos tales como los ARN modificados como se describe en esta invención reducen las interacciones con los compañeros de unión al surco principal y, por lo tanto, reducen la respuesta inmunitaria innata.
Ejemplo de interacción del surco principal, p.ej., unión, compañeros incluyen, pero no se limitan a, las siguientes nucleasas y helicasas. Dentro de las membranas, los TLR (Receptoresdetipo Toll) 3, 7, y 8 pueden responder a los ARN de cadena simple y doble. Dentro del citoplasma, los miembros de la superfamilia 2 clase de DEX(D/H) helicasas y ATPasas pueden detectar ARN para iniciar respuestas antivirales. Estas helicasas incluyen el RIG-I (gen I induciblepor ácido retinoico) y MDA5 (den 5 asociado a ladiferenciacikón del melanoma). Otros ejemplos incluyen el laboratorio de genética y fisiología 2 (LGP2), proteínas que contienen el dominio HIN-200 o proteínas que contienen el dominio Helicasa.
Proteínas de unión a ARN
En algunos casos de la presente divulgación, se proporcionan proteínas de unión a ARN. Las proteínas de unión al ARN pueden proporcionarse como proteínas y/o como ácidos nucleicos que codifican tales proteínas. Las proteínas de unión al a Rn desempeñan una multitud de funciones en la regulación de la estabilidad del ARN y la traducción de proteínas. Elementos ricos en A/U en la UTR 3' de los ARNm conduce a la formación de estructuras secundarias que están unidas por Proteínas de Unión Ricas en A/U (AREBP) que dan como resultado un aumento o una disminución de la estabilidad del ARNm (Fan, X.C. Y col., Overexpression of HuR, a nuclear-cytoplasmic shuttling protein, increases the in vivo stability of ARE-containing mRNAs. EMBO J. 1998 Jun 15; 17(12):3448-60). HuR es una AREBP estabilizadora. Para aumentar la estabilidad del ARNm de interés, se puede cotransfectar o inyectar conjuntamente un ARNm que codifica HuR junto con el ARNm de interés en las células o en el tejido. Estas proteínas también pueden unirse al ARNm de interés in vitro y a continuación administrarse juntas a las células. La proteína de unión a la cola poli A, PABP, interactúa con el factor de iniciación de la traducción eucariota eIF4G para estimular la iniciación de la traducción. Co-administración de ARNm que codifican estas prácticas comerciales restrictivas junto con el fármaco de ARNm y/o unir estas proteínas al fármaco de ARNm in vitro y administrar el ARNm unido a proteínas en las células puede aumentar la eficiencia de traducción del ARNm. El mismo concepto se puede extender a la co-administración de ARNm junto con ARNm que codifican diversos factores y facilitadores de la traducción, así como con las propias proteínas para influir en la estabilidad del ARN y/o eficiencia traslacional.
Variantes de polipéptidos
Se proporcionan ácidos nucleicos que codifican polipéptidos variantes, que tienen una cierta identidad con una secuencia polipeptídica de referencia. Tal como se conoce en la técnica, el término "identidad" hace referencia a una relación entre las secuencias de dos o más polipéptidos o polinucleótidos determinada mediante la comparación de las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre péptidos, determinado por el número de coincidencias entre cadenas de dos o más residuos de aminoácidos.
La "identidad" mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre la más pequeña de dos o más secuencias con alineaciones de espacios (si las hay) abordadas por un modelo matemático o programa de computadora en particular (es decir, "algoritmos"). La identidad de los péptidos relacionados se puede calcular fácilmente mediante procedimientos conocidos. Dichos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; y Carillo y col., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988).
La variante de polipéptido puede tener la misma actividad o similar que el polipéptido de referencia. Alternativamente, la variante puede tener una actividad alterada (por ejemplo, aumentada o disminuida) con respecto a un polipéptido de referencia. En general, las variantes de un polinucleótido o polipéptido particular tienen al menos 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o más de identidad de secuencia con dicho polinucleótido o polipéptido de referencia particular, según se determina mediante parámetros y programas de alineación de secuencia descritos en esta invención y conocidos por los expertos en la técnica.
Como reconocerán los expertos en la técnica, los fragmentos de proteína, dominios de proteína funcional y proteínas homólogas, también se consideran como descritos en esta invención. Por ejemplo, en esta invención se proporciona cualquier fragmento de proteína de una proteína de referencia (lo que significa una secuencia polipeptídica al menos un residuo de aminoácido más corta que una secuencia polipeptídica de referencia pero por lo demás idéntica) 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más de 100 aminoácidos de longitud En otro ejemplo, cualquier proteína que incluya un tramo de aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50 o aproximadamente 100 aminoácidos que son aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente Se puede utilizar un 60 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o aproximadamente un 100 % idéntico a cualquiera de las secuencias descritas en esta invención de acuerdo con la divulgación. En ciertos casos, una secuencia de proteína para ser utilizada de acuerdo con la divulgación incluye 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más mutaciones como se muestra en cualquiera de las secuencias proporcionadas o referenciadas en esta invención.
Bibliotecas de polipéptidos
También se proporcionan bibliotecas de polinucleótidos que contienen modificaciones de nucleósidos, donde los polinucleótidos contienen individualmente una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido, como un anticuerpo, un compañero de unión a proteínas, una proteína dee andamio y otros polipéptidos conocidos en la técnica. Preferiblemente, los polinucleótidos son ARNm en una forma adecuada para la introducción directa en una célula huésped diana, que a su vez sintetiza el polipéptido codificado.
En ciertos casos, se producen y prueban múltiples variantes de una proteína, cada una con diferentes modificaciones de aminoácidos, para determinar la mejor variante en términos de farmacocinética, estabilidad, biocompatibilidad, y/o actividad biológica, o una propiedad biofísica como el nivel de expresión. Dicha biblioteca puede contener 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109o más de 109 variantes posibles (incluyendo sustituciones, eliminaciones de uno o más residuos e inserción de uno o más residuos).
Complejos polipéptido-ácido nucleico
La traducción adecuada de proteínas implica la agregación física de varios polipéptidos y ácidos nucleicos asociados con el ARNm. La divulgación proporciona complejos que contienen conjugados de proteínas y ácidos nucleicos, que contienen un ARNm traducible que tiene una o más modificaciones de nucleósidos (p. ej., al menos dos modificaciones de nucleósidos diferentes) y uno o más polipéptidos unidos al ARNm. Generalmente, las proteínas se proporcionan en una cantidad efectiva para impedir o reducir una respuesta inmunitaria innata de una célula donde se introduce el complejo.
Restos de direccionamiento
En los casos de la divulgación, se proporcionan ácidos nucleicos modificados para expresar un compañero de unión a proteínas o un receptor en la superficie de la célula, que funciona para dirigir la célula a un espacio de tejido específico o para interactuar con un resto específico, ya sea in vivo o in vitro.Los compañeros de unión a proteínas adecuados incluyen anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos, proteínas de andamio o péptidos. Además, se pueden emplear ácidos nucleicos modificados para dirigir la síntesis y la localización extracelular de lípidos, carbohidratos u otros restos biológicos.
Como se describe en esta invención, una característica útil de los ácidos nucleicos modificados de la descripción es la capacidad de reducir la respuesta inmunitaria innata de una célula a un ácido nucleico exógeno. Se proporcionan procedimientos para realizar la titulación, reducción o eliminación de la respuesta inmunitaria en una célula o una población de células. En algunos casos, la célula se pone en contacto con una primera composición que contiene una primera dosis de un primer ácido nucleico exógeno que incluye una región traducible y al menos una modificación de nucleósido, y el nivel de la respuesta inmunitaria innata de la célula al primer ácido nucleico exógeno se determina el ácido. Posteriormente, la célula se pone en contacto con una segunda composición, que incluye una segunda dosis del primer ácido nucleico exógeno, conteniendo la segunda dosis una cantidad menor del primer ácido nucleico exógeno en comparación con la primera dosis.
Alternativamente, la célula se pone en contacto con una primera dosis de un segundo ácido nucleico exógeno. El segundo ácido nucleico exógeno puede contener uno o más nucleósidos modificados, que pueden ser iguales o diferentes del primer ácido nucleico exógeno o, alternativamente, el segundo ácido nucleico exógeno puede no contener nucleósidos modificados. Las etapas de contacto de la célula con la primera composición. y/o la segunda composición puede repetirse una o más veces.
Además, la eficiencia de la producción de proteínas (p. ej., traducción de proteínas) en la célula se determina opcionalmente, y la célula se puede volver a transfectar con la primera y/o segunda composición repetidamente hasta que se logre una eficiencia de producción de proteína diana.
En un caso, el extremo 3' de los ácidos nucleicos modificados descritos en esta invención puede incluir una secuencia para dirigir el ácido nucleico modificado a una ubicación deseada dentro de la célula, como, entre otros, microvesículas dentro de una célula. La secuencia para el direccionamiento puede ser "similar a un código postal" en su función, ya que puede ser reconocida por la maquinaria celular que puede transportar moléculas a varios lugares dentro de la célula. En la Publicación de Patente Internacional N°. WO2013109713, se describen ejemplos no limitantes de secuencias para dirigir ácidos nucleicos. Bolukbasi y col. han demostrado secuencias similares a códigos postales y miR-1289. para enriquecer ARNm en microvesículas (Mol. Ther. Nuc. Acid 2012 1, e10), ya que tanto los códigos postales como los microARN desempeñan un papel en la regulación postranscripcional del ARNm.
En un caso, la secuencia para dirigirse al ácido nucleico modificado es SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 38 o un concatómero de al menos una SEQ ID NO: 22 y al menos una SEQ ID NO: 38 como se describe en la Publicación de Patente Internacional N° WO2013109713.
Vacunas
Como se describe en esta invención, se proporcionan ARNm que tienen secuencias que sustancialmente no son traducibles. Dicho ARNm es efectivo como vacuna cuando se administra a un sujeto mamífero.
También se proporcionan ácidos nucleicos modificados que contienen una o más regiones no codificantes. Dichos ácidos nucleicos modificados generalmente no se traducen, pero son capaces de unirse y secuestrar uno o más componentes de la maquinaria de traducción, como una proteína ribosómica o un ARN de transferencia (ARNt), reduciendo así de manera efectiva la expresión de proteínas en la célula. El ácido nucleico modificado puede contener un pequeño ARN nucleolar (sno-ARN), micro ARN (miARN), pequeño ARN de interferencia (siRNA) o ARN que interactúa con Piwi (piARN).
Además, ciertos nucleósidos modificados, o combinaciones de los mismos, cuando se introducen en ácidos nucleicos modificados activan la respuesta inmunitaria innata. Dichos ácidos nucleicos activados modificados, por ejemplo, ARN modificados, son útiles como adyuvantes cuando se combinan con polipéptidos u otras vacunas. En ciertos aspectos, las moléculas de activación contienen una región traducible que codifica una secuencia polipeptídica útil como vacuna, proporcionando así la capacidad de ser autoadyuvante.
Agentes terapéuticos
Los ácidos nucleicos modificados (ARN modificados) y las proteínas traducidas a partir de los ácidos nucleicos modificados descritos en esta invención pueden utilizarse como agentes terapéuticos. Por ejemplo, un ácido nucleico modificado descrito en esta invención se puede administrar a un sujeto, donde el ácido nucleico modificado se traduce in vivo para producir un péptido terapéutico en el sujeto. Se proporcionan composiciones, procedimientos, kits y reactivos para impedir, tratar o diagnosticar una enfermedad o afección en seres humanos y otros mamíferos. Los agentes terapéuticos activos de la divulgación incluyen ácidos nucleicos modificados, células que contienen ácidos nucleicos modificados o polipéptidos traducidos de los ácidos nucleicos modificados, polipéptidos traducidos de los ácidos nucleicos modificados y células en contacto con células que contienen ácidos nucleicos modificados o polipéptidos traducidos de los ácidos nucleicos modificados. .
En ciertos casos, se proporcionan tratamientos combinados que contienen uno o más ácidos nucleicos modificados que contienen regiones traducibles que codifican una proteína o proteínas que aumentan la inmunidad de un sujeto mamífero junto con una proteína que induce toxicidad celular dependiente de anticuerpos. Por ejemplo, se proporcionan agentes terapéuticos que contienen uno o más ácidos nucleicos que codifican trastuzumab y factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF). En particular, estos tratamientos combinados son útiles en pacientes con cáncer de mama Her2+ que desarrollan resistencia inducida a trastuzumab. (Véase, por ejemplo, Albrecht, Immunotherapy. 2(6):795-8 (201o)).
Se proporcionan procedimientos para inducir la traducción de un polipéptido recombinante en una población celular utilizando los ácidos nucleicos modificados descritos en esta invención. Esta traducción puede ser in vivo, ex vivo, in cultivo, o in vitro. La población celular se pone en contacto con una cantidad efectiva de una composición que contiene un ácido nucleico que tiene al menos una modificación de nucleósido y una región traducible que codifica el polipéptido recombinante. La población se pone en contacto en condiciones tales que el ácido nucleico se localiza en una o más células de la población celular y el polipéptido recombinante se traduce en la célula a partir del ácido nucleico.
Se proporciona una cantidad efectiva de la composición en función, al menos en parte, del tejido diana, el tipo celular diana, los medios de administración, las características físicas del ácido nucleico (p. ej., tamaño y cantidad de nucleósidos modificados) y otros determinantes. En general, una cantidad efectiva de la composición proporciona una producción efectiva de proteínas en la célula, preferiblemente más efectiva que una composición que contiene el correspondiente ácido nucleico no modificado. El aumento de la eficiencia puede demostrarse mediante un aumento de la transfección celular (es decir, el porcentaje de células transfectadas con el ácido nucleico), un aumento de la traducción de la proteína del ácido nucleico, una disminución de la degradación del ácido nucleico (como se demuestra, por ejemplo, por un aumento de la duración de la traducción de la proteína de un ácido nucleico modificado), o respuesta inmune innata reducida de la célula huésped.
Aspectos de la divulgación están dirigidos a procedimientos para inducir la traducción in vivo de un antígeno de polipéptido en un sujeto mamífero en necesidad del mismo. Allí, se administra al sujeto una cantidad efectiva de una composición que contiene un ácido nucleico que tiene al menos una modificación de nucleósido y una región traducible que codifica el polipéptido recombinante usando los procedimientos de administración descritos en esta invención. El ácido nucleico se proporciona en una cantidad y en otras condiciones tales que el ácido nucleico se localiza en una célula del sujeto y el polipéptido recombinante se traduce en la célula a partir del ácido nucleico. La célula donde se localiza un ácido nucleico de la divulgación, o el tejido donde está presente la célula, puede ser alcanzada con una o más rondas de administración de ácido nucleico.
Otros aspectos de la divulgación se relacionan con el trasplante de células que contienen ácidos nucleicos modificados a un sujeto mamífero. La administración de células a mamíferos es conocida por los expertos en la técnica e incluye, pero no se limita a, implantación local (por ejemplo, administración tópica o subcutánea), administración de órganos o inyección sistémica (por ejemplo, inyección intravenosa o inhalación) y la formulación de células en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones que contienen ácidos nucleicos modificados se formulan para la administración por vía intramuscular, transarterial, intraocular, vaginal, rectal, intraperitoneal, intravenosa, intranasal, subcutánea, endoscópica, transdérmica o intratecal. La composición se puede formular para una liberación prolongada.
El sujeto al que se le puede administrar el agente terapéutico padece o puede tener riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección deletérea. Se proporcionan procedimientos para identificar, diagnosticar y clasificar sujetos sobre estas bases, que pueden incluir diagnóstico clínico, niveles de biomarcadores, estudios de asociación de todo el genoma (GWAS) y otros procedimientos conocidos en la técnica.
En ciertos casos, el ácido nucleico modificado administrado dirige la producción de uno o más polipéptidos recombinantes que proporcionan una actividad funcional que está sustancialmente ausente en la célula donde se traduce el polipéptido recombinante. Por ejemplo, la actividad funcional faltante puede ser de naturaleza enzimática, estructural o reguladora de genes. En casos relacionados, el ácido nucleico modificado administrado dirige la producción de uno o más polipéptidos recombinantes que aumentan (p. ej., sinérgicamente) una actividad funcional que está presente pero es sustancialmente deficiente en la célula donde se traduce el polipéptido recombinante.
En otros casos, el ácido nucleico modificado administrado dirige la producción de uno o más polipéptidos recombinantes que reemplazan un polipéptido (o múltiples polipéptidos) que está sustancialmente ausente en la célula donde se traduce el polipéptido recombinante. Tal ausencia puede deberse a una mutación genética del gen codificante o vía reguladora del mismo. El polipéptido recombinante puede aumentar el nivel de una proteína endógena en la célula hasta un nivel deseable; tal aumento puede llevar el nivel de la proteína endógena de un nivel subnormal a un nivel normal o de un nivel normal a un nivel supernormal.
Alternativamente, el polipéptido recombinante funciona para antagonizar la actividad de una proteína endógena presente en, sobre la superficie o secretada de la célula. Normalmente, la actividad de la proteína endógena es perjudicial para el sujeto; por ejemplo, debido a la mutación de la proteína endógena que da como resultado una actividad o localización alterada. Además, el polipéptido recombinante antagoniza, directa o indirectamente, la actividad de un resto biológico presente en, sobre la superficie o secretado de la célula. Ejemplos de restos biológicos antagonizados incluyen lípidos (p. ej., colesterol), una lipoproteína (p. ej., lipoproteína de baja densidad), un ácido nucleico, un carbohidrato, una toxina proteica como las toxinas shiga y toxinas del tétanos, o una pequeña toxina molecular como las toxinas botulínica, del cólera y diftérica. Además, la molécula biológica antagonizada puede ser una proteína endógena que exhibe una actividad indeseable, tal como una actividad citotóxica o citostática. Las proteínas recombinantes descritas en esta invención están diseñadas para su localización dentro de la célula, potencialmente dentro de un compartimento específico como el núcleo, o están diseñadas para la secreción desde la célula o la translocación a la membrana plasmática de la célula.
Terapéutica
Se proporcionan procedimientos para tratar o impedir un síntoma de enfermedades caracterizadas por actividad proteica faltante o aberrante, reemplazando la actividad proteica faltante o superando la actividad proteica aberrante. Debido al rápido inicio de la producción de proteínas tras la introducción de ARNm modificados, en comparación con los vectores de ADN viral, los compuestos de la presente divulgación son particularmente ventajosos en el tratamiento de enfermedades agudas tales como sepsis, accidente cerebrovascular e infarto de miocardio. Además, la falta de regulación transcripcional de los ARNm modificados de la descripción es ventajosa porque se puede lograr una titulación precisa de la producción de proteínas.
En algunos casos, los ARNm modificados y sus polipéptidos codificados según la presente descripción pueden usarse con fines terapéuticos. En algunos casos, los ARNm modificados y sus polipéptidos codificados de acuerdo con la presente descripción pueden usarse para el tratamiento de cualquiera de una variedad de enfermedades, trastornos y/o afecciones, que incluyen, entre otros, uno o más de los siguientes: trastornos autoinmunes (por ejemplo, diabetes, lupus, esclerosis múltiple, psoriasis, artritis reumatoide); trastornos inflamatorios (por ejemplo, artritis, enfermedad pélvica inflamatoria); enfermedades infecciosas (por ejemplo, infecciones virales (por ejemplo, VIH, VHC, RSV), infecciones bacterianas, infecciones fúngicas, sepsis); trastornos neurológicos (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, autismo, distrofia muscular de Duchenne); trastornos cardiovasculares (por ejemplo, aterosclerosis, hipercolesterolemia, trombosis, trastornos de la coagulación, trastornos angiogénicos tales como degeneración macular); trastornos proliferativos (por ejemplo, cáncer, neoplasias benignas); trastornos respiratorios (por ejemplo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica); trastornos digestivos (por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal, úlceras); trastornos musculoesqueléticos (por ejemplo, fibromialgia, artritis); trastornos endocrinos, metabólicos y nutricionales (por ejemplo, diabetes, osteoporosis); trastornos urológicos (por ejemplo, enfermedad renal); trastornos psicológicos (por ejemplo, depresión, esquizofrenia); trastornos de la piel (por ejemplo, heridas, eczema); trastornos sanguíneos y linfáticos (por ejemplo, anemia, hemofilia); etc.
Las enfermedades caracterizadas por actividad proteica disfuncional o aberrante incluyen fibrosis quística, anemia de células falciformes, epidermólisis ampollosa, esclerosis lateral amiotrófica y deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. La presente divulgación proporciona un procedimiento para tratar dichas afecciones o enfermedades en un sujeto mediante la introducción de ácidos nucleicos o terapias basadas en células que contienen los ácidos nucleicos modificados proporcionados en esta invención, donde los ácidos nucleicos modificados codifican una proteína que antagoniza o supera de otro modo la actividad aberrante de la proteína. presente en la célula del sujeto. Ejemplos específicos de una proteína disfuncional son las variantes de mutación sin sentido del gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), que producen una variante de proteína disfuncional de la proteína CFTR, que causa la fibrosis quística.
Las enfermedades caracterizadas por la ausencia (o disminución sustancial de la actividad proteica que impide la función proteica adecuada) incluyen la fibrosis quística, el tipo C de Niemann-Pick, la talasemia p mayor, la distrofia muscular de Duchenne, el síndrome de Hurler, el síndrome de Hunter y la hemofilia A. Tales las proteínas pueden no estar presentes o son esencialmente no funcionales. La presente divulgación proporciona un procedimiento para tratar dichas afecciones o enfermedades en un sujeto mediante la introducción de ácidos nucleicos o terapias basadas en células que contienen los ácidos nucleicos modificados proporcionados en esta invención, donde los ácidos nucleicos modificados codifican una proteína que reemplaza la actividad de la proteína que falta en las células diana del sujeto. Ejemplos específicos de una proteína disfuncional son las variantes de mutación sin sentido del gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), que producen una variante de proteína disfuncional de la proteína CFTR, que causa la fibrosis quística.
Por lo tanto, se proporcionan procedimientos para tratar la fibrosis quística en un mamífero poniendo en contacto una célula del sujeto con un ácido nucleico modificado que tiene una región traducible que codifica un polipéptido CFTR funcional, en condiciones tales que se obtiene una cantidad efectiva del polipéptido CTFR. presentes en la célula. Células diana preferidas son células epiteliales, endoteliales y mesoteliales, tales como el pulmón, y los procedimientos de administración se determinan en vista del tejido diana; es decir, para administración pulmonar, las moléculas de ARN se formulan para administración por inhalación.
En otro caso, la presente descripción proporciona un procedimiento para tratar la hiperlipidemia en un sujeto, introduciendo en una población celular del sujeto una molécula de ARNm modificada que codifica sortilina, una proteína recientemente caracterizada por estudios genómicos, mejorando así la hiperlipidemia en un sujeto. El gen SORT1 codifica una proteína transmembrana de la red trans-Golgi (TGN) llamada Sortilina. Estudios genéticos han demostrado que uno de cada cinco individuos tiene un polimorfismo de un solo nucleótido, rs12740374, en el locus 1p13 del gen SORT1 que los predispone a tener niveles bajos de lipoproteínas de baja densidad (LDL) y lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) . Cada copia del alelo menor, presente en alrededor del 30 % de las personas, altera el colesterol LDL en 8 mg/dL, mientras que dos copias del alelo menor, presente en aproximadamente 5 % de la población, reduce el colesterol LDL 16 mg/dL. También se ha demostrado que los vehículos del alelo menor tienen un 40 % menos de riesgo de infarto de miocardio. Estudios funcionales in vivo en ratones describen que la sobreexpresión de SORT1 en tejido hepático de ratón condujo a niveles de colesterol LDL significativamente más bajos, hasta un 80 % más bajos, y que silenciar SORT1 aumentó el colesterol LDL aproximadamente en un 200 % (Musunuru K y col. From noncoding variant to phenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus. Nature 2010; 466: 714-721).
Modulación del destino celular
Se proporcionan procedimientos para inducir una alteración en el destino celular en una célula de mamífero diana. La célula de mamífero diana puede ser una célula precursora y la alteración puede implicar impulsar la diferenciación en un linaje o bloquear dicha diferenciación. Alternativamente, la célula de mamífero diana puede ser una célula diferenciada, y la alteración del destino celular incluye conducir la desdiferenciación a una célula precursora pluripotente, o bloquear dicha desdiferenciación, como la desdiferenciación de células cancerosas en células madre cancerosas. En situaciones donde se desea un cambio en el destino celular, se introducen cantidades eficaces de ARNm que codifican un polipéptido inductor del destino celular en una célula diana en condiciones tales que se induce una alteración en el destino celular. En algunos casos, los ARNm modificados son útiles para reprogramar una subpoblación de células de un primer fenotipo a un segundo fenotipo. Tal reprogramación puede ser temporal o permanente.
Opcionalmente, la reprogramación induce a una célula diana a adoptar un fenotipo intermedio.
Además, los procedimientos de la presente divulgación son particularmente útiles para generar células madre pluripotentes inducidas (células iPS) debido a la alta eficiencia de transfección, la capacidad de volver a transfectar células y la sostenibilidad de la cantidad de polipéptidos recombinantes producidos en las células diana. Además, se espera que el uso de células iPS generadas usando los procedimientos descritos en esta invención tenga una incidencia reducida de formación de teratoma.
También se proporcionan procedimientos para reducir la diferenciación celular en una población de células diana. Por ejemplo, una población de células diana que contiene uno o más tipos celulares precursoras se pone en contacto con una composición que tiene una cantidad efectiva de un ARNm modificado que codifica un polipéptido, en condiciones tales que el polipéptido se traduce y reduce la diferenciación de la célula precursora. En casos no limitativos, la población de células diana contiene tejido lesionado en un sujeto mamífero o tejido afectado por un procedimiento quirúrgico. La célula precursora es, por ejemplo, una célula precursora del estroma, una célula precursora neural o una célula precursora mesenquimatosa.
En un caso específico, se proporcionan ácidos nucleicos modificados que codifican uno o más factores de diferenciación Gata4, Mef2c y Tbx4. Estos factores generados por ARNm se introducen en los fibroblastos e impulsan la reprogramación en los cardiomiocitos. Dicha reprogramación se puede realizar in vivo, poniendo en contacto un parche que contiene ARNm u otro material con tejido cardíaco dañado para facilitar la regeneración cardíaca. Tal procedimiento promueve la génesis de cardiomiocitos en oposición a la fibrosis.
Focalización de organismos patógenos: purificación de materiales biológicos
En esta invención se proporcionan procedimientos para focalizar microorganismos patógenos, como bacterias, levaduras, protozoos, helmintos y similares, utilizando ARNm modificados que codifican polipéptidos citostáticos o citotóxicos. Preferiblemente, el ARNm introducido en el organismo patógeno diana contiene nucleósidos modificados u otras modificaciones de la secuencia de ácido nucleico que el ARNm se traduce exclusivamente, o preferentemente, en el organismo patógeno diana, para reducir los posibles efectos no deseados del agente terapéutico. Dichos procedimientos son útiles para eliminar organismos patógenos de material biológico, incluidos sangre, semen, óvulos y materiales de trasplante, incluidos embriones, tejidos y órganos.
Focalización de células enfermas
En esta invención se proporcionan procedimientos para dirigirse a células patógenas o enfermas, en particular células cancerosas, utilizando ARNm modificados que codifican polipéptidos citostáticos o citotóxicos. Preferiblemente, el ARNm introducido en el organismo patógeno diana contiene nucleósidos modificados u otras modificaciones de la secuencia de ácido nucleico que el ARNm se traduce exclusivamente, o preferentemente, en el organismo patógeno diana, para reducir los posibles efectos no deseados del agente terapéutico. Alternativamente, la descripción proporciona restos de direccionamiento que son capaces de direccionar los ARNm modificados para unirse preferentemente a la célula patógena diana y entrar en ella.
Producción de proteínas
Los procedimientos proporcionados en esta invención son útiles para mejorar el rendimiento del producto proteico en un procedimiento de cultivo celular. En un cultivo celular que contiene una pluralidad de células huésped, la introducción de los ARNm modificados descritos en esta invención da como resultado una mayor eficiencia de producción de proteínas en relación con un ácido nucleico no modificado correspondiente. Tal eficiencia de producción de proteínas aumentada puede demostrarse, por ejemplo, mostrando transfección celular aumentada, traducción de proteínas aumentada desde el ácido nucleico, degradación de ácidos nucleicos disminuida, y/o reducción de la respuesta inmune innata de la célula huésped. La producción de proteína puede medirse mediante ELISA, y la actividad de la proteína puede medirse mediante diversos ensayos funcionales conocidos en la técnica. La producción de proteínas puede generarse en un procedimiento de mamíferos continuo o discontinuo.
Además, es útil para optimizar la expresión de un polipéptido específico en una línea celular o colección de líneas celulares de interés potencial, particularmente una proteína diseñada como una variante de proteína de una proteína de referencia que tiene una actividad conocida. En un caso, se proporciona un procedimiento para optimizar la expresión de una proteína manipulada en una célula diana, proporcionando una pluralidad de tipos celulares diana y poniendo en contacto de forma independiente con cada uno de la pluralidad de tipos celulares diana un ARNm modificado que codifica un polipéptido modificado. Además, las condiciones de cultivo pueden alterarse para aumentar la eficiencia de producción de proteínas. Posteriormente, la presencia y/o se detecta el nivel del polipéptido diseñado en la pluralidad de tipos celulares diana y/o cuantificado, lo que permite la optimización de la expresión de un polipéptido manipulado mediante la selección de una célula diana eficiente y las condiciones de cultivo celular relacionadas con la misma. Dichos procedimientos son particularmente útiles cuando el polipéptido diseñado contiene una o más modificaciones postraduccionales o tiene una estructura terciaria sustancial, situaciones que a menudo complican la producción eficiente de proteínas.
Silenciamiento de genes
Los ARNm modificados descritos en esta invención son útiles para silenciar (es decir, impedir o reducir sustancialmente) la expresión de uno o más genes diana en una población celular. Un ARNm modificado que codifica un polipéptido capaz de dirigir la metilación de la histona H3 específica de la secuencia se introduce en las células de la población en condiciones tales que el polipéptido se traduce y reduce la transcripción génica de un gen diana a través de la metilación de la histona H3 y la subsiguiente formación de heterocromatina. En algunos casos, el mecanismo de silenciamiento se realiza en una población celular presente en un sujeto mamífero. A modo de ejemplo no limitativo, un gen diana útil es un miembro de la familia Janus Kinase-2 mutado, donde el sujeto mamífero expresa el gen diana mutante que sufre una enfermedad mieloproliferativa resultante de la actividad quinasa aberrante.
También se proporciona en esta invención la coadministración de ARNm y siRNA modificados. Como se demostró en la levadura, el silenciamiento trans específico de secuencia es un mecanismo efectivo para alterar la función celular. La levadura de fisión requiere dos complejos de ARNi para el ensamblaje de heterocromatina mediada por siRNA: el complejo de silenciamiento transcripcional inducido por ARN (RITS) y el complejo de ARN polimerasa dirigido por ARN (RDRC) (Motamedi y col. Cell 2004, 119, 789-802). En la levadura de fisión, el complejo RITS contiene la proteína Ago1 de la familia Argonauta de unión a siRNA, una proteína de cromodominio Chp1 y Tas3. El complejo RDRC de levadura de fisión está compuesto por una ARN polimerasa Rdp1 dependiente de Ar N, una supuesta ARN helicasa Hrr1 y una proteína de la familia de polimerasas poliA Cidi12. Estos dos complejos requieren la ribonucleasa Dicer y la histona H3 metiltransferasa Clr4 para su actividad. Juntos, Ago1 se une a moléculas de siRNA generadas a través de la escisión mediada por Dicer de transcritos de dsRNA generados co-transcripcionalmente por Rdp1 y permite la asociación directa específica de secuencia de Chp1, Tas3, Hrr1 y Clr4 a regiones de ADN destinadas a la metilación y modificación de histonas y posterior compactación en heterocromatina transcripcionalmente silenciada. Si bien este mecanismo funciona en cis- con regiones centroméricas de ADN, el silenciamiento trans específico de secuencia es posible a través de la cotransfección con siRNA de doble cadena para regiones específicas de ADN y el silenciamiento concomitante dirigido por ARNi de la ribonucleasa de siRNA Eri1 (Buhler y col. Cell 2006, 125, 873-886).
Modulación de vías biológicas
La traducción rápida de los ARNm modificados introducidos en las células proporciona un mecanismo deseable para modular las vías biológicas diana. Tal modulación incluye antagonismo o agonismo de una vía dada. En un caso, se proporciona un procedimiento para antagonizar una vía biológica en una célula poniendo en contacto la célula con una cantidad efectiva de una composición que comprende un ácido nucleico modificado que codifica un polipéptido recombinante, en condiciones tales que el ácido nucleico se localiza en la célula y el polipéptido recombinante puede traducirse en la célula a partir del ácido nucleico, donde el polipéptido recombinante inhibe la actividad de un polipéptido funcional en la vía biológica. Ejemplos de vías biológicas son aquellas defectuosas en un trastorno autoinmune o inflamatorio tal como esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, lupus eritematoso, colitis espondilitis anquilosante o enfermedad de Crohn; en particular, el antagonismo de las vías de señalización de IL-12 e IL-23 son de particular utilidad. (Ver Kikly K, Liu L, Na S, Sedgwick JD (2006) Curr. Opin. Immunol. 18 (6): 670-5).
Además, se proporcionan ácidos nucleicos modificados que codifican un antagonista de los receptores de quimiocinas; los receptores de quimiocinas CXCR-4 y CCR-5 son necesarios, por ejemplo, para la entrada del VIH en las células huésped (Arenzana-Seisdedos F y col, (1996) Nature. Oct 3;383(6599):400).
Alternativamente, se proporcionan procedimientos para agonizar una vía biológica en una célula poniendo en contacto la célula con una cantidad efectiva de un ácido nucleico modificado que codifica un polipéptido recombinante en condiciones tales que el ácido nucleico se localiza en la célula y el polipéptido recombinante es capaz de ser traducido en la célula a partir del ácido nucleico, y el polipéptido recombinante induce la actividad de un polipéptido funcional en la vía biológica. Vías biológicas agonizantes ejemplares incluyen vías que modulan la determinación del destino celular. Tal agonización es reversible o, alternativamente, irreversible.
Administración de ácido nucleico celular
Los procedimientos de la presente descripción mejoran el suministro de ácido nucleico a una población celular, in vivo, ex vivo, o en cultivo.Por ejemplo, un cultivo celular que contiene una pluralidad de células huésped (p. ej., células eucariotas como levaduras o células de mamífero) se pone en contacto con una composición que contiene un ácido nucleico mejorado que tiene al menos una modificación de nucleósido y, opcionalmente, una región traducible. La composición también contiene generalmente un reactivo de transfección u otro compuesto que aumenta la eficacia de la captación mejorada de ácido nucleico en las células huésped. El ácido nucleico mejorado presenta una retención mejorada en la población celular, en relación con un ácido nucleico no modificado correspondiente. La retención del ácido nucleico mejorado es mayor que la retención del ácido nucleico no modificado. En algunos casos, se trata al menos de 50 %, 75 %, 90 %, 95 %, 100 %, 150 %, 200 % o más del 200 % mayor que la retención del ácido nucleico no modificado. Tal ventaja de retención puede lograrse mediante una ronda de transfección con el ácido nucleico mejorado, o puede obtenerse después de repetidas rondas de transfección.
En algunos casos, el ácido nucleico mejorado se entrega a una población celular diana con uno o más ácidos nucleicos adicionales. Tal entrega puede ser al mismo tiempo, o el ácido nucleico mejorado se entrega antes de la entrega de uno o más ácidos nucleicos adicionales. El uno o más ácidos nucleicos adicionales pueden ser ácidos nucleicos modificados o ácidos nucleicos no modificados. Se entiende que la presencia inicial de los ácidos nucleicos mejorados no induce sustancialmente una respuesta inmunitaria innata de la población celular y, además, que la respuesta inmunitaria innata no se activará por la presencia posterior de los ácidos nucleicos no modificados. A este respecto, el ácido nucleico mejorado puede no contener por sí mismo una región traducible, si la proteína que se desea que esté presente en la población de células diana se traduce a partir de los ácidos nucleicos no modificados.
IV. Composiciones farmacéuticas
Formulaciones, Administración, Entrega y Dosificación
La presente divulgación proporciona composiciones y complejos de polinucleótidos, ácido nucleico modificado, ARN modificado mejorado y ácido ribonucleico en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir opcionalmente una o más sustancias activas adicionales, por ejemplo, sustancias terapéuticamente y/o profilácticamente activas. Es posible encontrar consideraciones generales de la formulación y/o fabricación de agentes farmacéuticos, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, Lippincott Williams & Wilkins, 2005.
En un caso, se proporcionan formulaciones que contienen una cantidad efectiva de un ácido ribonucleico (p. ej., un ARNm o un ácido nucleico que contiene un ARNm) diseñadas para evitar una respuesta inmunitaria innata de una célula donde entra el ácido ribonucleico. El ácido ribonucleico generalmente incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de interés.
En algunas realizaciones, las composiciones se administran a seres humanos, pacientes o sujetos humanos. Para los fines de la presente divulgación, la frase "ingrediente activo" generalmente se refiere a un ácido nucleico modificado, un ácido nucleico mejorado o un ácido ribonucleico que se administrará como se describe en esta invención.
Aunque las descripciones de las composiciones farmacéuticas proporcionadas en esta invención están dirigidas principalmente a las composiciones farmacéuticas que son adecuadas para la administración a seres humanos, el experto en la materia entenderá que tales composiciones son generalmente adecuadas para la administración a cualquier otro animal, por ejemplo, a animales no humanos, p.ej. mamíferos no humanos. La modificación de las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a seres humanos con el fin de hacer que las composiciones sean adecuadas para la administración a varios animales es bien conocida, y el farmacólogo veterinario con experiencia ordinaria puede diseñar y/o realizar dicha modificación con experimentación meramente ordinaria, si es que la hay. Los sujetos para los cuales se contempla la administración de las composiciones farmacéuticas incluyen, entre otros, seres humanos y/o primates; mamíferos, incluyendo mamíferos pertinentes en términos comerciales, tales como ganado, cerdos, caballos, ovejas, gatos, perros, ratones y/o ratas; y/o aves, incluyendo aves pertinentes en términos comerciales, tales como aves de corral, pollos, patos, gansos y/o pavos.
Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido o que se desarrolle posteriormente en la técnica de la farmacología. En general, tales procedimientos de preparación incluyen la etspa de asociar el ingrediente activo con un excipiente y/o uno o más ingredientes auxiliares y luego, si es necesario y/o deseable, dividir, moldear y/o envasar el producto en un conjunto monodosis o multidosis deseado.
Una composición farmacéutica según la invención puede prepararse, empaquetarse y/o venderse a granel, como una dosis unitaria individual y/o como una pluralidad de dosis unitarias individuales. Como se usa en esta invención, una "dosis unitaria" es una cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del ingrediente activo es generalmente igual a la dosis del ingrediente activo que se administraría a un sujeto y/o una fracción conveniente de dicha dosis como, por ejemplo, la mitad o un tercio de dicha dosis.
Las cantidades relativas del ingrediente activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica de acuerdo con la divulgación variarán, dependiendo de la identidad, tamaño y/o condición del sujeto tratado y dependiendo además de la vía por la que se va a administrar la composición. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre el 0,1% y el 100 %, por ejemplo, entre el ,5 y el 50 %, entre el 1 - 30 %, entre el 5 - 80 % o al menos el 80 % (p/p) del ingrediente activo.
Formulaciones
Los polinucleótidos, el ácido nucleico modificado, el ARN modificado mejorado y el ácido ribonucleico de la descripción se pueden formular utilizando uno o más excipientes para: (1) aumentar la estabilidad; (2) aumentar la transfección celular; (3) permitir la liberación retardada o sostenida (p. ej., a partir de una formulación de depósito de los ácidos nucleicos modificados, ARN modificado potenciado o ácidos ribonucleicos); (4) alterar la biodistribución (p. ej., focalizar los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos a tejidos o tipos celulares específicos); (5) aumentar la traducción de la proteína codificada in vivo; y/o (6) alterar el perfil de liberación de la proteína codificada in vivo. Además de los excipientes tradicionales tales como cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes superficialmente activos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, los excipientes de la presente divulgación pueden incluir, sin limitación, lipidoides, liposomas, nanopartículas de lípidos, polímeros, lipoplejos, nanopartículas de núcleo y cubierta, péptidos, proteínas, células transfectadas con polinucleótidos, ácido nucleico modificado, ARN modificado mejorado y ácido ribonucleico (p. ej., para trasplante en un sujeto), hialuronidasa, nanopartícula imitaciones y combinaciones de las mismas.
En consecuencia, las formulaciones de la divulgación pueden incluir uno o más excipientes, cada uno en una cantidad que en conjunto aumenta la estabilidad del polinucleótido, ácido nucleico modificado, ARN modificado mejorado o ácido ribonucleico, aumenta la transfección celular por los polinucleótidos, ácido nucleico modificado, ácido nucleico mejorado ARN modificado o ácido ribonucleico, aumenta la expresión de polinucleótidos, ácido nucleico modificado, ARN modificado mejorado o proteína codificada por ácido ribonucleico, y/o altera el perfil de liberación de los polinucleótidos, ácido nucleico modificado, ARN modificado mejorado o proteínas codificadas por ácido ribonucleico. Además, los polinucleótidos, el ácido nucleico modificado, el ARN modificado mejorado o el ácido ribonucleico de la presente descripción pueden formularse usando nanopartículas de ácido nucleico autoensambladas,
Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido o que se desarrolle posteriormente en la técnica de la farmacología. En general, tales procedimientos preparatorios incluyen el etapa de asociar el ingrediente activo con un excipiente y/o uno o más de otros ingredientes accesorios.
Los polinucleótidos, el ácido nucleico modificado, el ARN modificado mejorado y el ácido ribonucleico de la descripción pueden formularse para su administración en los tejidos. y/o órganos de un sujeto. Los órganos pueden incluir, entre otros, el corazón, los pulmones, el cerebro, el hígado, los ganglios basales, la médula del tronco encefálico, el mesencéfalo, la protuberancia, el cerebelo, la corteza cerebral, el hipotálamo, los ojos, la hipófisis, la tiroides, las paratiroides, el esófago, el timo, las glándulas suprarrenales. glándulas, apéndice, vejiga, vesícula biliar, intestinos (por ejemplo, intestino grueso e intestino delgado), riñón, páncreas, bazo, estómago, piel, próstata, testículos, ovarios, útero, glándulas suprarrenales, ano, bronquios, oídos, esófago, genitales, laringe (caja de la voz), ganglios linfáticos, meninges, boca, nariz, glándulas paratiroides, glándula pituitaria, recto, glándulas salivales, médula espinal, glándula timo, lengua, tráquea, uréteres, uretra, colon. Los tejidos pueden incluir, entre otros, válvulas cardíacas, huesos, venas, oído medio, músculos (cardíacos, lisos o esqueléticos), cartílagos, tendones o ligamentos. Como ejemplo no limitativo, los polinucleótidos, el ácido nucleico modificado, el ARN modificado mejorado y el ácido ribonucleico pueden formularse en una nanopartícula lipídica y administrarse en un órgano tal como, entre otros, el hígado, el bazo, el riñón o el pulmón. En otro ejemplo no limitativo, los polinucleótidos, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado y el ácido ribonucleico pueden formularse en una nanopartícula lipídica que comprende el lípido catiónico DLin-KC2-DMA y administrarse a un órgano tal como, entre otros, el hígado, bazo, riñón o pulmón.
Una composición farmacéutica según la invención puede prepararse, empaquetarse y/o venderse a granel, como una dosis unitaria individual y/o como una pluralidad dosis unitarias individuales. Como se usa en esta invención, una "dosis unitaria" es una cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del ingrediente activo generalmente puede ser igual a la dosis del ingrediente activo que se administraría a un sujeto y/o una fracción conveniente de dicha dosis que incluye, entre otros, la mitad o un tercio de dicha dosis
Cantidades relativas del ingrediente activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica según la presente divulgación puede variar, conforme a la identidad, el tamaño y/o la condición del sujeto tratado y adicionalmente según la vía de administración de la composición. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre el 0,1 % y el 99 % (p / p) de ingrediente activo.
En algunos casos, las formulaciones de ARNm modificadas descritas en esta invención pueden contener al menos un ARNm modificado. Las formulaciones pueden contener 1, 2, 3, 4 o 5 ARNm modificados. En un caso, la formulación puede contener ARNm modificado que codifica proteínas seleccionadas de entre categorías tales como, entre otras, proteínas humanas, proteínas veterinarias, proteínas bacterianas, proteínas biológicas, anticuerpos, proteínas inmunogénicas, péptidos y proteínas terapéuticos, proteínas secretadas, proteínas de membrana plasmática, proteínas citoplasmáticas y del citoesqueleto, proteínas unidas a la membrana intracelular, proteínas nucleares, proteínas asociadas con enfermedades humanas y/o proteínas asociadas con enfermedades no humanas. En un aspecto, la formulación contiene al menos tres proteínas que codifican ARNm modificado. En un aspecto, la formulación contiene al menos cinco proteínas que codifican ARNm modificado.
Las formulaciones farmacéuticas pueden comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable que, como se usa en esta invención, incluye, entre otros, todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes y similares, según sea adecuado para la forma de dosificación particular deseada. En la técnica, se conocen varios excipientes para la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas para preparar la composición (véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006). Se puede contemplar el uso de un medio excipiente convencional, excepto en la medida en que cualquier medio excipiente convencional pueda ser incompatible con una sustancia o sus derivados, por ejemplo, produciendo algún efecto biológico indeseable o interactuando de otra manera de manera nociva con cualquier otro componente de la composición farmacéutica.
En algunos casos, el tamaño de partícula de la nanopartícula lipídica puede aumentarse y/o disminuirse. El cambio en el tamaño de partícula puede ayudar a contrarrestar una reacción biológica tal como, entre otras, la inflamación, o puede aumentar el efecto biológico del ARNm modificado administrado a mamíferos.
Excipientes farmacéuticamente aceptables utilizados en la elaboración de composiciones farmacéuticas incluyen, de modo no taxativo, diluyentes inertes, agentes activos de superficie y/o emulsionantes, conservantes, agentes tampones, agentes lubricantes y/o aceites. Tales excipientes pueden incluirse opcionalmente en composiciones farmacéuticas de la divulgación.
Lipidoides
La síntesis de lipidoides se ha descrito ampliamente y las formulaciones que contienen estos compuestos son particularmente adecuadas para la administración de polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado y ácidos ribonucleicos (ver Mahon y col., Bioconjug Chem. 2010 21:1448-1454; Schroeder y col., J Intern Med. 2010 267:9-21; Akinc y col., Nat Biotechnol. 2008 26:561-569; Love y col., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 107:1864-1869; Siegwart y col., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 108:12996-3001).
Si bien estos lípidoides se han utilizado para administrar eficazmente pequeñas moléculas de ARN interferente de doble cadena en roedores y primates no humanos (ver Akinc y col., Nat Biotechnol. 2008 26:561-569; Frank-Kamenetsky y col., Proc Natl Acad Sci USA. 2008 105:11915-11920; Akinc y col., Mol Ther. 2009 17:872-879; Love y col., Proc Natl Acad Sci USA. 2010 107:1864-1869; Leuschner y col., Nat Biotechnol. 2011 29:1005-1010), la presente divulgación describe su formulación y uso para administrar polinucleótidos monocatenarios, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado y ácidos ribonucleicos. Se pueden preparar complejos, micelas, liposomas o partículas que contienen estos lipidoides y, por lo tanto, pueden dar como resultado una administración efectiva de polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado y ácidos ribonucleicos, a juzgar por la producción de una proteína codificada, después de la inyección. de una formulación lipidoide a través de rutas de administración localizadas y/o sistémicas. Los complejos lipidoides de polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado y ácidos ribonucleicos pueden administrarse por diversos medios que incluyen, entre otros, las vías intravenosa, intramuscular o subcutánea.
La administración in vivo de ácidos nucleicos puede verse afectada por muchos parámetros, que incluyen, entre otros, la composición de la formulación, la naturaleza de la PEGilación de las partículas, el grado de carga, la relación entre oligonucleótidos y lípidos y parámetros biofísicos como el tamaño de las partículas (Akinc y col., Mol Ther. 2009 17:872-879). Como ejemplo, pequeños cambios en la longitud de la cadena de anclaje de los lípidos de poli(etilenglicol) (PEG) pueden resultar en efectos significativos sobre la eficacia in vivo. Formulaciones con los diferentes lípidos, que incluyen, pero no se limitan a clorhidrato de penta[3-(1-laurilaminopropionil)]-trietilenetetramina (TETA-5LAP; también conocido como 98N12-5, véase Murugaiah y col., Analytical Biochemistry, 401:61 (2010)), C12-200 (incluidos derivados y variantes) y MD1, se pueden probar para determinar la actividad in vivo.
El lípidoide al que se hace referencia en esta invención como "98N12-5" es descrito por Akinc y col., Mol Ther. 2009 17:872-879.
El lípidoide al que se hace referencia en esta invención como "C12-200" se describe por Love y col., Proc Natl Acad Sci USA. 2010 107:1864-1869 y Liu and Huang, Molecular Therapy. 2010669-670. Las formulaciones de lipidoides pueden incluir partículas que comprenden 3 o 4 o más componentes además de polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado y ácidos ribonucleicos. Como ejemplo, las formulaciones con ciertos lipidoides incluyen, pero no se limitan a, 98N12-5 y pueden contener 42 % de lipidoide, 48 % de colesterol y 10 % de PEG (longitud de cadena de alquilo C14). Como otro ejemplo, las formulaciones con ciertos lipidoides incluyen, pero no se limitan a, C12-200 y pueden contener 50 % de lipidoide, 10 % de disteroilfosfatidilcolina, 38,5 % de colesterol y 1,5 % de PEG-DMG.
En un caso, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos formulados con un lipidoide para la administración intravenosa sistémica pueden focalizarse al hígado. Por ejemplo, una formulación intravenosa optimizada final que utiliza ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos, y que comprende una composición molar de lípidos de 42 % de 98N12-5, 48 % de colesterol y 10 % de lípidos PEG con una relación de peso final de aproximadamente 7,5 a 1 de lípido total a polinucleótido, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos, y una longitud de cadena de alquilo C14 en el lípido PEG, con un tamaño medio de partícula de aproximadamente 50-60 nm, puede dar como resultado la distribución de la formulación ser superior al 90 % al hígado (ver, Akinc y col., Mol Ther. 2009 17:872-879). En otro ejemplo, una formulación intravenosa que usa un lipidoide C12-200 (ver WO2010129709) puede tener una proporción molar de 50/10/38,5/1,5 de C12-200/disteroilfosfatidilcolina/colesterol/PEG-DMG, con una proporción en peso de 7 a 1 lípido total a polinucleótido, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos, y un tamaño medio de partícula de 80 nm puede ser efectivo para administrar polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos a hepatocitos (ver, Love y col., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 107:1864-1869). En otro caso, se puede usar una formulación que contiene lipidoide MD1 para administrar de forma efectiva polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos a hepatocitos in vivo.Las características de las formulaciones de lípidos optimizadas para las rutas intramuscular o subcutánea pueden variar significativamente dependiendo del tipo celular diana y la capacidad de las formulaciones para difundirse a través de la matriz extracelular hacia el torrente sanguíneo. Si bien se puede desear un tamaño de partícula de menos de 150 nm para la administración efectiva de hepatocitos debido al tamaño de las ventanas endoteliales (ver, Akinc y col., Mol Ther. 2009 17:872-879), el uso de polinucleótidos formulados con lipidoides , los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos para administrar la formulación a otros tipos celulares, incluidas, entre otras, células endoteliales, células mieloides y células musculares pueden no tener un tamaño limitado similar. Se ha informado sobre el uso de formulaciones de lipidoides para administrar siRNA in vivo a otras células que no son hepatocitos, como las células mieloides y el endotelio (ver Akinc y col., Nat Biotechnol. 2008 26:561 - 569; Leuschner y col., Nat Biotechnol. 2011 29:1005-1010; Cho y col. Adv. Funct. Mater. 200919:3112-3118; 8a Conferencia Internacional Judah Folkman, Cambridge, MA 8 al 9 de octubre de 2010). La administración efectiva a células mieloides, como los monocitos, las formulaciones de lipidoides pueden tener una proporción molar de componentes similar. Se pueden usar diferentes proporciones de lipidoides y otros componentes que incluyen, entre otros, disteroilfosfatidilcolina, colesterol y PEG-DMg , para optimizar la formulación de polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos para la administración a diferentes tipos celulares, incluyendo, pero sin limitarse a, hepatocitos, células mieloides, células musculares, etc. Por ejemplo, la relación molar del componente puede incluir, pero sin limitarse a, 50 % C12-200, 10 % disteroilfosfatidilcolina, 38,5 % colesterol y % 1.5 Pe G-DMG (ver Leuschner y col., Nat Biotechnol 2011 29:1005-1010). El uso de formulaciones de lipidoides para la entrega localizada de ácidos nucleicos a las células (tales como, entre otras, células adiposas y células musculares) a través de la administración subcutánea o intramuscular, puede no requerir todos los componentes de la formulación deseados para la administración sistémica, y como tal, puede comprender solo el lipidoide y los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos.
Se pueden usar combinaciones de diferentes lipidoides para mejorar la eficacia de polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o producción de proteínas dirigida por ácidos ribonucleicos, ya que los lipidoides pueden aumentar la transfección celular por los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados o ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos; y/o aumentar la traducción de la proteína codificada (ver Whitehead y col., Mol. Ther. 2011, 19:1688-1694).
Liposomas, lipoplexos y nanopartículas lipídicas
Los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la descripción pueden formularse utilizando uno o más liposomas, lipoplejos o nanopartículas lipídicas. En un caso, las composiciones farmacéuticas de polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos incluyen liposomas. Los liposomas son vesículas preparadas artificialmente que pueden estar compuestas principalmente por una bicapa lipídica y pueden usarse como vehículo de suministro para la administración de nutrientes y formulaciones farmacéuticas. Los liposomas pueden ser de diferentes tamaños, como, entre otros, una vesícula multilamelar ( MLV) que puede tener cientos de nanómetros de diámetro y puede contener una serie de bicapas concéntricas separadas por compartimentos acuosos estrechos, una vesícula unicelular pequeña (SUV) que puede tener menos de 50 nm de diámetro y una vesícula unilamelar grande (LUV) que puede tener entre 50 y 500 nm de diámetro. El diseño de liposomas puede incluir, pero no se limita a, opsoninas o ligandos con el fin de mejorar la unión de los liposomas a tejidos no saludables o para activar eventos tales como, pero sin limitarse a, endocitosis. Los liposomas pueden contener un pH alto o bajo para mejorar la administración de las formulaciones farmacéuticas.
La formación de liposomas puede depender de características fisicoquímicas como, entre otras, la formulación farmacéutica atrapada y los ingredientes liposomales, la naturaleza del medio en el que se dispersan las vesículas lipídicas, la concentración efectiva de la sustancia atrapada y su potencial toxicidad, cualquier procedimiento adicional involucrado durante la aplicación y/o entrega de las vesículas, el tamaño optimizado, la polidispersidad y la vida útil de las vesículas para la aplicación prevista, y la reproducibilidad de lote a lote y la posibilidad de producción a gran escala de productos liposomales seguros y eficientes.
En un caso, las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención pueden incluir, sin limitación, liposomas como los formados a partir de liposomas de 1,2-dioleiloxi-W,W-dimetilaminopropano (DODMA), liposomas DiLa2 de Marina Biotech (Bothell, WA), liposomas 1,2 -dilinoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-DMA), 2,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA) y MC3 (US20100324120) y liposomas que pueden administrar fármacos de molécula pequeña como, entre otros, DOXIL® de Janssen Biotech, Inc. (Horsham, PA).En un caso, las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención pueden incluir, sin limitación, liposomas como los formados a partir de la síntesis de partículas de lípidos de plásmido estabilizadas (SPLP) o partículas de lípidos de ácido nucleico estabilizadas (SNALP) que se han descrito previamente y han demostrado ser adecuadas para la administración de oligonucleótidos in vitro e in vivo (ver Wheeler y col. Gene Therapy. 19996:271-281; Zhang y col. Gene Therapy. 1999 6:1438-144/; Jeffs y col. Pharm Res. 2005 22:362-372; Morrissey y col., Nat Biotechnol. 2005 2:1002-100/; Zimmermann y col., Nature. 2006 441: 111-114; Heyes y col. J Contr Rel. 2005107:276-287; Semple y col. Nature Biotech. 201028:1/2-1/6; Judge y col. J Clin Invest. 2009 119:661-673; deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132.) El procedimiento de fabricación original de Wheeler et Alabama. fue un procedimiento de diálisis con detergente, que luego fue mejorado por Jeffs y col. y se conoce como el procedimiento de formación espontánea de vesículas. Las formulaciones de liposomas se componen de 3 a 4 componentes lipídicos además de los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos. Como ejemplo, un liposoma puede contener, entre otros, 55 % de colesterol, 20 % de disteroilfosfatidilcolina (DSPC), 10 % de Pe G-S-DSG y 15 % de 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DODMA ), tal como lo describen Jeffs y col. Como otro ejemplo, ciertas formulaciones de liposomas pueden contener, entre otros, 48 % de colesterol, 20 % de DSPC, 2 % de PEG-c-DMA y 30 % de lípidos catiónicos, donde el lípido catiónico puede ser 1,2-disteadoxi-W,W-dimetilaminopropano (DSDMA), DODMA, DLin-DMA o 1,2-dilinoleniloxi-3-dimetilaminopropano (DLenDMA), como describen Heyes y co.
En un caso, las composiciones farmacéuticas pueden incluir liposomas que pueden formarse para administrar polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado y ácidos ribonucleicos que pueden codificar al menos un inmunógeno. Los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado y ácidos ribonucleicos pueden ser encapsulados por el liposoma. y/o pueden estar contenidos en un núcleo acuoso que a continuación puede ser encapsulado por el liposoma (ver Publicaciones Internacionales N°. WO2012031046, WO2012031043, WO2012030901 y WO2012006378). En otro caso de polinucleótidos, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado y los ácidos ribonucleicos que pueden codificar un inmunógeno pueden formularse en una emulsión de aceite en agua catiónica donde la partícula de emulsión comprende un núcleo de aceite y un lípido catiónico que puede interactuar con los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado y ácidos ribonucleicos que anclan la molécula a la partícula de emulsión (véase la publicación internacional N° WO2012006380). En otro caso más, la formulación lipídica puede incluir al menos un lípido catiónico, un lípido que puede potenciar la transfección y al menos un lípido que contiene un grupo de cabeza hidrofílico unido a un resto lipídico (Publicación internacional N° WO2011076807 y Publicación EE. UU. N° 20110200582). En otro caso, los polinucleótidos, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos que codifican un inmunógeno pueden formularse en una vesícula lipídica que puede tener enlaces cruzados entre bicapas lipídicas funcionalizadas (ver Publicación de EE. UU. No. 20120177724).
En un caso, los polinucleótidos, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos pueden formularse en una vesícula lipídica que puede tener entrecruzamientos entre bicapas lipídicas funcionalizadas.
En un caso, los polinucleótidos, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos pueden formularse en un complejo de policatión de lípidos. La formación del complejo lípido-policatión puede lograrse mediante procedimientos conocidos en la técnica y/o como se describe en la Pub. de EE. UU. N° 20120178702. A modo de ejemplo no taxativo, el policatión puede incluir un polipéptido o péptido catiónico, tal como, de modo no taxativo, polilisina, poliornitina y/o poliarginina. En otro caso, el polinucleótido, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos pueden formularse en un complejo de policatión de lípidos que puede incluir además un lípido neutro tal como, entre otros, colesterol o dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE).
La formulación de liposomas puede estar influenciada por, pero sin limitarse a, la selección del componente lipídico catiónico, el grado de saturación de lípidos catiónicos, la naturaleza de la PEGilación, la proporción de todos los componentes y parámetros biofísicos tales como el tamaño. En un ejemplo de Semple y col. (Semple y col. Nature Biotech. 2010 28:172-176), la formulación de liposomas estaba compuesta de 57,1 % de lípido catiónico, 7,1 % de dipalmitoilfosfatidilcolina, 34,3 % de colesterol y 1,4 % de PEG-c-DMA. Como otro ejemplo, cambiar la composición del lípido catiónico podría entregar siRNA de manera más efectiva a varias células presentadoras de antígenos (Basha y col. Mol Ther. 2011 19:2186-2200.
La proporción de PEG en las formulaciones de LNP puede aumentar o disminuir y/o la longitud de la cadena de carbono del lípido PEG puede modificarse de C14 a C18 para alterar la farmacocinética y/o biodistribución de las formulaciones de LNP. Como ejemplo no limitante, las formulaciones de LNP pueden contener 1-5 % de la relación molar de lípidos de PEG-c-DOMG en comparación con el lípido catiónico, DSPC y colesterol. En otra modalidad, es posible reemplazar PEG-c-DOMG con un lípido con PEG tal como, de modo no taxativo, PEG-DSG (1,2-distearoil-snglicerol, metoxipolietilenglicol), o PEG-DPG (1,2-dipalmitoil-sn-glicerol, metoxipolietilenglicol). El lípido catiónico se puede seleccionar de entre cualquier lípido conocido en la técnica tal como, de modo no taxativo, DLin-MC3-DMA, DLin-DMA, C12-200 y DLin-KC2-DMA.
El lípido catiónico puede seleccionarse, de modo no taxativo, de entre un lípido catiónico descrito en las Publicaciones internacionales N° WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724, WO201021865 y WO2008103276, Patentes EE. UU. N° 7.893.302 y 7.404.969 y Publicación de Patente EE. UU. N° US20100036115. En otro caso, el lípido catiónico puede seleccionarse de entre, pero sin limitarse a, la fórmula A descrita en Publicaciones internacionales N° WO2012040184, WO2011153120,WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365 y WO2012044638. En otro caso más, el lípido catiónico puede seleccionarse de entre, pero sin limitarse a, la fórmula CLI-CLXXIX de la Publicación internacional N° WO2008103276, fórmula CLI-CLXXIX de la Patente de EE. UU. N° 7,893.302, fórmula CLI -CLXXXXII de la Patente de EE. UU. N° 7.404.969 y fórmula I-VI de la Publicación de Patente de EE. UU. N° US20100036115. Como ejemplo no limitante, el lípido catiónico puede seleccionarse de entre (20Z,23Z)-N,N-dimetilnonacosa-20,23-dien-10-amina, (17Z,20Z)-N,N-dimetihexacosa-l7,20-dien-9-amina, (1Z, 19Z)-N5N~dimetilpentacosa~I6, 19-dien-8-amina, (l3Z,16z)-N,N-dimetildocosa-13JI6-dien-5-amina, (12Z,15Z)-NJN-dimetilhenicosa-12,15-dien-4-amina, (14Z,17Z)-N,N-dimetiltricosa-14,17-dien-6-amina, (15Z,18Z)-N,N-dimetiltetracosa-15,18-dien-7-amina, (18Z,21 Z)-N,N-dimetilheptacosa-18,21-dien-10-amina,(15Z,18Z)-N,N-dimetiltetracosa-15,18-dien-5-amina,(14Z,17Z)-N,N-dimetiltdcosa-14,17-dien-4-amina,(19Z,22Z)-N,N-dimetioctacosa-19,22-dien-9-amina, (18Z,21z )-N ,N-dimetilheptacosa-18 ,21 -dien-8-amina, (17Z,20Z)-N,N-dimetilhexacosa- 17"20-dien-7-amina, (16Z;19Z)-N,N-dimetilpentacosa-16,19-dien-6-amina, (22Z,25Z)-N,N-dimetilhentdaconta-22,25-dien- 10-amina, (21 Z ,24Z)-N,N-dimetilriaconta-21 ,24-dien-9-amina, (18Z)-N,N-dimetilheptacos-18-en-10-amina, (17Z)-N,N-dimetilhexacos-17-en-9-amina, (19Z,22Z)-NJN-dimetiloctacosa-19,22-dien-7-amina, N, N-dimetilheptacosan-10-amina, (20Z,23Z)-N-etil-N-metilnonacosa-20J23-dien-l0-amina, 1-[(1IZ,14Z)-I-nonilicosa-I1,14-dien-I-il] pirrolidina, (20Z)-N,N-dimetileptacos-20-en-I0-amina, (15Z)-N,N-dimetil eptacos-15-en-I0-amina, (14Z)-N,N-dimetilnonacos-14-en-I0-amina, (l7Z)-N,N-dimetilnonacos-17-en-I0-amina, (24Z)-N,N-dimetiltritriacont-24-en-l 0-amina, (20Z)-N,N-dimetilnonacos-20-en-I0-amina, (22Z)-N,N-dimetilhentriacont-22-en-I0-amina, (16Z)-N,N-dimetilpentacos-16-en-8-amina, (12Z, 15Z)-N,N-dimetil-2-nonilhenicosa-12, 15 -dien-1 -amina, (13Z, 16Z)-N,N-dimetil-3-nonildocosa-I3, 16-dien-I-amina, N,N-dimetill-[(IS,2R)-2-octilciclopropil] eptadecan-8-amina, 1 -[(1 S,2R)-2-hexilcyclopropil]-N,N-dimetilnonadecan- 10-amina, N,N-dimetil-1- [( 1S ,2R)-2-octilciclopropil]nonadecan- 10-amina, N,N-dimetil-21~[(iS,2R)-2-octilciclopropiljhenicosan-I0-amina, N,N-dimetil-1-[(1S ,2S)-2- {[(IR,2R)-2-pentilciclopropil]metil} ciclopropil]nonadecan- 10-amina, N,N-dimetil-1-[(1 S,2R)-2-octilciclopropil]hexadecan-8-amina, N,N-dimetiH -[(IR,2S)-2-undecilciclopropil]tetradecan-5-amina, N,N-dimetil-3- {7-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]heptil} dodecan-1-amina, 1 - [(1R,2 S)-2-heptiIciclopropi1] -N,N-dimetiloctadecan-9 -amina, 1-[(1 S,2R)-2-decilciclopropil]-N,N-dimetilpentadecan-6-amina, N,N-dimetil-I-[(IS,2R)-2-octilciclopropiljpentadecan-8-amina, R -N,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina, S -N,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina, 1-{2-[(9z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxil-1-[(octiloxi) metil]etil}pirrolidina, (2S)-N,N-dimetil-1-[(9Z,12z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-3-[(5Z)-oct -5-en-1 -iloxi]propan-2-amina, 1-{2-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1 -iloxil-1-[(octiloxi) metil]etil}azetidina, (2s )-1-(hexiloxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxilpropan-2-amina, (2s)-1-(heptiloxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxilpropan-2-amina, N,N-dimetil-1-(noniloxi)-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxilpropan-2-amina, N,N-dimetil-1-[(9Z)-octadec-9-en-1-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina (Compuesto 9); (2S)-N,N-dimetil-1-[(6Z,9Z,12Z)-octadeca-6,9,12-trien-1-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina, (2S)-1-[(11Z,14Z)-icosa-11,14-dien-1-iloxil-N,N-dimetil-3-(pentiloxi)propan-2-amina, (2S)-1-(hexiloxi)-3-[(11z,14z)-icosa-11,14-dien-1-iloxi]-N,N-dimetilpropan-2-amina,1-[(11z,14Z)-icosa-11,14-dien-1-iloxi]-N, N-dimeti1-3-(octiloxi)propan-2-amina,1-[(13Z,16Z)-docosa-I3,16-dien-l-iloxi-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, (2S)-1-[(13Z,16z)-docosa-13,16-dien-1-iloxil-3-(hexiloxi)-N,N-dimetilpropan-2-amina, (2S)-1-[(13Z)-docos-13-en-1-iloxi]-3-(hexiloxi)-N,N-dimetilpropan-2-amina, 1-[(13Z)-docos-13-en-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, 1-[(9Z)-hexadec-9-en-1-iloxij-N, N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, (2R)-N,N-dimetil-H(1-metoiloctil)oxi]-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxilpropan-2-amina, (2R)-1-[(3,7-dimetiioctil)oxi]-N,N-dimetii-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9, 12-dien-1-iloxilpropan-2-amina, N,N-dimetil-1-(octiloxi)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1 R,2R)-2-pentilciclopropil]metil]ciclopropil]octil]oxi)propan-2-amina, N,N-dimetil-1-{[8-(2-octilciclopropil)octil]oxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina y (1IE,20Z,23Z)-N;N-dimetilnonacosa-l1,20,2-trien-10-amina o una de sus sales o estereoisómeros farmacéuticamente aceptables.
El lípido catiónico se puede sintetizar mediante procedimientos conocidos en la técnica. y/o como se describe en las Publicaciones internacionales N° WO2012040184, WO2011153120,WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724 y WO201021865.
En una realización, las formulaciones de LNP pueden contener PEG-c-DOMG en una proporción molar de lípidos del 3 %. En otro caso, la formulación de LNP puede contener una proporción molar de lípidos del 1,5 % de PEG-c-DOMG.
En una realización, la formulación de LNP puede contener PEG-DMG 2000 (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000). En un caso, la formulación de LNP puede contener PEG-DMG 2000, un lípido catiónico conocido en la técnica y al menos otro componente. En otro caso, la formulación de LNP puede contener PEG-DMG 2000, un lípido catiónico conocido en la técnica, DSPC y colesterol. Como ejemplo no limitante, la formulación de LNP puede contener PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC y colesterol. Como otro ejemplo no limitativo, la formulación de LNP puede contener PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC y colesterol en una proporción molar de 2:40:10:48. (ver Geall y col., Nonviral delivery of self-amplifying RNA vaccines, PNAS 2012; PMID: 22908294).
En un caso, la formulación de LNP puede formularse mediante los métodos descritos en las Publicaciones Internacionales N°. WO2011127255 o WO2008103276. Como ejemplo no limitante, el ARN modificado descrito en esta invención puede encapsularse en formulaciones de LNP como se describe en WO2011127255 y/o WO2008103276.
Las formulaciones de LNP descritas en esta invención pueden comprender una composición policatiónica. A modo de ejemplo no taxativo, la composición policatiónica puede seleccionarse de entre la fórmula 1-60 de la Publicación de Patente de EE. UU. N° US20050222064. En otro caso, las formulaciones de LNP que comprenden una composición policatiónica puede usarse para la administración del ARN modificado descrito en esta invención in vivo y/o in vitro.
Las formulaciones de LNP descritas en esta invención pueden comprender adicionalmente una molécula que mejore la permeabilidad. Moléculas que mejoran la permeabilidad no limitativas se describen en la Publicación de Patente de EE.UU. N° US20050222064.
En un caso, las composiciones farmacéuticas pueden formularse en liposomas tales como, entre otros, liposomas DiLa2 (Marina Biotech, Bothell, WA), SMARTlCLES® (Marina Biotech, Bothell, WA), DOPC neutro (1,2-dioleoil -snglicero-3-fosfocolina) basados en liposomas (p. ej., suministro de siRNA para cáncer de ovario (Landen y col. Cancer Biology & Therapy 20065(12)1708-1713)) y liposomas recubiertos con hialuronano (Quiet Therapeutics, Israel).
Las formulaciones de nanopartículas lipídicas pueden mejorarse al reemplazar el lípido catiónico con un lípido catiónico biodegradable que se sepa que es una nanopartícula lipídica de eliminación rápida (reLNP - rapidly eliminated lipid nanoparticle). Se ha demostrado que los lípidos catiónicos ionizables, tales como, de modo no taxativo, DLinDMA, DLin-KC2-DMA y DLin-MC3-DMA, se acumulan en plasma y los tejidos con el tiempo y pueden ser una fuente potencial de toxicidad. El metabolismo rápido de los lípidos de eliminación rápida puede mejorar la tolerabilidad e índice terapéutico de las nanopartículas lipídicas en un orden de magnitud de una dosis de 1 mg/kg a una dosis de 10 mg/kg en ratas. La inclusión de un enlace de éster degradado de forma enzimática puede mejorar el perfil de degradación y metabolismo del componente catiónico, mientras que igual se mantiene la actividad de la formulación de reLNP. El enlace de éster puede ubicarse internamente dentro de la cadena lipídica o puede encontrarse de forma terminal en un extremo de la cadena lipídica. El enlace de éster interno puede reemplazar cualquier carbono de la cadena lipídica.
En una realización, el enlace éster interno puede estar ubicado en cualquier lado del carbono saturado. Ejemplos no limitantes de reLNP incluyen,
Figure imgf000222_0001
Se puede provocar una respuesta inmunitaria administrando una nanopartícula lipídica que puede incluir una nanoespecie, un polímero y un inmunógeno. (Publicación de EE. UU. N° 20120189700 y Publicación Internacional N° WO2012099805). El polímero puede encapsular la nanoespecie o encapsular parcialmente la nanoespecie. El inmunógeno puede ser una proteína recombinante, un ARN modificado y/o un polinucleótido descrito en esta invención. En una realización, la nanopartícula lipídica se puede formular para su uso en una vacuna tal como, entre otros, contra un patógeno.
Las nanopartículas lipídicas pueden diseñarse para alterar las propiedades superficiales de las partículas, de manera que las nanopartículas lipídicas puedan penetrar la barrera de mucosa. La mucosa está ubicada en el tejido mucoso, tales como, por ejemplo, oral (por ejemplo, las membranas bucales y esofágicas y el tejido de las amígdalas), oftálmico, gastrointestinal (por ejemplo, estómago, intestino delgado, intestino grueso, colon, recto), nasal, respiratorio (por ejemplo, membrana nasal, faríngea, traqueal y bronquial), genital (por ejemplo, membrana vaginal, del cuello del útero y uretral). Se creía que las nanopartículas mayores que 10-200 nm que se prefieren por su mayor eficacia de encapsulación del fármaco y la capacidad de proporcionar administración sostenida para un conjunto amplio de fármacos, eran muy grandes como para difundirse rápidamente a través de las barreras de mucosa. La mucosa se secreta, dispersa, descarta o digiere y recicla continuamente, de manera que la mayoría de las partículas atrapadas puedan eliminarse del tejido mucoso en segundos o en unas pocas horas. Las nanopartículas poliméricas mayores (con un diámetro entre 200 nm y 500 nm) que se han recubierto de forma densa con un polietilenglicol (PEG) de peso molecular bajo se difunden a través de la mucosa solamente de 4 a 6 veces más lentamente que la difusión de las mismas partículas en agua (Lai y col. PNAS 2007 104(5):1482-487; Lai y col. Adv Drug Deliv Rev. 200961(2): 158­ 171). El transporte de nanopartículas puede determinarse mediante el uso de velocidades de permeación y/o técnicas de microscopía fluorescente, inclusive, de modo no taxativo, recuperación de fluorescencia a continuación de fotoblanqueo (FRAP) y rastreo de partículas múltiples (MPT) de alta resolución.
Las nanopartículas lipídicas diseñadas para penetrar la mucosa pueden comprender un material polimérico (es decir, un núcleo polimérico) y/o un conjugado de polímero y vitamina y/o un copolímero de tribloque. El material polimérico puede incluir, de modo no taxativo, poliaminas, poliéteres, poliamidas, poliésteres, policarbamatos, poliureas, policarbonatos, poli(estirenos), poliimidas, polisulfonas, poliuretanos, poliacetilenos, polietilenos, polietileniminas, poliisocianatos, poliacrilatos, polimeacrilatos, poliacrilonitrilos y poliarilatos. El material polimérico puede ser biodegradable y/o biocompatible. Ejemplos no limitantes de polímeros específicos incluyen poli(caprolactona)
(PCL), polímero de etileno y acetato de vinilo (EVA), poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido L-láctico) (PLLA), poli(ácido glicólico) (PGA), poli(ácido láctico-co-ácido glicólico) ) (PLGA), poli(ácido L-láctico-co-ácido glicólico) (PLLGA), poli(D,L-lactida) (PDLA), poli(L-lactida) (PLLA), poli(D,L-lactida -co-caprolactona), poli(D,L-lactida-co-caprolactona-coglicolida), poli(D,L-lactida-co-PEO-co-D,L-lactida), poli(D,L- lactida-co-PPO-co-D,L-lactida), cianoacralato de polialquilo, poliuretano, poli-L-lisina (PLL), metacrilato de hidroxipropilo (HPMA), polietilenglicol, ácido poli-L-glutámico, poli(hidroxiácidos), polianhídridos, poliortoésteres, poli(éster amidas), poliamidas, poli(éster éter), policarbonatos, polialquilenos como polietileno y polipropileno, polialquilenglicoles como poli(etilenglicol) (PEG), óxidos de polialquileno (PEO), tereftalatos de polialquileno como poli(tereftalato de etileno), alcoholes de polivinilo (PVA), éteres de polivinilo, ésteres de polivinilo como poli(acetato de vinilo), haluros de polivinilo como poli(cloruro de vinilo) (PVC), polivinilpirrolidona, polisiloxanos, poliestireno (PS), poliuretanos, celulosas derivatizadas como alquilcelulosas, hidroxialquilcelulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, nitrocelulosas, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, polímeros acrílicos ácidos, tales como poli((met)acrilato de metilo) (PMMA), poli(met)acrilato de fetilo), poli((met)acrilato de butilo), poli((met)acr|lato de isobutilo), poli((met)acrilato de hexilo), poli(isodecilo(met)acrilato), poli(lauril(met)acrilato), poli(fenil(met)acrilato) poli(metilacrilato), poli(isopropilacrilato), polifisobutilacrilato), poli(octadecilacrilato) y copolímeros y mezclas de los mismos, polidioxanona y sus copolímeros, polihidroxialcanoatos, polipropileno fumarato, polioximetileno, poloxámeros, poli(orto)ésteres, poli(ácido butírico), poli(ácido valérico), poli(láctido-co-caprolactona) y carbonato de trimetileno, polivinilpirrolidona. Las nanopartículas lipídicas pueden recubrirse o asociarse con un copolímero, tal como, de modo no taxativo, un copolímero de bloque y copolímero de tribloque (poli(etilenglicol))-óxido de (poli)etileno-(poli(etilenglicol))(ver Publicación EE. UU.
20120121718 y Publicación EE. UU. 20100003337). El copolímero puede ser un polímero que se considera en general seguro (GRAS) y la formación de la nanopartícula lipídica puede ser de una manera tal que no se creen entidades químicas nuevas. Por ejemplo, la nanopartícula lipídica puede comprender poloxámeros que recubren nanopartículas de PLGA sin formar entidades químicas nuevas que todavía son capaces de penetrar rápidamente en la mucosa humana (Yang y col. Angew. Chem. Int. Ed. 201150:2597-2600).
La vitamina del conjugado de polímero-vitamina puede ser vitamina E. La porción de vitamina del conjugado se puede sustituir con otros componentes adecuados como, por ejemplo, vitamina A, vitamina E, otras vitaminas, colesterol, un resto hidrofóbico o un componente hidrofóbico de otros surfactantes (por ejemplo, cadenas de esterol, ácidos grasos, cadenas de hidrocarburos y cadenas de óxido de alquileno).
La nanopartícula lipídica modificada para penetrar la mucosa puede incluir agentes que modifican la superficie como, entre otros, polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado, ácidos ribonucleicos, proteínas aniónicas (por ejemplo, albúmina de suero bovino), surfactantes (por ejemplo, surfactantes catiónicos como, por ejemplo, bromuro de dimetildioctadecil-amonio), azúcares o derivados de azúcares (por ejemplo, ciclodextrina), ácidos nucleicos, polímeros (por ejemplo, heparina, polietilenglicol y poloxámero), agentes mucolíticos (por ejemplo, N-acetilcisteína, artemisa, bromelaina, papaína, clerodendrum, acetilcisteína, bromhexina, carbocisteína, eprazinona, mesna, ambroxol, sobrerol, domyodol, letosteína, estepronina, tiopronina, gelsolina, timosina p4 dornasa alfa, neltenexina, erdosteína) y diversas DNasas incluido rhDNasa. El agente que altera la superficie puede incrustarse o incorporarse en la superficie de la partícula, o disponerse (por ejemplo, mediante recubrimiento, adsorción, enlace covalente u otro procedimiento) en la superficie de la nanopartícula lipídica (Ver Publicación EE. UU. 20100215580 y Publicación EE. UU. 20080166414).
Las nanopartículas lipídicas que penetran en la mucosidad pueden comprender al menos un polinucleótido, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos descritos en esta invención. El polinucleótido puede encapsularse en la nanopartícula lipídica y/o disponerse en la superficie de la partícula. El polinucleótido, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos pueden acoplarse covalentemente a la nanopartícula lipídica. Las formulaciones de nanopartículas de lípidos que penetran en la mucosidad pueden comprender una pluralidad de nanopartículas. Además, las formulaciones pueden contener partículas que pueden interactuar con la mucosidad y alterar las propiedades estructurales y/o adhesivas de la mucosidad circundante para disminuir la mucoadhesión, lo que puede aumentar la liberación de la mucosidad. penetración de nanopartículas lipídicas al tejido de la mucosa.
En un caso, el polinucleótido, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos se formulan como un lipoplex, como, entre otros, el sistema ATUPLEX™ , el sistema DACC, el sistema DBTC y otra tecnología de lipoplex siRNA de Silence Therapeutics (Londres, Reino UNido), STEMFECT™ de STEMGENT® (Cambridge, MA), y y polietilenimina (PEI) o suministro de ácidos nucleicos dirigido y no dirigido a base de protamina (Aleku y col. Cancer Res. 2008 68:9788-9798; Strumberg y col. Int J Clin Pharmacol Ther 2012 50:76-78; Santel y col., Gene Ther 2006 13:1222-1234; Santel y col., Gene Ther 2006 13: 1360-1370; Gutbier y col., Pulm Pharmacol. Ther. 2010 23:334-344; Kaufmann y col. Microvasc Res 2010 80:286-293Weide y col. J Immunother. 2009 32:498-507; Weide y col. J Immunother. 200831:180-188; Pascolo Expert Opin. Biol. Ther. 4:1285-1294; Fotin-Mleczek y col., 2011 J. Immunother. 34:1-15; Song y col., Nature Biotechnol. 2005, 23:709-717; Peer y col., Proc Natl Acad Sci U S A. 20076;104:4095-4100; deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132).
En un caso, dichas formulaciones también pueden construirse o modificarse las composiciones de manera que se dirijan de forma pasiva o activa a diferentes tipos celulares in vivo, incluidos, entre otros, hepatocitos, células inmunitarias, células tumorales, células endoteliales, células presentadoras de antígenos y leucocitos (Akinc y col. Mol Ther. 2010 18:1357-1364; Song y col., Nat Biotechnol. 2005 23:709-717, Judge y col., J Clin Invest. 2009 119:661-673; Kaufmann y col., Microvasc Res 2010 80:286-293; Santel y col., Gene Ther2006 13:1222-1234; Santel y col., Gene Ther 200613:1360-1370; Gutbier y col., Pulm Pharmacol. Ther. 201023:334-344; Basha y col., Mol. Ther. 2011 19:2186-2200; Fenske y Cullis, Expert Opin Drug Deliv. 2008 5:25-44; Peer y col., Science. 2008 319:627-630; Peer y Lieberman, Gene Ther. 201118:1127-1133). Un ejemplo de orientación pasiva de las formulaciones a las células hepáticas incluye las formulaciones de nanopartículas lipídicas basadas en DLin-DMA, DLin-KC2-DMA y MC3 que han demostrado unirse a la apolipoproteína E y promover la unión y la absorción de estas formulaciones en los hepatocitos in vivo (Akinc y col. Mol Ther. 2010 18:1357-1364). Las formulaciones también pueden dirigirse selectivamente a través de la expresión de diferentes ligandos en su superficie, como lo ejemplifican, entre otros, folato, transferrina, N-acetilgalactosamina (GaINAc) y estrategias dirigidas a anticuerpos (Kolhatkar y col., Curr Drug Discov Technol. 2011 8:197-206; Musacchio and Torchilin, Front Biosci. 2011 16:1388-1412; Yu y col., Mol Membr Biol. 201027:286-298; Patil y col., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 200825:1-61; Benoit y col., Biomacromolecules.
2011 12:2708-2714Zhao y col., Expert Opin Drug Deliv. 2008 5:309-319; Akinc y col., Mol Ther. 2010 18:1357-1364; Srinivasan y col., Methods Mol Biol. 2012 820:105-116; Ben-Arie y col., Methods Mol Biol. 2012 757:497-507; Peer 2010 J Control Release. 20:63-68; Peer y col., Proc Natl Acad Sci USA. 2007 104:4095-4100; Kim y col., Methods Mol Biol. 2011 721:339-353; Subramanya y col., Mol Ther. 2010 18:2028-2037; Song y col., Nat Biotechnol. 200523:709-717; Peer y col., Science. 2008319:627-630; Peer and Lieberman, Gene Ther. 201118:1127-1133).
En un caso, el polinucleótido, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos se formulan como una nanopartícula lipídica sólida. Una nanopartícula lipídica sólida (SLN - solid lipid nanoparticle) puede ser esférica con un diámetro promedio de entre 10 y 1000 nm. La SLN posee una matriz central lipídica sólida que puede solubilizar moléculas lipofílicas y puede estabilizarse con tensioactivos y/o emulsionantes. La nanopartícula lipídica puede ser una nanopartícula lípido-polímero autoensamblada (ver Zhang y col., ACS Nano, 2008, 2 (8), pp.
1696-1702).
Se pueden usar liposomas, lipoplejos o nanopartículas lipídicas para mejorar la eficacia de polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o producción de proteínas dirigida por ácidos ribonucleicos, ya que estas formulaciones pueden aumentar la transfección celular por los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ácidos nucleicos modificados mejorados. ARN o ácidos ribonucleicos; y/o aumentar la traducción de la proteína codificada. Un ejemplo de esto implica el uso de la encapsulación de lípidos para facilitar la administración sistémica efectiva de ADN de plásmido poliplejo (Heyes y col. Mol Ther. 2007 15:713-720). Los liposomas, lipoplejos o nanopartículas lipídicas también se pueden usar para aumentar la estabilidad de los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos.
En un caso, el polinucleótido, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la presente descripción pueden formularse para liberación controlada. y/o entrega dirigida. Tal como se usa en esta invención, “ liberación controlada” se refiere a un perfil de liberación de un compuesto o composición farmacéutica que se conforma a un patrón particular de liberación para efectuar un resultado terapéutico. En un caso, el polinucleótido, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos pueden encapsularse en un agente de administración descrito en esta invención y/o conocido en la técnica para liberación controlada y/o administración dirigida. Tal como se usa en esta invención, el término "encapsular" significa envolver, encerrar o rodear. En lo que se refiere a la formulación de los compuestos de la divulgación, la encapsulación puede ser sustancial, completa o parcial. El término "sustancialmente encapsulado" significa que al menos más del 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,9 o más del 99,999 % de la composición farmacéutica o compuesto del la divulgación puede estar envuelta, rodeada o encerrada dentro del agente de entrega. “Encapsulación parcial” significa que menos que 10, 10, 20, 30, 40, 50 o menos de la composición farmacéutica o compuesto de la descripción puede encontrarse envuelto, encerrado o rodeado dentro del agente de entrega. Ventajosamente, la encapsulación puede estar determinada mediante la medición del escape o la actividad de la composición farmacéutica o compuesto de la descripción mediante el uso de fluorescencia y/o micrografía electrónica. Por ejemplo, al menos 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 o más que 99,99 % de la composición farmacéutica o compuesto de la descripción se encuentra encapsulado en el agente de administración.
En otro caso, los polinucleótidos, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos pueden encapsularse en una nanopartícula lipídica o una nanopartícula lipídica que se elimina rápidamente y las nanopartículas lipídicas o una nanopartícula lipídica que se elimina rápidamente se pueden encapsular en un polímero, hidrogel y /o sellador quirúrgico descrito en esta invención y/o conocido en la técnica. Como ejemplo no limitativo, el polímero, hidrogel o sellador quirúrgico puede ser PLGA, etileno acetato de vinilo (EVAc), poloxámero, GELSITE® (Nanotherapeutics, Inc. Alachua, FL), HYLENEX® (Halozyme Therapeutics, San Diego c A), selladores quirúrgicos como polímeros de fibrinógeno (Ethicon Inc. Cornelia, GA), TISSELL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL), selladores a base de PEG y COSEAL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL).
En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica puede encapsularse en cualquier polímero conocido en la técnica que pueda formar un gel al inyectarse en un sujeto. Como otro ejemplo no taxativo, la nanopartícula lipídica puede encapsularse en una matriz de polímero que puede ser biodegradable.
En un caso, la formulación de polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos para liberación controlada y/o la entrega dirigida también puede incluir al menos un recubrimiento de liberación controlada. Los recubrimientos de liberación controlada incluyen, entre otros, OPADRY®, copolímero de polivinilpirrolidona/acetato de vinilo, polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxietilcelulosa, EUDRAGIT RL®, EUDRAGIT RS® y derivados de celulosa como las dispersiones acuosas de etilcelulosa (AQUACOAT® y SURELEASE®).
La formulación de liberación controlada y/o liberación dirigida puede comprender al menos un poliéster degradable que puede contener cadenas laterales policatiónicas. Los poliésteres degradables incluyen, de modo no taxativo, éster de poli(serina), poli(L-láctido-co-L-lisina), éster de poli(4-hidroxi-L-prolina) y combinaciones de los mismos. En otra modalidad, los poliésteres degradables pueden incluir una conjugación de PEG para formar un polímero PEGilado.
En un caso, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la presente descripción pueden encapsularse en una nanopartícula terapéutica. Las nanopartículas terapéuticas pueden formularse mediante procedimientos descritos en esta invención y conocidos en la técnica tales como, de forma no taxativa, Pub Internacional N° W02010005740, WO2010030763, WO2010005721, WO2010005723, WO2012054923, US Pub. N° US20110262491, US20100104645, US20100087337, US20100068285, US20110274759, US20100068286, y Pat EE. UU. N° 8.206.747). En otro caso, las nanopartículas poliméricas terapéuticas pueden identificarse mediante los procedimientos descritos en la publicación de EE.UU. N° US20120140790.
En un caso, la nanopartícula terapéutica puede formularse para liberación sostenida. Tal como se usa en esta invención, "liberación sostenida" hace referencia a una composición farmacéutica o compuesto que se conforma a una velocidad de liberación en un período específico de tiempo. El período de tiempo puede incluir, de modo no taxativo, horas, días, semanas, meses y años. Como ejemplo no limitativo, la nanopartícula de liberación sostenida puede comprender un polímero y un agente terapéutico como, entre otros, los polinucleótidos, las construcciones primarias y el ARN modificado mejorado de la presente divulgación (ver Publicación Internacional N° 2010075072 y Pub EE. UU. N° US20100216804 y US20110217377.
Las nanopartículas terapéuticas se pueden formular para que sean específicas de la diana. A modo de ejemplo no taxativo, las nanopartículas terapéuticas pueden incluir un corticoesteroide (ver Pub. International N° WO2011084518). Las nanopartículas terapéuticas se pueden formular para que sean específicas para cáncer. A modo de ejemplo no taxativo, las nanopartículas terapéuticas pueden formularse en las nanopartículas descritas en las Pub Internacionales N° WO2008121949, WO2010005726, WO2010005725, WO2011084521 y Pub de EE. US. N° US20100069426, US20120004293y US20100104655.
En un caso, las nanopartículas de la presente divulgación pueden comprender una matriz polimérica. Como ejemplo no limitativo, la nanopartícula puede comprender dos o más polímeros tales como, pero sin limitarse a, polietilenos, policarbonatos, polianhídridos, polihidroxiácidos, polipropilfumeratos, policaprolactonas, poliamidas, poliacetales, poliéteres, poliésteres, poli(ortoésteres), policianoacrilatos, alcoholes polivinílicos, poliuretanos, polifosfacenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, policianoacrilatos, poliureas, poliestirenos, poliaminas, polilisina, poli(etilenimina), poli(éster de serina), poli(L-lactida-co-L-lisina), poli(4- éster de hidroxi-L-prolina) o combinaciones de los mismos.
En un caso, el copolímero dibloque puede incluir PEG en combinación con un polímero tal como, entre otros, polietilenos, policarbonatos, polianhídridos, polihidroxiácidos, polipropilfumeratos, policaprolactonas, poliamidas, poliacetales, poliéteres, poliésteres, poli(ortoésteres), policianoacrilatos, alcoholes polivinílicos, poliuretanos, polifosfacenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, policianoacrilatos, poliureas, poliestirenos, poliaminas, polilisina, poli(etilenimina), poli(éster de serina), poli(L-lactida-co-L-lisina), poli(4- éster de hidroxi-L-prolina) o combinaciones de los mismos.
En un caso, la nanopartícula terapéutica comprende un copolímero dibloque. A modo de ejemplo no taxativo, la nanopartícula terapéutica comprende un copolímero en bloque PLGA-PEG (ver la Pub. EE. u U. N° US20120004293 y Pat EE. UU. N° 8,236,330). En otro ejemplo no limitativo, la nanopartícula terapéutica es una nanopartícula furtiva que comprende un copolímero dibloque de PEG y PLA o PEG y PlGa (ver Pat EE. UU. N° 8.246.968).
En un caso, la nanopartícula terapéutica puede comprender al menos un polímero acrílico. Los polímeros acrílicos incluyen, entre otros, ácido acrílico, ácido metacrílico, copolímeros de ácido acrílico y ácido metacrílico, copolímeros de metacrilato de metilo, metacrilatos de etoxietilo, metacrilato de cianoetilo, copolímero de metacrilato de aminoalquilo, poli(ácido acrílico), poli(ácido metacrílico), policianoacrilatos y combinaciones de los mismos.
Las nanopartículas terapéuticas pueden comprender al menos un polímero catiónico descrito en esta invención y/o conocido en la técnica.
Las nanopartículas terapéuticas pueden comprender al menos un polímero que contiene amina tal como, pero sin limitarse a, polilisina, polietilenimina, dendrímeros de poli (amidoamina) y combinaciones de los mismos.
En una realización, las nanopartículas terapéuticas pueden comprender al menos un poliéster degradable que puede contener cadenas laterales policatiónicas. Los poliésteres degradables incluyen, de modo no taxativo, éster de poli(serina), poli(L-láctido-co-L-lisina), éster de poli(4-hidroxi-L-prolina) y combinaciones de los mismos. En otra modalidad, los poliésteres degradables pueden incluir una conjugación de PEG para formar un polímero PEGilado.
En otro caso, la nanopartícula terapéutica puede incluir una conjugación de al menos un ligando de direccionamiento.
La nanopartícula terapéutica se puede formular en una solución acuosa que se puede utilizar para alcanzar el cáncer (ver Pub Internacional N° WO2011084513 y Pub US. N° US20110294717).
En un caso, los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos pueden encapsularse, unirse y/o asociarse con nanoportadores sintéticos. Los nanoportadores sintéticos pueden formularse utilizando procedimientos conocidos en la técnica y/o descritos en esta invención. A modo de ejemplo no taxativo, los nanoportadores sintéticos pueden formularse mediante los procedimientos descritos en las Pub Internacionales N° WO2010005740, WO2010030763 y Pub. EE. UU. N° US20110262491, US20100104645 y US20100087337. Las formulaciones de nanoportadores sintéticos pueden liofilizarse mediante procedimientos descritos en las Pub. Internacional N° WO2011072218 y Pat EE. UU. N° 8.211.473.
En un caso, los nanoportadores sintéticos pueden contener grupos reactivos para liberar los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos descritos en esta invención (consulte la Publicación Internacional N° WO20120952552 y US Pub N°. US20120171229).
En un caso, los nanoportadores sintéticos pueden contener un agente inmunoestimulador para mejorar la respuesta inmunitaria a partir del suministro del nanoportador sintético. Como un ejemplo no taxativo, el nanoportador sintético puede comprender un agente inmunoestimulador de Th1 que puede mejorar una respuesta basada en Th1 del sistema inmunitario (ver Pub Internacional N° WO2010123569 y Pub. EE. UU. N° US20110223201).
Los nanoportadores sintéticos pueden formularse para la liberación dirigida. El nanoportador sintético puede formularse para liberar los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos aquí descritos a un pH especificado y/o después de un intervalo de tiempo deseado. Como ejemplo no limitativo, la nanopartícula sintética puede formularse para liberar los polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARNmm después de 24 horas y/o a un pH de 4,5 (ver Pub.Internacionales N° WO2010138193 y WO2010138194 y Pub EE. UU. N° US20110020388 y US20110027217).
En un caso, los nanoportadores sintéticos pueden formularse para la liberación controlada y/o sostenida de los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos descritos en esta invención. A modo de ejemplo no taxativo, los nanoportadores sintéticos para liberación sostenida pueden formularse mediante procedimientos conocidos en la técnica, descritos en esta invención y/o descritos en la Pub Internacional N° WO2010138192 y Pub EE. UU. N° 20100303850.
En una modalidad, el nanoportador sintético se puede formular para utilizar como una vacuna. En un caso, el nanoportador sintético puede encapsular al menos un ácido nucleico modificado, un ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos que codifican al menos un antígeno. Como ejemplo no limitativo, el nanoportador sintético puede incluir al menos un antígeno y un excipiente para una forma de dosificación de vacuna (ver Publicación Internacional N° WO2011150264 y Pub EE. UU. N°. US20110293723). Como otro ejemplo no limitativo, una forma de dosificación de vacuna puede incluir al menos dos nanoportadores sintéticos con antígenos iguales o diferentes y un excipiente (consulte la Publicación Internacional N° WO2011150249 y Pub EE. UU. N°. US20110293701). La forma de dosificación de vacuna puede seleccionarse mediante procedimientos descritos en esta invención, conocidos en la técnica y/o descritos en la Publicación Internacional N° WO2011150258 y Pub EE. UU. N°. US20120027806).
En un caso, el nanoportador sintético puede comprender al menos un polinucleótido, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos que codifican al menos un adyuvante. En otro caso, el nanoportador sintético puede comprender al menos un ácido nucleico modificado, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos y un adyuvante. Como un ejemplo no taxativo, el nanoportador sintético que comprende un adyuvante se puede formular a través de los procedimientos descritos en la Publicación Internacional N° WO2011150240 y Pub e E. UU. N° US20110293700.
En un caso, el nanoportador sintético puede encapsular al menos un polinucleótido, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos que codifica un péptido, fragmento o región de un virus. A modo de ejemplo no taxativo, el nanoportador sintético puede incluir, de modo no taxativo, los nanoportadores descritos en las publicaciones internacionales N° WO2012024621, WO201202629, WO2012024632 y Pub EE. UU. N° US20120064110, US20120058153y US20120058154.
Polímeros, nanopartículas biodegradables y nanopartículas Core-Shell
Los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la descripción se pueden formular utilizando polímeros naturales y/o sintéticos. Los ejemplos no limitativos de polímeros que se pueden usar para la administración incluyen, entre otros, formulaciones Dynamic POLYCONJUGATE™ formulaciones de MIRUS® Bio (Madison, WI) y Roche Madison (Madison, WI), PHASERX™ formulaciones de polímeros tales como, sin limitación, SMARTT POLYMER TECHNOLOGY™ (Seattle, WA), DMRI/DOPE, poloxamer, adyuvante VAXFECTIN® de Vical (San Diego, CA), quitosano, ciclodextrina de Calando Pharmaceuticals (Pasadena, CA), dendrímeros y poli(co-láctico- ácido glicólico) (PLGA), polímeros RONDEL™ (ARNi/suministro de nanopartículas de oligonucleótidos) (Arrowhead Research Corporation, Pasadena, CA) y polímeros cobloque sensibles al pH como, entre otros, PHASERX™ (Seattle, WA).
Un ejemplo no limitante de formulaciones de PLGA incluye, entre otros, depósitos inyectables de PLGA (p. ej., ELIGARD® que se forma disolviendo PLGA en 66 % de N-metil-2-pirrolidona (NMP) y el resto es disolvente acuoso y leuprolida. Una vez inyectado, el péptido PLGA y leuprolida precipita en el espacio subcutáneo).
Muchas de estas estrategias de polímeros han demostrado su eficacia para administrar oligonucleótidos in vivo en el citoplasma celular (revisado en deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132). Dos estrategias poliméricas que han producido una entrega robusta in vivo de ácidos nucleicos, en este caso con ARN de interferencia pequeño (siRNA), son policonjugados dinámicos y nanopartículas basadas en ciclodextrina. El primero de estos enfoques de entrega utiliza policonjugados dinámicos y se ha demostrado in vivo en ratones para entregar de manera efectiva el siRNA y silenciar el ARNm diana endógeno en los hepatocitos (Rozema y col., Proc Natl Acad Sci USA. 2007 104:12982-12887). Esta estrategia particular es un sistema de polímero multicomponente cuyas características clave incluyen un polímero de membrana activa al que el ácido nucleico, en este caso siRNA, se acopla covalentemente a través de un enlace disulfuro y donde tanto PEG (para enmascaramiento de carga) como grupos N-acetilgalactosamina (para alcanzar hepatocitos) son enlazados a través de enlaces sensibles al pH (Rozema y col., Proc Natl Acad Sci Us A. 2007 104:12982-12887). Al unirse al hepatocito y entrar en el endosoma, el complejo polimérico se desmonta en el entorno de pH bajo, con el polímero exponiendo su carga positiva, lo que conduce al escape endosómico y la liberación citoplasmática del siRNA del polímero. Mediante el reemplazo del grupo N-acetilgalactosamina por un grupo manosa, se demostró que se podía alterar la dirección de los hepatocitos que expresan el receptor de asialoglicoproteína al endotelio sinusoidal y las células de Kupffer. Otra estrategia de polímero implica el uso de nanopartículas de policationes que contienen ciclodextrina dirigidas a transferrina. Estas nanopartículas han demostrado un silenciamiento dirigido del producto del gen EWS-FLI1 en células tumorales de sarcoma de Ewing que expresan el receptor de transferrina (Hu-Lieskovan y col., Cancer Res.200565: 8984-8982) y siRNA formulado en estas nanopartículas fue bien tolerado en primates no humanos (Heidel y col., Proc Natl Acad Sci USA 2007104:5715-21), Ambas estrategias de entrega incorporan enfoques racionales que utilizan tanto la entrega dirigida como los mecanismos de escape endosomal.
La formulación polimérica puede permitir la liberación retardada o sostenida de polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos (p. ej., después de una inyección intramuscular o subcutánea). El perfil de liberación alterado para los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos puede dar como resultado, por ejemplo, la traducción de una proteína codificada durante un período de tiempo prolongado. La formulación polimérica también se puede usar para aumentar la estabilidad del polinucleótido, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos. Los polímeros biodegradables se han utilizado previamente para proteger los ácidos nucleicos distintos de los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la degradación y se ha demostrado que dan como resultado una liberación sostenida de cargas útiles in vivo (Rozema y col., Proc Natl Acad Sci USA.
2007104:12982-12887; Sullivan y col., Expert Opin Drug Deliv. 2010 7:1433-1446; Convertine y col., Biomacromolecules. 2010 Oct 1; Chu y col., Acc Chem Res. 2012 Jan 13; Manganiello y col., Biomaterials. 2012 33:2301-2309; Benoit y col., Biomacromolecules. 2011 12:2708-2714; Singha y col., Nucleic Acid Ther. 2011 2:133-147; deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132; Schaffert and Wagner, Gene Ther. 2008 16:1131-1138; Chaturvedi y col., Expert Opin Drug Deliv. 2011 8:1455-1468; Davis, Mol Pharm. 20096:659-668; Davis, Nature 2010 464:1067-1070).
En un caso, las composiciones farmacéuticas pueden ser formulaciones de liberación sostenida. Las formulaciones de liberación sostenida pueden ser para administración subcutánea. Las formulaciones de liberación sostenida pueden incluir, entre otras, microesferas de PLGA, etileno vinil acetato (EVAc), poloxámero, GELSITE® (Nanotherapeutics, Inc. Alachua, FL), HYLENEX® (Halozyme Therapeutics, San Diego CA), selladores quirúrgicos como como polímeros de fibrinógeno (Ethicon Inc. Cornelia, GA), TISSELL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL), selladores a base de PEG y COSEa L® (Baxter International, Inc Deerfield, IL).
Como ejemplo no limitativo, se puede formular ARNm modificado en microesferas de PLGA preparando las microesferas de PLGA con velocidades de liberación ajustables (por ejemplo, días y semanas) y encapsulando el ARNm modificado en las microesferas de PLGA mientras se mantiene la integridad del ARNm modificado durante el procedimiento de encapsulación. EVAc son polímeros biocompatibles no biodegradables que se utilizan ampliamente en aplicaciones preclínicas de implantes de liberación sostenida (p. ej., productos de liberación prolongada Ocusert, un inserto oftálmico de pilocarpina para el glaucoma o progestasert, un dispositivo intrauterino de progesterona de liberación sostenida; sistemas de administración transdérmica Testoderm, Duragesic y Selegiline; catéteres). Poloxamer F-407 NF es un copolímero tribloque hidrofílico, tensioactivo no iónico de polioxietileno-polioxipropilenopolioxietileno que tiene una baja viscosidad a temperaturas inferiores a 5 °C y forma un gel sólido a temperaturas superiores a 15 °C. Los selladores quirúrgicos a base de PEG comprenden dos componentes sintéticos de PEG mezclados en un dispositivo de administración que se puede preparar en un minuto, se sella en 3 minutos y se reabsorbe en 30 días. GELSITE® y los polímeros naturales pueden gelificarse in situ en el lugar de administración. Se ha demostrado que interactúan con los candidatos terapéuticos de proteínas y péptidos a través de la interacción iónica para proporcionar un efecto estabilizador.
Las formulaciones de polímeros también pueden dirigirse selectivamente a través de la expresión de diferentes ligandos, como lo ejemplifican, entre otros, folato, transferrina y N-acetilgalactosamina (GaINAc) (Benoit y col., Biomacromolecules. 2011 12:2708-2714; Rozema y col., Proc Natl Acad Sci USA. 2007 104:12982-12887; Davis, Mol Pharm. 20096:659-668; Davis, Nature 2010464:1067-1070).
Los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la divulgación pueden formularse con o en un compuesto polimérico. El polímero puede incluir al menos un polímero tal como, entre otros, polietilenos, polietilenglicol (PEG), poli(I-lisina)(PLL), PEG injertado en PLL, lipopolímero catiónico, lipopolímero catiónico biodegradable, polietilenimina (PEI) , poli(alquileniminas) ramificadas reticuladas, un derivado de poliamina, un poloxámero modificado, un polímero biodegradable, copolímero de bloque biodegradable, copolímero aleatorio biodegradable, copolímero de poliéster biodegradable, copolímero de bloque de poliéster biodegradable, copolímero aleatorio de bloque de poliéster biodegradable, copolímero biodegradable lineal, poli[a-(4-aminobutil)-L-ácido glicólico) (PAGA), copolímeros multibloque catiónicos reticulados biodegradables, policarbonatos, polianhídridos, polihidroxiácidos, polipropilfumeratos, policaprolactonas, poliamidas, poliacetales, poliéteres, poliésteres, poli(ortoésteres) ), policianoacrilatos, alcoholes polivinílicos, poliuretanos, polifosfacenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, policianoacrilatos, poliureas, poliestirenos, poliaminas , polilisina, poli(etilenimina), poli(éster de serina), poli(L-lactida-co-L-lisina), poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina), polímeros acrílicos, polímeros que contienen amina o combinaciones de los mismos.
Como ejemplo no limitativo, los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la divulgación pueden formularse con el compuesto polimérico de PEG injertado con PLL como se describe en Pat. EE. UU. N° 6.177.274. La formulación se puede usar para transfectar células in vitro o para la administración in vivo de ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos. En otro ejemplo, los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos pueden suspenderse en una solución o medio con un polímero catiónico, en una composición farmacéutica seca o en una solución que se pueda secar como se describe en la Pub EE. UU. N° 20090042829 y 20090042825.
Como otro ejemplo no limitante, los polinucleótidos, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la descripción pueden formularse con un copolímero de bloque PLGA-PEG. (ver Pub EE.UU. N° US20120004293 y Pat EE. UU. N° 8.236.330). Como ejemplo no limitante, los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la descripción pueden formularse con un copolímero dibloque de PEG y PLA o PEG y PLGA (ver Patente EE.UU. N° 8,246,968).
Puede usarse un derivado de poliamina para administrar ácidos nucleicos o para tratar y/o impedir una enfermedad o ser incluido en un dispositivo implantable o inyectable (Pub. EE. UU. No. 20100260817). Como ejemplo no limitante, una composición farmacéutica puede incluir los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos y el derivado de poliamina descrito en la Pub. EE. UU. N°. 20100260817.
Los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la descripción pueden formularse con al menos un polímero acrílico. Los polímeros acrílicos incluyen, de modo no taxativo, ácido acrílico, ácido metacrílico, copolímeros de ácido metacrílico y ácido acrílico, copolímeros de metacrilato de metilo, metacrilatos de etoxietilo, metacrilato de cianoetilo, copolímero de amino alquil metacrilato, ácido (poli)acrílico, ácido (poli)metacrílico, policianoacrilatos y combinaciones de los mismos.
En un caso, los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la presente descripción pueden formularse con al menos un polímero descrito en las Publicaciones Internacionales N°. WO2011115862, WO2012082574 y WO2012068187. En otro caso, los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la presente descripción pueden formularse con un polímero de fórmula Z como se describe en WO2011115862. En otro caso más, los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos pueden formularse con un polímero de fórmula Z, Z' o Z" como se describe en WO2012082574 o WO2012068187. Los polímeros formulados con el ARN modificado de la presente divulgación pueden sintetizarse mediante los procedimientos descritos en WO2012082574 o WO2012068187.
Las formulaciones de polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la descripción pueden incluir al menos un polímero que contiene amina tal como, entre otros, polilisina, polietilenimina, poli(amidoamina) dendrímeros o combinaciones de los mismos.
Por ejemplo, los polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARNmm de la divulgación se puede formular en un compuesto farmacéutico que incluye una poli (alquilen imina), un lipopolímero catiónico biodegradable, un copolímero de bloque biodegradable, un polímero biodegradable o un copolímero aleatorio biodegradable, un copolímero de bloque de poliéster biodegradable, un polímero de poliéster biodegradable, un copolímero aleatorio de poliéster biodegradable, un copolímero biodegradable lineal, PAGA, un copolímero multibloque catiónico reticulado biodegradable o combinaciones de los mismos. El lipopolímero catiónico biodegradable se puede fabricarse mediante procedimientos conocidos en la técnica y/o descritos en la Pat. EE.UU. N° 6.696.038, Solicitud de EE.UU. N° 20030073619 y 20040142474. La poli (alquileno imina) se puede preparar usando procedimientos conocidos en la técnica. y/o como se describe en Pub. de EE. UU. N° 20100004315. El polímero biodegradable, el copolímero de bloques biodegradable, el copolímero aleatorio biodegradable, el copolímero de bloques de poliéster biodegradable, el polímero de poliéster biodegradable o el copolímero aleatorio de poliéster biodegradable se pueden preparar usando procedimientos conocidos en la técnica. y/o como se describe en la Pat. de EE.UU. N° 6.517.869 y 6.267.987. El copolímero biodegradable lineal se puede preparar usando procedimientos conocidos en la técnica. y/o como se describe en la Pat. de EE.UU. N° 6.652.886. El polímero PAGA se puede fabricar usando procedimientos conocidos en la técnica. y/o como se describe en la Pat. de EE.UU. N° 6.217.912. El polímero PAGA puede copolimerizarse para formar un copolímero o copolímero de bloques con polímeros tales como, pero sin limitarse a, poli-L-lisina, poliarginina, poliornitina, histonas, avidina, protaminas, polilactidas y poli (lactida-co-glicólidos). Los copolímeros multibloques catiónicos reticulados biodegradables pueden hacerse mediante procedimientos conocidos en la técnica. y/o como se describe en la Pat. de EE.UU. N° 8.057.821 o Pub. de EE.UU. N° 2012009145. Por ejemplo, los copolímeros multibloques se pueden sintetizar usando bloques de polietilenimina lineal (LPEI) que tienen patrones distintos en comparación con las polietileniminas ramificadas. Además, la composición o composición farmacéutica se pueden preparar por los procedimientos conocidos en la técnica, descritos en esta invención, o como se describe en la Pub. de EE.UU. N° 20100004315 o Pat. de EE.UU. 6.267.987 y 6.217.912.
Los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la descripción pueden formularse con al menos un poliéster degradable que puede contener cadenas laterales policatiónicas. Los poliésteres degradables incluyen, de modo no taxativo, éster de poli(serina), poli(L-láctido-co-L-lisina), éster de poli(4-hidroxi-L-prolina) y combinaciones de los mismos. En otra modalidad, los poliésteres degradables pueden incluir una conjugación de p Eg para formar un polímero PEGilado.
En un caso, los polímeros descritos en esta invención se pueden conjugar con un PEG que termina en lípidos. Como ejemplo no limitante, PLGA puede conjugarse con un PEG que termina en lípidos formando PLGA-DSPE-PEG. Como otro ejemplo no limitante, los conjugados de PEG para su uso con la presente divulgación se describen en la Publicación Internacional N° WO2008103276.
En un caso, los polinucleótidos, el ARN modificado descritos en esta invención pueden conjugarse con otro compuesto. Se describen ejemplos no limitantes de conjugados en Patentes de EE. UU. N° 7.964.578 y 7.833.992. En otro caso, el ARN modificado de la presente descripción puede conjugarse con conjugados de fórmula 1-122 como se describe en Patentes EE. UU. N°. 7.964.578 y 7.833.992.
Como se describe en la Pub. EE. UU. N° 20100004313, una composición de administración de genes puede incluir una secuencia de nucleótidos y un poloxámero. Por ejemplo, el polinucleótido, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la presente invención pueden usarse en una composición de administración de genes con el poloxámero descrito en la Pub. de EE.UU. N° 20100004313.
En un caso, la formulación polimérica de la presente divulgación puede estabilizarse poniendo en contacto la formulación polimérica, que puede incluir un vehículo catiónico, con un lipopolímero catiónico que puede estar unido covalentemente a grupos colesterol y polietilenglicol. La formulación de polímero puede ponerse en contacto con un lipopolímero catiónico usando los procedimientos descritos en la Pub de EE. UU. N° 20090042829. El vehículo catiónico puede incluir, pero no se limita a, polietilenimina, poli(trimetilenimina), poli(tetrametilenimina), polipropilenimina, aminoglucósido-poliamina, didesoxi-diamino-b-cidodextrina, espermina, espermidina, poli(2-dimetilamino)metacrilato de etilo, poli(lisina), poli(histidina), poli (arginina), gelatina cationizada, dendrímeros, quitosano, 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), cloruro de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio ( DOTMA), cloruro de 1-[2-(oleoiloxi)etil]-2-oleil-3-(2-hidroxietil)imidazolinio (DOTIM), 2,3-dioleiloxi-N-[2(spemninacarboxamido)etil]-N,N -trifluoroacetato de dimetil-1-propanaminio (DOSPA), clorhidrato de 3B-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol (DC-HCl de colesterol) diheptadecilamidoglicil espermidina (DOGS), N,N-diestearil-N, Bromuro de N-dimetilamonio (DDAB), bromuro de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DMRIE), cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio DODAC ) y combinaciones de los mismos.
Los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la divulgación también se pueden formular como una nanopartícula utilizando una combinación de polímeros, lípidos y/u otros agentes biodegradables, como, entre otros, fosfato de calcio. Los componentes pueden combinarse en una arquitectura de core-shell, híbrida y/o capa por capa, para permitir el ajuste fino de la nanopartícula para que entregue los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos pueden mejorarse (Wang y col, Nat Mater. 2006 5:791-796; Fuller y col, Biomaterials. 2008 29:1526-1532, DeKoker y col, Adv Drug Deliv Rev.
2011 63:748-761; Endres y col., Biomaterials. 201132:7721-7731; Su y col., Mol Pharm. 2011 Jun 6;8(3):774-87).
Se ha demostrado que las nanopartículas de fosfato de calcio biodegradables en combinación con lípidos y/o polímeros liberan polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos in vivo.En un caso, se puede usar una nanopartícula de fosfato de calcio recubierta de lípido, que también puede contener un ligando dirigido como anisamida, para administrar los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la presente divulgación. Por ejemplo, para administrar eficazmente siRNA en un modelo de pulmón metastásico de ratón, se utilizó una nanopartícula de fosfato cálcico recubierta de lípidos (Li y col., J Contr Rel. 2010 142: 416-421; Li y col., J Contr Rel. 2012 158:108-114; Yang y col., Mol Ther. 2012 20:609-615). Este sistema de entrega combina una nanopartícula dirigida y un componente para mejorar el escape endosomal, fosfato de calcio, con el fin de mejorar la entrega del siRNA.
En un caso, el fosfato de calcio con un copolímero de bloque de polianión-PEG se puede usar para administrar polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos (Kazikawa y col., J Contr Rel. 200497:345-356; Kazikawa y col., J Contr Rel. 2006 111:368-370).
En un caso, se puede usar un polímero de conversión de carga de PEG (Pitella y col., Biomaterials. 2011 32:3106-3114) para formar una nanopartícula para administrar los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ribonucleico ácidos de la presente divulgación. El polímero de conversión de carga de PEG puede mejorar los copolímeros de bloque de polianión de PEG al escindirse en un policatión a pH ácido, mejorando así el escape endosómico.
El uso de nanopartículas de core-shell se ha centrado además en un estrategia de alto rendimiento para sintetizar núcleos de nanogel catiónicos reticulados y varias capas (Siegwart y col., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 108:12996-13001). La complejación, la liberación y la internalización de las nanopartículas poliméricas se pueden controlar con precisión alterando la composición química en los componentes del núcleo y de la cubierta de la nanopartícula. Por ejemplo, las nanopartículas de core-shell pueden entregar eficazmente siRNA a los hepatocitos de ratón después de que unen covalentemente el colesterol a la nanopartícula.
En un caso, se puede usar un núcleo lipídico hueco que comprende una capa media de PLGA y una capa lipídica neutra externa que contiene PEG para administrar el polinucleótido, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la presente descripción. Como ejemplo no limitativo, en ratones con un tumor que expresa luciferasa, se determinó que la nanopartícula híbrida lípido-polímero-lípido suprimió significativamente la expresión de luciferasa, en comparación con un lipoplex convencional (Shi y col. Angew Chem Int Ed 2011 50:7027-7031).
Péptidos y Proteínas
Los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la descripción pueden formularse con péptidos y/o proteínas para aumentar la transfección de células por los ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos. En un caso, los péptidos tales como, pero sin limitación, péptidos y proteínas que penetran en las células y péptidos que permiten la administración intracelular pueden usarse para administrar formulaciones farmacéuticas. Un ejemplo no limitante de un péptido de penetración celular que puede usarse con las formulaciones farmacéuticas de la presente divulgación incluye una secuencia de péptido de penetración celular unida a policationes que facilita la administración al espacio intracelular, por ejemplo, péptido TAT derivado del VIH, penetratinas, transportans, o péptidos penetrantes de células derivados de hCT (ver, por ejemplo, Caron y col., Mol. Ther. 3(3):310-8 (2001); Langel, Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications (CRC Press, Boca Raton FL, 2002); El-Andaloussi y col., Curr. Pharm. Des. 11(28):3597-611 (2003); y Deshayes y col., Cell. Mol. Life Sci. 62(16):1839-49 (2005)). Las composiciones también se pueden formular para incluir un agente de penetración celular, por ejemplo, liposomas, que mejoran la administración de las composiciones al espacio intracelular. Los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la divulgación pueden formar complejos con péptidos y/o proteínas tales como, entre otros, péptidos y/o proteínas de Aileron Therapeutics (Cambridge, MA) y Permeon Biologics (Cambridge, MA) ) para permitir la administración intracelular (Cronican y col., ACS Chem. Biol. 2010 5:747-752; McNaughton y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009 106:6111-6116; Sawyer, Chem Biol Drug Des. 200973:3-6; Verdine y Hilinski, Methods Enzymol. 2012;503:3-33).
En un caso, el polipéptido de penetración celular puede comprender un primer dominio y un segundo dominio. El primer dominio puede comprender un polipéptido sobrecargado. El segundo dominio puede comprender una pareja de unión a proteínas. Tal como se usa en esta invención, "pareja de unión a proteínas" incluye, pero no se limita a, anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos, proteínas de andamio o péptidos. El polipéptido que penetra en las células puede comprender además una pareja de unión intracelular para la pareja de unión a proteínas. El polipéptido que penetra en las células puede ser capaz de ser secretado por una célula donde se pueden introducir los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos.
Las formulaciones de los péptidos o proteínas incluidos pueden usarse para aumentar la transfección celular por los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos, alterar la biodistribución de los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos (por ejemplo, por dirigidos a tejidos o tipos celulares específicos) y/o aumentar la traducción de la proteína codificada.
Células
Los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la divulgación pueden transfectarse ex vivo en células, que posteriormente se trasplantan a un sujeto. Como ejemplos no limitantes, las composiciones farmacéuticas pueden incluir glóbulos rojos para administrar ARN modificado al hígado y células mieloides, virosomas para administrar ARN modificado en partículas similares a virus (VLP) y células electroporadas tales como, entre otras, de MAXCYTE® (Gaithersburg, MD) y de ERYTECH® (Lyon, France) para entregar ARN modificado. Se han documentado ejemplos del uso de glóbulos rojos, partículas virales y células electroporadas para entregar cargas útiles que no sean polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos (Godfrin y col., Expert Opin Biol Ther. 201212:127-133; Fang y col., Expert Opin Biol Ther. 2012 12:385-389; Hu y col., Proc Natl Acad Sci USA. 2011 108:10980-10985; Lund y col., Pharm Res. 201027:400-420; Huckriede y col., J Liposome Res. 2007;17:39-47; Cusi, Hum Vaccin. 20062:1-7; de Jonge y col., Gene Ther. 2006 13:400-411). El ARN modificado puede administrarse en VLP sintéticas sintetizadas mediante los procedimientos descritos en la Publicación Internacional N° WO2011085231 y Pub EE. UU. N°. 20110171248.
Las formulaciones basadas en células de los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado potenciado o ácidos ribonucleicos de la descripción pueden usarse para garantizar la transfección celular (p. ej., en el vehículo celular), alterar la biodistribución de los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos (p. ej., dirigiendo el vehículo celular a tejidos o tipos celulares específicos), y/o aumentar la traducción de la proteína codificada.
Introducción en las células
Se conocen en la técnica una variedad de procedimientos que son adecuados para la introducción de ácido nucleico en una célula, incluidas técnicas mediadas por virus y sin virus. Ejemplos de técnicas típicas no mediadas por virus incluyen, entre otras, electroporación, transferencia mediada por fosfato de calcio, nucleofección, sonoporación, choque térmico, magnetofección, transferencia mediada por liposomas, microinyección, transferencia mediada por microproyectiles (nanopartículas), transferencia mediada por polímeros catiónicos ( DEAE-dextrano, polietilenimina, polietilenglicol (PEG) y similares) o fusión celular.
La técnica de sonoporación, o sonicación celular, es el uso de sonido (por ejemplo, frecuencias ultrasónicas) para modificar la permeabilidad de la membrana plasmática celular. Los procedimientos de sonoporación son conocidos en la técnica y también se enseñan, por ejemplo, en lo que se refiere a bacterias en la Publicación de patente de EE. UU. 20100196983 y en lo que se refiere a otros tipos celulares en, por ejemplo, la Publicación de Patente de EE. UU.
20100009424.
Las técnicas de electroporación también son bien conocidas en la técnica. En un caso, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos pueden administrarse mediante electroporación como se describe en el Ejemplo 11.
Hialuronidasa
La inyección localizada intramuscular o subcutánea de polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la descripción puede incluir hialuronidasa, que cataliza la hidrólisis de hialuronano. Al catalizar la hidrólisis del hialuronano, un componente de la barrera intersticial, la hialuronidasa reduce la viscosidad del hialuronano, lo que aumenta la permeabilidad del tejido (Frost, Expert Opin. Drug Deliv. (2007) 4:427-440). Es útil para agilizar su dispersión y distribución sistémica de proteínas codificadas producidas por células transfectadas. Alternativamente, la hialuronidasa se puede usar para aumentar el número de células expuestas a ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la descripción administrados por vía intramuscular o subcutánea.
Imitadores de Nanopartículas
Los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la descripción pueden encapsularse y/o absorberse en un imitador de nanopartículas. Un imitador de nanopartículas puede imitar la función de administración de organismos o partículas tales como, entre otros, patógenos, virus, bacterias, hongos, parásitos, priones y células. Como ejemplo no limitante, los polinucleótidos, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la descripción pueden encapsularse en una partícula que no sea de hierro que puede imitar la función de liberación de un virus (véase la Publicación Internacional N°. WO2012006376).
Nanotubos
Los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la descripción pueden unirse o unirse de otro modo a al menos un nanotubo como, entre otros, nanotubos de roseta, nanotubos de roseta que tienen bases gemelas con un conector, nanotubos de carbono y /o nanotubos de carbono de pared simple. Los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos pueden unirse a los nanotubos a través de fuerzas tales como, entre otras, fuerzas estéricas, iónicas, covalentes y/u otras.
En un caso, el nanotubo puede liberar uno o más polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos en las células. El tamaño y/o la estructura de la superficie de al menos un nanotubo puede alterarse para controlar la interacción de los nanotubos dentro del cuerpo y/o unirse o unirse a los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos descritos en esta invención. En un caso, el bloque de construcción y/o los grupos funcionales unidos al bloque de construcción del al menos un nanotubo pueden modificarse para ajustar las dimensiones y/o propiedades del nanotubo. Como ejemplo no limitante, la longitud de los nanotubos puede alterarse para impedir que los nanotubos pasen a través de los orificios en las paredes de los vasos sanguíneos normales pero todavía lo suficientemente pequeños para atravesar los orificios más grandes en los vasos sanguíneos del tejido tumoral.
En un caso, al menos un nanotubo también se puede recubrir con compuestos que mejoran la administración, incluidos polímeros, como, entre otros, polietilenglicol. En otro caso, al menos un nanotubo y/o el ARNm modificado pueden mezclarse con excipientes y/o vehículos de administración farmacéuticamente aceptables.
En un caso, los polinucleótidos o el ARNm modificado se unen y/o se unen de otro modo a al menos un nanotubo de roseta. Los nanotubos de roseta pueden formarse mediante un procedimiento conocido en la técnica y/o por el procedimiento descrito en la Publicación Internacional N° WO2012094304. Al menos un ARNm modificado puede unirse y/o unirse de otro modo a al menos un nanotubo de roseta mediante un procedimiento como se describe en la Publicación Internacional N° WO2012094304, donde los nanotubos de roseta o los módulos que forman nanotubos de roseta se mezclan en medios acuosos con al menos un ARNm modificado. en condiciones que pueden hacer que al menos un ARNm modificado se una o se una de otro modo a los nanotubos de roseta.
Conjugados
Los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la divulgación incluyen conjugados, como ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos unidos covalentemente a un vehículo o grupo diana, o que incluyen dos regiones codificantes que juntas producen un proteína de fusión (p. ej., que lleva un grupo objetivo y una proteína o péptido terapéutico).
Los conjugados de la divulgación incluyen una sustancia de origen natural, como una proteína (por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA), lipoproteína de baja densidad (LDL), lipoproteína de alta densidad (HDL) o globulina); un carbohidrato (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico); o un lípido. El ligando también puede ser una molécula recombinante o sintética, como un polímero sintético, por ejemplo, un poliaminoácido sintético, un oligonucleótido (por ejemplo, un aptámero). Ejemplos de poliaminoácidos incluyen poliaminoácido es una polilisina (PLL), poli L-ácido aspártico, poli L-ácido glutámico, copolímero de estireno-anhídrido de ácido maleico, copolímero de poli (L-lactida-co-glicolizado), copolímero de divinil éter-anhídrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil) metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (PEG), alcohol polivinílico (PVA), poliuretano, poli (ácido 2-etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida o polifosfazina. Los ejemplos de poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopéptido-poliamina, poliamina peptidomimética, poliamina dendrímera, arginina, amidina, protamina, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina o un péptido alfa-helicoidal
Patentes de EE. UU. representativas que enseñan la preparación de conjugados de polinucleótidos, particularmente de ARN, incluyen, pero no se limitan a, Pat. EE. UU. N°. 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717. 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241. 5.391.723; 5.416.203. 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 and 5.688.941; 6.294.664; 6.320.017; 6.576.752; 6.783.931; 6.900.297; 7.037.646.
En un caso, el conjugado de la presente divulgación puede funcionar como un vehículo para el polinucleótido, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la presente divulgación. El conjugado puede comprender un polímero catiónico tal como, pero sin limitarse a, poliamina, polilisina, polialquilenimina y polietilenimina que pueden injertarse con poli (etilenglicol). Como ejemplo no limitante, el conjugado puede ser similar al conjugado polimérico y el procedimiento de síntesis del conjugado polimérico descrito en la Patente de EE.UU. N° 6.586.524.
Los conjugados también pueden incluir grupos diana, por ejemplo, un agente dirigido a célula o tejido, por ejemplo, una lectina, glicoproteína, lípido o proteína, por ejemplo, un anticuerpo, que se une a un tipo celular específico tal como una célula de riñón. Un grupo diana puede ser una tirotropina, melanotropina, lectina, glicoproteína, proteína surfactante A, carbohidrato de mucina, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetilgulucosamina manosa multivalente, fucosa multivalente, poliaminoácidos glicosilados, galactosa multivalente, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, un lípido, colesterol, un esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, biotina, un péptido RGD, un mimético de péptido RGD o un aptámero.
Los grupos diana pueden ser proteínas, p. ej., glucoproteínas o péptidos, p. ej., moléculas que tienen una afinidad específica por un coligando, o anticuerpos, p. ej., un anticuerpo, que se une a un tipo celular específico, como una célula cancerosa, una célula endotelial, o célula ósea. Los grupos diana también pueden incluir hormonas y receptores hormonales. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como lípidos, lectinas, carbohidratos, vitaminas, cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, manosa multivalente N-acetilgulucosamina, fucosa multivalente o aptámeros. El ligando puede ser, por ejemplo, un lipopolisacárido o un activador de p38 MAP quinasa.
El grupo diana puede ser cualquier ligando que sea capaz de dirigirse a un receptor específico. Ejemplos incluyen, sin limitación, folato, GalNAc, galactosa, manosa, manosa-6P, apatameros, ligandos de receptores de integrina, ligandos de receptores de quimiocinas, transferrina, biotina, ligandos de receptores de serotonina, PSMA, endotelina, GCPII, somatostatina, LDL y ligandos de HDL. En un caso particular, el grupo diana es un aptámero. El aptámero puede no estar modificado o tener cualquier combinación de modificaciones descritas en esta invención.
En un caso, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden incluir modificaciones químicas tales como, pero sin limitación, modificaciones similares a los ácidos nucleicos bloqueados.
Patentes de EE. UU. representativas que enseñan la preparación de ácido nucleico bloqueado (LNA), como las de Santaris, incluyen, entre otras, las siguientes: Pat. EE. Uu . N° 6.268.490; 6.670.461; 6.794.499; 6.998.484; 7.053.207; 7.084.125; y 7.399.845.
Patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de compuestos de ANP comprenden, aunque no se limitan a, Pat. EE. UU. N°. 5,539,082; 5,714,331; y 5,719,262. Enseñanzas adicionales de compuestos de PNA pueden encontrarse en Nielsen y col., Science, 1991, 254, 1497-1500.
Algunos casos presentados en la divulgación incluyen ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos con estructuras de fosforotioato y oligonucleósidos con otras estructuras modificadas, y en particular --CH2--NH--CH2--, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[conocido como metileno (metilimino) o esqueleto MMI], --CH2-O--N(CHa)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- and --N(CHa)--CH2--CH2--[donde el esqueleto de fosfodiéster nativo se representa como --O-P(O)2--O--CH2--] de la antes mencionada Pat. EE. UU. N°. 5,489,677, y los esqueletos de amida de la antes mencionada Pat. EE. Uu . N°. 5,602,240. En algunos casos, los polinucleótidos presentados en la esta invención tienen estructuras de cadena principal de morfolino de la antes mencionada Patente EE. UU. N° 5.034.506.
Las modificaciones en la posición de 2' también pueden ayudar en la administración. Preferiblemente, las modificaciones en la posición 2' no están ubicadas en una secuencia codificante de polipéptido, es decir, no en una región traducible. Modificaciones en la posición 2' se pueden ubicar en una UTR 5', una UTR 3' y/o una región de descolado. Las modificaciones en la posición 2' pueden incluir una de las siguientes en la posición 2': H (es decir, 2'-desoxi); F; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; o O-alquil-O-alquilo, donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C1 a C10 sustituido o no sustituido o alquenilo y alquinilo C2 a C10. Modificaciones ejemplares adecuadas incluyen O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, and O(cH2)nON[(CH2)nCH3)]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. En otros casos, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos incluyen uno de los siguientes en la posición 2': alquilo inferior C1 a C10, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, c N, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo informador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En algunos casos, la modificación incluye un 2'-metoxietoxi (2'-O--CH2CH2OCH3, también conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'-MOE) (Martin y col., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) es decir, un grupo alcoxi-alcoxi. Otra modificación ejemplar es 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, también conocido como 2'-DMAOE, como se describe en los ejemplos a continuación, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O--CH2--O--CH2-N(CH2)2, también descrito en los ejemplos en esta invención a continuación. Otras modificaciones incluyen 2'-metoxi (2 -OCH3), 2'-aminopropoxi (2 -OCH2CH2CH2NH2) y 2'-fluoro (2'-F). También se pueden realizar modificaciones similares en otras posiciones, en particular la posición 3' del azúcar en el nucleótido terminal 3' o en dsARN enlazados 2'-5' y la posición 5' del nucleótido terminal 5'. Los polinucleótidos de la divulgación también pueden tener miméticos de azúcar tales como fracciones de ciclobutilo en lugar del azúcar de pentofuranosilo. Patentes EE. UU. representativas que enseñan la preparación de dichas estructuras de azúcar modificadas incluyen, entre otras, Pat. EE. UU. N°. 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; y 5.700.920.
En otros casos más, los polinucleótidos, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos se conjugan covalentemente con un polipéptido de penetración celular.
El péptido que penetra en las células también puede incluir una secuencia señal. Los conjugados de la invención pueden diseñarse para que tengan una mayor estabilidad; aumento de la transfección celular; y/o la biodistribución alterada (p. ej., dirigida a tejidos o tipos celulares específicos).
Nanopartículas de ácido nucleico autoensambladas
Las nanopartículas autoensambladas tienen un tamaño bien definido que puede controlarse con precisión, ya que las cadenas de ácido nucleico pueden reprogramarse fácilmente. Por ejemplo, el tamaño de partícula óptimo para un vehículo de nanoentrega dirigida al cáncer es de 20-100 nm ya que un diámetro mayor de 20 nm evita la eliminación por los riñones y mejora el suministro a ciertos tumores a través de una mayor permeabilidad y efecto de retención. Usando nanopartículas de ácido nucleico autoensambladas, una sola población uniforme en tamaño y forma tiene una orientación espacial y una densidad controladas con precisión de ligandos dirigidos al cáncer para una entrega mejorada. Como ejemplo no limitativo, las nanopartículas de oligonucleótidos se preparan utilizando el autoensamblaje programable de fragmentos cortos de ADN y siRNA terapéuticos. Estas nanopartículas son molecularmente idénticas con tamaño de partícula controlable y ubicación y densidad del ligando diana. Los fragmentos de ADN y los siRNA se autoensamblaron en una reacción de una sola etapa para generar nanopartículas tetraédricas de DNA/siRNA para administración in vivo dirigida (Lee y col., Nature Nanotechnology 20127:389-393).
Excipientes
Las formulaciones farmacéuticas pueden comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable, que, tal como se utiliza en esta invención, incluye todos los solventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes activos de superficie, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares, según corresponda a la forma de dosificación particular deseada. En la técnica, se conocen varios excipientes para la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas para preparar la composición (véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006). Se puede contemplar el uso de un medio excipiente convencional, excepto en la medida en que cualquier medio excipiente convencional pueda ser incompatible con una sustancia o sus derivados, por ejemplo, produciendo algún efecto biológico indeseable o interactuando de otra manera de manera nociva con cualquier otro componente de la composición farmacéutica.
En algunos casos, un excipiente farmacéuticamente aceptable es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % puro. En algunos casos, un excipiente se aprueba para su uso para humanos o para uso veterinario. En algunos casos, un excipiente puede ser aprobado por la administración de alimentos y fármacos de los EE. UU. En algunos casos, un excipiente puede ser de calidad farmacéutica. En algunos casos, un excipiente cumple con los estándares de la Farmacopea de los EE. UU. (USP), la Farmacopea europea (EP), la Farmacopea británica y/o la Farmacopea internacional.
Excipientes farmacéuticamente aceptables usados en la fabricación de composiciones farmacéuticas incluyen, entre otros, diluyentes inertes, agentes dispersantes y/o granulantes, agentes tensioactivos y/o emulsionantes, agentes desintegrantes, agentes aglutinantes, conservantes, agentes tamponadores, agentes lubricantes, y/o aceites. Tales excipientes pueden incluirse opcionalmente en composiciones farmacéuticas. La composición también puede incluir excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios, agentes colorantes, agentes de recubrimiento, edulcorantes, aromatizantes y/o agentes perfumantes.
Diluyentes ejemplares incluyen, de modo no taxativo, carbonato de calcio, carbonato de sodio, fosfato de calcio, fosfato de dicalcio, sulfato de calcio, hidrogenofosfato de calcio, lactosa fosfato de sodio, sacarosa, celulosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, sorbitol, inositol, cloruro de sodio, almidón seco, almidón de maíz, azúcar en polvo, etc., y/o combinaciones de los mismos.
Ejemplos de agentes de granulación y/o dispersión incluyen, pero no se limitan a, almidón de patata, almidón de maíz, almidón de tapioca, glicolato de almidón de sodio, arcillas, ácido algínico, goma guar, pulpa de cítricos, agar, bentonita, productos de celulosa y madera, esponja natural , resinas de intercambio catiónico, carbonato de calcio, silicatos, carbonato de sodio, polivinilpirrolidona reticulada (crospovidona), carboximetilalmidón de sodio (almidón glicolato de sodio), carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio reticulada (croscarmelosa), metilcelulosa , almidón pregelatinizado (almidón 1500), almidón microcristalino, almidón insoluble en agua, carboximetilcelulosa de calcio, silicato de magnesio y aluminio (Veegum), laurilsulfato de sodio, compuestos de amonio cuaternario, etc., y/o combinaciones de los mismos.
Ejemplos de agentes activos de superficie y/o emulsionantes incluyen, de modo no taxativo, emulsionantes naturales (por ejemplo, acacia, agar, ácido algínico, alginato de sodio, tragacanto, chondrux, colesterol, xantana, pectina, gelatina, yema de huevo, caseína, lanolina, colesterol, cera y lecitina), arcillas coloidales (por ejemplo, bentonita [silicato de aluminio] y VEEGUM® [aluminosilicato de magnesio]), derivados de aminoácidos de cadena larga, alcoholes de peso molecular alto (por ejemplo, alcohol estearílico, alcohol cetílico, alcohol oleílico, monoestearato de triacetina, diestearato de etilenglicol, monoestearato de glicerilo y monoestearato de propilenglicol, alcohol polivinílico), carbómeros (por ejemplo, carboxi polimetileno, ácido poliacrílico, polímero de ácido acrílico y polímero de carboxivinilo), carragenano, derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, celulosa en polvo, hidroximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa), ésteres de ácidos grasos de sorbitán (por ejemplo, monolaurato de sorbitán polioxietileno [TWEEN®20], polioxietileno de sorbitán [TWEEN®60], monooleato de sorbitán polioxietileno [TWEEN®80], monopalmitato de sorbitán [SPAN®40], monoestearato de sorbitá [Span®60], tri estearato de sorbitá [Span®65], monooleato de glicerilo, monooleato de sorbitán [SPAN®80]), ésteres de polioxietileno (por ejemplo, monoestearato de polioxietileno [MYRJ®45], aceite de ricino hidrogenado de polioxietileno, aceite de ricino polietoxilado, estearato de polioximetileno y SOLUTOL®), ésteres de ácido graso de sacarosa, ésteres de ácido graso de polietilenglicol (por ejemplo, CREMOPHOR®), éteres de polioxietileno (por ejemplo, lauril éter de polioxietileno [BRIJ®30]), poli(vinilpirrolidona), monolaurato de dietilenglicol, oleato de trietanolamina, oleato de sodio, oleato de potasio, oleato de etilo, ácido oleico, laurato de etilo, lauril sulfato de sodio, PLUORINC®F 68, POLOXAMEr®188, bromuro de cetrimonio, cloruro de cetilpiridinio, cloruro de benzalconio, docusato sódico, etc. y/o combinaciones de los mismos.
Agentes aglutinantes ejemplares incluyen, de modo no taxativo, almidón (por ejemplo, almidón de maíz y pasta de almidón), gelatina; azúcares (por ejemplo, sacarosa, glucosa, dextrosa, dextrina, melaza, lactosa, lactitol, manitol,), gomas naturales y sintéticas (por ejemplo, acacia, alginato de sodio, extracto de musgo irlandés, goma panwar, goma ghatti, mucílago de cáscara de isapol, carboximetilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina, acetato de celulosa, poli(vinilpirrolidona), aluminosilicato de magnesio (Veegum®), y arabogalactano de lárice); alginatos; óxido de polietileno; polietilenglicol; sales inorgánicas de calcio; ácidos silícicos; polimetacrilatos; ceras; agua; alcohol; etc.; y combinaciones de los mismos.
Conservantes ejemplares pueden incluir, entre otros, antioxidantes, agentes quelantes, conservantes antimicrobianos, conservantes antifúngicos, conservantes de alcohol, conservantes ácidos y/u otros conservantes. Antioxidantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, alfa tocoferol, ácido ascórbico, palmitato de acorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, monotioglicerol, metabisulfito de potasio, ácido propiónico, galato de propilo, ascorbato de sodio, bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio y/o sulfito de sodio. . Agentes quelantes ejemplares incluyen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico monohidrato, edetato disódico, edetato dipotásico, ácido edético, ácido fumárico, ácido málico, ácido fosfórico, edetato sódico, ácido tartárico y/o edetato trisódico. Conservantes antimicrobianos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, bronopol, cetrimida, cloruro de cetilpiridinio, clorhexidina, clorobutanol, clorocresol, cloroxilenol, cresol, alcohol etílico, glicerina, fenetidina, fenetidina, imidureaxidinio, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, propilenglicol y/o timerosal. Conservantes antifúngicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, butil paraben, metil paraben, etil paraben, propil paraben, ácido benzoico, ácido hidroxibenzoico, benzoato de potasio, sorbato de potasio, benzoato de sodio, propionato de sodio y/o ácido sórbico. Conservantes de alcohol ejemplares incluyen, pero no se limitan a, etanol, polietilenglicol, fenol, compuestos fenólicos, bisfenol, clorobutanol, hidroxibenzoato y/o alcohol feniletílico. Conservantes ácidos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, vitamina A, vitamina C, vitamina E, betacaroteno, ácido cítrico, ácido acético, ácido deshidroacético, ácido ascórbico, ácido sórbico y/o ácido fítico. Otros conservantes incluyen, entre otros, tocoferol, acetato de tocoferol, mesilato de deteroxima, cetrimida, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitoluenado butilado (BHT), etilendiamina, lauril sulfato de sodio (SLS), lauril éter sulfato de sodio (SLES), bisulfito, metabisulfito de sodio, sulfito de potasio, metabisulfito de potasio, GLYDANT PLUS®, PHENONIP®, metilparabeno, GERMALL®115, GERMABEN®II, NEOLONE™, KATHON™, y/o EUXYL®.
Agentes tamponadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, soluciones tampón de citrato, soluciones tampón de acetato, soluciones tampón de fosfato, cloruro de amonio, carbonato de calcio, cloruro de calcio, citrato de calcio, glubionato de calcio, gluceptato de calcio, gluconato de calcio, ácido D-glucónico, calcio. glicerofosfato, lactato cálcico, ácido propanoico, levulinato cálcico, ácido pentanoico, fosfato cálcico dibásico, ácido fosfórico, fosfato cálcico tribásico, hidróxido fosfato cálcico, acetato potásico, cloruro de potasio, gluconato de potasio, mezclas de potasio, fosfato de potasio dibásico, fosfato de potasio monobásico, mezclas de fosfato de potasio, acetato de sodio, bicarbonato de sodio, cloruro de sodio, citrato de sodio, lactato de sodio, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio monobásico, mezclas de fosfato de sodio, trometamina, hidróxido de magnesio, hidróxido de aluminio, ácido algínico, agua sin pirógenos, solución salina isotónica, solución de Ringer, alcohol etílico, etc., y/o combinaciones de los mismos.
Agentes lubricantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, estearato de magnesio, estearato de calcio, ácido esteárico, sílice, talco, malta, betanato de glicerilo, aceites vegetales hidrogenados, polietilenglicol, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, leucina, lauril sulfato de magnesio, lauril sulfato de sodio, etc., y combinaciones de los mismos.
Aceites ejemplares incluyen, pero no se limitan a, almendra, semilla de albaricoque, aguacate, babasú, bergamota, semilla de corriente negra, borraja, cade, manzanilla, canola, alcaravea, carnauba, ricino, canela, manteca de cacao, coco, hígado de bacalao, café., maíz, semilla de algodón, emú, eucalipto, onagra, pescado, linaza, geraniol, calabaza, semilla de uva, avellana, hisopo, miristato de isopropilo, jojoba, nuez kukui, lavandina, lavanda, limón, litsea cubeba, nuez de macademia, malva, semilla de mango, semilla de espuma de prado, visón, nuez moscada, aceituna, naranja, reloj anaranjado, palma, almendra de palma, almendra de melocotón, maní, semilla de amapola, semilla de calabaza, colza, salvado de arroz, romero, cártamo, sándalo, sasquana, sabroso, espino amarillo, sésamo, manteca de karité, silicona, soja, girasol, árbol de té, cardo, tsubaki, vetiver, nuez y aceites de germen de trigo. Aceites ejemplares incluyen, pero no se limitan a, estearato de butilo, triglicérido caprílico, triglicérido cáprico, ciclometicona, sebacato de dietilo, dimeticona 360, miristato de isopropilo, aceite mineral, octildodecanol, alcohol oleílico, aceite de silicona y/o combinaciones de los mismos.
Excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios, agentes colorantes, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, aromatizantes y/o perfumantes pueden estar presentes en la composición, según el criterio del formulador.
Administración
La presente divulgación abarca la administración de polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos para cualquier tratamiento, farmacéutico, diagnóstico o imagen por cualquier ruta apropiada teniendo en cuenta los posibles avances en las ciencias de la administración de fármacos. Administración puede ser desnuda o formulada.
Administración desnuda
Los polinucleótidos, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la presente divulgación pueden administrarse a una célula desnuda. Como se usa en esta invención, "desnudo" se refiere a la administración de polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos libres de agentes que promuevan la transfección. Por ejemplo, los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos administrados a la célula pueden no contener modificaciones. Los polinucleótidos desnudos, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado potenciado o los ácidos ribonucleicos pueden administrarse a la célula utilizando vías de administración conocidas en la técnica y descritas en esta invención.
Administración formulada
Los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la presente descripción pueden formularse utilizando los procedimientos descritos en esta invención. Las formulaciones pueden contener polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos que pueden estar modificados y/o sin modificar Las formulaciones pueden incluir además, pero no se limitan a, agentes de penetración celular, un vehículo farmacéuticamente aceptable, un agente de administración, un polímero bioerosionable o biocompatible, un disolvente y un depósito de liberación sostenida. Los polinucleótidos formulados, los ácidos nucleicos modificados o los ácidos nucleicos modificados mejorados pueden administrarse a la célula utilizando vías de administración conocidas en la técnica y descritas en esta invención.
Las composiciones también se pueden formular para la administración directa a un órgano o tejido de varias formas en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, remojo o baño directo, a través de un catéter, mediante geles, polvos, ungüentos, cremas, geles, lociones y/o gotas, utilizando sustratos tales como tejidos o materiales biodegradables revestidos o impregnados con las composiciones y similares.
En ciertos casos, las formulaciones incluyen uno o más agentes de penetración celular, por ejemplo, agentes de transfección. En un caso específico, se mezcla un ácido ribonucleico con un agente de transfección (o una mezcla de los mismos) y la mezcla resultante se emplea para transfectar células. Agentes de transfección preferidos son composiciones lipídicas catiónicas, particularmente composiciones lipídicas catiónicas monovalentes y polivalentes, más particularmente "LIPOFECTIN", "LIPOFECTACE", "LIPOFECTAMINE", "CELLFECTIN", DMRIE-C, DMRIE, DOTAP, DOSPA y DOSPER, y composiciones dendrímeras. , particularmente dendrímeros G5-G10, incluidos dendrímeros de estrella densa, dendrímeros PAMAM, dendrímeros injertados y dendrímeros conocidos como dendrímeros y "SUPERFECT". En un segundo procedimiento de transfección específico, un ácido ribonucleico se conjuga con un grupo de unión a ácido nucleico, por ejemplo, una poliamina y más particularmente una espermina, que a continuación se introduce en la célula o se mezcla con un agente de transfección (o una mezcla de los mismos) y el la mezcla resultante se emplea para transfectar células. En un tercer caso específico, una mezcla de uno o más péptidos, proteínas o fragmentos de proteínas que mejoran la transfección, incluidos péptidos o proteínas fusagénicos, péptidos o proteínas de transporte o tráfico, péptidos o proteínas de ligando receptor, o péptidos o proteínas de localización nuclear. y/o sus análogos modificados (p. ej., péptidos o proteínas modificados con espermina) o combinaciones de los mismos se mezclan y se complejan con un ácido ribonucleico para introducirlo en una célula, mezclándose opcionalmente con un agente de transfección y la mezcla resultante se emplea para transfectar células. Además, un componente de un agente de transfección (p. ej., lípidos, lípidos catiónicos o dendrímeros) se conjuga covalentemente con péptidos, proteínas o fragmentos de proteínas seleccionados directamente oa través de un grupo de enlace o espaciador. De particular interés en este caso son los péptidos o proteínas que son fusagénicos, permeabilizadores de membrana, transporte o tráfico, o que funcionan para dirigirse a células. El complejo de péptido o proteína-agente de transfección se combina con un ácido ribonucleico y se emplea para la transfección.
En determinados casos, las formulaciones incluyen un vehículo farmacéuticamente aceptable que hace que la cantidad efectiva de polinucleótido, ácido nucleico modificado o ácido ribonucleico se retenga sustancialmente en un tejido diana que contiene la célula.
Administración
Los polinucleótidos, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la presente divulgación pueden administrarse por cualquier vía que produzca un resultado terapéuticamente efectivo. Estos incluyen, entre otros, administración enteral, gastroenteral, epidural, oral, transdérmica, epidural (peridural), intracerebral (en el cerebro), intracerebroventricular (en los ventrículos cerebrales), epicutánea (aplicación en la piel), intradérmica, (en la piel misma), subcutánea (debajo de la piel), administración nasal (a través de la nariz), intravenosa (en una vena), intraarterial (en una arteria), intramuscular (en un músculo), intracardíaca (en el corazón), perfusión intraósea (en la médula ósea), intratecal (en el canal espinal), intraperitoneal, (infusión o inyección en el peritoneo), infusión intravesical, intravítrea (a través del ojo), inyección intracavernosa (en la base del pene), administración intravaginal, intrauterina, administración extraamniótica, transdérmica (difusión a través de la piel intacta para distribución sistémica), transmucosa (difusión a través de una membrana mucosa), insuflación (inhalación), sublingual, sublabial, enema, colirio (sobre la conjuntiva), o en gotas para los oídos.
En un caso, se proporcionan composiciones para la generación de un depósito in vivo que contiene un polinucleótido, un ácido nucleico modificado o un ribonucleótido diseñado. Por ejemplo, la composición contiene un polímero bioerosionable y biocompatible, un disolvente presente en una cantidad efectiva para plastificar el polímero y formar un gel con él, y un polinucleótido, un ácido nucleico modificado o un ácido ribonucleico manipulado. En ciertos casos, la composición también incluye un agente de penetración celular como se describe en esta invención. En otros casos, la composición también contiene una cantidad tixotrópica de un agente tixotrópico que se puede mezclar con el polímero para que sea efectiva para formar una composición tixotrópica. Otras composiciones incluyen un agente estabilizador, un agente de carga, un agente quelante o un agente tamponador.
En otros casos, se proporcionan depósitos de liberación sostenida, como para la administración de un polinucleótido, ácido nucleico modificado o ácido ribonucleico diseñado en un entorno (es decir, un órgano o tejido) en un paciente. Dichos depósitos generalmente contienen un ácido ribonucleico diseñado y un polímero de cadena flexible donde tanto el ácido ribonucleico diseñado como el polímero de cadena flexible están atrapados dentro de una matriz porosa de una proteína de matriz reticulada. Por lo general, el tamaño de los poros es inferior a 1 mm, como 900 nm, 800 nm, 700 nm, 600 nm, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 200 nm, 100 nm o menos de 100 nm. Normalmente, el polímero de cadena flexible es hidrófilo. Normalmente, el polímero de cadena flexible tiene un peso molecular de al menos 50 kDa, como 75 kDa, 100 kDa, 150 kDa, 200 kDa, 250 kDa, 300 kDa, 400 kDa, 500 kDa o superior a 500 kDa. Por lo general, el polímero de cadena flexible tiene una duración de persistencia de menos de 10 %, como 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2,1 o menos de 1 % de la duración de la persistencia de la proteína de matriz. Normalmente, el polímero de cadena flexible tiene una carga similar a la de la matriz proteica. En algunos casos, el polímero de cadena flexible altera el tamaño de poro efectivo de una matriz de proteína de matriz reticulada a un tamaño capaz de sostener la difusión del ácido ribonucleico diseñado desde la matriz hacia un tejido circundante que comprende una célula donde el polinucleótido, el ácido nucleico modificado ácido, el ácido ribonucleico diseñado es capaz de entrar.
En casos específicos, las composiciones se pueden administrar de una manera que les permita atravesar la barrera hematoencefálica, la barrera vascular u otra barrera epitelial. Rutas de administración no limitantes para los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la presente descripción se describen a continuación.
La presente divulgación proporciona procedimientos que comprenden la administración de polinucleótidos, ARNm modificados y sus proteínas o complejos codificados de acuerdo con la divulgación a un sujeto que lo necesite. Los ácidos nucleicos, las proteínas o los complejos, o sus composiciones farmacéuticas, de imaginología, de diagnóstico o profilácticas, pueden administrarse a un sujeto utilizando cualquier cantidad y cualquier vía de administración efectiva para impedir, tratar, diagnosticar o imaginizar una enfermedad, trastorno y/o o condición (por ejemplo, una enfermedad, trastorno y/o condición relacionada con déficits de memoria de trabajo). La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, la edad y el estado general del sujeto, la gravedad de la enfermedad, la composición particular, su modo de administración, su modo de actividad y similares. Las composiciones de acuerdo con la descripción se formulan típicamente en forma de conjuntos de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. Se entenderá, sin embargo, que el uso diario total de las composiciones de la presente descripción lo decidirá el médico tratante dentro del alcance del buen juicio médico. El nivel de dosis de formación de imágenes específico terapéuticamente efectivo, profilácticamente efectivo o apropiado para cualquier paciente en particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el tiempo de administración, vía de administración y velocidad de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; fármacos utilizados en combinación o coincidentes con el compuesto específico empleado; y como factores bien conocidos en las artes médicas.
Administración parenteral e inyectable
Formas de dosificación líquidas para la administración oral y parenteral incluyen, entre otras, emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y/o elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los ingredientes activos, las formas de dosificación líquidas pueden comprender diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica como, por ejemplo, agua u otros solventes, agentes solubilizantes y emulsionantes como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceite de semilla de algodón, maní, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán , y mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, aromatizantes y/o perfumantes. En determinados casos para administración parenteral, las composiciones se mezclan con agentes solubilizantes tales como CREMOPHOR®, alcoholes, aceites, aceites modificados, glicoles, polisorbatos, ciclodextrinas, polímeros y/o combinaciones de los mismos.
Es posible formular preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones estériles inyectables acuosas o suspensiones oleaginosas, según la técnica conocida, usando agentes de dispersión, agentes humectantes y/o agentes de suspensión adecuados. Las preparaciones inyectables estériles pueden ser soluciones, suspensiones y/o emulsiones inyectables estériles en diluyentes y/o disolventes no tóxicos parenteralmente aceptables, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los solventes y vehículos aceptables que pueden ser empleados se encuentran agua, solución de Ringer, U.S.P. y solución isotónica de cloruro de sodio. Se emplean convencionalmente aceites no volátiles estériles como un solvente o medio de suspensión. A tales efectos, se puede emplear cualquier aceite no volátil insípido, inclusive mono o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos como el ácido oleico se pueden utilizar en la preparación de inyectables.
Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias y/o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.
Para prolongar el efecto de un ingrediente activo, a menudo es deseable retardar la absorción del ingrediente activo de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con una escasa solubilidad en agua. Entonces, la velocidad de absorción del fármaco depende de su velocidad de disolución, la que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. De manera alternativa, la absorción retardada de una forma de fármaco administrado parenteralmente se logra al disolver o suspender el fármaco en un vehículo oleoso. Las formas de depósito inyectables se preparan formando matrices de microcápsulas de los fármacos en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicólido. En función de la relación del fármaco respecto al polímero y de la naturaleza del polímero particular utilizado se puede controlar la velocidad de liberación del fármaco. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones de depósito inyectables también se preparan atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales
Administración rectal y vaginal
Las composiciones para administración rectal o vaginal son típicamente supositorios que pueden prepararse mezclando composiciones con excipientes adecuados no irritantes como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera para supositorios que son sólidos a temperatura ambiente pero líquidos a temperatura corporal y por lo tanto se funden en el recto o cavidad vaginal y liberan el ingrediente activo.
Administración por vía oral
Las formas de dosificación sólidas para administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, pastillas, polvos y gránulos. En tales formas de dosificación sólidas, un ingrediente activo se mezcla con al menos un excipiente inerte farmacéuticamente aceptable, como citrato de sodio o fosfato dicálcico y/o rellenos o diluyentes (p. ej., almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico), aglutinantes (p. ej., carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidinona, sacarosa y acacia), humectantes (p. ej., glicerol), agentes desintegrantes (p. ej., agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato de sodio), retardantes de la solución (por ejemplo, parafina), aceleradores de absorción (por ejemplo, compuestos de amonio cuaternario), agentes humectantes (por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol), absorbentes (por ejemplo, caolín y arcilla de bentonita) y lubricantes (por ejemplo, talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos , laurilsulfato de sodio), y mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, comprimidos y pastillas, la dosificación también puede comprender agentes tamponadores.
Administración tópica o transdérmica
Como se describe en esta invención, las composiciones que contienen los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos de la divulgación pueden formularse para administración tópica. La piel puede ser un lugar diana ideal para la administración, ya que es fácilmente accesible. La expresión génica puede estar restringida no solo a la piel, evitando potencialmente la toxicidad inespecífica, sino también a capas específicas y tipos celulares dentro de la piel.
El sitio de expresión cutánea de las composiciones administradas dependerá de la ruta de administración del ácido nucleico. Generalmente se consideran tres rutas para administrar polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos a la piel: (i) aplicación tópica (por ejemplo, para local/regional tratamiento); (ii) inyección intradérmica (p. ej., para local/regional tratamiento); y (iii) administración sistémica (p. ej., para el tratamiento de enfermedades dermatológicas que afectan tanto a regiones cutáneas como extracutáneas). Los polinucleótidos, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos pueden administrarse a la piel mediante varios enfoques diferentes conocidos en la técnica. Se ha demostrado que la mayoría de los enfoques de administración tópica funcionan para la administración de ADN, como, entre otros, la aplicación tópica de complejo de liposoma-ADN no catiónico, complejo de liposoma-ADN catiónico, mediado por partículas (pistola de genes), gen mediado por punción transfecciones y estrategias de administración viral. Después de la administración del ácido nucleico, se han detectado productos génicos en varios tipos celulares cutáneas diferentes, incluidos, entre otros, queratinocitos basales, células de las glándulas sebáceas, fibroblastos dérmicos y macrófagos dérmicos.
En un caso, la divulgación proporciona una variedad de apósitos (p. ej., apósitos para heridas) o vendajes (p. ej., vendajes adhesivos) para llevar a cabo de manera conveniente y/o efectiva los procedimientos de la presente divulgación. Típicamente, los apósitos o vendajes pueden comprender cantidades suficientes de composiciones farmacéuticas y/o polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos descritos en esta invención para permitir que un usuario realice múltiples tratamientos de un sujeto o sujetos.
En un caso, la divulgación prevé que las composiciones de polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos se suministren en más de una inyección.
En un caso, antes de la administración tópica y/o transdérmica, al menos un área de tejido, como la piel, puede someterse a un dispositivo y/o solución que puede aumentar la permeabilidad. En un aspecto, el tejido puede someterse a un dispositivo de abrasión para aumentar la permeabilidad de la piel (ver Publicación de Patente EE. UU. N° 20080275468). En otro caso, el tejido puede someterse a un dispositivo de mejora por ultrasonidos. Un dispositivo de mejora por ultrasonido puede incluir, entre otros, los dispositivos descritos en la Publicación EE. UU. N° 20040236268 y Patentes EE. UU. N° 6.491.657 y 6.234.990. Procedimientos para mejorar la permeabilidad del tejido se describen en las Publicaciones EE. UU. N° 20040171980 y 20040236268 y Pat. EE. UU. N° 6.190.315.
En un caso, se puede usar un dispositivo para aumentar la permeabilidad del tejido antes de administrar las formulaciones de ARNm modificado descritas en esta invención. La permebilidad de la piel se puede medir usando procedimientos conocidos en la técnica y/o como se describe en la Patente de EE.UU. N° 6.190.315. Como ejemplo no limitativo, se puede administrar una formulación de ARNm modificado mediante los procedimientos de administración de fármacos descritos en la Patente EE. UU. N° 6.190.315.
En otro ejemplo no limitativo, el tejido puede tratarse con una crema de mezcla eutéctica de anestésicos locales (EMLA) antes, durante y/o después de que el tejido pueda someterse a un dispositivo que puede aumentar la permeabilidad. Katz y col. (Anesth Analg (2004); 98:371-76) demostraron que utilizando la crema EMLA en combinación con una energía baja, se observó un inicio de la analgesia cutánea superficial tan rápido como 5 minutos después de un pretratamiento con un ultrasonido de baja energía.
En un caso, se pueden aplicar elementos para mejorar el tejido antes, durante y/o después de que el tejido haya sido tratado para aumentar la permeabilidad. Mejoradores incluyen, pero no se limitan a, mejoradores del transporte, mejoradores físicos y mejoradores de la cavitación. Se describen ejemplos no limitantes de mejoradores en la Patente EE. UU. N° 6.190.315.
En un caso, se puede usar un dispositivo para aumentar la permeabilidad del tejido antes de administrar formulaciones de ARNm descritas en esta invención, que además pueden contener una sustancia que invoque una respuesta inmune. En otro ejemplo no limitante, una formulación que contiene una sustancia para invocar una respuesta inmune puede administrarse mediante los procedimientos descritos en las Publicaciones EE. UU. N° 20040171980 y 20040236268.
Las formas de dosificación para la administración tópica y/o transdérmica de una composición pueden incluir pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, aerosoles, inhalantes y/o parches. Generalmente, un ingrediente activo se mezcla en condiciones estériles con un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier conservante y/o tampón que se requiera. Además, la presente divulgación contempla el uso de parches transdérmicos, que a menudo tienen la ventaja añadida de proporcionar una administración controlada de un compuesto al cuerpo. Dichas formas de dosificación se pueden preparar, por ejemplo, disolviendo y/o distribuyendo el compuesto en el medio adecuado. Como alternativa o adicionalmente, la velocidad puede controlarse proporcionando una membrana de control de la velocidad y/o dispersando el compuesto en una matriz polimérica y/o gel.
Formulaciones adecuadas para la administración tópica incluyen, entre otras, preparaciones líquidas y/o semilíquidas como linimentos, lociones, emulsiones de aceite en agua y/o de agua en aceite como cremas, ungüentos y/o pastas y/o soluciones y/o suspensiones.
Las formulaciones administrables tópicamente pueden comprender, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 10 % (p/p) de ingrediente activo, aunque la concentración de ingrediente activo puede ser tan alta como el límite de solubilidad del ingrediente activo en el disolvente. Formulaciones para administración tópica pueden comprender además uno o más de los ingredientes adicionales descritos en esta invención.
Administración por depósito
Como se describe en esta invención, en algunos casos, la composición se formula en depósitos para liberación prolongada. Generalmente, un órgano o tejido específico (un "tejido diana") es alcanzado para administración..
En algunos aspectos de la divulgación, los ácidos nucleicos (particularmente los ácidos ribonucleicos que codifican polipéptidos) se retienen espacialmente dentro o cerca de un tejido diana. Se proporciona un procedimiento para proporcionar una composición a un tejido diana de un sujeto mamífero poniendo en contacto el tejido diana (que contiene una o más células diana) con la composición en condiciones tales que la composición, en particular el o los componentes de ácido nucleico de la composición, se retiene sustancialmente en el tejido diana, lo que significa que al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 o más del 99,99 % de la composición se retiene en el tejido diana. Ventajosamente, la retención se determina midiendo la cantidad de ácido nucleico presente en la composición que entra en una o más células diana. Por ejemplo, al menos 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 o más del 99,99 % del los ácidos nucleicos administrados al sujeto están presentes intracelularmente en un período de tiempo después de la administración. Por ejemplo, la inyección intramuscular a un sujeto mamífero se realiza usando una composición acuosa que contiene un ácido ribonucleico y un reactivo de transfección, y la retención de la composición se determina midiendo la cantidad de ácido ribonucleico presente en las células musculares.
Aspectos de la invención están dirigidos a procedimientos para proporcionar una composición a un tejido diana de un sujeto mamífero, poniendo en contacto el tejido diana (que contiene una o más células diana) con la composición en condiciones tales que la composición se retenga sustancialmente en el tejido diana. En otro caso, un polinucleótido, ácido ribonucleico diseñado para evitar una respuesta inmunitaria innata de una célula donde entra el ácido ribonucleico, donde el ácido ribonucleico contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de interés, en condiciones tales que se produce el polipéptido de interés. en al menos una célula diana. Las composiciones contienen generalmente un agente de penetración celular, aunque también se contempla un ácido nucleico "desnudo" (tal como ácidos nucleicos sin un agente de penetración celular u otro agente) y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunas circunstancias, la cantidad de proteína producida por las células en un tejido aumenta de forma deseable. Preferiblemente, este aumento en la producción de proteínas se restringe espacialmente a las células dentro del tejido diana. Por tanto, se proporcionan procedimientos para aumentar la producción de una proteína de interés en un tejido de un sujeto mamífero. Se proporciona una composición que contiene un ácido ribonucleico diseñado para evitar una respuesta inmune innata de una célula en la que el ácido ribonucleico ingresa y codifica el polipéptido de interés y la composición se caracteriza porque se ha determinado que una cantidad unitaria de composición produce el polipéptido de interés en un porcentaje sustancial de células contenidas dentro de un volumen predeterminado del tejido diana.
En algunos casos, la composición incluye una pluralidad de diferentes ácidos ribonucleicos, donde uno o más de uno de los ácidos ribonucleicos está diseñado para evitar una respuesta inmune innata de una célula donde ingresa el ácido ribonucleico, y donde uno o más de uno de los ácidos ribonucleicos codifica un polipéptido de interés. Opcionalmente, la composición también contiene un agente de penetración celular para ayudar en el suministro intracelular del ácido ribonucleico. Se determina la dosis de la composición requerida para producir el polipéptido de interés en un porcentaje sustancial de células contenidas dentro del volumen predeterminado del tejido diana (generalmente, sin inducir una producción significativa del polipéptido de interés en el tejido adyacente al predeterminado). volumen, o distalmente al tejido diana). Posteriormente a esta determinación, la dosis determinada se introduce directamente en el tejido del sujeto mamífero.
En un caso, la descripción prevé que los polinucleótidos, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos se administren en más de una inyección o mediante inyecciones de dosis fraccionadas.
En un caso, la descripción se puede retener cerca del tejido diana usando un pequeño depósito de fármaco desechable o una bomba de parche. Ejemplos no limitativos de bombas de parche incluyen las fabricadas y/o vendidas por BD®, (Franklin Lakes, NJ), Insulet Corporation (Bedford, MA), SteadyMed Therapeutics (San Francisco, CA), Medtronic (Minneapolis, MN) , UniLife (York, PA), Valeritas (Bridgewater, NJ), y SpringLeaf Therapeutics (Boston, MA).
Administración pulmonar
Se puede preparar, empaquetar y/o vender una composición farmacéutica en una formulación adecuada para administración pulmonar a través de la cavidad bucal. Tal formulación puede comprender partículas secas que comprenden el ingrediente activo y que tienen un diámetro en el intervalo de aproximadamente 0,5 nm a aproximadamente 7 nm o de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 6 nm. Dichas composiciones están convenientemente en forma de polvos secos para la administración usando un dispositivo que comprende un depósito de polvo seco al cual se puede dirigir una corriente de propulsor para dispersar el polvo y/o usando un recipiente dispensador de polvo/disolvente autopropulsado, tal como un dispositivo que comprende el ingrediente activo disuelto y/o suspendido en un propulsor de bajo punto de ebullición en un recipiente sellado. Dichos polvos comprenden partículas donde al menos el 98 % de las partículas en peso tienen un diámetro superior a 0,5 nm y al menos el 95 % de las partículas en número tienen un diámetro inferior a 7 nm. Alternativamente, al menos el 95 % de las partículas en peso tienen un diámetro mayor de 1 nm y al menos el 90 % de las partículas en número tienen un diámetro menor de 6 nm. Las composiciones de polvo seco pueden incluir un diluyente de polvo fino sólido tal como azúcar y se proporcionan convenientemente en forma de dosis unitaria.
Propulsores de bajo punto de ebullición generalmente incluyen propulsores líquidos que tienen un punto de ebullición por debajo de los 65 °F a la presión atmosférica. Generalmente, el propulsor puede constituir del 50 % al 99,9 % (p/p) de la composición, y el ingrediente activo puede constituir del 0,1 % al 20 % (p/p) de la composición. Un propulsor puede comprender además ingredientes adicionales tales como un tensioactivo líquido no iónico y/o aniónico sólido y/o un diluyente sólido (que puede tener un tamaño de partícula del mismo orden que las partículas que comprenden el ingrediente activo).
Las composiciones farmacéuticas formuladas para administración pulmonar pueden proporcionar un ingrediente activo en forma de gotitas de una solución y/o suspensión. Dichas formulaciones pueden prepararse, empaquetarse y/o venderse como soluciones y/o suspensiones acuosas y/o alcohólicas diluidas, opcionalmente estériles, que comprenden ingrediente activo, y pueden administrarse convenientemente usando cualquier dispositivo de nebulización y/o atomización. Dichas formulaciones pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales que incluyen, pero no se limitan a, un agente aromatizante como sacarina sódica, un aceite volátil, un agente tamponador, un agente tensioactivo y/o un conservante como metilhidroxibenzoato. Las gotitas proporcionadas por esta vía de administración pueden tener un diámetro medio en el intervalo de aproximadamente 0,1 nm a aproximadamente 200 nm.
Administración intranasal, nasal y bucal
Las formulaciones descritas en esta invención como útiles para la administración pulmonar son útiles para la administración intranasal de una composición farmacéutica. Otra formulación adecuada para la administración intranasal es un polvo grueso que comprende el ingrediente activo y que tiene una partícula promedio de aproximadamente 0,2 pm a 500 pm. Dicha formulación se administra de la manera en que se toma la porción a aspirar, i.e. mediante inhalación rápida a través del conducto nasal desde un recipiente con el polvo que se sujeta cerca de la nariz.
Las formulaciones adecuadas para la administración nasal pueden, por ejemplo, comprender desde aproximadamente un 0,1 % (p/p) hasta un 100 % (p/p) de ingrediente activo, y pueden comprender uno o más de los ingredientes adicionales descritos en esta invención. . Se puede preparar, empaquetar y/o vender una composición farmacéutica en una formulación adecuada para administración bucal. Tales formulaciones pueden, por ejemplo, estar en forma de comprimidos y/o pastillas preparadas usando procedimientos convencionales, y pueden, por ejemplo, de 0,1 % a 20 % (p/p) de ingrediente activo, comprendiendo el resto un ingrediente activo que se disuelve por vía oral y/o composición degradable y, opcionalmente, uno o más de los ingredientes adicionales descritos en esta invención. Alternativamente, las formulaciones adecuadas para la administración bucal pueden comprender un polvo y/o una solución y/o suspensión aerosolizada y/o atomizada que comprende un ingrediente activo. Tales formulaciones en polvo, aerosolizadas y/o en aerosol, cuando se dispersan, pueden tener un tamaño medio de partículas y/o gotas en el intervalo de aproximadamente 0,1 nm a aproximadamente 200 nm, y pueden comprender además uno o más de los ingredientes adicionales descritos en esta invención.
Administración oftálmica
Se puede preparar, empaquetar y/o vender una composición farmacéutica en una formulación adecuada para administración oftálmica. Tales formulaciones pueden estar, por ejemplo, en forma de gotas para los ojos que incluyen, por ejemplo, una solución y/o suspensión al 0,1/1,0 % (p/p) del ingrediente activo en un excipiente líquido acuoso o aceitoso. Dichas gotas pueden comprender además agentes tamponantes, sales y/o uno o más de cualquier ingrediente adicional descrito en esta invención. Otras formulaciones de administración oftálmica que son útiles incluyen aquellas que comprenden el ingrediente activo en forma microcristalina y/o en una preparación liposomal. Se contemplan gotas para los oídos y/o gotas para los ojos.
Administración de carga útil: Agentes detectables y Agentes terapéuticos
Los polinucleótidos, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos descritos en esta invención se pueden usar en varios escenarios diferentes en los que se desea la entrega de una sustancia (la "carga útil") a una diana biológica, por ejemplo, la entrega de sustancias detectables para detección de la diana, o suministro de un agente terapéutico. Los procedimientos de detección pueden incluir, entre otros, procedimientos de obtención de imágenes tanto in vitro como in vivo, por ejemplo, inmunohistoquímica, imágenes por bioluminiscencia (BLI), imágenes por resonancia magnética (MRI), tomografía por emisión de positrones (PET), microscopía electrónica, X- tomografía computarizada de rayos, imágenes Raman, tomografía de coherencia óptica, imágenes de absorción, imágenes térmicas, imágenes de reflectancia de fluorescencia, microscopía de fluorescencia, imágenes de tomografía molecular de fluorescencia, imágenes de resonancia magnética nuclear, imágenes de rayos X, imágenes de ultrasonido, imágenes fotoacústicas, ensayos de laboratorio o en cualquier situación donde se requiera etiquetado/tinción/imagen.
Los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos pueden diseñarse para incluir tanto un enlazador como una carga útil en cualquier orientación útil. Por ejemplo, un enlazador que tiene dos extremos se usa para unir un extremo a la carga útil y el otro extremo a la nucleobase, como en las posiciones C-7 o C-8 de la deaza-adenosina o deaza-guanosina o a las posiciones N-3 o C-5 de citosina o uracilo. El polinucleótido de la divulgación puede incluir más de una carga útil (por ejemplo, una etiqueta y un inhibidor de la transcripción), así como un enlazador escindible.
En un caso, el nucleótido modificado es un trifosfato de 7-desaza-adenosina modificado, donde un extremo de un enlazador escindible está unido a la posición C7 de 7-desaza-adenina, el otro extremo del enlazador está unido a un inhibidor (por ejemplo, a la posición C5 de la nucleobase en una citidina), y se une una etiqueta (por ejemplo, Cy5) al centro del enlazador (ver, por ejemplo, el compuesto 1 de A*pCp C5 Parg Capless en la Fig. 5 y las columnas 9 y 10 de la Pat. EE. UU. N°. 7.994.304). Tras la incorporación del trifosfato de 7-deaza-adenosina modificado a una región codificante, el polinucleótido resultante tendrá un enlazador escindible unido a una etiqueta y un inhibidor (por ejemplo, un inhibidor de polimerasa). Tras la escisión del enlazador (por ejemplo, con condiciones reductoras para reducir un enlazador que tiene un resto disulfuro escindible), se liberan la etiqueta y el inhibidor. En esta invención se describen enlazadores y cargas útiles adicionales (por ejemplo, agentes terapéuticos, etiquetas detectables y cargas útiles que penetran en las células).
Por ejemplo, los polinucleótidos, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos descritos en esta invención se pueden usar en la reprogramación de células madre pluripotentes inducidas (células iPS), que pueden rastrear directamente las células que se transfectan en comparación con las células totales en el grupo. En otro ejemplo, se puede usar un fármaco que se puede unir a los ácidos nucleicos modificados, al ARN modificado mejorado o a los ácidos ribonucleicos a través de un enlazador y se puede marcar con fluorescencia para rastrear el fármaco in vivo, por ejemplo, intracelularmente. Otros ejemplos incluyen, pero no se limitan a, el uso de polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos en la administración reversible de fármacos a las células.
Los polinucleótidos, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos descritos en esta invención se pueden usar en el direccionamiento intracelular de una carga útil, por ejemplo, un agente detectable o terapéutico, a un orgánulo específico. Ejemplos de dianas intracelulares pueden incluir, pero no se limitan a, la localización nuclear para el procesamiento de ARNm avanzado, o una secuencia de localización nuclear (NLS) unida al ARNm que contiene un inhibidor.
Además, los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos descritos en esta invención pueden usarse para administrar agentes terapéuticos a células o tejidos, por ejemplo, en animales vivos. Por ejemplo, los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos descritos en esta invención pueden usarse para administrar agentes quimioterapéuticos altamente polares para destruir células cancerosas. Los polinucleótidos, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos unidos al agente terapéutico a través de un enlazador pueden facilitar la permeación de los miembros, lo que permite que el agente terapéutico viaje al interior de una célula para alcanzar una diana intracelular.
En otro ejemplo, los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos se pueden unir a los polinucleótidos, ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos en un péptido inhibidor viral (VIP) a través de un enlazador escindible. El enlazador escindible puede liberar el VIP y el colorante en la célula. En otro ejemplo, los polinucleótidos, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos se pueden unir a través del conector a un ribosilato de ADP, que es responsable de las acciones de algunas toxinas bacterianas, como la toxina del cólera, la toxina de la difteria y la toxina de la tos ferina. Estas proteínas de toxinas son ADP-ribosiltransferasas que modifican proteínas diana en células humanas. Por ejemplo, la toxina del cólera ADP-ribosilatos de proteínas G modifica las células humanas provocando una secreción masiva de líquido del revestimiento del intestino delgado, lo que provoca una diarrea potencialmente mortal.
En algunos casos, la carga útil puede ser un agente terapéutico, como una citotoxina, un ion radiactivo, un agente quimioterapéutico u otro agente terapéutico. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células. Los ejemplos incluyen, entre otros, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenipósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracinediona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona , glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, maitansinoides, p. ej., maitansinol (ver Pat. EE. UU. N°.
5.208.020), rachelmicina (CC-I065, ver Pat. EE. UU. N°. 5.475.092, 5.585.499, y 5.846.545), y análogos u homólogos de los mismos. Los iones radiactivos incluyen, pero no se limitan a, yodo (por ejemplo, yodo 125 o yodo 131), estroncio 89, fósforo, paladio, cesio, iridio, fosfato, cobalto, itrio 90, samario 153 y praseodimio. Otros agentes terapéuticos incluyen, entre otros, antimetabolitos (p. ej., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (p. ej., mecloretamina, tiotepa clorambucilo, rachelmicina (CC-1065), melfalán, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cisdiclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (p. ej., daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos ( por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina, vinblastina, taxol y maitansinoides).
En algunos casos, la carga útil puede ser un agente detectable, como varias moléculas orgánicas pequeñas, compuestos inorgánicos, nanopartículas, enzimas o sustratos de enzimas, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes (p. ej., luminol), materiales bioluminiscentes (p. ej., luciferasa, luciferina y aecuorina), materiales quimioluminiscentes, materiales radiactivos (p. ej., 18F, 67Ga, 81mKr, 82Rb, 111In, 123I, 133Xe, 2°1Tl, 125I, 35S, 14C, 3H, o 99mTc (p. ej., como pertecnetato [tecnetato(VII), TcO4-)), y agentes de contraste (p. ej., oro (p. ej., nanopartículas de oro), gadolinio (p. ej., Gd quelado), óxidos de hierro (p. ej., óxido de hierro superparamagnético (SPIO), nanopartículas de óxido de hierro monocristalino (MION) y óxido de hierro superparamagnético ultrapequeño (USPIO)), quelatos de manganeso (p. ej., Mn-DPDP), sulfato de bario, medios de contraste yodados (iohexol), microburbujas o perfluorocarbonos). Dichos marcadores ópticamente detectables incluyen, por ejemplo, sin limitación, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'disulfónico; acridina y derivados (por ejemplo, acridina e isotiocianato de acridina); ácido 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfónico (EDANS); disulfonato de 4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5; N-(4-anilino-I-naftil)maleimida; antranilamida; CUERPO; amarillo brillante; cumarina y derivados (p. ej., cumarina, 7-amino-4-metilcumarina (AMC, Coumarin 120) y 7-amino-4-trifluorometilcumarina (Coumarin 151)); tintes de cianina; cianosina; 4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI); 5'5"-dibromopirogalolsulfonaftaleína (bromopirogalol rojo); 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina; pentaacetato de dietilentriamina; ácido 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2'-disulfónico; ácido 4,4'-diisotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico; cloruro de 5-[dimetilamino]-naftaleno-1-sulfonilo (DNS, cloruro de dansil); 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC); eosina y derivados (por ejemplo, eosina e isotiocianato de eosina); eritrosina y derivados (por ejemplo, eritrosina B e isotiocianato de eritrosina); etidio; fluoresceína y derivados (p. ej., 5-carboxifluoresceína (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceína (DTAF), 2',7'-dimetoxi-4'5'-dichioro-6-cart) oxifluoresceína, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, X-rodamina-5-(y-6)-isotiocianato (QFITC o XRITC) y fluorescamina); 2-[2-[3-[[1,3-dihidro-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)-2H-benz[e]indol-2-ilidenetilidenil-2-[4-(etoxicarbonilo) -1-piperazinil]-1-ciclopenten-1-il]etenil]-1,1-dimetil-3-(3-sulforpropil)-1H-benz[e]indoliohidróxido, sal interna, compuesto con n,n-dietiletanamina( 1:1)(IR144);5-cloro-2-[2-[3-[(5-cloro-3-etil-2(3H)-benzotiazol-ilideno)etiliden]-2-(difenilamino)-1- perclorato de ciclopenten-1-il]etenil]-3-etilbenzotiazolio (IR140); isotiocianato de verde de malaquita; 4-metilumbeliferona ortocresolftaleína; nitrotirosina; pararosanilina; Fenol rojo; B-ficoeritrina; o-ftaldialdehído; pireno y derivados (p. ej., pireno, butirato de pireno y succinimidil 1-pireno); puntos cuánticos de butirato; rojo reactivo 4 (CibacronTM Brilliant Red 3B-A); rodamina y derivados (p. ej., 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboximodamina (R6G), lisamina rodamina B cloruro de sulfonilo modarnina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, isotiocianato de rodamina X, sulforrodamina B, sulforhodamina 101, derivado de cloruro de sulfonilo de sulforrodamina 101 (Texas Red), N,N,N',N'tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA) tetrametil rodamina e isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC)); riboflavina; ácido rosólico; derivados de quelatos de terbio; cianina-3 (Cy3); cianina-5 (Cy5); cianina-5,5 (Cy5,5), cianina-7 (Cy7); IRD 700; IRD 800; Alexa647; La Jolta Azul; ftalocianina; y naftalocianina.
En algunos casos, el agente detectable puede ser un precursor no detectable que se vuelve detectable tras la activación (p. ej., construcciones fluorogénicas de tetrazina-fluoróforo (p. ej., tetrazina-BODIPY FL, tetrazina-Oregon Green 488 o tetrazina-BODIPY TMR-X ) o agentes fluorogénicos activables por enzimas (p. ej., PROSENSE® (VisEn Medical))). Ensayos in vitro donde se pueden usar las composiciones marcadas con enzimas incluyen, entre otros, ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), ensayos de inmunoprecipitación, inmunofluorescencia, inmunoensayos enzimáticos (EIA), radioinmunoensayos (RIA) y análisis de transferencia Western. Combinación
Los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos pueden usarse en combinación con uno o más agentes terapéuticos, profilácticos, de diagnóstico o de formación de imágenes. Por "en combinación con", no se pretende implicar que los agentes deben administrarse al mismo tiempo y/o que deben formularse para su administración conjunta, aunque estos procedimientos de administración están dentro del alcance de la presente descripción. Las composiciones se pueden administrar simultáneamente con, antes o después de, uno o más de otros procedimientos terapéuticos o médicos deseados. En general, cada agente se administrará en una dosis y/o en un horario determinado para ese agente. En algunos casos, la presente descripción abarca la administración de composiciones farmacéuticas, profilácticas, de diagnóstico o de formación de imágenes en combinación con agentes que pueden mejorar su biodisponibilidad, reducir y/o modificar su metabolismo, inhibir su excreción y/o modificar su distribución dentro del cuerpo. Como ejemplo no limitante, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos pueden usarse en combinación con un agente farmacéutico para el tratamiento del cáncer o para controlar las células hiperproliferativas. En la Pat. EE. UU. N° 7.964.571, se describe una terapia de combinación para el tratamiento de tumores sólidos primarios o metastatizados usando una composición farmacéutica que incluye un plásmido de ADN que codifica la interleucina-12 con un lipopolímero y también administra al menos un agente anticanceroso o quimioterapéutico. Además, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la presente divulgación que codifican moléculas antiproliferativas pueden estar en una composición farmacéutica con un lipopolímero (ver, por ejemplo, la Pub. EE. UU. N°. 20110218231, que reivindica una composición farmacéutica que comprende plásmido que codifica una molécula antiproliferativa y un lipopolímero) que puede administrarse con al menos un agente quimioterapéutico o anticancerígeno.
Administración de carga útil: Carga útil para penetración celular
En algunos casos, los polinucleótidos, nucleótidos modificados y moléculas de ácido nucleico modificadas, que se incorporan a un ácido nucleico, por ejemplo, ARN o ARNm, también pueden incluir una carga útil que puede ser un resto que penetra en la célula o un agente que mejora la administración intracelular de las composiciones. Por ejemplo, las composiciones pueden incluir, entre otras, una secuencia peptídica de penetración celular que facilita la administración al espacio intracelular, por ejemplo, péptido TAT derivado del v Ih , penetratinas, transportadores o péptidos de penetración celular derivados de hCT, ver, por ejemplo, Caron y col, (2001) Mol Ther. 3(3):310-8; Langel, Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications (CRC Press, Boca Raton FL 2002); El-Andaloussi y col., (2005) Curr Pharm Des. 11(28):3597-611; y Deshayes y col., (2005) Cell Mol Life Sci. 62(16):1839-49. Las composiciones también se pueden formular para incluir un agente de penetración celular, por ejemplo, liposomas, que mejoran la administración de las composiciones al espacio intracelular.
Administración de carga útil: Diana biológica
Los nucleótidos modificados y las moléculas de ácido nucleico modificadas descritas en esta invención, que se incorporan a un ácido nucleico, por ejemplo, ARN o ARNm, pueden usarse para entregar una carga útil a cualquier diana biológica para la que exista o pueda generarse un ligando específico. El ligando puede unirse a la diana biológica de forma covalente o no covalente.
Ejemplos de dianas biológicas incluyen, entre otros, biopolímeros, por ejemplo, anticuerpos, ácidos nucleicos como ARN y ADN, proteínas, enzimas; los ejemplos de proteínas incluyen, pero no se limitan a, enzimas, receptores y canales iónicos. En algunos casos, la diana puede ser un marcador específico de tejido o de tipo celular, por ejemplo, una proteína que se expresa específicamente en un tejido o tipo celular seleccionado. En algunos casos, la diana puede ser un receptor, tal como, entre otros, receptores de membrana plasmática y receptores nucleares; ejemplos más específicos incluyen, pero no se limitan a, receptores acoplados a proteína G, proteínas de poro celular, proteínas transportadoras, anticuerpos expresados en superficie, proteínas HLA, proteínas MHC y receptores de factores de crecimiento.
Dosificación
La presente divulgación proporciona procedimientos que comprenden la administración de ARNm modificados y sus proteínas o complejos codificados de acuerdo con la divulgación a un sujeto que lo necesite. Los ácidos nucleicos, las proteínas o los complejos, o sus composiciones farmacéuticas, de imaginología, de diagnóstico o profilácticas, pueden administrarse a un sujeto utilizando cualquier cantidad y cualquier vía de administración efectiva para impedir, tratar, diagnosticar o imaginizar una enfermedad, trastorno y/o o condición (por ejemplo, una enfermedad, trastorno y/o condición relacionada con déficits de memoria de trabajo). La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, la edad y el estado general del sujeto, la gravedad de la enfermedad, la composición particular, su modo de administración, su modo de actividad y similares. Las composiciones según la invención se formulan típicamente en forma de conjunto de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. Sin embargo, se entenderá que el uso diario total de las composiciones de la presente descripción puede ser decidido por el médico tratante dentro del alcance del buen juicio médico. El nivel de dosis de formación de imágenes específico terapéuticamente efectivo, profilácticamente efectivo o apropiado para cualquier paciente en particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el tiempo de administración, vía de administración y velocidad de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; fármacos utilizados en combinación o coincidentes con el compuesto específico empleado; y como factores bien conocidos en las artes médicas.
En ciertos casos, las composiciones de acuerdo con la presente divulgación pueden administrarse a niveles de dosificación suficientes para administrar desde alrededor de 0,0001 mg/kg hasta alrededor de 100 mg/kg, desde alrededor de 0,001 mg/kg hasta alrededor de 0,05 mg/kg, desde alrededor de 0,005 mg /kg a aproximadamente 0,05 mg/kg, de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 0,005 mg/kg, de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 0,5 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, o de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, del peso corporal del sujeto por día, una o más veces al día, para obtener el efecto terapéutico, de diagnóstico, profiláctico o de formación de imágenes deseado. La dosificación deseada se puede administrar tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, cada dos días, cada tercer día, semanalmente, cada dos semanas, cada tres semanas o cada cuatro semanas. En ciertos casos, la dosificación deseada puede administrarse utilizando múltiples administraciones (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o más administraciones).
Según la presente descripción, se ha descubierto que la administración de ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos en regímenes de dosis fraccionadas produce niveles más altos de proteínas en sujetos mamíferos. Tal como se usa en esta invención, una "dosis dividida" es la división de la dosis unitaria única o la dosis diaria total en dos o más dosis, por ejemplo, dos o más administraciones de la dosis unitaria única. Tal como se usa en esta invención, una "dosis unitaria única" es una dosis de cualquier terapéutico administrado en una dosis/en un momento/vía única/punto único de contacto, es decir, un evento de administración única. Tal como se usa en esta invención, una "dosis diaria total" es una cantidad administrada o prescrita en un período de 24 horas. Puede administrarse como una dosis unitaria única. En un caso, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la presente divulgación se administran a un sujeto en dosis fraccionadas. Los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos pueden formularse solo en tampón o en una formulación descrita en esta invención.
Formas de dosificación
Una composición farmacéutica descrita en esta invención puede formularse en una forma de dosificación descrita en esta invención, como tópica, intranasal, intratraqueal o inyectable (por ejemplo, intravenosa, intraocular, intravítrea, intramuscular, intracardíaca, intraperitoneal, subcutánea).
Formas de dosificación líquidas
Las formas de dosificación líquidas para administración parenteral incluyen, pero no se limitan a, emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y/o elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los ingredientes activos, las formas de dosificación líquidas pueden comprender diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica que incluyen, entre otros, agua u otros solventes, agentes solubilizantes y emulsionantes como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico. , benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán y mezclas de los mismos. En determinados casos para administración parenteral, las composiciones se pueden mezclar con agentes solubilizantes tales como CREMOPHOR®, alcoholes, aceites, aceites modificados, glicoles, polisorbatos, ciclodextrinas, polímeros y/o combinaciones de los mismos.
Inyectables
Las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles se pueden formular de acuerdo con la técnica conocida y pueden incluir agentes dispersantes, agentes humectantes y/o agentes de suspensión adecuados. Las preparaciones inyectables estériles pueden ser soluciones, suspensiones y/o emulsiones inyectables estériles en diluyentes y/o disolventes parenteralmente aceptables no tóxicos, por ejemplo, una solución en 1,3-butanodiol. Entre los solventes y vehículos aceptables que pueden ser empleados se encuentran, sin limitación, agua, solución de Ringer, U.S.P. y solución isotónica de cloruro de sodio. Los aceites fijos estériles se emplean convencionalmente como disolvente o medio de suspensión. A tales efectos, se puede emplear cualquier aceite no volátil insípido, inclusive mono o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos como el ácido oleico se pueden utilizar en la preparación de inyectables.
Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se puedan disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.
Para prolongar el efecto de un ingrediente activo, a menudo es deseable ralentizar la absorción del ingrediente activo por inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con una escasa solubilidad en agua. La velocidad de absorción del ARNm modificado depende a continuación de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de un ARNm modificado administrado por vía parenteral puede lograrse disolviendo o suspendiendo el ARNm modificado en un vehículo oleoso. Las formas de depósito inyectables se fabrican formando matrices de microcápsulas del ARNm modificado en polímeros biodegradables como poliláctidopoliglicólido. Dependiendo de la proporción de ARNm modificado a polímero y la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación de ARNm modificado. Ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen, entre otros, poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de depósito se pueden preparar atrapando el ARNm modificado en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales.
Pulmonar
Las formulaciones descritas en esta invención como útiles para la administración pulmonar también pueden usarse para la administración intranasal de una composición farmacéutica. Otra formulación adecuada para la administración intranasal es un polvo grueso que comprende el ingrediente activo y que tiene una partícula promedio de aproximadamente 0,2 pm a 500 pm. Dicha formulación se administra de la manera en que se toma la porción a aspirar, es decir, mediante inhalación rápida a través del conducto nasal desde un recipiente del polvo que se sujeta cerca de la nariz.
Las formulaciones adecuadas para la administración nasal pueden, por ejemplo, comprender desde aproximadamente un 0,1 % (p/p) hasta un 100 % (p/p) de ingrediente activo, y pueden comprender uno o más de los ingredientes adicionales descritos en esta invención. . Se puede preparar, empaquetar y/o vender una composición farmacéutica en una formulación adecuada para administración bucal. Tales formulaciones pueden, por ejemplo, estar en forma de comprimidos y/o pastillas preparadas usando procedimientos convencionales, y pueden contener, por ejemplo, alrededor de 0,1 % a 20 % (p/p) de ingrediente activo, donde el resto puede comprender un ingrediente activo por vía oral. composición soluble y/o degradable y, opcionalmente, uno o más de los ingredientes adicionales descritos en esta invención. Alternativamente, las formulaciones adecuadas para la administración bucal pueden comprender un polvo y/o una solución y/o suspensión aerosolizada y/o atomizada que comprende un ingrediente activo. Tales formulaciones en polvo, aerosolizadas y/o en aerosol, cuando se dispersan, pueden tener un tamaño medio de partículas y/o gotas en el intervalo de aproximadamente 0,1 nm a aproximadamente 200 nm, y pueden comprender además uno o más de los ingredientes adicionales descritos en esta invención.
Es posible encontrar consideraciones generales de la formulación y/o fabricación de agentes farmacéuticos, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21a ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005.
Recubrimientos o Cubiertas
Las formas de dosificación sólidas de comprimidos, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos se pueden preparar con recubrimientos y cubiertas tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. Opcionalmente pueden comprender agentes opacificantes y pueden ser de una composición que liberen el ingrediente o los principios activos solo, o preferentemente, en una determinada parte del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Ejemplos de composiciones de inclusión que se pueden usar incluyen sustancias poliméricas y ceras. Composiciones sólidas de un tipo similar se pueden empelar como cargas en cápsulas de gelatina rellenas duras y blandas usando excipientes tales como lactosa o azúcar de la leche así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
Kits
La divulgación proporciona una variedad de kits para llevar a cabo de manera conveniente y/o efectiva los procedimientos de la presente divulgación. Normalmente, los kits comprenderán números y/o cantidades suficientes de componentes para permitir que un usuario realice múltiples tratamientos de un sujeto o sujetos y/o realice múltiples experimentos.
En un aspecto, la presente descripción proporciona kits para la producción de proteínas, que comprenden un primer ácido nucleico modificado, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos que comprenden una región traducible. El kit puede comprender además el envase e instrucciones y/o un agente de administración para formar una composición de formulación. El agente de administración puede comprender una solución salina, una solución tamponada, un lípido o cualquier agente de administración descrito en esta invención.
En un caso, la solución tampón puede incluir cloruro de sodio, cloruro de calcio, fosfato y/o EDTA. En otro caso, la solución tampón puede incluir, entre otros, solución salina, solución salina con calcio 2 mM, sacarosa al 5 %, sacarosa al 5 % con calcio 2 mM, manitol al 5 %, manitol al 5 % con calcio 2 mM, lactato de Ringer, cloruro de sodio, cloruro de sodio con calcio 2 mM. En un caso adicional, las soluciones tampón pueden precipitarse o pueden liofilizarse. La cantidad de cada componente se puede variar para permitir formulaciones de tampón simple o solución salina de mayor concentración consistentes y reproducibles. Los componentes también se pueden variar para aumentar la estabilidad del ARN modificado en la solución tampón durante un período de tiempo y/o bajo una variedad de condiciones.
En un aspecto, la presente descripción proporciona kits para la producción de proteínas, que comprenden: ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos que comprenden una región traducible, proporcionados en una cantidad efectiva para producir una cantidad deseada de una proteína codificada por la región traducible cuando introducido en una célula diana; unos segundos ácidos nucleicos modificados, ARN modificado potenciado o ácidos ribonucleicos que comprenden un ácido nucleico inhibidor, proporcionados en una cantidad eficaz para inhibir sustancialmente la respuesta inmunitaria innata de la célula; y embalaje e instrucciones.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona kits para la producción de proteínas, que comprenden ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos que comprenden una región traducible, donde el ácido nucleico muestra una degradación reducida por una nucleasa celular, y embalaje e instrucciones.
En un aspecto, la presente descripción proporciona kits para la producción de proteínas, que comprenden ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos que comprenden una región traducible, donde el ácido nucleico muestra una degradación reducida por una nucleasa celular y una célula de mamífero adecuada para la traducción de la región traducible del primer ácido nucleico
Dispositivos
La presente descripción proporciona dispositivos que pueden incorporar ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos que codifican polipéptidos de interés. Estos dispositivos contienen en una formulación estable los reactivos para sintetizar un ácido nucleico en una formulación disponible para ser administrado inmediatamente a un sujeto que lo necesite, tal como un paciente humano. Ejemplos no limitantes de dicho polipéptido de interés incluyen un factor de crecimiento y/o estimulador de la angiogénesis para la cicatrización de heridas, un antibiótico peptídico para facilitar el control de infecciones y un antígeno para estimular rápidamente una respuesta inmunitaria a un virus recién identificado.
En algunos casos, el dispositivo es autónomo y, opcionalmente, tiene capacidad de acceso remoto inalámbrico para obtener instrucciones para la síntesis y/o análisis de los ácidos nucleicos modificados generados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos. El dispositivo es capaz de realizar la síntesis móvil de al menos un ácido nucleico modificado, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos y preferiblemente un número ilimitado de diferentes ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos. En ciertos casos, el dispositivo puede ser transportado por una persona o un pequeño número de personas. En otros casos, el dispositivo se escala para caber en una mesa de trabajo o escritorio. En otros casos, el dispositivo se escala para caber en una maleta, mochila u objeto de tamaño similar. En otro caso, el dispositivo puede ser un lugar de atención o un dispositivo portátil. En otros casos, el dispositivo se escala para caber en un vehículo, como un coche, camión o ambulancia, o un vehículo militar como un tanque o un vehículo de transporte de personal. La información necesaria para generar un polipéptido de interés que codifica ácido ribonucleico está presente dentro de un medio legible por computadora presente en el dispositivo.
En un caso, se puede usar un dispositivo para evaluar los niveles de una proteína que se ha administrado en forma de ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos. El dispositivo puede comprender una prueba de sangre, orina u otra biofluídica.
En algunos casos, el dispositivo es capaz de comunicarse (p. ej., comunicación inalámbrica) con una base de datos de secuencias de ácidos nucleicos y polipéptidos. El dispositivo contiene al menos un bloque de muestra para la inserción de uno o más recipientes de muestra. Dichos recipientes de muestra son capaces de aceptar en líquido o en otra forma cualquier número de materiales tales como ADN plantilla, nucleótidos, enzimas, tampones y otros reactivos. Los recipientes de muestra también pueden calentarse y enfriarse por contacto con el bloque de muestra. El bloque de muestra generalmente está en comunicación con una base de dispositivo con uno o más conjuntos de control electrónico para el al menos un bloque de muestra. El bloque de muestra contiene preferiblemente un módulo de calentamiento, tal molécula de calentamiento capaz de calentar y/o enfriar los recipientes de muestra y el contenido de los mismos a temperaturas entre aproximadamente -20 C y superiores 100C. La base del dispositivo está en comunicación con un suministro de voltaje, como una batería o un suministro de voltaje externo. El dispositivo también contiene medios para almacenar y distribuir los materiales para la síntesis de ARN.
Opcionalmente, el bloque de muestra contiene un módulo para separar los ácidos nucleicos sintetizados. Alternativamente, el dispositivo contiene un módulo de separación vinculado operativamente al bloque de muestras. Preferiblemente, el dispositivo contiene un medio para el análisis del ácido nucleico sintetizado. Dicho análisis incluye la identidad de la secuencia (demostrada, por ejemplo, por hibridación), la ausencia de secuencias no deseadas, la medición de la integridad del ARNm sintetizado (por ejemplo, mediante viscosimetría microfluídica combinada con espectrofotometría) y concentración y/o potencia de ácidos nucleicos modificados, ARN modificado mejorado o ácidos ribonucleicos (como por espectrofotometría).
En ciertos casos, el dispositivo se combina con un medio para la detección de patógenos presentes en un material biológico obtenido de un sujeto, por ejemplo, el sistema IBIS PLEX-ID (Abbott, Abbott Park, IL) para identificación microbiana.
Dispositivos adecuados para usar en la administración de composiciones farmacéuticas intradérmicas descritas en esta invención incluyen dispositivos de agujas cortas como los descritos en las Patentes de EE. UU. 4.886.499; 5.190.521; 5.328.483; 5.527.288; 4.270.537; 5.015.235; 5.141.496; y 5.417.662. Composiciones intradérmicas se pueden administrar mediante dispositivos que limitan la extensión de penetración efectiva de una aguja en la piel, tales como los que se describen en la Publicación PCT WO 99/34850 y equivalentes funcionales de los mismos. Son adecuados los dispositivos de inyección a chorro que suministran composiciones líquidas a la dermis a través de un inyector de chorro de líquido y/o a través de una aguja que perfora el estrato córneo y produce un chorro que llega a la dermis. Los dispositivos de inyección a chorro se describen, por ejemplo, en las Patentes EE. UU. 5.480.381; 5.599.302; 5.334.144; 5.993.412; 5.649.912; 5.569.189; 5.704.911; 5.383.851; 5.893.397; 5.466.220; 5.339.163; 5.312.335; 5.503.627; 5.064.413; 5.520.639; 4.596.556; 4.790.824; 4.941.880; 4.940.460; y Publicaciones PCT WO 97/37705 y WO 97/13537. Dispositivos balísticos de administración de polvos/partículas que utilizan gas comprimido para acelerar la vacuna en forma de polvo a través de las capas externas de la piel hasta la dermis son adecuados.
Como alternativa o adicionalmente, se pueden usar jeringas convencionales en el procedimiento clásico de administración intradérmica de mantoux.
En algunos casos, el dispositivo puede ser una bomba o comprender un catéter para la administración de compuestos o composiciones de la descripción a través de la barrera hematoencefálica. Dichos dispositivos incluyen, pero no se limitan a, un dispositivo de suministro olfativo presurizado, dispositivos de iontoforesis, dispositivos microfluídicos multicapa y similares. Dichos dispositivos pueden ser portátiles o estacionarios. Pueden ser implantables o anclados externamente al cuerpo o combinaciones de los mismos.
Pueden emplearse dispositivos para la administración para administrar los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la presente divulgación de acuerdo con los regímenes de dosificación única, múltiple o dividida que se enseñan en el presente documento. Dichos dispositivos se describen a continuación.
Los procedimientos y dispositivos conocidos en la técnica para la administración múltiple a células, órganos y tejidos se contemplan para su uso junto con los procedimientos y composiciones descritos en esta invención como casos de la presente descripción. Estos incluyen, por ejemplo, aquellos procedimientos y dispositivos que tienen múltiples agujas, dispositivos híbridos que emplean, por ejemplo, lúmenes o catéteres, así como dispositivos que utilizan calor, corriente eléctrica o mecanismos accionados por radiación.
Según la presente divulgación, estos dispositivos de administración múltiple pueden utilizarse para administrar las dosis únicas, múltiples o divididas contempladas en esta invención.
Un procedimiento para administrar agentes terapéuticos a un tejido sólido ha sido descrito por Bahrami y col. y se enseña, por ejemplo, en la Publicación de Patente EE. UU. 20110230839. Según Bahrami, se incorpora un conjunto de agujas en un dispositivo que administra una cantidad sustancialmente igual de fluido en cualquier lugar de dicho tejido sólido a lo largo de la longitud de cada aguja.
Un dispositivo para la administración de material biológico a través del tejido biológico ha sido descrito por Kodgule y col. y se enseña, por ejemplo, en la Publicación de Patente EE. UU. 20110172610. SEgún Kodgule, múltiples microagujas huecas hechas de uno o más metales y que tienen diámetros exteriores de alrededor de 200 micras a alrededor de 350 micras y longitudes de al menos 100 micras se incorporan al dispositivo que administra péptidos, proteínas, carbohidratos, moléculas de ácido nucleico , lípidos y otros ingredientes farmacéuticamente activos o combinaciones de los mismos.
Una sonda de administración para administrar un agente terapéutico a un tejido ha sido descrita por Gunday y col. y se enseña, por ejemplo, en la Publicación de Patente EE. UU. 20110270184. Según Gunday, se incorporan múltiples agujas en el dispositivo que mueve las cápsulas adheridas entre una posición activada y una posición inactiva para forzar la salida del agente de las cápsulas a través de las agujas.
Assaf ha descrito un aparato médico de inyección múltiple y se enseña, por ejemplo, en la Publicación de Patente EE.
UU. 20110218497. Según Assaf, se incorporan múltiples agujas en el dispositivo que tiene una cámara conectada a una o más de dichas agujas y un medio para rellenar continuamente la cámara con el fluido médico después de cada inyección.
En un caso, los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos se administran por vía subcutánea o intramuscular a través de al menos 3 agujas a tres sitios diferentes, opcionalmente adyacentes, simultáneamente, o dentro de un período de 60 minutos (por ejemplo, administración a 4,5, 6, 7, 8, 9 o 10 sitios simultáneamente o en un período de 60 minutos). Las dosis fraccionadas se pueden administrar simultáneamente al tejido adyacente utilizando los dispositivos descritos en las Publicaciones de Patentes EE. UU. N°. 20110230839 y 20110218497.
Forsell ha descrito un sistema al menos parcialmente implantable para inyectar una sustancia en el cuerpo de un paciente, en particular un sistema de estimulación de la erección del pene, y se enseña, por ejemplo, en la Publicación de Patente EE. UU. 20110196198. Según Forsell, se incorporan múltiples agujas en el dispositivo que se implanta junto con uno o más alojamientos adyacentes a los cuerpos cavernosos izquierdo y derecho del paciente. También se implantan un depósito y una bomba para suministrar medicamentos a través de las agujas.
Berenson ha descrito un procedimiento para la administración transdérmica de una cantidad terapéuticamente efectiva de hierro y se enseña, por ejemplo, en la Publicación de Patente EE. UU. 20100130910. Según Berenson, se pueden usar múltiples agujas para crear múltiples microcanales en el estrato córneo para mejorar el suministro transdérmico del hierro iónico en un parche iontoforético.
Un procedimiento para la administración de material biológico a través del tejido biológico ha sido descrito por Kodgule y col. y se enseña, por ejemplo, en la Publicación de Patente EE. UU. 20110196308. Según Kodgule, se incorporan múltiples microagujas biodegradables que contienen un ingrediente activo terapéutico en un dispositivo que administra proteínas, carbohidratos, moléculas de ácido nucleico, lípidos y otros ingredientes farmacéuticamente activos o combinaciones de los mismos.
Donovan ha descrito un parche transdérmico que comprende una composición de toxina botulínica y se enseña, por ejemplo, en la Publicación de Patente EE. UU. 20080220020. Según Donovan, se incorporan múltiples agujas en el parche que administra la toxina botulínica debajo del estrato córneo a través de dichas agujas que se proyectan a través del estrato córneo de la piel sin romper un vaso sanguíneo.
Se puede colocar sobre la piel un pequeño reservorio de fármaco desechable, o bomba de parche, que puede contener aproximadamente de 0,2 a 15 ml de formulaciones líquidas y administrar la formulación de forma continua por vía subcutánea utilizando un orificio pequeño necesario (p. ej., calibre 26 a 34). Como ejemplos no limitantes, la bomba de parche puede tener un resorte de 50 mm por 76 mm por 20 mm con una aguja de calibre 30 a 34 (Microinfusor BD™ , Franklin Lakes NJ), 41 mm por 62 mm por 17 mm con un reservorio de 2 mL usado para la administración de fármacos como insulina (OMNIPOD®, Insulet Corporation Bedford, MA), o 43-60 mm de diámetro, 10 mm de espesor con un reservorio de 0,5 a 10 mL (PATCHPUMP®, SteadyMed Therapeutics, San Francisco, CA). Además, la bomba de parche puede funcionar con batería. y/o ser recargable
Toubia ha descrito una sonda criogénica para la administración de un agente activo en una ubicación de tratamiento criogénico y se enseña, por ejemplo, en la Publicación de Patente EE. UU. 20080140061. Según Toubia, se incorporan múltiples agujas a la sonda que recibe el agente activo en una cámara y administra el agente al tejido.
Stock y col ha descrito un procedimiento para tratar o impedir la inflamación o promover la salud de las articulaciones y se enseña, por ejemplo, en la Publicación de Patente EE. UU. 20090155186. Según Stock, se incorporan múltiples agujas en un dispositivo que administra composiciones que contienen compuestos moduladores de la transducción de señales.
Un sistema de inyección multisitio ha sido descrito por Kimmell y coll. se enseña, por ejemplo, en la Publicación de Patente EE. UU. 20100256594. Según Kimmell, se incorporan múltiples agujas en un dispositivo que administra un medicamento en un estrato córneo a través de las agujas.
Un procedimiento para administrar interferones al compartimento intradérmico ha sido descrito por Dekker y col. y se enseña, por ejemplo, en la Publicación de Patente EE. UU. 20050181033. Según Dekker, múltiples agujas que tienen una salida con una altura expuesta de entre 0 y 1 mm se incorporan a un dispositivo que mejora la farmacocinética y la biodisponibilidad al administrar la sustancia a una profundidad de entre 0,3 mm y 2 mm.
Desai ha descrito un procedimiento para administrar genes, enzimas y agentes biológicos a células tisulares y se enseña, por ejemplo, en la Publicación de Patente EE. UU.20030073908. Según Desai, se incorporan múltiples agujas en un dispositivo que se inserta en un cuerpo y administra un fluido de medicación a través de dichas agujas.
Un procedimiento para tratar arritmias cardíacas con células de fibroblastos ha sido descrito por Lee y col y se enseña, por ejemplo, en la Publicación de Patente EE. UU. 20040005295. Según Lee, se incorporan múltiples agujas en el dispositivo que administra células de fibroblastos en la región local del tejido.
Un procedimiento que usa una bomba controlada magnéticamente para tratar un tumor cerebral ha sido descrito por Shachar y col. y se enseña, por ejemplo, en la Patente EE. 7.799.012 (procedimiento) y 7.799.016 (dispositivo). Según Shachar, se incorporaron múltiples agujas a la bomba que empuja un agente medicante a través de las agujas a una velocidad controlada.
Procedimientos para tratar los trastornos funcionales de la vejiga en hembras de mamífero han sido descritos por Versi y col. y se enseñan, por ejemplo, en la Patente EE. UU. 8.029.496. Según Versi, se incorpora una matriz de microagujas en un dispositivo que administra un agente terapéutico a través de las agujas directamente al trígono de la vejiga.
Un dispositivo de transporte transdérmico por microagujas ha sido descrito por Angel y col y se enseña, por ejemplo, en la Patente EE. UU. 7.364.568. Según Angel, se incorporan múltiples agujas en el dispositivo que transporta una sustancia a la superficie del cuerpo a través de las agujas que se insertan en la superficie desde diferentes direcciones. El dispositivo de transporte transdérmico por microagujas puede ser un sistema de microagujas sólidas o un sistema de microagujas huecas. Como ejemplo no limitativo, el sistema de microagujas sólidas puede tener una capacidad de hasta 0,5 mg, con 300-1500 microagujas sólidas por cm2 de aproximadamente 150-700 pm de altura recubiertas con un fármaco. Las microagujas penetran en el estrato córneo y permanecen en la piel durante un breve período (p. ej., de 20 segundos a 15 minutos). En otro ejemplo, el sistema de microagujas huecas tiene una capacidad de hasta 3 mL para administrar formulaciones líquidas usando 15-20 microagujas por cm2 con una altura aproximada de 950 pm. Las microagujas penetran la piel para permitir que las formulaciones líquidas fluyan desde el dispositivo hacia la piel. El sistema de microagujas huecas se puede usar de 1 a 30 minutos dependiendo del volumen y la viscosidad de la formulación.
Un dispositivo para infusión subcutánea ha sido descrito por Dalton y col y se enseñan, por ejemplo, en la Patente EE. UU. 7.150.726. Según Dalton, se incorporan múltiples agujas en el dispositivo que suministra fluido a través de las agujas al tejido subcutáneo.
Un dispositivo y un procedimiento para la administración intradérmica de vacunas y agentes terapéuticos génicos a través de microcánulas han sido descritos por Mikszta y col. y se enseñan, por ejemplo, en la Patente EE. UU.
7.473.247.. Según Mitszta, se incorpora al menos una microaguja hueca en el dispositivo que administra las vacunas a la piel del sujeto a una profundidad de entre 0,025 mm y 2 mm.
Pettis y col ha descrito un procedimiento para administrar insulina y se enseña, por ejemplo, en la Patente de EE.UU.
7.722.595. Según Pettis, se incorporan dos agujas en un dispositivo donde ambas agujas se insertan esencialmente simultáneamente en la piel con la primera a una profundidad de menos de 2,5 mm para administrar insulina al compartimento intradérmico y la segunda a una profundidad de más de 2,5 mm y menos. de 5,0 mm para administrar insulina al compartimiento subcutáneo.
La administración de inyección cutánea bajo succión ha sido descrita por Kochamba y col. y se enseña, por ejemplo, en la Patente EE. UU. 6.896.666. Según Kochamba, múltiples agujas en relativa adyacencia entre sí se incorporan a un dispositivo que inyecta un fluido debajo de la capa cutánea.
Un dispositivo para retirar o administrar una sustancia a través de la piel ha sido descrito por Down y col y se enseña, por ejemplo, en la Patente EE. UU. 6.607.513. Según Down, los múltiples elementos de penetración en la piel que se incorporan al dispositivo tienen longitudes de aproximadamente 100 micras a aproximadamente 2000 micras y tienen un calibre de aproximadamente 30 a 50.
Un dispositivo para administrar una sustancia a la piel ha sido descrito por Palmer y col y se enseña, por ejemplo, en la Patente EE. UU. 6.537.242. Según Palmer, se incorpora una matriz de microagujas en el dispositivo que utiliza un conjunto de estiramiento para mejorar el contacto de las agujas con la piel y proporciona una administración más uniforme de la sustancia.
Zamoyski ha descrito un dispositivo de perfusión para la administración localizada de fármacos y se enseña, por ejemplo, en la Patente EE. UU. 6.468.247. Según Zamoyski, se incorporan múltiples agujas hipodérmicas al dispositivo que inyecta el contenido de las agujas hipodérmicas en un tejido a medida que se retraen dichas agujas hipodérmicas.
Prausnitz y col., han descrito un procedimiento para mejorar el transporte de fármacos y moléculas biológicas a través del tejido mediante la mejora de la interacción entre las microagujas y la piel humana y se enseña, por ejemplo, en la Patente EE. UU. 6.743.211.. Según Prausnitz, se incorporan múltiples microagujas en un dispositivo que es capaz de presentar una superficie más rígida y menos deformable sobre la que se aplican las microagujas.
Un dispositivo para la administración intraorgánica de agentes medicinales ha sido descrito por Ting y col y se enseña, por ejemplo, en la Patente EE. UU. 6.077.251. Según Ting, se incorporan múltiples agujas que tienen aberturas laterales para mejorar la administración en un dispositivo que, al extender y retraer dichas agujas desde y hacia la cámara de la aguja, fuerza un agente medicinal desde un depósito hacia dichas agujas e inyecta dicho agente medicinal en un órgano diana.
Brown ha descrito un portaagujas múltiple y un puerto de infusión de múltiples canales subcutáneos y se enseña, por ejemplo, en la Patente EE. UU. 4.695.273. Según Brown, múltiples agujas en el portaagujas se insertan a través del tabique del puerto de infusión y se comunican con cámaras aisladas en dicho puerto de infusión.
Una jeringa hipodérmica doble ha sido descrita por Horn y se enseña, por ejemplo, en la Patente EE. UU. 3.552.394. Según Horn, dos agujas incorporadas en el dispositivo están separadas menos de 68 mm y pueden ser de diferentes estilos y longitudes, lo que permite realizar inyecciones a diferentes profundidades.
Hershberg ha descrito una jeringa con múltiples agujas y múltiples compartimentos de fluidos y se enseña, por ejemplo, en la Patente EE. Uu . 3.572.336. Según Hershberg, se incorporan múltiples agujas a la jeringa que tiene múltiples compartimentos de fluidos y es capaz de administrar simultáneamente fármacos incompatibles que no se pueden mezclar para una inyección.
Un instrumento quirúrgico para la inyección intradérmica de fluidos ha sido descrito por Eliscu y col. y se enseña, por ejemplo, en la Patente EE. UU. 2.588.623. Según Eliscu, se incorporan múltiples agujas al instrumento que inyecta fluidos por vía intradérmica con una dispersión más amplia.
Hung ha descrito un aparato para el suministro simultáneo de una sustancia a múltiples conductos de leche materna y se enseña, por ejemplo, en EP 1818017. Según Hung, se incorporan múltiples lúmenes en el dispositivo que se inserta a través de los orificios de las redes ductales y suministra un fluido a las redes ductales.
Tkebuchava ha descrito un catéter para la introducción de medicamentos en el tejido de un corazón u otros órganos y se enseña, por ejemplo, en WO2006138109. Según Tkebuchava, se incorporan dos agujas curvas que penetran en la pared del órgano en una trayectoria aplanada.
Dispositivos para administrar agentes médicos han sido descritos por Mckay y col. y se enseñan, por ejemplo, en WO2006118804. Según Mckay, se incorporan múltiples agujas con múltiples orificios en cada aguja a los dispositivos para facilitar la administración regional a un tejido, como el espacio discal interior de un disco espinal.
Pettis ha descrito un procedimiento para administrar directamente una sustancia inmunomoduladora en un espacio intradérmico dentro de la piel de un mamífero y se enseña, por ejemplo, en WO2004020014. Según Pettis, se incorporan múltiples agujas en un dispositivo que administra la sustancia a través de las agujas a una profundidad de entre 0,3 mm y 2 mm.
Procedimientos y dispositivos para la administración de sustancias en al menos dos compartimentos en la piel para absorción sistémica y farmacocinética mejorada han sido descritos por Pettis y col. y se enseñan, por ejemplo, en WO2003094995 Según Pettis, múltiples agujas que tienen longitudes entre aproximadamente 300 pm y aproximadamente 5 mm se incorporan en un dispositivo que administra a los compartimentos de tejido intradérmico y subcutáneo simultáneamente.
Un dispositivo de administración de fármacos con agujas y un rodillo ha sido descrito por Zimmerman y col. y se enseña, por ejemplo, en WO2012006259. Según Zimmerman, múltiples agujas huecas colocadas en un rodillo se incorporan al dispositivo que entrega el contenido en un depósito a través de las agujas a medida que gira el rodillo.
Procedimientos y dispositivos que utilizan catéteres y/o lúmenes
Pueden emplearse procedimientos y dispositivos que usan catéteres y lúmenes para administrar los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la presente descripción en un programa de dosificación único, múltiple o dividido. Dichos procedimientos y dispositivos se describen a continuación.
Jacoby y col. han descrito una administración, basada en catéter, de mioblastos esqueléticos al miocardio de corazones dañados y se enseña, por ejemplo, en la Publicación de Patente EE. UU. 20060263338. Según Jacoby, se incorporan múltiples agujas en el dispositivo, al menos una parte de las cuales se inserta en un vaso sanguíneo y administra la composición celular a través de las agujas en la región localizada del corazón del sujeto.
Un aparato para tratar el asma usando neurotoxina ha sido descrito por Deem y col y se enseña, por ejemplo, en la Publicación de Patente EE. UU. 20060225742. Según Deem, se incorporan múltiples agujas en el dispositivo que administra neurotoxina a través de las agujas al tejido bronquial.
Nayak ha descrito un procedimiento para administrar terapias de componentes múltiples y se enseña, por ejemplo, en la Patente EE. UU. 7.699.803. Según Nayak, se pueden incorporar múltiples cánulas de inyección en un dispositivo donde se pueden incluir ranuras de profundidad para controlar la profundidad a la que se administra la sustancia terapéutica dentro del tejido.
Un dispositivo quirúrgico para la ablación de un canal y la administración de al menos un agente terapéutico en una región deseada del tejido ha sido descrito por McIntyre y col y se enseña, por ejemplo, en la Patente EE. UU.
8.012.096. Según McIntyre, se incorporan múltiples agujas al dispositivo que dispensa un agente terapéutico en una región de tejido que rodea el canal y es particularmente adecuado para operaciones de revascularización transmiocárdica.
Procedimientos para tratar los trastornos funcionales de la vejiga en hembras de mamífero han sido descritos por Versi y col. y se enseñan, por ejemplo, en la Patente EE. UU. 8.029.496. Según Versi, se incorpora una matriz de microagujas en un dispositivo que administra un agente terapéutico a través de las agujas directamente al trígono de la vejiga.
Un dispositivo y un procedimiento para administrar fluidos en una barrera biológica flexible han sido descritos por Yeshurun y col. y se enseñan, por ejemplo, en las Patentes EE. UU. 7.998.119 (dispositivo) y 8.007.466 (procedimiento). Según Yeshurun, las microagujas del dispositivo penetran y se extienden dentro de la barrera biológica flexible y se inyecta líquido a través del orificio de las microagujas huecas.
Un procedimiento para inyectar epicárdicamente una sustancia en un área de tejido de un corazón que tiene una superficie epicárdica y está dispuesta dentro de un torso ha sido descrito por Bonner y col y se enseña, por ejemplo, en la Patente EE. u U. 7.628.780. Según Bonner, los dispositivos tienen ejes alargados y cabezales de inyección distales para introducir agujas en el tejido e inyectar agentes médicos en el tejido a través de las agujas.
Un dispositivo para sellar un pinchazo ha sido descrito por Nielsen y col y se enseña, por ejemplo, en la Patente EE. UU. 7.972.358. Según Nielsen, se incorporan múltiples agujas en el dispositivo que administra un agente de cierre en el tejido que rodea el tracto de la punción.
Un procedimiento para la miogénesis y la angiogénesis ha sido descrito por Chiu y col. y se enseña, por ejemplo, en la Patente EE. UU. 6.551.338. Según Chiu, se incorporan de 5 a 15 agujas que tienen un diámetro máximo de al menos 1,25 mm y una longitud efectiva para proporcionar una profundidad de punción de 6 a 20 mm en un dispositivo que se inserta en la proximidad de un miocardio y suministra un factor angiogénico o miogénico exógeno a dicho miocardio a través de los conductos que se encuentran en al menos algunas de dichas agujas.
Un procedimiento para el tratamiento del tejido prostático ha sido descrito por Bolmsj y col. y se enseña, por ejemplo, en la Patente EE. UU. 6.524.270. Según Bolmsj, un dispositivo que comprende un catéter que se inserta a través de la uretra tiene al menos una punta hueca extensible hacia el tejido prostático circundante. Se administra un medicamento astringente y analgésico a través de dicha punta en dicho tejido prostático.
Un procedimiento para infundir fluidos a un sitio intraóseo ha sido descrito por Findlay y col. y se enseña, por ejemplo, en la Patente EE. UU. 6.761.726. Según Findlay, se incorporan múltiples agujas en un dispositivo que es capaz de penetrar una cubierta dura de material cubierta por una capa de material blando y suministra un fluido a una distancia predeterminada por debajo de dicha cubierta dura de material.
Un dispositivo para inyectar medicamentos en la pared de un vaso ha sido descrito por Vigil y col. y se enseña, por ejemplo, en la Patente EE. UU. 5.713.863. Según Vigil, se montan múltiples inyectores en cada uno de los tubos flexibles del dispositivo que introduce un fluido de medicamento a través de un catéter de múltiples lúmenes, dentro de dichos tubos flexibles y fuera de dichos inyectores para su infusión en la pared del vaso.
Un catéter para la administración terapéutica y/o agentes de diagnóstico para el tejido que rodea un pasaje corporal ha sido descrito por Faxon y col. y se enseña, por ejemplo, en la Patente EE. UU. 5.464.395. Según Faxon, se incorpora al catéter al menos una cánula de aguja que suministra los agentes deseados al tejido a través de dichas agujas que sobresalen del catéter.
Orr ha descrito catéteres con globo para administrar agentes terapéuticos y se enseñan, por ejemplo, en WO2010024871. Según Orr, se incorporan múltiples agujas en los dispositivos que administran los agentes terapéuticos a diferentes profundidades dentro del tejido.
Procedimientos y dispositivos que utilizan corriente eléctrica.
Se pueden emplear procedimientos y dispositivos que utilizan corriente eléctrica para administrar los ácidos nucleicos modificados, el ARN modificado mejorado o los ácidos ribonucleicos de la presente divulgación según los regímenes de dosificación individuales, múltiples o divididos que se enseñan en esta invención. Dichos procedimientos y dispositivos se describen a continuación.
Márquez ha descrito un dispositivo de terapia de inducción de electrocolágeno y se enseña, por ejemplo, en la Publicación de Patente EE. Uu .20090137945. Según Márquez, se incorporan múltiples agujas en el dispositivo que perforan repetidamente la piel y extraen a la piel una porción de la sustancia que se aplica primero a la piel.
Un sistema electrocinético ha sido descrito por Etheredge y col. y se enseña, por ejemplo, en la Publicación de Patente EE. UU. 20070185432. Según Etheredge, las microagujas se incorporan a un dispositivo que impulsa el medicamento mediante una corriente eléctrica a través de las agujas hacia el sitio de tratamiento diana.
Un dispositivo de iontoforesis ha sido descrito por Matsumura y col. y se enseña, por ejemplo, en la Patente EE. UU.
7.437.189. Según Matsumura, se incorporan múltiples agujas en el dispositivo que es capaz de administrar medicamentos ionizables en un cuerpo vivo a mayor velocidad o con mayor eficiencia.
La administración intradérmica de agentes biológicamente activos mediante inyección sin aguja y electroporación ha sido descrita por Hoffmann y col y se enseña, por ejemplo, en la Patente EE. UU. 7.171.264. Según Hoffmann, se incorporan uno o más inyectores sin aguja en un dispositivo de electroporación y la combinación de inyección sin aguja y electroporación es suficiente para introducir el agente en las células de la piel, el músculo o la mucosa.
Un procedimiento para el suministro intracelular mediado por electropermeabilización ha sido descrito por Lundkvist y col. y se enseña, por ejemplo, en la Patente EE. UU. 6.625.486. Según Lundkvist, se incorpora un par de electrodos de aguja en un catéter. Dicho catéter se coloca en un lumen del cuerpo seguido de la extensión de dichos electrodos de aguja para penetrar en el tejido que rodea dicho lumen. Luego, el dispositivo introduce un agente a través de al menos uno de dichos electrodos de aguja y aplica un campo eléctrico mediante dicho par de electrodos de aguja para permitir que dicho agente pase a través de las membranas celulares hacia las células en el sitio de tratamiento.
Un sistema de administración para la inmunización transdérmica ha sido descrito por Levin y col. y se enseña por ejemplo en WO2006003659 Según Levin, se incorporan múltiples electrodos en el dispositivo que aplica energía eléctrica entre los electrodos para generar microcanales en la piel para facilitar la administración transdérmica.
Schomacker ha descrito un procedimiento para suministrar energía de RF a la piel y se enseña, por ejemplo, en WO2011163264. Según Schomacker, se incorporan varias agujas en un dispositivo que aplica vacío para hacer que la piel entre en contacto con una placa, de modo que las agujas se inserten en la piel a través de los orificios de la placa y emitan energía de radiofrecuencia.
Definiciones
En varios lugares de la presente memoria descriptiva, los sustituyentes de los compuestos de la presente divulgación se describen en grupos o en intervalos. Se pretende específicamente que la presente divulgación incluya todas y cada una de las subcombinaciones individuales de los miembros de dichos grupos e intervalos. Por ejemplo, el término "alquilo C1-6 " está destinado específicamente a describir individualmente metilo, etilo, alquilo C3 , alquilo C4 , alquilo C5 , y alquilo C6.
Alrededor de: Como se usa en esta invención, el término "alrededor de" significa /- 10 % del valor enumerado.
Animal: Tal como se usa en esta invención, el término "animal" se refiere a cualquier miembro del reino animal. En algunos casos, "animal" se refiere a seres humanos en cualquier etapa de desarrollo. En algunos casos, "animal" se refiere a animales no-humanos en cualquier etapa de desarrollo. En ciertos casos, el animal no humano es un mamífero (por ejemplo, un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, un ganado vacuno, un primate o un cerdo). En algunos casos, los animales incluyen, entre otros, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces y gusanos. En algunos casos, el animal es un animal transgénico, un animal modificado genéticamente o un clon.
Aproximadamente: Tal como se usa en esta invención, la expresión “aproximadamente” o “alrededor de”, según se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia indicado. En determinados casos, la expresión “aproximadamente” o “alrededor de” se refiere a un intervalo de valores que se encuentra dentro del 25, el 20, el 19, el 18, el 17, el 16, el 15, el 14, el 13, el 12, el 11, el 10, el 9, el 8, el 7, el 6, el 5, el 4, el 3, el 2, el 1 % o menos en cualquier dirección (mayor o menor) del valor de referencia indicado, a menos que se indique lo contrario, o resulte evidente lo contrario a partir del contexto (salvo donde dicho número supere el 100 % de un valor posible).
Asociado con: Tal como se usa en esta invención, los términos "asociado con", "conjugado", "enlazado", "unido" y "anclado", cuando se usan con respecto a dos o más restos, significa que los restos están físicamente asociados o conectados entre sí, ya sea directamente o mediante uno o más restos adicionales que sirven como agente de enlace, para formar una estructura que sea suficientemente estable de modo que los restos permanezcan físicamente asociados en las condiciones donde se usa la estructura, por ejemplo, condiciones fisiológicas. Una "asociación" no tiene por qué ser estrictamente mediante un enlace químico covalente directo. También puede sugerir enlaces iónicos o de hidrógeno o una conectividad basada en hibridación suficientemente estable de modo que las entidades "asociadas" permanezcan físicamente asociadas.
Auxotrófico: Como se usa en esta invención, el término "auxotrófico" se refiere a ARNm que comprende al menos una característica que desencadena o induce la degradación o inactivación del ARNm de modo que la expresión de la proteína se impide o reduce sustancialmente en un tejido u órgano seleccionado.
Bifuncional: Tal como se usa en esta invención, el término "bifuncional" se refiere a cualquier sustancia, molécula o resto que sea capaz de o mantenga al menos dos funciones. Las funciones pueden afectar el mismo resultado o un resultado diferente. La estructura que produce la función puede ser la misma o diferente. Por ejemplo, los ARN modificados bifuncionales de la presente divulgación pueden codificar un péptido citotóxico (una primera función) mientras que los nucleósidos que comprenden el ARN codificante son, en y por sí mismos, citotóxicos (segunda función). En este ejemplo, la administración del ARN modificado bifuncional a una célula cancerosa produciría no solo un péptido o molécula de proteína que podría mejorar o tratar el cáncer, sino que también entregaría una carga citotóxica de nucleósidos a la célula en caso de degradación, en lugar de traducción del ARN modificado.
Biocompatible: Tal como se usa en esta invención, el término "biocompatible" significa compatible con células, tejidos, órganos o sistemas vivos que presentan poco o ningún riesgo de lesión, toxicidad o rechazo por parte del sistema inmunológico.
Biodegradable: Tal como se usa en esta invención, el término "biodegradable" significa que puede descomponerse en productos inocuos por la acción de seres vivos.
Biológicamente activo: Tal como se usa en esta invención, la frase "biológicamente activo" se refiere a una característica de cualquier sustancia que tenga actividad en un sistema y/u organismo biológico. Por ejemplo, una sustancia que, cuando se administra a un organismo, tiene un efecto biológico sobre ese organismo, se considera biológicamente activa. En realizaciones particulares, un polinucleótido de la presente invención puede considerarse biológicamente activo si incluso una parte de los polinucleótidos es biológicamente activa o imita una actividad considerada biológicamente relevante.
Términos químicos: A continuación se proporciona la definición de varios términos químicos desde "acilo" hasta "tiol".
El término "acilo", tal como se usa en esta invención, representa un grupo hidrógeno o alquilo (por ejemplo, un grupo haloalquilo), tal como se definen en esta invención, que está acoplado al grupo molecular original a través de un grupo carbonilo, tal como se define en esta invención, y un ejemplo de este es formilo (es decir, un grupo carboxialdehído), acetilo, propionilo, butanoilo y similares. Grupos acilo no sustituidos ejemplares incluyen de 1 a 7, de 1 a 11, o de 1 a 21 carbonos. En algunos casos, el grupo alquilo se sustituye adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes como se describe en esta invención.
El término "acilamino", como se usa en esta invención, representa un grupo acilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular original a través de un grupo amino, como se define en esta invención (es decir, -N(RN1)-C(O)-R, donde R es H o un grupo alquilo C1-6, C1-10, o C1-20 opcionalmente sustituido y RN1 es como se define en esta invención). Grupos acilamino no sustituidos ejemplares incluyen de 1 a 41 carbonos (por ejemplo, de 1 a 7, de 1 a 13, de 1 a 21, de 2 a 7, de 2 a 13, de 2 a 21 o de 2 a 41 carbonos) . En algunos casos, el grupo alquilo se sustituye adicionalmente con 1,2, 3 o 4 sustituyentes como se describe en esta invención, y/o el grupo amino es -NH2 o -NHRN1, donde RN1 es, independientemente, OH, NO2, NH2, NRN22, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, alquilo, o arilo, y cada RN2 puede ser H, alquilo, o arilo.
El grupo "aciloxi", como se usa en esta invención, representa un grupo acilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular de origen a través de un átomo de oxígeno (es decir, -O-C(O)-R, donde R es H o nun grupo alquilo C1-6, C1-10, o C1-20 opcionalmente sustituido). Grupos aciloxi no sustituidos ejemplares incluyen de 1 a 21 carbonos (por ejemplo, de 1 a 7 o de 1 a 11 carbonos). En algunos casos, el grupo alquilo se sustituye adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes como se describe en esta invención, y/o el grupo amino es -NH2 o -NHRN1, donde RN1 es, independientemente, OH, NO2, NH2, NRN22, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, alquilo, o arilo, y cada RN2 puede ser H, alquilo, o arilo.
El término "alcarilo", como se usa en esta invención, representa un grupo arilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular principal a través de un grupo alquileno, como se define en esta invención. Grupos alcarilo no sustituidos ejemplares son de 7 a 30 carbonos (por ejemplo, de 7 a 16 o de 7 a 20 carbonos, tales como C1-6 alc-C6-10 arilo, C1-10 alc-C6-10 arilo, o C1-20 alc-C6-10 arilo). En algunos casos, el alquileno y el arilo pueden estar sustituidos cada uno con 1, 2, 3 ó 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención para los grupos respectivos. Otros grupos precedidos por el prefijo "alc-" se definen de la misma manera, donde "alc" se refiere a un C1-6 alquileno, a menos que se indique lo contrario, y la estructura química adjunta es como se define en esta invención.
El término "alkcicloalquilo" representa un grupo cicloalquilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular principal a través de un grupo alquileno, como se define en esta invención (por ejemplo, un grupo alquileno de 1 a 4, de 1 a 6, de 1 a 10, o formar de 1 a 20 carbonos). En algunos casos, el alquileno y el cicloalquilo pueden estar sustituidos cada uno con 1, 2, 3 ó 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención para el grupo respectivo.
El término "alquenilo", como se usa en esta invención, representa grupos monovalentes de cadena lineal o ramificada de, a menos que se especifique lo contrario, de 2 a 20 carbonos (por ejemplo, de 2 a 6 o de 2 a 10 carbonos) que contienen uno o más carbonos dobles enlaces de carbono y se ejemplifica por etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo, 2-metil-1-propenilo, 1-butenilo, 2-butenilo y similares. Los alquenilos incluyen isómeros tanto cis como trans. Los grupos alquenilo pueden estar opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes que se seleccionan, independientemente, de entre amino, arilo, cicloalquilo o heterociclilo (por ejemplo, heteroarilo), como se define en esta invención, o cualquiera de los grupos sustituyentes alquilo ejemplares descritos en esta invención.
[0775 El grupo "alqueniloxi", que como se usa en esta invención, representa un sustituyente químico de fórmula -OR, donde R es un grupo alquenilo C2-20 (p.ej., C2-6 o C2-10 alquenilo), a menos que se especifique lo contrario.. Grupos alqueniloxi ejemplares incluyen eteniloxi, propeniloxi y similares. En algunos casos, el grupo alquenilo se puede sustituir adicionalmente con 1,2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención (p. ej., un grupo hidroxi).
El término "heteroarilalquilo" se refiere a un grupo heteroarilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular de origen a través de un grupo alquileno, como se define en esta invención. Grupos heteroarilalquilo no sustituidos ejemplares son de 2 a 32 carbonos (por ejemplo, de 2 a 22, de 2 a 18, de 2 a 17, de 2 a 16, de 3 a 15, de 2 a 14, de 2 a 13 o de 2 a 12 carbonos, tales como C1-6 alc-C1-12 heteroarilo, C1-10 alc-C1-12 heteroarilo, o C1-20 alc-C1-12 heteroarilo). En algunos casos, el alquileno y el heteroarilo pueden estar sustituidos cada uno con 1,2, 3 ó 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención para el grupo respectivo. Los grupos alqueteroarilo son un subconjunto de los grupos alqueterociclilo.
El término "alqueterociclilo" representa un grupo heterociclilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular original a través de un grupo alquileno, como se define en esta invención. Grupos alqueterociclilo sin sustituir ejemplares son de 2 a 32 carbonos (por ejemplo, de 2 a 22, de 2 a 18, de 2 a 17, de 2 a 16, de 3 a 15, de 2 a 14, de 2 a 13, o de 2 a 12 carbonos, como C1-6 alc-C1-12 heterociclilo, C1-10 alc-C1-12 heterociclilo, o C1-20 alc-C1-12 heterociclilo). En algunos casos, el alquileno y el heterociclilo pueden estar sustituidos cada uno con 1, 2, 3 ó 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención para el grupo respectivo.
El término "alcoxi" representa un sustituyente químico de fórmula -OR, donde R es un grupo alquilo C1-20 (p.ej., C1-6 o C1-10 alquilo), a menos que se especifique lo contrario.. Grupos alcoxi ejemplares incluyen metoxi, etoxi, propoxi (p. ej., n-propoxi e isopropoxi), t-butoxi y similares. En algunos casos, el grupo alquilo se puede sustituir adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención (p. ej., hidroxi o alcoxi).
El grupo "alcoxialcoxi" representa un grupo alcoxi que está sustituido con un grupo alcoxi. Grupos alcoxialcoxi no sustituidos ejemplares incluyen entre 2 y 40 carbonos (por ejemplo, de 2 a 12 o de 2 a 20 carbonos, como C1-6 alcoxi-C1-6 alcoxi, C1-10 alcoxi-C1-10 alcoxi, o C1-20 alcoxi-C1-20 alcoxi). En algunos casos, cada grupo alcoxi se puede sustituir adicionalmente con 1,2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención.
El grupo "alcoxialquilo" representa un grupo alquilo que está sustituido con un grupo alcoxi. Grupos alcoxialquilo no sustituidos ejemplares incluyen entre 2 a 40 carbonos (por ejemplo, de 2 a 12 o de 2 a 20 carbonos, tal como C1-6 alcoxi-C1-6 alquilo, C1-10 alcoxi-C1-10 alquilo, o C1-20 alcoxi-C1-20 alquilo). En algunos casos, el alquilo y el alcoxi pueden estar sustituidos cada uno con 1, 2, 3 ó 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención para el grupo respectivo.
El término "alcoxicarbonilo", como se usa en esta invención, representa un alcoxi, como se define en esta invención, unido al grupo molecular principal a través de un átomo de carbonilo (por ejemplo, -C(O)-OR, donde R es H o un grupo alquilo C1-6, C1-10, o C1-20 opcionalmente sustituido). Alcoxicarbonilos no sustituidos ejemplares incluyen de 1 a 21 carbonos (por ejemplo, de 1 a 11 o de 1 a 7 carbonos). En algunos casos, el grupo alcoxi se sustituye adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes como se describe en esta invención.
El grupo "alcoxicarbonilalcoxi", como se usa en esta invención, representa un grupo alcoxi, como se define en esta invención, que está sustituido con un grupo alcoxicarbonilo, como se define en esta invención (por ejemplo, -O-alquilo-C(O)-OR, donde R es un grupo alquilo C1-6, C1-10, o C1-20 opcionalmente sustituido). Grupos alcoxicarbonilalcoxi no sustituidos ejemplares incluyen de 3 a 41 carbonos (p. ej., de 3 a 10, de 3 a 13, de 3 a 17, de 3 a 21 o de 3 a 31 carbonos, como C1-6 alcoxicarbonilo-C1-6 alcoxi, C1-10 alcoxicarbonilo-C1-10 alcoxi, o C1-20 alcoxicarbonilo-C1-20 alcoxi). En algunos casos, cada grupo alcoxi está además sustituido de forma independiente con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes, como se describe en esta invención (p. ej., un grupo hidroxi).
El término "alcoxicarbonilalquilo", como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, que está sustituido con un grupo alcoxicarbonilo, como se define en esta invención (por ejemplo, -alquilo-C(O)-OR, donde R es un grupo alquilo C1-20, C1-10, o C1-6 opcionalmente sustituido). Alcoxicarbonilalquilos no sustituidos ejemplares incluyen de 3 a 41 carbonos (p. ej., de 3 a 10, de 3 a 13, de 3 a 17, de 3 a 21 o de 3 a 31 carbonos, como C1-6 alcoxicarbonilo-C1-6 alquilo, C1-10 alcoxicarbonilo-C1-10 alquilo, o C1-20 alcoxicarbonilo-C1-20 alquilo). En algunos casos, cada grupo alquilo y alcoxi está además sustituido independientemente con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes como se describe en esta invención (p. ej., un grupo hidroxi).
El término "alquilo", como se usa en esta invención, incluye grupos saturados tanto de cadena lineal como de cadena ramificada de 1 a 20 carbonos (por ejemplo, de 1 a 10 o de 1 a 6), a menos que se especifique lo contrario. Los grupos alquilo son ejemplos de metilo, etilo, n- e isopropilo, n-, sec-, iso- y terc-butilo, neopentilo y similares, y pueden estar opcionalmente sustituidos con uno, dos, tres o, en el caso de grupos alquilo de dos carbonos o más, cuatro sustituyentes seleccionados independientemente de entre el grupo que consiste en: (1) C1-6 alcoxi; (2) C1-6 alquilsulfinil; (3) amino, como se define en esta invención (e.g., amino no sustituido (i.e., -NH2) o un amino sustituido (i.e., -N(RN1)2, donde RN1 es como definido para amino); (4) C6-10 arilo-C1-6 alcoxi; (5) azido; (6) halo; (7) (C2-9 heterociclil)oxi; (8) hidroxi; (9) nitro; (10) oxo (e.g., carboxialdehido o acilo); (11) C1-7 espirociclilo; (12) tioalcoxi; (13) tiol; (14) -CO2RA', donde RA' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) C1-20 alquilo (e.g., C1-6 alquilo), (b) C2-20 alquenilo (e.g., C2-6 alquenilo), (c) C6-10 arilo, (d) hidrógeno, (e) C1-6 alq-C6-10 arilo, (f) amino-C1-20 alquilo, (g) polietilenglicol de -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', donde s1 es un entero de 1 a 10 (e.g., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (e.g., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y R' es H o C1-20 alquilo, y (h) amino-polietilenglicol de - NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, donde s1 es un entero de 1 a 10 (e.g., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (e.g., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y cada RN1 es, independientemente, hidrógeno o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido; (15) -C(O)NRB'RC', donde cada uno de RB' y RC' es, independientemente, seleccionado de entre el grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) C1-6 alquilo, (c) C6-10 arilo, y (d) C1-6 alq-C6-10 arilo; (16) -SO2RD', donde RD' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) C1-6 alquilo, (b) C6-10 arilo, (c) C1-6 alq-C6-10 arilo, y (d) hidroxi; (17) -SO2NRE'RF', donde cada uno de RE' y RF' es, independientemente, seleccionado de entre el grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) C1-6 alquilo, (c) C6-10 arilo y (d) C1-6 alq-C6-10 arilo; (18) -C(O)RG', donde RG' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) C1-20 alquilo (e.g., C1-6 alquilo), (b) C2-20 alquenilo (e.g., C2-6 alquenilo), (c) C6-10 arilo, (d) hidrógeno, (e) C1-6 alq-C6-10 arilo, (f) amino-C1-20 alquilo, (g) polietilenglicol de -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', donde s1 es un entero de 1 a 10 (e.g., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (e.g., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y R' es H o C1-20 alquilo, y (h) amino-polietilenglicol de -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, donde s1 es un entero de 1 a 10 (e.g., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (e.g., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y cada RN1 es, independientemente, hidrógeno o opcionalmente sustituido C1-6 alquilo; (19) -NRH'C(O)RI', donde RH' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a1) hidrógeno y (b1) C1-6 alquilo, y RI' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a2) C1-20 alquilo (e.g., C1-6 alquilo), (b2) C2-20 alquenilo (e.g., C2-6 alquenilo), (c2) C6-10 arilo, (d2) hidrógeno, (e2) C1-6 alq-C6-10 arilo, (f2) amino-C1-20 alquilo, (g2) polietilenglicol of -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', donde s1 es un entero de 1 a 10 (e.g., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (e.g., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y R' es H o C1-20 alquilo, y (h2) amino-polietilenglicol de -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, donde s1 es un entero de 1 a 10 (e.g., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (e.g., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y cada RN1 is, independientemente, hidrógeno o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido; (20) -NRJ'C(O)ORK', donde RJ' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a1) hidrógeno y (b1) C1-6 alquilo, y RK' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a2) C1-20 alquilo (e.g., C1-6 alquilo), (b2) C2-20 alquenilo (e.g., C2-6 alquenilo), (c2) C6-10 arilo, (d2) hidrógeno, (e2) C1-6 alq-C6-10 arilo, (f2) amino-C1-20 alquilo, (g2) polietilenglicol de -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', donde s1 es un entero de 1 a 10 (e.g., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (e.g., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y R' is H o C1-20 alquilo, y (h2) amino-polietilenglicol de -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, donde s1 es un entero de 1 a 10 (e.g., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (e.g., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y cada RN1 es, independientemente, hidrógeno or opcionalmente sustituido C1-6 alquilo; y (21) amidina. En algunas realizaciones, cada uno de estos grupos puede sustituirse adicionalmente como se describe en esta invención. Por ejemplo, el grupo alquileno de un C1-alcarilo puede sustituirse adicionalmente con un grupo oxo para proporcionar el sustituyente ariloílo respectivo.
El término "alquileno", como se usa en esta invención, representa un grupo hidrocarburo divalente saturado derivado de un hidrocarburo saturado de cadena lineal o ramificada mediante la eliminación de dos átomos de hidrógeno, y está ejemplificado por metileno, etileno, isopropileno y similares. El término "Cx-y alquileno" y el prefijo "Cx-y alq-" representan grupos alquileno que tienen carbonos entre x y . Valores ejemplares para x son 1, 2, 3, 4, 5 y 6, y los valores ejemplares para y son 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, o 20 (por ejemplo, C1-6, C1-10, C2-20, C2-6, C2-10, o C2-20 alquileno). En algunas realizaciones, el alquileno puede estar adicionalmente sustituido con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención para un grupo alquilo.
El grupo "alquilsulfinilo", que como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo unido al grupo molecular de origen a través de un grupo -S (O) -. Grupos alquilsulfinilo no sustituidos ejemplares son de 1 a 6, de 1 a 10 o de 1 a 20 carbonos. En algunos casos, el grupo alquilo se puede sustituir adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención.
El grupo "alquilsulfinilalquilo", como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, sustituido con un grupo alquilsulfinilo. Grupos alquilsulfinilalquilo no sustituidos ejemplares son de 2 a 12, de 2 a 20 o de 2 a 40 carbonos. En algunas realizaciones, cada grupo alquilo puede estar sustituido con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención.
El término "alquinilo", como se usa en esta invención, representa grupos monovalentes de cadena lineal o ramificada de 2 a 20 átomos de carbono (por ejemplo, de 2 a 4, de 2 a 6 o de 2 a 10 carbonos) que contienen un carbono-carbono triple enlace y está ejemplificado por etinilo, 1-propinilo y similares. Los grupos alquinilo pueden estar opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes que se seleccionan, independientemente, de entre arilo, cicloalquilo o heterociclilo (p. ej., heteroarilo), como se define en esta invención, o cualquiera de los ejemplos de grupos sustituyentes alquilo descritos en esta invención. .
El grupo "alquiniloxi", que como se usa en esta invención, representan un sustituyente químico de fórmula -OR, donde
R es un grupo alquinilo C2-20 (p.ej., C2-6 o C2-10 alquinilo), a menos que se especifique lo contrario.. Grupos alquiniloxi ejemplares incluyen etiniloxi, propiniloxi y similares. En algunos casos, el grupo alquinilo puede estar adicionalmente sustituido con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención (por ejemplo, un grupo hidroxi).
El término "amidina", como se usa en esta invención, representa un grupo -C(=NH)NH2.
El término "amino," como se usa en esta invención, representa -N(RN1)2, donde cada RN1 es, independientemente, H, OH, NO2, N(RN2)2, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, un grupo N-protector, alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, arilo, alcarilo, cicloalquilo, alccicloalquilo, carboxialquilo, sulfoalquilo, heterociclilo (p. ej., heteroarilo) o alqueterociclilo (p. ej., alqueteroarilo), en el que cada uno de estos grupos RN1 citados puede estar opcionalmente sustituido, como definido aquí para cada grupo; o dos RN1 se combinan para formar un heterociclilo o un grupo protector de N, y donde cada
RN2 es, independientemente, H, alquilo, o arilo. Los grupos amino de la divulgación pueden ser un grupo amino no sustituido (es decir, -NH2) o un amino sustituido (es decir, -N(RN1)2). En un caso preferido, amino es -NH2 o -NHRN1, donde RN1 es, independientemente, OH, NO2, NH2, NRN22, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, alquilo, carboxialquilo, sulfoalquilo o arilo, y cada RN2 puede ser H, C1-20 alquilo (e.g., C1-6 alquilo), o C6-10 arilo.
El término "aminoácido", como se describe en esta invención, se refiere a una molécula que tiene una cadena lateral, un grupo amino y un grupo ácido (por ejemplo, un grupo carboxi de —CO2H o un grupo sulfo de —SO3H), donde el aminoácido está unido al grupo molecular de origen por la cadena lateral, el grupo amino o el grupo ácido (por ejemplo, la cadena lateral). En algunos casos, el aminoácido está unido al grupo molecular de origen mediante un grupo carbonilo, donde la cadena lateral o el grupo amino está unido al grupo carbonilo. Cadenas laterales ejemplares incluyen un alquilo, arilo, heterociclilo, alcarilo, alqueterociclilo, aminoalquilo, carbamoilalquilo y carboxialquilo opcionalmente sustituidos. Aminoácidos ejemplares incluyen alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, hidroxinorvalina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, norvalina, ornitina, fenilalanina, prolina, pirrolisina, selenocisteína, serina, taurina, treonina, triptófano, tirosina y valina. Los grupos de aminoácidos pueden estar opcionalmente sustituidos con uno, dos, tres o, en el caso de grupos de aminoácidos de dos carbonos o más, cuatro sustituyentes seleccionados independientemente de entre vel grupo que consiste en: (1)
C1-6 alcoxi; (2) C1-6 alquilsulfinil; (3) amino, como se define en esta invención (p.ej., amino no sustituido (i.e., -NH2) o un amino sustituido (i.e., -N(RN1)2, donde RN1 es como definido para amino); (4) C6-10 arilo-C1-6 alcoxi; (5) azido; (6) halo; (7) (C2-9 heterociclil)oxi; (8) hidroxi; (9) nitro; (10) oxo (p.ej., carboxialdehido o acil); (11) C1-7 spirociclil; (12) tioalcoxi; (13) tiol; (14) -CO2RA', donde RA' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) C1-20 alquilo (p.ej., C1-6 alquilo), (b) C2-20 alquenilo (p.ej., C2-6 alquenilo), (c) C6-10 arilo, (d) hidrógeno, (e) C1-6 alc-C6-10 arilo, (f) amino-C1-20 alquilo, (g) polietileno glicol de -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', donde s1 es un entero de 1 a 10 (p.ej., de 1 a 6 o de
1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (p.ej., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y R' es H o C1-20 alquilo, y (h) amino-polietileno glicol de - NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, donde s1 es un entero de 1 a 10 (p.ej., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a
10 (p.ej., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y cada RN1 es, independientemente, hidrógeno o opcionalmente sustituido C1-6 alquilo; (15) -C(O)NRB'RC', donde cada uno de RB' y RC' es, independientemente, seleccionado de entre el grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) C1-6 alquilo, (c) C6-10 arilo, y (d) C1-6 alc-C6-10 arilo;
(16) -SO2RD', donde RD' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) C1-6 alquilo, (b) C6-10 arilo, (c) C1-6 alc-C6-10 arilo, y (d) hidroxi; (17) -SO2NRE'RF', donde cada uno de RE' y RF' es, independientemente, seleccionado de entre el grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) C1-6 alquilo, (c) C6-10 arilo y (d) C1-6 alc-C6-10 arilo; (18) -C(O)RG', donde RG' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) C1-20 alquilo (p.ej., C1-6 alquilo), (b) C2-20 alquenilo (p.ej., C2-6 alquenilo), (c) C6-10 arilo, (d) hidrógeno, (e) C1-6 alc-C6-10 arilo, (f) amino-C1-20 alquilo, (g) polietileno glicol de -(CH2)s2(OcH2CH2)s1(CH2)s3OR', donde s1 es un entero de 1 a 10 (p.ej., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (p.ej., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y R' es H o C1-20 alquilo, y (h) amino-polietileno glicol de -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, donde s1 es un entero de 1 a 10 (p.ej., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (p.ej., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y cada RN1 es, independientemente, hidrógeno o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido;
(19) - NRH'C(O)RI', donde RH' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a1) hidrógeno y (b1) C1-6 alquilo, y R1' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a2) C1-20 alquilo (p.ej., C1-6 alquilo), (b2) C2-20 alquenilo (p.ej., C2-6 alquenilo), (c2) C6-10 arilo, (d2) hidrógeno, (e2) C1-6 alc-C6-10 arilo, (f2) amino-C1-20 alquilo, (g2) polietileno glicol de -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', donde s1 es un entero de 1 a 10 (p.ej., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (p.ej., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y R' es H o C1-20 alquilo, y (h2) amino-polietileno glicol de -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, donde s1 es un entero de 1 a 10 (p.ej., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (p.ej., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y cada RN1 es, independientemente, hidrógeno o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido;
(20) -NRJ'C(O)ORK', donde RJ' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a1) hidrógeno y (b1) C1-6 alquilo, y RK' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a2) C1-20 alquilo (p.ej., C1-6 alquilo), (b2) C2-20 alquenilo (p.ej., C26 alquenilo), (c2) C6-10 arilo, (d2) hidrógeno, (e2) Ci-6 alc-C6-io arilo, (f2) amino-Ci-20 alquilo, (g2) polietileno glicol de -(CH2)s2(OCH2cH2)si(CH2)s3OR', donde s1 es un entero de 1 a 10 (p.ej., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (p.ej., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y R' es H o C1-20 alquilo, y (h2) amino-polietileno glicol de - NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, donde s1 es un entero de 1 a 10 (p.ej., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (p.ej., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y cada RN1 es, independientemente, hidrógeno o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido; y (21) amidina. En algunos casos, cada uno de estos grupos puede sustituirse adicionalmente como se describe en esta invención.
El término «aminoalquilo», como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, sustituido por un grupo amino, como se define en esta invención. El alquilo y el amino pueden estar sustituidos cada uno adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención para el grupo respectivo (por ejemplo, CO2RA', donde RA' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) alquilo C1-6, (b) arilo C6-10, (c) hidrógeno, y (d) arilo C1-6 alc-C6-10, por ejemplo, carboxi).
El término «aminoalquilo», como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, sustituido por un grupo amino, como se define en esta invención. El alquilo y el amino pueden estar sustituidos cada uno adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención para el grupo respectivo (por ejemplo, CO2RA', donde RA' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) alquilo C1-6, (b) arilo C6-10, (c) hidrógeno, y (d) arilo C1-6 alc-C6-10, por ejemplo, carboxi).
El término "arilo", como se usa en esta invención, representa un sistema de anillo carbocíclico mono, bicíclico o multicíclico que tiene uno o dos anillos aromáticos y está ejemplificado por fenilo, naftilo, 1,2-dihidronaftilo, 1,2,3,4-tetrahidronaftilo, antracenilo, fenantrenilo, fluorenilo, indanilo, indenilo y similares, y pueden estar opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3, 4 o 5 sustituyentes seleccionados independientemente de entre el grupo que consiste en: (1) C1-7 acilo (p.ej., carboxialdehido); (2) C1-20 alquilo (p.ej., C1-6 alquilo, C1-6 alcoxi-C1-6 alquilo, C1-6 alquilsulfinil-C1-6 alquilo, amino-C1-6 alquilo, azido-C1-6 alquilo, (carboxialdehido)-C1-6 alquilo, halo-C1-6 alquilo (p.ej., perfluoroalquilo), hidroxi-C1-6 alquilo, nitro-C1-6 alquilo, o C1-6 tioalcoxi-C1-6 alquilo); (3) C1-20 alcoxi (p.ej., C1-6 alcoxi, tal como perfluoroalcoxi); (4) C1-6 alquilsulfinilo; (5) C6-10 arilo; (6) amino; (7) C1-6 alc-C6-10 arilo; (8) azido; (9) C3-8 cicloalquilo; (10) C1-6 alc-C3-8 cicloalquilo; (11) halo; (12) C1-12 heterociclilo (p.ej., C1-12 heteroarilo); (13) (C1-12 heterociclil)oxi; (14) hidroxi; (15) nitro; (16) C1-20 tioalcoxi (p.ej., C1-6 tioalcoxi); (17) —(CH2)qCO2RA', donde q es un entero de cero a cuatro, y RA' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) C1-6 alquilo, (b) C6-10 arilo, (c) hidrógeno, y (d) C1-6 alc-C6-10 arilo; (18) - (CH2)qCONRB'RC', donde q es un entero de cero a cuatro y donde RB' y RC' son independientemente seleccionados de entre el grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) C1-6 alquilo, (c) C6-10 arilo, y (d) C1-6 alc-C6-10 arilo; (19) —(CH2)qSO2RD', donde q es un entero de cero a cuatro y donde RD' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) alquilo, (b) C6-10 arilo, y (c) alc-C6-10 arilo; (20) —(CH2)qSO2NRE'RF', donde q es un entero de cero a cuatro y donde cada uno de RE' y RF' es, independientemente, seleccionado de entre el grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) C1-6 alquilo, (c) C6-10 arilo, y (d) C1-6 alc-C6-10 arilo; (21) tiol; (22) C6-10 ariloxi; (23) C3-8 cicloalcoxi; (24) C6-10 arilo-C1-6 alcoxi; (25) C1-6 alc-C1-12 heterociclilo (p.ej., C1-6 alc-C1-12 heteroarilo); (26) C2-20 alquenilo; y (27) C2-20 alquinilo. En algunas realizaciones, cada uno de estos grupos puede sustituirse adicionalmente como se describe en esta invención. Por ejemplo, el grupo alquileno de un C1-alcarilo o un C1-alqueterociclilo se puede sustituir adicionalmente con un grupo oxo para producir el respectivo grupo sustituyente ariloílo y (heterociclil)oílo.
El término "arilalcoxi", como se usa en esta invención, significa un grupo alcarilo, como se define en esta invención, unido al resto molecular parental a través de un átomo de oxígeno. Grupos alcoxialquilo no sustituidos ejemplares incluyen de 7 a 30 carbonos (por ejemplo, de 7 a 16 o de 7 a 20 carbonos, tales como C6-10 arilo-C1-6 alcoxi, C6-10 arilo-C1-10 alcoxi, o C6-10 arilo-C1-20 alcoxi). En algunas realizaciones, el grupo arilalcoxi puede estar sustituido con 1,2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención.
El grupo "ariloxi", que como se usa en esta invención, representa un sustituyente químico de fórmula -OR', donde R' es un grupo arilo de 6 a 18 carbonos, a menos que se especifique lo contrario. En algunos casos, el grupo arilo puede estar sustituido con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes como se describe en esta invención.
El término "ariloilo" como se usa en esta invención significa un grupo arilo, como se define en esta invención, que está nunido al grupo molecular de origen a través de un grupo carbonilo. Grupos ariloílo no sustituidos ejemplares son de 7 a 11 carbonos. En algunos casos, el grupo arilo puede estar sustituido con 1,2, 3 o 4 sustituyentes como se describe en esta invención.
El término "azido" representa un grupo —N3 , que también se puede representar como -N=N=N.
El término "bicíclico", como se usa en esta invención, se refiere a una estructura que tiene dos anillos, que pueden ser aromáticos o no aromáticos. Las estructuras bicíclicas incluyen grupos espirociclilo, como se define en esta invención, y dos anillos que comparten uno o más puentes, donde dichos puentes pueden incluir un átomo o una cadena que incluye dos, tres o más átomos. Grupos bicíclicos ejemplares incluyen un grupo carbociclilo bicíclico, donde el primer y segundo anillos son grupos carbociclilo, como se define en esta invención; grupos arilo bicíclicos, donde el primer y segundo anillos son grupos arilo, como se define en esta invención; grupos heterociclilo bicíclicos, donde el primer anillo es un grupo heterociclilo y el segundo anillo es un grupo carbociclilo (por ejemplo, arilo) o heterociclilo (por ejemplo, heteroarilo); y grupos heteroarilo bicíclicos, donde el primer anillo es un grupo heteroarilo y el segundo anillo es un grupo carbociclilo (por ejemplo, arilo) o heterociclilo (por ejemplo, heteroarilo). En algunos casos, el grupo bicíclico puede estar sustituido con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes como se define en esta invención para los grupos cicloalquilo, heterociclilo y arilo.
Los términos "carbocíclico" y "carbociclilo", como se usan en esta invención, se refieren a una estructura C3-12 monocíclica, bicíclica o tricíclica opcionalmente sustituida donde los anillos, que pueden ser aromáticos o no aromáticos, están formados por átomos de carbono. Las estructuras carbocíclicas incluyen grupos cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquinilo y arilo.
El grupo "carbamoílo", como se usa en esta invención, representa —C(O)-N(RN1)2, donde el significado de cada RN1 se encuentra en la definición de "amino" proporcionada en esta invención.
El término "carbamoilalquilo", como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, sustituido por un grupo carbamoílo, como se define en esta invención. El grupo alquilo puede estar además sustituido con 1, 2, 3 ó 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención.
El término "carbamilo", como se usa en esta invención, se refiere a un grupo carbamato que tiene la estructura -NRN1C(=O)OR or -OC(=O)N(RN1)2, donde el significado de cada RN1 se encuentra en la definición de "amino" proporcionado en esta invención, y R es alquilo, cicloalquilo, alccicloalquilo, arilo, alcarilo, heterociclilo (p. ej., heteroarilo) o alqueterociclilo (p. ej., alqueteroarilo), como se define en esta invención.
El término «carbonilo», como se usa en esta invención, representa un grupo C(O), que también puede representarse como C=O.
El grupo "carboxialdehído" representa un grupo acilo que tiene la estructura -CHO.
El término "carboxi", como se usa en esta invención, hace referencia a -CO2H.
El término "carboxialcoxi", como se usa en esta invención, representa un grupo alcoxi, como se define en esta invención, sustituido por un grupo carboxi, como se define en esta invención. El grupo alcoxi puede estar además sustituido con 1, 2, 3 ó 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención para el grupo alquilo.
El término "carboxialquilo", como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, sustituido por un grupo carboxi, como se define en esta invención. El grupo alquilo puede estar además sustituido con 1, 2, 3 ó 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención.
El término «ciano», como se usa en esta invención, representa un grupo -CN.
El término "cicloalcoxi" representa un sustituyente químico de fórmula -OR, donde R es un grupo cicloalquilo C3-8 como se define en esta invención, a menos que se especifique lo contrario. El grupo cicloalquilo puede estar además sustituido con 1, 2, 3 ó 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención. Grupos cicloalcoxi no sustituidos ejemplares son de 3 a 8 carbonos. En algunos casos, el grupo cicloalquilo puede estar sustituido adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención.
El término "cicloalquilo", como se usa en esta invención, representa un grupo hidrocarburo cíclico no aromático saturado o insaturado monovalente de tres a ocho carbonos, a menos que se especifique lo contrario, y se ejemplifica por ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, biciclo[2.2.1.]heptilo y análogos. Cuando el grupo cicloalquilo incluye un doble enlace carbono-carbono, el grupo cicloalquilo puede denominarse grupo "cicloalquenilo". Grupos cicloalquenilo ejemplares incluyen ciclopentenilo, ciclohexenilo y similares. Los grupos cicloalquilo de esta divulgación pueden estar opcionalmente sustituidos con: (1) C1-7 acilo (p.ej., carboxialdehido); (2) C1-20 alquilo (p.ej., C1-6 alquilo, C1-6 alcoxi-C1-6 alquilo, C1-6 alquilsulfinil-C1-6 alquilo, amino-C1-6 alquilo, azido-C1-6 alquilo, (carboxialdehido)-C1-6 alquilo, halo-C1-6 alquilo (p.ej., perfluoroalquilo), hidroxi-C1-6 alquilo, nitro-C1-6 alquilo, o C1-6 tioalcoxi-C1-6 alquilo); (3) C1-20 alcoxi (p.ej., C1-6 alcoxi, tal como perfluoroalcoxi); (4) C1-6 alquilsulfinilo; (5) C6-10 arilo; (6) amino; (7) C1-6 alc-C6-10 arilo; (8) azido; (9) C3-8 cicloalquilo; (10) C1-6 alc-C3-8 cicloalquilo; (11) halo; (12) C1-12 heterociclilo (p.ej., C1-12 heteroarilo); (13) (C1-12 heterociclil)oxi; (14) hidroxi; (15) nitro; (16) C1-20 tioalcoxi (p.ej., C1-6 tioalcoxi); (17) —(CH2)qCO2RA', donde q es un entero de cero a cuatro, y RA' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) C1-6 alquilo, (b) C6-10 arilo, (c) hidrógeno, y (d) C1-6 alc-C6-10 arilo; (18) -(CH2)qCONRB'RC', donde q es un entero de cero a cuatro y donde RB' y RC' son independientemente seleccionados de entre el grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) C6-10 alquilo, (c) C6-10 arilo, y (d) C1-6 alc-C6-10 arilo; (19) —(CH2)qSO2RD', donde q es un entero de cero a cuatro y donde RD' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) C6-10 alquilo, (b) C6-10 arilo, y (c) C1-6 alc-C6-10 arilo; (20) —(CH2)qSO2NRE'RF', donde q es un entero de cero a cuatro y donde cada uno de RE' y RF' es, independientemente, seleccionado de entre el grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) C6-10 alquilo, (c) C6-10 arilo, y (d) C1-6 alc-C6-10 arilo; (21) tiol; (22) C6-10 ariloxi; (23) C3-8 cicloalcoxi; (24) C6-10 arilo-C1-6 alcoxi; (25) C1-6 alc-C1-12 heterociclilo (p.ej., C1-6 alc-C1-12 heteroarilo); (26) oxo; (27) C2-20 alquenilo; y (28) C2-20 alquinilo. En algunos casos, cada uno de estos grupos puede sustituirse adicionalmente como se describe en esta invención. Por ejemplo, el grupo alquileno de un C1alcarilo o un C1-alc-heterociclilo se puede sustituir adicionalmente con un grupo oxo para producir el respectivo grupo sustituyente ariloílo y (heterociclil)oílo.
El término "diastereoisómero", como se usa en esta invención, significa estereoisómeros que no son imágenes especulares entre sí y no se pueden superponer entre sí.
El término "cantidad efectiva" de un agente, como se usa en esta invención, es la cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados, por ejemplo, resultados clínicos y, como tal, una "cantidad efectiva" depende del contexto donde se está aplicando. Por ejemplo, en el contexto de la administración de un agente que trata el cáncer, una cantidad efectiva de un agente es, por ejemplo, una cantidad suficiente para lograr el tratamiento, como se define en esta invención, del cáncer, en comparación con la respuesta obtenida sin la administración del agente.
El término "enantiómero", como se usa en esta invención, significa cada forma ópticamente activa individual de un compuesto de la divulgación, que tiene una pureza óptica o exceso enantiomérico (según se determina mediante procedimientos estándar en la técnica) de al menos 80 % (es decir, al menos 90 % de un enantiómero y como máximo 10 % del otro enantiómero), preferiblemente al menos 90 % y más preferiblemente al menos 98 %.
El término «halo», como se usa en esta invención, representa un halógeno seleccionado de bromo, cloro, yodo o flúor.
El término "haloalcoxi", tal como se usa en esta invención, representa un grupo alcoxi, tal como se define en esta invención, sustituido con un grupo halógeno (es decir, F, Cl, Br o I). Un haloalcoxi puede estar sustituido con uno, dos o tres, o en el caso de grupos alquilo de dos carbonos o más, cuatro halógenos. Los grupos haloalcoxi incluyen perfluoroalcoxis (por ejemplo, -OCF3), -OCHF2, -OCH2F, -OCCla, -OCH2CH2Br, -OCH2CH(CH2CH2Br)CH3, y -OCHICH3. En algunas realizaciones, el grupo haloalcoxi puede estar adicionalmente sustituido con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención para grupos alquilo.
El término "haloalquilo", tal como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, tal como se define en esta invención, sustituido con un grupo halógeno (es decir, F, Cl, Br o I). Un haloalquilo puede estar sustituido con uno, dos o tres, o, en el caso de grupos alquilo de dos carbonos o más, cuatro halógenos. Los grupos haloalquilo incluyen perfluoroalquilos (por ejemplo, -CF3), -CHF2, -CH2F, -CCl3, -CH2CH2Br, -CH2CH(CH2CH2Br)CH3, y -CHICH3. En algunos casos, el grupo haloalquilo puede estar adicionalmente sustituido con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención para grupos alquilo.
El término "heteroalquileno", como se usa en esta invención, se refiere a un grupo alquileno, como se define en esta invención, donde uno o dos de los átomos de carbono constituyentes han sido reemplazados cada uno por nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, el grupo heteroalquileno puede estar adicionalmente sustituido con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención para grupos alquileno.
El término «heteroarilo», como se usa en esta invención, representa ese subconjunto de heterociclilos, como se define en esta invención, que son aromáticos: es decir, contienen 4n+2 electrones pi dentro del sistema de anillo mono o multicíclico. Grupos heteroarilo no sustituidos ejemplares tienen de 1 a 12 (por ejemplo, 1 a 11, 1 a 10, 1 a 9, 2 a 12, 2 a 11, 2 a 10 o 2 a 9) carbonos. En algunos casos, el heteroarilo está sustituido con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define para un grupo heterociclilo.
El término «heterociclilo», como se usa en esta invención, representa un anillo de 5, 6 o 7 miembros, a menos que se especifique lo contrario, que contiene uno, dos, tres o cuatro heteroátomos seleccionados independientemente de entre el grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre. El anillo de 5 miembros tiene de cero a dos dobles enlaces, y los anillos de 6 y 7 miembros tienen de cero a tres dobles enlaces. Grupos heterociclilo no sustituidos ejemplares tienen de 1 a 12 (por ejemplo, 1 a 11, 1 a 10, 1 a 9, 2 a 12, 2 a 11,2 a 10 o 2 a 9) carbonos. El término «heterociclilo» también representa un compuesto heterocíclico que tiene una estructura multicíclica puenteada donde uno o más carbonos y/o heteroátomos conectan dos miembros no adyacentes de un anillo monocíclico, por ejemplo, un grupo quinuclidinilo. El término "heterociclilo" incluye grupos bicíclicos, tricíclicos y tetracíclicos en los cuales cualquiera de los anillos heterocíclicos antemencionados está fusionado a uno, dos o tres anillos carbocíclicos, por ejemplo, un anillo de arilo, un anillo de ciclohexano, un anillo de ciclohexeno, un anillo de ciclopentano, un anillo de ciclopenteno, y otro anillo heterocíclico monocíclico, tal como indolilo, quinolilo, isoquinolilo, tetrahidroquinolilo, benzofurilo, benzotienilo y similares. Los ejemplos de heterociclilos fusionados incluyen tropanos y 1,2,3,5,8,8a-hexahidroindolizina. Los heterocíclicos incluyen pirrolilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, pirazolilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, imidazolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, piridilo, piperidinilo, homopiperidinilo, pirazinilo, piperazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, oxazolilo, oxazolidinilo, isoxazolilo, isoxazolidiniilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, tiazolilo, tiazolidinilo, isotiazolilo, isotiazolidinilo, indolilo, indazolilo, quinolilo, isoquinolilo, quinoxalinilo, dihidroquinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo, ftalazinilo, benzimidazolilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, benzotiadiazolilo, furilo, tienilo, tiazolidinilo, isotiazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxadiazolilo (por ejemplo, 1,2,3-oxadiazolilo), purinilo, tiadiazolilo (por ejemplo, 1,2,3-tiadiazolilo), tetrahidrofuranilo, dihidrofuranilo, tetrahidrotienilo, dihidrotienilo, dihidroindolilo, dihidroquinolilo, tetrahidroquinolilo, tetrahidroisoquinolilo, dihidroisoquinolilo, piranilo, dihidropiranilo, ditiazolilo, benzofuranilo, isobenzofuranilo, benzotienilo y similares, inclusive formas dihidro y tetrahidro de los mismos, donde uno o más enlaces dobles se reducen y reemplazan con hidrógenos. Todavía otros ejemplos de heterociclilos incluyen: 2,3,4,5-tetrahidro-2-oxooxazolil; 2,3-dihidro-2-oxo-1H-imidazolil; 2,3,4,5-tetrahidro-5-oxo-1H-pirazolil (por ejemplo, 2,3,4,5-tetrahidro-2-fenil-5-oxo-1H-pirazolil); 2,3,4,5-tetrahidro-2,4-dioxo-1H-imidazolil (p. ej., 2,3,4,5-tetrahidro-2,4-dioxo-5-metil-5-fenil-1H-imidazolil) ; 2,3-dihidro-2-tioxo-1,3,4-oxadiazolil (por ejemplo, 2,3-dihidro-2-tioxo-5-fenil-1,3,4-oxadiazolil); 4,5-dihidro-5-oxo-1H-triazolil (por ejemplo, 4,5-dihidro-3-metil-4-amino 5-oxo-1H-triazolil); 1,2,3,4-tetrahidro-2,4-dioxopindinil (por ejemplo, 1,2,3,4-tetrahidro-2,4-dioxo-3,3-dietilpiridinilo); 2,6-dioxo-piperidinil (por ejemplo, 2,6-dioxo-3-etil-3-fenilpiperidinil); 1,6-dihidro-6-oxopiridiminilo; 1,6-dihidro-4-oxopirimidinil (por ejemplo, 2-(metiltio)-1,6-dihidro-4-oxo-5-metilpirimidin-1-il); 1,2,3,4-tetrahidro-2,4-dioxopirimidinil (por ejemplo, 1,2,3,4-tetrahidro-2,4-dioxo-3-etilpirimidinil); 1.6- dihidro-6-oxo-piridazinil (por ejemplo, 1,6-dihidro-6-oxo-3-etilpiridazinil); 1,6-dihidro-6-oxo-1,2,4-triazinil (por ejemplo, 1,6-dihidro-5-isopropil-6-oxo-1,2,4-triazinil); 2,3-dihidro-2-oxo-1H-indolil (e.g., 3,3-dimetil-2,3-dihidro-2-oxo-1H-indolil y 2,3-dihidro-2-oxo-3,3'-spiropropano-1H-indol-1-il); 1,3-dihidro-1-oxo-2H-iso-indolil; 1,3-dihidro-1,3-dioxo-2H-iso-indolil; 1H-benzopirazolil (e.g., l-(etoxicarbonil)- 1H-benzopirazolil); 2,3-dihidro-2-oxo-1H-benzimidazolil (e.g., 3-etil-2,3-dihidro-2-oxo-1H-benzimidazolil); 2,3-dihidro-2-oxo-benzoxazolil (e.g., 5-cloro-2,3-dihidro-2-oxobenzoxazolil); 23-dihidro-2-oxo-benzoxazolil 2-oxo-2H-benzopiranil; 1,4-benzodioxanil; 1,3-benzodioxanil; 2,3-dihidro-3-oxo,4H-1,3-benzotiazinil; 3,4-dihidro-4-oxo-3H-quinazolinil (e.g., 2-metil-3,4-dihidro-4-oxo-3H-quinazolinil); 1,2,3,4-tetrahidro-2,4-dioxo-3H-quinazolil (e.g., 1-etil-1,2,3,4-tetrahidro-2,4-dioxo-3H-quinazolil); 1,2,3,6-tetrahidro-2,6-dioxo-7H-purinil (e.g., 1,2,3,6-tetrahidro-1,3-dimetil-2,6-dioxo-7 H -purinil); 1,2,3,6-tetrahidro-2,6-dioxo-1 H-purinil (e.g., 1.2.3.6- tetrahidro-3,7-dimetil-2,6-dioxo-1 H-purinil); 2-oxobenz[c,d]indolil; 1,1-dioxo-2H-naft[1,8-c,d]isotiazolil, y 1,8-naftilenedicarboxamido. Los heterocíclicos adicionales incluyen 3,3a,4,5,6,6a-hexahidro-pirrolo[3,4-b]pirrol-(2H)-ilo, y 2,5-diazabiciclo[2.2.1]heptan-2-ilo, homopiperazinilo (o diazepanil), tetrahidropiranilo, ditiazolilo, benzofuranilo, benzotienilo, oxepanilo, tiepanilo, azocanilo, oxecanilo y tiocanilo. Los grupos heterocíclicos también incluyen grupos de fórmula
Figure imgf000261_0001
, donde
E' se selecciona de entre el grupo que consiste en -N- y -CH-; F' se selecciona de entre el grupo que consiste en -N=CH-, -NH-CH2-, -NH-C(O)-, -NH-, -CH=N-, -CH2-NH-, -C(O)-NH-, -CH=CH-, -CH2-, -CH2CH2-, -CH2O-, -OCH2-, -O­ , y -S-; y G' se selecciona de entre el grupo que consiste en -CH- y -N-. Cualquiera de los grupos heterociclilo mencionados en esta invención puede estar opcionalmente sustituido con uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituyentes seleccionados independientemente de entre el grupo que consiste en: (1) C1-7 acil (p.ej., carboxialdehido ); (2) C1-20 alquilo (p.ej., C1-6 alquilo, C1-6 alcoxi-C1-6 alquilo, C1-6 alquilsulfinil-C1-6 alquilo, amino-C1-6 alquilo, azido-C1-6 alquilo, (carboxialdehido)-C1-6 alquilo, halo-C1-6 alquilo (p.ej., perfluoroalquilo), hidroxi-C1-6 alquilo, nitro-C1-6 alquilo, o C1-6 tioalcoxi-C1-6 alquilo); (3) C1-20 alcoxi (p.ej., C1-6 alcoxi, such as perfluoroalcoxi); (4) C1-6 alquilsulfinil; (5) C6-10 arilo; (6) amino; (7) C1-6 alc-C6-10 arilo; (8) azido; (9) C3-8 cycloalquilo; (10) C1-6 alc-C3-s cycloalquilo; (11) halo; (12) C1-12 heterociclil (p.ej., C2-12 heteroaril); (13) (C1-12 heterociclil)oxi; (14) hidroxi; (15) nitro; (16) C1-20 tioalcoxi (p.ej., C1-6 tioalcoxi); (17) -(CH2)qCO2RA', donde q es un entero de cero a cuatro, y RA' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) C1-6 alquilo, (b) C6-10 arilo, (c) hidrógeno, y (d) C1-6 alc-C6-10 arilo; (18) -(CH2)qCONRB'RC', donde q es un entero de cero a cuatro y donde RB' y RC' are independientemente seleccionado de entre el grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) C1-6 alquilo, (c) C6-10 arilo, y (d) C1-6 alc-C6-10 arilo; (19) -(CH2)qSO2RD', donde q es un entero de cero a cuatro y donde RD' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) C1-6 alquilo, (b) C6-10 arilo, y (c) C1-6 alc-C6-10 arilo; (20) -(CH2)qSO2NRE'RF', donde q es un entero de cero a cuatro y donde cada uno de RE' y RF' es, independientemente, seleccionado de entre el grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) C1-6 alquilo, (c) C6-10 arilo, y (d) C1-6 alc-C6-10 arilo; (21) tiol; (22) C6-10 ariloxi; (23) C3-8 cycloalcoxi; (24) arilalcoxi; (25) C1-6 alc-C1-12 heterociclil (p.ej., C1-6 alc-C1-12 heteroaril); (26) oxo; (27) (C1-12 heterociclil)imino; (28) C2-20 alquenilo; y (29) C2-20 alquinil. En algunos casos, cada uno de estos grupos puede sustituirse adicionalmente como se describe en esta invención. Por ejemplo, el grupo alquileno de un C1-alcarilo o un C1-alc-heterociclilo se puede sustituir adicionalmente con un grupo oxo para producir el respectivo grupo sustituyente ariloílo y (heterociclil)oílo.
El término "(heterociclil)imino", como se usa en esta invención, representa un grupo heterociclilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular principal a través de un grupo imino. En algunas realizaciones, el grupo heterociclilo puede estar sustituido con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención.
El término «(heterociclil)oxi», como se usa en esta invención, representa un grupo heterociclilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular original a través de un átomo de oxígeno. En algunas realizaciones, el grupo heterociclilo puede estar sustituido con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención.
El término "(heterociclil)oílo", como se usa en esta invención, representa un grupo heterociclilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular original a través de un grupo carbonilo. En algunas realizaciones, el grupo heterociclilo puede estar sustituido con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención.
El término "hidrocarburo", como se usa en esta invención, representa un grupo que consiste únicamente en átomos de carbono e hidrógeno.
El término «hidroxi», como se usa en esta invención, representa un grupo -OH.
El grupo "hidroxialquenilo", como se usa en esta invención, representa un grupo alquenilo, como se define en esta invención, sustituido con uno a tres grupos hidroxi, con la condición de que no más de un grupo hidroxi pueda estar unido a un solo átomo de carbono del grupo alquilo, y está ejemplificado por dihidroxipropenilo, hidroxiisopentenilo y similares.
El grupo "hidroxialquilo", que como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, sustituido con uno a tres grupos hidroxi, con la condición de que no más de un grupo hidroxi puede estar unido a un solo átomo de carbono del grupo alquilo, y se ejemplifica por hidroximetilo, dihidroxipropilo y similares.
El término "isómero", como se usa en esta invención, significa cualquier tautómero, estereoisómero, enantiómero o diastereómero de cualquier compuesto de la divulgación. Se reconoce que los compuestos de la divulgación pueden tener uno o más centros quirales y/o dobles enlaces y, por lo tanto, existen como estereoisómeros, tales como isómeros de doble enlace (es decir, isómeros geométricos E/Z) o diastereómeros (p. ej., enantiómeros (es decir, (+) o (-)) o isómeros cis/trans). Según la divulgación, las estructuras químicas representadas en esta invención, y por lo tanto los compuestos de la divulgación, abarcan todos los estereoisómeros correspondientes, es decir, tanto la forma estereoméricamente pura (por ejemplo, geométricamente pura, enantioméricamente pura o diastereoméricamente pura) como enantiomérica y mezclas estereoisoméricas, por ejemplo, racematos. Las mezclas enantioméricas y estereoisoméricas de compuestos de la divulgación pueden resolverse típicamente en sus componentes enantiómeros o estereoisómeros mediante procedimienrtos bien conocidos, tales como cromatografía de gases en fase quiral, cromatografía líquida de alta resolución en fase quiral, cristalización del compuesto como un complejo de sal quiral, o cristalizar el compuesto en un disolvente quiral. Los enantiómeros y estereoisómeros también se pueden obtener a partir de intermedios, reactivos y catalizadores estereomérica o enantioméricamente puros mediante procedimientos sintéticos asimétricos bien conocidos.
El término "aminoW-protegido," como se usa en esta invención, se refiere a un grupo amino, como se define en esta invención, al que se une uno o dos grupos W-protectores, como se define en esta invención.
El término "grupoW-protector," como se usa en esta invención, representa aquellos grupos destinados a proteger un grupo amino contra reacciones indeseables durante los procedimientos sintéticos. Grupos W-protectores usados comúnmente se describen en Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis," 3a Ed. (John Wiley & Sons, New York, 1999).Los grupos W-protectores incluyen grupos acilo, ariloil o carbamil como formil, acetil, propionil, pivaloil, tbutilacetil, 2-cloroacetil, 2-bromoacetil, trifluoroacetil, tricloroacetil, phthalil, o-nitrophenoxiacetil, a-chlorobutyril, benzoil, 4-clorobenzoílo, 4-bromobenzoílo, 4-nitrobenzoílo y auxiliares quirales tales como D, L o D,L-aminoácidos protegidos o no protegidos tales como alanina, leucina, fenilalanina y similares; grupos que contienen sulfonilo tales como bencenosulfonilo, p-toluenosulfonilo y similares; grupos formadores de carbamato tales como benciloxicarbonilo, p-clorobenciloxicarbonilo, p-metoxibenciloxicarbonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, 2-nitrobenciloxicarbonilo, pbromobenciloxicarbonilo, 3,4-dimetoxibenciloxicarbonilo, 3,5-dimetoxibenciloxicarbonilo, 2,4-dimetoxibenciloxicarbonilo, 4-metoxibenciloxicabonilo, 2-nitro-4,5-dimetoxibenciloxicarbonilo, 3,4,5-trimetoxibenciloxicarbonilo, 1-(p-bifenilil)-i-metiletoxicarbonilo, a,a-dimetil-3,5- dimetoxibenciloxicarbonilo, benzhidriloxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo, diisopropilmetoxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo, metoxicarbonilo, aliloxicarbonilo, 2,2,2,-tricloroetoxicarbonilo, fenoxicarbonilo, 4-nitrofenoxicarbonilo, fluorenil-9-metoxicarbonilo, ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, ciclohex, andoxicarbonilo similares, grupos alcarilo tales como bencilo, trifenilmetilo, benciloximetilo y similares y grupos sililo, tales como trimetilsililo y similares. Grupos W-protectores preferidos son formilo, acetilo, benzoilo, pivaloilo, t-butilacetilo, alanilo, fenilsulfonilo, bencilo, tbutiloxicarbonilo (Boc) y benciloxicarbonilo (Cbz).
El término "nitro," como se usa en esta invención, representa un grupo -NO2.
El término «oxo» como se usa en esta invención representa =0.
El grupo "perfluoroalquilo", que como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, donde cada radical hidrógeno unido al grupo alquilo ha sido reemplazado por un radical fluoruro. Los grupos perfluoroalquilo se ejemplifican mediante trifluorometilo, pentafluoroetilo y similares.
El grupo "perfluoroalcoxi", que como se usa en esta invención, representa un grupo alcoxi, como se define en esta invención, donde cada radical de hidrógeno unido al grupo alcoxi ha sido reemplazado por un radical fluoruro. Los grupos perfluoroalcoxi son ejemplificados por trifluorometoxi, pentafluoroetoxi y similares.
El término "espirociclilo", como se usa en esta invención, representa un dirradical de alquileno C2-7 cuyos extremos están unidos al mismo átomo de carbono del grupo de origen para formar un grupo espirocíclico, y también un dirradical heteroalquileno C1-6 ambos extremos de los cuales están unidos al mismo átomo. El radical heteroalquileno que forma el grupo espirociclilo puede contener uno, dos, tres o cuatro heteroátomos seleccionados independientemente de entre el grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre. En algunas realizaciones, el grupo espirociclilo incluye de uno a siete carbonos, excluyendo el átomo de carbono al que está unido el dirradical. Los grupos espirociclilo de la invención pueden estar opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes proporcionados en esta invención como sustituyentes opcionales para cicloalquilo y/o grupos heterociclilo.
El término "estereoisómero", como se usa en esta invención, se refiere a todas las posibles formas isoméricas y conformacionales diferentes que puede poseer un compuesto (por ejemplo, un compuesto de cualquier fórmula descrita en esta invención), en particular todas las formas estereoquímicas y conformacionalmente isoméricas posibles, todos los diastereómeros, enantiómeros y/o confórmeros de estructura molecular básica. Algunos compuestos de la presente divulgación pueden existir en diferentes formas tautoméricas.
El término "sulfoalquilo", como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, sustituido con un grupo sulfo de -SO3H. En algunos casos, el grupo alquilo puede estar sustituido adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención.
El término “sulfonilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo -S(O)2-.
El grupo "tioalcarilo", como se usa en esta invención, representa un sustituyente químico de fórmula -SR, donde R es un grupo alcarilo. En alguno casos, el grupo alcarilo puede estar sustituido con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención.
El término "tioalqueterociclilo", como se usa en esta invención, representa un sustituyente químico de fórmula -SR, donde R es un grupo alqueterociclilo. En algunas realizaciones, el grupo heterociclilo puede estar sustituido con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención.
El grupo "tioalcoxi", como se usa en esta invención, representa un sustituyente químico de fórmula -SR, donde R es un grupo alquilo, como se define en esta invención. En algunas realizaciones, el grupo alquilo puede estar sustituido adicionalmente con 1,2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención.
El término "tiol" representa un grupo -SH.
Compuesto: Tal como se usa en esta invención, el término "compuesto" pretende incluir todos los estereoisómeros, isómeros geométricos, tautómeros e isótopos de las estructuras representadas.
Los compuestos descritos en esta invención pueden ser asimétricos (p.ej., tener uno o más estereocentros). Todos los estereoisómeros, tales como enantiómeros y diastereómeros, están destinados a menos que se indique lo contrario. Los compuestos de la presente divulgación que contienen átomos de carbono sustituidos asimétricamente pueden aislarse en formas ópticamente activas o racémicas. Se conocen en la técnica procedimientos sobre cómo preparar formas ópticamente activas a partir de materiales de partida ópticamente activos, tales como por resolución de mezclas racémicas o por síntesis estereoselectiva. Muchos isómeros geométricos de olefinas, dobles enlaces C=N y similares también pueden estar presentes en los compuestos descritos en esta invención, y todos estos isómeros estables se contemplan en la presente descripción. Los isómeros geométricos cis y trans de los compuestos de la presente descripción se describen y pueden aislarse como una mezcla de isómeros o como formas isoméricas separadas.
Los compuestos de la presente divulgación también incluyen formas tautoméricas. Las formas tautoméricas son el resultado del intercambio de un enlace simple con un enlace doble adyacente junto con la migración concomitante de un protón. Las formas tautoméricas incluyen tautómeros prototrópicos que son estados de protonación isoméricos que tienen la misma fórmula empírica y carga total. Ejemplos de tautómeros prototrópicos incluyen pares cetona-enol, pares amida-ácido imídico, pares lactama-lactima, pares amida-ácido imídico, pares enamina-imina y formas anulares donde un protón puede ocupar dos o más posiciones de un sistema heterocíclico, por ejemplo, 1H- y 3H-imidazol, 1H-, 2H- y 4H- 1, 2, 4-triazol, 1H- y 2H- isoindol, y 1H- y 2H-pirazol. Las formas tautoméricas pueden estar en equilibrio o bloqueadas estéricamente en una forma mediante una sustitución apropiada.
Los compuestos de la presente divulgación también incluyen todos los isótopos de los átomos que se encuentran en los compuestos intermedios o finales. "Isótopos" se refiere a átomos que tienen el mismo número atómico pero diferentes números de masa resultantes de un número diferente de neutrones en los núcleos. Por ejemplo, los isótopos de hidrógeno incluyen tritio y deuterio.
Los compuestos y sales de la presente divulgación se pueden preparar en combinación con moléculas de agua o disolvente para formar solvatos e hidratos mediante procedimientos rutinarios.
Conservado: Tal como se usa en esta invención, el término "conservado" se refiere a nucleótidos o residuos de aminoácidos de una secuencia de polinucleótidos o secuencia de polipéptidos, respectivamente, que son los que se producen inalterados en la misma posición de dos o más secuencias que se comparan. Los nucleótidos o aminoácidos que están relativamente conservados son aquellos que se conservan entre más secuencias relacionadas que los nucleótidos o aminoácidos que aparecen en otras partes de las secuencias.
En algunos casos, se dice que dos o más secuencias están "completamente conservadas" si son 100 % idénticas entre sí. En algunos casos, se dice que dos o más secuencias están "altamente conservadas" si son al menos un 70 % idénticas, al menos un 80 % idénticas, al menos un 90 % idénticas o al menos un 95 % idénticas entre sí. En algunos casos, se dice que dos o más secuencias están "altamente conservadas" si son aproximadamente un 70 % idénticas, aproximadamente un 80 % idénticas, aproximadamente un 90 % idénticas, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 % idénticas entre sí. . En algunos casos, se dice que dos o más secuencias están "conservadas" si son al menos un 30 % idénticas, al menos un 40 % idénticas, al menos un 50 % idénticas, al menos un 60 % idénticas, al menos un 70 % idénticas, al menos 80 % idénticas, al menos 90 % idénticas o al menos 95 % idénticas entre sí. En algunos casos, se dice que dos o más secuencias están "conservadas" si son aproximadamente un 30 % idénticas, aproximadamente un 40 % idénticas, aproximadamente un 50 % idénticas, aproximadamente un 60 % idénticas, aproximadamente un 70 % idénticas, aproximadamente un 80 % idénticas, aproximadamente un 90 % idénticas, aproximadamente un 95 % idénticas, aproximadamente un 98 % idénticas o aproximadamente un 99 % idénticas entre sí. La conservación de la secuencia puede aplicarse a la longitud completa de un oligonucleótido o polipéptido o puede aplicarse a una porción, región o característica del mismo. La conservación de la secuencia puede aplicarse a la longitud completa de un oligonucleótido o polipéptido o puede aplicarse a una porción, región o característica del mismo.
Entrega: Tal como se usa en esta invención, "entrega" se refiere al acto o la manera de entregar un compuesto, sustancia, entidad, fracción, carga o carga útil.
Agente de entrega: Tal como se usa en esta invención, "agente de entrega" se refiere a cualquier sustancia que facilite, al menos en parte, la entrega in vivo de un ácido nucleico modificado a células diana.
Etiqueta detectable: Tal como se usa en esta invención, "etiqueta detectable" se refiere a uno o más marcadores, señales o restos que están unidos, incorporados o asociados con otra entidad que se detecta fácilmente mediante procedimientos conocidos en la técnica que incluyen radiografía, fluorescencia, quimioluminiscencia, actividad enzimática, absorbancia y similares. Etiquetas detectables incluyen radioisótopos, fluoróforos, cromóforos, enzimas, colorantes, iones metálicos, ligandos tales como biotina, avidina, estreptavidina y haptenos, puntos cuánticos y similares. Etiquetas detectables se pueden ubicar en cualquier posición en los péptidos o proteínas descritos en esta invención. Pueden estar dentro de los aminoácidos, péptidos o proteínas, o localizados en los extremos N- o C-.
Dispositivo: Como se usa en esta invención, el término "dispositivo" significa una pieza de equipo diseñada para cumplir un propósito especial. El dispositivo puede comprender muchas características tales como, pero sin limitarse a, componentes eléctricos (por ejemplo, cableado y circuitos), módulos de almacenamiento y módulos de análisis.
Enfermedad: Tal como se usa en esta invención, el término "enfermedad" se refiere a una condición anormal que afecta al cuerpo de un organismo que a menudo muestra síntomas corporales específicos.
Trastorno: Tal como se usa en esta invención, el término "trastorno" se refiere a una interrupción o una interferencia con las funciones normales o los sistemas establecidos del cuerpo.
Digerir. Tal como se usa en esta invención, el término "digerir'' significa romper en piezas o componentes más pequeños. Cuando se hace referencia a polipéptidos o proteínas, la digestión da como resultado la producción de péptidos.
Señal de escisión de proteína codificada: Tal como se usa en esta invención, "señal de escisión de proteína codificada" se refiere a la secuencia de nucleótidos que codifica una señal de escisión de proteína.
Ingeniería: Tal como se usa en esta invención, realizaciones de la invención se "someten a ingeniería" cuando son diseñadas para tener una característica o propiedad, ya sea estructural o química, que varía desde un punto de partida, una molécula salvaje o una molécula nativa.
Exosoma: Tal como se usa en esta invención, "exosoma" es una vesícula secretada por células de mamífero o un complejo involucrado en la degradación del ARN.
Expresión: Tal como se usa en esta invención, la "expresión" de una secuencia de ácido nucleico se refiere a uno o más de los eventos siguientes: (1) producción de una plantilla de ARN a partir de una secuencia de ADN (p.ej., mediante transcripción); (2) procesamiento de una transcripción de ARN (p.ej., mediante corte, edición, formación de extremo 5' y/o procesamiento de extremo 3'); (3) traducción de un ARN a un polipéptido o proteína; y (4) modificación postraduccional de un polipéptido o proteína.
Característica: Tal como se usa en esta invención, una "característica" se refiere a un rasgo, una propiedad o un elemento distintivo.
Formulación: Tal como se usa en esta invención, una "formulación" incluye al menos un ácido nucléico modofocado y un agente de entrega.
Fragmento: Un "fragmento", como se usa en esta invención, se refiere a una porción. Por ejemplo, los fragmentos de proteínas pueden comprender polipéptidos obtenidos al digerir proteínas de longitud completa aisladas de células cultivadas.
Funcional: Tal como se usa en esta invención, una molécula biológica "funcional" es una molécula biológica en una forma donde exhibe una propiedad y/o actividad por la que se caracteriza.
Heterólogo: Como se usa en esta invención, el término "heterólogo" en referencia a una región no traducida como 5'UTR o 3'UTR significa una región de ácido nucleico, particularmente ácido nucleico no traducido que no se encuentra naturalmente con la región codificante codificada en el polinucleótido idéntico o instantáneo, construcción primaria o ARNmm. Las UTR homólogas, por ejemplo, representarían aquellas UTR que se encuentran naturalmente asociadas con la región codificante del ARNm, como la UTR de tipo salvaje.
Homología: Tal como se usa en esta invención, el término "homología" se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, p.ej., entre moléculas de ácido nucleico (p.ej. moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas polipeptídicas. En algunos casos, las moléculas poliméricas se consideran "homólogas" entre sí si sus secuencias son al menos 25 %, por lo menos 30 %, por lo menos 35 %, por lo menos 40 %, por lo menos 45 %, por lo menos 50 %, por lo menos 55 %, por lo menos 60 %, por lo menos 65 %, por lo menos 70 %, por lo menos 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 95 %, o al menos 99 % idénticos. En algunos casos, las moléculas poliméricas se consideran "homólogas" entre sí si sus secuencias son al menos 25 %, por lo menos 30 %, por lo menos 35 %, por lo menos 40 %, por lo menos 45 %, por lo menos 50 %, por lo menos 55 %, por lo menos 60 %, por lo menos 65 %, por lo menos 70 %, por lo menos 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 95 %, o al menos 99 % similar. El término "homólogo" se refiere necesariamente a una comparación entre al menos dos secuencias (secuencias de polinucleótidos o polipéptidos).
De acuerdo con la invención, dos secuencias de polinucleótidos se consideran homólogas si los polipéptidos que codifican son idénticos en al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos aproximadamente el 90 % idénticos para al menos un tramo de al menos aproximadamente 20 aminoácidos.
En algunos casos, las secuencias de polinucleótidos homólogas se caracterizan por la capacidad de codificar un tramo de al menos 4-5 aminoácidos especificados de forma única. Para secuencias de polinucleótidos de 60 nucleótidos de longitud, la homología se determina por la capacidad de codificar un tramo de al menos 4--5 aminoácidos especificados de forma única. De acuerdo con la invención, dos secuencias de proteínas se consideran homólogas si las proteínas son al menos alrededor de 50 % idénticas, al menos alrededor de 60 % idénticas, al menos alrededor de 70 % idénticas, al menos alrededor de 80 % idénticas o al menos alrededor de 90 % idénticas durante al menos un tramo de al menos alrededor de 20 aminoácidos.
Identidad: Tal como se usa en esta invención, el término "identidad" se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, p.ej., entre moléculas de oligonucleótidos (p.ej. moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas polipeptídicas. El cálculo del porcentaje de identidad de dos secuencias de ácido de polinucleótidos se puede efectuar, por ejemplo, alineando las dos secuencias para una comparación óptima (p.ej., se pueden introducir huecos en una o ambas secuencias de ácido nucleico primera y segunda para un alineamiento óptimo y las secuencias no idénticas se pueden descartar con fines comparativos). En ciertos casos, la extensión de una secuencia alineada a efectos comparativos es de al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o el 100 % de la extensión de la secuencia de referencia. A continuación, se comparan los nucleótidos en posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido que en la posición correspondiente en la segunda secuencia, a continuación, las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función de la cantidad de posiciones idénticas que comparten las secuencias, teniendo en cuenta la cantidad de espacios y la longitud de cada espacio, que es necesario introducir para la alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograr usando un algoritmo matemático. Por ejemplo, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar usando procedimientos tales como los que se describen en el documento Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., Ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., Ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., Ed., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., Ed., M Stockton Press, Nueva York, 1991. Por ejemplo, es posible determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos usando el algoritmo de Meyers y Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17), el cual se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) mediante el uso de una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12 y una penalización de espacio de 4. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse, de manera alternativa, usando el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMP. Los procedimientos comúnmente empleados para determinar el porcentaje de identidad entre secuencias incluyen, entre otros, aquellos descritos en Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988). Las técnicas para determinar la identidad se codifican en programas informáticos disponibles al público. Software informático ejemplar para determinar la homología entre dos secuencias incluyen, entre otros, el paquete de programa GCG, Devereux J. y col, Nucleic Acids Research, 12(1), 387(1984), BLASTP, BLASTN, y FASTA, Altschul, S. F. y col., J. Molec. Biol., 215, 403 (1990)).
Inhibir la expresión de un gen: Tal como se usa en esta invención, la frase "inhibir la expresión de un gen" significa provocar una reducción en la cantidad de un producto de expresión del gen. El producto de expresión puede ser un ARN transcrito del gen (p.ej., un ARNm) o un polipéptido traducido de un ARNm transcrito del gen. Normalmente, una reducción en el nivel de un ARNm da como resultado una reducción en el nivel de un polipéptido traducido del mismo. El nivel de expresión se puede determinar usando técnicas estándar para medir ARNm o proteína.
In vitro: Tal como se usa en esta invención, el término "in vitro" se refiere a eventos que se producen en un ambiente artificial, p.ej., en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en un cultivo celular, en una placa de Petri, etc., en lugar de dentro de un organismo (p.ej., animal, planta, o microbio).
In vivo: Tal como se usa en esta invención, el término "in vivo" se refiere a eventos que se producen dentro de un organismo (p.ej., animal, planta o microbio o célula o tejido del mismo).
Aislado: Tal como se usa en esta invención, el término "aislado" hace referencia a una sustancia o entidad que ha sido separada de al menos algunos de los componentes con los cuales estuvo asociada (ya sea naturalmente o en condiciones experimentales). Las sustancias aisladas pueden tener niveles variables de pureza en referencia a las sustancias desde las cuales han sido asociadas. Sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de al menos alrededor del 10, alrededor del 20, alrededor del 30, alrededor del 40, alrededor del 50, alrededor del 60, alrededor del 70, alrededor del 80, alrededor del 90 % o más de otros componentes a los cuales estuvieron inicialmente asociadas. En algunas realizaciones, los agentes aislados son más de aproximadamentel 80, aproximadamentel 85, aproximadamentel 90, aproximadamentel 91, aproximadamentel 92, aproximadamentel 93, aproximadamentel 94, aproximadamentel 95, aproximadamentel 96, aproximadamentel 97, aproximadamentel 98, aproximadamentel 99 % o más de aproximadamentel 99 % puros. Como se usa en esta invención, una sustancia es "pura" si está sustancialmente libre de otros componentes. Sustancialmente aislado: Por "sustancialmente aislado" se entiende que el compuesto está sustancialmente separado del entorno donde se formó o detectó. La separación parcial puede incluir, por ejemplo, una composición enriquecida en el compuesto de la presente divulgación. La separación sustancial puede incluir composiciones que contienen al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 97 % o al menos aproximadamente el 99 % en peso del compuesto de la presente divulgación, o una sal del mismo. Los procedimientos para aislar compuestos y sus sales son habituales en la técnica.
Enlazador: Tal como se usa en esta invención, un enlazador se refiere a un grupo de átomos, por ejemplo, 10--1.000 átomos, y puede estar comprendido por átomos o grupos tales como, pero no limitado a, carbono, amino, alquilamino, oxígeno, azufre, sulfóxido, sulfonilo, carbonilo e imina. El enlazador se puede unir a un nucleósido o nucleótido modificado en la nucleobase o resto de azúcar en un primer extremo, y a una carga útil, por ejemplo, un agente detectable o terapéutico, en un segundo extremo. El enlazador puede tener una longitud suficiente para no interferir con la incorporación en una secuencia de ácido nucleico. El enlazador se puede usar para cualquier propósito útil, como para formar multímeros de ARNm modificados (p. ej., a través del enlace de dos o más ácidos nucleicos modificados) o conjugados de ARNm modificados, así como para administrar una carga útil, como se describe en esta invención. Los ejemplos de grupos químicos que se pueden incorporar en el enlazador incluyen, pero no se limitan a, alquilo, alquenilo, alquinilo, amido, amino, éter, tioéter, éster, alquileno, heteroalquileno, arilo o heterociclilo, cada uno de los cuales puede ser opcionalmente sustituido, como se describe en esta invención. Los ejemplos de enlazadores incluyen, pero no se limitan a, alcanos insaturados, polietilenglicoles (por ejemplo, conjuntos monoméricos de etileno o propilenglicol, por ejemplo, dietilenglicol, dipropilenglicol, trietilenglicol, tripropilenglicol, tetraetilenglicol o tetraetilenglicol) y polímeros de dextrano. Otros ejemplos incluyen, pero no se limitan a, restos escindibles dentro del enlazador, tales como, por ejemplo, un enlace disulfuro (-S-S-) o un enlace azo (-N= N-), que se puede escindir usando un agente reductor o fotólisis. Ejemplos no limitantes de un enlace selectivamente escindible incluyen un enlace amido que se puede escindir, por ejemplo, mediante el uso de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) u otros agentes reductores, y/o fotólisis, así como un enlace éster puede ser escindido, por ejemplo, mediante hidrólisis ácida o básica.
Modificado: Tal como se usa en esta invención, "modificado" se refiere a un estado o estructura cambiada de una molécula de la invención. Las moléculas pueden modificarse de muchas maneras, incluso química, estructural y funcionalmente. En un caso, las moléculas de ARNm de la presente descripción se modifican mediante la introducción de nucleósidos y/o nucleótidos no naturales.
De origen natural: Tal como se usa en esta invención, "de origen natural" significa que existe en la naturaleza sin ayuda artificial.
Marco de lectura abierto: Tal como se usa en esta invención, "marco de lectura abierto" u "ORF (Open reading frame)" se refiere a una secuencia que no contiene un codón de parada en un marco de lectura dado.
Unido operativamente: Tal como se usa en esta invención, la frase "unido operativamente" se refiere a una conexión funcional entre dos o más moléculas, construcciones, transcripciones, entidades, restos o similares.
Paciente: Tal como se usa en esta invención, "paciente" se refiere a un sujeto que puede buscar o necesitar tratamiento, que requiere tratamiento, está recibiendo tratamiento, recibirá tratamiento o un sujeto que está bajo el cuidado de un profesional capacitado para una enfermedad o afección particular.
Opcionalmente sustituido: En esta invención, una frase de la forma "X opcionalmente sustituido" (p.ej., alquilo opcionalmente sustituido) pretende ser equivalente a "X, donde X está opcionalmente sustituido" (p.ej., "alquilo, donde dicho alquilo está opcionalmente sustituido"). No pretende significar que la característica "X" (p.ej. alquilo) per se sea opcional. Péptido: Como se usa en esta invención, "péptido" tiene una longitud inferior o igual a 50 aminoácidos, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos de longitud.
Péptido: Tal como se usa en esta invención, "péptido" tiene una longitud menor o igual a 50 aminoácidos, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos de longitud.
Composición farmacéutica: La frase "composición farmacéutica" se refiere a una composición que altera la etiología de una enfermedad, trastorno y/o condición.
Farmacéuticamente aceptable: La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea en esta invención para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin una excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una proporción razonable de beneficio/riesgo.
Excipientes farmacéuticamente aceptables: La frase "excipiente farmacéuticamente aceptable", tal como se usa en esta invención, se refiere a cualquier ingrediente que no sean los compuestos descritos en esta invención (por ejemplo, un vehículo capaz de suspender o disolver el compuesto activo) y que tenga las propiedades de ser sustancialmente no tóxico y no -inflamatorio en un paciente. Los excipientes pueden incluir, por ejemplo: antiadherentes, antioxidantes, aglutinantes, recubrimientos, auxiliares de compresión, desintegrantes, colorantes (colores), emolientes, emulsionantes, rellenos (diluyentes), formadores de película o recubrimientos, sabores, fragancias, deslizantes (que mejoran flujo), lubricantes, conservantes, tintas de impresión, sorbentes, agentes de suspensión o dispersantes, edulcorantes y aguas de hidratación. Ejemplos de excipientes incluyen, pero no se limitan a: hidroxitolueno butilado (BHT), carbonato de calcio, fosfato de calcio (dibásico), estearato de calcio, croscarmelosa, polivinil pirrolidona reticulada, ácido cítrico, crospovidona, cisteína, etilcelulosa, gelatina, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa, lactosa, estearato de magnesio, maltitol, manitol, metionina, metilcelulosa, metil parabeno, celulosa microcristalina, polietileno glicol, polivinilpirrolidona, povidona, almidón pregelatinizado, propilparabeno, palmitato de retinilo, laca, dióxido de silicio, carboximetil celulosa de sodio, citrato de sodio, glicolato almidón de sodio, sorbitol, almidón (maíz), ácido esteárico, sacarosa, talco, dióxido de titanio, vitamina A, vitamina E, vitamina C y xilitol.
Sales farmacéuticamente aceptables: La presente divulgación también incluye sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en esta invención. Tal como se usa en esta invención, "sales farmacéuticamente aceptables" hace referencia a derivados de los compuestos descritos donde se modifica el compuesto principal al convertir un resto básico o ácido existente en su forma de sal (por ejemplo, haciendo reaccionar el grupo de base libre con un ácido orgánico adecuado). Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque no se limitan a, sales de ácidos minerales u orgánicos de residuos básicos tales como aminas; sales alcalinas u orgánicas de residuos ácidos tales como ácidos carboxílicos y similares. Las sales de adición ácida representativas incluyen sales de acetato, adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidroxibromuro, hidroxicloruro, hidroyoduro, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, sulfato de laurilo, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, toluenosulfonato, undecanoato, valerato y similares. Sales de metales alcalinos o alcalinotérreos representativas incluyen sales de sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares, así como amonio no tóxico, amonio cuaternario y cationes de amina, incluidos, entre otros, amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina. , trimetilamina, trietilamina, etilamina y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente descripción incluyen las sales no tóxicas convencionales del compuesto precursor formadas, por ejemplo, a partir de ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos. Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente descripción se pueden sintetizar a partir del compuesto principal que contiene un resto ácido o básico mediante procedimientos químicos convencionales. Generalmente, tales sales pueden prepararse haciendo reaccionar las formas de ácido o base libres de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o ácido apropiado en agua o en un solvente orgánico, o en una mezcla de los dos; generalmente, se prefieren medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Listas de sales adecuadas se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418 y Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 (1977).
Farmacocinética: Tal como se usa en esta invención, "farmacocinética" se refiere a una o más propiedades de una molécula o compuesto en lo que se refiere a la determinación del destino de las sustancias administradas a un organismo vivo. La farmacocinética se divide en varias áreas que incluyen el grado y la velocidad de absorción, distribución, metabolismo y excreción. Esto se conoce comúnmente como ADME donde: (A) Absorción es el procedimiento de una sustancia que ingresa a la circulación sanguínea; (D) Distribución es la dispersión o diseminación de sustancias por los fluidos y tejidos del cuerpo; (M) Metabolismo (o biotransformación) es la transformación irreversible de compuestos parentales en metabolitos hijos; y (E) Excreción (o eliminación) se refiere a la eliminación de las sustancias del cuerpo. En casos raros, algunos fármacos se acumulan irreversiblemente en el tejido corporal.
Solvato farmacéuticamente aceptable: El término "solvato farmacéuticamente aceptable", tal como se usa en esta invención, significa un compuesto de la divulgación donde se incorporan moléculas de un disolvente adecuado en la red cristalina.: Un disolvente adecuado es fisiológicamente tolerable a la dosis administrada. Por ejemplo, los solvatos se pueden preparar mediante cristalización, recristalización o precipitación a partir de una solución que incluye disolventes orgánicos, agua o una mezcla de los mismos. Ejemplos de disolventes adecuados son etanol, agua (por ejemplo, mono, di y trihidratos), /V-metilpirrolidinona (NMP), dimetil sulfóxido (DMSO), W,W-dimetilformamida (DMF), W,W-dimetilacetamida (DMAC), 1,3-dimetil-2-imidazolidinona (DMEU), 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2-(1 h )-pirimidinona (DMPU), acetonitrilo (ACN), propilenglicol, acetato de etilo, alcohol bencílico, 2-pirrolidona, benzoato de bencilo, y similares. Cuando el agua es el disolvente, el solvato se denomina "hidrato".
Fisicoquímica: Tal como se usa en esta invención, "fisicoquímica" significa o se relaciona con una propiedad física y/o química.:
Prevenir: Como se usa en esta invención, el término "impedir" se refiere a retrasar parcial o completamente la aparición de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección; retrasar parcial o completamente la aparición de uno o más síntomas, características o manifestaciones clínicas de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección particular; retrasar parcial o completamente la aparición de uno o más síntomas, características o manifestaciones de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección particular; retrasar parcial o completamente la progresión de una infección, una enfermedad, trastorno y/o afección particular; y/o disminuir el riesgo de desarrollar patología asociada con la infección, la enfermedad, trastorno y/o afección.
Profármaco: La presente divulgación también incluye profármacos de los compuestos descritos en esta invención. Como se usa en esta invención, "profármacos" se refiere a cualquier sustancia, molécula o entidad que se encuentra en una forma predicada para que esa sustancia, molécula o entidad actúe como terapéutica tras una alteración química o física. Los profármacos pueden unirse covalentemente o secuestrarse de alguna manera y liberan o se convierten en el resto de fármaco activo antes, durante o después de su administración a un sujeto mamífero. Los profármacos se pueden preparar modificando los grupos funcionales presentes en los compuestos de tal manera que las modificaciones se escindan, ya sea en la manipulación de rutina o in vivo, a los compuestos originales. Los profármacos incluyen compuestos donde los grupos hidroxilo, amino, sulfhidrilo o carboxilo están unidos a cualquier grupo que, cuando se administra a un sujeto mamífero, se escinde para formar un grupo hidroxilo, amino, sulfhidrilo o carboxilo libre, respectivamente. La preparación y el uso de profármacos se analizan en T. Higuchi y V. Stella, "Prodrugs as Novel Delivery Systems," Vol. 14 de la A.C.S. Symposium Series, y en Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987.
Sitio de escisión de proteínas: Tal como se usa en esta invención, "sitio de escisión de proteínas" se refiere a un sitio donde se puede lograr la escisión controlada de la cadena de aminoácidos por medios químicos, enzimáticos o fotoquímicos.
Señal de escisión de proteínas: Tal como se usa en esta invención, "señal de escisión de proteínas" se refiere a al menos un aminoácido que marca o señala un polipéptido para la escisión.
Proteína de interés: Como se usa en esta invención, los términos "proteínas de interés" o "proteínas deseadas" incluyen las proporcionadas en esta invención y fragmentos, mutantes, variantes y alteraciones de las mismas.
Proximal: Tal como se usa en esta invención, el término "proximal" significa situado más cerca del centro o a un punto o región de interés.
Pseudouridina: Como se usa en esta invención, pseudouridina se refiere al isómero C-glucósido del nucleósido uridina. Un "análogo de pseudouridina" es cualquier modificación, variante, isoforma o derivado de pseudouridina. Por ejemplo, los análogos de pseudouridina incluyen pero no se limitan a 1-carboximetil-pseudouridina, 1-propinil-pseudouridina, 1-taurinometil-pseudouridina, 1-taurinometil-4-tio-pseudouridina, 1-metilpseudouridina (m1^ ), 1- metil-4-tiopseudouridina (m1s4^ ), 4-tio-1-metil-pseudouridina, 3-metil-pseudouridina (m3^ ), 2-tio-1-metil-pseudouridina, 1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, dihidropseudouridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-metoxiuridina, 2-metoxi-4-tio-uridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4- metoxi-2-tio-pseudouridina, N1-metil-pseudouridina, l-metil-3- (3-amino-3-carboxipropil) pseudouridina (acp3^ ) y 2-O-metil-pseudouridina (^m).
Purificado: Como se usa en esta invención, "purificar", "purificado", "purificación" significa hacer sustancialmente puro o claro a partir de componentes no deseados, contaminación del material, mezcla o imperfección.
Reducción del efecto: Como se usa en esta invención, la frase "reducción del efecto" cuando se refiere a los síntomas, significa reducir, eliminar o aliviar el síntoma en el sujeto. No significa necesariamente que el síntoma, de hecho, será completamente eliminado, reducido o aliviado.
Muestra: Como se usa en esta invención, el término "muestra" o "muestra biológica" se refiere a un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes (por ejemplo, fluidos corporales, que incluyen, entre otros, sangre, moco, líquido linfático, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, saliva, líquido amniótico, sangre del cordón amniótico, orina, líquido vaginal y semen). Una muestra puede incluir además un homogeneizado, lisado o extracto preparado a partir de un organismo completo o un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes, o una fracción o porción de los mismos, incluyendo pero no limitado a, por ejemplo, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, las secciones externas de la piel, tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, glóbulos, tumores, órganos. Una muestra se refiere además a un medio, como un caldo o gel nutritivo, que puede contener componentes celulares, como proteínas o molécula de ácido nucleico.
Muestra: Como se usa en esta invención, el término "muestra" o "muestra biológica" se refiere a un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes (por ejemplo, fluidos corporales, incluidos, entre otros, sangre, mucosidad, líquido linfático, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, saliva , líquido amniótico, sangre de cordón amniótico, orina, líquido vaginal y semen). Una muestra puede incluir además un homogeneizado, lisado o extracto preparado a partir de un organismo completo o un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes, o una fracción o porción de los mismos, incluyendo pero no limitado a, por ejemplo, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, las secciones externas de la piel, tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, glóbulos, tumores, órganos. Una muestra se refiere además a un medio, como un caldo o gel nutritivo, que puede contener componentes celulares, como proteínas o molécula de ácido nucleico.
Semilla: Como se usa en esta invención con respecto al micro ARN (miARN), una "semilla" de miARN es una secuencia con identidad de nucleótidos en las posiciones 2-8 del miARN maduro. En un caso, una semilla de miARN comprende las posiciones 2-7 del miARN maduro.
Efecto secundario: Como se usa en esta invención, la frase "efecto secundario" se refiere a un efecto secundario del tratamiento.
Secuencias de péptido señal: Como se usa en esta invención, la frase "secuencias de péptido señal" se refiere a una secuencia que puede dirigir el transporte o la localización de una proteína.
Similaridad: Tal como se usa en esta invención, el término "similaridad" se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, p.ej. entre moléculas de polinucleótidos (p.ej. moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas polipeptídicas. El cálculo del porcentaje de similitud de moléculas poliméricas entre sí se puede realizar de la misma manera que el cálculo del porcentaje de identidad, excepto que el cálculo del porcentaje de similitud tiene en cuenta las sustituciones conservadoras como se entiende en la técnica.
Dosis dividida: Tal como se usa en esta invención, una "dosis dividida" es la división de la dosis unitaria única o la dosis diaria total en dos o más dosis.
Estable: Como se usa en esta invención, "estable" se refiere a un compuesto que es suficientemente robusto para sobrevivir al aislamiento hasta un grado útil de pureza a partir de una mezcla de reacción, y preferiblemente capaz de formularse en un agente terapéutico efectivo.
Estabilizado: Tal como se usa en esta invención, el término "estabilizar", "estabilizado", "región estabilizada" significa hacer o volverse estable.
Sujeto: Tal como se usa en esta invención, el término “sujeto” o "paciente" hace referencia a cualquier organismo al que se pueda administrar una composición según la invención, p.ej., con fines experimentales, diagnósticos, profilácticos, y/o terapéuticos. Sujetos típicos incluyen animales (p.ej., mamíferos tales como ratones, ratas, conejos, primates no humanos y humanos) y/o plantas.
Sustancialmente: Tal como se usa en esta invención, el término "sustancialmente" se refiere a la condición cualitativa de mostrar una medida o grado total, o casi total, de una característica o propiedad de interés. Un experto en la materia biológica comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos en raras ocasiones, si es que ocurre, se completan y/o llegan a completarse o logran o evitan un resultado absoluto. El término "sustancialmente" se usa en esta invención, por lo tanto, para capturar la posible falta de compleción inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos.
Sustancialmente igual: Tal como se usa en esta invención en relación con las diferencias de tiempo entre dosis, el término significa más/menos 2 %.
Sustancialmente simultáneamente: Tal como se usa en esta invención y en lo que se refiere a una pluralidad de dosis, el término significa dentro de 15 segundos.
Que padece: Un individuo "que padece" una enfermedad, trastorno y/o afección ha sido diagnosticado y/o presenta uno o más síntomas de una enfermedad, trastorno y/o afección.
Susceptible a: Una persona que es "susceptible a" una enfermedad, trastorno o afección no ha sido diagnosticada o puede no presentar síntomas de la enfermedad, trastorno o afección, pero tiene una propensión a desarrollar una enfermedad o sus síntomas. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección (por ejemplo, cáncer) puede caracterizarse por uno o más de los siguientes: (1) una mutación genética asociada con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (2) un polimorfismo genético asociado con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (3) expresión y/o actividad aumentada y/o disminuida de una proteína y/o ácido nucleico asociado con la enfermedad, trastorno y/o afección; (4) hábitos y/o estilos de vida asociados con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (5) antecedentes familiares de la enfermedad, trastorno y/o afección; y (6) exposición y/o infección con un microbio asociado con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunos casos, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección desarrollará la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunos casos, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección no desarrollará la enfermedad, trastorno y/o afección.
Síntoma: Tal como se usa en esta invención, el término "síntoma" es una señal de una enfermedad, trastorno y/o condición. Por ejemplo, el sujeto que los tiene puede sentir o notar los síntomas, pero es posible que no se pueda acceder a ellos fácilmente observando la apariencia externa o los comportamientos del sujeto. Ejemplos de síntomas incluiyen, entre otros, debilidad, dolores y molestias, fiebre, fatiga, pérdida de peso, coágulos de sangre, aumento de los niveles de calcio en la sangre, recuento bajo de glóbulos blancos, dificultad para respirar, mareos, dolores de cabeza, hiperpigmentación, ictericia, ertema, prurito, crecimiento excesivo de vello, cambios en los hábitos intestinales, cambios en la función de la vejiga, llagas duraderas, manchas blancas dentro de la boca, manchas blancas en la lengua, sangrado o secreción inusual, engrosamiento o bulto en partes del cuerpo , indigestión, dificultad para tragar, cambios en verrugas o lunares, cambios en la piel nueva y tos persistente o ronquera.
Sintético: El término "sintético" significa producido, preparado y/o fabricado por la mano del hombre. La síntesis de polinucleótidos o polipéptidos u otras moléculas de la presente divulgación puede ser química o enzimática.
Células diana: Tal como se usa en esta invención, "células diana" se refiere a una o más células de interés. Las células se pueden encontrar in vitro, in vivo, in situ o en el tejido u órgano de un organismo. El organismo puede ser un animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano y lo más preferiblemente un paciente.
Región terminal: Como se usa en esta invención, el término "región terminal" se refiere a una región en el extremo 5' o 3' de una región de nucleósidos enlazados que codifican un polipéptido de interés o una región codificante.
Terminalmente optimizado: El término "terminalmente optimizado" cuando se refiere a ácidos nucleicos significa que las regiones terminales del ácido nucleico se han mejorado con respecto a las regiones terminales nativas.
Agente terapéutico: El término "agente terapéutico" se refiere a cualquier agente que, tras ser administrado a un sujeto, tiene un efecto terapéutico, diagnóstico y/o profiláctico, y/o produce un efecto farmacológico y/o biológico deseado.
Cantidad terapéuticamente efectiva: Tal como se usa en esta invención, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad de un agente a administrar (p.ej., ácido nucleico, fármaco, agente terapéutico, agente de diagnóstico, agente profiláctico, etc.) que es suficiente, cuando se administra. a un sujeto que padece o es susceptible a una infección, enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, mejorar los síntomas, diagnosticar, impedir y/o retrasar la aparición de la infección, enfermedad, trastorno y/o afección.
Cantidad terapéuticamente efectiva: Tal como se usa en esta invención, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad de un agente a administrar (p.ej., ácido nucleico, fármaco, agente terapéutico, agente de diagnóstico, agente profiláctico, etc.) que es suficiente, cuando se administra. a un sujeto que padece o es susceptible a una infección, enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, mejorar los síntomas, diagnosticar, impedir y/o retrasar la aparición de la infección, enfermedad, trastorno y/o afección.
Dosis diaria total: Tal como se usa en esta invención, una "dosis diaria total" es una cantidad administrada o prescrita en un período de 24 horas. Puede administrarse como una dosis unitaria única.
Factor de transcripción: Como se usa en esta invención, el término "factor de transcripción" se refiere a una proteína de unión al ADN que regula la transcripción del ADN en ARN, por ejemplo, mediante la activación o represión de la transcripción. Algunos factores de transcripción efectúan la regulación de la transcripción por sí solos, mientras que otros actúan en conjunto con otras proteínas. Algún factor de transcripción puede activar y reprimir la transcripción bajo ciertas condiciones. En general, los factores de transcripción se unen a una secuencia o secuencias diana específicas muy similares a una secuencia consenso específica en una región reguladora de un gen diana. Los factores de transcripción pueden regular la transcripción de un gen diana solo o en un complejo con otras moléculas.
Tratar: Tal como se usa en esta invención, el término "tratar" se refiere a aliviar, mejorar, inhibir, impedir, retrasar el inicio de, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección particular. Por ejemplo, "tratar" el cáncer puede referirse a inhibir la supervivencia, el crecimiento, y/o diseminación de un tumor. El tratamiento puede administrarse a un sujeto que no muestra signos de una enfermedad, trastorno y/o afección, y/o a un sujeto que muestra únicamente síntomas iniciales de la enfermedad, trastorno y/o afección, con el fin de disminuir el riesgo de desarrollar patologías asociadas con la enfermedad, trastorno y/o afección.
Sin modificar: Tal como se usa en esta invención, "sin modificar" se refiere a cualquier sustancia, compuesto o molécula antes de ser cambiado de alguna manera. Sin modificar puede, pero no siempre, referirse al tipo salvaje o la forma nativa de una biomolécula. Las moléculas pueden sufrir una serie de modificaciones mediante las cuales cada molécula modificada puede servir como la molécula de partida "no modificada" para una modificación posterior.
En las reivindicaciones, los artículos como “un”, “una”, “el” y “ la” pueden significar uno o más de uno, a menos que se indique lo contrario o que resulte evidente a partir del contexto. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno o todos los miembros del grupo están presentes, son empleados o, de lo contrario, son relevantes para un producto o procedimiento determinado, a menos que se indique lo contrario o que resulte evidente a partir del contexto. La invención incluye realizaciones donde exactamente un miembro del grupo está presente, se emplea o de otro modo es relevante para un producto o procedimiento dado. La invención incluye realizaciones donde más de uno o todos los miembros del grupo están presentes, son empleados o, de lo contrario, son relevantes para un producto o procedimiento determinado.
También se señala que el término "que comprende" está destinado a ser abierto y permite la inclusión de elementos o etapas adicionales.
Cuando se dan los intervalos, se incluyen los puntos finales. Además, debe entenderse que, a menos que se indique lo contrario o sea evidente del contexto y la comprensión de un experto en la materia, los valores que se expresan como intervalos pueden asumir cualquier valor específico o subintervalo dentro de los intervalos establecidos en diferentes realizaciones del invención, a la décima parte de la unidad del límite inferior del intervalo, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Producción de ARNm modificado
Los ARNm modificados según la divulgación se fabrican usando procedimientos y materiales de laboratorio estándar.
El marco de lectura abierto con varias regiones corriente arriba o aguas abajo (globina p, etiquetas, etc.) se pide a DNA2.0 (Menlo Park, CA) y normalmente contiene un sitio de clonación múltiple con reconocimiento Xbal. Al recibir la construcción, se reconstituye y se transforma en E. co/iquímicamente competente. Para el presente ejemplo, se utiliza E. co/i competente NEB DH5-alfa. En la Figura 3 se muestra un mapa de clones típico. Las transformaciones se realizan según las instrucciones de NEB utilizando 100 ng de plásmido. El protocolo es el siguiente:
1. Descongelar un tubo de células de E. co/i competentes NEB 5-alfa en hielo durante 10 minutos.
2. Añadir 1-5 pl que contengan 1 pg-100 ng de ADN plasmídico a la mezcla de células. Mover con cuidado el tubo de 4 a 5 veces para mezclar las células y el ADN. No agitar.
3. Colocar la mezcla en hielo durante 30 minutos. No mezclar.
4. Choque de calor a 42 °C durante exactamente 30 segundos. No mezclar.
5. Colocar en hielo durante 5 minutos. No mezclar.
6. Pipetear 950 pl de SOC a temperatura ambiente en la mezcla.
7. Colocar a 37 °C durante 60 minutos. Agitar vigorosamente (250 rpm) o girar.
8. Calentar las placas de selección a 37 ° C.
9. Mezclar bien las células moviendo el tubo e invirtiéndolo.
10. Distribuir 50-100 pl de cada dilución en una placa de selección e incubar durante la noche a 37 °C. Alternativamente, incubar a 30 °C durante 24-36 horas o 25 °C durante 48 horas.
A continuación se usa una sola colonia para inocular 5 ml de medio de crecimiento LB usando el antibiótico apropiado y a continuación se deja crecer (250 RPM, 37 °C) durante 5 horas. A continuación, se utiliza para inocular un medio de cultivo de 200 ml y se deja crecer durante la noche en las mismas condiciones.
Para aislar el plásmido (hasta 850 |jg), se realiza una preparación máxima utilizando el kit Invitrogen PureLink™ HiPure Maxiprep (Carlsbad, c A), siguiendo las instrucciones del fabricante.
Para generar cDNA para la transcripción In Vitro (IVT), el plásmido primero se linealiza usando una enzima de restricción como Xbal. Una digestión de restricción típica con Xbal comprenderá lo siguiente: Plásmido 1,0 pg; tampón 10x 1,0 pl; Xbal 1,5 pl; dH20 hasta 10 pl; se incubó a 37 °C durante 1 h. Si se realiza a escala de laboratorio (<5 pg), la reacción se limpia con el Micro Kit PureLink™ PCR de Invitrogen (Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. Es posible que sea necesario realizar una purificación a gran escala con un producto que tenga una mayor capacidad de carga, como el kit de PCR estándar PURELINK de Invitrogen (Carlsbad, CA). Después de la limpieza, el vector linealizado se cuantifica usando el NanoDrop y se analiza para confirmar la linealización usando electroforesis en gel de agarosa.
Como ejemplo no limitante, G-CSF puede representar el polipéptido de interés. Las secuencias utilizadas en las etapas descritas en los Ejemplos 1-5 se muestran en la Tabla 16. Cabe señalar que el codón de inicio (ATG) se ha subrayado en cada secuencia de la Tabla 16.
Tabla 16. Secuencias G-CSF
Figure imgf000272_0001
Figure imgf000273_0001
Ejemplo 2. PCR para la producción de ADNc
Los procedimientos de PCR para la preparación de ADNc se realizan usando 2x KAPA HIFI™ HotStart ReadyMix por Kapa Biosystems (Woburn, Ma ). Este sistema incluye 2x KAPA ReadyMix12,5 pl; Cebador directo (10 uM); 0,75 pl; Cebador inverso (10 uM) 0,75 pl; ADNc Plantilla; -100 ng; y dH20 diluido a 25,0 pl. Las condiciones de reacción son a 95 °C durante 5 min. y 25 ciclos de 98 °C durante 20 segundos, a continuación 58 °C durante 15 segundos, a continuación 72 °C durante 45 segundos, a continuación 72 °C durante 5 min. a continuación 4 °C hasta la terminación. El cebador inverso de la presente divulgación incorpora un poli-T 120 para un poli-A120 en el ARNm. Se pueden usar otros cebadores inversos con tractos poli(T) más largos o más cortos para ajustar la longitud de la cola poli(A) en el ARNm.
La reacción se limpia con el micro kit PureLink™ PCR de Invitrogen (Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante (hasta 5 pg) Las reacciones más grandes requerirán una limpieza con un producto de mayor capacidad. Después de la limpieza, el ADNc se cuantifica usando el NanoDrop y se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa para confirmar que el ADNc tiene el tamaño esperado. A continuación, el ADNc se envía para análisis de secuenciación antes de proceder a la reacción de transcripción in vitro .
Ejemplo 3. Transcripción In vitro
La reacción de transcripción in vitro genera ARNm que contiene nucleótidos modificados o ARN modificado. La mezcla de trifosfato de nucleótidos de entrada (NTP) se fabrica internamente utilizando NTP naturales y no naturales.
Una reacción de transcripción in vitro típica incluye lo siguiente:
1. 1. Plantilla de ADNc 1,0 pg
2. 2. 10x solución tampón de transcripción (Tris-HCl 400 mM pH 8,0, MgCl2 190 mM, DTT 50 mM, espermidina 10 mM) 2,0 pl
3. 3. NTP a la medida (cada uno 25 mM) 7,2 pl
4. 4. Inhibidor RNasa 20 U
5. 5. ARN polimerasa T73000 U
6. 6. dH20 hasta 20.0 pl. y
7. 7. Incubación a 37 °C durante 3h-5h.
La mezcla cruda de IVT se puede almacenar a 4 ° C durante la noche para su limpieza al día siguiente. A continuación se usa 1 U de DNasa libre de RNasa para digerir la plantilla original. Después de 15 minutos de incubación a 37 °C, el ARNm se purifica usando el kit MEGAclear™ de Ambion (Austin, TX) siguiendo las instrucciones del fabricante. Este kit puede purificar hasta 500 pg de ARN. Después de la limpieza, el ARN se cuantifica utilizando el NanoDrop y se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa para confirmar que el ARN tiene el tamaño adecuado y que no se ha producido degradación del ARN.
Ejemplo 4. Protección enzimática de ARNm
La protección del ARNm se realiza de la siguiente manera donde la mezcla incluye: IVT RNA 60 pg-180 pg y dH20 hasta 72 pl. La mezcla se incuba a 65 °C durante 5 minutos para desnaturalizar el ARN y a continuación se transfiere inmediatamente a hielo.
A continuación, el protocolo implica la mezcla de tampón de protección 10x (Tris-HCl 0,5 M (pH 8,0), KCl 60 mM, MgCl2 12,5 mM (10,0 pl); GTP 20 mM (5,0 pl); S-adenosil metionina 20 mM (2,5 pl); Inhibidor de ARNasa (100 U); 2'-0-metiltransferasa (400 U); Enzima de protección contra Vaccinia (Guanilil transferasa) (40 U); dH20 (hasta 28 pl); e incubación a 37 °C durante 30 minutos para 60 pg de ARN o hasta 2 horas para 180 pg de ARN.
A continuación, el polinucleótido se purifica usando el kit MEGAclear™ de Ambion (Austin, TX) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la limpieza, el ARN se cuantifica con NANODROP™ (ThermoFisher, Waltham, MA) y se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa para confirmar que el ARN tiene el tamaño adecuado y que no se ha producido ninguna degradación. El producto de ARN también se puede secuenciar ejecutando una PCR de transcripción inversa para generar el ADNc para la secuenciación.
Ejemplo 5. Reacción de descolado de poliA
Sin una poli-T en el ADNc, se debe realizar una reacción de descolado de poli-A antes de limpiar el producto final. Esto se hace mezclando ARN de IVT protegido (100 pl); Inhibidor de ARNasa (20 U); Tampón de descolado 10x (Tris-HCl 0,5 M (pH 8,0), NaCl 2,5 M, MgCl2100 mM)(12,0 pl); 20 mM ATP (6,0 pl); Poli-A Polimerasa (20 U); dH20 hasta 123,5 pl e incubación a 37 °C durante 30 min. Si la cola de poli-A ya está en la transcripción, a continuación la reacción de descolado puede omitirse y proceder directamente a la limpieza con el kit MEGAclear™ de Ambion (hasta 500 pg). La polimerasa poli-A es preferiblemente una enzima recombinante expresada en levadura.
Para los estudios realizados y descritos en esta invención, la cola poli-A está codificada en la plantilla IVT para comprender 160 nucleótidos de longitud. Sin embargo, debe entenderse que la procesividad o la integridad de la reacción de descolado de poli-A no siempre pueden dar como resultado exactamente 160 nucleótidos. Por tanto, colas poliA de aproximadamente 160 nucleótidos, por ejemplo, aproximadamente 150-165, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 o 165, están dentro del alcance de la invención.
Ejemplo 6. Caperuzas naturales en 5’ y análogos de caperuzas en 5’
La protección en 5' de los polinucleótidos se puede completar de manera concomitante durante la reacción de transcripción in vitro, usando los siguientes análogos químicos de protección de ARN para generar la estructura de protección de 5'-guanosina según los protocolos del fabricante: 3'-O-Me-m7G(5') ppp(5') G; G(5')ppp(5')A; G(5')ppp(5')G; m7G(5')ppp(5')A; m7G(5')ppp(5')G (New England BioLabs, Ipswich, Ma ). La protección 5' del a Rn modificado puede completarse después de la transcripción utilizando una enzima de protección del virus Vaccinia para generar la estructura "Cap 0": m7G(5')ppp(5')G (New England BioLabs, Ipswich, MA). La estructura Cap 1 puede generarse usando tanto la Enzima de Protección del Virus Vaccinia como una 2'-O metil-transferasa para generar: m7G (5') ppp (5') G-2'-O-metilo. La estructura Cap 2 puede generarse a partir de la estructura Cap 1 seguida de la 2'-O-metilación del nucleótido 5'-antepenúltimo usando una 2'-O metiltransferasa. La estructura Cap 3 puede generarse a partir de la estructura Cap 2 seguida de la 2'-O-metilación del nucleótido 5'-preantepenúltimo usando una 2'-O metiltransferasa. Las enzimas se derivan preferiblemente de una fuente recombinante.
Cuando se transfectan en células de mamífero, los ARNm modificados tienen una estabilidad de entre 12-18 horas, o mayor que 18 horas, por ejemplo, 24, 36, 48, 60, 72, o mayor que 72 horas.
Ejemplo 7. Caperuza química vs. Ensayo de expresión de proteína de Caperuza derivada enzimáticamente
Los ARNm sintéticos que codifican G-CSF humano que contienen el análogo cap ARCA o la estructura Cap1 se pueden transfectar en queratinocitos primarios humanos a concentraciones iguales. 6, 12, 24 y 36 horas después de la transfección, la cantidad de G-CSF secretada en el medio de cultivo puede ensayarse mediante ELISA. Los polinucleótidos sintéticos que secretan altos niveles de proteína al medio corresponden a un polinucleótido sintético con una estructura de Caperuza competente traduccionalmente mayor.
Ejemplo 8. Caperuza química vs. Análisis de pureza de caperuza derivada enzimáticamente
Los ARNm sintéticos que codifican G-CSF humano que contienen el análogo de caperuza ARCA o los productos de síntesis crudos de la estructura Cap1 se pueden comparar en cuanto a pureza mediante electroforesis en gel de agarosa-urea desnaturalizante o análisis HPLC. Los polinucleótidos de ARN con una banda consolidada única por electroforesis corresponden al producto de mayor pureza comparado con los polinucleótidos con múltiples bandas o bandas veteadas. Los polinucleótidos de ARN modificados químicamente con un único pico de HPLC también corresponderán a un producto de mayor pureza. La reacción de protección con mayor eficacia proporcionarán una población de ARNm más pura.
Ejemplo 9. Caperuza química vs. Análisis de citoquinas de Caperuza derivadas enzimáticamente
Los ARNm sintéticos que codifican el G-CSF humano que contiene el análogo de caperuza ARCA o la estructura Cap1 se pueden validar en queratinocitos primarios humanos a múltiples concentraciones 6, 12, 24 y 36 horas después de la transfección, la cantidad de citoquinas proinflamatorias como TNF-alfa y el IFN-beta secretado en el medio de cultivo puede analizarse mediante ELISA. Los ARNm sintéticos que secretan niveles más altos de citocinas proinflamatorias en el medio corresponden a un ARNm sintético que contiene una estructura de caperuza inmuno-activante.
Ejemplo 10. Caperuza química vs. Eficiencia de la reacción de protección por caperuza derivada enzimáticamente
Los ARNm sintéticos que codifican G-CSF humano que contienen el análogo de caperuza ARCA o la estructura Cap1 se pueden analizar para determinar la eficacia de la reacción de protección mediante LC-MS después del tratamiento con nucleasa de ARNm protegida. El tratamiento con nucleasa de ARNm protegidos produce una mezcla de nucleótidos libres y la estructura de la caperuza de 5'-5-trifosfato protegida detectable por LC-MS. La cantidad de producto protegido en los espectros de LC-MS se expresa como un porcentaje del ARNm total de la reacción y correspondería a la eficacia de la reacción de protección. La estructura de caperuza con mayor eficiencia de reacción de protección tendría una mayor cantidad de producto protegido por LC-MS.
Ejemplo 11. Electroforesis en gel de agarosa de ARN modificado o productos de PCR de RT
Se cargan polinucleótidos individuales (200-400 ng en un volumen de 20 j l ) o productos de PCR transcritos inversamente (200-400 ng) en un pocillo en un E-Gel de agarosa al 1,2 % no desnaturalizante (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se corren durante 12-15 minutos según el protocolo del fabricante.
Ejemplo 12. Cuantificación de ARN modificado con Nanodrop y Datos espectrales UV
Cuantificación de ARN modificado con Nanodrop y datos espectrales UV: Los ARN modificados en tampón TE (1 j l) se utilizan para las lecturas de absorbancia UV de Nanodrop para cuantificar el rendimiento de cada ARN modificado a partir de una reacción de transcripción in vitro .
Ejemplo 13. Transcripción in vitro de ARN modificado que contiene longitudes de cola poli-A variables
Los ARNm modificados se fabricaron utilizando procedimientos y materiales de laboratorio estándar para la transcripción in vitro, con la excepción de que la mezcla de nucleótidos contiene nucleótidos modificados. Los ARNm modificados del presente ejemplo incluían 5-metocitosina y pseudouridina. El marco de lectura abierto (ORF) del gen de interés está flanqueado por una región no traducida (UTR) 5' que contiene una fuerte señal de iniciación de la traducción Kozak y una UTR 3' de globina alfa que termina con una secuencia de oligo(dT) para la adición moldeada de una cola poliA para ARN modificados que no incorporan análogos de adenosina. Los ARNmod que contienen adenosina se sintetizan sin una secuencia de oligo (dT) para permitir el descolado de poli (A) polimerasa poli-(A) posterior a la transcripción. Se generaron longitudes de cola poli-a de 0 nts, 80 nts, 120 nts, 160 nts para G-CSF humano. Las secuencias de G-CSF incluyen la secuencia de cDNA (SEQ ID NO: 4257), la secuencia de ARNm (SEQ ID NO: 4258) y la secuencia de proteína (SEQ ID NO: 4259). La detección de G-CSF se puede realizar mediante los conjuntos de sonda de cebador para cDNA, incluido el cebador directo TTG GAC CCT CGT ACA GAA GCT AAT ACG (SEQ ID NO: 4260), un cebador inverso para la plantilla Poly(A) descolado T(12ü) CT TCC TAC TCA GGC TTT ATT CAA AGA CCA (SEQ ID NO: 4261) y un cebador inverso para descolado de poli(A) polimerasa postranscripcionales CTT CCT ACT CAG GCT TTA t TC AAA GAC CA (Se D ID NO: 4262). La detección también se puede realizar mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) de molécula de ácido nucleico modificada con G-CSF, cebador directo TGG CCG GTC Cc G CGA CCC AA (SEQ ID NO: 4263) y cebador inverso GCT TCA CGG CTG CGC AAG AT (SEC ID N°: 4264).
Los cebadores inversos sintetizados se diseñaron y encargaron a IDT. Los cebadores inversos incorporan poli-T40, poli-T80, poli-T 120, poli-T 160 para poli-A40, poli-A80, poli-A120 y poli-A160 respectivamente. El riñón embrionario humano (HEK) 293 se cultivó en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) y suero bovino fetal al 10 % (FBS) hasta que alcanzaron una confluencia de 80-90 %. Se transfectaron aproximadamente 80000 células con 100 ng y 500 ng de ARN modificado complejado con RNAiMax de Invitrogen (Carlsbad, CA) en una placa de 24 pocillos. los RNA:RNAiMax El complejo se formó incubando primero el RNAiMax con EMEM en una dilución volumétrica 5X durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Luego, el vial de ARN se mezcló con el vial de RNAiMAX y se incubó durante 20-30 a temperatura ambiente antes de agregarlo a las células gota a gota. Se añadió G-CSF humano recombinante en 2ng/mL a los pocillos de cultivo celular de control. La concentración de G-CSF humano secretado se midió 12 horas después de la transfección.
La figura 4 muestra el histograma del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para G-CSF humano de células HEK293 transfectadas con ARN modificado con G-CSF humano que tenía colas de poli-A de diferentes longitudes: 0 nts, 80 nts, 120 nts, 160 nts. Observamos una mayor expresión de proteína con la cola poli-A de 160 nts.
A partir de los datos se puede determinar que las colas poli-A más largas producen más proteína y que esta actividad depende de la dosis.
Ejemplo 14. Expresión de ácido nucleico modificado con sitio de unión a microARN
Se sembraron células epiteliales de riñón embrionario humano (HEK293A) y hepatocitos humanos primarios (Hepatocitos) a una densidad de 200 000 por pocillo en 500 ul de medio de cultivo celular (medio InVitro GRO de Celsis, Chicago, IL). ARNm de G-CSF que tiene una globina alfa 3'UTR (G-CSF alfa) (la secuencia de ADNc se muestra en SEQ ID NO: 4265; la secuencia de ARNm se muestra en SEQ ID NO: 4266; la cola poliA de aproximadamente 160 nucleótidos no se muestra en secuencia; 5'Cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y pseudouridina) ARNm de G-CSF que tiene una globina alfa 3'UTR y un sitio de unión de miR-122 (G-CSF miR-122) (la secuencia de ADNc se muestra en SEQ ID NO: 4267; la secuencia de ARNm se muestra en SEQ ID NO: 4268; la cola poliA de aproximadamente 160 nucleótidos no se muestra en la secuencia; 5'Cap, Cap1; totalmente modificado con 5-metilcitidina y pseudouridina) o ARNm de G-CSF que tiene un 3'UTR de alfa-globina con cuatro sitios de unión de miR-122 con la semilla eliminada (G-CSF sin semilla) (la secuencia de cDNA se muestra en SEQ ID NO: 4269; la secuencia de ARNm se muestra en Se Q ID NO: 4270; la cola poliA de aproximadamente 160 nucleótidos no mostrados en la secuencia; 5'Cap, Cap1; totalmente modificado con 5-metilcitidina y pseudouridina) se analizó a una concentración de 250 ng por pocillo en placas de 24 pocillos. La expresión de G-CSF se midió por ELISA y los resultados se muestran en la Tabla 17
Tabla 17. Sitios de unión de miR-122
Figure imgf000276_0001
Dado que las células HEK293 no expresan miR-122, no hubo regulación negativa de la proteína G-CSF de la secuencia que contiene miR-122. Mientras que los hepatocitos humanos expresan altos niveles de miR-122 y se observó una disminución drástica de la proteína G-CSF cuando la secuencia de G-CSF contenía la secuencia diana de miR-122. En consecuencia, el ARNm funcionó como un ARNm auxotrófico.
Ejemplo 15. SAR dirigida de pseudouridina y N1-metil pseudouridina
Con el enfoque reciente en el nucleósido de pirimidina pseudouridina, se diseñaron una serie de estudios de actividad de estructura para investigar las modificaciones que contienen ARNm en pseudouridina o N1-metil-pseudourdina.
El estudio se diseñó para explorar el efecto de la longitud de la cadena, el aumento de la lipofilia, la presencia de estructuras de anillo y la alteración de las interacciones hidrofóbicas o hidrofílicas cuando se realizaron modificaciones en la posición N1, la posición C6, la posición 2, la posición 4 y en el esqueleto de fosfato. También se investigó la estabilidad.
Con este fin, se investigan modificaciones que implican alquilación, cicloalquilación, alquil-cicloalquilación, arilación, alquilaril-arilación, fracciones de alquilación con grupos amino, fracciones de alquilación con grupos de ácido carboxílico y fracciones de alquilación que contienen fracciones cargadas con aminoácidos. El grado de alquilación es generalmente C1-C6. Los ejemplos de modificaciones químicas incluyen las enumeradas en las Tablas 18 y 19.
Tabla 18. Pseudouridina N1-metil Pseudouridina SAR
Figure imgf000276_0002
Figure imgf000277_0001
Tabla 19. Pseudouridina Nl-metil Pseudouridina SAR
Figure imgf000277_0002
Figure imgf000278_0001
Figure imgf000279_0001
Ejemplo 16. Incorporación de nucleósidos naturales y no naturales Los nucleósidos naturales y no naturales se incorporan al ARNm que codifica un polipéptido de interés. Ejemplos de estos se dan en las Tablas 20 y 21. Ciertos nucleósidos trifosfato (NTP) disponibles comercialmente se investigan en los polinucleótidos de la divulgación. Una selección de estos se da en la Tabla 20. A continuación se examina el ARNm resultante para determinar su capacidad para producir proteínas, inducir citoquinas, y/o producir un resultado terapéutico.
Tabla 20. Nucleósidos naturales no naturales
Figure imgf000280_0001
Tabla 21. Trifosfatos de nucleósidos no naturales
Figure imgf000280_0002
Figure imgf000281_0001
Ejemplo 17. Incorporación de modificaciones a la nucleobase y carbohidrato (azúcar)
Los nucleósidos naturales y no naturales se incorporan al ARNm que codifica un polipéptido de interés. Los nucleósidos y NTP disponibles comercialmente que tienen modificaciones tanto en la nucleobase como en el carbohidrato (azúcar) se examinan para determinar su capacidad para incorporarse en el ARNm y producir proteínas, inducir citoquinas, y/o producir un resultado terapéutico. En las Tablas 22 y 23 se dan ejemplos de estos nucleósidos.
Tabla 22. Modificaciones de combinación
Figure imgf000281_0002
Tabla 23. Combinaciones que ocurren naturalmente
Figure imgf000281_0003
Figure imgf000282_0001
En las tablas, "UTP" significa trifosfato de uridina, "GTP" significa trifosfato de guanosina, "ATP" significa trifosfato de adenosina, "CTP" significa trifosfato de citosina, "TP" significa trifosfato y "Bz" significa bencilo.
Ejemplo 18. Estudio de intercambio de secuencias señales
Varias variantes de ARNmm que codifican factor estimulante de colonias de granulocitos humanos (G-CSF) (secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 4258; cola poliA de aproximadamente 160 nucleótidos que no se muestra en la secuencia; 5'cap, Cap1) se sintetizaron usando nucleótidos modificados pseudouridina y 5-metilcitidina (pseudo-U/5mC). Estas variantes incluían las construcciones de G-CSF que codifican la secuencia peptídica señal secretora N terminal de tipo salvaje (MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWTVQEA; SEQ ID NO: 4271) , ninguna secuencia peptídica señal secretora o secuencias peptídicas señal secretoras tomadas de otros ARNm. Estas incluían secuencias donde la secuencia del péptido señal de GCSF de tipo salvaje se reemplazó con la secuencia del péptido señal de: a-1-antitripsina humana (a At ) (MMPSSVSWGILLLAGLCClVpVSLA; Se Q ID NO: 4272) , Factor IX humano (FIX) (MQRVNMIMAESPSLITILLCGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKR; SEQ ID NO: 4273) , prolactina humana (Prolac) (MKGSLLLLLVSNLLLCQSVAP; SEQ ID NO: 4274), o albúmina humana (Alb) (MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR; SEQ ID NO: 4275).
Se transfectaron 250 ng de ARNm modificado que codifica cada variante de G-CSF en HE K293A (293A en la tabla), mioblastos de ratón (MM en la tabla) (C2C12, CRL-1772, ATCC) y mioblastos de rata (RM en la tabla) (línea L6, CRL-1458, ATCC) líneas celulares en una placa de 24 pocillos usando 1 ul de Lipofectamina 2000 (Life Technologies), cada pocillo conteniendo 300.000 células. Los sobrenadantes se recogieron después de 24 horas y la proteína G-CSF secretada se analizó mediante ELISA utilizando el kit ELISA para G-CSF humano (Life Technologies). Los datos que se muestran en la Tabla 24 revelan que las células transfectadas con ARNm de G-CSF que codifica el péptido señal de albúmina secretan al menos 12 veces más proteína G-CSF que su homólogo de tipo salvaje.
Tabla 24. Intercambio de Péptido señal
Figure imgf000282_0002
Ejemplo 19. Regiones no traducidas 3'
Se puede proporcionar una UTR 3' como región flanqueante. Pueden incluirse múltiples UTR 3' en las regiones flanqueantes y pueden ser las mismas o de secuencias diferentes. Cualquier porción de las regiones flanqueantes, incluida ninguna, puede tener codones optimizados y cualquiera puede contener independientemente una o más modificaciones estructurales o químicas diferentes, antes y/o después de la optimización de codones.
En la Tabla 7 se muestra una lista de regiones 3' sin traducir de la divulgación. Pueden utilizarse variantes de UTR 3' donde se añaden o eliminan uno o más nucleótidos en los extremos, incluidos A, T, C o G.
Ejemplo 20. Alteración del tráfico de polinucleótidos: NLS y NES
Dos señales de exportación nuclear (NES) que pueden incorporarse en los polinucleótidos de la presente descripción incluyen las informadas por Muller, y col (Traffic, 2009, 10: 514-527) y están asociadas con la señalización a través del gen COMMD1. Estas son NES1, PVAIIELEL (SEQ ID NO 4276) y NES2, VNQILKTLSE (SEQ ID NO 4277).
También pueden utilizarse señales de localización nuclear. Una de tales secuencias es PKKKRKV (SEQ ID NO: 4278).
A las líneas celulares o a los ratones se les administra uno o más polinucleótidos que tienen un NLS o NES codificado en ellos. Tras la administración, el polinucleótido se transporta a una ubicación alternativa, por ejemplo, al núcleo utilizando el NLS. El polipéptido que tiene el NLS se transportaría al núcleo donde enviaría una señal de supervivencia o muerte al microambiente nuclear. Los polipéptidos que pueden localizarse en el núcleo incluyen aquellos con propiedades de unión alteradas para el a Dn que funcionarán para alterar el perfil de expresión de la célula de una manera terapéuticamente beneficiosa para la célula, el tejido o el organismo.
En un experimento, el polinucleótido codifica un COMMD1 mut1/mut 2 NLS (p. ej., ambas señales NES interrumpidas más un NLS agregado) siguiendo los procedimientos de Muller y col, (Traffic 2009; 10: 514-527) y van de Sluis y col, (J Clin Invest. 2010;120 (6):2119-2130). La secuencia señal puede codificar un polipéptido o una secuencia cifrada que no es traducible. La secuencia señal codificada interactuaría con HIF1-alfa para alterar el transcriptoma de las células cancerosas.
El experimento se repite en condiciones normales e hipóxicas.
Una vez identificado, el polinucleótido dependiente de HIF1-alfa se prueba en líneas de células cancerosas, se mide la supervivencia clonal o se mide un marcador de apoptosis y se compara con células tratadas de control o simuladas.
Ejemplo 21. Sitios de unión de miARN (BS) útiles como secuencias sensoras en polinucleótidos
Los sitios de unión de miARN se utilizan en la 3'UTR de la terapia de ARNm para dirigir la terapia de ARNm citotóxica o citoprotectora a células específicas (normales).y/o canceroso).
Una fuerte señal apoptótica (es decir, AIFsh - isoforma corta del factor inductor de apoptosis) se codifica como el polipéptido o "señal" y se codifica junto con una serie de sitios de unión 3'UTR miR, como el de mir-122a, que haría el polinucleótido es relativamente mucho más estable en las células cancerosas que en las células normales.
Se realizan in vitro experimentos que comparan líneas de células hepáticas normales y cancerosas donde las líneas celulares cancerosas tienen una firma miR específica. Se utilizan SNU449 o HEP3B (líneas celulares de HCC derivadas de humanos) porque se ha demostrado que ambas tienen "miR-122a indetectable", mientras que los hepatocitos normales deberían tener niveles muy altos de miR-122a. Primero se selecciona una célula cancerosa que es sensible al polinucleótido AIFsh (es decir, da como resultado apoptosis).
Tres sitios de unión de miR-122a están codificados en la 3'UTR de una secuencia de ARNm para AIFsh y los brazos del estudio incluyen 2 líneas celulares (hepatocito normal, SNU449 o HEP3B) x 5 tratamientos (vehículo solo, polinucleótido no traducible, polinucleótido AIFsh (sin miR BS en 3'UTR), 3'UTR[miR122a licenciatura x3]-polinucleótido intraducible, 3'UTR[miR122a licenciatura x3]- polinucleótido AIFsh).
El resultado esperado sería una apoptosis significativa frente al polinucleótido AIFsh tanto en líneas celulares normales como cancerosas (HEP3B o SNU449) en ausencia de cualquier 3'UTR-miR122a BS. Sin embargo, una diferencia significativa en la apoptosis relativa de líneas celulares normales frente a cancerosas frente a 3'UTR [miR122a licenciatura x3]- polinucleótido AIFsh.
La reversibilidad del efecto se muestra con la coadministración de miR122a a la línea celular cancerosa (p. ej., a través de alguna transducción de la actividad de miR122a de regreso a la línea celular cancerosa).
Luego se realizan estudios en animales in vivo usando cualquiera de los modelos descritos en esta invención o un modelo de HCC ortotópico disponible comercialmente.
Ejemplo 22. Líneas celulares para el estudio de Polinucleótidos
Polinucleótidos de la presente divulgación y formulaciones que comprenden los polinucleótidos de la presente divulgación o descritos en la Solicitud Internacional N° PCT/US2012/69610 pueden investigarse en cualquier número de líneas celulares cancerosas o normales. Las líneas celulares útiles en esta invención descripción incluyen las de ATCC (Manassas, VA) y se enumeran en la Tabla 25.
Tabla 25. Líneas celulares
Figure imgf000284_0001
Figure imgf000285_0001
Figure imgf000286_0001
Figure imgf000287_0001
Figure imgf000288_0001
Figure imgf000289_0001
Figure imgf000290_0001
Figure imgf000291_0001
Figure imgf000292_0001
Figure imgf000293_0001
Figure imgf000294_0001
Ejemplo 23. Proteínas de unión a ARN
Las proteínas de unión al ARN pueden proporcionarse como proteínas y/o como ácidos nucleicos que codifican tales proteínas. Las proteínas de unión al ARN desempeñan una multitud de funciones en la regulación de la estabilidad del ARN y la traducción de proteínas. En algunos casos, las proteínas de unión al ARN se proporcionan en proteínas y/o forma de ácido nucleico con elementos de la presente divulgación. Dichas proteínas de unión a ARN incluyen, entre otras, las enumeradas (junto con el número ENSG, que identifica el gen correspondiente, así como uno o más números ENST, que identifican las variantes transcripcionales de cada uno) en la Tabla 26.
Tabla 26. Proteínas de unión a ARN
Figure imgf000294_0002
Figure imgf000295_0001
Figure imgf000296_0001
Figure imgf000297_0001
Figure imgf000298_0001
Figure imgf000299_0001
Figure imgf000300_0001
Figure imgf000301_0001
Figure imgf000302_0001
Figure imgf000303_0001
Figure imgf000304_0001
Figure imgf000305_0001
Figure imgf000306_0001
Figure imgf000307_0001
Figure imgf000308_0001
Figure imgf000309_0001
HuR es un AREBP estabilizador. Para aumentar la estabilidad del ARNm de interés, se puede cotransfectar o inyectar conjuntamente un ARNm que codifica HuR junto con el ARNm de interés en las células o en el tejido. Estas proteínas también pueden unirse al ARNm de interés in vitro y a continuación administrarse juntas a las células. La proteína de unión a la cola poli A, PABP, interactúa con el factor de iniciación de la traducción eucariota eIF4G para estimular la iniciación de la traducción. Co-administración de ARNm que codifican estas prácticas comerciales restrictivas junto con el fármaco de ARNm y/o unir estas proteínas al fármaco de ARNm in vitro y administrar el ARNm unido a proteínas en las células puede aumentar la eficiencia de traducción del ARNm. El mismo concepto se puede extender a la co­ administración de ARNm junto con ARNm que codifican diversos factores y facilitadores de la traducción, así como con las propias proteínas para influir en la estabilidad del ARN y/o eficiencia traslacional.
Ejemplo 24. Expresión de ácido nucleico modificado con s itio de unión a microARN
Células epiteliales de riñón embrionario humano (HEK293A), células presentadoras de antígeno o líneas celulares con alta expresión mir-142/146, tales como células dendríticas derivadas de monocitos (MDDC) o PBMC, se siembran a una densidad de 200.000 por pocillo en 500 ul de medio de cultivo celular (medio InVitro GRO de Celsis, Chicago, IL). ARNm de G-CSF (la secuencia de ARNm se muestra en SEQ ID NO: 4258; la cola poliA de al menos 140 nucleótidos no se muestra en la secuencia; 5'Cap, Cap1) ARNm de G-CSF que tiene un sitio de unión miR-142-5p (G-CSF miR-142-5p) (la secuencia de cDNA se muestra en SEQ ID NO: 4985; la secuencia de ARNm se muestra en SEQ ID NO: 4986, la cola poliA de al menos 140 nucleótidos no se muestra en la secuencia; 5'Cap, Cap1), G -ARNm de CSF que tiene una secuencia semilla del sitio de unión de miR-142-5p (semilla de G-CSF miR-142-5p) (la secuencia de ADNc se muestra en SEQ ID NO: 4987; la secuencia de ARNm se muestra en SEQ ID NO: 4988; cola poliA de al menos 140 nucleótidos que no se muestra en la secuencia; 5'Cap, Cap1) ARNm de G-CSF que tiene un sitio de unión a miR-142-5p sin la secuencia semilla (G-CSF miR-142-5p-sin semillas) (secuencia de ADNc se muestra en SEQ ID NO: 4989, la secuencia de ARNm se muestra en SEQ ID NO: 4990; la cola poliA de al menos 140 nucleótidos no se muestra en la secuencia; 5'Cap, Cap1) ARNm de G-CSF que se une a miR-142-3p sitio (G-CSF miR-142-3p) (la secuencia de ADNc se muestra en Se Q ID NO: 4991; la secuencia de ARNm se muestra en SE Q NÚMERO De IDENTIFICACIÓN: 4992; cola poliA de al menos 140 nucleótidos no mostrada en la secuencia; 5'Cap, Cap1) ARNm de G-CSF que tiene una secuencia semilla del sitio de unión de miR-142-3p (semilla de G-CSF miR-142-3p) (la secuencia de ADNc se muestra en SEQ ID NO: 4993; se muestra la secuencia de ARNm en SEQ ID NO: 4994; cola poliA de al menos 140 nucleótidos no mostrada en la secuencia; 5'Cap, Cap1) ARNm de G-CSF que tiene un sitio de unión a miR-142-3p sin la secuencia semilla (G-CSF miR-142- 3p-sin semillas) (la secuencia de A d N se muestra en SEQ ID NO: 4995; la secuencia de ARNm se muestra en SEQ ID NO: 4996; la cola poliA de al menos 140 nucleótidos no se muestra en la secuencia; 5'Cap, Cap1) ARNm de G-CSF que tiene un sitio de unión de miR-146a (G-CSF miR-146a) (la secuencia de cDNA se muestra en SEQ ID NO: 4997; la secuencia de ARNm se muestra en SEQ ID NO: 4998; la cola poliA de al menos 140 nucleótidos no se muestra en la secuencia; 5 'Cap, Cap1) ARNm de G-CSF que tiene una secuencia semilla del sitio de unión de miR-146a (semilla de G-CSF miR-146a) (la secuencia de ADNc se muestra en SEQ ID NO:4999 la secuencia de ARNm se muestra en SEQ ID NO: 5000; cola poliA de al menos 140 nucleótidos no mostrados en la secuencia; 5'Cap,Cap1) o ARNm de G-CSF que tiene un sitio de unión de miR-146a sin la secuencia semilla (G-CSF miR-146a-sin semillas) (la secuencia de ADNc se muestra en SEQ ID NO: 5001; la secuencia de ARNm se muestra en SEQ ID NO: 5002; la cola poliA al menos los nucleótidos no mostrados en la secuencia; 5'Cap, Cap1) se analizan a una concentración de 250 ng por pocillo en placas de 24 pocillos. Las secuencias de ARNm se evalúan con varias modificaciones químicas descritas en esta invención. y/o conocidos en la técnica que incluyen, completamente modificada con 5-metilcitidina y pseudouridina, completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina, completamente modificada con pseudouridina, completamente modificada con 1-metilpseudouridina y donde el 25 % de los residuos de uridina están modificados con 2- la tiouridina y el 25 % de los residuos de citosina se modifican con 5-metilcitidina. La expresión de G-CSF en cada muestra se mide por ELISA.
En la Tabla 27 se muestran las secuencias de G-CSF de ADN y ARNm con los sitios de unión a miR descritos anteriormente. En la tabla, el codón de inicio de cada secuencia está subrayado.
Tabla 27. Construcciones de G-CSF con sitios de unión a miR
Figure imgf000310_0001
Figure imgf000311_0001
Figure imgf000312_0001
Figure imgf000313_0001
Es como si la secuencia de "semilla" del sitio de unión fuera suficiente para inducir la unión del mircoARN, la expresión de G-CSF debería regularse a la baja en las células transfectadas con miR-142-3p, miR-142-3p-seed, miR -l42-5p, miR-142-5p-semilla, miR-146a o miR-146a-semilla. Mientras que miR-142-3p-sin semillas, miR-142-5p-sin semillas, miR-146a-sin semillas no debería cambiar la expresión de G-CSF, en comparación con las células transfectadas con ARNm de G-CSF sin sitios de unión de microARN.
Ejemplo 25. Sitios de unión de microARN específicos de APC para suprimir la estimulación inmunitaria mediada por ácidos nucleicos modificados
Los sitios de unión para los microARN se utilizan en la 3'UTR de la terapia de ARNm para degradar selectivamente la terapia de ARNm en las células inmunitarias para controlar las reacciones inmunogénicas no deseadas causadas por la administración de la terapia de ARNm.
Un polinucleótido que comprende una serie de sitios de unión 3'UTR miR que hacen que los ácidos nucleicos o el ARNm de la presente descripción sean más inestables en las células presentadoras de antígenos (APC), tales como, entre otras, mir-142-5p, mir -142-3p, mir-146a-5p y mir-146a-3p, codifica un polipéptido relacionado con la oncología de la presente divulgación. La adición de sitios de unión de miR en la 3'UTR que hace que un polinucleótido sensor de señal sea inestable sometería a la estimulación inmunitaria mediada por el ARNm modificado.
Los experimentos que comparan la expresión de citocinas (p. ej., TNF-alfa) inducida por el polipéptido con firma de microARN específica de APC frente a sin dicha firma se realizan in vitro mediante los procedimientos descritos en esta invención y/o conocido en la técnica.
Ejemplo 26.Expresión in vitro de ARNm con sitios de unión a miR
Células epiteliales de riñón embrionario humano (HEK293A), células presentadoras de antígeno o líneas celulares con alta expresión mir-142/146, tales como células dendríticas derivadas de monocitos (MDDC) o PBMC, se siembran a una densidad de 200.000 por pocillo en 500 ul de medio de cultivo celular (medio InVitro GRO de Celsis, Chicago, IL). Las células cultivadas se transfectaron con ARNm de G-CSF con o sin firma de microARN, como se describe en el Ejemplo 24. Las células se transfectaron durante cinco días consecutivos. Los complejos de transfección se eliminan cuatro horas después de cada ronda de transfección.
El sobrenadante del cultivo se analiza para G-CSF secretado (R & Sistemas D, catálogo #DCS50), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) e interferón alfa (IFN-alfa) por ELISA todos los días después de la transfección siguiendo los protocolos de los fabricantes. Se analiza la viabilidad de las células utilizando CELL TITER GLO® (Promega, catálogo #G7570) 6 horas y 18 horas después de la primera ronda de transfección y cada día alterno después de eso. Al mismo tiempo, a partir de las células recogidas, se aísló el ARN total y se trató con DNASE® usando el micro kit RNAEASY (catálogo #74004) siguiendo el protocolo de los fabricantes. Se utilizaron 100 ng de ARN total para la síntesis de ADNc utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, cat. #4368814) siguiendo el protocolo de los fabricantes. A continuación, se analiza el ADNc para determinar la expresión de genes de respuesta inmunitaria innata mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando SybrGreen en un instrumento Biorad c Fx 384 siguiendo el protocolo del fabricante.
Ejemplo 27. Estudio de detección in vivo de respuesta inmune innata
Para probar los ácidos nucleicos o la expresión de proteínas de ARNm y la respuesta inmune in vivo, mujeres BALB/C ratones (n=5) se inyectan por vía intramuscular con ARNm de G-CSF con o sin firmas de microARN como se describe en el Ejemplo 24. La sangre se recoge 8 horas después de la dosificación. Los niveles de proteína de G-CSF, TNF-alfa e IFN-alfa se determinan mediante ELISA.
La diferencia en la producción de citoquinas se observa medida por el nivel de TNF-alfa e IFN-alfa de ratón en el suero. La inyección con ARNm modificado con G-CSF que tiene un sitio de unión de miR-142 y miR-146a o una semilla del sitio de unión muestra un nivel más bajo de respuesta de citoquinas in vivo.
Ejemplo 28. Expresión de miR-122 en hepatocitos primarios
Se midió el nivel de miR-122 específico de hepatocitos en hepatocitos primarios humanos y de rata. Se cultivaron células Hela y hepatocitos primarios de rata y humanos y se extrajeron los ARN de los lisados celulares. El nivel de miR-122 en hepatocitos primarios humanos y de rata se comparó con el de las células Hela. El nivel de miR-122 es aproximadamente 6 veces mayor en los hepatocitos humanos primarios y aproximadamente 12 veces mayor en los hepatocitos primarios de rata, respectivamente, en comparación con el de las células Hela.
Ejemplo 29. Expresión de ácido nucleico modificado con sitio de unión a mir-122 en hepatocitos
Se sembraron hepatocitos humanos y de rata primarios y células Hela a una densidad de 200.000 por pocillo en 500 ul de medio de cultivo celular (medio InVitro GRO de Celsis, Chicago, IL). ARNm de G-CSF que tiene un sitio de unión de miR-122 en la 3'UTR (G-CSF miR-122-1X) (la secuencia de ARNm se muestra en SEQ ID NO: 4268; la cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no se muestra en la secuencia; 5 'Cap, Cap1) completamente modificada con 5-metilcitidina y pseudouridina (5mC/pU), o completamente modificada con pseudouridina (pU) o ARNm de G-CSF con cuatro sitios de unión de miR-122 con la semilla eliminada (G-CSF sin semilla) (la secuencia de ARNm se muestra en SEQ ID NO: 4270; la cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrado en secuencia; 5'Cap, Cap1) completamente modificada con 5-metilcitidina y pseudouridina (5mC/pU) o totalmente modificada con pseudouridina (pU) a una concentración de 250 ng por pocillo en placas de 24 pocillos. 24 horas después de la transfección, se midió la expresión de G-CSF por ELISA, y los resultados se muestran en la Tabla 28.
T l 2 . Ex r i n - F mir122
Figure imgf000315_0001
Ejemplo 30. Expresión de ácidos nucleicos modificados con sitios de unión a mir-122 en hepatocitos
Los microARN controlan la expresión génica a través de la supresión de la traducción y/o degradación del ARN mensajero diana. El sitio de unión a Mir-122 que contenía ARNm de G-CSF se reguló traduccionalmente en los hepatocitos.
Se sembraron hepatocitos humanos y de rata primarios y células Hela a una densidad de 200.000 por pocillo en 500 ul de medio de cultivo celular (medio InVitro GRO de Celsis, Chicago, IL). ARNm de G-CSF (G-CSF alfa) (la secuencia de ARNm se muestra en SEQ ID NO: 4266; la cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no se muestra en la secuencia; 5'Cap, Cap1) completamente modificada con 5-metilcitidina y pseudouridina (5mC/pU), ARNm de G-CSF que tiene un sitio de unión de miR-122 en la 3'UTR (G-CSF miR-122-1X) (la secuencia de ARNm se muestra en SEQ ID NO: 4268; la cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no se muestra en la secuencia; 5 'Cap, Cap 1) completamente modificada con 5-metilcitidina y pseudouridina (5mc/pU) o ARNm de G-CSF con cuatro sitios de unión de miR-122 con la semilla eliminada (G-CSF sin semilla) (la secuencia de ARNm se muestra en SEQ ID NO: 4270; la cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no se muestra en la secuencia; 5' Cap, Cap1) completamente modificada con 5-metilcitidina y pseudouridina (5mC/pU) se probó a una concentración de 250 ng por pocillo en placas de 24 pocillos. 24 horas después de la transfección, se midió la expresión de G-CSF por ELISA. Los niveles de fármaco G-CSF (ARNm) y los niveles de proteína se muestran en la Tabla 29.
Tabla 29. Niveles de fármaco roteína G-CSF
Figure imgf000315_0002
Ejemplo 31. Secuencias de ARNm modificadas con o sin Kozak y/o secuencias IRES
ARNm modificado que codifica G-CSF con o sin Kozak y/o secuencia IRES y sus correspondientes secuencias de ADNc se muestran a continuación en la Tabla 30. En la Tabla 30, el codón de inicio de cada secuencia está subrayado. Tabla 30. Secuencias G-CSF
Figure imgf000316_0001
Figure imgf000317_0001
Figure imgf000318_0001
Figure imgf000319_0001
Figure imgf000320_0001
Figure imgf000321_0001
Estas secuencias de ARNm modificadas pueden incluir al menos una modificación química descrita en esta invención. La secuencia de ARNm modificada con G-CSF se puede formular utilizando los procedimientos descritos en esta invención. y/o conocido en la técnica, antes de la transfección y/o administración.
La secuencia de ARNm modificada que codifica G-CSF se puede transfectar in vitro in vitro a varios tipos celulares como HEK293, HeLa, PBMC y fibroblastos BJ y los descritos en la Tabla 25 utilizando los procedimientos descritos en esta invención. y/o son conocidos en la técnica. Luego, las células se analizan utilizando los procedimientos descritos en esta invención. y/o son conocidos en la técnica para determinar la concentración de G-CSF y/o viabilidad celular.
La secuencia de ARNm modificada que codifica G-CSF también se puede administrar a mamíferos, incluidos ratas, primates no humanos y humanos. El suero y el tejido circundante pueden recolectarse a intervalos predeterminados y analizarse utilizando los procedimientos descritos en esta invención. y/o son conocidos en la técnica para determinar la concentración de G-CSF y otras propiedades farmacocinéticas mencionadas en esta invención.
Ejemplo 32. Secuencias de ARNm modificadas Secuencias de miR-122 en una UTR de alfa-globina
El ARNm modificado que codifica G-CSF o Factor IX con una secuencia mir-122 en una 3'UTR de alfa-globina humana o de ratón, y sus secuencias de ADNc correspondientes, se muestran a continuación en la Tabla 31. En la Tabla 31, el codón de inicio de cada secuencia está subrayado.
Tabla 31. Secuencias G-CSF FIX
Figure imgf000322_0001
Figure imgf000323_0001
Figure imgf000324_0001
Figure imgf000325_0001
Figure imgf000326_0001
Figure imgf000327_0001
Figure imgf000328_0001
Figure imgf000329_0001
Figure imgf000330_0001
Figure imgf000331_0001
Figure imgf000332_0001
Estas secuencias de ARNm modificadas pueden incluir al menos una modificación química descrita en esta invención. La secuencia de ARNm modificada con G-CSF y/o Factor IX se puede formular usando procedimientos descritos en esta invención y/o conocidos en la técnica, antes de la transfección y/o administración.
La secuencia de ARNm modificada que codifica G-CSF o Factor IX se puede transfectar in vitro a varios tipos celulares, como HEK293, HeLa, PBMC y fibroblastos BJ, y las descritas en la Tabla 25 usando los procedimientos descritos en esta invención y/o conocidos en la técnica. A continuación, las células se analizan utilizando procedimientos descritos en esta invención y/o conocidos en la técnica para determinar la concentración de G-CSF o Factor IX y/o la viabilidad celular.
La secuencia de ARNm modificada que codifica G-CSF o Factor IX también se puede administrar a mamíferos, incluidos ratas, primates no humanos y humanos. El suero y el tejido circundante pueden recolectarse a intervalos predeterminados y analizarse utilizando los procedimientos descritos en esta invención y/o son conocidos en la técnica para determinar la concentración de G-CSF o Factor IX y otras propiedades farmacocinéticas mencionadas en esta invención.
Ejemplo 33. Sistemas m icrofisio lógicos
Los polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARNmm descritos en esta invención se formulan utilizando uno de los procedimientos descritos en esta invención, como en tampón, nanopartículas lipídicas y PLGA. A continuación, estas formulaciones se administran o se ponen en contacto con sistemas microfisiológicos creados a partir de chips de órganos como se describe en las publicaciones internacionales N° WO2013086502, WO2013086486 y WO2013086505.
Ejemplo 34. Elementos de mejora de la traducción (TEE) en regiones no traducidas
Las regiones no traducidas (UTR) 5' y/o 3' en los polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARNmm descrito en esta invención puede incluir al menos un elemento que mejora la traducción (TEE). Dicho TEE que podrá incluirse en la 5'UTR y/o 3'UTR incluyen, pero no se limitan a, los enumerados en la Tabla 32, incluida una porción y/o fragmentos de los mismos. La secuencia TEE puede incluir al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al me menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al me menos 95 %, al menos 99 % o más de 99 % de las secuencias TEE descritas en la Tabla 28 y/o la secuencia TEE puede incluir un fragmento de 5-30 nucleótidos, un fragmento de 5-25 nucleótidos, un fragmento de 5-20 nucleótidos, un fragmento de 5-15 nucleótidos, un fragmento de 5-10 nucleótidos de las secuencias TEE descritas en la Tabla 32.
Figure imgf000334_0001
Figure imgf000335_0001
Figure imgf000336_0001
Figure imgf000337_0001
Figure imgf000338_0001
Figure imgf000339_0001
Figure imgf000340_0001
Figure imgf000341_0001
Figure imgf000342_0001
Figure imgf000343_0001
Figure imgf000344_0001
ij44
Figure imgf000345_0001

Figure imgf000346_0001

Figure imgf000347_0001

Figure imgf000348_0001

Figure imgf000349_0001

Figure imgf000350_0001
Figure imgf000351_0001
Figure imgf000352_0001
Figure imgf000353_0001
Figure imgf000354_0001
ij54
Figure imgf000355_0001
ij55
Figure imgf000356_0001

Figure imgf000357_0001

Figure imgf000358_0001

Figure imgf000359_0001

Figure imgf000360_0001
Figure imgf000361_0001
Figure imgf000362_0001
Figure imgf000363_0001
Figure imgf000364_0001
ij64
Figure imgf000365_0001
ij65
Figure imgf000366_0001
ij66
Figure imgf000367_0001

Figure imgf000368_0001

Figure imgf000369_0001

Figure imgf000370_0001
Figure imgf000371_0001
Figure imgf000372_0001
Figure imgf000373_0001
Figure imgf000374_0001
ij74
Figure imgf000375_0001
ij75
Figure imgf000376_0001
ij76
Figure imgf000377_0001
ij77
Figure imgf000378_0001

Figure imgf000379_0001

Figure imgf000380_0001
Figure imgf000381_0001
Figure imgf000382_0001
Figure imgf000383_0001
Figure imgf000384_0001
ij84
Figure imgf000385_0001
ij85
Figure imgf000386_0001
ij86
Figure imgf000387_0001
ij87
Figure imgf000388_0001
ij88
Figure imgf000389_0001

Figure imgf000390_0001
Figure imgf000391_0001
Figure imgf000392_0001
Figure imgf000393_0001
Figure imgf000394_0001
ij94
Figure imgf000395_0001
ij95
Figure imgf000396_0001
ij96
Figure imgf000397_0001
ij97
Figure imgf000398_0001
ij98
Figure imgf000399_0001
ij99
Figure imgf000400_0001
Figure imgf000401_0001
Figure imgf000402_0001
Figure imgf000403_0001
Figure imgf000404_0001
Figure imgf000405_0001
Figure imgf000406_0001
Figure imgf000407_0001
Figure imgf000408_0001
Figure imgf000409_0001
Figure imgf000410_0001
Figure imgf000411_0001
Figure imgf000412_0001
Figure imgf000413_0001
Figure imgf000414_0001
Figure imgf000415_0001
Figure imgf000416_0001
Figure imgf000417_0001
Figure imgf000418_0001
Figure imgf000419_0001
Figure imgf000420_0001
Figure imgf000421_0001
Figure imgf000422_0001
Figure imgf000423_0001
Figure imgf000424_0001
Figure imgf000425_0001
Figure imgf000426_0001
Figure imgf000427_0001
Figure imgf000428_0001
Figure imgf000429_0001
Ejemplo 35.Expresión in vitro de ácidos nucleicos modificados con miR-122
El microARN controla la expresión génica a través de la supresión traduccional y/o la degradación del ARN mensajero diana. La expresión de ARNm de G-CSF y ARNm de Factor IX con regiones no traducidas (UTR) 3' de alfa-globina humana o de ratón se reguló negativamente en hepatocitos primarios humanos usando secuencias de miR-122 en la 3'UTR.
Se sembraron hepatocitos humanos primarios a una densidad de 350000 por pocillo en 500 ul de medio de cultivo celular (medio InVitro GRO de Celsis, Chicago, IL).
ARNm de G-CSF que tiene una alfa-globina humana 3'UTR (G-CSF Hs3'UTR; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5716; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Cap1) o una 3'UTR de alfa-globina de ratón (G-CSF Mm3'UTR; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5717; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Cap1) se modificaron completamente con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina. ARNm de G-CSF que contiene una 3'UTR humana que tiene una secuencia de miR-122 en la 3'UTR (G-CSF Hs3'UTR miR-122; secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5018; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no se muestra en secuencia; 5'cap, Cap1), o una secuencia semilla miR-122 en la 3'UTR (semilla G-CSF Hs3'UTR miR-122; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5020; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no se muestra en la secuencia; 5'cap, Cap1) o una secuencia de miR-122 sin la secuencia semilla en la 3'UTR (G-CSF Hs3'UTR miR-122 sin semilla; secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5022; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrados en secuencia; 5'cap, Cap1) se modificaron completamente con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina. ARNm de G-CSF que contiene una 3'UTR de ratón que tiene una secuencia de miR-122 en la 3'UTR (G-CSF Mm3'UTR miR-122; secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5024; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no se muestra en secuencia; 5'cap, Cap1), o una secuencia semilla miR-122 en la 3'UTR (semilla G-CSF Mm3'UTR miR-122; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5026; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no se muestra en la secuencia; 5'cap, Cap1) o una secuencia de miR-122 sin la secuencia semilla en la 3'UTR (G-CSF Mm3'UTR miR-122 sin semilla; secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5028; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrados en secuencia; 5'cap, Cap1) se modificaron completamente con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina.
ARNm de Factor IX que tiene una alfa-globina humana 3'UTR (Factor IX Hs3'UTR; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5718; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Cap1) o una 3'UTR de alfa-globina de ratón (Factor IX Mm3'UTR; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5719; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Cap1) se modificaron completamente con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina. ARNm de Factor IX que contiene una 3'UTR humana que tiene una secuencia de miR-122 en la 3'UTR (Factor IX Hs3'UTR miR-122; secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5030; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no se muestra en secuencia; 5'cap, Cap1), o una secuencia semilla miR-122 en la 3'UTR (semilla Factor IX Hs3'UTR miR-122; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5032; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no se muestra en la secuencia; 5'cap, Cap1) o una secuencia de miR-122 sin la secuencia semilla en la 3'UTR (Factor IX Hs3'UTR miR-122 sin semilla; secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5034; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrados en secuencia; 5'cap, Cap1) se modificaron completamente con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina. ARNm de Factor IX que contiene una 3'UTR de ratón que tiene una secuencia de miR-122 en la 3'UTR (Factor IX Mm3'UTR miR-122; secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5036; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no se muestra en secuencia; 5'cap, Cap1), o una secuencia semilla miR-122 en la 3'UTR (semilla Factor IX Mm3'UTR miR-122; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5038; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no se muestra en la secuencia; 5'cap, Cap1) o una secuencia de miR-122 sin la secuencia semilla en la 3'UTR (Factor IX Mm3'UTR miR-122 sin semilla; secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5040; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrados en secuencia; 5'cap, Cap1) se modificaron completamente con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina.
Cada secuencia de ARNm de Factor CSF o Factor IX se analizó a una concentración de 500 ng por pocillo en placas de 24 pocillos. 24, 48 y 72 horas después de la transfección, se midió la expresión de proteína por ELISA. Los niveles de proteína para G-CSF se muestran en la Tabla 33 y los niveles de proteína para el Factor IX se muestran en la Tabla 34.
Tabla 33. Expresión de proteína G-CSF
Figure imgf000430_0001
Figure imgf000431_0001
T l 4. Ex r i n r ín F r IX
Figure imgf000431_0002
Ejemplo 36.Expresión in vitro de ácido nucleico modificado con sitios de unión mir-142 o miR-146
Se sembraron células HeLa y RAW264 a una densidad de 17000 y 80000 por pocilio respectivamente, en 100 ul de medio de cultivo celular (Dm Em 10 % de FBS).
El ARNm de G-CSF (G-CSF; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 4258; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en la secuencia; 5'cap, Capí) se modificó completamente con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina.
ARNm de G-CSF que tiene una secuencia de miR-142-3p en 3'UTR (G-CSF miR-142-3p; secuencia de ARNm mostrada en SEQ iD NO: 4992; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5' cap, Cap1), o una secuencia semilla miR-142-3p en la 3'UTR (semilla G-CSF miR-142-3p; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 4994; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Cap1) o una secuencia de miR-142-3p sin la secuencia semilla en la 3'UTR (G-CSF miR-142-3p sin semilla; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 4996; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no se muestran en secuencia; 5'cap, Cap1) se modificaron completamente con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina,
ARNm de G-CSF que tiene una secuencia de miR-142-5p en la 3'UTR (G-CSF miR-142-5p; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 4986; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5' cap, Cap1), o una secuencia semilla miR-142-5p en la 3'UTR (semilla G-CSF miR-142-5p; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 4988; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Cap1) o una secuencia de miR-142-5p sin la secuencia semilla en la 3'UTR (G-CSF miR-142-5p sin semilla; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 4990; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no se muestran en secuencia; 5'cap, Cap1) se modificaron completamente con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina.
ARNm de G-CSF que tiene una secuencia de miR-146a en 3'UTR (G-CSF miR-146a; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 4998; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Cap1) , o una secuencia semilla de miR-146a en la 3'UTR (semilla G-CSF miR-146a; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5000; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Cap1) o una secuencia de miR-146a sin la secuencia semilla en el 3'UTR (G-CSF miR-146a sin semilla; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5002; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no se muestran en secuencia; 5'cap, Cap1) se modificaron completamente con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina.
Cada secuencia de ARNm de G-CSF se analizó a una concentración de 500 ng por pocillo en placas de 24 pocillos para cada tipo celular. 24 horas después de la transfección, se midió la expresión de proteína mediante ELISA y los niveles de proteína se muestran en la Tabla 35. Las secuencias de G-CSF con una secuencia miR-142-3p en la 3'UTR redujeron la expresión de G-CSF en células RAW264 mientras que las secuencias de G-CSF con una secuencia miR-142-5p o miR-146a en la 3'UTR no reguló negativamente la expresión de G-CSF.
Tabla 35. Ex resión de G-CSF
Figure imgf000432_0001
Ejemplo 37. Efecto de la secuencia Kozak sobre la expresión de ácidos nucleicos modificados
Se sembraron células HeLa a una densidad de 17000 por pocillo en 100 ul de medio de cultivo celular (DMEM 10 % de FBS). ARNm de G-CSF que tiene una secuencia IRES y una secuencia Kozak (G-CSF IRES Kozak; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5004; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Cap1), ARNm de G-CSF que tiene una secuencia IRES pero no una secuencia Kozak (G-CSF IRES; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5006; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Cap1), ARNm de G-CSF sin IRES o secuencia Kozak (GCSF no Kozak; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5008; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Cap1) o una secuencia de G-CSF que tiene una secuencia Kozak (G-CSF Kozak ; secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5720; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos que no se muestra en la secuencia; 5'cap, Cap1) se modificaron completamente con 5-metilcitidina y 1.metilpseudouridina y se probaron a una concentración de 75 ng por pocillo en placas de 24 pocillos. 24 horas después de la transfección, se midió la expresión de G-CSF mediante ELISA y los resultados se muestran en la Tabla 36.
T l . Ex r i n - F
Figure imgf000432_0002
Ejemplo 38. Construcciones MALAT1
El ARNm modificado que codifica G-CSF o mCherry con una secuencia de MALAT1 humana o de ratón y sus secuencias de ADNc correspondientes se muestran a continuación en la Tabla 37. En la Tabla 37, el codón de inicio de cada secuencia está subrayado y las secuencias de MALAT1 están en negrita.
Tabla 37. Construcciones MALAT1
Figure imgf000432_0003
Figure imgf000433_0001
Figure imgf000434_0001
Figure imgf000435_0001
Estas secuencias de ARNm modificadas pueden incluir al menos una modificación química descrita en esta invención. La secuencia de ARNm modificada con G-CSF o mCherry se puede formular usando procedimientos descritos en esta invención y/o conocidos en la técnica, antes de la transfección y/o administración.
La secuencia de ARNm modificada que codifica G-CSF o mCherry se puede transfectar in vitro a varios tipos celulares, como HEK293, HeLa, PBMC y fibroblastos BJ, y las descritas en la Tabla 25 usando los procedimientos descritos en esta invención y/o conocidos en la técnica. A continuación, las células se analizan utilizando procedimientos descritos en esta invención y/o conocidos en la técnica para determinar la concentración de G-CSF o mCherry y/o la viabilidad celular.
Ejemplo 39. Utilización de 5'UTR heterólogas
Se puede proporcionar una UTR 5' como una región flanqueante para los ácidos nucleicos, los ácidos nucleicos modificados o el ARNm de la descripción. 5'UTR puede ser homólogo o heterólogo a la región codificante encontrada en los ácidos nucleicos, ácidos nucleicos modificados o ARNm de la descripción. Pueden incluirse múltiples UTR 5' o 3' en las regiones flanqueantes y pueden ser las mismas o de secuencias diferentes. Cualquier porción de las regiones flanqueantes, incluida ninguna, puede tener codones optimizados y cualquiera puede contener independientemente una o más modificaciones estructurales o químicas diferentes, antes y/o después de la optimización de codones.
En la Tabla Extensa 21 en la Solicitud Provisional de EE. UU. N° 61/7/5,509, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Heterologous Untranslated Regions for ARNm y en la Tabla Extensa 21 en la Solicitud Provisional de EE. UU. N° 61/829.372, depositada el 31 de mayo de 2013, titulada Heterologous Untranslated Regions for ARNm se muestra una lista del sitio de inicio y finalización de los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la divulgación. Cada 5'UTR (5'UTR-005 a 5'UTR 68511) se identifica por su sitio de inicio y finalización en relación con su transcrito nativo o de tipo salvaje (homólogo) (ENST; el identificador utilizado en la base de datos ENSEMBL).
Para alterar una o más propiedades de los ácidos nucleicos, ácidos nucleicos modificados o ARNm de la divulgación, las 5'UTR que son heterólogas a la región codificante de los ácidos nucleicos, los ácidos nucleicos modificados o el ARNm de la divulgación se transforman en compuestos de la divulgación Los ácidos nucleicos, los ácidos nucleicos modificados o el ARNm se administran luego a células, tejidos u organismos y se miden resultados como el nivel de proteína, la localización y/o la vida media para evaluar los efectos beneficiosos que la 5'UTR heteróloga puede tener sobre los ácidos nucleicos. ácidos nucleicos modificados o ARNm de la divulgación. Se pueden utilizar variantes de las 5'UTR donde se agregan o eliminan uno o más nucleótidos de los extremos, incluidos A, T, C o G. Las 5'UTR también se pueden optimizar por codones o modificar de cualquier manera descrita en esta invención.
Ejemplo 40. Utilización adicional de regiones no traducidas 5'
Puede proporcionarse una UTR 5' como una región flanqueante para los ácidos nucleicos, los ácidos nucleicos modificados o el ARNm de la divulgación. 5'UTR puede ser homóloga o heteróloga a la región codificante encontrada en los ácidos nucleicos, ácidos nucleicos modificados o ARNm de la divulgación. Pueden incluirse múltiples UTR 5' en las regiones flanqueantes y pueden ser las mismas o de secuencias diferentes. Cualquier porción de las regiones flanqueantes, incluida ninguna, puede tener codones optimizados y cualquiera puede contener independientemente una o más modificaciones estructurales o químicas diferentes, antes y/o después de la optimización de codones. En la Tabla 38 se muestra una lista de regiones no traducidas en 5' que pueden usarse con los ácidos nucleicos, ácidos nucleicos modificados o ARNm de la presente divulgación.
Para alterar una o más propiedades de los ácidos nucleicos, ácidos nucleicos modificados o ARNm de la divulgación, as 5'UTR que son heterólogas a la región codificante de los ácidos nucleicos, los ácidos nucleicos modificados o el ARNm de la divulgación se transforman en compuestos de la divulgación Los ácidos nucleicos, los ácidos nucleicos modificados o el ARNm se administran luego a células, tejidos u organismos y se miden resultados como el nivel de proteína, la localización y/o la vida media para evaluar los efectos beneficiosos que la 5'UTR heteróloga puede tener sobre los ácidos nucleicos. ácidos nucleicos modificados o ARNm de la divulgación. Pueden utilizarse variantes de as UTR 5' donde se añaden o eliminan uno o más nucleótidos en los extremos, incluidos A, T, C o G. Las 5'UTR también pueden optimizarse por codones o modificarse de cualquier manera descrita en esta invención.
Tabla 38. 5'-Re iones no traducidas
Figure imgf000436_0001
Figure imgf000437_0001
Ejemplo 41. Producción de proteínas utilizando 5'UTR heterólogas
El día antes de la transfección, se recogieron 20 000 células HeLa (ATCC n.° CCL-2; Manassas, VA) mediante tratamiento con solución de tripsina-EDTA (LifeTechnologies, Grand Island, NY) y se sembraron en un volumen total de 100 ul de medio EMEM (suplementado con 10 % de FCS y 1x Glutamax) por pocillo en una placa de cultivo celular de 96 pocillos (Corning, Manassas, VA). Las células se cultivaron a 37 °C en 5 % de atmósfera de CO2 durante la noche. Al día siguiente, 37,5 ng, 75 ng o 150 de ARN modificado con G-CSF que comprende una secuencia de ácido nucleico para 5UTR-001 (secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en la secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina), ARN modificado con G-CSF que comprende una secuencia de ácido nucleico para 5UTR-68515 (secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5732; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Cap1; totalmente modificado con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina), ARN modificado con G-CSF que comprende una secuencia de ácido nucleico para 5UTR-68516 (secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5733; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos que no se muestra en secuencia; 5'cap, Cap1; totalmente modificado con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina), ARN modificado con G-CSF que comprende una secuencia de ácido nucleico para 5UTR-68521 (secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5738; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrados en secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina) o ARN modificado con G-CSF que comprende una secuencia de ácido nucleico para 5UTR-68522 (secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5739; poliA cola de aproximadamente 140 nucleótidos que no se muestra en secuencia; 5'cap, Cap1; totalmente modificado con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina) se diluyeron en un volumen final de 10 ul de OPTI-MEM (LifeTechnologies, Grand Island, NY). Se utilizó Lipofectamina 2000 (LifeTechnologies, Grand Island, NY) como reactivo de transfección y se diluyeron 0,2 ul en un volumen final de 10 ul de OPTI-MEM. Después de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente, ambas soluciones se combinaron y se incubaron 15 minutos más a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron 20 ul de solución combinada a 100 ul de medio de cultivo celular que contenía las células HeLa y se incubaron a temperatura ambiente.
Después de una incubación de 24 horas, las células que expresaban G-CSF se lisaron con 100 ul de tampón de lisis pasiva (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante. La producción de proteína G-CSF se determinó por ELISA.
Estos resultados, que se muestran en la Tabla 39, demuestran que el ARNm de G-CSF que comprende 5UTR-68515 o 5UTR-68521 produjo la mayor cantidad de proteína mientras que el ARNm de G-CSF que comprende 5UTR-68522 produjo la menor cantidad de proteína.
T l . Pr i n r ín - F r ir ' TR h r l
Figure imgf000437_0002
Ejemplo 42. Efecto de la secuencia Kozak en ácidos nucleicos modificados
Se sembraron células HeLa a una densidad de 15000 por pocillo en 100 ul de medio de cultivo celular DMEM+FBS 10 %. ARNm de G-CSF que tiene una secuencia Kozak (G-CSF Kozak; secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5004; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos que no se muestra en la secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1- metilpseudouridina) o ARNm de G-CSF que no tiene una secuencia Kozak (G-CSF no Kozak; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5008; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5 -metilcitidina y 1-metilpseudoundina) y se transfectaron por triplicado a una concentración de 75 ng por pocillo en placas de 96 pocillos.
24 horas, 48 horas y 72 horas después de la transfección, se recogió el sobrenadante y se midió la expresión de G-CSF mediante ELISA, y los resultados se muestran en la Tabla 40.
Tabla 40. Expresión de G-CSF
Figure imgf000438_0002
Ejemplo 43. Efecto de la 5'UTR en ácidos nucleicos modificados
El ARNm que codifica un polipéptido de interés y tiene una secuencia poliA y una caperuza, está completamente modificada con al menos una química descrita en esta invención y/o en la publicación internacional en tramitación N° WO2013052523 y el ARNm comprende una 5'UTR de la Tabla 41. Las células HeLa se siembran en medio de cultivo celular y se transfectan con el ARNm a una concentración predeterminada (ng por pocillo) en placas de pocillos. A intervalos predeterminados (por ejemplo, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 60 horas y/o 72 horas) después de la transfección, se recoge el sobrenadante y se mide la expresión de la proteína mediante ELISA.
Tabla 41. 5' UTR
Figure imgf000438_0001
Ejemplo 44. Efecto de la longitud de la cola de PolyA en ácidos nucleicos modificados
A. Bioanalizador
ARNm de G-CSF modificado (secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5745; 5'cap, Cap 1 completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina (5mc/1mpU) o completamente modificada con 1-metilpseudouridina (1mpU)), ARNm del factor IX modificado (FIX) (la secuencia de ARNm se muestra en SEQ ID NO: 5746; 5'cap, Cap 1 completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina (5mc/1mpU) o completamente modificada con 1-metilpseudouridina (1mpU)), ARNm de eritropoyetina (EPO) modificado (la secuencia de ARNm se muestra en SEQ ID NO: 5747; 5'cap, Cap 1 completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina (5mc/1mpU) o completamente modificada con 1-metilpseudouridina (1mpU)) o ARNm de mCherry modificado (secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5748; 5'cap, Cap 1 completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina (5mc/1mpU) o totalmente modificada con 1-metilpseudouridina (1mpU)) que tenían una cola poliA de 20, 40, 80, 100, 120, 140 o 160 nucleótidos de longitud o sin cola poliA se analizaron mediante un bioanalizador (bioanalizador Agilent 2100). Todas las muestras mantuvieron la integridad del ARNm según lo determinado por el bioanalizador.
B. Fibroblastos BJ
Fibroblastos primarios de prepucio humano (fibroblastos BJ) se obtienen de American Type Culture Collection (ATCC) (catálogo # CRL-2522) y crecido en Medio Esencial Mínimo de Eagle (ATCC, cat# 11095-114) suplementado con suero bovino fetal al 10 % a 37 °C, bajo 5 % de CO2. Se siembran fibroblastos BJ en una placa de 24 pocillos a una densidad de 100.000 células por pocillo en 0,5 ml de medio de cultivo. 250 ng de ARNm de G-CSF modificado (secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5745; 5'cap, Cap 1 completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina (5mc/1mpU) o completamente modificada con 1-metilpseudouridina (1mpU)), ARNm del factor IX modificado (FIX) (la secuencia de ARNm se muestra en SEQ ID NO: 5746; 5'cap, Cap 1 completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina (5mc/1mpU) o completamente modificada con 1-metilpseudouridina (1mpU)), ARNm de eritropoyetina modificada (EPO) (secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5747; 5'cap,
Cap 1 totalmente modificado con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina (5mc/1mpU) o completamente modificada con 1-metilpseudouridina (1mpU)) o ARNm de mCherry modificado (secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5748; 5'cap, Cap 1 completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina (5mc/1mpU) o completamente modificada con 1-metilpseudouridina (1mpU)) que tenían una cola poliA de 20, 40, 80, 100, 120, 140 o 160 nucleótidos de longitud o sin cola poliA se transfectaron utilizando Lipofectamina 2000, siguiendo el protocolo del fabricante. FIX, G-CSF y EPO se transfectaron por triplicado.
El sobrenadante se recogió a las 24 horas, 48 horas y 72 horas para FIX, G-CSF y EPO y a las 24 horas para mCherry. La expresión de la proteína se analizó mediante ELISA para FIX, G-CSF y EPO y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para mCherry. Los resultados para G-CSF se muestran en la Tabla 42, los resultados para EPO se muestran en la Tabla 43, los resultados para FIX se muestran en la Tabla 44 y los resultados para mCherry se muestran en la Tabla 45.
Tabla 42. Expresión de proteína G-CSF
Figure imgf000439_0001
Figure imgf000440_0001
T l 4. Ex r i n r ín EP
Figure imgf000440_0002
Figure imgf000441_0001
T l 44. Ex r i n r ín FIX
Figure imgf000441_0002
Figure imgf000442_0001
T l 4. Ex r i n m h rr
Figure imgf000442_0002
Figure imgf000443_0001
Ejemplo 45. Ácidos nucleicos modificados con secuencia mir-122
A. Células HeLa
Se sembraron células HeLa a una densidad de 15000 por pocilio en 100 ul de medio de cultivo celular (DMEM 10 % de FBS). ARNm de G-CSF que tiene una secuencia de miR-122 en 3'UTR (G-CSF miR122; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5024; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap,Cap 1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina) o ARNm de G-CSF que tiene una secuencia de miR-122 sin la secuencia semilla en la 3'UTR (G-CSF sin semilla; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5028; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrados en la secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudoundina) se transfectaron con 0,3 ul por pocillo de Lipofectamina 2000 a una concentración de 75 ng de ARNm por pocillo en placas de 96 pocillos. El sobrenadante se recogió entre 16 y 18 horas después de la transfección y se midió la expresión de G-CSF mediante ELISA, y los resultados se muestran en la Tabla 46.
T l 4 . Ex r i n - F n H L
Figure imgf000443_0002
B. Hepatocitos primarios humanos y de rata
Se sembraron células primarias de hepatocitos humanos o de rata a una densidad de 350.000 células por pocillo en 500 ul de medio de cultivo celular (InvitroGRO CP e InVitroGRO HI Medium 2,2 % de Torpedo Antibiotic Mix). ARNm de G-CSF que tiene una secuencia de miR-122 en 3'UTR (G-CSF miR122; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5024; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap,Cap 1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina) o ARNm de G-CSF que tiene una secuencia de miR-122 sin la secuencia semilla en la 3'UTR (G-CSF sin semilla; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5028; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrados en la secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudoundina) se transfectaron con 1 ul por pocillo de Lipofectamina 2000 a una concentración de 500 ng de ARNm por pocillo en placas de 24 pocillos para los hepatocitos primarios humanos y los hepatocitos primarios de rata. El sobrenadante se recogió entre 16 y 18 horas después de la transfección y se midió la expresión de G-CSF mediante ELISA, y los resultados se muestran en la Tabla 47. La secuencia del sitio de unión de mir-122 en el ARNm amortiguó la expresión de la proteína G-CSF en los hepatocitos primarios.
Tabla 47. Ex resión de G-CSF en He atocitos
Figure imgf000443_0003
Ejemplo 46. Evolución temporal de ácidos nucleicos modificados con una secuencia mir-122
A. Células HeLa
Se sembraron células HeLa a una densidad de 17000 por pocilio en 100 ul de medio de cultivo celular (DMEM 10 % de FBS). ARNm de G-CSF sin una secuencia de miR-122 en 3'UTR (G-CSF; secuencia de ARNm de 3'UTR de ratón mostrada en SEQ ID NO: 5717; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Cap1 ; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina; secuencia de ARNm de 3'UTR humana mostrada en SEQ ID NO: 5716; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina), ARNm de G-CSF que tiene una secuencia de miR-122 en 3'UTR (G-CSF miR122; secuencia de ARNm de 3'UTR de ratón mostrada en SEQ ID NO: 5024; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina; secuencia de ARNm de 3'UTR humana que se muestra en SEQ ID NO: 5018; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos que no se muestra en la secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilipseudouridina), ARNm de G-CSF que tiene una secuencia semilla de miR-122 en la 3'UTR (semilla de G-CSF; secuencia de ARNm de 3'UTR de ratón mostrada en SEQ ID NO: 5026; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en la secuencia; 5'cap, Cap1; totalmente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilipseudouridina, secuencia de ARNm de 3'UTR humana mostrada en SEQ ID NO: 5020; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en la secuencia; 5'cap, Cap1; totalmente modificado con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina), ARNm de G-CSF que tiene una secuencia de miR-122 sin la secuencia semilla en 3'UTR (G-CSF sin semillas; secuencia de ARNm de 3'UTR de ratón que se muestra en SEQ ID NO: 5028; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina; secuencia de ARNm de 3'UTR humana mostrada en SEQ ID NO: 5022; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no se muestra en secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina), ARNm del factor IX sin una secuencia de miR-122 en el 3'UTR (FIX; secuencia de ARNm de 3'UTR de ratón que se muestra en SEQ ID NO : 5719; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos que no se muestra en la secuencia; 5'cap, Cap1; totalmente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina; secuencia de ARNm de 3'UTR humana que se muestra en SEQ ID NO: 5718; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrados en secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina), ARNm del factor IX que tiene una secuencia de miR-122 en la 3'UTR (FIX miR122; secuencia de ARNm de UTR 3' de ratón mostrada en SEQ ID NO: 5036; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en la secuencia; 5'cap, Cap1; totalmente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilipseudouridina, secuencia de ARNm de 3'UTR humana mostrada en SEQ ID NO: 5030; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en la secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina), el ARNm del factor IX que tiene una secuencia semilla de miR-122 en la 3'UTR (semilla FIX; la secuencia del ARNm de la 3'UTR de ratón se muestra en SEQ ID NO: 5038; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrados en secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilipseudouridina, secuencia de ARNm de 3'UTR humana mostrada en SEQ ID NO: 5032; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5' cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudoundina) o el ARNm del factor IX que tiene una secuencia de miR-122 sin la secuencia semilla en el 3'UTR (FIX sin semilla; la secuencia del ARNm del 3'UTR de ratón se muestra en SEQ ID NO: 5040; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos que no se muestra en la secuencia; 5'cap, Cap1; totalmente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilipseudouridina, secuencia de ARNm de 3'UTR humana que se muestra en SEQ ID NO: 5034; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no se muestra en secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudoundina) se transfectaron con 0,3 ul por pocillo de Lipofectamina 2000 a una concentración de 75 ng de ARNm por pocillo en placas de 96 pocillos. El sobrenadante se recogió entre 16 y 18 horas después de la transfección y se midió la expresión de G-CSF o Factor IX mediante ELISA, y los resultados se muestran en la Tabla 48.
T l 4 . Ex r i n n H L
Figure imgf000444_0001
Figure imgf000445_0001
B. Hepatocitos primarios humanos y de rata
Se sembraron células primarias de hepatocitos humanos o de rata a una densidad de 350.000 células por pocilio en 500 ul de medio de cultivo celular (InvitroGRO CP e InVitroGRO HI Medium 2,2 % de Torpedo Antibiotic). ARNm de G-CSF sin una secuencia de miR-122 en 3'UTR (G-CSF; secuencia de ARNm de 3'UTR de ratón mostrada en SEQ ID NO: 5717; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Capí ; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina; secuencia de ARNm de 3'UTR humana mostrada en SEQ ID NO: 5716; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Capí; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina), ARNm de G-CSF que tiene una secuencia de miR-122 en 3'UTR (G-CSF miR122; secuencia de ARNm de 3'UTR de ratón mostrada en SEQ ID NO: 5024; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina; secuencia de ARNm de 3'UTR humana que se muestra en SEQ ID NO: 5018; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos que no se muestra en la secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilipseudouridina), ARNm de G-CSF que tiene una secuencia semilla de miR-122 en la 3'UTR (semilla de G-Cs F; secuencia de ARNm de 3'UTR de ratón mostrada en SEQ ID NO: 5026; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en la secuencia; 5'cap, Cap1; totalmente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilipseudouridina, secuencia de ARNm de 3'UTR humana mostrada en SEQ ID NO: 5020; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en la secuencia; 5'cap, Cap1; totalmente modificado con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina), ARNm de G-CSF que tiene una secuencia de miR-122 sin la secuencia semilla en 3'UTR (G-CSF sin semilla; secuencia de ARNm de 3'UTR de ratón que se muestra en SEQ ID NO: 5028; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina; secuencia de ARNm de 3'UTR humana mostrada en SEQ ID NO: 5022; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no se muestra en secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina), ARNm del factor IX sin una secuencia de miR-122 en el 3'UTR (FIX; secuencia de ARNm de 3'UTR de ratón que se muestra en SEQ ID NO : 5719; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos que no se muestra en la secuencia; 5'cap, Cap1; totalmente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina; secuencia de ARNm de 3'UTR humana que se muestra en SEQ ID NO: 5718; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrados en secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina), ARNm del factor IX que tiene una secuencia de miR-122 en la 3'UTR (FIX miR122; secuencia de ARNm de UTR 3' de ratón mostrada en SEQ ID NO: 5036; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en la secuencia; 5'cap, Cap1; totalmente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilipseudouridina, secuencia de ARNm de 3'UTR humana mostrada en SEQ ID NO: 5030; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en la secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina), el ARNm del factor IX que tiene una secuencia semilla de miR-122 en la 3'UTR (semilla FIX; la secuencia del ARNm de la 3'UTR de ratón se muestra en SEQ ID NO: 5038; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrados en secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilipseudouridina, secuencia de ARNm de 3'UTR humana mostrada en SEQ ID NO: 5032; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5' cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudoundina) o el ARNm del factor IX que tiene una secuencia de miR-122 sin la secuencia semilla en el 3'UTR (FIX sin semilla; la secuencia del ARNm del 3'UTR de ratón se muestra en SEQ ID NO: 5040; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos que no se muestra en la secuencia; 5'cap, Cap1; totalmente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilipseudouridina, secuencia de ARNm de 3'UTR humana que se muestra en SEQ ID NO: 5034; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no se muestra en secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudoundina) se transfectaron con 1 ul por pocillo de Lipofectamina 2000 a una concentración de 500 ng por pocillo en placas de 24 pocillos para los hepatocitos primarios humanos y de rata. El sobrenadante se recogió entre 24, 48 horas horas y 72 horas después de la transfección y se midió la expresión de G-CSF y Factor IX mediante ELISA, y los resultados se muestran en la Tabla 49. La secuencia del sitio de unión de mir-122 en el ARNm amortiguó la expresión de la proteína G- CSF y Factor IX en los hepatocitos primarios.
T l 4 . Ex r i n - F n H i
Figure imgf000445_0002
Figure imgf000446_0001
Ejemplo 47. Evolución temporal de ácidos nucleicos modificados con una secuencia mir-122 en células cancerosas
A. Nivel base de miR-122
El nivel básico de mir-122 en hepatocitos humanos, hepatocitos de rata, células de carcinoma hepatocelular humano (Hep3B) y células HeLa se determinó mediante análisis TAQMAN® utilizando el protocolo del fabricante. Los niveles se normalizaron a U6 y los resultados se muestran en la Tabla 50.
Tabla 50. Niveles de miR-122 en varios tipos celulares
Figure imgf000446_0002
B. Hepatocitos humanos primarios y células Hep3B
Se sembraron hepatocitos humanos primarios a una densidad de 50.000 células por pocillo en 100 ul de medio de cultivo celular (InvitroGRO CP e InVitroGRO HI Medium Torpedo Antibiotic Mix al 2,2 %) y se sembraron células Hep3B a una densidad de 20.000 células por pocillo en 100 ul de medio de cultivo celular MEM 10 % de FBS. ARNm de G-CSF sin una secuencia de miR-122 en 3'UTR (G-CSF; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5745; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, capí; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina), ARNm de G-CSF que tiene una secuencia miR-122 en la 3'UTR (G-CSF miR122; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5018; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia ; 5'cap, capí; totalmente modificado con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina), ARNm de G-CSF que tiene una secuencia semilla de miR-122 en la 3'UTR (semilla de G-CSF; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5020 ; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos que no se muestra en la secuencia; 5'cap, cap1; totalmente modificado con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina) o ARNm de G-CSF que tiene una secuencia de miR-122 sin la secuencia semilla en la 3'UTR ( G-CSF sin semillas; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5022; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina a y 1-metilpseudouridina) se transfectaron con 0,3 ul por pocillo de Lipofectamina 2000 a una concentración de 75 ng de ARNm por pocillo en placas de 96 pocillos para los hepatocitos humanos primarios y las células Hep3B. El sobrenadante se recogió entre 24, 48 horas horas y 72 horas después de la transfección y se midió la expresión de G-CSF mediante ELISA, y los resultados se muestran en la Tabla 51. La secuencia del sitio de unión de mir-122 en el ARNm redujo la expresión de la proteína G-CSF en los hepatocitos humanos primarios pero no en las células Hep3B.
Tabla 51. Expresión de G-CSF
Figure imgf000447_0001
Ejemplo 48. Evolución temporal de ácidos nucleicos modificados con una secuencia mir-1423p
A. Nivel base de miR-1433p
El nivel base de miR-1423p en células RAW264.7 y células HeLa se determinó mediante análisis TAQMAN® utilizando el protocolo del fabricante. Los niveles se normalizaron a U6 y los resultados se muestran en la Tabla 52.
Tabla 52. Niveles de miR-1423p en varios tipos celulares
Figure imgf000447_0002
B. Células HeLa y RAW264.7
Se sembraron células HeLa a una densidad de 17.000 por pocillo en 100 ul de medio de cultivo celular DMEM 10 % de FBS y se sembraron células RAW264.7 a una densidad de 200.000 por pocillo en 100 ul de medio de cultivo celular DMEM 10 % de FBS. ARNm de G-CSF sin una secuencia de miR-142 3p 3'UTR (G-CSF; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5749; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Capí; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina), ARNm de G-CSF que tiene una secuencia miR-142 3p en la 3'UTR (G-CSF miR142 3p; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5750; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no se muestra en secuencia; 5'cap, Cap1; totalmente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilipseudouridina), ARNm de G-CSF que tiene una secuencia semilla miR-142 3p en la 3'UTR (semilla G-CSF; secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5751; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos que no se muestra en la secuencia; 5'cap, cap1; totalmente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudoundina) o ARNm de G-CSF que tiene una secuencia 3p de miR-142 sin la secuencia semilla en la 3'UTR (G-CSF sin semilla; la secuencia de ARNm se muestra en SEQ ID NO: 5752; la cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no se muestra en la secuencia; 5'cap, Cap1; totalmente modificada con 5-me tilcitidina y 1-metilpseudouridina) se transfectaron con 0,3 ul por pocillo de Lipofectamina 2000 a una concentración de 75 ng de ARNm por pocillo en placas de 96 pocillos para HeLa o con 1 ul por pocillo de Lipofectamina 2000 a una concentración de 250 ng de ARNm por pocillo en placas de 24 pocillos para células RAW264.7. El sobrenadante se recogió 16-18 horas después de la transfección, se midió la expresión de G-CSF mediante ELISA y los resultados se muestran en la Tabla 53. Se demostró que los sitios miR-142 3p en G-CSF regulan a la baja la expresión de G-CSF en células RAW264.7.
Tabla 53. Expresión
Figure imgf000448_0001
C. Evolución temporal en células RAW264.7
Se sembraron células RAW264.7 a una densidad de 60.000 células por pocillo en 100 ul de medio de cultivo celular (DMEM 10 % de FBS). ARNm de G-CSF sin una secuencia de miR-1423p en 3'UTR (G-CSF; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5749; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina), ARNm de G-CSF que tiene una secuencia miR-142 3p en la 3'UTR (G-CSF miR142 3p; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5750; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia ; 5'cap, cap1; totalmente modificado con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina), ARNm de G-CSF que tiene una secuencia semilla de miR-142 3p en la 3'UTR (semilla de G-CSF; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5751; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos que no se muestra en la secuencia; 5'cap, cap1; totalmente modificado con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina) o ARNm de G-CSF que tiene una secuencia de miR-1423p sin la secuencia semilla en la 3'UTR (G-CSF sin semilla; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5752; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina a y 1-metilpseudouridina) se transfectaron con 0,3 ul por pocillo de Lipofectamina 2000 a una concentración de 75 ng de ARNm por pocillo en placas de 96 pocillos. El sobrenadante se recogió entre 24, 48 horas horas y 72 horas después de la transfección y se midió la expresión de G-CSF mediante ELISA, y los resultados se muestran en la Tabla 54. La secuencia del sitio de unión miR-1423p en el ARNm mostró una fuerte supresión de la expresión de G-CSF en células RAW264.7 a lo largo del tiempo.
Tabla 54. Ex resión de G-CSF
Figure imgf000448_0002
Figure imgf000449_0001
D. miR-1423p en PBMC
Se sembraron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a una densidad de 150.000 células por pocilio en 100 ul de medio de cultivo celular (Opti-MEM y después de la transfección se agregó 10 % de FBS). ARNm de G-CSF que tiene una secuencia miR-142 3p en 3'u Tr (G-CSF miR142 3p; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5750; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina), ARNm de G-CSF que tiene una secuencia semilla miR-1423p en la 3'UTR (semilla G-CSF; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5751; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina) o ARNm de G-CSF que tiene una secuencia miR-142 3p sin la secuencia semilla en 3'UTR (G-CSF sin semilla; secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5752; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos que no se muestra en la secuencia; 5'cap, cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudoundina) se transfectaron por triplicado con 0,4 ul por pocillo de Lipofectamine 2000 a una concentración de 500 ng de ARNm por pocillo en placas de 96 pocillos para 2 o 3 donantes. El sobrenadante se recogió 24 horas después de la transfección y se midió la expresión de G-CSF mediante ELISA. Los resultados de los 2 donantes se muestran en la Tabla 55 y los resultados de los 3 donantes se muestran en la Tabla 56. Se demostró que la secuencia del sitio de unión de mir-1423p en el ARNm regula a la baja la expresión de G-CSF en PBMC humana.
Tabla 55. Expresión PBMC 2 donantes
Figure imgf000449_0002
Tabla 56. Expresión PBMC 3 donantes
Figure imgf000449_0003
Ejemplo 49. Expresión in vivo de ARNm modificado
A. Ratones desnudos BALB/c
Ratones desnudos BALB/c fueron inyectados por vía intravenosa con 0,1 mg/kg ARNm modificado con luciferasa sin un sitio de unión a miR-122 ("ARNm no dirigido"; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5753; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5' cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpeudouridina) formulada en una nanopartícula lipídica descrita en la Tabla 57 o ARNm modificado con luciferasa con un sitio de unión de miR-122 en la 3'UTR ("ARNm dirigido a miR-122"; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5754; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; cap 5', Cap1; totalmente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpeudouridina) formulada en una nanopartícula lipídica descrita en la Tabla 58.
Tabla 57. Nanopartícula lipídica para ARNm no diri ido
Figure imgf000449_0004
Figure imgf000450_0001
T l . N n r í l li í i r ARNm iri i
Figure imgf000450_0002
24 horas después del tratamiento, se anestesió a los animales, se les inyectó el sustrato de luciferasa D-luciferina y se evaluaron las imágenes de bioluminiscencia (BLI) de animales vivos en un generador de imágenes IVIS 15 minutos después. Las señales se obtuvieron de animales inyectados con ARNm no dirigido y de ARNm dirigido de miR-122, y se presentan en la Tabla 59. La señal de luz total producida a partir de hígados de animales tratados con ARNm dirigido de miR 122 es 29 veces menor que el ARNm no dirigido, lo que demuestra que el elemento diseñado en 3'UTR puede inhibir la expresión de proteínas en tejido normal.
Tabla 59.Expresión in vivo de ARNm modificado modulado por un sitio de unión de miR122 diseñado
Figure imgf000450_0003
B. Ratones desnudos BALB/c con células con carcinoma hepatocelular Hep3B
Ratones desnudos BALB/c se implantaron intrahepáticamente con 2*10® células de carcinoma hepatocelular Hep3B y los tumores ortotópicos resultaron se abandonaron crecer durante 24 días. A continuación, a los ratones portadores de tumores se les inyectó por vía intravenosa 0,1 mg/kg ARNm modificado con luciferasa sin un sitio de unión a miR-122 ("ARNm no dirigido"; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5753; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5' cap, Cap1; completamente modificada con 5- metilcitidina y 1-metilpeudouridina) o ARNm modificado con luciferasa con un sitio de unión de miR-122 en la 3'UTR ("ARNm dirigido a miR-122"; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5754; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpeudouridina) formulado en una nanopartícula lipídica descrita en la Tabla 57 y 58 (arriba). 24 horas después del tratamiento, los animales se anestesiaron, se les inyectó el sustrato de luciferasa D-luciferina y se evaluaron las imágenes de bioluminiscencia (BLI) de animales vivos en un generador de imágenes IVIS 20 minutos después. Se cuantificó la señal de los tumores ortotópicos en comparación con el hígado normal adyacente, y el ARNm dirigido a miR-122 administrado sistémicamente a través de nanopartículas lipídicas logró un enriquecimiento de más de 2 veces en el tumor en comparación con el hígado normal.
Ejemplo 50. Efecto de la secuencia Kozak en ácidos nucleicos modificados
Se sembraron células HeLa a una densidad de 15000 por pocillo en 100 ul de medio de cultivo celular DMEM+FBS al 10 %. ARNm de G-CSF que tiene una secuencia Kozak (G-CSF Kozak; secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5716; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos que no se muestra en la secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1- metilpseudouridina), ARNm de G-CSF que no tiene una secuencia Kozak (G-CSF no Kozak; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5008; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5 -metilcitidina y 1-metilpseudouridina), ARNm de G-CSF donde la posición -3 A, corriente arriba del codón de inicio, se convirtió en una T, (G-CSF 3t5'; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5755 (Tabla 60); cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos que no se muestra en la secuencia; 5'cap, Cap1; totalmente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina), ARNm de G-CSF donde la posición -9 A, corriente arriba del codón de inicio, se convirtió a una T, (G-CSF 9t5'; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5756 (Tabla 60); cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudoundina) o ARNm de G-CSF donde se eliminaron 9 nucleótidos corriente arriba del codón de inicio (AGAGCCACC) (G-CSF 9del5'; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5757 (Tabla 60); cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en la secuencia; 5'cap, Cap1; totalmente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudoundana) y transfectada por triplicado a una concentración de 37,5 ng por pocillo en placas de 96 pocillos. 24 horas, 48 horas y 72 horas después de la transfección, se recogió el sobrenadante y se midió la expresión de G-CSF mediante ELISA, y los resultados se muestran en la Tabla 61. En la Tabla 60, el codón de inicio de cada secuencia está subrayado. En la Tabla 60, para G-CSF 3t5', la posición -3 A, corriente arriba del codón de inicio está en negrita y subrayada y para G-CSF 9t5', la posición -9 A corriente arriba del codón de inicio está en negrita y subrayada.
Tabla 60. Secuencias G-CSF
Figure imgf000451_0001
Tabla 61. Ex resión de G-CSF
Figure imgf000451_0002
Ejemplo 51. Efecto de la modificación de 5'UTR en ácidos nucleicos modificados
Se sembraron células de fibroblastos BJ a una densidad de 100.000 por pocillo en 500 ul de medio de cultivo celular EMEM+FBS al 10 %. ARNm de G-CSF que tiene una 5'UTR sintética (G-CSF; secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5716; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos que no se muestra en la secuencia; 5'cap, Capí; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina) o ARNm de G-CSF que contiene una 5'UTR con cinco repeticiones en tándem de una secuencia de 18 nucleótidos del IRES del gen g Tx (GTX G-CSF; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5758 (Tabla 62); cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrados en secuencia; 5'cap, Cap1; totalmente modificado con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina) y transfectado por triplicado a una concentración de 250 ng por pocillo en placas de 24 pocillos. 24 horas, 48 horas y 72 horas después de la transfección, se recogió el sobrenadante y se midió la expresión de G-CSF mediante ELISA, y los resultados se muestran en la Tabla 63. En la Tabla 62, el codón de inicio está subrayado y las cinco repeticiones en tándem de una secuencia de 18 nucleótidos del IRES del gen GTX están en negrita y la primera, tercera y quinta repetición en tándem de la secuencia de 18 nucleótidos también están subrayadas.
Tabla 62. Secuencia GTX G-CSF
Figure imgf000452_0001
Tabla 63. 5' UTR
Figure imgf000452_0002
Ejemplo 53. Efecto de la modificación de 5'UTR en ácidos nucleicos modificados
Se sembraron células de fibroblastos BJ a una densidad de 100.000 por pocillo en 500 ul de medio de cultivo celular EMEM+FBS al 10 %. ARNm de G-CSF que tiene una 5'UTR sintética (G-CSF; secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5716; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos que no se muestra en la secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 1-metilpseudouridina) o ARNm de G-CSF que contiene una 5'UTR con cinco repeticiones en tándem de una secuencia de 18 nucleótidos del gen IRES de Gtx (Gtx G-CSF; secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5758 (Tabla 62); cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no se muestra en secuencia; 5'cap, Cap1; totalmente modificada con 1-metilpseudouridina) y transfectada por triplicado a una concentración de 250 ng por pocillo en placas de 24 pocillos. 24 horas, 48 horas y 72 horas después de la transfección, se recogió el sobrenadante y se midió la expresión de G-CSF mediante ELISA, y los resultados se muestran en la Tabla 64.
Tabla 64. 5' UTR
Figure imgf000452_0003
Ejemplo 54.Efecto in vivo de la modificación de 5'UTR en ácidos nucleicos modificados con 5-metilcitidina y 1 -metilpseudouridina
Para estudiar el efecto de la modificación de la 5'UTR en ratones Balb/c hembra modificados con ácidos nucleicos (n=3; 12 semanas de edad; Harlan Laboratories (South Easton, MA)) se trataron con ARNm lipoplexado.
8 ug de ARNm de G-CSF que tiene una 5'UTR sintéticoa(G-CSF; secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5716; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos que no se muestra en la secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilipseudouridina) o ARNm de G-CSF donde se eliminaron 9 nucleótidos corriente arriba del codón de inicio (G-CSF 9del5'; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5757 (Tabla 60); cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no se muestra en secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina) para el tratamiento de 3 ratones se diluyó con DMEm estéril y sin suero (Life Technologies) para obtener un volumen total de 200 ul. Se diluyeron un total de 8 ul de Lipofectamine2000 (LifeTechnologies, 11668019) para el tratamiento de 3 ratones con DMEM estéril y sin suero (LifeTechnologies, Grand Island, NY; 11965-118) para obtener un volumen total de 200 ul. Después de 5 minutos de incubación, las dos soluciones se combinaron y se mezclaron cuidadosamente con una pipeta. Después de 20 minutos, se completó la formación de lipoplejos de ARNm-Lipofectamina2000. La solución de lipoplex se transfirió a una jeringa estéril de 1 ml (BD Falcon) con una aguja de inyección de calibre 27 (jeringa de insulina BD SafetyGlide de 0,3 ml con aguja fijada permanentemente de 29 G * A en BD (catálogo #305935)). Los ratones Balb/C se colocaron bajo una lámpara de calor durante 5 minutos antes de la inyección intravenosa de 100 ul en la vena de la cola que contenía 2 ug de ARNm lipoplexado. 6 horas después de la inyección, los ratones se anestesiaron y se sangraron para recoger el suero mediante punción cardíaca. A continuación, las muestras de suero se analizaron en un ELISA G-CSF (R & Catálogo de sistemas D #SCS50) y los resultados se muestran en la Tabla 65. El ARNm de G-CSF que tenía los 9 nucleótidos corriente arriba del codón de inicio suprimidos tenía un nivel de expresión de G-CSF más alto a las 6 horas en comparación con el G-CSF que tenía una u Tr sintética.
Tabla 65. Expresión de G-CSF Kozak in vivo
Figure imgf000453_0001
Ejemplo 55. Efectoin vivo de la modificación GTX de 5'UTR en ácidos nucleicos G- CSF modificados con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina
Para estudiar el efecto de la modificación de la 5'UTR en ratones Balb/c hembra modificados con ácidos nucleicos (n=3; 12 semanas de edad; Harlan Laboratories (South Easton, MA)) se trataron con ARNm lipoplexado.
8 ug de ARNm de G-CSF que tiene una 5'UTR sintética (G-CSF; secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5716; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos que no se muestra en la secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 5- metilcitidina y 1-metilpseudoundina) o ARNm de G-CSF que contiene una 5'UTR con cinco repeticiones en tándem de una secuencia de 18 nucleótidos del gen IRES de GTX (GTX G-CSF; secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5758 (Tabla 62) ; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrada en la secuencia; 5'cap, Cap1; totalmente modificada con 5-metilcitidina y 1-metilpseudouridina) para el tratamiento de 3 ratones se diluye con DMEM estéril y sin suero (Life Technologies) para obtener una volumen total de 200ul. Se diluyeron un total de 8 ul de Lipofectamine2000 (LifeTechnologies, 11668019) para el tratamiento de 3 ratones con DMEM estéril y sin suero (LifeTechnologies, Grand Island, NY; 11965-118) para obtener un volumen total de 200 ul. Después de 5 minutos de incubación, las dos soluciones se combinaron y se mezclaron cuidadosamente con una pipeta. Después de 20 minutos, se completó la formación de lipoplejos de ARNm-Lipofectamina2000. La solución de lipoplex se transfirió a una jeringa estéril de 1 ml (BD Falcon) con una aguja de inyección de calibre 27 (jeringa de insulina BD SafetyGlide de 0,3 ml con aguja fijada permanentemente de 29 G * A en BD (catálogo #305935)). Los ratones Balb/C se colocaron bajo una lámpara de calor durante 5 minutos antes de la inyección intravenosa de 100 ul en la vena de la cola que contenía 2 ug de ARNm lipoplejado. 6 horas después de la inyección, los ratones se anestesiaron y se sangraron para recoger el suero mediante punción cardíaca. A continuación, las muestras de suero se analizaron en un ELISA G-CSF (R & Catálogo de sistemas D #SCS50) y los resultados se muestran en la Tabla 66. El ARNm de G-CSF que tenía cinco repeticiones en tándem de una secuencia de 18 nucleótidos del gen IRES de GTX tenía un mayor nivel de expresión de G-CSF a las 6 horas en comparación con el G-CSF que tenía una UTR sintética.
Tabla 66. Expresión de GTX G-CSF in vivo
Figure imgf000453_0002
Ejemplo 56. Efectoin vivo de la modificación GTX de 5'UTR en ácidos nucleicos G-CSF modificados con 1-metilpseudouridina
Para estudiar el efecto de la modificación de la 5'UTR en ratones Balb/c hembra modificados con ácidos nucleicos (n=3; 12 semanas de edad; Harlan Laboratories (South Easton, MA)) se trataron con ARNm lipoplexado.
8 ug de ARNm de G-CSF que tiene una 5'UTR sintética (G-CSF; secuencia de ARNm que se muestra en SEQ ID NO: 5716; cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos que no se muestra en la secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 1- metilpseudoundina) o ARNm de G-CSF que contiene una 5'UTR con cinco repeticiones en tándem de una secuencia de 18 nucleótidos del gen IRES de GTX (GTX G-CSF; secuencia de ARNm mostrada en SEQ ID NO: 5758 (Tabla 62); cola poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrados en secuencia; 5'cap, Cap1; completamente modificada con 1-metilpseudoundina) para el tratamiento de 3 ratones se diluye con DMEM estéril y sin suero (Life Technologies) para obtener un volumen total de 200 ul. Se diluyeron un total de 8 ul de Lipofectamine2000 (LifeTechnologies, 11668019) para el tratamiento de 3 ratones con DMEM estéril y sin suero (LifeTechnologies, Grand Island, NY; 11965-118) para obtener un volumen total de 200 ul. Después de 5 minutos de incubación, las dos soluciones se combinaron y se mezclaron cuidadosamente con una pipeta. Después de 20 minutos, se completó la formación de lipoplejos de ARNm-Lipofectamina2000. La solución de lipoplex se transfirió a una jeringa estéril de 1 ml (BD Falcon) con una aguja de inyección de calibre 27 (jeringa de insulina BD SafetyGlide de 0,3 ml con aguja fijada permanentemente de 29 G * A en BD (catálogo #305935)). Los ratones Balb/C se colocaron bajo una lámpara de calor durante 5 minutos antes de la inyección intravenosa de 100 ul en la vena de la cola que contenía 2 ug de ARNm lipoplejado. 6 horas después de la inyección, los ratones se anestesiaron y se sangraron para recoger el suero mediante punción cardíaca. A continuación, las muestras de suero se analizaron en un ELISA G-CSF (R & Catálogo de sistemas D #SCS50) y los resultados se muestran en la Tabla 67. El ARNm de G-CSF que tenía cinco repeticiones en tándem de una secuencia de 18 nucleótidos del gen IRES de GTX tenía un mayor nivel de expresión de G-CSF a las 6 horas en comparación con el G-CSF que tenía una UTR sintética.
Tabla 67. Expresión de GTX G-CSF in vivo
Figure imgf000454_0001

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Una formulación de nanopartículas lipídicas de un ARNm para la expresión dirigida de un polipéptido de interés en tipos celulares específicas, comprendiendo dicho ARNm
(a) una región no traducida 5'
(b) una región de nucleósidos enlazados que codifican el polipéptido de interés;
(c) una región no traducida en 3' que comprende al menos un sitio de unión de microARN para un microARN expresado en un tipo celular específico de manera que la expresión de ARNm puede reducirse, donde el ARNm está destinado a degradación o traducción reducida en presencia del microARN; y
(d) una región de descolado 3' de nucleósidos enlazados,
donde el uracilo o la uridina en el ARNm se reemplaza al 100 % con un uracilo modificado o una uridina modificada, respectivamente.
2. La formulación de nanopartículas lipídicas de la reivindicación 1, donde cualquiera de las regiones (a) -(d) en la reivindicación 1 comprende al menos un análogo de pseudouridina,
donde opcionalmente el análogo de pseudouridina es 1-metilpseudouridina en cuyo caso el ARNm opcionalmente comprende además el nucleósido modificado 5-metilcitidina.
3. La formulación de nanopartículas lipídicas de la reivindicación 1, donde al menos una región del ARNm está optimizada en codones, opcionalmente donde la región de nucleósidos enlazados que codifican dicho polipéptido de interés está optimizada en codones.
4. La formulación de nanopartículas lipídicas de la reivindicación 1, donde la 5'UTR es la 5'UTR nativa del polipéptido codificado.
5. La formulación de nanopartículas lipídicas de la reivindicación 1, donde la 5'UTR comprende una secuencia de iniciación de la traducción seleccionada de entre el grupo que consiste en la secuencia Kozak y un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES).
6. La formulación de nanopartículas lipídicas de la reivindicación 1, donde la 5'UTR es una UTR estructurada.
7. La formulación de nanopartículas lipídicas de la reivindicación 1, que comprende al menos una estructura de caperuza en 5', donde opcionalmente la al menos una estructura de caperuza en 5' se selecciona de entre el grupo que consiste en Cap0, Cap1, ARCA, inosina, N1-metil-guanosina , 2'fluoro-guanosina, 7-deazaguanosina, 8-oxo-guanosina, 2-amino-guanosina, LNA-guanosina, 2-azido-guanosina, Cap2, Cap4 y CAP-003 - CAP-225.
8. La formulación de nanopartículas lipídicas de la reivindicación 1, donde al menos un sitio de unión de microARN es para un microARN específico de células inmunitarias,
donde opcionalmente el microARN específico de células inmunitarias se selecciona de entre el grupo que consiste en miR-122, miR-142- 3p, miR-142-5p, miR-146a y miR-146b.
9. La formulación de nanopartículas lipídicas de la reivindicación 1, donde la región de descolado 3' de los nucleósidos enlazados comprende además un nucleósido que termina la cadena,
donde opcionalmente el nucleósido que termina la cadena se selecciona de entre el grupo que consiste en 3'-desoxiadenosina (cordicepina), 3 '-desoxiuridina, 3'-desoxicitosina, 3'-desoxiguanosina, 3'-desoxitimina, 2',3'-didesoxinucleósidos, 2',3'- didesoxiadenosina, 2',3'-didesoxiuridina, 2',3'-didesoxicitosina , 2',3'-didesoxiguanosina, 2',3'-didesoxitimina, un 2'-desoxinucleósido y -O-metilnucleósido.
10. La formulación de nanopartículas lipídicas de la reivindicación 1, donde la región de descolado 3' comprende una secuencia de horquilla.
11. La formulación de nanopartículas lipídicas de la reivindicación 1, donde la 5'UTR comprende al menos una secuencia del elemento mejorador de la traducción (TEE).
12. La formulación de nanopartículas lipídicas de cualquier reivindicación anterior, donde al menos un sitio de unión de microARN es para miR-142-3p.
13. La formulación de nanopartículas lipídicas de cualquier reivindicación anterior, donde el ARNm comprende al menos dos sitios de unión a microARN.
14. La formulación de nanopartículas lipídicas de la reivindicación 13, donde los sitios de unión del microARN son los mismos.
15. La formulación de nanopartículas lipídicas de la reivindicación 13, donde los sitios de unión del microARN son diferentes.
16. Una formulación de nanopartículas lipídicas de un ARNm como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-15 para uso en un procedimiento terapéutico donde la expresión del ARNm está dirigida a tipos celulares específicos.
ES13779667T 2012-11-26 2013-10-02 ARN modificado terminalmente Active ES2921623T3 (es)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261729933P 2012-11-26 2012-11-26
US201261737224P 2012-12-14 2012-12-14
US201361758921P 2013-01-31 2013-01-31
US201361775509P 2013-03-09 2013-03-09
US201361781139P 2013-03-14 2013-03-14
US201361829359P 2013-05-31 2013-05-31
US201361829372P 2013-05-31 2013-05-31
US201361839903P 2013-06-27 2013-06-27
US201361842709P 2013-07-03 2013-07-03
US201361857436P 2013-07-23 2013-07-23
PCT/US2013/062943 WO2014081507A1 (en) 2012-11-26 2013-10-02 Terminally modified rna

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2921623T3 true ES2921623T3 (es) 2022-08-30

Family

ID=49447811

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES13779667T Active ES2921623T3 (es) 2012-11-26 2013-10-02 ARN modificado terminalmente

Country Status (15)

Country Link
US (4) US9597380B2 (es)
EP (2) EP4074834A1 (es)
JP (5) JP6144355B2 (es)
AU (3) AU2017202228B2 (es)
CA (1) CA2892529C (es)
DK (1) DK2922554T3 (es)
ES (1) ES2921623T3 (es)
HK (1) HK1214515A1 (es)
HR (1) HRP20220607T1 (es)
LT (1) LT2922554T (es)
PL (1) PL2922554T3 (es)
PT (1) PT2922554T (es)
RS (1) RS63237B1 (es)
SI (1) SI2922554T1 (es)
WO (1) WO2014081507A1 (es)

Families Citing this family (252)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10347710B4 (de) 2003-10-14 2006-03-30 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Rekombinante Impfstoffe und deren Verwendung
DE102005046490A1 (de) 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen
TR201901311T4 (tr) 2009-12-01 2019-02-21 Translate Bio Inc İnsan genetik hastalıklarında mRNA'nın teslimi için steroid türevi.
HUE047796T2 (hu) 2010-07-06 2020-05-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa RNS bevitele több immunútvonal bekapcsolására
MX2013000164A (es) 2010-07-06 2013-03-05 Novartis Ag Liposomas con lipidos que tienen valor de pka ventajoso para suministro de arn.
JP5940064B2 (ja) 2010-07-06 2016-06-29 ノバルティス アーゲー 低用量のｒｎａを用いた大型哺乳動物の免疫化
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
WO2012019630A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded protein
CA2809851A1 (en) 2010-08-31 2012-03-08 Novartis Ag Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
US20120237975A1 (en) 2010-10-01 2012-09-20 Jason Schrum Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP4098324A1 (en) 2010-10-11 2022-12-07 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Antigen delivery platforms
WO2012075040A2 (en) 2010-11-30 2012-06-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA FOR USE IN TREATMENT OF HUMAN GENETIC DISEASES
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
WO2012159754A2 (en) 2011-05-24 2012-11-29 Biontech Ag Individualized vaccines for cancer
ES2911653T3 (es) 2011-06-08 2022-05-20 Translate Bio Inc Composiciones de nanopartículas lipídicas y métodos para el suministro de ARNm
JP2014522842A (ja) 2011-07-06 2014-09-08 ノバルティス アーゲー 免疫原性組み合わせ組成物およびその使用
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
RS62993B1 (sr) 2011-10-03 2022-03-31 Modernatx Inc Modifikovani nukleozidi, nukleotidi, i nukleinske kiseline, i njihove upotrebe
WO2013090648A1 (en) * 2011-12-16 2013-06-20 modeRNA Therapeutics Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
WO2013120498A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded allergenic antigen or an autoimmune self-antigen
WO2013120497A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded therapeutic protein
WO2013120500A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded tumour antigen
WO2013120499A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly (a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded pathogenic antigen
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
US9458450B2 (en) 2012-03-15 2016-10-04 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoretic separation technology using multi-dimensional standing waves
US10689609B2 (en) 2012-03-15 2020-06-23 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic bioreactor processes
US10322949B2 (en) 2012-03-15 2019-06-18 Flodesign Sonics, Inc. Transducer and reflector configurations for an acoustophoretic device
US10967298B2 (en) 2012-03-15 2021-04-06 Flodesign Sonics, Inc. Driver and control for variable impedence load
US9752113B2 (en) 2012-03-15 2017-09-05 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
US9950282B2 (en) 2012-03-15 2018-04-24 Flodesign Sonics, Inc. Electronic configuration and control for acoustic standing wave generation
US9745548B2 (en) 2012-03-15 2017-08-29 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
WO2013143555A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Biontech Ag Rna formulation for immunotherapy
CA2859452C (en) 2012-03-27 2021-12-21 Curevac Gmbh Artificial nucleic acid molecules for improved protein or peptide expression
SG11201405545XA (en) 2012-03-27 2014-11-27 Curevac Gmbh Artificial nucleic acid molecules comprising a 5'top utr
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
EP3501550A1 (en) 2012-04-02 2019-06-26 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
US10737953B2 (en) 2012-04-20 2020-08-11 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoretic method for use in bioreactors
EA201492055A1 (ru) 2012-06-08 2015-11-30 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. ИНГАЛЯЦИОННАЯ ДОСТАВКА мРНК В НЕЛЕГОЧНЫЕ КЛЕТКИ-МИШЕНИ
US20150267192A1 (en) 2012-06-08 2015-09-24 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof
EP2885419A4 (en) 2012-08-14 2016-05-25 Moderna Therapeutics Inc ENZYMES AND POLYMERASES FOR RNA SYNTHESIS
SI2922554T1 (sl) 2012-11-26 2022-06-30 Modernatx, Inc. Terminalno modificirana RNA
EP2925348B1 (en) 2012-11-28 2019-03-06 BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH Individualized vaccines for cancer
CA2897941A1 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Moderna Therapeutics, Inc. Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
EP2968391A1 (en) 2013-03-13 2016-01-20 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
AU2014236305B2 (en) 2013-03-14 2019-01-17 Ethris Gmbh CFTR mRNA compositions and related methods and uses
EP2971010B1 (en) 2013-03-14 2020-06-10 ModernaTX, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
DK2970955T3 (en) 2013-03-14 2019-02-11 Translate Bio Inc METHODS FOR CLEANING MESSENGER RNA
LT2970456T (lt) 2013-03-14 2021-08-10 Translate Bio, Inc. Būdai ir kompozicijos, skirti mrnr koduojamų antikūnų pristatymui
SI2972360T1 (en) 2013-03-15 2018-08-31 Translate Bio, Inc. Synergistic improvement in the delivery of nucleic acids via mixed formulations
US11377470B2 (en) 2013-03-15 2022-07-05 Modernatx, Inc. Ribonucleic acid purification
EP2983804A4 (en) 2013-03-15 2017-03-01 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
US10077439B2 (en) 2013-03-15 2018-09-18 Modernatx, Inc. Removal of DNA fragments in mRNA production process
EP2971033B8 (en) 2013-03-15 2019-07-10 ModernaTX, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
WO2014180490A1 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Biontech Ag Predicting immunogenicity of t cell epitopes
SI3019619T1 (sl) 2013-07-11 2021-12-31 Modernatx, Inc. Sestave, ki zajemajo sintetične polinukleotide, ki kodirajo proteine, pozvezane s crispr, in sintetične sgrna, ter metode uporabe
US9867885B2 (en) 2013-07-30 2018-01-16 Phaserx, Inc. Block copolymers
US20160194368A1 (en) 2013-09-03 2016-07-07 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
US9745569B2 (en) 2013-09-13 2017-08-29 Flodesign Sonics, Inc. System for generating high concentration factors for low cell density suspensions
EP3052106A4 (en) 2013-09-30 2017-07-19 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EP3052511A4 (en) 2013-10-02 2017-05-31 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
US10323076B2 (en) 2013-10-03 2019-06-18 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
CN105658242A (zh) 2013-10-22 2016-06-08 夏尔人类遗传性治疗公司 用于苯丙酮尿症的mrna疗法
WO2015061467A1 (en) 2013-10-22 2015-04-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lipid formulations for delivery of messenger rna
EP4276176A3 (en) 2013-10-22 2024-01-10 Translate Bio, Inc. Mrna therapy for argininosuccinate synthetase deficiency
EA201690588A1 (ru) 2013-10-22 2016-09-30 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Доставка мрнк в цнс и ее применение
US10428368B2 (en) * 2013-12-05 2019-10-01 New England Biolabs, Inc. Methods for enriching for a population of RNA molecules
US11225658B2 (en) * 2013-12-05 2022-01-18 New England Biolabs, Inc. Enrichment and sequencing of RNA species
US11254951B2 (en) 2014-12-30 2022-02-22 Curevac Ag Artificial nucleic acid molecules
ES2712092T3 (es) 2013-12-30 2019-05-09 Curevac Ag Moléculas de ácido nucleico artificiales
JP6584414B2 (ja) 2013-12-30 2019-10-02 キュアバック アーゲー 人工核酸分子
US9725710B2 (en) 2014-01-08 2017-08-08 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber
EP3981437A1 (en) 2014-04-23 2022-04-13 ModernaTX, Inc. Nucleic acid vaccines
BR112016024632A2 (pt) 2014-04-25 2018-01-30 Shire Human Genetic Therapies métodos de purificação de rna mensageiro
ES2750686T3 (es) 2014-05-30 2020-03-26 Translate Bio Inc Lípidos biodegradables para la administración de ácidos nucleicos
KR20240023185A (ko) * 2014-06-13 2024-02-20 도레이 카부시키가이샤 대장암의 검출 키트 또는 디바이스 및 검출 방법
RU2017100434A (ru) 2014-06-13 2018-07-18 Торэй Индастриз, Инк. Набор или устройство для обнаружения рака молочной железы и способ обнаружения
WO2015196128A2 (en) 2014-06-19 2015-12-23 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
EP3157572A4 (en) * 2014-06-19 2018-02-14 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
CN111588695A (zh) 2014-06-24 2020-08-28 川斯勒佰尔公司 用于递送核酸的立体化学富集组合物
JP6385732B2 (ja) * 2014-06-27 2018-09-05 国立大学法人北海道大学 免疫応答制御剤
US9744483B2 (en) 2014-07-02 2017-08-29 Flodesign Sonics, Inc. Large scale acoustic separation device
BR112016030852A2 (pt) 2014-07-02 2018-01-16 Shire Human Genetic Therapies encapsulação de rna mensageiro
WO2016011222A2 (en) 2014-07-16 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
JP2017524357A (ja) * 2014-07-16 2017-08-31 モデルナティエックス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ． キメラポリヌクレオチド
US20170202979A1 (en) * 2014-07-17 2017-07-20 Modernatx, Inc. Terminal modifications of polynucleotides
WO2016014478A1 (en) * 2014-07-21 2016-01-28 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College USE OF AN miRNA TO REDUCE PROLIFERATION OF A CANCER CELL
WO2016014846A1 (en) 2014-07-23 2016-01-28 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of intrabodies
WO2016023077A1 (en) * 2014-08-15 2016-02-18 Griffith University Biological markers
WO2016045732A1 (en) 2014-09-25 2016-03-31 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Stable formulations of lipids and liposomes
EP3218508A4 (en) * 2014-11-10 2018-04-18 Modernatx, Inc. Multiparametric nucleic acid optimization
WO2016090262A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Messenger rna therapy for treatment of articular disease
EP3230458B1 (en) 2014-12-12 2020-02-19 CureVac AG Artificial nucleic acid molecules for improved protein expression
JP2018509387A (ja) 2015-01-21 2018-04-05 フェーズアールエックス インコーポレイテッド 細胞に治療および診断剤を送達するための方法、組成物、ならびにシステム
US20180000953A1 (en) * 2015-01-21 2018-01-04 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
WO2016128060A1 (en) 2015-02-12 2016-08-18 Biontech Ag Predicting t cell epitopes useful for vaccination
JP6895892B2 (ja) 2015-03-19 2021-06-30 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド ポンペ病のｍＲＮＡ治療
US11021699B2 (en) 2015-04-29 2021-06-01 FioDesign Sonics, Inc. Separation using angled acoustic waves
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
US11377651B2 (en) 2016-10-19 2022-07-05 Flodesign Sonics, Inc. Cell therapy processes utilizing acoustophoresis
US11364292B2 (en) 2015-07-21 2022-06-21 Modernatx, Inc. CHIKV RNA vaccines
TW201718638A (zh) 2015-07-21 2017-06-01 現代治療公司 傳染病疫苗
US11459540B2 (en) 2015-07-28 2022-10-04 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
US11474085B2 (en) 2015-07-28 2022-10-18 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
US11564893B2 (en) 2015-08-17 2023-01-31 Modernatx, Inc. Methods for preparing particles and related compositions
WO2017044650A1 (en) * 2015-09-08 2017-03-16 The Translational Genomics Research Institute Biomarkers and methods of diagnosing and prognosing mild traumatic brain injuries
WO2017049286A1 (en) 2015-09-17 2017-03-23 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides containing a morpholino linker
WO2017049275A2 (en) 2015-09-17 2017-03-23 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides containing a stabilizing tail region
US10849920B2 (en) 2015-10-05 2020-12-01 Modernatx, Inc. Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs
WO2017059902A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh 3' utr sequences for stabilization of rna
CN114686548A (zh) 2015-10-14 2022-07-01 川斯勒佰尔公司 用于增强生产的rna相关酶的修饰
AU2016340183A1 (en) * 2015-10-16 2018-04-19 Modernatx, Inc. mRNA cap analogs and methods of mRNA capping
US20190218546A1 (en) 2015-10-16 2019-07-18 Modernatx, Inc. Mrna cap analogs with modified phosphate linkage
WO2017066797A1 (en) 2015-10-16 2017-04-20 Modernatx, Inc. Trinucleotide mrna cap analogs
PL3718565T3 (pl) 2015-10-22 2022-09-19 Modernatx, Inc. Szczepionki przeciwko wirusom układu oddechowego
EP3364950A4 (en) 2015-10-22 2019-10-23 ModernaTX, Inc. VACCINES AGAINST TROPICAL DISEASES
WO2017070613A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
CA3002912A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Nucleic acid vaccines for varicella zoster virus (vzv)
AU2016342376A1 (en) 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Sexually transmitted disease vaccines
WO2017100551A1 (en) * 2015-12-09 2017-06-15 Alexion Pharmaceuticals, Inc. HETEROLOGOUS UTR SEQUENCES FOR ENHANCED mRNA EXPRESSION
MA43415A (fr) 2015-12-09 2018-10-17 Modernatx Inc Arnm modifié codant pour une uridine diphosphate glucuronosyltransférase et utilisations associées
HRP20220652T1 (hr) 2015-12-10 2022-06-24 Modernatx, Inc. Pripravci i postupci unosa terapijskih sredstava
KR101737706B1 (ko) 2015-12-15 2017-05-18 한국원자력의학원 miR-5582-5p를 포함하는 항암제
US10465190B1 (en) 2015-12-23 2019-11-05 Modernatx, Inc. In vitro transcription methods and constructs
CN105483233B (zh) * 2015-12-24 2018-07-20 北京大学第一医院 检测miR-3158-5p表达量的系统在预测阿司匹林对心血管疾病患者疗效中的应用
CN105663023B (zh) * 2016-01-22 2018-08-10 江汉大学 一种光控药物释放的微针制备方法
EP3405579A1 (en) 2016-01-22 2018-11-28 Modernatx, Inc. Messenger ribonucleic acids for the production of intracellular binding polypeptides and methods of use thereof
US11293065B2 (en) * 2016-03-14 2022-04-05 Aelan Cell Technologies, Inc. Compositions and methods for the quality control of stem cell preparations
EP3825400A1 (en) 2016-04-08 2021-05-26 Translate Bio Ma, Inc. Multimeric coding nucleic acid and uses thereof
US11214789B2 (en) 2016-05-03 2022-01-04 Flodesign Sonics, Inc. Concentration and washing of particles with acoustics
US11085035B2 (en) 2016-05-03 2021-08-10 Flodesign Sonics, Inc. Therapeutic cell washing, concentration, and separation utilizing acoustophoresis
KR102358280B1 (ko) * 2016-05-05 2022-02-07 베니텍 바이오파마 리미티드 B형 간염 바이러스(hbv) 감염 처리용 시약 및 그 용도
CA3024470A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding interleukin-12 (il12) and uses thereof
MA45052A (fr) * 2016-05-18 2019-03-27 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour jagged1 pour le traitement du syndrome d'alagille
SG11201810256XA (en) 2016-05-18 2018-12-28 Modernatx Inc Polynucleotides encoding relaxin
MA45053A (fr) * 2016-05-18 2019-03-27 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour un régulateur de conductance transmembranaire de fibrose kystique pour le traitement de la fibrose kystique
JP2019520422A (ja) 2016-05-27 2019-07-18 トランスクリプティクス・インコーポレイテッド 合成メッセンジャーｒｎａによる原発性繊毛機能不全症の治療
CN109312313A (zh) 2016-06-13 2019-02-05 川斯勒佰尔公司 用于治疗鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症的信使rna疗法
CN109526226A (zh) 2016-07-07 2019-03-26 鲁比厄斯治疗法股份有限公司 与表达外源rna的治疗性细胞体系有关的组合物和方法
CN106139164B (zh) * 2016-08-04 2020-02-21 北京信生元生物医学科技有限公司 miR-5001在制备治疗白血病的药物中的应用
WO2018045022A1 (en) * 2016-08-30 2018-03-08 University Of South Florida Adipose derived stem cell exosomes and uses thereof
CA3036831A1 (en) 2016-09-14 2018-03-22 Modernatx, Inc. High purity rna compositions and methods for preparation thereof
EP3529347A1 (en) 2016-10-19 2019-08-28 Flodesign Sonics, Inc. Affinity cell extraction by acoustics
EP3528821A4 (en) 2016-10-21 2020-07-01 ModernaTX, Inc. VACCINE AGAINST THE HUMANE CYTOMEGALOVIRUS
RU2765874C2 (ru) 2016-10-26 2022-02-04 МОДЕРНАТиЭкс, ИНК. Матричные рибонуклеиновые кислоты для усиления иммунных ответов и способы их применения
WO2018089851A2 (en) 2016-11-11 2018-05-17 Modernatx, Inc. Influenza vaccine
EP3973955A3 (en) * 2016-11-23 2022-06-15 Mayo Foundation for Medical Education and Research Particle-mediated delivery of inhibitory rna
WO2018102317A1 (en) * 2016-11-29 2018-06-07 The Regents Of The University Of California Modulation of p53 for the treatment of cancer
WO2018107088A2 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Modernatx, Inc. Respiratory virus nucleic acid vaccines
WO2018111967A1 (en) 2016-12-13 2018-06-21 Modernatx, Inc. Rna affinity purification
WO2018126084A1 (en) 2016-12-30 2018-07-05 Phaserx, Inc. Branched peg molecules and related compositions and methods
CN108310381A (zh) * 2017-01-16 2018-07-24 昆山彭济凯丰生物科技有限公司 通过miR-6511b-3p进行抗癌的方法和药物及其应用
KR20190110612A (ko) 2017-02-01 2019-09-30 모더나티엑스, 인크. 활성화 종양유전자 돌연변이 펩티드를 인코드하는 면역조절 치료 mrna 조성물
MA47515A (fr) 2017-02-16 2019-12-25 Modernatx Inc Compositions immunogènes très puissantes
CN106591487A (zh) * 2017-02-22 2017-04-26 西北工业大学 老年骨质疏松性骨折的血清microRNA诊断标志物及其诊断试剂盒
EA201991747A1 (ru) 2017-02-27 2020-06-04 Транслейт Био, Инк. НОВАЯ КОДОН-ОПТИМИЗИРОВАННАЯ мРНК CFTR
EP3589290A4 (en) 2017-02-28 2020-12-30 Arcturus Therapeutics, Inc. TRANSLATABLE MOLECULES AND THEIR SYNTHESIS
MA52262A (fr) 2017-03-15 2020-02-19 Modernatx Inc Vaccin à large spectre contre le virus de la grippe
WO2018170256A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
WO2018170270A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (vzv) vaccine
MA47787A (fr) 2017-03-15 2020-01-22 Modernatx Inc Vaccin contre le virus respiratoire syncytial
US20200030432A1 (en) 2017-03-17 2020-01-30 Modernatx, Inc. Zoonotic disease rna vaccines
EP3607074A4 (en) * 2017-04-05 2021-07-07 Modernatx, Inc. REDUCTION OR ELIMINATION OF IMMUNE RESPONSES TO NON-INTRAVENOUS THERAPEUTIC PROTEINS, FOR EXAMPLE SUBCUTANEOUSLY
US20200123619A1 (en) * 2017-04-06 2020-04-23 The University Of Vermont And State Agricultural College Mirna signature expression in cancer
EP3612215A4 (en) 2017-04-20 2021-05-26 aTyr Pharma, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT OF Pneumonia
WO2018199275A1 (ja) * 2017-04-28 2018-11-01 東レ株式会社 卵巣腫瘍の検出のためのキット、デバイス及び方法
US11173190B2 (en) 2017-05-16 2021-11-16 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of codon-optimized mRNA encoding CFTR
US11485972B2 (en) 2017-05-18 2022-11-01 Modernatx, Inc. Modified messenger RNA comprising functional RNA elements
EP3638215A4 (en) 2017-06-15 2021-03-24 Modernatx, Inc. RNA FORMULATIONS
US20210139895A1 (en) * 2017-06-16 2021-05-13 Prostemics Co., Ltd. Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer
JP7318931B2 (ja) * 2017-07-12 2023-08-01 国立大学法人京都大学 高発現性ｍＲＮＡスイッチ
US20200165593A1 (en) 2017-07-21 2020-05-28 Modernatx, Inc. Modified mRNA Encoding a Propionyl-CoA Carboxylase and Uses Thereof
WO2019023179A1 (en) 2017-07-24 2019-01-31 Modernatx, Inc. MODIFIED mRNA ENCODING GLUCOSE-6-PHOSPHATASE AND USES THEREOF
MA49914A (fr) 2017-08-18 2021-04-21 Modernatx Inc Procédés analytiques par hplc
CN111212905A (zh) 2017-08-18 2020-05-29 摩登纳特斯有限公司 Rna聚合酶变体
US11912982B2 (en) 2017-08-18 2024-02-27 Modernatx, Inc. Methods for HPLC analysis
MX2020002348A (es) 2017-08-31 2020-10-08 Modernatx Inc Métodos de elaboración de nanopartículas lipídicas.
GB201714430D0 (en) * 2017-09-07 2017-10-25 Micol Romain Compositions and processes for targeted delivery and expression and modulation of therapeutic components in tissue
US10653767B2 (en) 2017-09-14 2020-05-19 Modernatx, Inc. Zika virus MRNA vaccines
IT201700105372A1 (it) 2017-09-20 2019-03-20 Fondazione St Italiano Tecnologia Molecola di acido nucleico funzionale e relativo uso
EP3725092A4 (en) 2017-12-14 2021-09-22 FloDesign Sonics, Inc. DRIVE AND CONTROL UNIT FOR ACOUSTIC CONVERTER
CA3084061A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Translate Bio, Inc. Improved composition and methods for treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
MA54676A (fr) 2018-01-29 2021-11-17 Modernatx Inc Vaccins à base d'arn contre le vrs
KR102141124B1 (ko) * 2018-01-30 2020-08-04 (주)바이오니아 이중 가닥 miRNA를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체 및 이의 용도
JP2021512090A (ja) 2018-01-30 2021-05-13 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド 免疫細胞に薬剤を送達するための組成物及び方法
CN108531586B (zh) * 2018-03-19 2022-03-29 朱伟 一种与乳腺癌辅助诊断相关的位于X染色体上的循环miRNA标志物及其应用
EP3773745A1 (en) 2018-04-11 2021-02-17 ModernaTX, Inc. Messenger rna comprising functional rna elements
AU2019255370B2 (en) 2018-04-19 2023-11-02 Checkmate Pharmaceuticals, Inc. Synthetic RIG-I-like receptor agonists
EP3833760A1 (en) * 2018-08-08 2021-06-16 Theramir Limited Microrna-based therapy targeted against lcp-1 positive cancers
AU2019325702A1 (en) 2018-08-24 2021-02-25 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger RNA
CN113164556A (zh) 2018-08-30 2021-07-23 特纳亚治疗股份有限公司 用心肌蛋白和ascl1进行的心脏细胞重编程
EP3849589A1 (en) 2018-09-14 2021-07-21 ModernaTX, Inc. Methods and compositions for treating cancer using mrna therapeutics
WO2020097409A2 (en) 2018-11-08 2020-05-14 Modernatx, Inc. Use of mrna encoding ox40l to treat cancer in human patients
CN109402262B (zh) * 2018-12-18 2022-01-25 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 辅助诊断神经母细胞瘤的PCR检测试剂盒及检测miR-199a-3p表达水平的方法
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition
MA55037A (fr) 2019-02-20 2021-12-29 Modernatx Inc Variants d'arn polymérase pour le coiffage co-transcriptionnel
US11851694B1 (en) 2019-02-20 2023-12-26 Modernatx, Inc. High fidelity in vitro transcription
EP3950699A4 (en) * 2019-04-05 2023-01-18 Kyoto University METHOD FOR CAPPING RNA, METHOD FOR PRODUCING MODIFIED RNA, AND MODIFIED RNA
WO2020227537A1 (en) 2019-05-07 2020-11-12 Modernatx, Inc Differentially expressed immune cell micrornas for regulation of protein expression
WO2020227510A1 (en) 2019-05-07 2020-11-12 Modernatx, Inc. Polynucleotides for disrupting immune cell activity and methods of use thereof
WO2020263985A1 (en) 2019-06-24 2020-12-30 Modernatx, Inc. Messenger rna comprising functional rna elements and uses thereof
EP3987027A1 (en) 2019-06-24 2022-04-27 ModernaTX, Inc. Endonuclease-resistant messenger rna and uses thereof
EP3997226A1 (en) 2019-07-11 2022-05-18 Tenaya Therapeutics, Inc. Cardiac cell reprogramming with micrornas and other factors
EP4027982A1 (en) 2019-09-11 2022-07-20 ModernaTX, Inc. Lnp-formulated mrna therapeutics and use thereof for treating human subjects
US20220402981A1 (en) * 2019-09-18 2022-12-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Protein tag to induce ligand dependent degradation of protein/protein-fusions
CN110724688A (zh) * 2019-10-09 2020-01-24 新乡医学院 miRNA138及其在调节TERT基因表达中的应用
WO2021076645A1 (en) * 2019-10-15 2021-04-22 The Regents Of The University Of California Treatment of airway conditions by modulation of mir200 family micrornas
MX2022004825A (es) 2019-10-23 2022-10-10 Regeneron Pharma Agonistas sintéticos del receptor similar a rig i.
CN111041025B (zh) 2019-12-17 2021-06-18 深圳市瑞吉生物科技有限公司 基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子及其制备方法
CN110938687B (zh) * 2019-12-26 2023-06-27 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院） 胎盘植入性疾病标志物
AU2021206307A1 (en) * 2020-01-11 2022-09-08 Sivec Biotechnologies Llc A microbial system for production and delivery of eukaryote-translatable mRNA to eukarya
CN113134010B (zh) * 2020-01-20 2023-09-01 上海市生物医药技术研究院 一种靶向雌激素受体α的微小RNA及其抗肿瘤用途
AU2021230476A1 (en) 2020-03-02 2022-10-20 Tenaya Therapeutics, Inc. Gene vector control by cardiomyocyte-expressed microRNAs
KR102462990B1 (ko) * 2020-03-17 2022-11-07 에이비온 주식회사 인비트로 트랜스크립트 mRNA 및 이를 함유하는 약학조성물
CN114410794B (zh) * 2020-03-30 2023-06-23 中国医学科学院肿瘤医院 外泌体miR-106b-3P、ARPC5在肺癌诊断中的应用
US11419847B2 (en) * 2020-04-10 2022-08-23 Matthias W. Rath Pharmaceutical micronutrient composition and its use to simultaneously inhibit multiple cellular mechanisms of infectivity caused by coronavirus, its variants and mutants
EP3901261A1 (en) 2020-04-22 2021-10-27 BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH Coronavirus vaccine
US20230233474A1 (en) 2020-05-28 2023-07-27 Modernatx, Inc. Use of mrnas encoding ox40l, il-23 and il-36gamma for treating cancer
CN111744019B (zh) 2020-07-01 2023-08-04 深圳瑞吉生物科技有限公司 基于甘露糖的mRNA靶向递送系统及其应用
US20230295257A1 (en) 2020-07-24 2023-09-21 Strand Therapeutics Inc. Lipid nanoparticle comprising modified nucleotides
CA3189854A1 (en) 2020-08-06 2022-02-10 Modernatx, Inc. Compositions for the delivery of payload molecules to airway epithelium
US11406703B2 (en) 2020-08-25 2022-08-09 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
CN111904974B (zh) * 2020-08-28 2021-12-28 中国人民解放军北部战区总医院 miR-574-5p在糖尿病及其相关疾病中的医药用途
AU2022205679A1 (en) 2021-01-08 2023-07-06 Strand Therapeutics Inc. Expression constructs and uses thereof
US20220226465A1 (en) 2021-01-18 2022-07-21 ConserV Bioscience Coronavirus Immunogenic Compositions, Methods and Uses Thereof
CN112961914B (zh) * 2021-02-07 2022-08-30 安徽省立医院(中国科学技术大学附属第一医院) miR-3074-5p作为类风湿关节炎标志物的应用及其试剂盒
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same
CN113249488A (zh) * 2021-06-29 2021-08-13 中国人民解放军空军军医大学 基于外泌体miRNA-4433-5p表达水平的胃癌恶液质早期诊断试剂盒
WO2023009421A1 (en) 2021-07-26 2023-02-02 Modernatx, Inc. Processes for preparing lipid nanoparticle compositions
WO2023009422A1 (en) 2021-07-26 2023-02-02 Modernatx, Inc. Processes for preparing lipid nanoparticle compositions for the delivery of payload molecules to airway epithelium
WO2023031394A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 CureVac SE Novel lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
WO2023064469A1 (en) 2021-10-13 2023-04-20 Modernatx, Inc. Compositions of mrna-encoded il15 fusion proteins and methods of use thereof
WO2023073228A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 CureVac SE Improved circular rna for expressing therapeutic proteins
WO2023077152A2 (en) * 2021-11-01 2023-05-04 Shattuck Labs, Inc. Chimeric proteins for treating cutaneous inflammation
WO2023086465A1 (en) 2021-11-12 2023-05-19 Modernatx, Inc. Compositions for the delivery of payload molecules to airway epithelium
CN114015769A (zh) * 2021-12-14 2022-02-08 上海市生物医药技术研究院 银屑病关节炎的诊断标记物及其用途
WO2023144330A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 CureVac SE Nucleic acid encoded transcription factor inhibitors
TW202345863A (zh) 2022-02-09 2023-12-01 美商現代公司 黏膜投與方法及調配物
KR20230141482A (ko) * 2022-03-31 2023-10-10 한미정밀화학주식회사 mRNA 캡 유사체 및 이의 용도
WO2023196988A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Modernatx, Inc. Methods of use of mrnas encoding il-12
US20230330264A1 (en) 2022-04-15 2023-10-19 Smartcella Solutions Ab COMPOSITIONS AND METHODS FOR EXOSOME-MEDIATED DELIVERY OF mRNA AGENTS
CN114657182B (zh) * 2022-04-18 2023-09-19 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种miRNA及其特异性检测方法和应用
WO2023212618A1 (en) 2022-04-26 2023-11-02 Strand Therapeutics Inc. Lipid nanoparticles comprising venezuelan equine encephalitis (vee) replicon and uses thereof
WO2023215498A2 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Modernatx, Inc. Compositions and methods for cd28 antagonism
WO2023219114A1 (ja) * 2022-05-10 2023-11-16 ヤマサ醤油株式会社 ｍＲＮＡキャップアナログ及びその製造方法、ｍＲＮＡの製造方法、並びにキット
WO2023230533A1 (en) * 2022-05-25 2023-11-30 Jasper Therapeutics, Inc. Modified stem cell compositions and methods for use
WO2023227608A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nucleic acid based vaccine encoding an escherichia coli fimh antigenic polypeptide
WO2024002985A1 (en) 2022-06-26 2024-01-04 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2024026490A1 (en) 2022-07-28 2024-02-01 Sqz Biotechnologies Company Polynucleotides encoding linked antigens and uses thereof
CN115261482B (zh) * 2022-10-08 2022-12-09 暨南大学 miR-4256在胃癌治疗、诊断以及预后评估中的应用

Family Cites Families (1382)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2008526A (en) 1932-11-03 1935-07-16 Wappler Frederick Charles Method and means for treating living tissue
US2588623A (en) 1948-05-10 1952-03-11 Eliscu Frank Surgical instrument for intradermal injection of fluids
US3467096A (en) 1966-04-12 1969-09-16 Ferrell S Horn Multiple hypodermic syringe arrangement
US3572336A (en) 1968-04-30 1971-03-23 Daniel R Hershberg Syringe
BE757653A (fr) 1969-10-21 1971-04-16 Ugine Kuhlmann Nouveaux medicaments derives d'acides nucleiques et procedes pour leur preparation
BE786542A (fr) 1971-07-22 1973-01-22 Dow Corning Dispositif d'aspiration permettant d'obtenir des echantillons de cellules
US3906092A (en) 1971-11-26 1975-09-16 Merck & Co Inc Stimulation of antibody response
US4270537A (en) 1979-11-19 1981-06-02 Romaine Richard A Automatic hypodermic syringe
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4500707A (en) 1980-02-29 1985-02-19 University Patents, Inc. Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides
US5132418A (en) 1980-02-29 1992-07-21 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4411657A (en) 1980-05-19 1983-10-25 Anibal Galindo Hypodermic needle
US4973679A (en) 1981-03-27 1990-11-27 University Patents, Inc. Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates
US4668777A (en) 1981-03-27 1987-05-26 University Patents, Inc. Phosphoramidite nucleoside compounds
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US4401796A (en) 1981-04-30 1983-08-30 City Of Hope Research Institute Solid-phase synthesis of polynucleotides
US4373071A (en) 1981-04-30 1983-02-08 City Of Hope Research Institute Solid-phase synthesis of polynucleotides
US4474569A (en) 1982-06-28 1984-10-02 Denver Surgical Developments, Inc. Antenatal shunt
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
US4588585A (en) 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
US4737462A (en) 1982-10-19 1988-04-12 Cetus Corporation Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US4579849A (en) 1984-04-06 1986-04-01 Merck & Co., Inc. N-alkylguanine acyclonucleosides as antiviral agents
US4957735A (en) 1984-06-12 1990-09-18 The University Of Tennessee Research Corporation Target-sensitive immunoliposomes- preparation and characterization
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
US4959314A (en) 1984-11-09 1990-09-25 Cetus Corporation Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5116943A (en) 1985-01-18 1992-05-26 Cetus Corporation Oxidation-resistant muteins of Il-2 and other protein
CA1288073C (en) 1985-03-07 1991-08-27 Paul G. Ahlquist Rna transformation vector
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
EP0204401A1 (en) 1985-04-09 1986-12-10 Biogen, Inc. Method of improving the yield of polypeptides produced in a host cell by stabilizing mRNA
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5017691A (en) 1986-07-03 1991-05-21 Schering Corporation Mammalian interleukin-4
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
US5153319A (en) 1986-03-31 1992-10-06 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4695273A (en) 1986-04-08 1987-09-22 I-Flow Corporation Multiple needle holder and subcutaneous multiple channel infusion port
US4879111A (en) 1986-04-17 1989-11-07 Cetus Corporation Treatment of infections with lymphokines
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US4886499A (en) 1986-12-18 1989-12-12 Hoffmann-La Roche Inc. Portable injection appliance
GB8704027D0 (en) 1987-02-20 1987-03-25 Owen Mumford Ltd Syringe needle combination
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US4940460A (en) 1987-06-19 1990-07-10 Bioject, Inc. Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
JP2774121B2 (ja) 1987-07-31 1998-07-09 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅
US6090591A (en) 1987-07-31 2000-07-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Selective amplification of target polynucleotide sequences
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
DE68908054T2 (de) 1988-01-21 1994-03-10 Genentech Inc Verstärkung und nachweis von nukleinsäuresequenzen.
JP2650159B2 (ja) 1988-02-24 1997-09-03 アクゾ・ノベル・エヌ・ベー 核酸増幅方法
CA1340807C (en) 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
DE68923027D1 (de) 1988-03-04 1995-07-20 Cancer Res Campaign Tech Antigene.
US5339163A (en) 1988-03-16 1994-08-16 Canon Kabushiki Kaisha Automatic exposure control device using plural image plane detection areas
EP0362371A4 (en) 1988-04-15 1990-10-24 Protein Design Labs, Inc. Il-2 receptor-specific chimeric antibodies
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5168038A (en) 1988-06-17 1992-12-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University In situ transcription in cells and tissues
US5021335A (en) 1988-06-17 1991-06-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University In situ transcription in cells and tissues
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5759802A (en) 1988-10-26 1998-06-02 Tonen Corporation Production of human serum alubumin A
FR2638359A1 (fr) 1988-11-03 1990-05-04 Tino Dalto Guide de seringue avec reglage de la profondeur de penetration de l'aiguille dans la peau
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5047524A (en) 1988-12-21 1991-09-10 Applied Biosystems, Inc. Automated system for polynucleotide synthesis and purification
US5262530A (en) 1988-12-21 1993-11-16 Applied Biosystems, Inc. Automated system for polynucleotide synthesis and purification
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US6673776B1 (en) 1989-03-21 2004-01-06 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate, mammal, fish, bird or human
US6867195B1 (en) 1989-03-21 2005-03-15 Vical Incorporated Lipid-mediated polynucleotide administration to reduce likelihood of subject's becoming infected
EP0465529B1 (en) 1989-03-21 1998-04-29 Vical, Inc. Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate
US5693622A (en) 1989-03-21 1997-12-02 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal
US6214804B1 (en) 1989-03-21 2001-04-10 Vical Incorporated Induction of a protective immune response in a mammal by injecting a DNA sequence
US5012818A (en) 1989-05-04 1991-05-07 Joishy Suresh K Two in one bone marrow surgical needle
IE66597B1 (en) 1989-05-10 1996-01-24 Akzo Nv Method for the synthesis of ribonucleic acid (RNA)
US5240855A (en) 1989-05-12 1993-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Particle gun
US5332671A (en) 1989-05-12 1994-07-26 Genetech, Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor and DNA encoding same
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
CA2020958C (en) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5545522A (en) 1989-09-22 1996-08-13 Van Gelder; Russell N. Process for amplifying a target polynucleotide sequence using a single primer-promoter complex
ATE269870T1 (de) 1989-10-24 2004-07-15 Isis Pharmaceuticals Inc 2'-modifizierte oligonukleotide
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
NO904633L (no) 1989-11-09 1991-05-10 Molecular Diagnostics Inc Amplifikasjon av nukleinsyrer ved transkriberbar haarnaalsprobe.
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5215899A (en) 1989-11-09 1993-06-01 Miles Inc. Nucleic acid amplification employing ligatable hairpin probe and transcription
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US5697901A (en) 1989-12-14 1997-12-16 Elof Eriksson Gene delivery by microneedle injection
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US6783931B1 (en) 1990-01-11 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US7037646B1 (en) 1990-01-11 2006-05-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
WO1991013080A1 (en) 1990-02-20 1991-09-05 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
EP0455905B1 (en) 1990-05-11 1998-06-17 Microprobe Corporation Dipsticks for nucleic acid hybridization assays and methods for covalently immobilizing oligonucleotides
US5194370A (en) 1990-05-16 1993-03-16 Life Technologies, Inc. Promoter ligation activated transcription amplification of nucleic acid sequences
JPH06500014A (ja) 1990-07-25 1994-01-06 シンジーン，インコーポレイテッド 多数の核酸相補体を生成させる環状伸長法
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5190521A (en) 1990-08-22 1993-03-02 Tecnol Medical Products, Inc. Apparatus and method for raising a skin wheal and anesthetizing skin
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US6140496A (en) 1990-10-09 2000-10-31 Benner; Steven Albert Precursors for deoxyribonucleotides containing non-standard nucleosides
CA2095212A1 (en) 1990-11-08 1992-05-09 Sudhir Agrawal Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
US5527288A (en) 1990-12-13 1996-06-18 Elan Medical Technologies Limited Intradermal drug delivery device and method for intradermal delivery of drugs
US6100024A (en) 1991-02-08 2000-08-08 Promega Corporation Methods and compositions for nucleic acid detection by target extension and probe amplification
EP1097945B1 (en) 1991-03-18 2007-07-04 New York University Monoclonal and chimeric antibody specific for human tumor necrosis factor
US5426180A (en) 1991-03-27 1995-06-20 Research Corporation Technologies, Inc. Methods of making single-stranded circular oligonucleotides
KR100249937B1 (ko) 1991-04-25 2000-04-01 나가야마 오사무 인간 인터루킨-6 수용체에 대한 재구성 인간 항체
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5169766A (en) 1991-06-14 1992-12-08 Life Technologies, Inc. Amplification of nucleic acid molecules
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5199441A (en) 1991-08-20 1993-04-06 Hogle Hugh H Fine needle aspiration biopsy apparatus and method
GB9118204D0 (en) 1991-08-23 1991-10-09 Weston Terence E Needle-less injector
SE9102652D0 (sv) 1991-09-13 1991-09-13 Kabi Pharmacia Ab Injection needle arrangement
ES2103918T3 (es) 1991-10-17 1997-10-01 Ciba Geigy Ag Nucleosidos biciclicos, oligonucleotidos, procedimiento para su obtencion y productos intermedios.
US5298422A (en) 1991-11-06 1994-03-29 Baylor College Of Medicine Myogenic vector systems
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5824307A (en) 1991-12-23 1998-10-20 Medimmune, Inc. Human-murine chimeric antibodies against respiratory syncytial virus
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
EP0625049A4 (en) 1992-01-23 1995-07-12 Vical Inc EX VIVO GENTRANSFER.
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
US5328483A (en) 1992-02-27 1994-07-12 Jacoby Richard M Intradermal injection device with medication and needle guard
JP3368603B2 (ja) 1992-02-28 2003-01-20 オリンパス光学工業株式会社 遺伝子治療用処置具
DE69231123T2 (de) 1992-03-25 2001-02-15 Immunogen Inc Konjugaten von Zell-bindender Mittel und Derivaten von CC-1065
US6174666B1 (en) 1992-03-27 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA
US6132419A (en) 1992-05-22 2000-10-17 Genetronics, Inc. Electroporetic gene and drug therapy
US5514545A (en) 1992-06-11 1996-05-07 Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for characterizing single cells based on RNA amplification for diagnostics and therapeutics
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
US6670178B1 (en) 1992-07-10 2003-12-30 Transkaryotic Therapies, Inc. In Vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
JPH07509365A (ja) 1992-07-31 1995-10-19 デイド・ベーリング・マルブルク・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング ポリヌクレオチド類の３’末端に特定配列を導入する方法
US5273525A (en) 1992-08-13 1993-12-28 Btx Inc. Injection and electroporation apparatus for drug and gene delivery
US5240885A (en) 1992-09-21 1993-08-31 Corning Incorporated Rare earth-doped, stabilized cadmium halide glasses
US5569189A (en) 1992-09-28 1996-10-29 Equidyne Systems, Inc. hypodermic jet injector
US5334144A (en) 1992-10-30 1994-08-02 Becton, Dickinson And Company Single use disposable needleless injector
WO1994009838A1 (en) 1992-11-04 1994-05-11 Denver Biomaterials, Inc. Apparatus for removal of pleural effusion fluid
WO1994011026A2 (en) 1992-11-13 1994-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
SG44845A1 (en) 1993-01-12 1997-12-19 Biogen Inc Recombitant anti-vla4 antibody molecules
JPH08508492A (ja) 1993-03-30 1996-09-10 スターリング ウィンスロップ インコーポレイティド 非環式ヌクレオシド類似体及びそれらを含むオリゴヌクレオチド配列
FR2703253B1 (fr) 1993-03-30 1995-06-23 Centre Nat Rech Scient Applicateur d'impulsions electriques pour traitement de tissus biologiques.
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US7135312B2 (en) 1993-04-15 2006-11-14 University Of Rochester Circular DNA vectors for synthesis of RNA and DNA
US5773244A (en) 1993-05-19 1998-06-30 Regents Of The University Of California Methods of making circular RNA
US6541498B2 (en) 1993-05-20 2003-04-01 Texas Biotechnology Benzenesulfonamides and the use thereof to modulate the activity of endothelin
US5851829A (en) 1993-07-16 1998-12-22 Dana-Farber Cancer Institute Method of intracellular binding of target molecules
US6294664B1 (en) 1993-07-29 2001-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of oligonucleotides
US5672491A (en) 1993-09-20 1997-09-30 The Leland Stanford Junior University Recombinant production of novel polyketides
US6432711B1 (en) 1993-11-03 2002-08-13 Diacrin, Inc. Embryonic stem cells capable of differentiating into desired cell lines
US6096503A (en) 1993-11-12 2000-08-01 The Scripps Research Institute Method for simultaneous identification of differentially expresses mRNAs and measurement of relative concentrations
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US7435802B2 (en) 1994-01-25 2008-10-14 Elan Pharaceuticals, Inc. Humanized anti-VLA4 immunoglobulins
US5840299A (en) 1994-01-25 1998-11-24 Athena Neurosciences, Inc. Humanized antibodies against leukocyte adhesion molecule VLA-4
DK0668350T4 (da) 1994-02-16 2009-02-23 Us Gov Health & Human Serv Melanomassocieret antigen, epitoper deraf samt vacciner mod melanom
IL112820A0 (en) 1994-03-07 1995-05-26 Merck & Co Inc Coordinate in vivo gene expression
WO1995024176A1 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Bioject, Inc. Ampule filling device
US5466220A (en) 1994-03-08 1995-11-14 Bioject, Inc. Drug vial mixing and transfer device
JP3482209B2 (ja) 1994-03-18 2003-12-22 ジェロン・コーポレーション オリゴヌクレオチドｎ３’→ｐ５’ホスホルアミデート：合成および化合物；ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ耐性特性
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US5457041A (en) 1994-03-25 1995-10-10 Science Applications International Corporation Needle array and method of introducing biological substances into living cells using the needle array
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5464395A (en) 1994-04-05 1995-11-07 Faxon; David P. Catheter for delivering therapeutic and/or diagnostic agents to the tissue surrounding a bodily passageway
US6074642A (en) 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
HU226874B1 (en) 1994-05-18 2010-01-28 Bayer Bioscience Gmbh Dna sequences coding for enzymes capable of facilitating the synthesis of linear alfa-1,4 glucans in plants, fungi and microorganisms
WO1995033835A1 (en) 1994-06-02 1995-12-14 Chiron Corporation Nucleic acid immunization using a virus-based infection/transfection system
GB9412230D0 (en) 1994-06-17 1994-08-10 Celltech Ltd Interleukin-5 specific recombiant antibodies
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
ATE306930T1 (de) 1994-08-12 2005-11-15 Immunomedics Inc Für b-zell-lymphom und leukämiezellen spezifische immunkonjugate und humane antikörper
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5665545A (en) 1994-11-28 1997-09-09 Akzo Nobel N.V. Terminal repeat amplification method
US5641665A (en) 1994-11-28 1997-06-24 Vical Incorporated Plasmids suitable for IL-2 expression
US5588960A (en) 1994-12-01 1996-12-31 Vidamed, Inc. Transurethral needle delivery device with cystoscope and method for treatment of urinary incontinence
US5807718A (en) 1994-12-02 1998-09-15 The Scripps Research Institute Enzymatic DNA molecules
WO1996021023A1 (en) 1995-01-06 1996-07-11 Centrum Voor Plantenveredelings- En Reproduktieonderzoek (Cpro - Dlo) Dna sequences encoding carbohydrate polymer synthesizing enzymes and method for producing transgenic plants
US5599302A (en) 1995-01-09 1997-02-04 Medi-Ject Corporation Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US5824497A (en) 1995-02-10 1998-10-20 Mcmaster University High efficiency translation of mRNA molecules
EP0727187B1 (en) 1995-02-15 2003-08-06 Joseph Eldor Multiple hole spinal needle
EP0735144B1 (en) 1995-03-28 2002-06-05 Japan Science and Technology Corporation Method for molecular indexing of genes using restriction enzymes
US5869230A (en) 1995-03-30 1999-02-09 Beth Israel Hospital Association Gene transfer into the kidney
US5986054A (en) 1995-04-28 1999-11-16 The Hospital For Sick Children, Hsc Research And Development Limited Partnership Genetic sequences and proteins related to alzheimer's disease
FR2733762B1 (fr) 1995-05-02 1997-08-01 Genset Sa Methode de couplage specifique de la coiffe de l'extremite 5' d'un fragment d'arnm et preparation d'arnm et d'adnc complet
US5700642A (en) 1995-05-22 1997-12-23 Sri International Oligonucleotide sizing using immobilized cleavable primers
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US6051429A (en) 1995-06-07 2000-04-18 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
US6111095A (en) 1995-06-07 2000-08-29 Merck & Co., Inc. Capped synthetic RNA, analogs, and aptamers
US5889136A (en) 1995-06-09 1999-03-30 The Regents Of The University Of Colorado Orthoester protecting groups in RNA synthesis
US5713863A (en) 1996-01-11 1998-02-03 Interventional Technologies Inc. Catheter with fluid medication injectors
US5766903A (en) 1995-08-23 1998-06-16 University Technology Corporation Circular RNA and uses thereof
US6265389B1 (en) 1995-08-31 2001-07-24 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Microencapsulation and sustained release of oligonucleotides
WO1997011085A1 (en) 1995-09-19 1997-03-27 University Of Massachusetts Inhibited biological degradation of oligodeoxynucleotides
US5830879A (en) 1995-10-02 1998-11-03 St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Treatment of vascular injury using vascular endothelial growth factor
US6265387B1 (en) 1995-10-11 2001-07-24 Mirus, Inc. Process of delivering naked DNA into a hepatocyte via bile duct
US6132988A (en) 1995-10-27 2000-10-17 Takeda Chemical Industries, Ltd. DNA encoding a neuronal cell-specific receptor protein
CU22584A1 (es) 1995-11-17 1999-11-03 Centro Inmunologia Molecular Composiciones farmacéuticas que contienen un anticuerpo monoclonal que reconoce el antígeno de diferenciación leucocitario humano cd6 y sus usos para el diagnóstico y tratamiento de la psoriasis
US6090382A (en) 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
US5962271A (en) 1996-01-03 1999-10-05 Cloutech Laboratories, Inc. Methods and compositions for generating full-length cDNA having arbitrary nucleotide sequence at the 3'-end
US5893397A (en) 1996-01-12 1999-04-13 Bioject Inc. Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus
US6261584B1 (en) 1996-02-02 2001-07-17 Alza Corporation Sustained delivery of an active agent using an implantable system
US6395292B2 (en) 1996-02-02 2002-05-28 Alza Corporation Sustained delivery of an active agent using an implantable system
AU1874397A (en) 1996-02-16 1997-09-02 Stichting Rega Vzw Hexitol containing oligonucleotides and their use in antisense strategies
US6534312B1 (en) 1996-02-22 2003-03-18 Merck & Co., Inc. Vaccines comprising synthetic genes
US6090391A (en) 1996-02-23 2000-07-18 Aviron Recombinant tryptophan mutants of influenza
US6300487B1 (en) 1996-03-19 2001-10-09 Cell Therapuetics, Inc. Mammalian lysophosphatidic acid acyltransferase
TW517061B (en) 1996-03-29 2003-01-11 Pharmacia & Amp Upjohn Ab Modified/chimeric superantigens and their use
GB9607549D0 (en) 1996-04-11 1996-06-12 Weston Medical Ltd Spring-powered dispensing device
US20030073908A1 (en) 1996-04-26 2003-04-17 2000 Injectx, Inc. Method and apparatus for delivery of genes, enzymes and biological agents to tissue cells
US5712127A (en) 1996-04-29 1998-01-27 Genescape Inc. Subtractive amplification
US5853719A (en) 1996-04-30 1998-12-29 Duke University Methods for treating cancers and pathogen infections using antigen-presenting cells loaded with RNA
US7329741B2 (en) 1996-06-05 2008-02-12 Chiron Corporation Polynucleotides that hybridize to DP-75 and their use
WO1997046680A1 (en) 1996-06-05 1997-12-11 Chiron Corporation Dna encoding dp. 75 and a process for its use
CA2258568A1 (en) 1996-06-21 1997-12-24 Merck & Co., Inc. Vaccines comprising synthetic genes
EP0925088A2 (en) 1996-06-28 1999-06-30 Sontra Medical, L.P. Ultrasound enhancement of transdermal transport
US5677124A (en) 1996-07-03 1997-10-14 Ambion, Inc. Ribonuclease resistant viral RNA standards
US5939262A (en) 1996-07-03 1999-08-17 Ambion, Inc. Ribonuclease resistant RNA preparation and utilization
US7288266B2 (en) 1996-08-19 2007-10-30 United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Liposome complexes for increased systemic delivery
US5849546A (en) 1996-09-13 1998-12-15 Epicentre Technologies Corporation Methods for using mutant RNA polymerases with reduced discrimination between non-canonical and canonical nucleoside triphosphates
US6114148C1 (en) 1996-09-20 2012-05-01 Gen Hospital Corp High level expression of proteins
ATE318915T1 (de) 1996-09-24 2006-03-15 Tanox Inc Genfamilie von apoptose-verwandten peptiden, dadurch kodierte peptide und verfahren zu deren herstellung
US6214966B1 (en) 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
EP0930893B1 (en) 1996-10-11 2005-04-13 The Regents of The University of California Immunostimulatory polynucleotide/immunomodulatory molecule conjugates
EP0839912A1 (en) 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
GB9623051D0 (en) 1996-11-06 1997-01-08 Schacht Etienne H Delivery of DNA to target cells in biological systems
US5980887A (en) 1996-11-08 1999-11-09 St. Elizabeth's Medical Center Of Boston Methods for enhancing angiogenesis with endothelial progenitor cells
US5759179A (en) 1996-12-31 1998-06-02 Johnson & Johnson Medical, Inc. Needle and valve assembly for use with a catheter
PT971946E (pt) 1997-01-21 2006-11-30 Gen Hospital Corp Selecção de proteínas utilizando fusões arn-proteína
EP0855184A1 (en) 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
US6228640B1 (en) 1997-02-07 2001-05-08 Cem Cezayirli Programmable antigen presenting cell of CD34 lineage
US6251665B1 (en) 1997-02-07 2001-06-26 Cem Cezayirli Directed maturation of stem cells and production of programmable antigen presenting dentritic cells therefrom
US6696291B2 (en) 1997-02-07 2004-02-24 Merck & Co., Inc. Synthetic HIV gag genes
ATE342916T1 (de) 1997-02-07 2006-11-15 Merck & Co Inc Synthetische hiv gag gene
US6576752B1 (en) 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6261281B1 (en) 1997-04-03 2001-07-17 Electrofect As Method for genetic immunization and introduction of molecules into skeletal muscle and immune cells
US5914269A (en) 1997-04-04 1999-06-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide inhibition of epidermal growth factor receptor expression
AU6972798A (en) 1997-04-18 1998-11-13 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Inhibition of hiv-1 replication by a tat rna-binding domain peptide analog
US5958688A (en) 1997-04-28 1999-09-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Characterization of mRNA patterns in neurites and single cells for medical diagnosis and therapeutics
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US5989911A (en) 1997-05-09 1999-11-23 University Of Massachusetts Site-specific synthesis of pseudouridine in RNA
US6761726B1 (en) 1998-05-15 2004-07-13 Pyng Medical Corp. Method and apparatus for the intraosseous introduction of a device such as an infusion tube
US5993412A (en) 1997-05-19 1999-11-30 Bioject, Inc. Injection apparatus
US6124091A (en) 1997-05-30 2000-09-26 Research Corporation Technologies, Inc. Cell growth-controlling oligonucleotides
US6589940B1 (en) 1997-06-06 2003-07-08 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
JP4101888B2 (ja) 1997-06-06 2008-06-18 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション 免疫刺激オリゴヌクレオチド、その組成物およびその使用方法
FI105309B (fi) 1997-06-24 2000-07-14 Nokia Mobile Phones Ltd Matkaviestinjärjestelmät
WO1999001579A1 (en) 1997-07-01 1999-01-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the delivery of oligonucleotides via the alimentary canal
US5994511A (en) 1997-07-02 1999-11-30 Genentech, Inc. Anti-IgE antibodies and methods of improving polypeptides
CN1275085A (zh) 1997-07-21 2000-11-29 法玛西雅和厄普约翰公司 靶细胞的定向细胞溶解、引起细胞溶解的试剂和组合物以及可用于制备这些试剂的化合物
US20030073640A1 (en) 1997-07-23 2003-04-17 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Novel compositions for the delivery of negatively charged molecules
AU8763898A (en) 1997-07-31 1999-02-22 St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Method for the treatment of grafts
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
AU752725B2 (en) 1997-09-18 2002-09-26 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Attenuated vif DNA immunization cassettes for genetic vaccines
EP1021549A2 (en) 1997-09-19 2000-07-26 Sequitur, Inc. SENSE mRNA THERAPY
US6004573A (en) 1997-10-03 1999-12-21 Macromed, Inc. Biodegradable low molecular weight triblock poly(lactide-co-glycolide) polyethylene glycol copolymers having reverse thermal gelation properties
JP2001519162A (ja) 1997-10-07 2001-10-23 ユニバーシティ・オブ・メリーランド・バイオテクノロジー・インスティチュート 動物細胞にｒｎａを導入して発現させる方法
CA2306796A1 (en) 1997-10-20 1999-04-29 Genzyme Transgenics Corporation Novel modified msp-1 nucleic acid sequences and methods for increasing mrna levels and protein expression in cell systems
US6019747A (en) 1997-10-21 2000-02-01 I-Flow Corporation Spring-actuated infusion syringe
AU1275899A (en) 1997-10-24 1999-05-17 Megabios Corporation Methods for preparing polynucleotide transfection complexes
US6077251A (en) 1997-10-30 2000-06-20 Ting; Windsor Medicinal agent administration system
JP2001521759A (ja) 1997-11-12 2001-11-13 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル，インコーポレイテッド ヒトアミロイド前駆体タンパク質遺伝子の翻訳エンハンサーエレメント
US6548633B1 (en) 1998-12-22 2003-04-15 Genset, S.A. Complementary DNA's encoding proteins with signal peptides
EP1987845B1 (en) 1997-11-20 2012-03-21 Vical Incorporated Treatment of cancer using cytokine-expressing polynucleotides and compositions therefor.
US7655777B2 (en) 1997-11-24 2010-02-02 Monsanto Technology Llc Nucleic acid molecules associated with the tocopherol pathway
US6517869B1 (en) 1997-12-12 2003-02-11 Expression Genetics, Inc. Positively charged poly(alpha-(omega-aminoalkyl)lycolic acid) for the delivery of a bioactive agent via tissue and cellular uptake
US6267987B1 (en) 1997-12-12 2001-07-31 Samyang Corporation Positively charged poly[alpha-(omega-aminoalkyl) glycolic acid] for the delivery of a bioactive agent via tissue and cellular uptake
WO1999033982A2 (en) 1997-12-23 1999-07-08 Chiron Corporation Human genes and gene expression products i
US6320017B1 (en) 1997-12-23 2001-11-20 Inex Pharmaceuticals Corp. Polyamide oligomers
US6383811B2 (en) 1997-12-30 2002-05-07 Mirus Corporation Polyampholytes for delivering polyions to a cell
CA2317549C (en) 1998-01-05 2006-04-11 University Of Washington Composition for enhancing transport through lipid-containing membranes, and uses thereof
AU740999B2 (en) 1998-01-08 2001-11-22 Sontra Medical, Inc. Sonophoretic enhanced transdermal transport
IT1298087B1 (it) 1998-01-08 1999-12-20 Fiderm S R L Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni
US8287483B2 (en) 1998-01-08 2012-10-16 Echo Therapeutics, Inc. Method and apparatus for enhancement of transdermal transport
US6365346B1 (en) 1998-02-18 2002-04-02 Dade Behring Inc. Quantitative determination of nucleic acid amplification products
US5955310A (en) 1998-02-26 1999-09-21 Novo Nordisk Biotech, Inc. Methods for producing a polypeptide in a bacillus cell
US6432925B1 (en) 1998-04-16 2002-08-13 John Wayne Cancer Institute RNA cancer vaccine and methods for its use
US6429301B1 (en) 1998-04-17 2002-08-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Use of a ribozyme to join nucleic acids and peptides
GB9808327D0 (en) 1998-04-20 1998-06-17 Chiron Spa Antidiotypic compounds
US6395253B2 (en) 1998-04-23 2002-05-28 The Regents Of The University Of Michigan Microspheres containing condensed polyanionic bioactive agents and methods for their production
US7521178B1 (en) 1998-04-23 2009-04-21 Takara Bio Inc. Method for synthesizing DNA
US20020064517A1 (en) 1998-04-30 2002-05-30 Stewart A. Cederholm-Williams Fibrin sealant as a transfection/transformation vehicle for gene therapy
US20090208418A1 (en) 2005-04-29 2009-08-20 Innexus Biotechnology Internaltional Ltd. Superantibody synthesis and use in detection, prevention and treatment of disease
US6177274B1 (en) 1998-05-20 2001-01-23 Expression Genetics, Inc. Hepatocyte targeting polyethylene glyco-grafted poly-L-lysine polymeric gene carrier
US6503231B1 (en) 1998-06-10 2003-01-07 Georgia Tech Research Corporation Microneedle device for transport of molecules across tissue
US7091192B1 (en) 1998-07-01 2006-08-15 California Institute Of Technology Linear cyclodextrin copolymers
MXPA01000271A (es) 1998-07-13 2002-10-17 Expression Genetics Inc Analogo de poliester de poli-lisina como un portador para el suministro de genes, soluble, biodegradable.
US6222030B1 (en) 1998-08-03 2001-04-24 Agilent Technologies, Inc. Solid phase synthesis of oligonucleotides using carbonate protecting groups and alpha-effect nucleophile deprotection
CN101695574A (zh) 1998-08-11 2010-04-21 拜奥根Idec公司 包括施用抗-cd20抗体的b-细胞淋巴瘤联合疗法
GB9817662D0 (en) 1998-08-13 1998-10-07 Crocker Peter J Substance delivery
US6924365B1 (en) 1998-09-29 2005-08-02 Transkaryotic Therapies, Inc. Optimized messenger RNA
US20090148906A1 (en) 1998-09-29 2009-06-11 Shire Human Genetic Therapies, Inc. A Delaware Corporation Optimized messenger rna
CA2348779A1 (en) 1998-11-03 2000-05-11 Yale University Multidomain polynucleotide molecular sensors
CN1679934B (zh) 1998-11-09 2012-09-05 生物基因Idec公司 使用抗cd20嵌合抗体治疗循环肿瘤细胞相关的血液恶性肿瘤
KR20010099788A (ko) 1998-11-09 2001-11-09 케네쓰 제이. 울코트 Ｂｍｔ 또는 ｐｂｓｃ 이식을 받은 환자의 키메라항-ｃｄ２０ 항체 치료법
WO2000027340A2 (en) 1998-11-12 2000-05-18 The Children's Medical Center Corporation USE OF t-RNA AND FRAGMENTS FOR INHIBITING ANGIOGENESIS AND COMPOSITIONS THEREOF
US6210931B1 (en) 1998-11-30 2001-04-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Ribozyme-mediated synthesis of circular RNA
US20040171980A1 (en) 1998-12-18 2004-09-02 Sontra Medical, Inc. Method and apparatus for enhancement of transdermal transport
EP1141376A4 (en) 1998-12-23 2002-03-13 Human Genome Sciences PEPTIDOGLYCANE RECOGNITION PROTEINS
CA2364921A1 (en) 1999-02-22 2000-08-31 European Molecular Biology Laboratory Translation system
US6255476B1 (en) 1999-02-22 2001-07-03 Pe Corporation (Ny) Methods and compositions for synthesis of labelled oligonucleotides and analogs on solid-supports
US7629311B2 (en) 1999-02-24 2009-12-08 Edward Lewis Tobinick Methods to facilitate transmission of large molecules across the blood-brain, blood-eye, and blood-nerve barriers
CA2689696C (en) 1999-02-26 2013-08-06 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Microemulsions with adsorbed macromolecules and microparticles
EP1818017A3 (en) 1999-03-01 2007-08-29 Cytyc Corporation Apparatus and kits for simultaneous delivery of a substance to multiple breast milk ducts
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
WO2000029561A2 (en) 1999-03-29 2000-05-25 Statens Serum Institut Nucleotide construct with optimised codons for an hiv genetic vaccine based on a primary, early hiv isolate and synthetic envelope
EP1985639B1 (en) 1999-04-09 2013-08-14 Life Technologies AS Process for the preparation of monodisperse polymer particles
NZ514348A (en) 1999-05-04 2004-05-28 Exiqon As L-ribo-LNA analogues
KR20020011985A (ko) 1999-05-07 2002-02-09 파르마솔 게엠베하 액상 및 고체상 지질 혼합물에 기초한 지질입자들 및 그의제조방법
WO2000067796A1 (en) 1999-05-07 2000-11-16 Genentech, Inc. Treatment of autoimmune diseases with antagonists which bind to b cell surface markers
US7171264B1 (en) 1999-05-10 2007-01-30 Genetronics, Inc. Intradermal delivery of active agents by needle-free injection and electroporation
US6346382B1 (en) 1999-06-01 2002-02-12 Vanderbilt University Human carbamyl phosphate synthetase I polymorphism and diagnostic methods related thereto
US6611707B1 (en) 1999-06-04 2003-08-26 Georgia Tech Research Corporation Microneedle drug delivery device
WO2000075356A1 (en) 1999-06-04 2000-12-14 Lin Shi Lung Rna polymerase chain reaction
US6743211B1 (en) 1999-11-23 2004-06-01 Georgia Tech Research Corporation Devices and methods for enhanced microneedle penetration of biological barriers
US6303573B1 (en) 1999-06-07 2001-10-16 The Burnham Institute Heart homing peptides and methods of using same
AU776268B2 (en) 1999-06-08 2004-09-02 Aventis Pasteur Immunostimulant oligonucleotide
EP1194167B1 (en) 1999-06-09 2009-08-19 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of autoimmune disorders using antibodies which target b-cells
US6949245B1 (en) 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
EP1196426A4 (en) 1999-06-30 2003-09-03 Advanced Cell Tech Inc CYTOPLASMIC TRANSFER TO REDUCE DIFFERENTIATION OF RECEIVED CELLS
US6514948B1 (en) 1999-07-02 2003-02-04 The Regents Of The University Of California Method for enhancing an immune response
CA2378653A1 (en) 1999-07-09 2001-01-18 American Home Products Corporation Methods and compositions for preventing the formation of aberrant rna during transcription of a plasmid sequence
CA2311201A1 (en) 1999-08-05 2001-02-05 Genset S.A. Ests and encoded human proteins
US8557244B1 (en) 1999-08-11 2013-10-15 Biogen Idec Inc. Treatment of aggressive non-Hodgkins lymphoma with anti-CD20 antibody
KR20020047132A (ko) 1999-08-24 2002-06-21 메다렉스, 인코포레이티드 인간 씨티엘에이-4 항체 및 그의 용도
US20050112141A1 (en) 2000-08-30 2005-05-26 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
US6551338B1 (en) 1999-09-01 2003-04-22 Mcgill University Method and device for myogenesis and angiogenesis of the heart
US20040106567A1 (en) 1999-09-07 2004-06-03 Hagstrom James E. Intravascular delivery of non-viral nucleic acid
EP1818409A1 (en) 1999-09-09 2007-08-15 CureVac GmbH Transfer of mRNAusing polycationic compounds
WO2001021810A1 (en) 1999-09-17 2001-03-29 Aventis Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof
US6623457B1 (en) 1999-09-22 2003-09-23 Becton, Dickinson And Company Method and apparatus for the transdermal administration of a substance
WO2002064799A2 (en) 1999-09-28 2002-08-22 Transkaryotic Therapies, Inc. Optimized messenger rna
AU7863200A (en) 1999-10-06 2001-05-10 Quark Biotech, Inc. Method for enrichment of natural antisense messenger rna
US7060291B1 (en) 1999-11-24 2006-06-13 Transave, Inc. Modular targeted liposomal delivery system
US6613026B1 (en) 1999-12-08 2003-09-02 Scimed Life Systems, Inc. Lateral needle-less injection apparatus and method
US6277974B1 (en) 1999-12-14 2001-08-21 Cogent Neuroscience, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating conditions, disorders, or diseases involving cell death
US6245929B1 (en) 1999-12-20 2001-06-12 General Electric Company Catalyst composition and method for producing diaryl carbonates, using bisphosphines
WO2001046272A1 (en) 1999-12-22 2001-06-28 Basell Technology Company B.V. Alpha-olefin polymerization catalyst system which contains an aromatic silane compound
SE515932C2 (sv) 1999-12-23 2001-10-29 Prostalund Operations Ab Sätt och anordning vid behandling av prostata
WO2001051092A2 (en) 2000-01-07 2001-07-19 University Of Washington Enhanced transport of agents using membrane disruptive agents
AU2001232485A1 (en) 2000-01-13 2001-07-24 Amsterdam Support Diagnostics B.V. A universal nucleic acid amplification system for nucleic acids in a sample
US7468275B2 (en) 2000-01-28 2008-12-23 The Scripps Research Institute Synthetic internal ribosome entry sites and methods of identifying same
US7183395B2 (en) 2000-01-28 2007-02-27 The Scripps Research Institute Methods of identifying synthetic transcriptional and translational regulatory elements, and compositions relating to same
CA2398756A1 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Eyal Raz Immunomodulatory polynucleotides in treatment of an infection by an intracellular pathogen
WO2001055306A2 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US6602498B2 (en) 2000-02-22 2003-08-05 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
PT1481992T (pt) 2000-02-24 2017-01-02 Lilly Co Eli Anticorpos humanizados que sequestram péptido beta-amiloide
CA2401327C (en) 2000-03-03 2014-05-06 Valentis, Inc. Nucleic acid formulations comprising poly-amino acids for gene delivery and methods of use
US20020081597A1 (en) 2000-03-31 2002-06-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for detecting and quantifying gene expression
CN1441677A (zh) 2000-03-31 2003-09-10 Idec药物公司 抗细胞因子抗体或拮抗剂与抗－cd20在b细胞淋巴瘤治疗中的联合应用
US6565572B2 (en) 2000-04-10 2003-05-20 Sdgi Holdings, Inc. Fenestrated surgical screw and method
US6368801B1 (en) 2000-04-12 2002-04-09 Molecular Staging, Inc. Detection and amplification of RNA using target-mediated ligation of DNA by RNA ligase
WO2001079442A2 (en) 2000-04-12 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20010046496A1 (en) 2000-04-14 2001-11-29 Brettman Lee R. Method of administering an antibody
US6468247B1 (en) 2000-04-21 2002-10-22 Mark Zamoyski Perfusion device for localized drug delivery
US6375972B1 (en) 2000-04-26 2002-04-23 Control Delivery Systems, Inc. Sustained release drug delivery devices, methods of use, and methods of manufacturing thereof
US7871598B1 (en) 2000-05-10 2011-01-18 Novartis Ag Stable metal ion-lipid powdered pharmaceutical compositions for drug delivery and methods of use
US20040229271A1 (en) 2000-05-19 2004-11-18 Williams Richard B. Compositions and methods for the identification and selection of nucleic acids and polypeptides
WO2001092523A2 (en) 2000-05-30 2001-12-06 Curagen Corporation Human polynucleotides and polypeptides encoded thereby
US6537242B1 (en) 2000-06-06 2003-03-25 Becton, Dickinson And Company Method and apparatus for enhancing penetration of a member for the intradermal sampling or administration of a substance
CA2412026A1 (en) 2000-06-07 2001-12-13 Biosynexus Incorporated Immunostimulatory rna/dna hybrid molecules
US6607513B1 (en) 2000-06-08 2003-08-19 Becton, Dickinson And Company Device for withdrawing or administering a substance and method of manufacturing a device
JP2004513616A (ja) 2000-06-23 2004-05-13 ワイス・ホールディングズ・コーポレイション 改変モルビリウイルスタンパク質
US20050181033A1 (en) 2000-06-29 2005-08-18 Dekker John P.Iii Method for delivering interferons to the intradermal compartment
EP1297005B1 (en) 2000-07-03 2009-08-26 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Immunisation against chlamydia pneumoniae
US6440096B1 (en) 2000-07-14 2002-08-27 Becton, Dickinson And Co. Microdevice and method of manufacturing a microdevice
AU7569501A (en) 2000-07-21 2002-02-05 Glaxo Group Ltd Codon-optimized papilloma virus sequences
US6902734B2 (en) 2000-08-07 2005-06-07 Centocor, Inc. Anti-IL-12 antibodies and compositions thereof
US20040142474A1 (en) 2000-09-14 2004-07-22 Expression Genetics, Inc. Novel cationic lipopolymer as a biocompatible gene delivery agent
US6696038B1 (en) 2000-09-14 2004-02-24 Expression Genetics, Inc. Cationic lipopolymer as biocompatible gene delivery agent
WO2002024873A1 (en) 2000-09-20 2002-03-28 Christopher Ralph Franks Stem cell therapy
DK1334109T3 (da) 2000-10-04 2006-10-09 Santaris Pharma As Forbedret syntese af purin-blokerede nukleinsyre-analoger
WO2002028165A2 (en) 2000-10-04 2002-04-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods of using capsid protein from flaviviruses and pestiviruses
US6998115B2 (en) 2000-10-10 2006-02-14 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
US7202226B2 (en) 2000-10-23 2007-04-10 Detroit R & D Augmentation of wound healing by elF-4E mRNA and EGF mRNA
US20030077604A1 (en) 2000-10-27 2003-04-24 Yongming Sun Compositions and methods relating to breast specific genes and proteins
US20020132788A1 (en) 2000-11-06 2002-09-19 David Lewis Inhibition of gene expression by delivery of small interfering RNA to post-embryonic animal cells in vivo
WO2002040545A2 (en) 2000-11-17 2002-05-23 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Reduction of the nonspecific animal toxicity of immunotoxins by mutating the framework regions of the fv to lower the isoelectric point
EP2336368A1 (en) 2000-12-07 2011-06-22 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Endogenous retroviruses up-regulated in prostate cancer
US7708915B2 (en) 2004-05-06 2010-05-04 Castor Trevor P Polymer microspheres/nanospheres and encapsulating therapeutic proteins therein
US20020130430A1 (en) 2000-12-29 2002-09-19 Castor Trevor Percival Methods for making polymer microspheres/nanospheres and encapsulating therapeutic proteins and other products
US7628780B2 (en) 2001-01-13 2009-12-08 Medtronic, Inc. Devices and methods for interstitial injection of biologic agents into tissue
EP1224943A1 (en) 2001-01-19 2002-07-24 Crucell Holland B.V. Fibronectin as a tumor marker detected by phage antibodies
IL157003A0 (en) 2001-01-19 2004-02-08 Vironovative Bv A virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
US20040110191A1 (en) 2001-01-31 2004-06-10 Winkler Matthew M. Comparative analysis of nucleic acids using population tagging
US20030186237A1 (en) 2001-02-14 2003-10-02 Baylor College Of Medicine Methods and compositions of amplifying RNA
US6652886B2 (en) 2001-02-16 2003-11-25 Expression Genetics Biodegradable cationic copolymers of poly (alkylenimine) and poly (ethylene glycol) for the delivery of bioactive agents
DE10109897A1 (de) 2001-02-21 2002-11-07 Novosom Ag Fakultativ kationische Liposomen und Verwendung dieser
US7232425B2 (en) 2001-03-02 2007-06-19 Sorenson Development, Inc. Apparatus and method for specific interstitial or subcutaneous diffusion and dispersion of medication
EP1373528B1 (en) 2001-03-09 2008-08-13 Gene Stream Pty Ltd. Novel expression vectors
JP2002262882A (ja) 2001-03-12 2002-09-17 Nisshinbo Ind Inc Ｒｎａの増幅法
FR2822164B1 (fr) 2001-03-19 2004-06-18 Centre Nat Rech Scient Polypeptides derives des arn polymerases, et leurs utilisations
US6520949B2 (en) 2001-04-02 2003-02-18 Martin St. Germain Method and apparatus for administering fluid to animals subcutaneously
US6625486B2 (en) 2001-04-11 2003-09-23 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Method and apparatus for intracellular delivery of an agent
DE10119005A1 (de) 2001-04-18 2002-10-24 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Proteinexpression ausgehend von stabilisierter linearer kurzer DNA in zellfreien in vitro-Transkription/Translations-Systemen mit Exonuklease-haltigen Lysaten oder in einem zellulären System enthaltend Exonukleasen
US20030171253A1 (en) 2001-04-19 2003-09-11 Averil Ma Methods and compositions relating to modulation of A20
DE50201240D1 (de) 2001-04-23 2004-11-11 Amaxa Gmbh Pufferlössung für die elektroporation und verfahren umfassend die verwendung derselben
US7560424B2 (en) 2001-04-30 2009-07-14 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
US6777187B2 (en) 2001-05-02 2004-08-17 Rubicon Genomics, Inc. Genome walking by selective amplification of nick-translate DNA library and amplification from complex mixtures of templates
US6527216B2 (en) 2001-05-08 2003-03-04 Magnatech International Llp Electronic length control wire pay-off system and method
US20050137155A1 (en) 2001-05-18 2005-06-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated treatment of Parkinson disease using short interfering nucleic acid (siNA)
US7514099B2 (en) 2005-02-14 2009-04-07 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
US8137911B2 (en) 2001-05-22 2012-03-20 Cellscript, Inc. Preparation and use of single-stranded transcription substrates for synthesis of transcription products corresponding to target sequences
JP4323949B2 (ja) 2001-05-30 2009-09-02 ザ・スクリプス・リサーチ・インステイチユート 核酸用送達系
ES2240745T3 (es) * 2001-06-05 2005-10-16 Curevac Gmbh Composicion farmaceutica que contiene un arnm estabilizado y optimizado para la traduccion, adecuada como vacuna y como regenerante de tejidos.
WO2002102839A2 (en) 2001-06-18 2002-12-27 Novartis Ag Novel g-protein coupled receptors and dna sequences thereof
US7785610B2 (en) 2001-06-21 2010-08-31 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same—III
US7547551B2 (en) 2001-06-21 2009-06-16 University Of Antwerp. Transfection of eukaryontic cells with linear polynucleotides by electroporation
AU2002352554A1 (en) 2001-06-26 2003-03-03 Novartis Ag G protein coupled receptors and dna sequences thereof
SE0102327D0 (sv) 2001-06-28 2001-06-28 Active Biotech Ab A novel engineered superantigen for human therapy
EP1416986A4 (en) 2001-06-29 2005-12-14 Becton Dickinson Co INTRADERMIC DISTRIBUTION OF VACCINES AND GENE THERAPEUTIC AGENTS VIA MICROCANNULE
WO2003029401A2 (en) 2001-07-13 2003-04-10 Advanced Research And Technology Institute Peptidoglycan recognition protein encoding nucleic acids and methods of use thereof
US6586524B2 (en) 2001-07-19 2003-07-01 Expression Genetics, Inc. Cellular targeting poly(ethylene glycol)-grafted polymeric gene carrier
JP2004536614A (ja) 2001-08-01 2004-12-09 ユニバーシティ オブ ユタ Ｐｄｅ３環状ヌクレオチド・ホスホジエステラーゼのアイソフォーム選択的な阻害剤および活性化剤
US20050106659A1 (en) 2001-08-27 2005-05-19 Klemens Kaupmann Novel g-protein coupled receptor and dna sequences thereof
US20040142325A1 (en) 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
AU2002347035B2 (en) 2001-09-28 2008-04-03 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V Micro-RNA molecules
AR045702A1 (es) 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp Composiciones de adyuvantes.
DE10148886A1 (de) 2001-10-04 2003-04-30 Avontec Gmbh Inhibition von STAT-1
US7276489B2 (en) 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
US7429258B2 (en) 2001-10-26 2008-09-30 Massachusetts Institute Of Technology Microneedle transport device
US7384739B2 (en) 2001-11-14 2008-06-10 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Compositions for enhancing DNA synthesis, DNA polymerase-related factors and utilization thereof
AU2002361642A1 (en) 2001-11-16 2003-06-10 The University Of Tennessee Research Corporation Recombinant antibody fusion proteins and methods for detection of apoptotic cells
US20050032062A1 (en) 2001-11-29 2005-02-10 Salah-Dine Chibout Methods for the assessment and prognosis of sarcoidosis
CA2409775C (en) 2001-12-03 2010-07-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Reversibly modified thermostable enzymes for dna synthesis and amplification in vitro
AU2002368276A1 (en) 2001-12-07 2004-05-13 Chiron Corporation Endogenous retrovirus up-regulated in prostate cancer
EP1521594B1 (en) 2001-12-07 2013-10-02 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Endogenous retrovirus polypeptides linked to oncogenic transformation
US20060275747A1 (en) 2001-12-07 2006-12-07 Hardy Stephen F Endogenous retrovirus up-regulated in prostate cancer
WO2003051923A2 (en) 2001-12-17 2003-06-26 Novartis Ag Novel g-protein coupled receptors and dna sequences thereof
DE10162480A1 (de) 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
DK1474109T3 (da) 2001-12-21 2010-10-25 Alcon Inc Anvendelse af syntetiske uorganiske nanopartikler som bærere af ophthalmiske lægemidler
WO2003059381A2 (en) 2002-01-18 2003-07-24 Curevac Gmbh Immunogenic preparations and vaccines on the basis of mrna
WO2003066649A1 (en) 2002-02-04 2003-08-14 Biomira Inc. Immunostimulatory, covalently lipidated oligonucleotides
US6870034B2 (en) 2002-02-05 2005-03-22 Genentech, Inc. Protein purification
FR2835749B1 (fr) 2002-02-08 2006-04-14 Inst Nat Sante Rech Med Composition pharmaceutique ameliorant le transfert de gene in vivo
DE10207178A1 (de) 2002-02-19 2003-09-04 Novosom Ag Komponenten für die Herstellung amphoterer Liposomen
US20050222064A1 (en) 2002-02-20 2005-10-06 Sirna Therapeutics, Inc. Polycationic compositions for cellular delivery of polynucleotides
AR038568A1 (es) 2002-02-20 2005-01-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-a beta y su uso
US7354742B2 (en) 2002-02-22 2008-04-08 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Method for generating amplified RNA
AU2003267943C1 (en) 2002-02-26 2009-05-21 Altravax, Inc. Novel flavivirus antigens
AU2003213687A1 (en) 2002-03-04 2003-09-22 Imclone Systems Incorporated Human antibodies specific to kdr and uses thereof
JP4679822B2 (ja) 2002-03-13 2011-05-11 ノバルティス アーゲー 医薬微粒子
US7074596B2 (en) 2002-03-25 2006-07-11 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Synthesis and use of anti-reverse mRNA cap analogues
JP4846200B2 (ja) 2002-04-04 2011-12-28 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー 免疫賦活性ｇ、ｕ含有オリゴリボヌクレオチド
EP1497327A2 (en) 2002-04-17 2005-01-19 Novartis AG Method for the identification of inhibitors of the binding of are-containing mrna and an hur protein
GB0209539D0 (en) 2002-04-26 2002-06-05 Avecia Ltd Monomer Polymer and process
EP1361277A1 (en) 2002-04-30 2003-11-12 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Optimization of transgene expression in mammalian cells
WO2003092623A2 (en) 2002-05-02 2003-11-13 Wyeth Holdings Corporation Calicheamicin derivative-carrier conjugates
EP3375463A1 (en) 2002-05-06 2018-09-19 Becton, Dickinson and Company Method and device for controlling drug pharmacokinetics
AU2003237824B9 (en) 2002-05-08 2008-06-19 The Regents Of The University Of California System and method for treating cardiac arrhythmias with fibroblast cells
US7374930B2 (en) 2002-05-21 2008-05-20 Expression Genetics, Inc. GLP-1 gene delivery for the treatment of type 2 diabetes
US20040018525A1 (en) 2002-05-21 2004-01-29 Bayer Aktiengesellschaft Methods and compositions for the prediction, diagnosis, prognosis, prevention and treatment of malignant neoplasma
DE10224200C1 (de) 2002-05-31 2003-08-21 Artus Ges Fuer Molekularbiolog Vermehrung von Ribonukleinsäuren
US7198899B2 (en) 2002-06-03 2007-04-03 Chiron Corporation Use of NRG4, or inhibitors thereof, in the treatment of colon and pancreatic cancers
SE0201907D0 (sv) 2002-06-19 2002-06-19 Atos Medical Ab Plaster for tracheostoma valves
EP1519714B1 (en) 2002-06-28 2010-10-20 Protiva Biotherapeutics Inc. Method and apparatus for producing liposomes
PL374580A1 (en) 2002-07-01 2005-10-31 The Kenneth S.Warren Institute, Inc. Recombinant tissue protective cytokines and encoding nucleic acids thereof for protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues, and organs
DE10229872A1 (de) 2002-07-03 2004-01-29 Curevac Gmbh Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA
GB0215509D0 (en) 2002-07-04 2002-08-14 Novartis Ag Marker genes
US20040009180A1 (en) 2002-07-11 2004-01-15 Allergan, Inc. Transdermal botulinum toxin compositions
WO2004007678A2 (en) 2002-07-16 2004-01-22 Advisys, Inc. Codon optimized synthetic plasmids
AU2003252136A1 (en) 2002-07-24 2004-02-09 Ptc Therapeutics, Inc. METHODS FOR IDENTIFYING SMALL MOLEDULES THAT MODULATE PREMATURE TRANSLATION TERMINATION AND NONSENSE MEDIATED mRNA DECAY
EP1393745A1 (en) 2002-07-29 2004-03-03 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5'ends
US6653468B1 (en) 2002-07-31 2003-11-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Universal support media for synthesis of oligomeric compounds
EP1386925A1 (en) 2002-07-31 2004-02-04 Girindus AG Method for preparing oligonucleotides
DE60311268T2 (de) 2002-08-01 2007-12-27 Abbott Laboratories Vascular Enterprises Ltd. Gerät zum abdichten von Punkturwunden durch Reduktion des Punkturumfangs
EP1873180B1 (en) 2002-08-14 2014-05-07 Novartis AG Ophthalmic device made from a radiation-curable prepolymer
CA2497086A1 (en) 2002-08-30 2004-03-11 Becton, Dickinson And Company Method of controlling pharmacokinetics of immunomodulatory compounds
AU2003278764C1 (en) 2002-09-06 2010-09-16 Cerulean Pharma Inc. Cyclodextrin-based polymers for therapeutic delivery
ATE412684T1 (de) 2002-09-09 2008-11-15 Nektar Therapeutics Al Corp Verfahren zur herstellung von wasserlöslichen polymerderivaten mit terminalen carboxylgruppen
US7534872B2 (en) 2002-09-27 2009-05-19 Syngen, Inc. Compositions and methods for the use of FMOC derivatives in DNA/RNA synthesis
LT3284753T (lt) 2002-10-17 2020-06-10 Genmab A/S Žmogaus monokloniniai antikūnai prieš cd20, skirti naudoti gydant išsėtinę sklerozę
DE60335490D1 (de) 2002-10-22 2011-02-03 Eisai R&D Man Co Ltd Spezifisch in postmitotischen dopamin-produzierenden neuronalen vorläuferzellen exprimiertes gen
US6896666B2 (en) 2002-11-08 2005-05-24 Kochamba Family Trust Cutaneous injection delivery under suction
AU2003294447A1 (en) 2002-11-21 2004-06-18 Epicentre Technologies Preparation and use of single-stranded transcription substrates for synthesis of transcription products corresponding to target sequences
US7491234B2 (en) 2002-12-03 2009-02-17 Boston Scientific Scimed, Inc. Medical devices for delivery of therapeutic agents
AU2003288467A1 (en) 2002-12-13 2004-07-09 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
PL212899B1 (pl) 2002-12-16 2012-12-31 Genentech Inc Humanizowane przeciwcialo, kompozycja zawierajaca to przeciwcialo, wyrób fabryczny, przeciwcialo lub jego fragment do zastosowania w sposobie indukowania apoptozy, izolowany kwas nukleinowy, wektor ekspresji, komórka gospodarza, sposób wytwarzania przeciwciala lub jego fragmentu, plynny preparat i zastosowanie przeciwciala do wytwarzania leku
US7625872B2 (en) 2002-12-23 2009-12-01 Dynavax Technologies Corporation Branched immunomodulatory compounds and methods of using the same
US7169892B2 (en) 2003-01-10 2007-01-30 Astellas Pharma Inc. Lipid-peptide-polymer conjugates for long blood circulation and tumor specific drug delivery systems
US20080227085A1 (en) 2003-01-17 2008-09-18 Pellegrini Matthew C Methods and Systems for the Identification of Rna Regulatory Sequences and Compounds that Modulate their Function
CA2514184C (en) 2003-01-21 2016-04-12 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for identifying compounds that modulate untranslated region-dependent gene expression and methods of using same
US8426194B2 (en) 2003-01-21 2013-04-23 Ptc Therapeutics, Inc. Methods and agents for screening for compounds capable of modulating VEGF expression
US9068234B2 (en) 2003-01-21 2015-06-30 Ptc Therapeutics, Inc. Methods and agents for screening for compounds capable of modulating gene expression
US20040147027A1 (en) 2003-01-28 2004-07-29 Troy Carol M. Complex for facilitating delivery of dsRNA into a cell and uses thereof
CN1768139A (zh) 2003-02-10 2006-05-03 独立行政法人产业技术总合研究所 通过dna干扰调控基因的表达
RU2358763C2 (ru) 2003-02-10 2009-06-20 Элан Фармасьютикалз, Инк. Композиции иммуноглобулина и способ их получения
US20040167090A1 (en) 2003-02-21 2004-08-26 Monahan Sean D. Covalent modification of RNA for in vitro and in vivo delivery
CA2450289A1 (en) 2003-03-20 2005-05-19 Imclone Systems Incorporated Method of producing an antibody to epidermal growth factor receptor
US7320961B2 (en) 2003-03-24 2008-01-22 Abbott Laboratories Method for treating a disease, disorder or adverse effect caused by an elevated serum concentration of an UGT1A1 substrate
EP1616033B1 (en) 2003-03-25 2010-03-03 Stratagene California Dna polymerase fusions and uses thereof
CA2522213A1 (en) 2003-04-08 2004-10-28 Dante J. Marciani Semi-synthetic saponin analogs with carrier and immune stimulatory activities for dna and rna vaccines
WO2004091657A2 (en) 2003-04-09 2004-10-28 Genentech, Inc. Therapy of autoimmune disease in a patient with an inadequate response to a tnf-alpha inhibitor
EP1620140B1 (en) 2003-05-05 2013-10-09 Ben-Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Injectable cross-linked polymeric preparations and uses thereof
US20050147618A1 (en) 2003-05-06 2005-07-07 Rivera Daniel S. Clotting factor-Fc chimeric proteins to treat hemophilia
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20040226556A1 (en) 2003-05-13 2004-11-18 Deem Mark E. Apparatus for treating asthma using neurotoxin
US9567591B2 (en) 2003-05-15 2017-02-14 Mello Biotechnology, Inc. Generation of human embryonic stem-like cells using intronic RNA
GB0313132D0 (en) 2003-06-06 2003-07-09 Ich Productions Ltd Peptide ligands
EP1636385A4 (en) 2003-06-24 2010-06-02 Mirus Bio Corp INHIBITION OF GENE FUNCTION BY IN VIVO DISTRIBUTION OF GENE EXPRESSION INHIBITORS BASED ON POLYNUCLEOTIDES IN MAMMALIAN CELLS
GB0316089D0 (en) 2003-07-09 2003-08-13 Xo Bioscience Ltd Differentiation method
US8592197B2 (en) 2003-07-11 2013-11-26 Novavax, Inc. Functional influenza virus-like particles (VLPs)
US7575572B2 (en) 2003-07-15 2009-08-18 Spinal Generations, Llc Method and device for delivering medicine to bone
US20050013870A1 (en) 2003-07-17 2005-01-20 Toby Freyman Decellularized extracellular matrix of conditioned body tissues and uses thereof
MXPA06000508A (es) 2003-07-18 2006-04-05 Amgen Inc Agentes de union especifica al factor del crecimiento de los hepatocitos.
WO2005013901A2 (en) 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
DE10335833A1 (de) 2003-08-05 2005-03-03 Curevac Gmbh Transfektion von Blutzellen mit mRNA zur Immunstimulation und Gentherapie
US8668926B1 (en) 2003-09-15 2014-03-11 Shaker A. Mousa Nanoparticle and polymer formulations for thyroid hormone analogs, antagonists, and formulations thereof
US7135010B2 (en) 2003-09-30 2006-11-14 Damage Control Surgical Technologies, Inc. Method and apparatus for rapid deployment chest drainage
MXPA06003828A (es) 2003-10-06 2006-06-14 Novartis Ag Uso de polimorfismos geneticos que se asocian con la eficacia del tratamiento de enfermedad inflamatoria.
DE10347710B4 (de) 2003-10-14 2006-03-30 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Rekombinante Impfstoffe und deren Verwendung
US20050130201A1 (en) 2003-10-14 2005-06-16 Dharmacon, Inc. Splint-assisted enzymatic synthesis of polyribounucleotides
HUE031632T2 (en) 2003-11-05 2017-07-28 Roche Glycart Ag Antigen binding molecules with enhanced Fc receptor binding affinity and effector function
WO2005047536A2 (en) 2003-11-13 2005-05-26 Novartis Ag Detection of genomic amplification and deletion in cancer
US7998119B2 (en) 2003-11-18 2011-08-16 Nano Pass Technologies Ltd. System and method for delivering fluid into flexible biological barrier
US20070054278A1 (en) 2003-11-18 2007-03-08 Applera Corporation Polymorphisms in nucleic acid molecules encoding human enzyme proteins, methods of detection and uses thereof
US7699852B2 (en) 2003-11-19 2010-04-20 Zimmer Spine, Inc. Fenestrated bone tap and method
US8304183B2 (en) 2005-11-30 2012-11-06 Cellscript, Inc. Selective terminal tagging of nucleic acids
US20050153333A1 (en) 2003-12-02 2005-07-14 Sooknanan Roy R. Selective terminal tagging of nucleic acids
EP1691746B1 (en) 2003-12-08 2015-05-27 Gel-Del Technologies, Inc. Mucoadhesive drug delivery devices and methods of making and using thereof
US7674884B2 (en) 2003-12-10 2010-03-09 Novimmune S.A. Neutralizing antibodies and methods of use thereof
US8034619B2 (en) 2003-12-19 2011-10-11 University Of Cincinnati Polyamides for nucleic acid delivery
CN104013957B (zh) 2003-12-23 2016-06-29 泰勒公司 用新的抗il13单克隆抗体治疗癌症
US7150726B2 (en) 2004-01-23 2006-12-19 Norfolk Medical Device for subcutaneous infusion of fluids
US8957034B2 (en) 2004-01-28 2015-02-17 Johns Hopkins University Drugs and gene carrier particles that rapidly move through mucous barriers
ATE440949T1 (de) 2004-01-30 2009-09-15 Maxygen Holdings Ltd Gesteuertes überlesen von stopcodons
US7309487B2 (en) 2004-02-09 2007-12-18 George Inana Methods and compositions for detecting and treating retinal diseases
EP2316857A1 (en) 2004-02-12 2011-05-04 Morphotek, Inc. Monoclonal antibodies that specifically bind to folate receptor alpha
US20070265220A1 (en) 2004-03-15 2007-11-15 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA
EP3269738A1 (en) 2004-03-24 2018-01-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Subtypes of humanized antibody against interleukin-6 receptor
WO2005098433A2 (en) 2004-04-01 2005-10-20 Novartis Ag Diagnostic assays for alzheimer’s disease
BRPI0509806A (pt) 2004-04-12 2007-09-18 Allergan Inc sistema de injeção em múltiplos locais
EP1740946B1 (en) 2004-04-20 2013-11-06 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd20
ES2246694B1 (es) 2004-04-29 2007-05-01 Instituto Cientifico Y Tecnologico De Navarra, S.A. Nanoparticulas pegiladas.
WO2005108411A2 (en) 2004-05-05 2005-11-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted pixyl protecting groups for oligonucleotide synthesis
JP2007537284A (ja) 2004-05-12 2007-12-20 バクスター インターナショナル インコーポレイテッド 核酸マイクロスフェア、その生成および送達
US20080103053A1 (en) 2005-11-22 2008-05-01 Helicos Biosciences Corporation Methods and compositions for sequencing a nucleic acid
US8012747B2 (en) 2004-06-01 2011-09-06 San Diego State University Foundation Expression system
WO2005120152A2 (en) 2004-06-07 2005-12-22 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods of use
WO2005121348A1 (en) 2004-06-07 2005-12-22 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
JP2008502739A (ja) 2004-06-11 2008-01-31 トラスティーズ オブ タフツ カレッジ 絹に基づく薬物送達システム
US8338648B2 (en) 2004-06-12 2012-12-25 Signum Biosciences, Inc. Topical compositions and methods for epithelial-related conditions
US7527947B2 (en) 2004-06-14 2009-05-05 Novozymes A/S Signal peptide for producing a polypeptide
WO2006046978A2 (en) 2004-06-28 2006-05-04 Argos Therapeutics, Inc. Cationic peptide-mediated transformation
MXPA06015234A (es) 2004-06-30 2007-11-22 Nektar Therapeutics Al Corp Conjugados de fraccion polimero-factor ix.
US20070292445A1 (en) 2004-07-06 2007-12-20 Transpharma Medical Ltd. Delivery system for transdermal immunization
DE102004035227A1 (de) 2004-07-21 2006-02-16 Curevac Gmbh mRNA-Gemisch zur Vakzinierung gegen Tumorerkrankungen
AU2005328382C1 (en) 2004-07-21 2013-01-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleobase
US7603349B1 (en) 2004-07-29 2009-10-13 Yahoo! Inc. User interfaces for search systems using in-line contextual queries
GB0417487D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Novartis Ag Organic compound
WO2006020768A2 (en) 2004-08-10 2006-02-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chemically modified oligonucleotides
SE0402025D0 (sv) 2004-08-13 2004-08-13 Active Biotech Ab Treatment of hyperproliferative disease with superantigens in combination with another anticancer agent
CA2478458A1 (en) 2004-08-20 2006-02-20 Michael Panzara Treatment of pediatric multiple sclerosis
DK2386640T3 (en) 2004-08-26 2015-04-27 Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd The making of functional nucleic acids into mammalian cells via bacterially derived intact minicells
DE102004042546A1 (de) 2004-09-02 2006-03-09 Curevac Gmbh Kombinationstherapie zur Immunstimulation
US7501486B2 (en) 2004-09-07 2009-03-10 Burnham Institute For Medical Research Peptides that selectively home to heart vasculature and related conjugates and methods
US8663599B1 (en) 2004-10-05 2014-03-04 Gp Medical, Inc. Pharmaceutical composition of nanoparticles
EP1811018A4 (en) 2004-10-12 2007-11-28 Tissue Targeting Japan Inc PROGENITOR FOR BRAIN DISPOSAL FROM BONE MARROW
EP2301536B1 (en) 2004-10-13 2014-04-09 PTC Therapeutics, Inc. Compounds and their use for treating nonsense-related diseases
US8057821B2 (en) 2004-11-03 2011-11-15 Egen, Inc. Biodegradable cross-linked cationic multi-block copolymers for gene delivery and methods of making thereof
WO2006047842A2 (en) 2004-11-08 2006-05-11 K.U. Leuven Research And Development Modified nucleosides for rna interference
CA2587216C (en) 2004-11-18 2014-11-18 Nanopass Technologies Ltd. System and method for delivering fluid into flexible biological barrier
JP2008520740A (ja) 2004-11-23 2008-06-19 ピーティーシー セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｖｅｇｆ産生を阻害する活性因子としての置換されたフェノール
US7964571B2 (en) 2004-12-09 2011-06-21 Egen, Inc. Combination of immuno gene therapy and chemotherapy for treatment of cancer and hyperproliferative diseases
US8354476B2 (en) 2004-12-10 2013-01-15 Kala Pharmaceuticals, Inc. Functionalized poly(ether-anhydride) block copolymers
WO2006071903A2 (en) 2004-12-28 2006-07-06 Ptc Therapeutics, Inc. Cell based methods and systems for the identification of rna regulatory sequences and compounds that modulate their functions
US8535702B2 (en) 2005-02-01 2013-09-17 Boston Scientific Scimed, Inc. Medical devices having porous polymeric regions for controlled drug delivery and regulated biocompatibility
US7404969B2 (en) 2005-02-14 2008-07-29 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
US20060263338A1 (en) 2005-03-04 2006-11-23 Jacoby Douglas B Catheter-based delivery of Skeletal Myoblasts to the Myocardium of Damaged Hearts
EP2287608B1 (en) 2005-03-11 2014-01-08 Firalis SAS Biomarkers for cardiovascular side-effects induced by cox-2 inhibitory compounds
JP4793806B2 (ja) 2005-03-22 2011-10-12 Ｔｔｉ・エルビュー株式会社 イオントフォレーシス装置
US8415325B2 (en) 2005-03-31 2013-04-09 University Of Delaware Cell-mediated delivery and targeted erosion of noncovalently crosslinked hydrogels
EP2062591A1 (en) 2005-04-07 2009-05-27 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. CACNA1E in cancer diagnosis detection and treatment
EP1910557A2 (en) 2005-04-07 2008-04-16 Chiron Corporation Cancer-related genes
EP1885403B1 (en) 2005-04-12 2013-05-08 Nektar Therapeutics Poly(ethyleneglycol) conjugates of Lysostaphin
US9085774B2 (en) 2005-04-19 2015-07-21 Basf Plant Science Gmbh Methods controlling gene expression
EP1899467A2 (en) 2005-04-26 2008-03-19 Coley Pharmaceutical GmbH Modified oligoribonucleotide analogs with enhances immunostimulatory activity
US7850656B2 (en) 2005-04-29 2010-12-14 Warsaw Orthopedic, Inc. Devices and methods for delivering medical agents
DK2161336T4 (en) 2005-05-09 2017-04-24 Ono Pharmaceutical Co Human monoclonal antibodies for programmed death 1 (PD-1) and methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapies
US20070072175A1 (en) 2005-05-13 2007-03-29 Biogen Idec Ma Inc. Nucleotide array containing polynucleotide probes complementary to, or fragments of, cynomolgus monkey genes and the use thereof
US20060265771A1 (en) 2005-05-17 2006-11-23 Lewis David L Monitoring microrna expression and function
DE102005023170A1 (de) 2005-05-19 2006-11-23 Curevac Gmbh Optimierte Formulierung für mRNA
ES2564823T3 (es) 2005-05-27 2016-03-29 Ospedale San Raffaele S.R.L. Vector génico que comprende miARN
MX2007015107A (es) 2005-06-03 2008-02-15 Genentech Inc Metodo para producir anticuerpos con funcion mejorada.
EP2377559A1 (en) 2005-06-03 2011-10-19 Southern Adelaide Health Service - Flinders Medical Centre Targeting cells with altered microRNA expression
US7550264B2 (en) 2005-06-10 2009-06-23 Datascope Investment Corporation Methods and kits for sense RNA synthesis
US7691086B2 (en) 2005-06-14 2010-04-06 Tengiz Tkebuchava Catheter for introduction of medications to the tissues of a heart or other organ
KR101304157B1 (ko) 2005-06-16 2013-09-06 넥타르 테라퓨틱스 분해가능한 결합을 갖는 컨주게이트 및 이러한 컨주게이트제조에 유용한 고분자 시약
AU2006282042B2 (en) 2005-06-17 2011-12-22 The University Of North Carolina At Chapel Hill Nanoparticle fabrication methods, systems, and materials
US8202835B2 (en) 2005-06-17 2012-06-19 Yitzchak Hillman Disease treatment via antimicrobial peptides or their inhibitors
US8101385B2 (en) 2005-06-30 2012-01-24 Archemix Corp. Materials and methods for the generation of transcripts comprising modified nucleotides
CN101495504A (zh) 2005-06-30 2009-07-29 阿切埃米克斯有限公司 用于生产全2’-修饰的核酸转录产物的材料和方法
US20080220471A1 (en) 2005-07-27 2008-09-11 Genentech, Inc. Vectors and Methods Using Same
US9012219B2 (en) 2005-08-23 2015-04-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA preparations comprising purified modified RNA for reprogramming cells
EP4174179A3 (en) 2005-08-23 2023-09-27 The Trustees of the University of Pennsylvania Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof
US20070048741A1 (en) 2005-08-24 2007-03-01 Getts Robert C Methods and kits for sense RNA synthesis
AU2006283077B2 (en) 2005-08-24 2012-06-28 The Scripps Research Institute Translation Enhancer-Element dependent vector systems
JP5135220B2 (ja) 2005-09-01 2013-02-06 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス ゲーエムベーハー アンド カンパニー カーゲー 血清群ｃ髄膜炎菌を含む複数ワクチン接種
US8715677B2 (en) 2005-09-01 2014-05-06 Celgene Corporation Immunological uses of immunomodulatory compounds for vaccine and anti-infectious disease therapy
US8420605B2 (en) 2005-09-07 2013-04-16 The University Of Strathclyde Hydrogel compositions
US20120021042A1 (en) 2005-09-15 2012-01-26 Steffen Panzner Efficient Method For Loading Amphoteric Liposomes With Nucleic Acid Active Substances
US20070185432A1 (en) 2005-09-19 2007-08-09 Transport Pharmaceuticals, Inc. Electrokinetic system and method for delivering methotrexate
DE102005046490A1 (de) 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen
US20070087437A1 (en) 2005-10-14 2007-04-19 Jifan Hu Methods for rejuvenating cells in vitro and in vivo
US8012096B2 (en) 2005-10-17 2011-09-06 Cardiogenesis Corporation Surgical device and method for performing combination revascularization and therapeutic substance delivery to tissue
CA2628328A1 (en) 2005-11-04 2007-05-10 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Influenza vaccines including combinations of particulate adjuvants and immunopotentiators
US20070105124A1 (en) 2005-11-08 2007-05-10 Getts Robert C Methods and kits for nucleic acid amplification
AU2006314757A1 (en) 2005-11-18 2007-05-24 Bioline Limited A method for enhancing enzymatic DNA polymerase reactions
EA016609B1 (ru) 2005-11-28 2012-06-29 Генмаб А/С Рекомбинантные моновалентные антитела и способы их получения
TWI389709B (zh) 2005-12-01 2013-03-21 Novartis Ag 經皮治療系統
CA2631714C (en) 2005-12-02 2014-09-16 Novartis Ag Nanoparticles for use in immunogenic compositions
US8603457B2 (en) 2005-12-02 2013-12-10 University Of Rochester Nonsense suppression and genetic codon alteration by targeted modification
US7579318B2 (en) 2005-12-06 2009-08-25 Centre De La Recherche De La Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
EP1969000A2 (en) 2005-12-06 2008-09-17 Centre National de la Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
EP1960547A2 (en) 2005-12-08 2008-08-27 Novartis AG Effects of inhibitors of fgfr3 on gene transcription
NZ569530A (en) 2005-12-13 2011-07-29 Univ Kyoto Nuclear reprogramming factor
CA2633063A1 (en) 2005-12-16 2007-06-21 Diatos Cell penetrating peptide conjugates for delivering of nucleic acids intocells
ES2545118T3 (es) 2006-01-05 2015-09-08 The Ohio State University Research Foundation Métodos basados en microARN y composiciones para el diagnóstico y tratamiento de cánceres sólidos
US7670840B2 (en) 2006-01-05 2010-03-02 The Ohio State University Research Foundation Micro-RNA expression abnormalities of pancreatic, endocrine and acinar tumors
WO2007087178A2 (en) 2006-01-13 2007-08-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vaccines and immunotherapeutics using codon optimized il-15 and methods for using the same
EP1984381B1 (en) 2006-01-27 2010-09-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
US20070178103A1 (en) 2006-01-30 2007-08-02 Fey Georg H CD19-specific immunotoxin and treatment method
US8946155B2 (en) 2006-02-03 2015-02-03 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US9458444B2 (en) 2006-02-03 2016-10-04 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US8476234B2 (en) 2006-02-03 2013-07-02 Prolor Biotech Inc. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
DE102006007433A1 (de) 2006-02-17 2007-08-23 Curevac Gmbh Adjuvanz in Form einer Lipid-modifizierten Nukleinsäure
JP5295785B2 (ja) 2006-02-20 2013-09-18 エファ・ユニバーシティ・インダストリー・コラボレイション・ファウンデイション 細胞膜透過性ペプチド
CN101420984B (zh) 2006-02-21 2013-01-02 尼克塔治疗公司 嵌段可降解聚合物及由其制备的轭合物
WO2007100789A2 (en) 2006-02-24 2007-09-07 Wyeth Gpat3 encodes a mammalian, microsomal acyl-coa:glycerol 3-phosphate acyltransferase
US8431160B2 (en) 2006-02-24 2013-04-30 Novartis Ag Microparticles containing biodegradable polymer and cationic polysaccharide for use in immunogenic compositions
US7910152B2 (en) 2006-02-28 2011-03-22 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Poly(ester amide)-based drug delivery systems with controlled release rate and morphology
EP3620469A1 (en) 2006-02-28 2020-03-11 Biogen MA Inc. Methods of treating inflammatory and autoimmune diseases with natalizumab
AU2007223311C1 (en) 2006-03-02 2013-06-20 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma MicroRNA expression profile associated with pancreatic cancer
GB0605217D0 (en) 2006-03-15 2006-04-26 Novartis Ag Method and compositions for assessing acute rejection
EP2012751A4 (en) 2006-03-21 2010-11-24 Morehouse School Of Medicine NEW NANOPARTICLES FOR THE DELIVERY OF ACTIVE AGENTS
ES2776100T3 (es) 2006-03-31 2020-07-29 Massachusetts Inst Technology Sistema para el suministro dirigido de agentes terapéuticos
CA2648291A1 (en) 2006-04-04 2007-11-01 Stc.Unm Swellable particles for drug delivery
EP2010659B1 (en) 2006-04-14 2014-06-18 CellScript, Inc. Kits and methods for generating 5' capped RNA
EP1852127A1 (en) 2006-05-02 2007-11-07 Charité - Universitätsmedizin Berlin Use of a B-cell-depleting antibody for treatment of polyoma virus infections
WO2007133807A2 (en) 2006-05-15 2007-11-22 Massachusetts Institute Of Technology Polymers for functional particles
US9925151B2 (en) 2006-05-24 2018-03-27 Merck Serono Sa Cladribine regimen for treating multiple sclerosis
CN104356230A (zh) 2006-06-02 2015-02-18 哈佛大学校长及研究员协会 蛋白质表面重建
US20090018566A1 (en) 2006-06-30 2009-01-15 Artheromed, Inc. Atherectomy devices, systems, and methods
JP5605895B2 (ja) 2006-07-04 2014-10-15 ゲンマブ エー／エス Ｃｏｐｄを処置するためのｃｄ２０結合分子
EP2397123A1 (en) 2006-07-07 2011-12-21 Aarhus Universitet Nanoparticles for nucleic acid delivery
PT2038310E (pt) 2006-07-12 2010-08-25 Novartis Ag Copolímeros reticuláveis por via actínica para o fabrico de lentes de contacto
US20110097261A1 (en) 2006-07-20 2011-04-28 Janatpour Mary J Amigo-2-inhibitors for treating, diagnosing or detecting cancer
EP2054036B1 (en) 2006-07-24 2019-12-18 Singh-Broemer and Company, Inc. Solid nanoparticle formulation of water insoluble pharmaceutical substances with reduced ostwald ripening
US8304529B2 (en) 2006-07-28 2012-11-06 Life Technologies Corporation Dinucleotide MRNA cap analogs
DE102006035618A1 (de) 2006-07-31 2008-02-07 Curevac Gmbh Nukleinsäure der Formel (I): GlXmGn, insbesondere als immunstimulierendes Adjuvanz
JP2010507361A (ja) 2006-07-31 2010-03-11 キュアバック ゲーエムベーハー 具体的には免疫刺激剤／アジュバントとしての、一般式（Ｉ）：ＧｌＸｍＧｎ、または一般式（ＩＩ）：ＣｌＸｍＣｎで表される核酸
JP2010507567A (ja) 2006-08-07 2010-03-11 ジェンザイム・コーポレーション 併用療法
US8658211B2 (en) 2006-08-18 2014-02-25 Arrowhead Madison Inc. Polyconjugates for in vivo delivery of polynucleotides
WO2008022046A2 (en) 2006-08-18 2008-02-21 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Dicer substrate rna peptide conjugates and methods for rna therapeutics
US7846895B2 (en) 2006-09-06 2010-12-07 The Regents Of The University Of California Selectively targeted antimicrobial peptides and the use thereof
MY170607A (en) 2006-09-07 2019-08-20 Crucell Holland Bv Human binding molecules capable of neutralizing influenza virus h5n1 and uses thereof
US20080140061A1 (en) 2006-09-08 2008-06-12 Arbel Medical Ltd. Method And Device For Combined Treatment
ATE498393T1 (de) 2006-09-08 2011-03-15 Univ Johns Hopkins Zusammensetzungen zur transportintensivierung durch die schleimhaut
US8454948B2 (en) 2006-09-14 2013-06-04 Medgenics Medical Israel Ltd. Long lasting drug formulations
JP5520605B2 (ja) 2006-09-19 2014-06-11 アシュラジェン インコーポレイテッド 膵臓疾患で差次的に発現されるマイクロｒｎａおよびその使用
GB0619182D0 (en) 2006-09-29 2006-11-08 Leuven K U Res & Dev Oligonucleotide arrays
CA2665225C (en) 2006-10-03 2015-06-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid containing formulations
AU2007333528B2 (en) 2006-10-05 2013-10-17 The Johns Hopkins University Water-dispersible oral, parenteral, and topical formulations for poorly water soluble drugs using smart polymeric nanoparticles
DE102006051516A1 (de) 2006-10-31 2008-05-08 Curevac Gmbh (Basen-)modifizierte RNA zur Expressionssteigerung eines Proteins
EP2087135B8 (en) 2006-11-01 2013-07-24 The Ohio State University Research Foundation Microrna expression signature for predicting survival and metastases in hepatocellular carcinoma
US8414927B2 (en) 2006-11-03 2013-04-09 Boston Scientific Scimed, Inc. Cross-linked polymer particles
US7999087B2 (en) 2006-11-15 2011-08-16 Agilent Technologies, Inc. 2′-silyl containing thiocarbonate protecting groups for RNA synthesis
US8242258B2 (en) 2006-12-03 2012-08-14 Agilent Technologies, Inc. Protecting groups for RNA synthesis
US8399007B2 (en) 2006-12-05 2013-03-19 Landec Corporation Method for formulating a controlled-release pharmaceutical formulation
WO2008068631A2 (en) 2006-12-06 2008-06-12 Novartis Ag Vaccines including antigen from four strains of influenza virus
US20090092974A1 (en) 2006-12-08 2009-04-09 Asuragen, Inc. Micrornas differentially expressed in leukemia and uses thereof
US9034348B2 (en) 2006-12-11 2015-05-19 Chi2Gel Ltd. Injectable chitosan mixtures forming hydrogels
CN105582521A (zh) 2006-12-18 2016-05-18 阿塞勒隆制药公司 活化素-actrii拮抗剂及在提高红细胞水平中的用途
WO2008082563A2 (en) 2006-12-21 2008-07-10 Stryker Corporation Sustained-release formulations comprising crystals, macromolecular gels, and particulate suspensions of biologic agents
WO2008140615A2 (en) 2006-12-21 2008-11-20 Novozymes, Inc. Modified messenger rna stabilizing sequences for expressing genes in bacterial cells
CA2673029C (en) 2006-12-22 2017-03-28 Archemix Corp. Materials and methods for the generation of transcripts comprising modified nucleotides
DE102006061015A1 (de) 2006-12-22 2008-06-26 Curevac Gmbh Verfahren zur Reinigung von RNA im präparativen Maßstab mittels HPLC
US8057426B2 (en) 2007-01-03 2011-11-15 Medtronic Vascular, Inc. Devices and methods for injection of multiple-component therapies
US8338166B2 (en) 2007-01-04 2012-12-25 Lawrence Livermore National Security, Llc Sorting, amplification, detection, and identification of nucleic acid subsequences in a complex mixture
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
WO2008091799A2 (en) 2007-01-22 2008-07-31 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Cell-based methods for identifying inhibitors of parkinson's disease-associated lrrk2 mutants
JP4866467B2 (ja) 2007-01-30 2012-02-01 エピバックス インコーポレーテッド 調節性ｔ細胞エピトープ、組成物およびその使用
US8859229B2 (en) 2007-02-02 2014-10-14 Yale University Transient transfection with RNA
TW202021980A (zh) 2007-02-02 2020-06-16 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ActRIIB的變體與其用途
WO2008096370A2 (en) 2007-02-05 2008-08-14 Natco Pharma Limited An efficient and novel purification method of recombinant hg-csf
US8333799B2 (en) 2007-02-12 2012-12-18 C. R. Bard, Inc. Highly flexible stent and method of manufacture
WO2008103276A2 (en) 2007-02-16 2008-08-28 Merck & Co., Inc. Compositions and methods for potentiated activity of biologicaly active molecules
US8242087B2 (en) 2007-02-27 2012-08-14 K.U.Leuven Research & Development Phosphate modified nucleosides useful as substrates for polymerases and as antiviral agents
AR065573A1 (es) 2007-03-02 2009-06-17 Boehringer Ingelheim Int Metodo de produccion de proteinas heterologas por expresion de una proteina con dominio de trasnferencia de lipido relacionada con proteina reguladora de la esteroidogenesis aguda start.
EP1964922A1 (en) 2007-03-02 2008-09-03 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH &amp; Co. KG Improvement of protein production
US8029496B2 (en) 2007-03-05 2011-10-04 Ebrahim Versi Method and device for delivering drug to the trigone of the bladder
AU2008222822A1 (en) 2007-03-05 2008-09-12 Washington University Nanoparticle delivery systems for membrane-integrating peptides
EP2125892A2 (en) 2007-03-20 2009-12-02 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding humanized immunoglobulin that binds a4b7 integrin
WO2014064687A1 (en) 2012-10-22 2014-05-01 Deliversir Ltd A system for delivering therapeutic agents into living cells and cells nuclei
RU2435616C2 (ru) 2007-04-27 2011-12-10 Эко Терапьютикс, Инк. Устройство для повышения проницаемости кожи для обнаружения аналита или трансдермальтной доставки лекарственных препаратов
EP2777710A1 (en) 2007-04-30 2014-09-17 Glaxosmithkline LLC Methods for administering anti-IL-5 antibodies
WO2008135855A2 (en) 2007-05-03 2008-11-13 Pfizer Products Inc. Nanoparticles comprising a cholesteryl ester transfer protein inhibitor and a nonionizable polymer
DK2494993T3 (en) 2007-05-04 2018-11-12 Marina Biotech Inc Amino acid lipids and uses thereof
US7682789B2 (en) 2007-05-04 2010-03-23 Ventana Medical Systems, Inc. Method for quantifying biomolecules conjugated to a nanoparticle
US8728491B2 (en) 2007-05-07 2014-05-20 Alba Therapeutics Corporation Transcutaneous delivery of therapeutic agents
JP5296328B2 (ja) 2007-05-09 2013-09-25 独立行政法人理化学研究所 １本鎖環状ｒｎａおよびその製造方法
WO2008141248A2 (en) 2007-05-10 2008-11-20 Agilent Technologies, Inc. Thiocarbon-protecting groups for rna synthesis
PT3072525T (pt) 2007-05-14 2018-04-20 Astrazeneca Ab Métodos para reduzir os níveis de basófilos
WO2008144365A2 (en) 2007-05-17 2008-11-27 Novartis Ag Method for making dry powder compositions containing ds-rna based on supercritical fluid technology
EA200901550A1 (ru) 2007-05-22 2010-10-29 Новартис Аг Способы лечения, диагностирования и выявления ассоциированных с fgf21 нарушений
WO2008147974A1 (en) 2007-05-23 2008-12-04 University Of South Florida Micro-rnas modulating immunity and inflammation
DK2826863T3 (en) 2007-05-30 2017-12-04 Univ Northwestern NUCLEIC ACID FUNCTIONALIZED NANOPARTICLES FOR THERAPEUTIC APPLICATIONS
WO2008151058A2 (en) 2007-05-30 2008-12-11 The General Hospital Corporation Methods of generating pluripotent cells from somatic cells
US20090099034A1 (en) 2007-06-07 2009-04-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Reagents and Methods for miRNA Expression Analysis and Identification of Cancer Biomarkers
PL2167523T3 (pl) 2007-06-19 2014-12-31 Univ Louisiana State Synteza i zastosowanie anty-odwrotnych tiofosforanowych analogów kapu matrycowego RNA
EP2173872B1 (en) 2007-06-29 2014-04-02 CellScript, Inc. Copy dna and sense rna
US8367318B2 (en) 2007-07-23 2013-02-05 Dharmacon, Inc. Screening of micro-RNA cluster inhibitor pools
US20090042825A1 (en) 2007-08-06 2009-02-12 Majed Matar Composition, method of preparation & application of concentrated formulations of condensed nucleic acids with a cationic lipopolymer
US9144546B2 (en) 2007-08-06 2015-09-29 Clsn Laboratories, Inc. Nucleic acid-lipopolymer compositions
WO2009023798A2 (en) 2007-08-14 2009-02-19 Fred Hutchinson Cancer Research Center Needle array assembly and method for delivering therapeutic agents
WO2009024599A1 (en) 2007-08-23 2009-02-26 Novartis Ag Methods for detecting oligonucleotides
WO2009030368A1 (en) 2007-09-05 2009-03-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with type i and type ii anti-cd20 antibodies
WO2009030254A1 (en) 2007-09-04 2009-03-12 Curevac Gmbh Complexes of rna and cationic peptides for transfection and for immunostimulation
US8506928B2 (en) 2007-09-07 2013-08-13 The Regents Of The University Of California Methods and compounds for targeting tissues
US20130108663A1 (en) 2007-09-14 2013-05-02 Vrije Universiteit Brussel Enhancing the t-cell stimulatory capacity of human antigen presenting cells in vitro and in vivo and their use in vaccination
US20110086904A1 (en) 2007-09-17 2011-04-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania GENERATION OF HYPERSTABLE mRNAs
US8835621B2 (en) 2007-09-26 2014-09-16 Intrexon Corporation Synthetic 5'UTRs, expression vectors, and methods for increasing transgene expression
WO2009042892A1 (en) 2007-09-26 2009-04-02 Oregon Health & Science University Cyclic undecapeptides and derivatives as multiple sclerosis therapies
SI2644594T1 (sl) 2007-09-28 2017-10-30 Pfizer Inc. Ciljanje rakavih celic z uporabo nanodelcev
EP2042193A1 (en) 2007-09-28 2009-04-01 Biomay AG RNA Vaccines
US8470560B2 (en) 2007-10-03 2013-06-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army CR-2 binding peptide P28 as molecular adjuvant for DNA vaccines
WO2009046739A1 (en) 2007-10-09 2009-04-16 Curevac Gmbh Composition for treating prostate cancer (pca)
WO2009046738A1 (en) 2007-10-09 2009-04-16 Curevac Gmbh Composition for treating lung cancer, particularly of non-small lung cancers (nsclc)
CA2917512A1 (en) 2007-10-12 2009-04-23 Massachusetts Institute Of Technology Vaccine nanotechnology
US20090098118A1 (en) 2007-10-15 2009-04-16 Thomas Friess Combination therapy of a type ii anti-cd20 antibody with an anti-bcl-2 active agent
EP2205277B1 (en) 2007-10-22 2017-07-26 Genmab A/S Novel antibody therapies
RU2531493C2 (ru) 2007-11-01 2014-10-20 Юниверсити Оф Рочестер Рекомбинантный фактор viii, обладающий повышенной стабильностью
CA2705263A1 (en) 2007-11-09 2009-05-14 Novartis Ag Combination therapy with an antagonist anti-cd 40 antibody and cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine and prednisone (chop) for treatment of b-cell malignancies
WO2009062348A1 (fr) 2007-11-14 2009-05-22 Institute Of Microbiology, Chinese Academy Of Sciences Procédés d'inhibition d'une infection par le virus de la grippe et leurs médicaments
US20090137945A1 (en) 2007-11-28 2009-05-28 Claire Marquez Electro Collagen Induction Therapy Device
EP2225396A4 (en) 2007-11-30 2011-03-02 Univ Ohio State Res Found PROFILING AND SCREENING OF MICRO-RNA EXPRESSION IN PERIPHERAL BLOOD IN LUNG CANCER
CN101932608A (zh) 2007-11-30 2010-12-29 葛兰素集团有限公司 抗原结合构建体
US7871985B2 (en) 2007-12-10 2011-01-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of factor VII gene
CA2708766C (en) 2007-12-11 2016-02-02 The Scripps Research Institute Compositions and methods related to mrna translational enhancer elements
EP2229459B1 (en) 2007-12-13 2014-08-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of RSV infection
EP2072618A1 (en) 2007-12-14 2009-06-24 Johannes Gutenberg-Universität Mainz Use of RNA for reprogramming somatic cells
BRPI0819593A2 (pt) 2007-12-21 2015-05-05 Genentech Inc "método para tratamento de um paciente com artrite reumatóide (ra)"
KR20100120663A (ko) 2008-01-23 2010-11-16 아지노모토 가부시키가이샤 Ｌ-아미노산의 제조법
WO2009093384A1 (ja) 2008-01-24 2009-07-30 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology ポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド類似体並びにこれらを用いた遺伝子発現制御方法
EP2548960B1 (en) 2008-01-31 2018-01-31 CureVac AG Nucleic acids comprising formula (nugixmgnv)a and derivatives thereof as an immunostimulating agents/adjuvant
EP2260110B1 (en) 2008-02-08 2014-11-12 Asuragen, INC. miRNAs DIFFERENTIALLY EXPRESSED IN LYMPH NODES FROM CANCER PATIENTS
US20100330677A1 (en) 2008-02-11 2010-12-30 Cambridge Enterprise Limited Improved Reprogramming of Mammalian Cells, and Cells Obtained
EP2240155B1 (en) 2008-02-13 2012-06-06 Intarcia Therapeutics, Inc Devices, formulations, and methods for delivery of multiple beneficial agents
DE102008009920A1 (de) 2008-02-15 2009-08-20 Aj Innuscreen Gmbh Mobiles Gerät für die Nukleinsäureisolierung
US8506966B2 (en) 2008-02-22 2013-08-13 Novartis Ag Adjuvanted influenza vaccines for pediatric use
US20120027813A1 (en) 2008-02-22 2012-02-02 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Adjuvanted influenza vaccines for pediatric use
EP2254668A4 (en) 2008-02-28 2012-08-15 Univ Ohio State Res Found MICRORNA SIGNATURES ASSOCIATED WITH HUMAN CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA (CLL) AND THEIR USE
WO2009108891A2 (en) 2008-02-29 2009-09-03 Egen, Inc. Modified poloxamers for gene expression and associated methods
ES2759075T3 (es) 2008-03-14 2020-05-07 Biocon Ltd Un anticuerpo monoclonal y un método del mismo
CN102027043A (zh) 2008-03-14 2011-04-20 艾根股份有限公司 生物可降解的交联支链聚(亚烷基亚胺)
JP5917143B2 (ja) 2008-03-28 2016-05-11 グラクソスミスクライン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ＬＬＣ 処置方法
DK2279254T3 (en) 2008-04-15 2017-09-18 Protiva Biotherapeutics Inc PRESENT UNKNOWN LIPID FORMS FOR NUCLEIC ACID ADMINISTRATION
WO2009127230A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
EP2112235A1 (en) 2008-04-24 2009-10-28 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Compositions and methods for microRNA expression profiling of nasopharyngeal carcinoma
AU2009238607B2 (en) 2008-04-25 2015-08-06 Northwestern University Nanostructures suitable for sequestering cholesterol
AU2009243187C1 (en) 2008-04-28 2015-12-24 President And Fellows Of Harvard College Supercharged proteins for cell penetration
AU2009241354B2 (en) 2008-04-30 2014-06-12 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Chimeric West Nile/Dengue viruses
US9394538B2 (en) 2008-05-07 2016-07-19 Shi-Lung Lin Development of universal cancer drugs and vaccines
EP2891501B1 (en) 2008-05-08 2016-09-21 MiniPumps, LLC Methods of manufacture of drug-delivery pumps
US8697098B2 (en) 2011-02-25 2014-04-15 South Dakota State University Polymer conjugated protein micelles
AU2009246327B8 (en) 2008-05-13 2013-10-03 Phaserx, Inc. Diblock copolymers and polynucleotide complexes thereof for delivery into cells
EP2297323A1 (en) 2008-05-21 2011-03-23 Hartmann, Gunther 5' triphosphate oligonucleotide with blunt end and uses thereof
FR2931824B1 (fr) 2008-05-29 2014-11-28 Centre Nat Rech Scient Procede de synthese d'arn par voie chimique.
CN102186879A (zh) 2008-05-29 2011-09-14 韩诺生物制约株式会社 修饰的显示增加的蛋白酶抗性的促红细胞生成素(epo)多肽及其药物组合物
US20100086922A1 (en) 2008-05-30 2010-04-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Assessment of chromosomal alterations to predict clinical outcome of bortezomib treatment
EP2296731A2 (en) 2008-06-06 2011-03-23 Wockhardt Research Centre A device and a system for delivery of biological material
PL215513B1 (pl) 2008-06-06 2013-12-31 Univ Warszawski Nowe boranofosforanowe analogi dinukleotydów, ich zastosowanie, czasteczka RNA, sposób otrzymywania RNA oraz sposób otrzymywania peptydów lub bialka
TWI451876B (zh) 2008-06-13 2014-09-11 Lilly Co Eli 聚乙二醇化之離脯胰島素化合物
WO2010005726A2 (en) 2008-06-16 2010-01-14 Bind Biosciences Inc. Therapeutic polymeric nanoparticles with mtor inhibitors and methods of making and using same
JP6363320B2 (ja) 2008-06-16 2018-07-25 ファイザー・インク 薬剤を装填したポリマーナノ粒子及びその製造方法と使用方法
SI2285350T1 (en) 2008-06-16 2018-03-30 Pfizer Inc. Methods for the preparation of diblock copolymers functionalized with targeting agent for use in the manufacture of therapeutic nanoparticles
JP2012501966A (ja) 2008-06-16 2012-01-26 バインド バイオサイエンシズ インコーポレイテッド ビンカアルカロイド含有治療用ポリマーナノ粒子並びにその製造方法及び使用方法
US7799016B2 (en) 2008-06-20 2010-09-21 Pharmaco-Kinesis Corporation Magnetic breather pump and a method for treating a brain tumor using the same
US9913806B2 (en) 2008-06-25 2018-03-13 Fe3 Medical, Inc. Patches and methods for the transdermal delivery of a therapeutically effective amount of iron
US20100009424A1 (en) 2008-07-14 2010-01-14 Natasha Forde Sonoporation systems and methods
WO2010009065A2 (en) 2008-07-15 2010-01-21 Novartis Ag Amphipathic peptide compositions
CA2730737A1 (en) 2008-07-15 2010-01-21 Novartis Ag Immunogenic amphipathic peptide compositions
WO2010018563A2 (en) 2008-08-12 2010-02-18 Rosetta Genomics Ltd. Compositions and methods for the prognosis of lymphoma
WO2010021865A1 (en) 2008-08-18 2010-02-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel lipid nanoparticles and novel components for delivery of nucleic acids
WO2010024871A1 (en) 2008-08-26 2010-03-04 Med Institute, Inc. Balloon catheters having a plurality of needles for the injection of one or more therapeutic agents
EP2331561A4 (en) 2008-09-03 2013-02-27 Xenome Ltd PEPTIDE CONJUGATE LIBRARIES AND METHODS OF MAKING SAME
WO2010027512A2 (en) 2008-09-06 2010-03-11 Chemgenes Corporation Rna synthesis - phosphoramidites for synthetic rna in the reverse direction, and application in convenient introduction of ligands, chromophores and modifications of synthetic rna at the 3' - end
US20120100558A1 (en) 2008-09-08 2012-04-26 Hanash Samir M Lung cancer diagnosis
US20100087337A1 (en) 2008-09-10 2010-04-08 Bind Biosciences, Inc. High Throughput Fabrication of Nanoparticles
AR073295A1 (es) 2008-09-16 2010-10-28 Genentech Inc Metodos para tratar la esclerosis multiple progresiva. articulo de fabricacion.
WO2010033906A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 President And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
WO2010037408A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
WO2010042490A1 (en) 2008-10-06 2010-04-15 Boston Medical Center Corporation A single lentiviral vector system for induced pluripotent (ips) stem cells derivation
ES2475065T3 (es) 2008-10-09 2014-07-10 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Aminol�pidos mejorados y métodos para la administración de ácidos nucleicos
US8535655B2 (en) 2008-10-10 2013-09-17 Polyactiva Pty Ltd. Biodegradable polymer—bioactive moiety conjugates
RU2011114561A (ru) 2008-10-10 2012-11-20 Милакс Холдинг Са (Lu) Ввод лекарственных препаратов
US8343498B2 (en) 2008-10-12 2013-01-01 Massachusetts Institute Of Technology Adjuvant incorporation in immunonanotherapeutics
ITVI20080239A1 (it) 2008-10-14 2010-04-15 Antoine Assaf Apparato medicale per iniezioni multiple.
WO2010047765A2 (en) 2008-10-20 2010-04-29 Massachussetts Institute Of Technology Nanostructures for drug delivery
SI2937418T1 (en) 2008-10-20 2018-02-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compounds and procedures for inhibiting the expression of transthyretin
US20120015899A1 (en) 2008-10-25 2012-01-19 Plant Bioscience, Limited Modified plant virus particles and uses therefor
US8969353B2 (en) 2008-11-07 2015-03-03 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
KR102459839B1 (ko) 2008-11-10 2022-10-27 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료제 운반용 신규 지질 및 조성물
EP2364362B1 (en) 2008-11-12 2015-10-21 Ospedale San Raffaele S.r.l. Gene vector for inducing transgene-specific immune tolerance
US9074206B2 (en) 2008-11-13 2015-07-07 Fudan University Compositions and methods for micro-RNA expression profiling of colorectal cancer
US8734853B2 (en) 2008-11-17 2014-05-27 University Of North Texas Health Science Center At Fort Worth HDL particles for delivery of nucleic acids
EP2191840A1 (en) 2008-11-28 2010-06-02 Sanofi-Aventis Antitumor combinations containing antibodies recognizing specifically CD38 and melphalan
EP2196476A1 (en) 2008-12-10 2010-06-16 Novartis Ag Antibody formulation
WO2010066384A1 (en) 2008-12-10 2010-06-17 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Compositions and methods for micro-rna expression profiling of cancer stem cells
US8563041B2 (en) 2008-12-12 2013-10-22 Bind Therapeutics, Inc. Therapeutic particles suitable for parenteral administration and methods of making and using same
EP2376091A4 (en) 2008-12-12 2012-08-01 Univ California NEW TARGETS FOR THE TREATMENT OF HYPERCHOLESTEROLEMIA
EP2379064B1 (en) 2008-12-15 2020-02-26 Pfizer Inc. Long circulating nanoparticles for sustained release of therapeutic agents
WO2010080724A1 (en) 2009-01-12 2010-07-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel lipid nanoparticles and novel components for delivery of nucleic acids
KR20110111303A (ko) 2009-01-16 2011-10-10 글락소스미스클라인 엘엘씨 벤다무스틴 및 항-ｃｄ２０ 항체의 조합을 이용한 암의 치료
WO2010084371A1 (en) 2009-01-26 2010-07-29 Mitoprod Novel circular interfering rna molecules
EP3243504A1 (en) 2009-01-29 2017-11-15 Arbutus Biopharma Corporation Improved lipid formulation
US8669085B2 (en) 2009-02-05 2014-03-11 Ut-Battelle, Llc Transformation of gram positive bacteria by sonoporation
WO2010088927A1 (en) 2009-02-09 2010-08-12 Curevac Gmbh Use of pei for the improvement of endosomal release and expression of transfected nucleic acids, complexed with cationic or polycationic compounds
US20140141089A1 (en) 2009-02-11 2014-05-22 Colorado School Of Mines Nanoparticles, Compositions Thereof, and Methods of Use, and Methods of Making the Same
JP5735927B2 (ja) 2009-02-24 2015-06-17 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート タンパク質生産の増強のためのｍＲＮＡの一次構造の再操作
WO2010141135A2 (en) 2009-03-05 2010-12-09 Trustees Of Boston University Bacteriophages expressing antimicrobial peptides and uses thereof
WO2010102066A1 (en) 2009-03-05 2010-09-10 Bend Research, Inc. Dextran polymer powder for inhalation administration of pharmaceuticals
WO2010105277A1 (en) 2009-03-13 2010-09-16 Egen, Inc. Compositions and methods for the delivery of biologically active rnas
ES2931174T3 (es) 2009-03-20 2022-12-27 Egen Inc Derivados de poliamina
WO2010111290A1 (en) 2009-03-23 2010-09-30 University Of Utah Research Foundation Methods and compositions related to modified guanine bases for controlling off-target effects in rna interference
JP5622254B2 (ja) 2009-03-31 2014-11-12 国立大学法人東京大学 二本鎖リボ核酸ポリイオンコンプレックス
DK2414387T3 (en) 2009-04-03 2016-03-07 Univ Chicago Compositions and methods related to the Protein A (spa) variants
WO2010120266A1 (en) 2009-04-13 2010-10-21 Inserm, Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Hpv particles and uses thereof
JP2013525260A (ja) 2009-04-17 2013-06-20 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 急性骨髄性白血病を治療するための組成物および方法
AU2010239689A1 (en) 2009-04-21 2011-11-03 Selecta Biosciences, Inc. Immunonanotherapeutics providing a Th1-biased response
US20100273220A1 (en) 2009-04-22 2010-10-28 Massachusetts Institute Of Technology Innate immune suppression enables repeated delivery of long rna molecules
US10837020B2 (en) * 2009-04-22 2020-11-17 Massachusetts Institute Of Technology Innate immune suppression enables repeated delivery of long RNA molecules
AR076402A1 (es) 2009-04-27 2011-06-08 Novartis Ag Composiciones y metodos para aumentar el crecimiento muscular
WO2010127159A2 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Intezyne Technologies, Incorporated Polymeric micelles for polynucleotide encapsulation
US8715736B2 (en) 2009-04-30 2014-05-06 Florida Agricultural And Mechanical University Nanoparticle formulations for skin delivery
KR20210031549A (ko) 2009-05-05 2021-03-19 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 지질 조성물
CA2761411A1 (en) 2009-05-08 2010-11-11 The Ohio State University Research Foundation Microrna expression profiling and targeting in chronic obstructive pulmonary disease (copd) lung tissue and methods of use thereof
DE202009007116U1 (de) 2009-05-18 2010-10-14 Amoena Medizin-Orthopädie-Technik GmbH Antidekubituskissen
CA2762650A1 (en) 2009-05-27 2010-12-02 Selecta Biosciences, Inc. Targeted synthetic nanocarriers with ph sensitive release of immunomodulatory agents
US8574835B2 (en) 2009-05-29 2013-11-05 Life Technologies Corporation Scaffolded nucleic acid polymer particles and methods of making and using
SI3431076T1 (sl) 2009-06-10 2022-04-29 Arbutus Biopharma Corporation Izboljšana lipidna formulacija
EP2440556A1 (en) 2009-06-10 2012-04-18 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase
CA2764832A1 (en) 2009-06-15 2010-12-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated dsrna targeting the pcsk9 gene
WO2010151664A2 (en) 2009-06-26 2010-12-29 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for treating cancer and modulating stress granule formation
IL292615B2 (en) 2009-07-01 2023-11-01 Protiva Biotherapeutics Inc Nucleic acid-lipid particles, preparations containing them and their uses
WO2011000106A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Improved cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
US20140099666A1 (en) * 2009-07-06 2014-04-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhancing production of a biological product
US20110300205A1 (en) 2009-07-06 2011-12-08 Novartis Ag Self replicating rna molecules and uses thereof
EP2459231B1 (de) * 2009-07-31 2016-06-08 Ethris Gmbh Rna mit einer kombination aus unmodifizierten und modifizierten nucleotiden zur proteinexpression
EP2281579A1 (en) 2009-08-05 2011-02-09 BioNTech AG Vaccine composition comprising 5'-Cap modified RNA
EP2467357B1 (en) 2009-08-20 2016-03-30 Sirna Therapeutics, Inc. Novel cationic lipids with various head groups for oligonucleotide delivery
WO2011028175A1 (en) 2009-09-01 2011-03-10 Agency For Science, Technology And Research Terminal device and method for processing an encrypted bit stream
US20110053829A1 (en) 2009-09-03 2011-03-03 Curevac Gmbh Disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates for the transfection of nucleic acids
US20110070227A1 (en) 2009-09-18 2011-03-24 Anna-Marie Novotney-Barry Treatment of Autoimmune and Inflammatory Diseases
EP2485770A4 (en) 2009-10-08 2013-04-10 Merck Sharp & Dohme NEW CATIONIC LIPIDS WITH SHORT LIPID CHAINS FOR ADMINISTRATION OF OLIGONUCLEOTIDES
US8859284B2 (en) 2009-10-22 2014-10-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Delivery of nanoparticles to neurons
US8449916B1 (en) 2009-11-06 2013-05-28 Iowa State University Research Foundation, Inc. Antimicrobial compositions and methods
WO2011060250A1 (en) 2009-11-13 2011-05-19 Bend Research, Inc. Cationic dextran polymer derivatives
WO2011062965A2 (en) 2009-11-18 2011-05-26 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Targeting monomers and polymers having targeting blocks
US8530429B2 (en) 2009-11-24 2013-09-10 Arch Cancer Therapeutics, Inc. Brain tumor targeting peptides and methods
TR201901311T4 (tr) 2009-12-01 2019-02-21 Translate Bio Inc İnsan genetik hastalıklarında mRNA'nın teslimi için steroid türevi.
US20110245756A1 (en) 2009-12-03 2011-10-06 Rishi Arora Devices for material delivery, electroporation, sonoporation, and/or monitoring electrophysiological activity
DE102009056884B4 (de) 2009-12-03 2021-03-18 Novartis Ag Impfstoff-Adjuvantien und verbesserte Verfahren zur Herstellung derselben
EA025416B1 (ru) 2009-12-06 2016-12-30 Байоджен Хемофилия Инк. Способ предотвращения или лечения эпизодов кровотечений с использованием химерного полипептида фактора viii длительного действия
US20130189741A1 (en) 2009-12-07 2013-07-25 Cellscript, Inc. Compositions and methods for reprogramming mammalian cells
LT3287525T (lt) 2009-12-07 2020-02-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rnr preparatai, apimantys išgrynintą modifikuotą rnr, skirti ląstelių reprogramavimui
CA3044884A1 (en) 2009-12-07 2011-06-16 Arbutus Biopharma Corporation Compositions for nucleic acid delivery
WO2011069528A1 (en) 2009-12-09 2011-06-16 Curevac Gmbh Lyophilization of nucleic acids in lactate-containing solutions
WO2011069529A1 (en) 2009-12-09 2011-06-16 Curevac Gmbh Mannose-containing solution for lyophilization, transfection and/or injection of nucleic acids
CN102811743B (zh) 2009-12-11 2015-11-25 佰恩德治疗股份有限公司 冻干治疗颗粒的稳定制剂
EA201290498A1 (ru) 2009-12-15 2013-01-30 Байнд Байосайенсиз, Инк. Терапевтические полимерные наночастицы, включающие эпотилон, и способы их получения и применения
JP5965844B2 (ja) 2009-12-15 2016-08-10 バインド セラピューティックス インコーポレイテッド 高いガラス転移温度または高分子量のコポリマーを有する治療用ポリマーナノ粒子組成物
JP6175237B2 (ja) 2009-12-15 2017-08-02 ファイザー・インク コルチコステロイドを含む治療用ポリマーナノ粒およびそれを製造かつ使用する方法
EP2512522A4 (en) 2009-12-16 2013-09-25 Brigham & Womens Hospital PARTICULARS FOR THE DELIVERY OF SEVERAL ACTIVE SUBSTANCES
DE102009058769A1 (de) 2009-12-16 2011-06-22 MagForce Nanotechnologies AG, 10589 Temperaturabhängige Aktivierung von katalytischen Nukleinsäuren zur kontrollierten Wirkstofffreisetzung
NZ600725A (en) 2009-12-18 2015-08-28 Univ British Colombia Methods and compositions for delivery of nucleic acids
EP2338520A1 (de) 2009-12-21 2011-06-29 Ludwig Maximilians Universität Konjugat mit Zielfindungsligand und dessen Verwendung
CA2785492C (en) 2009-12-23 2018-07-24 Novartis Ag Lipids, lipid compositions, and methods of using them
WO2011076143A1 (en) 2009-12-24 2011-06-30 Fudan University Compositions and methods for microrna expression profiling of lung cancer
WO2011076142A1 (en) 2009-12-24 2011-06-30 Fudan University Compositions and methods for microrna expession profiling in plasma of colorectal cancer
EP2341145A1 (en) 2009-12-30 2011-07-06 febit holding GmbH miRNA fingerprint in the diagnosis of diseases
WO2011085231A2 (en) 2010-01-08 2011-07-14 Selecta Biosciences, Inc. Synthetic virus-like particles conjugated to human papillomavirus capsid peptides for use as vaccines
WO2011088309A1 (en) 2010-01-14 2011-07-21 Regulus Therapeutics Inc. Microrna compositions and methods
EP2525781A1 (en) 2010-01-22 2012-11-28 Schering Corporation Novel cationic lipids for oligonucleotide delivery
WO2011094683A2 (en) 2010-01-29 2011-08-04 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Method of identifying myelodysplastic syndromes
EP2354246A1 (en) 2010-02-05 2011-08-10 febit holding GmbH miRNA in the diagnosis of ovarian cancer
CN102869774B (zh) 2010-02-24 2018-02-09 箭头研究公司 用于靶向递送siRNA的组合物
US8889193B2 (en) 2010-02-25 2014-11-18 The Johns Hopkins University Sustained delivery of therapeutic agents to an eye compartment
US20130133483A1 (en) 2010-03-08 2013-05-30 University Of Rochester Synthesis of Nanoparticles Using Reducing Gases
US20130059015A1 (en) 2010-03-11 2013-03-07 H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute Human Cancer micro-RNA Expression Profiles Predictive of Chemo-Response
WO2011116072A1 (en) 2010-03-16 2011-09-22 Escape Therapeutics, Inc. Hybrid hydrogel scaffold compositions and methods of use
KR20130006663A (ko) 2010-03-16 2013-01-17 유니버시티 오브 유타 리서치 파운데이션 뉴클레오티드 전달을 높이기 위한 환원가능한 폴리(아미도 에틸렌이민)으로의 절단성 변형법
WO2011115862A1 (en) 2010-03-18 2011-09-22 Merck Sharp & Dohme Corp. Endosomolytic poly(amidoamine) disulfide polymers for the delivery of oligonucleotides
US20110230816A1 (en) 2010-03-18 2011-09-22 Tyco Healthcare Group Lp Gels for Transdermal Delivery
US9149432B2 (en) 2010-03-19 2015-10-06 Massachusetts Institute Of Technology Lipid vesicle compositions and methods of use
GB201005005D0 (en) 2010-03-25 2010-05-12 Angeletti P Ist Richerche Bio New vaccine
US8207290B2 (en) 2010-03-26 2012-06-26 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for generating nanoparticles
CA2794307A1 (en) 2010-03-26 2011-09-29 Mersana Therapeutics, Inc. Modified polymers for delivery of polynucleotides, method of manufacture, and methods of use thereof
US20110247090A1 (en) 2010-04-02 2011-10-06 Intrexon Corporation Synthetic 5'UTRs, Expression Vectors, and Methods for Increasing Transgene Expression
US8808699B2 (en) 2010-04-05 2014-08-19 The University Of Chicago Compositions and methods related to protein A (SpA) antibodies as an enhancer of immune response
US9744228B2 (en) 2010-04-07 2017-08-29 Norvartis Ag Method for generating a parvovirus B19 virus-like particle
US20130037977A1 (en) 2010-04-08 2013-02-14 Paul A. Burke Preparation of Lipid Nanoparticles
WO2011125469A1 (ja) 2010-04-09 2011-10-13 国立大学法人東京大学 マイクロrna制御組換えワクシニアウイルス及びその使用
WO2011127456A2 (en) 2010-04-09 2011-10-13 Pacira Pharmaceuticals, Inc. Method for formulating large diameter synthetic membrane vesicles
US20110262491A1 (en) 2010-04-12 2011-10-27 Selecta Biosciences, Inc. Emulsions and methods of making nanocarriers
KR101196667B1 (ko) 2010-04-15 2012-11-02 포항공과대학교 산학협력단 피에이치 민감성 금속 나노 입자를 이용한 항암제 전달 시스템
EP3540059A1 (en) 2010-04-16 2019-09-18 Nuevolution A/S Bi-functional complexes and methods for making and using such complexes
EP2377938A1 (en) 2010-04-16 2011-10-19 Eukarys Capping-prone RNA polymerase enzymes and their applications
WO2011130624A2 (en) * 2010-04-16 2011-10-20 Immune Disease Institute, Inc. Sustained polypeptide expression from synthetic, modified rnas and uses thereof
US20130260460A1 (en) 2010-04-22 2013-10-03 Isis Pharmaceuticals Inc Conformationally restricted dinucleotide monomers and oligonucleotides
ES2605305T3 (es) 2010-04-23 2017-03-13 University Of Massachusetts Vectores de AAV que se dirigen al SNC y métodos de uso de los mismos
AU2011311255B2 (en) 2010-04-28 2015-10-08 Sorrento Therapeutics, Inc. Method for increasing permeability of an epithelial barrier
US9629979B2 (en) 2010-04-28 2017-04-25 Sanovas, Inc. Pressure/Vacuum actuated catheter drug delivery probe
WO2011139911A2 (en) 2010-04-29 2011-11-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated single stranded rna
MA34263B1 (fr) 2010-04-30 2013-05-02 Novartis Ag Marqueurs de prédiction utiles dans traitement du syndrome de l'x fragile (fxs)
WO2011143230A1 (en) 2010-05-10 2011-11-17 Alnylam Pharmaceuticals Methods and compositions for delivery of active agents
US20130123338A1 (en) 2010-05-12 2013-05-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel cationic lipids and methods of use thereof
WO2011141704A1 (en) 2010-05-12 2011-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc Novel cyclic cationic lipids and methods of use
EP2387999A1 (en) 2010-05-21 2011-11-23 CureVac GmbH Histidine-containing solution for transfection and/or injection of nucleic acids and uses thereof
WO2011149733A2 (en) 2010-05-24 2011-12-01 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel amino alcohol cationic lipids for oligonucleotide delivery
AU2011258165B2 (en) 2010-05-26 2016-11-17 Selecta Biosciences, Inc. Dose selection of adjuvanted synthetic nanocarriers
JP5957646B2 (ja) 2010-06-04 2016-07-27 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｉｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． オリゴヌクレオチド送達のための新規な低分子量カチオン性脂質
WO2011157713A2 (en) 2010-06-14 2011-12-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Cell-penetrating peptides and uses therof
WO2011157294A1 (en) 2010-06-16 2011-12-22 Universita' Degli Studi Di Padova Compositions for use in treating or preventing cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, metastasis, heart failure, cardiac remodelling, dilated cardiomyopathy, autoimmune diseases, or diseases or disorders related thereto
WO2011163121A1 (en) 2010-06-21 2011-12-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Multifunctional copolymers for nucleic acid delivery
US20120158100A1 (en) 2010-06-21 2012-06-21 Kevin Schomacker Driving Microneedle Arrays into Skin and Delivering RF Energy
US10478483B2 (en) 2010-06-25 2019-11-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Combinations of meningococcal factor H binding proteins
EP2589391B1 (en) 2010-07-01 2018-11-14 Rosetta Exosome Co., Ltd. Bacterial cell-derived microvesicles for use in a method of treating cancer
EP2588120B1 (en) 2010-07-02 2017-11-15 The University of Chicago Compositions and methods related to protein a (spa) variants
KR101130137B1 (ko) 2010-07-02 2012-03-28 연세대학교 산학협력단 발광다이오드 모듈
US8353871B2 (en) 2010-07-05 2013-01-15 Roller Jet Ltd. Drug delivery device with needles and roller
US9192661B2 (en) 2010-07-06 2015-11-24 Novartis Ag Delivery of self-replicating RNA using biodegradable polymer particles
EP2590625B1 (en) 2010-07-06 2017-09-20 GlaxoSmithKline Biologicals SA Cationic oil-in-water emulsions
JP6061849B2 (ja) 2010-07-06 2017-01-18 ノバルティス アーゲー 自己複製ｒｎａ分子についてのビリオン様送達粒子
US9770463B2 (en) 2010-07-06 2017-09-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Delivery of RNA to different cell types
MX2013000164A (es) 2010-07-06 2013-03-05 Novartis Ag Liposomas con lipidos que tienen valor de pka ventajoso para suministro de arn.
HUE047796T2 (hu) 2010-07-06 2020-05-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa RNS bevitele több immunútvonal bekapcsolására
JP5940064B2 (ja) 2010-07-06 2016-06-29 ノバルティス アーゲー 低用量のｒｎａを用いた大型哺乳動物の免疫化
KR20220097518A (ko) 2010-07-09 2022-07-07 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 인자 iｘ 폴리펩티드 및 이들의 사용 방법
US9611310B2 (en) 2010-07-09 2017-04-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor VIII processing and methods thereof
US20130177523A1 (en) 2010-07-13 2013-07-11 University Of Utah Research Foundation Gold particles and methods of making and using the same in cancer treatment
US20130230884A1 (en) 2010-07-16 2013-09-05 John Chaput Methods to Identify Synthetic and Natural RNA Elements that Enhance Protein Translation
GB201012410D0 (en) 2010-07-23 2010-09-08 Medical Res Council Intracellular immunity
ES2558106T3 (es) 2010-07-30 2016-02-02 Curevac Ag Formación de complejos de ácidos nucleicos con componentes catiónicos disulfuro-reticulados para la transfección e inmunoestimulación
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
WO2012021516A2 (en) 2010-08-09 2012-02-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nanoparticle-oligonucletide hybrid structures and methods of use thereof
WO2012019630A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded protein
AU2011291522A1 (en) 2010-08-20 2013-01-24 Selecta Biosciences, Inc. Synthetic nanocarrier vaccines comprising peptides obtained or derived from human influenza A virus M2E
CN103080313A (zh) 2010-08-20 2013-05-01 天蓝制药公司 缀合物、粒子、组合物以及相关方法
AU2011290471B2 (en) 2010-08-20 2015-08-20 Novartis Ag Soluble needle arrays for delivery of influenza vaccines
EP2605816B1 (en) 2010-08-20 2019-01-23 University Of Washington Circumferential aerosol device for delivering drugs to olfactory epithelium and brain
KR20130100278A (ko) 2010-08-31 2013-09-10 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 올리고뉴클레오티드의 전달을 위한 신규 단일 화학 존재물 및 방법
RS63984B1 (sr) 2010-08-31 2023-03-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Mali lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
AU2011295938B2 (en) 2010-08-31 2016-01-14 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Lipids suitable for liposomal delivery of protein-coding RNA
EP3556396B1 (en) 2010-08-31 2022-04-20 Theraclone Sciences, Inc. Human immunodeficiency virus (hiv)-neutralizing antibodies
CA2809851A1 (en) 2010-08-31 2012-03-08 Novartis Ag Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
WO2012031205A2 (en) 2010-09-03 2012-03-08 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Lipid-polymer hybrid particles
US9095540B2 (en) 2010-09-09 2015-08-04 The University Of Chicago Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens
WO2012034077A2 (en) 2010-09-09 2012-03-15 The University Of Chicago Compositions and methods related to attenuated staphylococcal strains
WO2012039979A2 (en) 2010-09-10 2012-03-29 The Johns Hopkins University Rapid diffusion of large polymeric nanoparticles in the mammalian brain
US8466122B2 (en) 2010-09-17 2013-06-18 Protiva Biotherapeutics, Inc. Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
US9669097B2 (en) 2010-09-20 2017-06-06 Sirna Therapeutics, Inc. Low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
EP2619307A1 (en) 2010-09-21 2013-07-31 RiboxX GmbH Method for synthesizing rna using dna template
US20130280334A1 (en) 2010-09-24 2013-10-24 Massachusetts Institute Of Technology Nanostructured Gels Capable of Controlled Release of Encapsulated Agents
WO2012050975A2 (en) 2010-09-29 2012-04-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Novel circular mammalian rna molecules and uses thereof
JP2013545723A (ja) 2010-09-30 2013-12-26 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション オリゴヌクレオチドの送達のための低分子量カチオン性脂質
US20120237975A1 (en) 2010-10-01 2012-09-20 Jason Schrum Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US10078075B2 (en) 2011-12-09 2018-09-18 Vanderbilt University Integrated organ-on-chip systems and applications of the same
EP4098324A1 (en) 2010-10-11 2022-12-07 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Antigen delivery platforms
EP2629802B1 (en) 2010-10-21 2019-12-04 Sirna Therapeutics, Inc. Low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
JP2013543844A (ja) 2010-10-22 2013-12-09 バインド セラピューティックス インコーポレイテッド 高分子コポリマーを含む治療用ナノ粒子
US9198964B2 (en) 2010-10-29 2015-12-01 Merck Sharp & Dohme Corp. Recombinant subunit dengue virus vaccine
EP2635265B1 (en) 2010-11-05 2018-04-04 Sirna Therapeutics, Inc. Novel low molecular weight cyclic amine containing cationic lipids for oligonucleotide delivery
WO2012061703A1 (en) 2010-11-05 2012-05-10 The Johns Hopkins University Compositions and methods relating to reduced mucoadhesion
EP2638162B1 (en) 2010-11-09 2016-08-10 The Regents of The University of California Skin permeating and cell entering (space) peptides and methods of use thereof
CN106434676B (zh) 2010-11-12 2020-10-23 宾夕法尼亚大学托管会 共有前列腺抗原、编码所述抗原的核酸分子以及包含所述核酸分子的疫苗及其用途
CN105327363A (zh) 2010-11-16 2016-02-17 塞莱克塔生物科学股份有限公司 免疫刺激性寡核苷酸
DK2640842T3 (en) 2010-11-17 2018-08-13 Aduro Biotech Inc Methods and compositions for inducing an immune response to EGFRVIII
EP2640400A4 (en) 2010-11-19 2016-01-20 Sirna Therapeutics Inc POLYMERIC POLYMERS (AMIDE) FOR THE ADMINISTRATION OF OLIGONUCLEOTIDES
EP3213770B1 (en) 2010-11-19 2021-02-24 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immune regulatory oligonucleotide (iro) compounds to modulate toll-like receptor based immune response
WO2012075040A2 (en) 2010-11-30 2012-06-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA FOR USE IN TREATMENT OF HUMAN GENETIC DISEASES
WO2012072096A1 (en) 2010-12-03 2012-06-07 Biontech Ag Method for cellular rna expression
WO2012103985A2 (en) 2010-12-16 2012-08-09 Steve Pascolo Pharmaceutical composition consisting of rna having alkali metal as counter ion and formulated with dications
WO2012082574A1 (en) 2010-12-17 2012-06-21 Merck Sharp & Dohme Corp. Membrane lytic poly(amido amine) polymers for the delivery of oligonucleotides
US8501930B2 (en) 2010-12-17 2013-08-06 Arrowhead Madison Inc. Peptide-based in vivo siRNA delivery system
WO2012088381A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 President And Fellows Of Harvard College Continuous directed evolution
KR20130108655A (ko) 2010-12-29 2013-10-04 에프. 호프만-라 로슈 아게 핵산의 세포내 전달을 위한 소분자 접합체
WO2012089225A1 (en) 2010-12-29 2012-07-05 Curevac Gmbh Combination of vaccination and inhibition of mhc class i restricted antigen presentation
WO2012092552A1 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Selecta Biosciences, Inc. Synthetic nanocarriers with reactive groups that release biologically active agents
EP2661255B1 (en) 2011-01-04 2021-03-10 Brown University Nanotubes as carriers of nucleic acids into cells
WO2012094574A2 (en) 2011-01-06 2012-07-12 The Johns Hopkins University Stabilized polyribonucleotide nanoparticles
US20140080766A1 (en) 2011-01-07 2014-03-20 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for macromolecular drug delivery
EP3202760B1 (en) 2011-01-11 2019-08-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Pegylated lipids and their use for drug delivery
DE102011082231A1 (de) 2011-01-12 2012-07-12 Robert Bosch Gmbh Zündspule, insbesondere für kleinbauende Motoren
US20120189700A1 (en) 2011-01-19 2012-07-26 Zoraida Aguilar Nanoparticle Based Immunological Stimulation
CA2825023A1 (en) 2011-01-26 2012-08-02 Cenix Bioscience Gmbh Delivery system and conjugates for compound delivery via naturally occurring intracellular transport routes
US10363309B2 (en) 2011-02-04 2019-07-30 Case Western Reserve University Targeted nanoparticle conjugates
US20140066363A1 (en) 2011-02-07 2014-03-06 Arun K. Bhunia Carbohydrate nanoparticles for prolonged efficacy of antimicrobial peptide
WO2012116715A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in newborns and infants
US20120207840A1 (en) 2011-02-10 2012-08-16 Aura Biosciences, Inc. Virion Derived Protein Nanoparticles For Delivering Diagnostic Or Therapeutic Agents For The Treatment Of Non-Melanoma Skin Cancer
CA2826904A1 (en) 2011-02-14 2012-08-23 Swift Biosciences, Inc. Polynucleotide primers and probes
WO2012112689A1 (en) 2011-02-15 2012-08-23 The University Of North Carolina At Chapel Hill Nanoparticle, liposomes, polymers, agents and proteins modified with reversible linkers
CA2827118A1 (en) 2011-02-15 2012-08-23 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for delivering nucleic acid to a cell
EP2489371A1 (en) 2011-02-18 2012-08-22 Instituto Nacional de Investigacion y Tecnologia Agraria y Alimentaria Carrier peptides for drug delivery
WO2012113413A1 (en) 2011-02-21 2012-08-30 Curevac Gmbh Vaccine composition comprising complexed immunostimulatory nucleic acids and antigens packaged with disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates
CN103492574B (zh) 2011-02-22 2015-12-09 加州理工学院 使用腺相关病毒（aav）载体递送蛋白
US8696637B2 (en) 2011-02-28 2014-04-15 Kimberly-Clark Worldwide Transdermal patch containing microneedles
WO2012116714A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in elderly patients
JP6191082B2 (ja) 2011-03-02 2017-09-06 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム より低用量の抗原および／またはアジュバントを有する混合ワクチン
EP2683812A4 (en) 2011-03-07 2014-12-03 Massachusetts Inst Technology METHODS FOR TRANSFECTING CELLS WITH NUCLEIC ACIDS
WO2012125680A1 (en) 2011-03-16 2012-09-20 Novartis Ag Methods of treating vasculitis using an il-17 binding molecule
SG192962A1 (en) 2011-03-17 2013-09-30 Novartis Ag Fgfr and ligands thereof as biomarkers for breast cancer in hr positive subjects
US20140212503A1 (en) 2011-03-17 2014-07-31 Hyukjin Lee Delivery system
ES2785108T3 (es) 2011-03-24 2020-10-05 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nanoemulsiones adyuvantes con fosfolípidos
WO2012135025A2 (en) 2011-03-28 2012-10-04 Massachusetts Institute Of Technology Conjugated lipomers and uses thereof
CN103476949A (zh) 2011-03-28 2013-12-25 诺瓦提斯公司 与细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂相关的标志物
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US10086043B2 (en) * 2011-04-03 2018-10-02 The General Hospital Corporation Efficient protein expression in vivo using modified RNA (MOD-RNA)
EP2694524B1 (en) 2011-04-04 2016-05-18 The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services 2'-o-aminooxymethyl nucleoside derivatives for use in the synthesis and modification of nucleosides, nucleotides and oligonucleotides
WO2012142132A1 (en) 2011-04-11 2012-10-18 Life Technologies Corporation Polymer particles and methods of making and using same
US11135174B2 (en) 2011-04-13 2021-10-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Coated mesoporous nanoparticles
WO2013158127A1 (en) 2012-04-16 2013-10-24 Molecular Transfer, Inc. Agents for improved delivery of nucleic acids to eukaryotic cells
US20140178894A1 (en) 2011-04-20 2014-06-26 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Culture medium suitable for the culture of undifferentiated cells
US20140287022A1 (en) 2011-04-26 2014-09-25 Molecular Express, Inc. Liposomal formulations
CN103687590A (zh) 2011-04-28 2014-03-26 Stc·Unm公司 用于靶向给药的多孔纳米颗粒支撑脂双层（原始细胞）及其使用方法
WO2012149536A1 (en) 2011-04-28 2012-11-01 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Neutralizing antibodies to nipah and hendra virus
WO2012149246A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 Novartis Ag Methods of treating squamous cell carcinoma related applications
CN107970440A (zh) 2011-04-29 2018-05-01 西莱克塔生物科技公司 致耐受性合成纳米载体
US20140113978A1 (en) 2011-05-01 2014-04-24 University Of Rochester Multifocal hepatocellular carcinoma microrna expression patterns and uses thereof
CN103826459B (zh) 2011-05-02 2017-05-10 韦恩州立大学 蛋白质诱导的多能细胞技术及其用途
UA116189C2 (uk) 2011-05-02 2018-02-26 Мілленніум Фармасьютікалз, Інк. КОМПОЗИЦІЯ АНТИ-α4β7 АНТИТІЛА
WO2012153187A2 (en) 2011-05-06 2012-11-15 Xentech Markers for cancer prognosis and therapy and methods of use
US8945588B2 (en) 2011-05-06 2015-02-03 The University Of Chicago Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens, such as EBH polypeptides
CN103547350A (zh) 2011-05-10 2014-01-29 巴斯夫欧洲公司 水包油乳液
US9283279B2 (en) 2011-05-11 2016-03-15 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Targeted polymeric conjugates and uses thereof
CN104023708A (zh) 2011-05-12 2014-09-03 耶路撒冷希伯来大学依苏姆研究发展公司 包含聚合物缀合的脂质的脂质体和有关用途
CA2835492A1 (en) 2011-05-12 2012-11-15 Helmut Vockner Novel pharmaceutical formulation
JP2014519819A (ja) 2011-05-13 2014-08-21 ノバルティス アーゲー 融合前ｒｓｖｆ抗原
US8691750B2 (en) 2011-05-17 2014-04-08 Axolabs Gmbh Lipids and compositions for intracellular delivery of biologically active compounds
CA2835428A1 (en) 2011-05-17 2012-11-22 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof for non-human vertebrates
WO2012162174A1 (en) 2011-05-20 2012-11-29 Kohler Co. Toilet installation system and method
WO2012159754A2 (en) 2011-05-24 2012-11-29 Biontech Ag Individualized vaccines for cancer
JP2014516531A (ja) 2011-05-25 2014-07-17 ノバルティス アーゲー 肺癌に対するバイオマーカー
WO2012166923A2 (en) 2011-05-31 2012-12-06 Bind Biosciences Drug loaded polymeric nanoparticles and methods of making and using same
MX349011B (es) 2011-06-02 2017-07-05 Novartis Ag Biomarcadores para terapia de inhibidor de hedgehog.
EP2714017B1 (en) 2011-06-02 2018-08-01 The Regents of The University of California Membrane encapsulated nanoparticles and method of use
US9181553B2 (en) 2011-06-06 2015-11-10 Novartis Forschungsstiftung Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Method of treatment of breast cancers over-expressing the SHP2 signature genes
ES2911653T3 (es) 2011-06-08 2022-05-20 Translate Bio Inc Composiciones de nanopartículas lipídicas y métodos para el suministro de ARNm
EP3998064A1 (en) 2011-06-08 2022-05-18 Translate Bio, Inc. Cleavable lipids
US8636696B2 (en) 2011-06-10 2014-01-28 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Transdermal device containing microneedles
WO2012168491A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Novartis Ag Pharmaceutical formulations of pcsk9 antagonists
WO2012170607A2 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Novartis Ag Use of pcsk9 antagonists
WO2012170753A2 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Novartis Ag Bovine vaccines and methods
US8916696B2 (en) 2011-06-12 2014-12-23 City Of Hope Aptamer-mRNA conjugates for targeted protein or peptide expression and methods for their use
WO2012172495A1 (en) 2011-06-14 2012-12-20 Novartis Ag Compositions and methods for antibodies targeting tem8
CA2839196A1 (en) 2011-06-15 2012-12-20 Chrontech Pharma Ab Injection needle and device
JP2014519338A (ja) 2011-06-16 2014-08-14 ノバルティス アーゲー 治療薬として使用される可溶性タンパク質
KR20140047069A (ko) 2011-06-20 2014-04-21 유니버시티 오브 피츠버그 - 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션 계산에 최적화된 광범위 반응을 나타내는 ｈ１ｎ１ 인플루엔자를 위한 항원
US9862926B2 (en) 2011-06-27 2018-01-09 Cellscript, Llc. Inhibition of innate immune response
EP3797824A1 (en) 2011-06-28 2021-03-31 Inovio Pharmaceuticals, Inc. A miniminally invasive dermal electroporation device
JP6472999B2 (ja) 2011-07-01 2019-02-20 ノバルティス アーゲー 代謝障害を治療するための方法
JP2014520506A (ja) 2011-07-04 2014-08-25 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション 核酸複合体
EP3456316A1 (en) 2011-07-06 2019-03-20 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Cationic oil-in-water emulsions
WO2013006834A1 (en) 2011-07-06 2013-01-10 Novartis Ag Oil-in-water emulsions that contain nucleic acids
JP2014522842A (ja) 2011-07-06 2014-09-08 ノバルティス アーゲー 免疫原性組み合わせ組成物およびその使用
EP2729126B1 (en) 2011-07-06 2020-12-23 GlaxoSmithKline Biologicals SA Liposomes having useful n:p ratio for delivery of rna molecules
CA2841047A1 (en) 2011-07-06 2013-01-10 Novartis Ag Immunogenic compositions and uses thereof
EP2729501A2 (en) 2011-07-07 2014-05-14 Life Technologies Corporation Polymer particles, nucleic acid polymer particles and methods of making and using the same
US20130012566A1 (en) 2011-07-10 2013-01-10 Aura Biosciences, Inc. Virion Derived Protein Nanoparticles For Delivering Diagnostic Or Therapeutic Agents For The Treatment of Alopecia
EP2758458A4 (en) 2011-07-10 2015-10-21 Harvard College COMPOSITIONS AND METHODS FOR SELF-ASSEMBLING POLYMERS WITH COMPLEMENTARY MACROSCOPIC AND MICROSCOPIC SCALE UNITS
WO2013009717A1 (en) 2011-07-10 2013-01-17 Elisabet De Los Pinos Virion derived protein nanoparticles for delivering diagnostic or therapeutic agents for the treatment of skin-related diseases
EP2732052B1 (en) 2011-07-15 2016-11-16 Leo Pharma A/S Diagnostic microrna profiling in cutaneous t-cell lymphoma (ctcl)
US20140148503A1 (en) 2011-07-20 2014-05-29 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid aptamers
GB2492999A (en) 2011-07-20 2013-01-23 Univ Central Lancashire Neutron detector
CN103732211B (zh) 2011-07-21 2017-03-01 禾大国际股份公开有限公司 支化的聚醚‑聚酰胺嵌段共聚物及其制造与使用方法
EP2736921B1 (en) 2011-07-25 2018-06-27 GlaxoSmithKline Biologicals SA Compositions and methods for assessing functional immunogenicity of parvovirus vaccines
US9493549B2 (en) 2011-07-25 2016-11-15 The Rockefeller University Antibodies directed toward the HIV-1 GP120 CD4 binding site with increased potency and breadth
JP2014521687A (ja) 2011-07-29 2014-08-28 セレクタ バイオサイエンシーズ インコーポレーテッド 体液性および細胞傷害性ｔリンパ球（ｃｔｌ）免疫応答を生成する合成ナノキャリア
AU2012296576B2 (en) 2011-08-15 2017-09-07 The University Of Chicago Compositions and methods related to antibodies to staphylococcal protein a
CN104024328A (zh) 2011-08-26 2014-09-03 箭头研究公司 用于体内核酸递送的聚(乙烯基酯)聚合物
EP2750712A2 (en) 2011-08-31 2014-07-09 Mallinckrodt LLC Nanoparticle peg modification with h-phosphonates
SI2750707T1 (sl) 2011-08-31 2019-02-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pegilirani liposomi za dostavo imunogen-kodirajoče RNA
US9126966B2 (en) 2011-08-31 2015-09-08 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods of use thereof
JP2014525462A (ja) 2011-09-01 2014-09-29 アイアールエム・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー Ｐｄｇｆｒキナーゼ阻害剤としての化合物および組成物
EP2751292A4 (en) 2011-09-01 2015-05-20 Allegro Diagnostics Corp METHOD AND COMPOSITIONS FOR DETECTING CANCER BASED ON MIRNA EXPRESSION PROFILES
JP2014525435A (ja) 2011-09-02 2014-09-29 ノバルティス アーゲー Ｈｓｆ１関連疾患を処置するための有機組成物
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3384938A1 (en) 2011-09-12 2018-10-10 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
WO2013039857A1 (en) 2011-09-12 2013-03-21 modeRNA Therapeutics Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2755683B1 (en) 2011-09-14 2019-04-03 GlaxoSmithKline Biologicals SA Methods for making saccharide-protein glycoconjugates
KR20140060541A (ko) 2011-09-16 2014-05-20 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 암을 치료하기 위한 rna 조작된 t 세포
US20150017245A1 (en) 2011-09-22 2015-01-15 Bind Therapeutics, Inc. Methods of treating cancers with therapeutic nanoparticles
WO2013072929A2 (en) 2011-09-23 2013-05-23 Indian Institute Of Technology Nanop article based cosmetic composition
TWI593708B (zh) 2011-09-26 2017-08-01 諾華公司 治療代謝病症之融合蛋白質
US9458214B2 (en) 2011-09-26 2016-10-04 Novartis Ag Dual function fibroblast growth factor 21 proteins
JP6250543B2 (ja) 2011-09-27 2017-12-20 アルニラム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド ジ脂肪族置換ｐｅｇ化脂質
WO2013045505A1 (en) 2011-09-28 2013-04-04 Novartis Ag Biomarkers for raas combination therapy
RS62993B1 (sr) 2011-10-03 2022-03-31 Modernatx Inc Modifikovani nukleozidi, nukleotidi, i nukleinske kiseline, i njihove upotrebe
AU2012322704B2 (en) 2011-10-11 2017-09-07 Novartis Ag Recombinant self-replicating polycistronic RNA molecules
WO2013055971A1 (en) 2011-10-11 2013-04-18 Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Polymers for delivering a substance into a cell
EP2766407B1 (en) 2011-10-12 2018-06-27 The Curators Of The University Of Missouri Pentablock polymers
WO2014066811A1 (en) 2012-10-25 2014-05-01 The Johns Hopkins University Bioreducible poly (b-amino ester)s for sirna delivery
US20150272885A1 (en) 2011-10-14 2015-10-01 Stc.Unm Porous nanoparticle-supported lipid bilayers (protocells) for targeted delivery including transdermal delivery of cargo and methods thereof
US9296826B2 (en) 2011-10-14 2016-03-29 Novartis Ag Antibodies and methods for WNT pathway-related diseases
HUE057604T2 (hu) 2011-10-18 2022-06-28 Dicerna Pharmaceuticals Inc Amin-kationos lipidek és felhasználásuk
WO2013059509A1 (en) 2011-10-18 2013-04-25 Micell Technologies, Inc. Drug delivery medical device
JP2014532620A (ja) 2011-10-20 2014-12-08 ノバルティス アーゲー 小児の初回免疫のためのアジュバント添加インフルエンザｂウイルスワクチン
EP2768507B1 (en) 2011-10-20 2019-12-11 Novartis AG Biomarkers predictive of responsiveness to alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor activator treatment
EP3915545A1 (en) 2011-10-25 2021-12-01 The University of British Columbia Limit size lipid nanoparticles and related methods
US20140243240A1 (en) 2011-10-26 2014-08-28 Georgetown University microRNA EXPRESSION PROFILING OF THYROID CANCER
WO2013061290A1 (en) 2011-10-26 2013-05-02 Nanopass Technologies Ltd. Microneedle intradermal drug delivery device with auto-disable functionality
KR102272498B1 (ko) 2011-10-27 2021-07-06 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 약물 캡슐화 마이크로스피어를 형성할 수 있는, ｎ-말단 상에 관능화된 아미노산 유도체
EP2771059B1 (en) 2011-10-27 2019-07-17 Sorrento Therapeutics, Inc. Transdermal delivery of high viscosity bioactive agents
AU2012328524B2 (en) 2011-10-28 2017-05-18 Excelse Bio, Inc. Protein formulations containing amino acids
WO2013062140A1 (en) 2011-10-28 2013-05-02 Kyoto University Method for efficiently inducing differentiation of pluripotent stem cells into hepatic lineage cells
US20140323907A1 (en) 2011-10-28 2014-10-30 Jason Frazier Methods for drug delivery
ES2936387T3 (es) 2011-10-31 2023-03-16 Hoffmann La Roche Formulaciones de anticuerpos anti-il13
JP6143767B2 (ja) 2011-10-31 2017-06-07 マリンクロッド エルエルシー がん治療用組合せリポソーム組成物
EP2773669B1 (en) 2011-11-04 2018-03-28 Novartis AG Low density lipoprotein-related protein 6 (lrp6) - half life extender constructs
SG11201401964TA (en) 2011-11-04 2014-05-29 Agency Science Tech & Res Self-assembled composite ultrasmall peptide-polymer hydrogels
US9579338B2 (en) 2011-11-04 2017-02-28 Nitto Denko Corporation Method of producing lipid nanoparticles for drug delivery
US9872870B2 (en) 2011-11-04 2018-01-23 University Of Notre Dame Du Lac Multifunctional micellar nanoparticle-based drug and targeting agent system
PL2773326T3 (pl) 2011-11-04 2019-06-28 Nitto Denko Corporation Sposób sterylnego wytwarzania cząstek lipid-kwas nukleinowy
US20130115247A1 (en) 2011-11-05 2013-05-09 Aura Biosciences, Inc. Virion Derived Protein Nanoparticles For Delivering Radioisotopes For The Diagnosis And Treatment Of Malignant And Systemic Disease And The Monitoring Of Therapy
US20130116408A1 (en) 2011-11-05 2013-05-09 Aura Biosciences, Inc. Virion Derived Protein Nanoparticles For Delivering Radioisotopes For The Diagnosis And Treatment Of Malignant And Systemic Disease And The Monitoring Of Therapy
EP2776459A1 (en) 2011-11-08 2014-09-17 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Rod cell-specific promoter
US20140314787A1 (en) 2011-11-08 2014-10-23 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung, Friedrich Miescher Institute Treatment for neurodegenerative diseases
WO2013068432A1 (en) 2011-11-08 2013-05-16 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung, Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Early diagnostic of neurodegenerative diseases
WO2013070872A1 (en) 2011-11-08 2013-05-16 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Methods and compositions for x-ray induced release from ph sensitive liposomes
WO2013070653A1 (en) 2011-11-09 2013-05-16 Board Of Trustees Michigan State University Metallic nanoparticle synthesis with carbohydrate capping agent
CN107875382B (zh) 2011-11-11 2024-03-08 变异生物技术公司 用于治疗巨细胞病毒的组合物和方法
WO2013071047A1 (en) 2011-11-11 2013-05-16 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for in vitro transcription of rna
CA2855826A1 (en) 2011-11-14 2013-05-23 Novartis Ag Immunogenic complexes of polyanionic carbomers and env polypeptides and methods of manufacture and use thereof
RU2014124184A (ru) 2011-11-15 2015-12-27 Новартис Аг Комбинация ингибитора фосфоинозитид-3-киназы и модулятора пути янус-киназы 2 - проводника сигнала и активатора транскрипции 5
FI2790681T4 (fi) 2011-11-18 2023-05-04 Polymeerillä päällystettyjä proteiinimikrohiukkasia käsittävän pitkävaikutteisen farmaseuttisen formulaation valmistusmenetelmä käyttäen sumutuskuivausta
CA2856252A1 (en) 2011-11-21 2013-05-30 Novartis Ag Methods of treating psoriatic arthritis (psa) using il-17 antagonists and psa response or non-response alleles
WO2013078199A2 (en) 2011-11-23 2013-05-30 Children's Medical Center Corporation Methods for enhanced in vivo delivery of synthetic, modified rnas
TR201111743A2 (tr) 2011-11-28 2012-04-24 Nesl�Han G�Rsoy Reyhan Kanser tedavisinde kullanılmak üzere yağ bazlı nanotaşıyıcı sistemler.
WO2013082111A2 (en) 2011-11-29 2013-06-06 The University Of North Carolina At Chapel Hill Geometrically engineered particles and methods for modulating macrophage or immune responses
US9364549B2 (en) 2011-11-30 2016-06-14 Andreas Voigt Hydrophobic drug-delivery material, method for manufacturing thereof and methods for delivery of a drug-delivery composition
CN104080506B (zh) 2011-11-30 2017-03-08 3M创新有限公司 包含肽治疗剂和氨基酸的微针装置以及制备和使用其的方法
WO2013082529A1 (en) 2011-12-02 2013-06-06 Yale University Enzymatic synthesis of poly(amine-co-esters) and methods of use thereof for gene delivery
WO2013082470A1 (en) 2011-12-02 2013-06-06 Pegasus Laboratories, Inc. Amphipathic lipid-based sustained release compositions
WO2013082590A1 (en) 2011-12-02 2013-06-06 Invivo Therapeutics Corporation Peg based hydrogel for peripheral nerve injury applications and compositions and method of use of synthetic hydrogel sealants
CA2858148C (en) 2011-12-05 2023-03-14 Factor Bioscience Inc. Methods and products for transfecting cells
US9814867B2 (en) 2011-12-05 2017-11-14 Nano Precision Medical, Inc. Device having titania nanotube membrane for drug delivery
US8497124B2 (en) 2011-12-05 2013-07-30 Factor Bioscience Inc. Methods and products for reprogramming cells to a less differentiated state
EP2788006A1 (en) 2011-12-07 2014-10-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable lipids for the delivery of active agents
WO2013086322A1 (en) 2011-12-07 2013-06-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Branched alkyl and cycloalkyl terminated biodegradable lipids for the delivery of active agents
GB201121070D0 (en) 2011-12-07 2012-01-18 Isis Innovation composition for delivery of biotherapeutics
WO2013086373A1 (en) 2011-12-07 2013-06-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipids for the delivery of active agents
WO2013086502A1 (en) 2011-12-09 2013-06-13 President And Fellows Of Harvard College Organ chips and uses thereof
WO2013086486A1 (en) 2011-12-09 2013-06-13 President And Fellows Of Harvard College Integrated human organ-on-chip microphysiological systems
EP2787977A4 (en) 2011-12-09 2015-05-06 Univ California LIPOSOMAL ACTIVE INVERTING
WO2013089151A1 (ja) 2011-12-12 2013-06-20 協和発酵キリン株式会社 カチオン性脂質を含有するドラッグデリバリーシステムのための脂質ナノ粒子
EP2792368A4 (en) 2011-12-12 2015-09-30 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd LIPID NANOPARTICLES WITH COMBINATIONS OF CATIONIC LIPIDES
CA2858884A1 (en) 2011-12-12 2013-06-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Proteins comprising mrsa pbp2a and fragments thereof, nucleic acids encoding the same, and compositions and their use to prevent and treat mrsa infections
SG10201601349XA (en) 2011-12-13 2016-03-30 Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd Bacterially derived, intact minicells for delivery of therapeutic agents to brain tumors
US20150000936A1 (en) 2011-12-13 2015-01-01 Schlumberger Technology Corporation Energization of an element with a thermally expandable material
EP2604253A1 (en) 2011-12-13 2013-06-19 Otto Glatter Water-in-oil emulsions and methods for their preparation
US20140343129A1 (en) 2011-12-14 2014-11-20 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleic acids, and acute care uses thereof
US20140378538A1 (en) 2011-12-14 2014-12-25 Moderma Therapeutics, Inc. Methods of responding to a biothreat
WO2013090897A1 (en) 2011-12-15 2013-06-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Using adaptive immunity to detect drug resistance
US9636414B2 (en) 2011-12-15 2017-05-02 Biontech Ag Particles comprising single stranded RNA and double stranded RNA for immunomodulation
WO2013090601A2 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Massachusetts Institute Of Technology Compact nanoparticles for biological applications
IN2014DN05912A (es) 2011-12-16 2015-06-05 Massachusetts Inst Technology
US9744318B2 (en) 2011-12-16 2017-08-29 Novartis Ag Aerosolization apparatus for inhalation profile-independent drug delivery
WO2013090648A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 modeRNA Therapeutics Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US20130157963A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Allergan, Inc. Ophthalmic compositions comprising polyvinyl capralactam-polyvinyl acetate-polyethylene glycol graft copolymers
US20140359902A1 (en) 2011-12-16 2014-12-04 Synthon Biopharmaceuticals B.V. EXPRESSION OF SECRETORY IgA ANTIBODIES IN DUCKWEED
US9546235B2 (en) 2011-12-19 2017-01-17 The University Of Sydney Peptide-hydrogel composite
US9241829B2 (en) 2011-12-20 2016-01-26 Abbott Medical Optics Inc. Implantable intraocular drug delivery apparatus, system and method
JP2015510495A (ja) 2011-12-21 2015-04-09 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 器官または器官移植片の生存可能性または寿命を延長する方法
US20130195851A1 (en) 2011-12-23 2013-08-01 Genentech, Inc. Articles of manufacture and methods for co-administration of antibodies
WO2013101908A1 (en) 2011-12-27 2013-07-04 Massachusetts Institute Of Technology Microneedle devices and uses thereof
JP2015505309A (ja) 2011-12-29 2015-02-19 ノバルティス アーゲー 髄膜炎菌ｈ因子結合タンパク質のアジュバントされた組み合わせ
EP2797634A4 (en) 2011-12-29 2015-08-05 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED mRNA ENCODING POLYPEPTIDES PENETRATING IN CELLS
PL3144389T3 (pl) 2011-12-30 2018-10-31 Cellscript, Llc WYTWARZANIE I STOSOWANIE ZSYNTETYZOWANEGO IN VITRO ssRNA DO WPROWADZANIA DO SSACZYCH KOMÓREK W CELU INDUKCJI EFEKTU BIOLOGICZNEGO LUB BIOCHEMICZNEGO
WO2013103659A1 (en) 2012-01-04 2013-07-11 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Stabilizing rna by incorporating chain-terminating nucleosides at the 3'-terminus
EP3735967A1 (en) 2012-01-06 2020-11-11 NeuroBo Pharmaceuticals, Inc. Compound for use in methods of reducing risk of cardiovascular disease
WO2013106496A1 (en) 2012-01-10 2013-07-18 modeRNA Therapeutics Methods and compositions for targeting agents into and across the blood-brain barrier
WO2013109713A1 (en) 2012-01-18 2013-07-25 The General Hospital Corporation Targeting rnas to microvesicles
SG11201404014PA (en) 2012-01-26 2014-08-28 Life Technologies Corp Methods for increasing the infectivity of viruses
KR20140129054A (ko) 2012-01-26 2014-11-06 라이프 테크놀로지스 코포레이션 바이러스의 감염성을 증가시키는 방법
EP2623121A1 (en) 2012-01-31 2013-08-07 Bayer Innovation GmbH Pharmaceutical composition comprising a polymeric carrier cargo complex and an antigen
WO2013113326A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Curevac Gmbh Pharmaceutical composition comprising a polymeric carrier cargo complex and at least one protein or peptide antigen
WO2013113325A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Curevac Gmbh Negatively charged nucleic acid comprising complexes for immunostimulation
CN104245745B (zh) 2012-02-09 2017-03-29 生命技术公司 亲水性聚合物颗粒及其制备方法
WO2013120500A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded tumour antigen
WO2013120499A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly (a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded pathogenic antigen
WO2013120498A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded allergenic antigen or an autoimmune self-antigen
WO2013120497A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded therapeutic protein
WO2013126776A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 Northwestern University Nanostructures for treating cancers and other conditions
US20140037573A1 (en) 2012-02-22 2014-02-06 Cerulean Pharma Inc. Conjugates, particles, compositions, and related methods
US20130243867A1 (en) 2012-02-23 2013-09-19 University Of South Florida (A Florida Non-Profit Corporation) Micelle compositions and methods for their use
WO2013130535A1 (en) 2012-02-27 2013-09-06 Newgen Biopharma Corporation Topical delivery of hormonal and non hormonal nano formulations, methods of making and using the same
WO2013129935A1 (en) 2012-02-27 2013-09-06 Epitarget As Use of a particulate immunomodulator in cancer therapy
EP2819651A1 (en) 2012-02-27 2015-01-07 Epitarget AS Use of an antibody and a particulate immunomodulator in therapy
WO2013128027A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Amgen Research (Munich) Gmbh Long life polypeptide binding molecules
US20130236504A1 (en) 2012-03-06 2013-09-12 Medical University Of South Carolina Delivery System for Enhancing Drug Efficacy
WO2013136234A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 University Of Kwazulu-Natal Transdermal delivery devices
US10322089B2 (en) 2012-03-14 2019-06-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nanoparticles, nanoparticle delivery methods, and systems of delivery
WO2013135359A1 (en) 2012-03-16 2013-09-19 Merck Patent Gmbh Targeting aminoacid lipids
CN104363924B (zh) 2012-03-16 2018-04-17 约翰霍普金斯大学 用于递送hif‑1抑制剂的控制释放调配物
CN104394891B (zh) 2012-03-16 2019-04-16 约翰霍普金斯大学 用于递送活性剂的非线性多嵌段共聚物-药物结合物
WO2013142349A1 (en) 2012-03-23 2013-09-26 University Of Chicago Compositions and methods related to staphylococcal sbi
US9610346B2 (en) 2012-03-23 2017-04-04 International Aids Vaccine Initiative Recombinant viral vectors
WO2013143555A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Biontech Ag Rna formulation for immunotherapy
US9717685B2 (en) 2012-03-26 2017-08-01 President And Fellows Of Harvard College Lipid-coated nucleic acid nanostructures of defined shape
SG11201405545XA (en) 2012-03-27 2014-11-27 Curevac Gmbh Artificial nucleic acid molecules comprising a 5'top utr
SG10201607962RA (en) 2012-03-27 2016-11-29 Curevac Ag Artificial nucleic acid molecules
CA2867323C (en) 2012-03-27 2020-07-07 Sirna Therapeutics, Inc. Diether based biodegradable cationic lipids for sirna delivery
CA2859452C (en) 2012-03-27 2021-12-21 Curevac Gmbh Artificial nucleic acid molecules for improved protein or peptide expression
EP2830596B1 (en) 2012-03-29 2020-12-30 Translate Bio, Inc. Lipid-derived neutral nanoparticles
CN108949772A (zh) 2012-04-02 2018-12-07 现代泰克斯公司 用于产生与人类疾病相关的生物制剂和蛋白质的修饰多核苷酸
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
EP3501550A1 (en) 2012-04-02 2019-06-26 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
US20150050354A1 (en) 2012-04-02 2015-02-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the treatment of otic diseases and conditions
US20140275229A1 (en) 2012-04-02 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides encoding udp glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide a1
EP2833926A4 (en) 2012-04-05 2015-11-25 Univ Florida NEUROPHILIC NANOPARTICLES
EP2833918B1 (en) 2012-04-05 2019-05-08 Massachusetts Institute of Technology Immunostimulatory compositions and methods of use thereof
WO2013152351A2 (en) 2012-04-06 2013-10-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Fusion polypeptides and methods of use thereof
CN104379127A (zh) 2012-04-08 2015-02-25 席拉蔻公司 制备用于治疗泌尿上皮失调的热可逆凝胶制剂
ES2560235T3 (es) 2012-04-11 2016-02-18 Intezyne Technologies Inc. Copolímeros en bloque para micelas estables
WO2013155493A1 (en) 2012-04-12 2013-10-17 Yale University Methods of treating inflammatory and autoimmune diseases and disorders
WO2013154766A1 (en) 2012-04-13 2013-10-17 New York University Microrna control of ldl receptor pathway
US11001797B2 (en) 2012-04-13 2021-05-11 President And Fellows Of Harvard College Devices and methods for in vitro aerosol delivery
CN103764153A (zh) 2012-04-18 2014-04-30 箭头研究公司 用于体内核酸递送的聚(丙烯酸酯)聚合物
US9402816B2 (en) 2012-04-19 2016-08-02 Sima Therapeutics, Inc. Diester and triester based low molecular weight, biodegradeable cationic lipids for oligonucleotide delivery
WO2013163234A1 (en) 2012-04-23 2013-10-31 Massachusetts Institute Of Technology Stable layer-by-layer coated particles
IN2014DN09134A (es) 2012-04-25 2015-05-22 Regulus Therapeutics Inc
KR102140989B1 (ko) 2012-05-03 2020-08-04 칼라 파마슈티컬스, 인크. 개선된 점막 수송을 나타내는 제약 나노입자
JP6392209B2 (ja) 2012-05-04 2018-09-19 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー 粘液内層を通過する迅速な透過のための脂質ベース薬物キャリア
WO2013173657A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Micell Technologies, Inc. Low burst sustained release lipophilic and biologic agent compositions
US9399672B2 (en) 2012-05-17 2016-07-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Hepatitis C virus neutralizing antibody
WO2013173693A1 (en) 2012-05-18 2013-11-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Nanoparticles with enhanced entry into cancer cells
KR20150032945A (ko) 2012-05-23 2015-03-31 더 오하이오 스테이트 유니버시티 지질-코팅된 알부민 나노입자 조성물 및 이를 제조하는 방법 및 사용하는 방법
US20150306249A1 (en) 2012-05-25 2015-10-29 Curevac Gmbh Reversible immobilization and/or controlled release of nucleic acid containing nanoparticles by (biodegradable) polymer coatings
CN104363949B (zh) 2012-06-06 2018-06-05 洛马维斯塔医药股份有限公司 可胀大的医疗装置
EP2858677B1 (en) 2012-06-08 2020-08-05 ethris GmbH Pulmonary delivery of messenger rna
PL2858974T3 (pl) 2012-06-08 2019-03-29 Nitto Denko Corporation Lipidy do preparatów do dostarczania środka terapeutycznego
EA201492055A1 (ru) 2012-06-08 2015-11-30 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. ИНГАЛЯЦИОННАЯ ДОСТАВКА мРНК В НЕЛЕГОЧНЫЕ КЛЕТКИ-МИШЕНИ
WO2014014613A2 (en) 2012-06-20 2014-01-23 President And Fellows Of Harvard College Self-assembling peptides, peptide nanostructures and uses thereof
CA2877051C (en) 2012-06-20 2021-09-21 Frank Gu Mucoadhesive nanoparticle delivery system
ES2729603T3 (es) 2012-06-27 2019-11-05 Merck Sharp & Dohme Anticuerpos IL-23 antihumanos cristalinos
US9150841B2 (en) 2012-06-29 2015-10-06 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cells for producing recombinant iduronate-2-sulfatase
US9956291B2 (en) 2012-07-10 2018-05-01 Shaker A. Mousa Nanoformulation and methods of use of thyroid receptor beta1 agonists for liver targeting
EP2872120B1 (en) 2012-07-16 2017-05-03 Nanoderm Sciences, Inc. Therapeutic nanoparticles with a polymyxin b as targeting agent
EP2687251A1 (en) 2012-07-17 2014-01-22 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Drug delivery device
EP2687252A1 (en) 2012-07-17 2014-01-22 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Drug delivery device
CN112587658A (zh) 2012-07-18 2021-04-02 博笛生物科技有限公司 癌症的靶向免疫治疗
WO2014015334A1 (en) 2012-07-20 2014-01-23 Brown University System and methods for nanostructure protected delivery of treatment agent and selective release thereof
EP2877600B1 (en) 2012-07-24 2019-04-10 President and Fellows of Harvard College Self-assembly of nucleic acid nanostructures
WO2014015422A1 (en) 2012-07-27 2014-01-30 Ontario Institute For Cancer Research Cellulose-based nanoparticles for drug delivery
GB201213624D0 (en) 2012-07-27 2012-09-12 Univ Ulster The Method and system for production of conjugated nanoparticles
US9931418B2 (en) 2012-08-07 2018-04-03 Northeastern University Compositions for the delivery of RNA and drugs into cells
WO2014024193A1 (en) 2012-08-07 2014-02-13 Prodel Pharma Ltd. Compositions and methods for rapid transmucosal delivery of pharmaceutical ingredients
EP2882474A4 (en) 2012-08-08 2016-05-11 Presage Biosciences Inc EXTRUSION METHODS AND DEVICES FOR ACTIVE INGREDIENT RELIEF
US9974886B2 (en) 2012-08-08 2018-05-22 Nanyang Technological University Methods of manufacturing hydrogel microparticles having living cells, and compositions for manufacturing a scaffold for tissue engineering
CN104736181A (zh) 2012-08-10 2015-06-24 北德克萨斯大学健康科学中心 包含靶向聚氨基酸与脂肪酸之缀合物的药物递送载剂
WO2014027006A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 Edko Pazarlama Tanitim Ticaret Limited Sirketi Bioadhesive formulations for use in drug delivery
WO2014028487A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipidoids and uses thereof
US9827321B2 (en) 2012-08-14 2017-11-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Stabilizing shear-thinning hydrogels
CA2881605A1 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Aaron FROESE Internal structured self assembling liposomes
EP2885419A4 (en) 2012-08-14 2016-05-25 Moderna Therapeutics Inc ENZYMES AND POLYMERASES FOR RNA SYNTHESIS
CA2882248A1 (en) 2012-08-15 2014-02-20 The University Of Chicago Exosome-based therapeutics against neurodegenerative disorders
WO2014039185A1 (en) 2012-09-05 2014-03-13 Creighton University Polymeric nanoparticles in a thermosensitive gel for coital-independent vaginal prophylaxis of hiv
US8703197B2 (en) 2012-09-13 2014-04-22 International Business Machines Corporation Branched polyamines for delivery of biologically active materials
PL2895156T3 (pl) 2012-09-17 2019-09-30 Pfizer Inc. Sposób wytwarzania nanocząstek terapeutycznych
WO2014047649A1 (en) 2012-09-24 2014-03-27 The Regents Of The University Of California Methods for arranging and packing nucleic acids for unusual resistance to nucleases and targeted delivery for gene therapy
CA2925687A1 (en) 2012-09-27 2014-04-03 The University Of North Carolina At Chapel Hill Lipid coated nanoparticles containing agents having low aqueous and lipid solubilities and methods thereof
US20150307542A1 (en) 2012-10-03 2015-10-29 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleic acid molecules and uses thereof
WO2014053879A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
EP2716655A1 (en) 2012-10-04 2014-04-09 Institut Pasteur Neutralizing antibodies directed against Hepatitis C virus ectodomain glycoprotein E2
EP2903595A1 (en) 2012-10-04 2015-08-12 University Of The Witwatersrand, Johannesburg Liposomal drug delivery system
WO2014053881A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
WO2014053880A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
US20140100178A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Aslam Ansari Composition and methods for site-specific drug delivery to treat malaria and other liver diseases
WO2014053882A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
WO2014064534A2 (en) 2012-10-05 2014-05-01 Chrontech Pharma Ab Injection needle, device, immunogenic compositions and method of use
EP2716689A1 (en) 2012-10-05 2014-04-09 National University of Ireland, Galway Polymer comprising a plurality of branches having at least one disulfide group and/or at least one vinyl group
WO2014059022A1 (en) 2012-10-09 2014-04-17 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Nanoparticles for targeted delivery of multiple therapeutic agents and methods of use
US20140106260A1 (en) 2012-10-11 2014-04-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Core-shell nanoparticulate compositions and methods
EP2908818A4 (en) 2012-10-16 2016-07-13 Endocyte Inc CONJUGATES OF DRUG DELIVERY CONTAINING ARTIFICIAL AMINO ACIDS AND METHODS OF USE
IL301018A (en) 2012-10-18 2023-05-01 Univ Rockefeller Broad-spectrum neutralizing antibodies against the AIDS virus
AU2013336582A1 (en) 2012-10-26 2015-06-11 Nlife Therapeutics, S.L. Compositions and methods for selective delivery of oligonucleotide molecules to cell types
US20150272900A1 (en) 2012-10-26 2015-10-01 The Johns Hopkins University Layer-By-Layer Approach to Co-Deliver DNA and siRNA via AuNPs: A Potential Platform for Modifying Release Kinetics
WO2014066912A1 (en) 2012-10-26 2014-05-01 Vanderbilt University Polymeric nanoparticles
WO2014067551A1 (en) 2012-10-29 2014-05-08 Technische Universität Dortmund T7 rna polymerase variants and methods of using the same
EP2914728B1 (en) 2012-11-01 2020-07-08 Factor Bioscience Inc. Methods and products for expressing proteins in cells
WO2014071072A2 (en) 2012-11-02 2014-05-08 Pungente Michael D Novel cationic carotenoid-based lipids for cellular nucleic acid uptake
WO2014068542A1 (en) 2012-11-05 2014-05-08 Fondazione Centro San Raffaele Novel targets in multiple myeloma and other disorders
WO2014074597A1 (en) 2012-11-06 2014-05-15 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods relating to complex nucleic acid nanostructures
BR112015010253A2 (pt) 2012-11-06 2017-07-11 Rochal Ind Llc entrega de agentes biologicamente ativos com o uso de solventes hidrofóbicos e voláteis
US9572893B2 (en) 2012-11-07 2017-02-21 Council Of Scientific And Industrial Research Nanocomplex containing cationic peptide for biomolecule delivery
EP2916873B1 (en) 2012-11-07 2017-07-26 Council of Scientific & Industrial Research Nanocomplex containing amphipathic peptide useful for efficient transfection of biomolecules
BR112015010318A2 (pt) 2012-11-08 2017-08-22 Albumedix As Variantes de albumina
CN104903349B (zh) 2012-11-08 2018-10-19 十一生物治疗股份有限公司 Il-6拮抗剂及其应用
TW201428101A (zh) 2012-11-08 2014-07-16 Inviragen Inc 登革熱病毒血清型４型之建構物的組成物、方法及用途
MX2015005839A (es) 2012-11-08 2015-12-17 Clearside Biomedical Inc Metodos y dispositivos para el tratamiento de trastornos oculares en sujetos humanos.
WO2014071963A1 (en) 2012-11-09 2014-05-15 Biontech Ag Method for cellular rna expression
AU2013343864B2 (en) 2012-11-09 2019-04-04 BioNTech SE Method for cellular RNA expression
EP2916853B1 (en) 2012-11-09 2020-05-06 Velin-Pharma A/S Compositions for pulmonary delivery
US9200119B2 (en) 2012-11-09 2015-12-01 Momentive Performance Materials Inc. Silicon-containing zwitterionic linear copolymer composition
KR20150083121A (ko) 2012-11-12 2015-07-16 레드우드 바이오사이언스 인코포레이티드 화합물, 및 컨쥬게이트의 제조방법
GB201220354D0 (en) 2012-11-12 2012-12-26 Medpharm Ltd Dermal compositions
EP2916862B1 (en) 2012-11-12 2020-01-08 GenVec, Inc. Malaria antigens and methods of use
US9943608B2 (en) 2012-11-13 2018-04-17 Baylor College Of Medicine Multi-arm biodegradable polymers for nucleic acid delivery
US9310374B2 (en) 2012-11-16 2016-04-12 Redwood Bioscience, Inc. Hydrazinyl-indole compounds and methods for producing a conjugate
WO2014078636A1 (en) 2012-11-16 2014-05-22 President And Fellows Of Harvard College Nucleic acid hydrogel self-assembly
CN104853747B (zh) 2012-11-19 2020-06-19 理工研究与开发基金公司 用于体内递送的脂质体
EP2732825B1 (en) 2012-11-19 2015-07-01 Invivogen Conjugates of a TLR7 and/or TLR8 agonist and a TLR2 agonist
US20150290328A1 (en) 2012-11-20 2015-10-15 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Formulations of active agents for sustained release
US20140141037A1 (en) 2012-11-20 2014-05-22 Novartis Ag Rsv f prefusion trimers
WO2014081300A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Tagworks Pharmaceuticals B.V. Channel protein activatable liposomes
WO2014081303A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Tagworks Pharmaceuticals B.V. Chemically cleavable group
WO2014081299A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Tagworks Pharmaceuticals B.V. Activatable liposomes
SI2922554T1 (sl) 2012-11-26 2022-06-30 Modernatx, Inc. Terminalno modificirana RNA
WO2014093574A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for altering cell phenotype
WO2014108515A1 (en) 2013-01-10 2014-07-17 Novartis Ag Influenza virus immunogenic compositions and uses thereof
CA2897941A1 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Moderna Therapeutics, Inc. Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
WO2014164253A1 (en) 2013-03-09 2014-10-09 Moderna Therapeutics, Inc. Heterologous untranslated regions for mrna
EP2968397A4 (en) 2013-03-12 2016-12-28 Moderna Therapeutics Inc DIAGNOSIS AND TREATMENT OF FIBROSIS
EP2968391A1 (en) 2013-03-13 2016-01-20 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
EP2971010B1 (en) 2013-03-14 2020-06-10 ModernaTX, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US11377470B2 (en) 2013-03-15 2022-07-05 Modernatx, Inc. Ribonucleic acid purification
EP2971033B8 (en) 2013-03-15 2019-07-10 ModernaTX, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
EP2983804A4 (en) 2013-03-15 2017-03-01 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
US20160032273A1 (en) 2013-03-15 2016-02-04 Moderna Therapeutics, Inc. Characterization of mrna molecules
US20160017313A1 (en) 2013-03-15 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Analysis of mrna heterogeneity and stability
US10077439B2 (en) 2013-03-15 2018-09-18 Modernatx, Inc. Removal of DNA fragments in mRNA production process
SI3019619T1 (sl) 2013-07-11 2021-12-31 Modernatx, Inc. Sestave, ki zajemajo sintetične polinukleotide, ki kodirajo proteine, pozvezane s crispr, in sintetične sgrna, ter metode uporabe
WO2015007871A2 (en) 2013-07-17 2015-01-22 Ospedale San Raffaele S.R.L. Micrornas and autoimmune-immune mediated inflammatory disease
US20160194368A1 (en) 2013-09-03 2016-07-07 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
WO2015034928A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
EP3043826A4 (en) 2013-09-13 2017-05-24 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide compositions containing amino acids
EP3052106A4 (en) 2013-09-30 2017-07-19 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
US10323076B2 (en) 2013-10-03 2019-06-18 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
WO2015058069A1 (en) 2013-10-18 2015-04-23 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods for tolerizing cellular systems
US20170202979A1 (en) 2014-07-17 2017-07-20 Modernatx, Inc. Terminal modifications of polynucleotides
EP3041948B1 (en) * 2014-11-10 2019-01-09 Modernatx, Inc. Alternative nucleic acid molecules containing reduced uracil content and uses thereof
CA2975333A1 (en) 2015-04-22 2016-10-27 Curevac Ag Rna containing composition for treatment of tumor diseases
WO2017112943A1 (en) 2015-12-23 2017-06-29 Modernatx, Inc. Methods of using ox40 ligand encoding polynucleotides

Also Published As

Publication number Publication date
LT2922554T (lt) 2022-06-27
PL2922554T3 (pl) 2022-06-20
CA2892529A1 (en) 2014-05-30
US9597380B2 (en) 2017-03-21
JP7047002B2 (ja) 2022-04-04
AU2021202758A1 (en) 2021-05-27
JP6666391B2 (ja) 2020-03-13
JP2020072766A (ja) 2020-05-14
US20180000910A1 (en) 2018-01-04
DK2922554T3 (en) 2022-05-23
HRP20220607T1 (hr) 2022-06-24
JP2015535430A (ja) 2015-12-14
AU2019203876A1 (en) 2019-06-20
US20140147454A1 (en) 2014-05-29
RS63237B1 (sr) 2022-06-30
AU2013348363A1 (en) 2015-06-11
US10925935B2 (en) 2021-02-23
JP2017140048A (ja) 2017-08-17
US10155029B2 (en) 2018-12-18
US20190290742A1 (en) 2019-09-26
HK1214515A1 (zh) 2016-07-29
JP2018164458A (ja) 2018-10-25
EP2922554A1 (en) 2015-09-30
SI2922554T1 (sl) 2022-06-30
JP6377804B2 (ja) 2018-08-22
WO2014081507A1 (en) 2014-05-30
JP2022093332A (ja) 2022-06-23
PT2922554T (pt) 2022-06-28
JP6144355B2 (ja) 2017-06-07
AU2017202228A1 (en) 2017-04-27
AU2017202228B2 (en) 2019-03-14
US20220395562A1 (en) 2022-12-15
CA2892529C (en) 2023-04-25
EP4074834A1 (en) 2022-10-19
EP2922554B1 (en) 2022-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7047002B2 (ja) 化学修飾ｍＲＮＡ
US11708396B2 (en) Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
US20170252461A1 (en) Heterologous untranslated regions for mrna
ES2923757T3 (es) Composiciones de ARNm modificado
EP3169783A2 (en) Terminal modifications of polynucleotides
US20140378538A1 (en) Methods of responding to a biothreat
WO2013090186A1 (en) Modified nucleic acids, and acute care uses thereof