KR20150083121A - 화합물, 및 컨쥬게이트의 제조방법 - Google Patents

화합물, 및 컨쥬게이트의 제조방법 Download PDF

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아론 에드워드 알버스
데이비드 라부카
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Abstract

본 발명은 컨쥬게이트 구조 및 이러한 컨쥬게이트를 제조하는데 이용되는 화합물 구조를 제공한다. 또한, 변형된 아미노산을 통해 연결된 약물-폴리펩타이드 또는 검출 가능한 표지-폴리펩타이드 컨쥬게이트를 제조하는 방법이 제공된다. 컨쥬게이트를 제조하는데 이용되는 변형된 아미노산의 구조가 개시되어 있다.

Description

화합물, 및 컨쥬게이트의 제조방법{COMPOUNDS AND METHODS FOR PRODUCING A CONJUGATE}
단백질-소분자 치료적 컨쥬게이트의 분야는 크게 진보되어 왔고, 많은 임상적으로 유익한 약물을 제공하는 한편 해를 거듭할수록 더 많이 제공하게 될 것으로 예상된다. 단백질-컨쥬게이트 치료제는, 예를 들어, 기능의 특이성, 다중성 및 상대적으로 낮은 표적 이탈 활성으로 인한 수개의 이점을 제공할 수 있고, 그 결과 더 적은 부작용을 가져올 수 있다. 단백질의 화학적 변형은 단백질에 더욱 강력하거나 안정적이거나 다중 모드를 부여함으로써 이들 이점을 확장시킬 수 있다.
많은 표준 화학 변형은 단백질에 대한 번역 후 변형을 작성하여 조작하는데 통상 이용된다. 특정 아미노산 선택성의 곁사슬을 변형시킬 수 있는 많은 방법이 있다. 예를 들어, 카복실산 곁사슬(아스파테이트 및 글루타메이트)은 수용성 카보다이이미드 시약에 의한 초기 활성화와 아민에 의한 후속 반응에 의해 표적화될 수 있다. 마찬가지로, 라이신은 활성화된 에스터 또는 아이소티오사이아네이트의 사용을 통해서 표적화될 수 있고, 시스테인 티올은 말레이미드 및 α-할로-카보닐로 표적화될 수 있다.
화학적으로 변화된 단백질 치료제 혹은 시약의 작성에 대한 하나의 중요한 장애는 생물학적으로 활성이면서 균질한 형태로 단백질을 생산하는 것이다. 폴리펩타이드에 대한 약물 또는 검출 가능한 표지(detectable label)의 컨쥬게이션은 제어하기 어려워, 화학적 컨쥬게이션의 위치 및 부착된 약물 분자의 수가 상이한 컨쥬게이트의 이종 혼합물을 생성하게 될 수 있다. 몇몇 경우에, 폴리펩타이드 상에 정밀하면서도 선택적인 화학 결합의 형성을 지향하기 위하여 합성 유기 화학의 툴을 이용해서 폴리펩타이드에 컨쥬게이트된 약물 또는 검출 가능한 표지 및/또는 컨쥬게이션의 부위를 제어하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 컨쥬게이트 구조 및 이러한 컨쥬게이트를 제조하는데 이용되는 화합물 구조를 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 컨쥬게이트의 제조 방법뿐만 아니라 이를 이용하는 방법도 포괄한다.
본 발명의 실시형태들은 하기 화학식의 적어도 하나의 변성 아미노산 잔기를 포함하는 컨쥬게이트를 포함한다:
Figure pct00001
식 중,
X는 N, NH, O, S, CH 또는 CH2이고;
Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 N, O 및 S로부터 선택되며;
n은 1 또는 2이고;
R2는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되며;
R3은 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실 아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고;
R4는 선택적이고, 만약 존재한다면, 수소, 하이드록실, 할로겐, 사이아노, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 아실, 카복실, 및 카복실 에스터로부터 선택되며;
R5는 선택적이고, 만약 존재한다면, 수소 또는 하이드록실이며; 그리고
R6은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실 아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고,
여기서 W1 및 W2 중 한쪽은 폴리펩타이드이고, 다른 한쪽은 약물 또는 검출 가능한 표지이며,
점선은 선택적 결합을 나타내고,
R4-탄소와 R5-탄소 사이의 점선이 이중 결합일 때, n은　1이고 R4와 R5는 존재하지 않으며, 그리고
n이 2일 때, R4-탄소와 R5-탄소 사이의 점선은 이중 결합이 아니고 R5는 존재하지 않는다.
상기 컨쥬게이트의 몇몇 실시형태에 있어서, Y1은 N이다.
상기 컨쥬게이트의 몇몇 실시형태에 있어서, Y2는 O이다.
상기 컨쥬게이트의 몇몇 실시형태에 있어서, R2는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다.
상기 컨쥬게이트의 몇몇 실시형태에 있어서, R2는 메틸, t-뷰틸 또는 아릴이다.
상기 컨쥬게이트의 몇몇 실시형태에 있어서, R4-탄소와 R5-탄소 사이의 점선은 이중 결합이고, n은　1이며, 그리고 R4와 R5는 존재하지 않는다.
상기 컨쥬게이트의 몇몇 실시형태에 있어서, R4-탄소와 R5-탄소 사이의 점선은 이중 결합이 아니고, n은　1이며, 그리고 R5는 하이드록실이다.
상기 컨쥬게이트의 몇몇 실시형태에 있어서, n은 2이고, R4-탄소와 R5-탄소 사이의 점선은 이중 결합이 아니며, R5는 존재하지 않는다.
상기 컨쥬게이트의 몇몇 실시형태에 있어서, X와 Y1 사이의 점선이 결합이므로, 변형된 아미노산 잔기는 하기 화학식을 가진다:
Figure pct00002
.
상기 컨쥬게이트의 몇몇 실시형태에 있어서, X와 Y1 사이의 점선이 결합이 아니므로, 변형된 아미노산 잔기는 하기 화학식을 가진다:
Figure pct00003
.
상기 컨쥬게이트의 몇몇 실시형태에 있어서, 검출 가능한 표지는 형광단(fluorophore)을 포함한다.
상기 컨쥬게이트의 몇몇 실시형태에 있어서, W1은 약물 또는 검출 가능한 표지이고, 그리고 W2는 폴리펩타이드이다.
상기 컨쥬게이트의 몇몇 실시형태에 있어서, W1은 폴리펩타이드이고, 그리고 W2는 약물 또는 검출 가능한 표지이다.
본 발명의 실시형태들은 하기 화학식의 화합물을 포함한다:
Figure pct00004
식 중,
R2는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고;
R3은 하이드록실, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 아실, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 치환된 헤테로사이클릴 및 -R9W로부터 선택되며;
R7은 수소, 하이드록실, 할로겐, 사이아노, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 아실, 카복실, 및 카복실 에스터로부터 선택되고;
R9는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되며; 그리고
W는 약물, 검출 가능한 표지 및 폴리펩타이드로부터 선택된다.
상기 화합물의 몇몇 실시형태에 있어서, R2는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다.
상기 화합물의 몇몇 실시형태에 있어서, R2는 메틸, t-뷰틸 또는 아릴이다.
상기 화합물의 몇몇 실시형태에 있어서, R3은 치환된 아릴이다.
상기 화합물의 몇몇 실시형태에 있어서, R3은 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아마이드, 치환된 아마이드, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 각각 독립적으로 선택된 1개 이상의 기로 치환된다.
상기 화합물의 몇몇 실시형태에 있어서, R3은 알킬아마이드 또는 치환된 알킬아마이드이다.
상기 화합물의 몇몇 실시형태에 있어서, R3은 -R9W이다.
상기 화합물의 몇몇 실시형태에 있어서, R7은 수소이다.
상기 화합물의 몇몇 실시형태에 있어서, R7은 할로겐이다.
상기 화합물의 몇몇 실시형태에 있어서, R7은 알킬 또는 치환된 알킬이다.
상기 화합물의 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 화합물은 4-(3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)벤조산(화합물 10); 3-(2-머캅토에틸)-1-메틸-1H-피라졸-5(4H)-온(화합물 A4); 3-(2-(2-(3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)에톡시)에톡시)프로판산(화합물 230); 퍼플루오로페닐 3-(2-(2-(3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)에톡시)에톡시)프로파노에이트(화합물 240); 또는 N-"카고"(cargo)-3-(2-(2-(3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)에톡시)에톡시) 프로판아마이드(화합물 250)이다.
본 발명의 실시형태들은 하기 화학식의 화합물을 포함한다:
Figure pct00005
식 중,
R2는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고;
R7은 수소, 하이드록실, 할로겐, 사이아노, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 아실, 카복실, 및 카복실 에스터로부터 선택되며;
R8은 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아마이드, 치환된 아마이드, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 치환된 헤테로사이클릴 및 -R9W로부터 선택되고;
R9는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되며; 그리고
W는 약물, 검출 가능한 표지 및 폴리펩타이드로부터 선택된다.
상기 화합물의 몇몇 실시형태에 있어서, R2는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다.
상기 화합물의 몇몇 실시형태에 있어서, R2는 메틸, t-뷰틸 또는 아릴이다.
상기 화합물의 몇몇 실시형태에 있어서, R7은 수소이다.
상기 화합물의 몇몇 실시형태에 있어서, R7은 할로겐이다.
상기 화합물의 몇몇 실시형태에 있어서, R7은 알킬 또는 치환된 알킬이다.
상기 화합물의 몇몇 실시형태에 있어서, R8은 -R9W이다.
본 발명의 실시형태들은 하기 화학식의 1종 이상의 화합물을 포함하는 컨쥬게이트를 포함한다:
Figure pct00006
식 중,
X1 및 X2는 각각 독립적으로 N 및 CH로부터 선택되고;
Y1 및 Y3은 각각 독립적으로 N 및 S로부터 선택되며;
Y2 및 Y4는 각각 독립적으로 N, O 및 S로부터 선택되고;
R2 및 R10은 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되며;
R3 및 R11은 각각 독립적으로 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실 아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고; 그리고
W1a, W1b 및 W2는 각각 독립적으로 약물, 검출 가능한 표지 및 폴리펩타이드로부터 선택된다.
상기 컨쥬게이트의 몇몇 실시형태에 있어서, Y1 및 Y3은 N이다.
상기 컨쥬게이트의 몇몇 실시형태에 있어서, R2 및 R10은 각각 독립적으로 알킬, 치환된 알킬, 아릴 및 치환된 아릴로부터 선택된다.
상기 컨쥬게이트의 몇몇 실시형태에 있어서, R2 및 R10은 각각 독립적으로 메틸, t-뷰틸 및 아릴로부터 선택된다.
상기 컨쥬게이트의 몇몇 실시형태에 있어서, Y2 및 Y4는 O이다.
상기 컨쥬게이트의 몇몇 실시형태에 있어서, W1a 및 W1b는 각각 독립적으로 약물 및 검출 가능한 표지로부터 선택되고, W2는 폴리펩타이드이다.
본 발명의 실시형태들은 컨쥬게이트를 제조하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 청구항 제14항의 화합물 및 반응성 기를 포함하는 제2 화합물을 반응 혼합물로 배합하는 단계를 포함하되, 여기서 배합은 상기 화합물과 제2 화합물의 반응성 기와의 반응을 촉진시키기는데 적합한 반응 조건 하에서 행해져 컨쥬게이트를 형성한다. 상기 방법은 반응 혼합물로부터 컨쥬게이트를 단리시키는 단계를 포함한다.
상기 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, R3은 -R9W이고, W는 약물 또는 검출 가능한 표지이며, 제2 화합물은 폴리펩타이드이다.
상기 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, R3은 -R9W이고, W는 폴리펩타이드이며, 제2 화합물은 약물 또는 검출 가능한 표지이다.
상기 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 반응성 기는 반응성 알데하이드기 또는 반응성 케톤기이다.
상기 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 반응 혼합물은 물을 포함한다.
상기 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 반응 혼합물은 pH 7을 지닌다.
상기 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 반응 조건은 37℃의 온도이다.
본 발명의 실시형태들은 본 명세서에 기재된 바와 같은 컨쥬게이트 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.
본 발명의 실시형태들은 컨쥬게이트를 대상체에게 전달하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 컨쥬게이트를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 실시형태들은 대상체의 병태를 치료하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 병태를 가진 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 여기서 상기 투여는 대상체의 병태를 치료하는데 효과적이다.
본 발명의 실시형태들은 하기 화학식의 화합물을 포함하는 컨쥬게이트를 포함한다:
Figure pct00007
식 중,
X는 N 또는 CH이고;
R3 및 R11은 각각 독립적으로 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 아실, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴 및 -R9W로부터 선택되며;
R7 및 R12는 각각 독립적으로 수소, 하이드록실, 할로겐, 사이아노, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 아실, 카복실, 및 카복실 에스터로부터 선택되고;
R9는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되며;
R13은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 아실, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드 및 -R14W로부터 선택되고;
R14는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되며; 그리고
W는 약물, 검출 가능한 표지 및 폴리펩타이드로부터 선택된다.
상기 컨쥬게이트의 몇몇 실시형태에 있어서, X는 N이다. 몇몇 실시형태에 있어서, X는 CH이다.
상기 컨쥬게이트의 몇몇 실시형태에 있어서, R3 및 R11은 각각 독립적으로 메틸 및 페닐로부터 선택된다.
상기 컨쥬게이트의 몇몇 실시형태에 있어서, R13은 H 또는 치환된 알킬이다.
도 1은 본 발명의 실시형태들에 따른 폴리펩타이드 컨쥬게이트의 개략도를 도시한다. 도 1A는 환식 커플링 모이어티를 포함하는 폴리펩타이드 컨쥬게이트의 제조용의 반응식을 도시한 도면이다. 도 1B는 비환식 커플링 모이어티를 포함하는 폴리펩타이드 컨쥬게이트의 제조용의 반응식을 도시한 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시형태들에 따른 알데하이드-보유 폼일글라이신(fGly) 잔기를 함유하는 펩타이드에 대한 작용화된 화합물의 반응성을 도시한다. 도 2A는 출발 물질(fGly 13량체 및 화합물 80)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 상이한 시점(1, 2, 4 및 5시간)에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다. 도 2B는 작용화된 화합물과 반응하는 알데하이드-태그된(즉, 표지된) 항체(aldehyde-tagged antibody)의 개략도이다.
도 3은 본 발명의 실시형태들에 따른 두 상이한 pH에서 알데하이드-보유 폼일글라이신(fGly) 잔기를 함유하는 펩타이드에 대한 작용화된 화합물의 반응성을 도시한다. 도 3a는 출발 물질(fGly 13량체 및 출발 물질 커플링 화합물(SM))에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 상이한 시점(pH 7.4 및 pH 4.6에서 2 및 24시간)에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다. 도 3b는 6량체 fGly 함유 펩타이드에 대한 SM의 이중 부가를 도시한다. 도 3c는 작용화된 화합물과 반응하는 알데하이드-표지된 항체의 개략도이다.
도 4는 본 발명의 실시형태들에 따른 알데하이드-표지된 항체의 컨쥬게이션을 도시한다. 도 4a는 화합물 C 또는 화합물 D를 이용해서 수행된 컨쥬게이션을 나타낸 개략도를 도시한다. 도 4b는 액체 크로마토그래피 다중 반응 모니터링 질량 분광법(LC-MRM-MS)에 의해 분석된 출발 물질 및 생성물 형성의 비를 도시한다. 화합물 D를 이용한 출발 물질의 소실은 화살표로 강조되어 있다. 화합물 C는 동일한 반응 조건 하에서 항체와 유의하게 반응하지 않았다.
도 5는 본 발명의 실시형태들에 따른 항체에 대한 검출 가능한 표지의 컨쥬게이션을 도시한다. 도 5a는 작용화된 검출 가능한 표지의 합성에 대한 반응식을 도시한다. 도 5b는 항체에 대한 작용화된 검출 가능한 표지의 컨쥬게이션 반응의 개략도를 도시한다. 도 5c는 반응의 결과를 나타내는 SDS-PAGE 겔의 이미지를 표시한다. SDS-PAGE는 표지된 중쇄를 경쇄로부터 분리하는데 이용되었다. 검출 가능한 표지의 컨쥬게이트는 형광 영상화에 의해 결정되었다.
도 6은 항체-검출 가능한 표지 컨쥬게이트의 안정성을 도시한다. 혈장 및 혈청에서 37℃에서 8일 후에 컨쥬게이트가 소실되지 않았다.
도 7은 본 발명의 실시형태들에 따른 알데하이드-표지된 항체(A)의 소수성 상호작용 칼럼(hydrophobic interaction column: HIC) 자취를 도시한다(도 7, 상부 패널). 알데하이드-표지된 항체(A)는, 2.5% DMA를 이용해서, pH 7, 37℃에서 PBS 중 Pz-2PEG-메이탄신(Maytansine)과 반응되었다. 반응 혼합물은 24시간 후에 소수성 상호작용 칼럼(HIC)에 의해 분석되었다(도 7, 하부 패널). 모노-컨쥬게이트(B)와 다이-컨쥬게이트(D) 단백질 컨쥬게이트 둘 모두가 관찰되었다.
도 8a는 출발 물질(fGly 12량체 및 화합물 A4)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 상이한 시점(3 및 15시간)에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다. 도 8b는 컨쥬게이션 반응으로부터 생성물 I2의 LC-MS/MS 분석이다. 도 8c는 컨쥬게이션 반응으로부터의 생성물 I3의 LC-MS/MS 분석이다. 도 8d는 컨쥬게이션 반응으로부터의 생성물 I4의 LC-MS/MS 분석이다.
도 9a는 출발 물질(fGly 12량체 및 화합물 C3)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 상이한 시점(4 및 16시간)에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다. 도 9b 및 도 9c는 컨쥬게이션 반응으로부터의 생성물 C4의 LC-MS/MS 분석이다.
도 10a는 출발 물질(fGly 12량체 및 화합물 D1)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 시간 경과에 따른 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다. 도 10b 및 도 10c는 컨쥬게이션 반응으로부터의 이중 부가 생성물의 LC-MS/MS 분석이다. 도 10d는 컨쥬게이션 반응으로부터의 단일 부가 생성물의 LC-MS/MS 분석이다.
도 11a는 출발 물질(fGly 12량체 및 화합물 G1)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 0.5, 5 및 10시간에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다. 도 11b는 컨쥬게이션 반응으로부터의 이중 부가 생성물의 LC-MS/MS 분석이다.
도 12a는 출발 물질(fGly 12량체 및 화합물 H1)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 1, 5.5 및 10시간에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다. 도 12b는 컨쥬게이션 반응으로부터의 이중 부가 생성물의 LC-MS/MS 분석이다.
도 13a는 출발 물질(fGly 12량체 및 디메돈)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 상이한 시점(1.5, 11.5 및 48시간)에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다. 도 13b는 컨쥬게이션 반응으로부터의 이중 부가 생성물의 LC-MS/MS 분석이다.
도 14a는 출발 물질(fGly 12량체 및 멜드럼의 산(Meldrum's acid))에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 상이한 시점(2 및 14시간)에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다. 도 14b는 컨쥬게이션 반응으로부터의 단일 부가 생성물의 LC-MS/MS 분석이다.
도 15a는 출발 물질(fGly 12량체 및 바비투르산)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 상이한 시점(2, 6.5 및 10시간)에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다. 도 15b 내지 도 15d는 컨쥬게이션 반응으로부터의 단일 부가 생성물의 LC-MS/MS 분석이다.
도 16은 출발 물질(fGly 12량체 및 테트론산)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 상이한 시점(2.5 및 14.5시간)에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다.
도 17은 출발 물질(fGly 12량체 및 4-하이드록시-6-메틸-2-피론)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 상이한 시점(1.5 및 13.5시간)에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다.
도 18은 출발 물질(fGly 12량체 및 2(5H)-퓨라논)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 상이한 시점(1.5, 6 및 10시간)에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다.
도 19는 출발 물질(fGly 12량체 및 (페닐설포닐)아세토나이트릴)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 상이한 시점(0.5 및 12.5시간)에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다.
도 20은 출발 물질(fGly 12량체 및 나이트로메틸 페닐 설폰)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 상이한 시점(1 및 13시간)에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다.
도 21은 C-말단 알데하이드-표지된 항체의 경쇄와 Pz의 반응이 없는 것을 나타내는 MS 데이터를 도시한다(상부 패널). 도 21(하부 패널)은 주된 생성물이 항체의 중쇄 상의 이중 부가인 것을 도시한다.
도 22는 5.5시간 후에 티오-Pz-2PEG-메이탄신 및 알데하이드-표지된 항체의 반응의 소수성 상호작용 칼럼(HIC) 자취를 도시한다.
도 23은 티오-Pz-2PEG-메이탄신과 컨쥬게이트된 IgG의 LC-MS 분석을 도시한 것이다.
정의
이하의 용어들은 달리 표시되지 않는 한 이하의 의미를 가진다. 임의의 정의되지 않은 용어들은 당업계에 인정된 의미를 가진다.
"알킬"은 1 내지 10개의 탄소 원자, 예컨대, 1 내지 6개의 탄소 원자, 또는 1 내지 5, 또는 1 내지 4, 또는 1 내지 3개의 탄소 원자를 가지는 1가의 포화 지방족 하이드로카빌기를 지칭한다. 이 용어는, 예로서, 메틸(CH3-), 에틸(CH3CH2-), n-프로필(CH3CH2CH2-), 아이소프로필((CH3)2CH-), n-뷰틸(CH3CH2CH2CH2-), 아이소뷰틸((CH3)2CHCH2-), sec-뷰틸((CH3)(CH3CH2)CH-), t-뷰틸((CH3)3C-), n-펜틸(CH3CH2CH2CH2CH2-) 및 네오펜틸((CH3)3CCH2-) 등과 같은 직쇄 및 분지쇄의 하이드로카빌을 포함한다.
"치환된 알킬"이란 용어는, 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 사이아노, 할로겐, 하이드록실, 옥소, 티오케토, 카복실, 카복실알킬, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로사이클로옥시, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 하이드록시아미노, 알콕시아미노, 나이트로, -SO-알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-아릴, -SO2-헤테로아릴 및 -NRaRb(여기서 R' 및 R"은 동일 혹은 상이할 수 있고, 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 사이클로알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로사이클릭로부터 선택됨)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 5개의 치환체를 가진 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬기를 지칭하되, 여기서 알킬 사슬 중의 1개의 이상의 탄소 원자는 -O-, -N-, -S-, -S(O)n-(여기서 n은 0 내지 2임), -NR-(여기서 R은 수소 또는 알킬임) 등과 같은 헤테로원자로 선택적으로 치환되어 있다.
"알킬렌"은, -O-, -NR10-, -NR10C(O)-, -C(O)NR10- 등으로부터 선택된 1개 이상의 기가 선택적으로 개입되어 있고, 직쇄 혹은 분지쇄인, 1 내지 6개, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개의 탄소 원자를 가지는 2가의 지방족 하이드로카빌기를 지칭한다. 이 용어는, 예로서, 메틸렌(-CH2-), 에틸렌(-CH2CH2-), n-프로필렌(-CH2CH2CH2-), 아이소-프로필렌(-CH2CH(CH3)-), (-C(CH3)2CH2CH2-), (-C(CH3)2CH2C(O)-), (-C(CH3)2CH2C(O)NH-), (-CH(CH3)CH2-) 등을 포함한다.
"치환된 알킬렌"이란, 1 내지 3개의 수소가 이하에 "치환된"의 정의에서 탄소에 대해서 정의된 바와 같은 치환체로 대체된 알킬렌기를 지칭한다.
"알칸"이란 용어는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬기 및 알킬렌기를 지칭한다.
"알킬아미노알킬", "알킬아미노알켄일" 및 "알킬아미노알킨일"이란 용어는 R'NHR"-기를 지칭하되, 여기서 R'은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬기이고 R"은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬렌, 알켄일렌 또는 알킨일렌기이다.
"알크아릴" 또는 "아르알킬"이란 용어는 -알킬렌-아릴 및 -치환된 알킬렌-아릴기를 지칭하되, 여기서 알킬렌, 치환된 알킬렌 및 아릴은 본 명세서에서 정의되어 있다.
"알콕시"는 -O-알킬기를 지칭하되, 여기서 알킬은 본 명세서에서 정의된 바와 같다. 알콕시는, 예로서, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 아이소프로폭시, n-뷰톡시, t-뷰톡시, sec-뷰톡시, n-펜톡시 등을 포함한다. "알콕시"란 용어는 또한 알켄일-O-, 사이클로알킬-O-, 사이클로알켄일-O- 및 알킨일-O-기를 지칭하고, 여기서 알켄일, 사이클로알킬, 사이클로알켄일 및 알킨일은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"치환된 알콕시"란 용어는 치환된 알킬-O-, 치환된 알켄일-O-, 치환된 사이클로알킬-O-, 치환된 사이클로알켄일-O- 및 치환된 알킨일-O-기를 지칭하되, 여기서 치환된 알킬, 치환된 알켄일, 치환된 사이클로알킬, 치환된 사이클로알켄일 및 치환된 알킨일은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"알콕시아미노"란 용어는 -NH-알콕시기를 지칭하되, 여기서 알콕시는 본 명세서에서 정의되어 있다.
"할로알콕시"란 용어는, 알킬기 상의 1개 이상의 수소 원자가 할로기로 치환되어 있는 알킬-O-기를 지칭하고, 예로서, 트라이플루오로메톡시 등과 같은 기를 포함한다.
"할로알킬"이란 용어는, 알킬기 상의 1개 이상의 수소 원자가 할로기로 치환되어 있는, 위에서 기재된 바와 같은 치환된 알킬기를 지칭한다. 이러한 기의 예는, 제한 없이, 플루오로알킬기, 예컨대, 트라이플루오로메틸, 다이플루오로메틸, 트라이플루오로에틸 등을 포함한다.
"알킬알콕시"란 용어는, -알킬렌-O-알킬, 알킬렌-O-치환된 알킬, 치환된 알킬렌-O-알킬 및 치환된 알킬렌-O-치환된 알킬기를 지칭하되, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알킬렌 및 치환된 알킬렌은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"알킬티오알콕시"란 용어는 -알킬렌-S-알킬, 알킬렌-S-치환된 알킬, 치환된 알킬렌-S-알킬 및 치환된 알킬렌-S-치환된 알킬기를 지칭하되, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알킬렌 및 치환된 알킬렌은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"알켄일"이란, 2 내지 6개의 탄소 원자, 바람직하게는 2 내지 4개의 탄소 원자를 지니고 또한 적어도 1개, 바람직하게는 1 내지 2개 부위의 이중 결합 불포화 부분을 지니는 직쇄 또는 분지쇄 하이드로카빌기를 지칭한다. 이 용어는, 예로서, 바이-비닐, 알릴 및 뷰트-3-엔-1-일을 포함한다. 이 용어 내에는 시스 및 트랜스 이성질체 또는 이들 이성질체의 혼합물이 포함된다.
"치환된 알켄일"이란 용어는, 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 사이아노, 할로겐, 하이드록실, 옥소, 티오케토, 카복실, 카복실알킬, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로사이클로옥시, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 하이드록시아미노, 알콕시아미노, 나이트로, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴 및 -SO2-헤테로아릴로부터 선택된 1 내지 5개의 치환체 또는 1 내지 3개의 치환체를 지니는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알켄일기를 지칭한다.
"알킨일"이란, 2 내지 6개의 탄소 원자, 바람직하게는 2 내지 3개의 탄소 원자를 지니고 또한 적어도 1개, 바람직하게는 1 내지 2개 부위의 삼중 고리 불포화 부분을 지니는, 직쇄 혹은 분지쇄의 1가 하이드로카빌기를 지칭한다. 이러한 알킨일기의 예는 아세틸렌일(-C=CH) 및 프로파길(-CH2C=CH)을 포함한다.
"치환된 알킨일"이란 용어는, 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 사이아노, 할로겐, 하이드록실, 옥소, 티오케토, 카복실, 카복실알킬, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로사이클로옥시, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 하이드록시아미노, 알콕시아미노, 나이트로, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴 및 -SO2-헤테로아릴로부터 선택된 1 내지 5개의 치환체 또는 1 내지 3개의 치환체를 지니는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킨일기를 지칭한다.
"알킨일옥시"란 -O-알킨일기를 지칭하되, 여기서 알킨일은 본 명세서에서 정의된 바와 같다. 알킨일옥시는, 예로서, 에틴일옥시, 프로핀일옥시 등을 포함한다.
"아실"이란 H-C(O)-, 알킬-C(O)-, 치환된 알킬-C(O)-, 알켄일-C(O)-, 치환된 알켄일-C(O)-, 알킨일-C(O)-, 치환된 알킨일-C(O)-, 사이클로알킬-C(O)-, 치환된 사이클로알킬-C(O)-, 사이클로알켄일-C(O)-, 치환된 사이클로알켄일-C(O)-, 아릴-C(O)-, 치환된 아릴-C(O)-, 헤테로아릴-C(O)-, 치환된 헤테로아릴-C(O)-, 헤테로사이클릴-C(O)- 및 치환된 헤테로사이클릴-C(O)-기를 지칭하되, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, 및 치환된 헤테로사이클릭은 본 명세서에서 정의된 바와 같다. 예를 들어, 아실은 "아세틸"기 CH3C(O)-기를 포함한다.
"아실아미노"란 -NR20C(O)알킬, -NR20C(O)치환된 알킬, NR20C(O)사이클로알킬, -NR20C(O)치환된 사이클로알킬, -NR20C(O)사이클로알켄일, -NR20C(O)치환된 사이클로알켄일, -NR20C(O)알켄일, -NR20C(O)치환된 알켄일, -NR20C(O)알킨일, -NR20C(O)치환된 알킨일, -NR20C(O)아릴, -NR20C(O)치환된 아릴, -NR20C(O)헤테로아릴, -NR20C(O)치환된 헤테로아릴, -NR20C(O)헤테로사이클릭 및 -NR20C(O)치환된 헤테로사이클릭기를 지칭하되, 여기서 R20은 수소 또는 알킬이고, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, 및 치환된 헤테로사이클릭은 본 명세서에 정의된 바와 같다.
"아미노카보닐" 또는 "아미노아실"이란 용어는 -C(O)NR21R22기를 지칭하되, 여기서 R21 및 R22는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릭 및 치환된 헤테로사이클릭으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이때 R21 및 R22는 이들에 결합된 질소와 함께 선택적으로 연결되어 헤테로사이클릭 또는 치환된 헤테로사이클릭기를 형성하고, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, 및 치환된 헤테로사이클릭은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"아미노카보닐아미노"란 -NR21C(O)NR22R23기를 지칭하되, 여기서 R21, R22 및 R23은 독립적으로 수소, 알킬, 아릴 또는 사이클로알킬로부터 선택되거나, 또는 2개의 R기가 연결되어 헤테로사이클릴기를 형성한다.
"알콕시카보닐아미노"란 용어는 -NRC(O)OR기를 지칭하되, 여기서 각각의 R은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클릴이고, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로사이클릴은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"아실옥시"란 용어는 알킬-C(O)O-, 치환된 알킬-C(O)O-, 사이클로알킬-C(O)O-, 치환된 사이클로알킬-C(O)O-, 아릴-C(O)O-, 헤테로아릴-C(O)O- 및 헤테로사이클릴-C(O)O-기를 지칭하되, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로사이클릴은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"아미노설포닐"이란 -SO2NR21R22기를 지칭하되, 여기서 R21 및 R22는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, 치환된 헤테로사이클릭으로 이루어진 군으로부터 선택되고, R21 및 R22는 이들에 결합된 질소와 함께 선택적으로 연결되어 헤테로사이클릭 또는 치환된 헤테로사이클릭기를 형성하며, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릭 및 치환된 헤테로사이클릭은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"설포닐아미노"란 -NR21SO2R22기를 지칭하되, 여기서 R21 및 R22는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, 및 치환된 헤테로사이클릭으로 이루어진 군으로부터 선택되고, R21 및 R22는 이들에 결합된 원자들과 함께 선택적으로 연결되어 헤테로사이클릭 또는 치환된 헤테로사이클릭기를 형성하며, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, 및 치환된 헤테로사이클릭은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"아릴" 또는 "Ar"이란, 단일 고리(예컨대, 페닐기에 존재하는) 또는 축합된 고리가 방향족일 수 있거나 방향족이 아닐 수 있는 다수의 축합된 고리를 지니는 고리계(이러한 방향족 고리계의 예는 나프틸, 안트릴 및 인단일을 포함함)를 지니되, 단 부착점은 방향족 고리의 원자를 통하는 것인, 6 내지 18개의 탄소 원자의 1가 방향족 탄소환기를 지칭한다. 이 용어는, 예로서, 페닐 및 나프틸을 포함한다. 달리 아릴 치환체에 대한 정의에 의해 구속되는 일 없이, 이러한 아릴기는, 선택적으로, 아실옥시, 하이드록시, 티올, 아실, 알킬, 알콕시, 알켄일, 알킨일, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 알킬, 치환된 알콕시, 치환된 알켄일, 치환된 알킨일, 치환된 사이클로알킬, 치환된 사이클로알켄일, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아실아미노, 알크아릴, 아릴, 아릴옥시, 아지도, 카복실, 카복실알킬, 사이아노, 할로겐, 나이트로, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 아미노아실옥시, 옥시아실아미노, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴, -SO2-헤테로아릴 및 트라이할로메틸로부터 선택된 1 내지 5개의 치환체, 또는 1 내지 3개의 치환체로 치환될 수 있다.
"아릴옥시"란 -O-아릴기를 지칭하되, 여기서 아릴은 본 명세서에서 정의된 바와 같고, 예로서, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 선택적으로 치환된 아릴기를 포함하는, 페녹시, 나프톡시 등을 포함한다.
"아미노"란 -NH2기를 지칭한다.
"치환된 아미노"란 용어는 -NRR기를 지칭하며, 여기서 각각의 R은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되되, 단 적어도 하나의 R은 수소가 아니다.
"아지도"란 용어는 -N3기를 지칭한다.
"카복실," "카복시" 또는 "카복실레이트"란 -CO2H 또는 그의 염을 지칭한다.
"카복실 에스터" 또는 "카복시 에스터" 또는 "카복시알킬" 또는 "카복실알킬"이란 용어는, -C(O)O-알킬, -C(O)O-치환된 알킬, -C(O)O-알켄일, -C(O)O-치환된 알켄일, -C(O)O-알킨일, -C(O)O-치환된 알킨일, -C(O)O-아릴, -C(O)O-치환된 아릴, -C(O)O-사이클로알킬, -C(O)O-치환된 사이클로알킬, -C(O)O-사이클로알켄일, -C(O)O-치환된 사이클로알켄일, -C(O)O-헤테로아릴, -C(O)O-치환된 헤테로아릴, -C(O)O-헤테로사이클릭, 및 -C(O)O-치환된 헤테로사이클릭기를 지칭하되, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, 및 치환된 헤테로사이클릭은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"(카복실 에스터)옥시" 또는 "카보네이트"란 -O-C(O)O-알킬, -O-C(O)O-치환된 알킬, -O-C(O)O-알켄일, -O-C(O)O-치환된 알켄일, -O-C(O)O-알킨일, -O-C(O)O-치환된 알킨일, -O-C(O)O-아릴, -O-C(O)O-치환된 아릴, -O-C(O)O-사이클로알킬, -O-C(O)O-치환된 사이클로알킬, -O-C(O)O-사이클로알켄일, -O-C(O)O-치환된 사이클로알켄일, -O-C(O)O-헤테로아릴, -O-C(O)O-치환된 헤테로아릴, -O-C(O)O-헤테로사이클릭 및 -O-C(O)O-치환된 헤테로사이클릭기를 지칭하되, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, 및 치환된 헤테로사이클릭은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"사이아노" 또는 "나이트릴"이란 -CN기를 지칭한다.
"사이클로알킬"이란 융합(즉, 축합), 브리지 및 스피로 고리계를 포함하는, 단일 또는 다수의 환식 고리를 지니는 3 내지 10개의 탄소 원자의 환식 알킬기를 지칭한다. 적절한 사이클로알킬기의 예는, 예를 들어, 아다만틸, 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로옥틸 등을 포함한다. 이러한 사이클로알킬기는, 예로서, 단일 고리 구조, 예컨대, 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로옥틸 등, 또는 다중 고리 구조, 예컨대, 아다만탄일 등을 포함한다.
"치환된 사이클로알킬"이란 용어는, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 사이아노, 할로겐, 하이드록실, 옥소, 티오케토, 카복실, 카복실알킬, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로사이클로옥시, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 하이드록시아미노, 알콕시아미노, 나이트로, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴 및 -SO2-헤테로아릴로부터 선택된 1 내지 5개의 치환체, 또는 1 내지 3개의 치환체를 지니는 사이클로알킬기를 지칭한다.
"사이클로알켄일"이란 단일 또는 다수의 고리를 지니고 또한 적어도 1개의 이중 결합, 바람직하게는 1 내지 2개의 이중 결합을 지니는 3 내지 10개의 탄소 원자의 비방향족 환식 알킬기를 지칭한다.
"치환된 사이클로알켄일"이란 용어는, 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 사이아노, 할로겐, 하이드록실, 케토, 티오케토, 카복실, 카복실알킬, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로사이클로옥시, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 하이드록시아미노, 알콕시아미노, 나이트로, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴 및 -SO2-헤테로아릴로부터 선택된 1 내지 5개의 치환체, 또는 1 내지 3개의 치환체를 지니는 사이클로알켄일기를 지칭한다.
"사이클로알킨일"이란, 단일 또는 다수의 고리를 지니고 또한 적어도 1개의 삼중 고리를 지니는 5 내지 10 탄소 원자의 비방향족 사이클로알킬기를 지칭한다.
"사이클로알콕시"란 -O-사이클로알킬을 지칭한다.
"사이클로알켄일옥시"란 -O-사이클로알켄일을 지칭한다.
"할로" 또는 "할로겐"이란 플루오로, 클로로, 브로모 및 아이오도를 지칭한다.
"하이드록시" 또는 "하이드록실"이란 -OH기를 지칭한다.
"헤테로아릴"이란 고리 내에 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 10개의 헤테로원자와 1 내지 15개의 탄소 원자, 예컨대, 1 내지 10개의 탄소 원자를 지니는 방향족기를 지칭한다. 이러한 헤테로아릴기는 고리계 내에 단일 고리(예컨대, 피리딘일, 이미다졸릴 또는 퓨릴) 또는 다수의 축합 고리(예를 들어, 인돌리진일, 퀴놀린일, 벤조퓨란, 벤즈이미다졸릴 또는 벤조티엔일 등과 같은 기에서처럼)를 지닐 수 있으며, 여기서 고리계 내의 적어도 1개의 고리는 방향족이고, 고리계 내의 적어도 1개의 고리는 방향족이되, 단 부착점은 방향족 고리의 원자를 통하는 것이다. 소정의 실시형태에 있어서, 헤테로아릴기의 질소 및/또는 황 고리 원자(들)는 선택적으로 산화되어 N-옥사이드(N→O), 설피닐 또는 설포닐 모이어티를 제공한다. 이 용어는, 예로서, 피리딘일, 피롤릴, 인돌릴, 티오페닐 및 퓨란일을 포함한다. 달리 헤테로아릴 치환체에 대한 정의로 구속되지 않는 한, 이러한 헤테로아릴기는 아실옥시, 하이드록시, 티올, 아실, 알킬, 알콕시, 알켄일, 알킨일, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 알킬, 치환된 알콕시, 치환된 알켄일, 치환된 알킨일, 치환된 사이클로알킬, 치환된 사이클로알켄일, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아실아미노, 알크아릴, 아릴, 아릴옥시, 아지도, 카복실, 카복실알킬, 사이아노, 할로겐, 나이트로, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 아미노아실옥시, 옥시아실아미노, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴 및 -SO2-헤테로아릴 및 트라이할로메틸로부터 선택된 1 내지 5개의 치환체, 또는 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환될 수 있다.
"헤테로아르알킬"이란 용어는 -알킬렌-헤테로아릴기를 지칭하되, 여기서 알킬렌 및 헤테로아릴은 본 명세서에서 정의되어 있다. 이 용어는, 예로서, 피리딜메틸, 피리딜에틸, 인돌릴메틸 등을 포함한다.
"헤테로아릴옥시"란 -O-헤테로아릴을 지칭한다.
"복소환"(헤테로사이클) "헤테로사이클릭," "헤테로사이클로알킬" 및 "헤테로사이클릴"이란 단일 고리 또는 축합된, 브리지된 및 스피로 고리를 포함하는 다수의 축합 고리를 지니고 또한 1 내지 10개의 헤테로 원자를 포함하는 3 내지 20개의 고리 원자를 지니는 포화 혹은 불포화기를 지칭한다. 이들 고리 원자는 질소, 황 또는 산소로 이루어진 군으로부터 선택되되, 여기서, 축합된 고리계에서, 고리들 중 1개 이상은 사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴일 수 있고, 단 부착점은 비방향족 고리를 통하는 것이다. 소정의 실시형태에 있어서, 헤테로사이클릭기의 질소 및/또는 황 원자(들)는 선택적으로 산화되어 N-옥사이드, -S(O)- 또는 -SO2- 모이어티를 제공한다.
복호환 및 헤테로아릴의 예는, 아제티딘, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 피리다진, 인돌리진, 아이소인돌, 인돌, 다이하이드로인돌, 인다졸, 퓨린, 퀴놀리진, 아이소퀴놀린, 퀴놀린, 프탈라진, 나프틸피리딘, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 신놀린, 프테리딘, 카바졸, 카볼린, 페난트리딘, 아크리딘, 페난트롤린, 아이소티아졸, 페나진, 아이소옥사졸, 페녹사진, 페노티아진, 이미다졸리딘, 이미다졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌린, 프탈이미드, 1,2,3,4-테트라하이드로아이소퀴놀린, 4,5,6,7-테트라하이드로벤조[b]티오펜, 티아졸, 티아졸리딘, 티오펜, 벤조[b]티오펜, 몰폴리닐, 티오몰폴리닐(또한 티아몰폴리닐이라고도 지칭됨), 1,1-다이옥소티오몰폴리닐, 피페리딘일, 피롤리딘, 테트라하이드로퓨란일 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
달리 헤테로사이클릭 치환체에 대한 정의로 구속되지 않는 한, 이러한 헤테로사이클릭기는, 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 사이아노, 할로겐, 하이드록실, 옥소, 티오케토, 카복실, 카복실알킬, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로사이클로옥시, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 하이드록시아미노, 알콕시아미노, 나이트로, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴, -SO2-헤테로아릴 및 축합된 복소환으로부터 선택된 1 내지 5개 또는 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환될 수 있다.
"헤테로사이클릴옥시"란 -O-헤테로사이클릴기를 지칭한다.
"헤테로사이클릴티오"란 용어는 헤테로사이클릭-S-기를 지칭한다.
"헤테로사이클렌"이란 용어는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 복소환으로부터 형성된 이중라디칼을 지칭한다.
"하이드록시아미노"란 용어는 -NHOH기를 지칭한다.
"나이트로"란 -NO2기를 지칭한다.
"옥소"란 원자(=O)를 지칭한다.
"설포닐"이란 SO2-알킬, SO2-치환된 알킬, SO2-알켄일, SO2-치환된 알켄일, SO2-사이클로알킬, SO2-치환된 사이클로알킬, SO2-사이클로알켄일, SO2-치환된 사이클로알켄일, SO2-아릴, SO2-치환된 아릴, SO2-헤테로아릴, SO2-치환된 헤테로아릴, SO2-헤테로사이클릭 및 SO2-치환된 헤테로사이클릭기를 지칭하되, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, 및 치환된 헤테로사이클릭은 본 명세서에서 정의된 바와 같다. 설포닐은, 예로서, 메틸-SO2-, 페닐-SO2- 및 4-메틸페닐-SO2-를 포함한다.
"설포닐옥시"란 -OSO2-알킬, OSO2-치환된 알킬, OSO2-알켄일, OSO2-치환된 알켄일, OSO2-사이클로알킬, OSO2-치환된 사이클로알킬, OSO2-사이클로알켄일, OSO2-치환된 사이클로알켄일, OSO2-아릴, OSO2-치환된 아릴, OSO2-헤테로아릴, OSO2-치환된 헤테로아릴, OSO2-헤테로사이클릭 및 OSO2 치환된 헤테로사이클릭기를 지칭하되, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, 및 치환된 헤테로사이클릭은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"아미노카보닐옥시"란 용어는 -OC(O)NRR기를 지칭하되, 여기서 각각의 R은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클릭이고, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로사이클릭은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"티올"이란 -SH기를 지칭한다.
"티오옥소" 또는 "티오케토"란 용어는 원자(=S)를 지칭한다.
"알킬티오" 또는 "티오알콕시"란 용어는 -S-알킬기를 지칭하되, 여기서 알킬은 본 명세서에서 정의된 바와 같다. 소정의 실시형태에 있어서, 황은 -S(O)-로 산화될 수 있다. 설폭사이드는 1개 이상의 입체이성질체로서 존재할 수 있다.
"치환된 티오알콕시"란 용어는 -S-치환된 알킬기를 지칭한다.
"티오아릴옥시"란 용어는 아릴-S-기를 지칭하되, 여기서 아릴기는 본 명세서에서 정의된 바와 같고, 예를 들어, 또한 본 명세서에서 정의된 바와 같은 선택적으로 치환된 아릴기를 포함한다.
"티오헤테로아릴옥시"란 용어는 헤테로아릴-S-기를 지칭하되, 여기서 헤테로아릴기는 본 명세서에서 정의된 바와 같으며, 예를 들어, 또한 본 명세서에서 정의된 바와 같은 선택적으로 치환된 아릴기를 포함한다.
"티오헤테로사이클로옥시"란 용어는 헤테로사이클릴-S-기를 지칭하되, 여기서 헤테로사이클릴기는 본 명세서에서 정의된 바와 같으며, 예를 들어, 또한 본 명세서에서 정의된 바와 같은 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴기를 포함한다.
본 명세서의 개시에 부가해서, "치환된"이란 용어는, 특정 기 혹은 라디칼을 변형시키기기 위하여 이용될 경우, 또한 특정된 기 혹은 라디칼의 1개 이상의 수소 원자가 각각 서로 독립적으로, 이하에 정의된 바와 같이, 동일 또는 상이한 치환기로 대체되는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 개별적인 용어에 관하여 개시된 기들에 부가해서, 특정 기 혹은 라디칼 내의 포화된 탄소 원자 상의 1개 이상의 수소(탄일 탄소 상의 임의의 2개의 수소가 =O, =NR70, =N-OR70, =N2 또는 =S로 대체될 수 있음)를 치환하기 위한 치환기는, 달리 특정되지 않는 한, -R60, 할로, =O, -OR70, -SR70, -NR80R80, 트라이할로메틸, -CN, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, =N2, -N3, -SO2R70, -SO2O-M+, -SO2OR70, -OSO2R70, -OSO2O-M+ -OSO2OR70, -P(O)(O-)2(M+)2, -P(O)(OR70)O-M+, -P(O)(OR70) 2, -C(O)R70, -C(S)R70, -C(NR70)R70, -C(O)O-M+, -C(O)OR70, -C(S)OR70, -C(O)NR80R80, -C(NR70)NR80R80, -OC(O)R70, -OC(S)R70, -OC(O)O-M+, -OC(O)OR70, -OC(S)OR70, -NR70C(O)R70, -NR70C(S)R70, -NR70CO2 -M+, -NR70CO2R70, -NR70C(S)OR70, -NR70C(O)NR80R80, -NR70C(NR70)R70 및 -NR70C(NR70)NR80R80이고, 여기서 R60은 선택적으로 치환된 알킬, 사이클로알킬, 헤테로알킬, 헤테로사이클로알킬알킬, 사이클로알킬알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴 및 헤테로아릴알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며, 각각의 R70은 독립적으로 수소 또는 R60이고; 각각의 R80은 독립적으로 R70이거나 또는 대안적으로 2개의 R80'은, 이들에 결합되는 질소 원자와 함께, O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 동일 혹은 상이한 추가적인 헤테로원자 1 내지 4개를 선택적으로 포함할 수 있는 5-, 6- 또는 7-원 헤테로사이클로알킬을 형성하고, 여기서 N은 -H 또는 C1-C3 알킬 치환을 지닐 수 있고; 각각의 M+는 단일의 알짜 양전하를 지니는 상대 이온이다. 각각의 M+는 독립적으로, 예를 들어, 알칼리 이온, 예컨대, K+, Na+, Li+; 암모늄 이온, 예컨대, +N(R60)4; 또는 알칼리 토류 이온, 예컨대, [Ca2+]0.5, [Mg2+]0.5, 또는 [Ba2+]0.5("아래첨자 0.5는 이러한 2가의 알칼리 토류 이온에 대한 상대 이온들 중 하나가 본 발명의 화합물의 이온화된 형태일 수 있고, 다른 하나가 클로라이드 등과 같은 전형적인 상대 이온일 수 있거나, 또는 본 명세서에 개시된 두 이온화된 화합물이 이러한 2가의 알칼리 토류 이온에 대한 상대 이온으로서 역할할 수 있거나, 또는 본 발명의 이중으로 이온화된 화합물이 이러한 2가의 알칼리 토류 이온에 대한 상대 이온으로서 역할할 수 있는 것을 의미함)일 수 있다. 구체적인 예로서, -NR80R80은 -NH2, -NH-알킬, N-피롤리딘일, N-피페라진일, 4N-메틸-피페라진-1-일 및 N-몰폴리닐을 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서의 개시에 부가해서, "치환된" 알켄, 알킨, 아릴 및 헤테로아릴기 내의 불포화 탄소 원자 상의 수소에 대한 치환기는, 달리 특정되지 않는 한, -R60, 할로, -O-M+, -OR70, -SR70, -S-M+, -NR80R80, 트라이할로메틸, -CF3, -CN, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, -N3, -SO2R70, -SO3 -M+, -SO3R70, -OSO2R70, -OSO3 -M+, -OSO3R70, -PO3 -2(M+)2, -P(O)(OR70)O-M+, -P(O)(OR70)2, -C(O)R70, -C(S)R70, -C(NR70)R70, -CO2 -M++, -CO2R70, -C(S)OR70, -C(O)NR80R80, -C(NR70)NR80R80, -OC(O)R70, -OC(S)R70, -OCO2 -M+, -OCO2R70, -OC(S)OR70, -NR70C(O)R70, -NR70C(S)R70, -NR70CO2 -M+, -NR70CO2R70, -NR70C(S)OR70, -NR70C(O)NR80R80, -NR70C(NR70)R70 및 -NR70C(NR70)NR80R80이되, 여기서 R60, R70, R80 및 M+는 앞에서 정의된 바와 같으며, 단, 치환된 알켄 또는 알킨의 경우에, 치환체는 -O-M+, -OR70, -SR70 또는 -S-M+가 아니다.
본 명세서에서 개별적인 용어에 관하여 개시된 기들에 부가해서, "치환된" 헤테로알킬 및 사이클로헤테로알킬기 내의 질소 원자 상의 수소에 대한 치환기는, 달리 특정되지 않는 한, -R60, -O-M+, -OR70, -SR70, -S-M+, -NR80R80, 트라이할로메틸, -CF3, -CN, -NO, -NO2, -S(O)2R70, -S(O)2O-M+, -S(O)2OR70, -OS(O)2R70, -OS(O)2O-M+, -OS(O)2OR70, -P(O)(O-)2(M+)2, -P(O)(OR70)O-M+, -P(O)(OR70)(OR70), -C(O)R70, -C(S)R70, -C(NR70)R70, -C(O)OR70, -C(S)OR70, -C(O)NR80R80, -C(NR70)NR80R80, -OC(O)R70, -OC(S)R70, -OC(O)OR70, -OC(S)OR70, -NR70C(O)R70, -NR70C(S)R70, -NR70C(O)OR70, -NR70C(S)OR70, -NR70C(O)NR80R80, -NR70C(NR70)R70 및 -NR70C(NR70)NR80R80이고, 이때 R60, R70, R80 및 M+는 앞에서 정의된 바와 같다.
본 명세서에서의 개시에 부가해서, 소정의 실시형태에 있어서, 치환되는 기는 1, 2, 3 또는 4개의 치환체, 1, 2 또는 3개의 치환체, 1 또는 2개의 치환체, 또는 1개의 치환체를 지닌다.
위에서 정의된 모든 치환된 기에서, 그 지체로 추가의 치환체를 지니는 치환체들을 정의함으로써(예컨대, 자체로 치환된 아릴기로 치환된 치환체로서 치환된 아릴기를 지니는 치환된 아릴, 이때 상기 치환된 아릴기는 치환된 아릴기 등으로 더욱 치환됨) 도달하게 되는 중합체가 본 명세서에서 내포를 위하여 의도된 것은 아님을 이해해야 한다. 이러한 경우에, 이러한 치환의 최대 개수는 3개이다. 예를 들어, 본 명세서에서 구체적으로 상정된 치환된 아릴기의 일련의 치환은 치환된 아릴-(치환된 아릴)-치환된 아릴로 제한된다.
달리 표시되지 않는 한, 본 명세서에서 명확하게 정의되어 있지 않은 치환체의 명명은 부착점을 향하여 인접한 작용성을 수반하는 작용성의 말단 부분을 명명함으로써 도달하게 된다. 예를 들어, 치환체 "아릴알킬옥시카보닐"은 (아릴)-(알킬)-O-C(O)-기를 지칭한다.
1개 이상의 치환체를 포함하는 본 명세서에 개시된 기들의 어느 것에 대해서도, 물론, 이러한 기는 입체적으로 실현불가능하고/하거나 합성적으로 실행불가능한 임의의 치환 혹은 치환 패턴을 포함하지 않음을 알 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 이들 화합물의 치환으로부터 생기는 모든 입체화학적 이성질체를 포함한다.
"약제학적으로 허용가능한 염"이란 용어는 환자, 예컨대, 포유동물에게 투여하기 위하여 허용 가능한 염(주어진 용량 요법을 위하여 허용가능한 포유류 안전성을 지니는 상대 이온을 가진 염)을 의미한다. 이러한 염은 약제학적으로 허용가능한 무기 또는 유기 염기로부터 그리고 약제학적으로 허용가능한 무기 또는 유기 산으로부터 유래될 수 있다. "약제학적으로 허용가능한 염"이란 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염을 지칭하며, 그 염은 당업계에 공지된 각종 유기 및 무기 상대 이온으로부터 유래되고, 단지 예로서, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 테트라알킬암모늄 등을 포함하고; 그리고 분자가 염기성 작용성을 포함할 경우, 유기 혹은 무기 산의 염, 예컨대, 염산염, 브로민화수소산염, 폼산염, 주석산염, 베실산염, 메실산염, 아세트산염, 말레산염, 옥살산염 등을 포함한다.
"그의 염"이란 용어는 산의 프로톤이 양이온, 예컨대, 금속 양이온 또는 유기 양이온 등으로 교체될 때 형성되는 화합물을 의미한다. 적용 가능하다면, 염은, 약제학적으로 허용가능한 염이지만, 이것은 환자에게 투여하기 위하여 의도되지 않은 중간생성물인 화합물의 염에 대해서 요구되지 않는다. 예로서, 본 발명의 화합물은, 화합물이 무기 또는 유기 산에 의해 프로톤화되어 양이온을 형성하되, 그 염의 음이온성 성분으로서 무기 또는 유기산의 컨쥬게이트 염기를 지니는 것들을 포함한다.
"용매화물"이란 용질의 분자 혹은 이온과 용매 분자의 조합에 의해 형성된 복합체를 지칭한다. 용매는 유기 화합물, 무기 화합물, 또는 이들 둘 모두의 혼합물일 수 있다. 용매의 몇몇 예는 메탄올, N,N-다이메틸폼아마이드, 테트라하이드로퓨란, 다이메틸설폭사이드 및 물을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 용매가 물인 경우, 형성된 용매화물은 수화물이다.
"입체이성질체" 및 "입체이성질체"란 동일한 원자 연결성을 지니지만 공간적으로 상이한 배열을 지니는 화합물을 지칭한다. 입체이성질체는 시스-트랜스 이성질체, E 및 Z 이성질체, 거울상이성질체 및 부분입체이성질체를 포함한다.
"호변이성질체"란 단지 원자들의 전자 결합 및/또는 프로톤의 위치만이 다른 분자의 대안적인 형태를 지칭하며, 예를 들어, 에놀-케토 및 이민-엔아민 호변이성질체, 또는 -N=C(H)-NH- 고리 원자 배열을 함유하는 헤테로아릴기의 호변이성질체형태, 예컨대, 피라졸, 이미다졸, 벤즈이미다졸, 트라이아졸 및 테트라졸 등을 들 수 있다. 당업자라면 기타 호변이성질체 고리 원자 배열이 가능하다는 것을 인식할 것이다.
"또는 그의 염 또는 용매화물 또는 입체이성질체"란 용어는 염, 용매화물 및 입체이성질체의 모든 변형, 예컨대, 대상 화합물의 입체이성질체의 약제학적으로 허용가능한 염의 용매화물을 포함하도록 의도된 것임이 이해될 것이다.
"약제학적 유효량" 및 "치료적 유효량"이란 특정 장애 또는 질환 또는 그의 하나 이상의 증상을 치료하고/하거나 질환 또는 장애의 발생을 예방하기에 충분한 화합물의 양을 지칭한다. 종양발생 증식적 장애에 관하여, 약제학적 혹은 치료적 유효량은, 무엇보다도, 종양을 수축시키거나 종양의 성장 속도를 저감시키기에 충분한 양을 포함한다.
"환자"란 인간 및 비-인간 대상체, 특별히 포유류 대상체를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "치료하는" 또는 "치료"란 용어는, 환자, 예컨대, 포유동물(특히 인간)의 질환 또는 의학적 병태를 치료하는 또는 그의 치료를 의미하며, 이는 (a) 질환 또는 의학적 병태가 발생하는 것을 예방하는 것, 예컨대, 대상체의 예방적 치료; (b) 질환 또는 의학적 병태를 개선하는 것, 예컨대, 환자의 질환 또는 의학적 병태를 제거하거나 그의 퇴행을 유발시키는 것; (c) 예를 들어, 환자의 질환 또는 의학적 병태의 전개를 지연 혹은 정지시킴으로써, 질환 또는 의학적 병태를 억제하는 것; 또는 (d) 환자의 질환 또는 의학적 병태의 증상을 완화시키는 것을 포함한다.
"폴리펩타이드," "펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는, 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 지칭하기 위하여 본 명세서에서 호환 가능하게 이용된다. 달리 구체적으로 표시되지 않는 한, "폴리펩타이드," "펩타이드" 및 "단백질"은 유전자 암호화된 및 암호화되지 않은 아미노산, 화학적으로 혹은 생화학적으로 변형된 혹은 유도체화된 아미노산, 및 변형된 펩타이드 골격을 지닌 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 이 용어는, 이종성 아미노산 서열을 가진 융합 단백질, 이종 및 동종 리더 서열을 가진 융합체, (예컨대, 재조합 박테리아 숙주 세포 내에서 생산을 용이하게 하기 위하여) 적어도 1개의 N-말단 메티오닌 잔기를 함유하는 단백질; 면역학적으로 표지된 단백질 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 융합 단백질을 포함한다.
"자연(native) 아미노산 서열" 또는 "모(parent) 아미노산 서열"은, 변형된 아미노산 잔기를 포함하도록 변형 전의 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 지칭하기 위하여 본 명세서에서 상호 호환적으로 이용된다.
"아미노산 유사체," "비천연 아미노산" 등은, 상호 호환적으로 이용될 수 있고, 자연 발생적 단백질에서 통상 발견되는 1개 이상의 아미노산(예컨대, Ala 또는 A, Cys 또는 C, Asp 또는 D, Glu 또는 E, Phe 또는 F, Gly 또는 G, His 또는 H, Ile 또는 I, Lys 또는 K, Leu 또는 L, Met 또는 M, Asn 또는 N, Pro 또는 P, Gln 또는 Q, Arg 또는 R, Ser 또는 S, Thr 또는 T, Val 또는 V, Trp 또는 W, Tyr 또는 Y)으로 구조 및/또는 전체적인 형상이 유사한 아미노산-유사 화합물을 포함한다. 아미노산 유사체는 또한 변형된 곁사슬 또는 골격을 지니는 천연 아미노산을 포함한다. 아미노산은 또한 L-형태보다 오히려 D-형태의 자연 발생적 아미노산을 포함한다. 몇몇 경우에, 아미노산 유사체는 1종 이상의 천연 아미노산의 골격 구조 및/또는 곁사슬 구조를 공유하며, 그 차이(들)는 분자 내에 1개 이상의 변형된 기가 있다는 점이다. 이러한 변형은, 관련된 원자(S 등) 대신 원자(N 등)의 치환, 기(예컨대, 메틸 또는 하이드록실 등) 또는 원자(Cl 또는 Br 등)의 부가, 기의 결실, 공유 결합의 치환(이중 결합 대신 단일 결합 등) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 아미노산 유사체는 α-하이드록시산, 및 α-아미노산 등을 포함할 수 있다.
"항체"란 용어는, 가장 넓은 의미로 사용되고, 이는 단클론성 항체(전장 단클론성 항체를 포함함), 다클론성 항체 및 다중특이적 항체(예를 들어, 이특이적(bispecific) 항체), 인간화 항체, 단쇄 항체, 키메라 항체, 항체 단편(예를 들어, Fab 단편) 등을 포함한다. 항체는 표적 항원에 결합할 수 있다(Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York). 표적 항원은 항체의 하나 이상의 가변 영역에 의해 형성되는 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR)에 의해 인식되는 에피토프로도 지칭되는 하나 이상의 결합 부위를 가질 수 있다.
"자연 항체"란 용어는 항체의 중쇄 및 경쇄가 다세포 유기체의 면역계에 의해 만들어지고 쌍을 이루게 된 항체를 지칭한다. 비장, 림프절, 골수 및 혈청은 자연 항체를 생성하는 조직의 예들이다. 예를 들어, 항원으로 면역화된 첫 번째 동물로부터 단리된 항체 생성 세포에 의해 생성된 항체는 자연 항체이다.
"인간화 항체" 또는 "인간화 면역글로불린"이란 용어는 인간 항체로부터의 상응하게 위치된 아미노산으로 치환된 (예를 들어, 프레임워크 영역, 불변 영역 또는 CDR 내에) 하나 이상의 아미노산을 함유하는 비-인간(예를 들어, 마우스 또는 토끼) 항체를 지칭한다. 일반적으로, 인간화 항체는 동일 항체의 비-인간화 형태에 비해 인간 숙주에서 감소된 면역 반응을 발생시킨다. 항체는, 예를 들어, CDR-이식(EP 239,400; PCT 공개 WO 91/09967; 미국 특허 제5,225,539호; 제5,530,101호; 및 제5,585,089호), 베니어링(veneering) 또는 재표면화(resurfacing)(EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994)) 및 사슬 셔플링(chain shuffling)(미국 특허 제5,565,332호)을 포함하는 당업계에 공지된 각종 수법을 이용해서 인간화될 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, 프레임워크 치환은 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR 및 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링 및 특정 위치에서 비정상 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다(예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)). 본 발명에서 사용하기 위해 고려되는 항체를 인간화시키기 위한 추가 방법은 미국 특허 제5,750,078호; 제5,502,167호; 제5,705,154호; 제5,770,403호; 제5,698,417호; 제5,693,493호; 제5,558,864호; 제4,935,496호; 및 제4,816,567호 및 PCT 공개 WO 98/45331 및 WO 98/45332에 기재되어 있다. 특정 실시형태에 있어서, 피검체인 토끼 항체는 US20040086979 및 US20050033031에 기재된 방법에 따라서 인간화될 수 있다. 따라서, 위에 기재된 항체는 당업계에 널리 공지된 방법을 이용해서 인간화될 수 있다.
"키메라 항체"란 용어는 경쇄 및 중쇄 유전자가 전형적으로 유전공학에 의해 상이한 종에 속하는 항체 가변 및 불변 영역 유전자로부터 작제된 항체를 지칭한다. 예를 들어, 마우스 단클론성 항체로부터의 유전자의 가변 세그먼트는 인간 불변 세그먼트, 예를 들어, 감마 1 및 감마 3에 연결될 수 있다. 치료적 키메라 항체의 예는 마우스 항체로부터의 가변 또는 항원-결합 도메인 및 인간 항체로부터의 불변 또는 효과기 도메인으로 구성되는 하이브리드 단백질이지만, 다른 포유동물 종으로부터의 도메인도 사용될 수 있다.
폴리펩타이드, 펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열에 대한 언급에서 사용되는 바와 같은 "유전학적으로 암호화 가능한"은, 아미노산 서열이 아미노산 서열을 암호화하는 핵산의 전사 및 번역에 의해 생성될 수 있는 아미노산 잔기로 구성되는 것을 의미하며, 이때의 전사 및/또는 번역은 세포 또는 무세포(cell-free) 시험관내 전사/번역 시스템에서 발생할 수 있다.
"조절 서열"(control sequence)이란 용어는 특정 발현 시스템, 예컨대, 포유동물 세포, 박테리아 세포, 무세포 합성 등에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열의 발현을 촉진하는 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물 시스템에 적합한 조절 서열은, 예를 들어, 프로모터, 선택적으로 작동자 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵생물 세포 시스템은 프로모터(promoter), 아데닐산중합반응 신호(polyadenylation signal) 및 인핸서(enhancer)를 이용할 수 있다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 상관관계로 배치되는 경우에 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 전서열(presequence) 또는 분비 선도(secretory leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 관여하는 프레단백질(preprotein)로 발현되는 경우에 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 리보솜 결합 부위는 번역의 개시를 촉진하도록 위치되는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"(operably linked)은 연결되는 DNA 서열이 연속적이고, 분비 선도의 경우, 연속적이고 해독틀(reading frame) 내에 존재하는 것을 의미한다. 연결은 결찰(ligation)에 의하거나 증폭반응을 통해 달성된다. 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커가 통상적인 실시에 따라 서열을 연결시키는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "발현 카세트"란 용어는 핵산에 삽입(예를 들어, 관심 작제물로의 결찰과 양립되는 제한 부위의 사용 또는 관심 작제물 또는 숙주 세포 유전체로의 상동성 재조합에 의함)될 수 있는 핵산의 세그먼트, 통상적으로 DNA를 나타낸다. 일반적으로, 핵산 세그먼트는 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 카세트 및 제한 부위는 전사 및 번역에 적절한 해독틀 내의 카세트의 삽입을 촉진하도록 설계된다. 발현 카세트는 또한 숙주 세포 내에서 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 촉진하는 요소를 포함할 수 있다. 이들 요소는 프로모터, 최소 프로모터(minimal promoter), 인핸서, 반응 요소, 종료자 서열, 아데닐산중합반응 서열 등을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "단리된"이란 용어는 화합물이 자연 발생하는 환경과는 상이한 환경에 있는 관심 화합물을 기술하는 것을 의미한다. "단리된"은 관심 화합물이 실질적으로 풍부화되고/되거나 관심 화합물이 부분적으로 또는 실질적으로 정제되는, 샘플 내에 있는 화합물을 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "실질적으로 정제된"이란 용어는 화합물의 자연 환경으로부터 분리되어 있고, 이와 자연 회합되는 다른 성분이 적어도 60%가 존재하지 않거나, 적어도 75%가 존재하지 않거나, 적어도 80%가 존재하지 않거나, 적어도 85%가 존재하지 않거나, 적어도 90%가 존재하지 않거나, 적어도 95%가 존재하지 않거나, 적어도 98%가 존재하지 않거나, 98% 초과가 존재하지 않는 화합물을 지칭한다.
"생리학적 조건"이란 용어는 살아있는 세포와 양립되는 조건, 예를 들어, 주로 살아있는 세포와 양립되는 온도, pH, 염도 등의 수성 조건을 포함하는 것을 의미한다.
"반응 파트너"는 또 다른 반응 파트너와 특별히 반응하여 반응 생성물을 생성시키는 분자 또는 분자 모이어티를 의미한다. 예시적 반응 파트너는 설파타제 모티프의 시스테인 또는 세린, 및 모티프 내에서 시스테인 또는 세린 대신 폼일글라이신(fGly)을 함유하는 전환된 알데하이드 태그(converted aldehyde tag)의 반응 생성물을 형성시키기 위해 반응하는 폼일글라이실 생성 효소(Formylglycine Generating Enzyme: FGE)를 포함한다. 다른 예시적 반응 파트너는, 알데하이드-반응성 기 및 관심 모이어티를 포함하고, 반응하여 변형된 fGly 잔기를 통해 변형된 폴리펩타이드에 컨쥬게이션된 관심 모이어티를 갖는 변형된 알데하이드 표지된 폴리펩타이드의 반응 생성물을 형성하는, "알데하이드-반응성 반응 파트너" 및 전환된 알데하이드 태그의 fGly 잔기의 알데하이드를 포함한다.
"N-말단"은 자유 아민기를 갖는 폴리펩타이드의 말단 아미노산 잔기를 지칭하며, 여기서 비-N-말단 아미노산 잔기 내의 아민기는 통상 폴리펩타이드의 공유 골격의 일부를 형성한다.
"C-말단"은 자유 카복실기를 갖는 폴리펩타이드의 말단 아미노산 잔기를 지칭하며, 여기서 비-C-말단 아미노산 잔기 내의 카복실기는 통상 폴리펩타이드의 공유 골격의 일부를 형성한다.
폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 관련하여 이용되는 바와 같은 "내부 부위"란, N-말단 또는 C-말단에 존재하지 않는 폴리펩타이드의 영역을 의미한다.
본 발명이 더욱 기술되기 전에, 본 발명은 기술되는 특정 실시형태들로 제한되지 않고, 그 자체로 물론 변경될 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시형태를 기재하기 위한 것으로, 이로 제한하고자 하는 것이 아님이 이해되어야 하는데, 이는 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문이다.
일정 범위의 값이 제공되는 경우, 문맥이 달리 명백히 기재하지 않는 한, 하한의 단위의 1/10까지의 상기 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 사이에 존재하는 값, 및 상기 언급된 범위에서 임의의 다른 언급되거나 사이에 존재하는 값이 본 발명에 포함되는 것이 이해된다. 이러한 보다 적은 범위의 상한 및 하한은 상기 보다 적은 범위 내에 독립적으로 포함될 수 있고, 이는 또한 언급된 범위 내의 임의의 특별히 배제된 제한을 조건으로 하여 본 발명에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 이러한 포함된 한계 중 어느 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
명료함을 위해, 별개의 실시형태의 맥락에서 기재되는 본 발명의 소정의 특징이 또한 단일 실시형태에서 조합하여 제공될 수 있음이 인지된다. 역으로, 간결함을 위해, 단일 실시형태의 맥락에서 기재되는 본 발명의 다양한 특징은 또한 별개로 또는 임의의 적합한 하위-조합으로 제공될 수 있다. 본 발명이 속하는 실시형태들의 모든 조합은 본 발명에 의해 명백히 포괄되며, 이는, 상기 조합이, 예를 들어, 안정적인 화합물(즉, 생물학적 활성에 대해 제조되고, 분리되고, 특성규명되고, 시험될 수 있는 화합물)인 화합물인 주제를 포괄하는 정도까지 각각 및 모든 조합이 개별적이며 명백히 개시되는 것처럼 본 명세서에 개시된다. 또한, 다양한 실시형태 및 이의 구성요소(예를 들어, 이러한 변수를 기술하는 실시형태에 나열된 화학적 기의 구성요소)의 모든 하위조합이 또한 본 발명에 의해 명백히 포괄되며, 이는 각각 및 모든 이러한 하위조합이 개별적이며 명백히 본 명세서에 개시되는 것처럼 본 명세서에 개시된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업계에서 통상의 기술을 가진 자(즉, 당업자)에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있으나, 바람직한 방법 및 물질이 이제 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물은 이러한 간행물이 인용하는 것과 관련된 방법 및/또는 물질을 개시하고 기재하기 위하여 참고로 본 명세서에 편입된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 그리고 첨부된 특허청구범위에 있어서, 단수 형태는 문맥이 명백히 달리 기재하지 않는 한 복수의 지시대상물을 포함하는 것임에 유의해야 한다. 특허청구범위는 어떠한 선택적 구성요소를 배제하도록 설계(draft)될 수 있음에 더욱 유의해야 한다. 이와 같이, 이러한 진술은 청구항 구성요소의 언급과 관련하여 "단독으로", "오직" 등과 같은 이러한 배타적 용어의 사용, 또는 "부정적" 제한의 사용을 위한 선행적 기초로서 역할하도록 의도된다.
명료함을 위해, 별개의 실시형태의 맥락에서 기재되는 본 발명의 소정의 특징이 또한 단일 실시형태에서 조합하여 제공될 수 있음이 인식된다. 역으로, 간결함을 위해, 단일 실시형태의 맥락에서 기재되는 본 발명의 다양한 특징은 또한 별개로 또는 임의의 적합한 하위-조합으로 제공될 수도 있다.
본 명세서에 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 전에 이들의 개시에 대해 단독으로 제공된다. 본 발명은 본 발명이 이전의 발명에 의해서 이러한 간행물에 선행할 자격이 없는 것을 시인하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 추가로, 제공된 간행일은 독립적으로 확인되는 것이 필요할 수도 있는 실제 간행일과는 상이할 수 있다.
상세한 설명
본 발명은 컨쥬게이트(예컨대, 폴리펩타이드 컨쥬게이트), 이 컨쥬게이트를 제조하기 위한 화합물, 그리고 이를 제조하는 방법 및 이용하는 방법을 제공한다. 각각의 실시형태는 이하의 부문에서 더욱 상세히 기술된다.
컨쥬게이트
본 발명은 컨쥬게이트를 제공한다. "컨쥬게이트"란 제2 모이어티와 안정적으로 회합되는 제1 모이어티를 의미한다. "안정적으로 회합되는"(stably associated)이란, 모이어티가 다른 모이어티 또는 구조에 표준 조건 하에 결합하는 것을 의미한다. 소정의 실시형태에 있어서, 제1 및 제2 모이어티는 하나 이상의 공유 결합을 통해서 서로 결합된다.
소정의 실시형태에 있어서, 컨쥬게이트는 폴리펩타이드 컨쥬게이트이고, 이는 제2 모이어티에 컨쥬게이트된 폴리펩타이드를 포함한다. 이하에 더욱 상세히 기재되는 바와 같이, 폴리펩타이드에 컨쥬게이트된 모이어티는 멤브레인 또는 표면에 폴리펩타이드의 고정화를 위하여 검출 가능한 표지, 약물, 수용성 중합체, 또는 모이어티 등(그러나 이들로 제한되지 않음)과 같은 다양한 모이어티의 어느 하나일 수 있다. 관심 대상 모이어티는 폴리펩타이드의 임의의 소망의 부위에서 폴리펩타이드에 컨쥬게이트될 수 있다. 이와 같이 해서, 본 발명은, 예를 들어, 폴리펩타이드의 C-말단의 위치에 혹은 그 부근에 컨쥬게이트된 모이어티를 지니는 변형된 폴리펩타이드를 제공한다. 다른 예는 폴리펩타이드의 N-말단의 위치에 혹은 그 부근에 컨쥬게이트된 모이어티를 지니는 변형된 폴리펩타이드를 제공한다. 그 예는 또한 폴리펩타이드의 C-말단과 N-말단 사이의 위치에(예컨대, 폴리펩타이드의 내부 위치에) 컨쥬게이트된 모이어티를 지니는 변형된 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 조합은 또한 변형된 폴리펩타이드가 둘 이상의 모이어티에 컨쥬게이트되는 경우 가능하다.
본 발명의 실시형태들은, 폴리펩타이드가 1개 이상의 모이어티, 예컨대, 2개의 모이어티, 3개의 모이어티, 4개의 모이어티, 5개의 모이어티, 6개의 모이어티, 7개의 모이어티, 8개의 모이어티, 9개의 모이어티, 또는 10개 혹은 그 이상의 모이어티에 컨쥬게이트된 컨쥬게이트들을 포함한다. 모이어티들은 폴리펩타이드 내의 하나 이상의 부위에서 폴리펩타이드에 컨쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 모이어티는 폴리펩타이드의 단일의 아미노산 잔기에 컨쥬게이트될 수 있다. 몇몇 경우에, 1개의 모이어티는 폴리펩타이드의 아미노산 잔기에 컨쥬게이트된다. 다른 실시형태에 있어서, 2개의 모이어티는 폴리펩타이드의 동일한 아미노산 잔기에 컨쥬게이트될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 제1 모이어티는 폴리펩타이드의 제1 아미노산 잔기에 컨쥬게이트되고, 제2 모이어티는 폴리펩타이드의 제2 아미노산 잔기에 컨쥬게이트된다. 상기의 조합은, 또한, 예를 들어, 폴리펩타이드가 제1 아미노산 잔기에서 제1 모이어티에 컨쥬게이트되고, 제2 아미노산 잔기에서 다른 2개의 모이어티에 컨쥬게이트되는 경우 가능하다. 다른 조합, 예컨대, 제1 아미노산 잔기에서 제1 및 제2 모이어티에 컨쥬게이트되고 제2 아미노산 잔기에서 제3 및 제4 모이어티에 컨쥬게이트된 폴리펩타이드 등(그러나 이것으로 제한되는 것은 아님)도 가능하다.
1개 이상의 모이어티에 컨쥬게이트된 1개 이상의 아미노산 잔기는 자연 발생적 아미노산, 비천연 아미노산, 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어, 컨쥬게이트는 폴리펩타이드의 자연 발생적 아미노산 잔기에 컨쥬게이트된 모이어티를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 컨쥬게이트는 폴리펩타이드의 비천연 아미노산 잔기에 컨쥬게이트된 모이어티를 포함할 수 있다. 1개 이상의 모이어티는, 위에서 기재된 바와 같은 단일의 천연 혹은 비천연 아미노산 잔기에서 폴리펩타이드에 컨쥬게이트될 수 있다. 폴리펩타이드 내의 1개 이상의 천연 혹은 비천연 아미노산 잔기는 본 명세서에 기재된 바와 같은 모이어티 또는 모이어티들에 컨쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 내의 2개(또는 그 이상)의 아미노산 잔기(예컨대, 천연 또는 비천연 아미노산 잔기)는 각각 1개 혹은 2개의 모이어티에 컨쥬게이트될 수 있으므로, 폴리펩타이드 내의 다수의 부위가 변형된다.
1개 이상의 모이어티(예컨대, 약물, 검출 가능한 표지, 폴리펩타이드 등)에 컨쥬게이트된 폴리펩타이드의 관점에서 본 명세서에서 설명되고 있지만, 본 발명의 실시형태들은 또한 하나의 모이어티(예컨대, 약물 또는 검출 가능한 표지)가 1개 이상의 다른 모이어티(예컨대, 약물, 검출 가능한 표지, 폴리펩타이드 등)에 컨쥬게이트되는 컨쥬게이트들을 포함한다. 예를 들어, 약물은 1개 이상의 다른 모이어티(예컨대, 약물, 검출 가능한 표지, 폴리펩타이드 등)에 컨쥬게이트될 수 있거나, 또는 다른 실시형태에 있어서, 검출 가능한 표지는 1개 이상의 다른 모이어티(예컨대, 약물, 검출 가능한 표지, 폴리펩타이드 등)에 컨쥬게이트될 수 있다. 이와 같이 해서, 예를 들어, 본 발명의 실시형태들은 이하의 것들: 폴리펩타이드와 약물의 컨쥬게이트; 폴리펩타이드와 검출 가능한 표지의 컨쥬게이트; 2종 이상의 폴리펩타이드의 컨쥬게이트; 2종 이상의 약물의 컨쥬게이트; 2종 이상의 검출 가능한 표지의 컨쥬게이트; 약물과 검출 가능한 표지의 컨쥬게이트; 폴리펩타이드, 약물 및 검출 가능한 표지의 컨쥬게이트; 하나의 폴리펩타이드와 2종 이상의 약물의 컨쥬게이트; 하나의 폴리펩타이드와 2종 이상의 검출 가능한 표지의 컨쥬게이트; 약물과 2종 이상의 폴리펩타이드의 컨쥬게이트; 검출 가능한 표지와 2종 이상의 폴리펩타이드의 컨쥬게이트 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
소정의 실시형태에 있어서, 관심대상 모이어티와 폴리펩타이드는 커플링 모이어티를 통해서 컨쥬게이트된다. 예를 들어, 관심대상 모이어티와 폴리펩타이드는 각각 커플링 모이어티에 결합(예컨대, 공유 결합)될 수 있고, 따라서 관심대상 모이어티와 폴리펩타이드를 함께 간접적으로 결합할 수 있다. 몇몇 경우에, 커플링 모이어티는 피라잘리논(Pz) 화합물 또는 피라잘리논 화합물의 유도체를 포함한다. 예를 들어, 피라잘리논 커플링 모이어티를 통해서 폴리펩타이드에 모이어티를 커플링시키기 위한 일반적인 반응식이 이하의 일반적인 반응식에 표시되어 있다:
Figure pct00008
상기 반응식에 있어서, R은 폴리펩타이드에 컨쥬게이트된 관심 대상 모이어티일 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 모이어티는, 검출 가능한 표지, 약물, 수용성 중합체, 또는 기재의 표면 또는 멤브레인에 폴리펩타이드의 고정화를 위한 모이어티 등(그러나 이들로 제한되지 않음)과 같은 각종 모이어티 중 어느 하나일 수 있다. R'은, 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴 등과 같은 임의의 소망의 치환체일 수 있다. 폴리펩타이드와 피라잘리논 커플링 모이어티 간의 결합은 이하에 더욱 상세히 기재된 바와 같이 단일 결합 혹은 이중 결합일 수 있다. 기타 커플링 모이어티가 또한 이하에 더욱 상세히 기재된 컨쥬게이트 및 화합물에 표시된 바와 같이 가능하다.
소정의 실시형태에 있어서, 상기 컨쥬게이트는 하기 화학식의 적어도 하나의 변형된 아미노산 잔기를 포함한다:
Figure pct00009
식 중,
X는 N, NH, O, S, CH 또는 CH2이고;
Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 N, O 및 S로부터 선택되며;
n은 1 또는 2이고;
R2는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되며;
R3은 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실 아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고;
R4는 선택적이고, 만약 존재한다면, 수소, 하이드록실, 할로겐, 사이아노, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 아실, 카복실, 및 카복실 에스터로부터 선택되며;
R5는 선택적이고, 만약 존재한다면, 수소 또는 하이드록실이며; 그리고
R6은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실 아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고,
여기서 W1 및 W2 중 한쪽은 폴리펩타이드이고, 다른 한쪽은 약물 또는 검출 가능한 표지이며,
점선은 선택적 결합을 나타내고,
R4-탄소와 R5-탄소 사이의 점선이 이중 결합일 때, n은　1이고 R4와 R5는 존재하지 않으며, 그리고
n이 2일 때, R4-탄소와 R5-탄소 사이의 점선은 이중 결합이 아니고 R5는 존재하지 않는다.
소정의 실시형태에 있어서, X는 N, NH, O, S, CH 또는 CH2이다. 소정의 실시형태에 있어서, X는 N 또는 NH이다. 소정의 실시형태에 있어서, X는 O이다. 소정의 실시형태에 있어서, X는 S이다. 소정의 실시형태에 있어서, X는 CH 또는 CH2이다.
소정의 실시형태에 있어서, Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 N, O 및 S로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, Y1은 N이다. 소정의 실시형태에 있어서, Y1은 O이다. 소정의 실시형태에 있어서, Y1은 S이다. 소정의 실시형태에 있어서, Y2는 N이다. 소정의 실시형태에 있어서, Y2는 O이다. 소정의 실시형태에 있어서, Y2는 S이다.
소정의 실시형태에 있어서, Y1은 N이고, Y2는 O이다. 소정의 실시형태에 있어서, Y1은 N이고, X는 N이다.
소정의 실시형태에 있어서, n은 1 또는 2이다. 소정의 실시형태에 있어서, n은 1이다. 이들 실시형태에 있어서, 폴리펩타이드는 단일 모이어티에 컨쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, W2가 폴리펩타이드인 실시형태에 있어서, W1이 컨쥬게이트된 모이어티이고, n이 1이면, 상기 폴리펩타이드는 하나의 모이어티에 컨쥬게이트된다. 예를 들어, 위에서 기재된 바와 같이, W1은 약물 또는 검출 가능한 표지일 수 있으므로, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 아미노산 잔기에서 하나의 약물 모이어티 또는 하나의 검출 가능한 표지에 컨쥬게이트될 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, W1은 링커 모이어티를 포함할 수 있고, 그 링커 모이어티를 통해서 약물, 검출 가능한 표지 또는 폴리펩타이드가 화합물에 컨쥬게이트된다. 예를 들어, 링커 모이어티는 1개 이상의 단량체 단위, 예컨대, 화학식 -(CH2-CH2-O)- 또는 -(O-CH2-CH2)-의 에틸렌 옥사이드를 포함할 수 있다. 이러한 단위의 개소는, 변화될 수 있고, 이러한 단위의 수는 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 4개이고, 예를 들어, 몇몇 실시형태에서는 2개의 단위를 포함한다.
소정의 실시형태에 있어서, n은 2이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 컨쥬게이트는 폴리펩타이드의 단일의 아미노산 잔기에서 2개의 모이어티에 컨쥬게이트된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, W2가 폴리펩타이드인 실시형태에서, W1가 컨쥬게이트된 모이어티이고, n이 2이면, 폴리펩타이드는 단일의 아미노산 잔기에서 2개의 모이어티에 컨쥬게이트된다. 예를 들어, 위에서 기재된 바와 같이, W1은 약물 또는 검출 가능한 표지일 수 있고, 따라서 폴리펩타이드는 단일의 아미노산 잔기에서 2개의 약물 모이어티 또는 2개의 검출 가능한 표지에 컨쥬게이트될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, W1은 폴리펩타이드일 수 있고, W2는 약물 또는 검출 가능한 표지일 수 있다. 이들 실시형태에 있어서, n이 2일 때, 약물 또는 검출 가능한 표지는 2개의 폴리펩타이드에 컨쥬게이트될 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, W1 및/또는 W2는 링커 모이어티를 포함할 수 있고, 이 링커 모이어티를 통해서 약물, 검출 가능한 표지 또는 폴리펩타이드가 화합물에 컨쥬게이트된다. 예를 들어, 링커 모이어티는 1개 이상의 단량체 단위, 예컨대, 화학식 -(CH2-CH2-O)- 또는 -(O-CH2-CH2)-의 에틸렌 옥사이드를 포함할 수 있다. 이러한 단위의 수는 다양할 수 있으며, 이러한 단위의 수는 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 4이고, 예를 들어 몇몇 실시형태는 2개의 유닛을 포함한다.
소정의 실시형태에 있어서, R2는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 수소이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 아릴 또는 치환된 아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이다.
소정의 실시형태에 있어서, R2는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다. 예를 들어, R2는 알킬 또는 치환된 알킬, 예컨대, C1-C10 알킬 또는 C1-C10 치환된 알킬(예컨대, C1-C6 알킬 또는 C1-C6 치환된 알킬)일 수 있다. 몇몇 경우에, R2는 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소-프로필, n-뷰틸, sec-뷰틸, 아이소뷰틸, t-뷰틸 등이다. 소정의 경우에, R2는 메틸 또는 t-뷰틸이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 메틸, t-뷰틸, 아릴 또는 치환된 아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 메틸, t-뷰틸 또는 아릴이다.
소정의 실시형태에 있어서, R3은 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실 아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 아미노 또는 치환된 아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 카복실 또는 카복실 에스터이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 아실 아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 알킬아마이드 또는 치환된 알킬아마이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 아릴 또는 치환된 아릴이다. 예를 들어, 몇몇 경우에, R3은 페닐 또는 치환된 페닐이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이다.
소정의 실시형태에 있어서, R4는 존재한다. R4가 존재하는 실시형태들에 있어서, R4는 수소, 하이드록실, 할로겐, 사이아노, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 아실, 카복실, 및 카복실 에스터로부터 선택될 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, R4는 수소이다. 소정의 실시형태에 있어서, R4는 할로겐, 예컨대, F, Cl, Br 또는 I이다. 소정의 실시형태에 있어서, R4는 F이다. 소정의 실시형태에 있어서, R4는 Cl이다. 소정의 실시형태에 있어서, R4는 Br이다. 소정의 실시형태에 있어서, R4는 I이다. 소정의 실시형태에 있어서, R4는 사이아노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R4는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R4는 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R4는 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R4는 알킬알콕시 또는 치환된 알킬알콕시이다. 소정의 실시형태에 있어서, R4는 아실, 카복실 또는 카복실 에스터이다.
소정의 실시형태에 있어서, R5는 존재한다. R5가 존재하는 실시형태에 있어서, R5는 수소 또는 하이드록실일 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, R5는 수소이다. 소정의 실시형태에 있어서, R5는 하이드록실이다.
소정의 실시형태에 있어서, R4와 R5가 모두 존재한다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에 있어서, n은 1이고, R4-탄소와 R5-탄소 사이의 점선은 존재하지 않는다(즉, 즉, R4-탄소와 R5-사이의 결합은 이중 결합이 아니라 단일 결합이다). 이들 실시형태에 있어서, R4와 R5는 모두 존재한다. 예를 들어, R5는 하이드록실일 수 있고, R4는 위에 기재된 바와 같을 수 있다.
소정의 실시형태에 있어서, R4는 존재하지 않는다. 소정의 실시형태에 있어서, R5는 존재하지 않는다. 예를 들어, R4-탄소와 R5-탄소 사이의 점선이 이중 결합일 때, R4와 R5가 모두 존재하지 않는다. 이들 실시형태에 있어서, n은 1이다. 다른 실시형태에 있어서, R4와 R5 중 한쪽이 존재하지 않을 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에 있어서, n은 2이고, R4-탄소와 R5-탄소 사이의 점선은 존재하지 않을 수 있다(즉, R4-탄소와 R5-탄소 사이의 결합은 이중 결합이 아니라 단일 결합이다). 이들 실시형태에 있어서, R5는 존재하지 않고 그리고 R4는 존재한다.
소정의 실시형태에 있어서, R6은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실 아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R6은 수소이다. 소정의 실시형태에 있어서, R6은 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R6은 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R6은 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R6은 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 소정의 실시형태에 있어서, R6은 아미노 또는 치환된 아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R6은 카복실 또는 카복실 에스터이다. 소정의 실시형태에 있어서, R6은 아실 아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R6은s 알킬아마이드 또는 치환된 알킬아마이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, R6은 아릴 또는 치환된 아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R6은 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R6은 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R6은 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이다.
소정의 실시형태에 있어서, W1 및 W2 중 한쪽은 폴리펩타이드이고, 다른 한쪽은 약물 또는 검출 가능한 표지이다. 소정의 실시형태에 있어서, W1은 약물 또는 검출 가능한 표지이고, W2는 폴리펩타이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, W1은 폴리펩타이드이고, W2는 약물 또는 검출 가능한 표지이다.
소정의 실시형태에 있어서, X와 Y1 사이의 점선이 결합이므로, 변형된 아미노산 잔기는 하기 화학식을 가진다:
Figure pct00010
.
이들 실시형태에 있어서, 상기 요소들 R2, R3, R4, R5, R6, W1, W2, X, Y1, Y2 및 n은 위에서 기재된 바와 같다.
소정의 실시형태에 있어서, X와 Y1 사이의 점선이 결합이 아니므로, 변형된 아미노산 잔기는 하기 화학식을 가진다:
Figure pct00011
.
이들 실시형태에 있어서, 상기 요소들 R2, R3, R4, R5, R6, W1, W2, X, Y1, Y2 및 n은 위에서 기재된 바와 같다.
위에서 기재된 바와 같이, 컨쥬게이트의 소정의 실시형태에 있어서, n은 2이다. 이들 실시형태에 있어서, 컨쥬게이트는 3개의 모이어티 사이에 컨쥬게이션을 포함할 수 있다. 예를 들어, 컨쥬게이트의 실시형태는 하기 화학식의 1종 이상의 화합물을 지니는 컨쥬게이트를 포함할 수 있다:
Figure pct00012
식 중,
X1 및 X2는 각각 독립적으로 N 및 CH로부터 선택되고;
Y1 및 Y3은 각각 독립적으로 N 및 S로부터 선택되며;
Y2 및 Y4는 각각 독립적으로 N, O 및 S로부터 선택되고;
R2 및 R10은 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되며; 그리고
R3 및 R11은 각각 독립적으로 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실 아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고,
W1a, W1b 및 W2는 각각 독립적으로 약물, 검출 가능한 표지 및 폴리펩타이드로부터 선택된다.
소정의 실시형태에 있어서, X1 및 X2는 각각 독립적으로 N 및 CH로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, X1은 N이다. 소정의 실시형태에 있어서, X1은 CH이다. 소정의 실시형태에 있어서, X2는 N이다. 소정의 실시형태에 있어서, X2는 CH이다. 소정의 실시형태에 있어서, X1 및 X2는 N이다. 소정의 실시형태에 있어서, X1 및 X2는 CH이다. 소정의 실시형태에 있어서, X1은 N이고 X2는 CH이다. 소정의 실시형태에 있어서, X1은 CH이고, X2는 N이다.
소정의 실시형태에 있어서, Y1 및 Y3은 각각 독립적으로 N 및 S로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, Y1은 N이다. 소정의 실시형태에 있어서, Y1은 S이다. 소정의 실시형태에 있어서, Y3은 N이다. 소정의 실시형태에 있어서, Y3은 S이다. 소정의 실시형태에 있어서, Y1 및 Y3은 N이다. 소정의 실시형태에 있어서, Y1 및 Y3은 S이다. 소정의 실시형태에 있어서, Y1은 N이고 Y3은 S이다. 소정의 실시형태에 있어서, Y1은 S이고 Y3은 N이다.
소정의 실시형태에 있어서, Y2 및 Y4는 각각 독립적으로 N, O 및 S로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, Y2는 N이다. 소정의 실시형태에 있어서, Y2는 O이다. 소정의 실시형태에 있어서, Y2는 S이다. 소정의 실시형태에 있어서, Y4는 N이다. 소정의 실시형태에 있어서, Y4는 O이다. 소정의 실시형태에 있어서, Y4는 S이다. 소정의 실시형태에 있어서, Y2 및 Y4는 O이다.
소정의 실시형태에 있어서, R2는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 수소이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 아릴 또는 치환된 아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이다.
소정의 실시형태에 있어서, R2는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다. 예를 들어, R2는 알킬 또는 치환된 알킬, 예컨대, C1-C10 알킬 또는 C1-C10 치환된 알킬(예컨대, C1-C6 알킬 또는 C1-C6 치환된 알킬)일 수 있다. 몇몇 경우에, R2는 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소-프로필, n-뷰틸, sec-뷰틸, 아이소뷰틸, t-뷰틸 등이다. 소정의 경우에, R2는 메틸 또는 t-뷰틸이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 메틸, t-뷰틸, 아릴 또는 치환된 아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 메틸, t-뷰틸 또는 아릴이다.
소정의 실시형태에 있어서, R10은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R10은 수소이다. 소정의 실시형태에 있어서, R10은 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R10은 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R10은 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R10은 아릴 또는 치환된 아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R10은 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R10은 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R10은 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이다.
소정의 실시형태에 있어서, R10은 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다. 예를 들어, R10은 알킬 또는 치환된 알킬, 예컨대, C1-C10 알킬 또는 C1-C10 치환된 알킬(예컨대, C1-C6 알킬 또는 C1-C6 치환된 알킬)일 수 있다. 몇몇 경우에, R10은 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소-프로필, n-뷰틸, sec-뷰틸, 아이소뷰틸, t-뷰틸 등이다. 소정의 경우에, R10은 메틸 또는 t-뷰틸이다. 소정의 실시형태에 있어서, R10은 메틸, t-뷰틸, 아릴 또는 치환된 아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R10은 메틸, t-뷰틸 또는 아릴이다.
소정의 실시형태에 있어서, R3은 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실 아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 아미노 또는 치환된 아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 카복실 또는 카복실 에스터이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 아실 아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 알킬아마이드 또는 치환된 알킬아마이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 아릴 또는 치환된 아릴이다. 예를 들어, 몇몇 경우에, R3은 페닐 또는 치환된 페닐이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이다.
소정의 실시형태에 있어서, R11은 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실 아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R11은 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R11은 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R11은 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R11은 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 소정의 실시형태에 있어서, R11은 아미노 또는 치환된 아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R11은 카복실 또는 카복실 에스터이다. 소정의 실시형태에 있어서, R11은 아실 아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R11은 알킬아마이드 또는 치환된 알킬아마이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, R11은 아릴 또는 치환된 아릴이다. 예를 들어, 몇몇 경우에, R11은 페닐 또는 치환된 페닐이다. 소정의 실시형태에 있어서, R11은 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R11은 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R11은 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이다.
소정의 실시형태에 있어서, W1a, W1b 및 W2는 각각 독립적으로 약물, 검출 가능한 표지 및 폴리펩타이드로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, W1a는 약물 또는 검출 가능한 표지이다. 소정의 실시형태에 있어서, W1a는 폴리펩타이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, W1b는 약물 또는 검출 가능한 표지이다. 소정의 실시형태에 있어서, W1b는 폴리펩타이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, W2는 약물 또는 검출 가능한 표지이다. 소정의 실시형태에 있어서, W2는 폴리펩타이드이다. 예를 들어, W2는 폴리펩타이드일 수 있고, W1a 및 W1b는 각각 약물 또는 검출 가능한 표지일 수 있다. 이들 실시형태에 있어서, 2개의 모이어티는 폴리펩타이드의 단일의 아미노산 잔기에 컨쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, W2는 폴리펩타이드일 수 있고, W1a 및 W1b는 각각 약물일 수 있다. 다른 경우에, W2는 폴리펩타이드일 수 있고, W1a 및 W1b는 검출 가능한 표지일 수 있다. 다른 경우에, W2는 폴리펩타이드일 수 있으며, W1a 및 W1b 중 한쪽은 약물이고 다른 한쪽은 검출 가능한 표지이다.
컨쥬게이트된 모이어티의 다른 조합이 가능하다. 예를 들어, 몇몇 경우에, W1a는 폴리펩타이드일 수 있고, W1b는 약물 또는 검출 가능한 표지일 수 있으며, W2는 약물 또는 검출 가능한 표지일 수 있다. 다른 경우에, W1a는 약물 또는 검출 가능한 표지일 수 있고, W1b는 폴리펩타이드일 수 있으며, W2는 약물 또는 검출 가능한 표지일 수 있다. 다른 경우에, W1a는 폴리펩타이드일 수 있고, W1b는 폴리펩타이드일 수 있으며, W2는 약물 또는 검출 가능한 표지일 수 있다. 다른 경우에, W1a는 폴리펩타이드일 수 있고, W1b는 약물 또는 검출 가능한 표지일 수 있으며, W2는 폴리펩타이드일 수 있다. 다른 경우에, W1a는 약물 또는 검출 가능한 표지일 수 있고, W1b는 폴리펩타이드일 수 있으며, W2는 폴리펩타이드일 수 있다. 다른 경우에, W1a, W1b 및 W2는 각각 폴리펩타이드이다. 다른 경우에, W1a, W1b 및 W2는 각각 독립적으로 약물 및 검출 가능한 표지로부터 선택된다.
소정의 실시형태에 있어서, W1a, W1b 및 W2 중 하나 이상은 링커 모이어티를 포함할 수 있되, 이 링커 모이어티를 통해서 약물, 검출 가능한 표지 또는 폴리펩타이드가 화합물에 컨쥬게이트된다. 예를 들어, 링커 모이어티는 1개 이상의 단량체 단위, 예컨대, 화학식 -(CH2-CH2-O)- 또는 -(O-CH2-CH2)-의 에틸렌 옥사이드를 포함할 수 있다. 이러한 단위의 수는 다양할 수 있고, 이러한 단위의 수는 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 4이며, 예를 들어 몇몇 실시형태는 2개의 유닛을 포함한다.
컨쥬게이트를 제조하는데 유용한 화합물
본 발명은 본 명세서에 기재된 컨쥬게이트를 제조하는데 유용한 화합물을 제공한다. 소정의 실시형태에 있어서, 이 화합물은 폴리펩타이드의 컨쥬게이션에 유용한 커플링 모이어티와 제2 모이어티일 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물은 폴리펩타이드에 결합되고 또한 제2 모이어티에도 결합될 수 있으므로, 폴리펩타이드와 제2 모이어티를 함께 간접적으로 결합할 수 있다.
소정의 경우에, 상기 화합물은 피라잘리논 또는 피라잘리논 유도체일 수 있다. 이 화합물의 실시형태는 하기 화합물의 화합물을 포함한다:
Figure pct00013
식 중,
R2는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고;
R3은 하이드록실, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 아실, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 치환된 헤테로사이클릴 및 -R9W로부터 선택되며;
R7은 수소, 하이드록실, 할로겐, 사이아노, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 아실, 카복실, 및 카복실 에스터로부터 선택되고;
R9는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되며; 그리고
W는 약물, 검출 가능한 표지 및 폴리펩타이드로부터 선택된다.
소정의 실시형태에 있어서, R2는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 아릴 또는 치환된 아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이다.
소정의 실시형태에 있어서, R2는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다. 예를 들어, R2는 알킬 또는 치환된 알킬, 예컨대, C1-C10 알킬 또는 C1-C10 치환된 알킬(예컨대, C1-C6 알킬 또는 C1-C6 치환된 알킬)일 수 있다. 몇몇 경우에, R2는 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소-프로필, n-뷰틸, sec-뷰틸, 아이소뷰틸, t-뷰틸 등이다. 소정의 경우에, R2는 메틸 또는 t-뷰틸이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 메틸, t-뷰틸, 아릴 또는 치환된 아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 메틸, t-뷰틸 또는 아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 n-프로필 또는 치환된 n-프로필이다. 예를 들어, R2는, 하이드록실, 아미노, 할로, 사이아노 등(이들로 제한되는 것은 아님) 등과 같은 1개 이상의 기로 치환된 n--프로필 또는 n-프로필일 수 있다. 몇몇 경우에, R2는 사이아노기로 치환된 n-프로필일 수 있다. 몇몇 경우에, R2는 2개의 사이아노기로 치환된 n-프로필일 수 있다.
소정의 실시형태에 있어서, R3은 하이드록실, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 아실, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 치환된 헤테로사이클릴 및 -R9W로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 하이드록실이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 아미노 또는 치환된 아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 아실, 카복실 또는 카복실 에스터이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 아실 아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 알킬아마이드 또는 치환된 알킬아마이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 아릴 또는 치환된 아릴이다. 예를 들어, 몇몇 경우에, R3은 페닐 또는 치환된 페닐이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이다.
소정의 실시형태에 있어서, R3은 -R9W이다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 약물, 검출 가능한 표지 및 폴리펩타이드로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 약물이다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 검출 가능한 표지이다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 폴리펩타이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 링커 모이어티를 포함할 수 있되, 이 링커 모이어티를 통해서 약물, 검출 가능한 표지 또는 폴리펩타이드가 화합물에 컨쥬게이트된다. 예를 들어, 링커 모이어티는 1개 이상의 단량체 단위, 예컨대, 화학식 -(CH2-CH2-O)- 또는 -(O-CH2-CH2)-의 에틸렌 옥사이드를 포함할 수 있다. 이러한 단위의 수는 다양할 수 있되, 이러한 단위의 수는 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 4이고, 예를 들어 몇몇 실시형태는 2개의 단위를 포함한다. R9는 이하에 더욱 상세히 기재된다.
소정의 실시형태에 있어서, R3은 제2 모이어티에의 화합물의 커플링을 용이하게 하기 위하여 1개 이상의 기로 치환된다. 예를 들어, R3은 1개 이상의 반응성 기로 치환될 수 있다. 몇몇 경우에, 반응성 기(들)는 화합물의 제2 모이어티에의 커플링을 용이하게 하기 위하여 제2 모이어티(예컨대, 약물, 검출 가능한 표지 또는 폴리펩타이드) 상의 대응하는 반응 파트너와 반응하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 소정의 실시형태에 있어서, R3은 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아미노아실, 아마이드, 치환된 아마이드, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 각각 독립적으로 선택된 1개 이상의 기로 치환된다.
소정의 실시형태에 있어서, R7은 수소, 하이드록실, 할로겐, 사이아노, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 아실, 카복실, 및 카복실 에스터로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 수소이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 할로겐(예컨대, F, Cl, Br 또는 I)이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 F이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 Cl이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 Br이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 I이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 사이아노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 알킬알콕시 또는 치환된 알킬알콕시이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 아실, 카복실 또는 카복실 에스터이다.
소정의 실시형태에 있어서, R9는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 아미노 또는 치환된 아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 카복실 또는 카복실 에스터이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 아실아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 알킬아마이드 또는 치환된 알킬아마이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 아릴 또는 치환된 아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이다.
몇몇 경우에, R2는 치환된 알킬, 예컨대, 치환된 C1-6 알킬 또는 치환된 C1-3 알킬일 수 있다. 몇몇 경우에, R2는 치환된 에틸기이다. 치환된 알킬기는 본 명세서에서 정의된 치환체들 중 어느 하나로 치환될 수 있다. 예를 들어, 치환된 알킬기는 티올기 또는 아실아미노기에 의해 치환될 수 있다.
몇몇 경우에, 상기 화합물은 위에서 기재된 화합물의 화합물일 수 있고, 여기서 R2는 티올기로 치환된, 치환된 에틸기이다, R3은 알킬기(예컨대, C1-6 알킬, 또는 C1-3 알킬)이고, R7은 수소이다. 이들 실시형태에 있어서, 상기 화합물은 3-(2-머캅토에틸)-1-메틸-1H-피라졸-5(4H)-온(화합물 A4)일 수 있다.
몇몇 경우에, R3은, 치환된 알킬, 예컨대, 치환된 C1-6 알킬 또는 치환된 C1-3 알킬일 수 있다. 몇몇 경우에, R3은 치환된 메틸 또는 치환된 에틸기이다. 치환된 알킬기는 본 명세서에 정의된 치환체들 중 어느 하나로 치환될 수 있다. 예를 들어, R3은 치환된 메틸기일 수 있다. 몇몇 경우에, 메틸기는 카복실 또는 아미노아실로 치환된다. 몇몇 경우에, 메틸기는 아미노아실기로 치환된다. 또한, 본 발명의 본 명세서에 기재된 바와 같은 화합물은 약물, 검출 가능한 표지 또는 폴리펩타이드로 컨쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, 상기 화학식에서 기재된 바와 같이, R3은 -R9W일 수 있되, 여기서 W는 약물, 검출 가능한 표지 또는 폴리펩타이드(예컨대, "카고")이다. 몇몇 경우에, "카고"는 아마이드 결합을 통해서 본 명세서에 기재된 화합물에 컨쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, "카고"는 아마이드 결합을 통해서 화합물에 컨쥬게이트되어 이하의 화학식의 화합물을 제공할 수 있다:
Figure pct00014
몇몇 경우에, R3이 치환된 알킬기일 때, 치환된 알킬기는 링커 모이어티에 의해 치환될 수 있다. 링커 모이어티는 1개 이상의 단량체 단위, 예컨대, 화학식 -(CH2-CH2-O)- 또는 -(O-CH2-CH2)-의 에틸렌 옥사이드를 포함할 수 있다. 이러한 단위의 수는 다양할 수 있되, 이러한 단위의 수는 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 4이고, 예를 들어 몇몇 실시형태는 2개의 단위를 포함한다. 또한, 링커기 내의 마지막 에틸렌 옥사이드기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 1개 이상의 작용기, 예를 들어, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 하이드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 아실, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 아미노아실, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴에 의해 더욱 치환될 수 있다. 몇몇 경우에, 링커기 내의 마지막 에틸렌 옥사이드기는 카복실, 또는 보호된 카복실기, 예컨대, 퍼플루오로페닐 보호된 카복실기로 더욱 치환될 수 있다.
예를 들어, 상기 화학식의 구체적인 화합물은, 3-(2-(2-(3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)에톡시)에톡시)프로판산(화합물 230) 및 퍼플루오로페닐 3-(2-(2-(3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)에톡시)에톡시)프로파노에이트(화합물 240)를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 본 명세서에 기재된 바와 같은 화합물은 약물, 검출 가능한 표지 또는 폴리펩타이드에 컨쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, 상기 화학식에 기재된 바와 같이, R3은 -R9W일 수 있고, 여기서 W는 약물, 검출 가능한 표지 또는 폴리펩타이드(예컨대, "카고")이다. 몇몇 경우에, "카고"는 아마이드 결합을 통해서 본 명세서에 기재된 화합물에 컨쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, "카고"는 아마이드 결합의 형성을 통해서 본 명세서에 기재된 화합물 240에 컨쥬게이트되어, N-"카고"-3-(2-(2-(3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)에톡시)에톡시) 프로판아마이드(화합물 250)를 생성할 수 있다.
소정의 실시형태에 있어서, 상기 화합물은 피라잘리논 유도체일 수 있다. 상기 화합물의 실시형태는 하기 화학식의 화합물을 포함한다:
Figure pct00015
식 중,
R2는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고;
R7은 수소, 하이드록실, 할로겐, 사이아노, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 아실, 카복실, 및 카복실 에스터로부터 선택되며;
R10은 알킬, 치환된 알킬, 하이드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아마이드, 치환된 아마이드, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 치환된 헤테로사이클릴 및 -R9W로부터 선택되고;
R9는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되며; 그리고
W는 약물, 검출 가능한 표지 및 폴리펩타이드로부터 선택된다.
소정의 실시형태에 있어서, R2는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 아릴 또는 치환된 아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이다.
소정의 실시형태에 있어서, R2는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다. 예를 들어, R2는 알킬 또는 치환된 알킬, 예컨대, C1-C10 알킬 또는 C1-C10 치환된 알킬(예컨대, C1-C6 알킬 또는 C1-C6 치환된 알킬)일 수 있다. 몇몇 경우에, R2는 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소-프로필, n-뷰틸, sec-뷰틸, 아이소뷰틸, t-뷰틸 등이다. 소정의 경우에, R2는 메틸 또는 t-뷰틸이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 메틸, t-뷰틸, 아릴 또는 치환된 아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 메틸, t-뷰틸 또는 아릴이다.
소정의 실시형태에 있어서, R7은 수소, 하이드록실, 할로겐, 사이아노, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 아실, 카복실, 및 카복실 에스터로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 수소이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 할로겐(예컨대, F, Cl, Br 또는 I)이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 F이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 Cl이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 Br이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 I이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 사이아노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 알킬알콕시 또는 치환된 알킬알콕시이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 아실, 카복실 또는 카복실 에스터이다.
소정의 실시형태에 있어서, R10은 알킬, 치환된 알킬, 하이드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아마이드, 치환된 아마이드, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 치환된 헤테로사이클릴 및 -R9W로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R10은 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R10은 하이드록실이다. 소정의 실시형태에 있어서, R10은 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 소정의 실시형태에 있어서, R10은 아미노 또는 치환된 아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R10은 카복실 또는 카복실 에스터이다. 소정의 실시형태에 있어서, R10은 아마이드 또는 치환된 아마이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, R10은 알킬아마이드 또는 치환된 알킬아마이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, R10은 아릴 또는 치환된 아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R10은 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R10은 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R10은 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이다.
소정의 실시형태에 있어서, R10은 -R9W이다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 약물, 검출 가능한 표지 및 폴리펩타이드로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 약물이다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 검출 가능한 표지이다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 폴리펩타이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 링커 모이어티를 포함할 수 있되, 이 링커 모이어티를 통해서 약물, 검출 가능한 표지 또는 폴리펩타이드가 화합물에 컨쥬게이트된다. 예를 들어, 링커 모이어티는 1개 이상의 단량체 단위, 예컨대, 화학식 -(CH2-CH2-O)- 또는 -(O-CH2-CH2)-의 에틸렌 옥사이드를 포함할 수 있다. 이러한 단위의 수는 다양할 수 있되, 이러한 단위의 수는 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 4이고, 예를 들어 몇몇 실시형태는 2개의 단위를 포함한다. R9는 이하에 더욱 상세히 기재된다.
소정의 실시형태에 있어서, R9는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 아미노 또는 치환된 아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 카복실 또는 카복실 에스터이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 아실아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 알킬아마이드 또는 치환된 알킬아마이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 아릴 또는 치환된 아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이다.
상기 화학식의 화합물의 일례는, R2가 메틸이고, R7이 수소이며, 그리고 R10이 하이드록실인 화합물을 포함한다. 예를 들어, 이 화합물 4-(3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)벤조산(화합물 10)일 수 있다.
상기 화학식의 화합물의 다른 예는, R10이 아미노 또는 치환된 아미노인 화합물을 포함한다. 이들 실시형태에 있어서, 상기 화합물은 피라잘리논 유도체, 예컨대, 하기 화학식의 화합물일 수 있다:
Figure pct00016
식 중,
R2는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고;
R7은 수소, 하이드록실, 할로겐, 사이아노, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 아실, 카복실, 및 카복실 에스터로부터 선택되며;
R8은 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아마이드, 치환된 아마이드, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 치환된 헤테로사이클릴 및 -R9W로부터 선택되고;
R9는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되며; 그리고
W는 약물, 검출 가능한 표지 및 폴리펩타이드로부터 선택된다.
소정의 실시형태에 있어서, R2는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 아릴 또는 치환된 아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이다.
소정의 실시형태에 있어서, R2는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다. 예를 들어, R2는 알킬 또는 치환된 알킬, 예컨대, C1-C10 알킬 또는 C1-C10 치환된 알킬(예컨대, C1-C6 알킬 또는 C1-C6 치환된 알킬)일 수 있다. 몇몇 경우에, R2는 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소-프로필, n-뷰틸, sec-뷰틸, 아이소뷰틸, t-뷰틸일 수 있다. 소정의 경우에, R2는 메틸 또는 t-뷰틸이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 메틸, t-뷰틸, 아릴 또는 치환된 아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R2는 메틸, t-뷰틸 또는 아릴이다.
소정의 실시형태에 있어서, R7은 수소, 하이드록실, 할로겐, 사이아노, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 아실, 카복실, 및 카복실 에스터로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 수소이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 할로겐(예컨대, F, Cl, Br 또는 I)이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 F이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 Cl이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 Br이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 I이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 사이아노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 알킬알콕시 또는 치환된 알킬알콕시이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 아실, 카복실 또는 카복실 에스터이다.
소정의 실시형태에 있어서, R8은 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아마이드, 치환된 아마이드, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 치환된 헤테로사이클릴 및 -R9W로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R8은 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R8은 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 소정의 실시형태에 있어서, R8은 아미노 또는 치환된 아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R8은 카복실 또는 카복실 에스터이다. 소정의 실시형태에 있어서, R8은 아마이드 또는 치환된 아마이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, R8은 알킬아마이드 또는 치환된 알킬아마이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, R8은 아릴 또는 치환된 아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R8은 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R8은 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R8은 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이다.
소정의 실시형태에 있어서, R8은 -R9W이다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 약물, 검출 가능한 표지 및 폴리펩타이드로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 약물이다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 검출 가능한 표지이다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 폴리펩타이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 링커 모이어티를 포함할 수 있되, 이 링커 모이어티를 통해서 약물, 검출 가능한 표지 또는 폴리펩타이드가 화합물에 컨쥬게이트된다. 예를 들어, 링커 모이어티는 1개 이상의 단량체 단위, 예컨대, 화학식 -(CH2-CH2-O)- 또는 -(O-CH2-CH2)-의 에틸렌 옥사이드를 포함할 수 있다. 이러한 단위의 수는 다양할 수 있되, 이러한 단위의 수는 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 4이고, 예를 들어 몇몇 실시형태는 2개의 단위를 포함한다. R9는 이하에 더욱 상세히 기재된다.
소정의 실시형태에 있어서, R9는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 아미노 또는 치환된 아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 카복실 또는 카복실 에스터이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 아실아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 알킬아마이드 또는 치환된 알킬아마이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 아릴 또는 치환된 아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이다.
부가적인 화합물
소정의 경우에, 상기 화합물은 비스-피라잘리논 또는 비스-피라잘리논 유도체일 수 있다. 이 화합물의 실시형태는 하기 화학식의 화합물을 포함한다:
Figure pct00017
식 중,
X는 N 또는 CH이고;
R3 및 R11은 각각 독립적으로 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 아실, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴 및 -R9W로부터 선택되며;
R7 및 R12는 각각 독립적으로 수소, 하이드록실, 할로겐, 사이아노, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 아실, 카복실, 및 카복실 에스터로부터 선택되고;
R9는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고;
R13은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 아실, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드 및 -R14W로부터 선택되며;
R14는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고; 그리고
W는 약물, 검출 가능한 표지 및 폴리펩타이드로부터 선택된다.
소정의 실시형태에 있어서, X는 N 또는 CH이다. 소정의 실시형태에 있어서, X는 N이다. 소정의 실시형태에 있어서, X는 CH이다.
소정의 실시형태에 있어서, R3은 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 아실, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴 및 -R9W로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 알킬 또는 치환된 알킬이다. 예를 들어, R3은 알킬, 예컨대, C1-3 알킬을 비롯하여 C1-6 알킬일 수 있다. 몇몇 경우에, R3은 메틸이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 아미노 또는 치환된 아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 아실, 카복실, 카복실 에스터 또는 아실아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 알킬아마이드 또는 치환된 알킬아마이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 아릴 또는 치환된 아릴이다. 예를 들어, R3은 아릴, 예컨대, 페닐일 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R3은 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이다.
소정의 실시형태에 있어서, R3은 -R9W이다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 약물, 검출 가능한 표지 및 폴리펩타이드로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 약물이다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 검출 가능한 표지이다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 폴리펩타이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 링커 모이어티를 포함할 수 있되, 이 링커 모이어티를 통해서 약물, 검출 가능한 표지 또는 폴리펩타이드가 화합물에 컨쥬게이트된다. 예를 들어, 링커 모이어티는 1개 이상의 단량체 단위, 예컨대, 화학식 -(CH2-CH2-O)- 또는 -(O-CH2-CH2)-의 에틸렌 옥사이드를 포함할 수 있다. 이러한 단위의 수는 다양할 수 있되, 이러한 단위의 수는 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 4이고, 예를 들어 몇몇 실시형태는 2개의 단위를 포함한다. R9는 이하에 더욱 상세히 기재된다.
소정의 실시형태에 있어서, R3은 제2 모이어티에의 화합물의 커플링을 용이하게 하기 위하여 1개 이상의 기로 치환된다. 예를 들어, R3은 1개 이상의 반응성 기로 치환될 수 있다. 몇몇 경우에, 반응성 기(들)는 화합물의 제2 모이어티에의 커플링을 용이하게 하기 위하여 제2 모이어티(예컨대, 약물, 검출 가능한 표지 또는 폴리펩타이드) 상의 대응하는 반응 파트너와 반응하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 소정의 실시형태에 있어서, R3은 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아마이드, 치환된 아마이드, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 각각 독립적으로 선택된 1개 이상의 기로 치환된다.
소정의 실시형태에 있어서, R11은 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 아실, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴 및 -R9W로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R11은 알킬 또는 치환된 알킬이다. 예를 들어, R11은 알킬, 예컨대, C1-3 알킬을 비롯하여 C1-6 알킬일 수 있다. 몇몇 경우에, R11은 메틸이다. 소정의 실시형태에 있어서, R11은 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R11은 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R11은 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 소정의 실시형태에 있어서, R11은 아미노 또는 치환된 아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R11은 아실, 카복실, 카복실 에스터 또는 아실아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R11은 알킬아마이드 또는 치환된 알킬아마이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, R11은 아릴 또는 치환된 아릴이다. 예를 들어, R11은 아릴, 예컨대, 페닐일 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, R11은 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R11은 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R11은 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이다.
소정의 실시형태에 있어서, R11은 -R9W이다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 약물, 검출 가능한 표지 및 폴리펩타이드로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 약물이다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 검출 가능한 표지이다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 폴리펩타이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 링커 모이어티를 포함할 수 있되, 이 링커 모이어티를 통해서 약물, 검출 가능한 표지 또는 폴리펩타이드가 화합물에 컨쥬게이트된다. 예를 들어, 링커 모이어티는 1개 이상의 단량체 단위, 예컨대, 화학식 -(CH2-CH2-O)- 또는 -(O-CH2-CH2)-의 에틸렌 옥사이드를 포함할 수 있다. 이러한 단위의 수는 다양할 수 있되, 이러한 단위의 수는 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 4이고, 예를 들어 몇몇 실시형태는 2개의 단위를 포함한다. R9는 이하에 더욱 상세히 기재된다.
소정의 실시형태에 있어서, R11은 제2 모이어티에의 화합물의 커플링을 용이하게 하기 위하여 1개 이상의 기로 치환된다. 예를 들어, R11은 1개 이상의 반응성 기로 치환될 수 있다. 몇몇 경우에, 반응성 기(들)는 화합물의 제2 모이어티에의 커플링을 용이하게 하기 위하여 제2 모이어티(예컨대, 약물, 검출 가능한 표지 또는 폴리펩타이드) 상의 대응하는 반응 파트너와 반응하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 소정의 실시형태에 있어서, R11은 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아마이드, 치환된 아마이드, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 각각 독립적으로 선택된 1개 이상의 기로 치환된다.
소정의 실시형태에 있어서, R7은 수소, 하이드록실, 할로겐, 사이아노, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 아실, 카복실, 및 카복실 에스터로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 수소이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 할로겐(예컨대, F, Cl, Br 또는 I)이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 F이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 Cl이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 Br이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 I이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 사이아노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 알킬알콕시 또는 치환된 알킬알콕시이다. 소정의 실시형태에 있어서, R7은 아실, 카복실 또는 카복실 에스터이다.
소정의 실시형태에 있어서, R12는 수소, 하이드록실, 할로겐, 사이아노, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 아실, 카복실, 및 카복실 에스터로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R12는 수소이다. 소정의 실시형태에 있어서, R12는 할로겐(예컨대, F, Cl, Br 또는 I)이다. 소정의 실시형태에 있어서, R12는 F이다. 소정의 실시형태에 있어서, R12는 Cl이다. 소정의 실시형태에 있어서, R12는 Br이다. 소정의 실시형태에 있어서, R12는 I이다. 소정의 실시형태에 있어서, R12는 사이아노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R12는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R12는 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R12는 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R12는 알킬알콕시 또는 치환된 알킬알콕시이다. 소정의 실시형태에 있어서, R12는 아실, 카복실 또는 카복실 에스터이다.
소정의 실시형태에 있어서, R9는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 아미노 또는 치환된 아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 카복실 또는 카복실 에스터이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 아실아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 알킬아마이드 또는 치환된 알킬아마이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 아릴 또는 치환된 아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R9는 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이다.
소정의 실시형태에 있어서, R13은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 아실, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드 및 -R14W로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R13은 수소이다. 소정의 실시형태에 있어서, R13은 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R13은 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R13은 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R13은 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 소정의 실시형태에 있어서, R13은 아미노 또는 치환된 아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R13은 아실, 카복실, 카복실 에스터 또는 아실아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R13은 알킬아마이드 또는 치환된 알킬아마이드이다.
소정의 실시형태에 있어서, R13은 -R14W이다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 약물, 검출 가능한 표지 및 폴리펩타이드로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 약물이다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 검출 가능한 표지이다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 폴리펩타이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, W는 링커 모이어티를 포함할 수 있되, 이 링커 모이어티를 통해서 약물, 검출 가능한 표지 또는 폴리펩타이드가 화합물에 컨쥬게이트된다. 예를 들어, 링커 모이어티는 1개 이상의 단량체 단위, 예컨대, 화학식 -(CH2-CH2-O)- 또는 -(O-CH2-CH2)-의 에틸렌 옥사이드를 포함할 수 있다. 이러한 단위의 수는 다양할 수 있되, 이러한 단위의 수는 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 4이고, 예를 들어 몇몇 실시형태는 2개의 단위를 포함한다. R14는 이하에 더욱 상세히 기재된다.
소정의 실시형태에 있어서, R14는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, R14는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R14는 알켄일 또는 치환된 알켄일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R14는 알킨일 또는 치환된 알킨일이다. 소정의 실시형태에 있어서, R14는 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 소정의 실시형태에 있어서, R14는 아미노 또는 치환된 아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R14는 카복실, 카복실 에스터 또는 아실아미노이다. 소정의 실시형태에 있어서, R14는 알킬아마이드 또는 치환된 알킬아마이드이다. 소정의 실시형태에 있어서, R14는 아릴 또는 치환된 아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R14는 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다. 소정의 실시형태에 있어서, R14는 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬이다. 소정의 실시형태에 있어서, R14는 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴이다.
소정의 실시형태에 있어서, X가 CH일 때, R13은 H이다. 소정의 실시형태에 있어서, X가 CH일 때, R13은 알킬 또는 치환된 알킬이다. 예를 들어, R13은 C1-10 알킬 또는 C1-10 치환된 알킬, 예컨대, C1-8 알킬 또는 C1-8 치환된 알킬, 또는 C1-6 알킬 또는 C1-6 치환된 알킬, 또는 C1-4 알킬 또는 C1-4 치환된 알킬일 수 있다. 예를 들어, 몇몇 경우에, 상기 치환된 알킬은 아실아미노 또는 아미노아실기로 치환될 수 있다.
표적 폴리펩타이드
광범위한 폴리펩타이드의 어느 것이라도 위에서 기재된 바와 같이 제2 모이어티에 컨쥬게이트되도록 변형될 수 있다. 변형을 위하여 적합한 폴리펩타이드는 자연-발생적 아미노산 서열, 자연-발생적 폴리펩타이드의 단편, 그리고 비자연 발생적 폴리펩타이드 및 그의 단편을 지니는 두 단백질 모두를 포함한다.
이하는 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드 컨쥬게이트를 제조하기 위하여 본명세서에 기재된 화합물 및 방법을 이용해서 변형하기 위한 관심 대상인 폴리펩타이드의 부류 및 유형의 예이다.
치료적 폴리펩타이드
소정의 실시형태에 있어서, 컨쥬게이트를 제조하는 방법은, 예를 들어, 혈청 반감기의 증가, 역 면역 반응의 감소, 부가적 혹은 대안적 생물학적 활성 또는 작용성 등과 같은 치료적 유익, 또는 기타 유익 혹은 부작용의 저감을 위하여 제공될 수 있는 폴리펩타이드의 변형에 적용된다. 치료적 폴리펩타이드가 백신용의 항원인 경우, 변형은 폴리펩타이드의 증대된 면역원성을 제공할 수 있다.
치료적 단백질의 부류의 예는 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 호르몬, 항체 및 항원인 것들을 포함한다. 추가의 예는, 이하의 것들: 에리트로포이에틴(EPO, 예컨대, 천연 EPO 또는 합성 EPO(예컨대, US 2003/0191291 참조), 예컨대, 제한 없이, 프로크릿(PROCRIT)(등록상표), 에프렉스(EPREX)(등록상표), 또는 에포겐(EPOGEN)(등록상표)(에포에틴-α), 아라네스프(ARANESP)(등록상표)(다베포이에틴-α), 네오레코몬(NEORECORMON)(등록상표), 에포긴(EPOGIN)(등록상표)(에포에틴-β) 등); 성장 호르몬(예컨대, 소마토프로핀, 예컨대, 제노트로핀(GENOTROPIN)(등록상표), 누트로핀(NUTROPIN)(등록상표), 노르디트로핀(NORDITROPIN)(등록상표), 사이젠(SAIZEN)(등록상표), 세로스팀(SEROSTIM)(등록상표), 후마트로프(HUMATROPE)(등록상표) 등); 인간 성장 호르몬(hGH); 소 성장 호르몬(bGH); 여포 자극 호르몬(FSH); 인터페론(예컨대, IFN-γ, IFN-α, IFN-β, IFN-ω IFN-τ 컨센서스 인터페론 등); 인슐린(예컨대, 노볼린(Novolin), 휴물린(Humulin), 휴말로그(Humalog), 란투스(Lantus), 울트라렌테(Ultralente) 등), 인슐린 유사 성장 인자(예컨대, IGF-I, IGF-II); 혈액 인자(예컨대, 인자 X, 조직 플라스미노겐 활성인자(tissue plasminogen activator: TPA) 등, 예를 들어, 제한 없이, 액티바제(ACTIVASE)(등록상표)(알테플라제(alteplase)) 조직 플라스미노겐 활성인자, 노보세븐(NOVOSEVEN)(등록상표)(재조합 인간 인자 VIIa), 인자 VIIa, 인자 VIII(예컨대, 코게네이트(KOGENATE)(등록상표)), 인자 IX, β-글로빈, 헤모글로빈 등); 집락 자극 인자(예컨대, 과립구-CSF(G-CSF, 예컨대, 뉴포겐(NEUPOGEN)(등록상표)(필그라스팀)), 대식세포-CSF(M-CSF), 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF), 뉴라스타(Neulasta)(페그필그라스팀), 과립구-단구 집락 자극 인자, 거핵구 단구 집락 자극 인자 등), 형질전환 성장 인자(예컨대, TGF-베타, TGF-알파); 인터류킨(예컨대, IL-1, IL-2(예컨대, 프로류킨(Proleukin)(등록상표)), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-12 등); 성장 인자(예컨대, 상피세포 성장 인자(EGF), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF, 예컨대, 레그라넥스(REGRANEX)(등록상표)(베클라퍼민(beclapermin))), 섬유아세포 성장 인자(FGF, 예컨대, aFGF, bFGF, 예컨대, 피블라스트(FIBLAST)(등록상표)(트라퍼민(trafermin))), 교질 세포주-유래 성장 인자(GDNF), 신경 성장 인자(NGF), 줄기 세포 인자(예컨대, 스템겐(STEMGEN)(등록상표)(안세스팀(ancestim))), 케라틴세포 성장 인자, 간세포 성장 인자 등); 가용성 수용체(예컨대, TNF-α-결합 가용성 수용체, 예컨대, 엔브렐(ENBREL)(등록상표)(에타너셉트(etanercept)), 가용성 VEGF 수용체, 가용성 인터류킨 수용체, 가용성 γ/δ T 세포 수용체 등); 효소(예컨대, α-글루코시다제, 세라자임(CERAZYME)(등록상표)(이미글루카라제(imiglucarase), β-글루코세레브로시다제, 세레다제(CEREDASE)(등록상표)(알글루세라제(alglucerase)); 효소 활성인자(예컨대, 조직 플라스미노겐 활성인자); 케모카인(예컨대, IP-10, Mig, Groα/IL-8, 조절된 및 정상 T 세포 발현 및 분비(RANTES), MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, PF-4 등); 혈관신생제(예컨대, 혈관내피 성장 인자(VEGF); 항혈관신생제(예컨대, 가용성 VEGF 수용체); 단백질 백신; 신경자극성 펩타이드, 예컨대, 브라디키닌, 콜레시스토키닌, 가스틴, 세크레틴, 옥시토신, 성선자극호르몬 방출 호르몬, 베타-엔돌핀, 엔케팔린, 물질 P(substance P), 소마토스타틴, 젤라닌, 성장 호르몬-방출 호르몬, 봄베신, 와파린, 디노핀, 뉴로텐신, 모틸린, 티로트로핀, 뉴로펩타이드 Y, 황체형성 호르몬, 칼시토닌, 인슐린, 글루카곤, 바소프레신, 안지오텐신 II, 티로트로핀-방출 호르몬, 혈관활성 장 펩타이드, 슬립 펩타이드(sleep peptide) 등; 기타 단백질, 예컨대, 혈전용해제, 심방성 나트륨이뇨 펩타이드, 골 형성 단백질, 트롬보포이에틴, 릴렉신, 신경교섬유질 산성 단백질, 여포 자극 호르몬, 인간 알파-1 안티트립신, 백혈병 저해 인자, 형질전환 성장 인자, 조직 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 황체형성 호르몬, 여포 자극 호르몬, 대식세포 활성 인자, 종양 괴사 인자, 호중구 주성 인자, 신경 성장 인자, 금속단백질분해효소의 조직 저해제; 혈관활성 장 펩타이드, 안지오제닌, 안지오트로핀, 피브린; 히루딘; 백혈병 저해 인자; IL-1 수용체 길항제(예컨대, 키네레트(Kineret)(등록상표)(아나킨라(anakinra))) 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 상기 치료적 단백질의 자연 형태가 또한 본 발명의 표적 폴리펩타이드로서 관심 있는 것임이 용이하게 이해될 것이다.
추가의 예는, 항체, 예컨대, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화 항체, 항원-결합 단편(예컨대, F(ab)', Fab, Fv), 단쇄 항체 등(예컨대, 리툭산(RITUXAN)(등록상표)(리툭시맙); 레미케이드(REMICADE)(등록상표)(인플릭시맙); 허셉틴(HERCEPTIN)(등록상표)(트라스투주맙); 휴미라(HUMIRA)(상표명)(아달리무맙); 졸레어(XOLAIR)(등록상표)(오말리주맙); 벡사(BEXXAR)(등록상표)(토시투모맙); 랍티바(RAPTIVA)(상표명)(에팔리주맙); 에르비툭스(ERBITUX)(상표명)(세툭시맙); 등)을 포함한다. 몇몇 경우에, 항체는 종양 항원, 면역 세포 항원(예컨대, CD4, CD8 등), 미생물의 항원, 특히 병원성 미생물(예컨대, 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충성 항원) 등에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
몇몇 경우에, 본 명세서에 기재된 방법, 컨쥬게이트 및 화합물은, 치료적 단백질의 하이퍼글라이코실화에서 발견되는 것들과 같은, 글라이코실화의 천연 혹은 공학적 조작 부위에서 모이어티(예컨대, 수용성 중합체)를 제공하기 위하여 적용될 수 있다.
변형된 표적 폴리펩타이드의 생물학적 활성은 당업계에 공지된 방법에 따라서 검정될 수 있다. 대응하는 모 단백질의 적어도 하나의 목적으로 하는 약리학적 활성을 보유하는 변형된 폴리펩타이드가 관심 대상이다.
면역원성 조성물
본 명세서에 개시된 방법, 컨쥬게이트 및 화합물은 또한 면역원성 조성물(예컨대, 치료적 백신)의 성분의 생산에서 용도를 찾을 수 있다. 예를 들어, 화합물은, 폴리펩타이드 항원의 혈청 반감기를 증가시키거나, 폴리펩타이드의 면역원성을 증가시키거나, 폴리펩타이드 운반체에 비-아미노산 항원을 연결시키는, 모이어티의 부착을 촉진시키는데 이용될 수 있다. 이와 관련하여, 화합물은, 미생물의 항원(예컨대, 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충성 항원), 종양 항원, 및 대상체에서 면역 반응을 유발시키기 위하여 대상체에게 투여하기 위하여 관심이 있는 기타 항원의 변형을 촉진시키는데 이용될 수 있다. 또한, 연구 툴로서 유용할 수 있는 항체를 유발하는데 유용한 항원의 변형이 또한 관심 대상이다.
본 명세서에 개시된 화합물을 이용하는 변형을 위해 관심 대상인 폴리펩타이드의 추가의 예는 검정에서 검출 혹은 기능적 모니터링을 위하여 관심 대상인 것들(예컨대, 약물 선별 검정에서 연구 툴로서 등)을 포함한다. 이런 유형의 폴리펩타이드의 예는 수용체(예컨대, G-단백질 커플링된 수용체(GPCR, 고아(orphan) GPCR을 포함함)), 수용체 리간드(자연-발생적 및 합성을 포함함), 단백질 통로(예컨대, 이온 통로(예컨대, 칼륨 통로, 칼슘 통로, 나트륨 통로 등), 및 기타 폴리펩타이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 세포-표면-회합된 폴리펩타이드의 변형(예컨대, 막관통 폴리펩타이드)은, 예를 들어, 폴리펩타이드가 막에 존재하면서 그러한 변형이 수행되는 경우, 관심 대상이다. 생리학적 조건 하에서 폴리펩타이드의 변형 방법이 이하에 더욱 기술된다.
폴리펩타이드 생산 방법
일반적으로, 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드는 발현 목적에 따라서 통상의 방법에 따라서 원핵생물 또는 진핵생물에서 발현될 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포, 예컨대, 유전자 변형 숙주 세포를 제공한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 컨쥬게이트를 형성하기에 적합한 컨쥬게이트되지 않은 혹은 변형된 폴리펩타이드의 제조(대규모 제조를 포함)하기 위한 숙주 세포는 각종 입수 가능한 숙주 세포들 중 어느 것인가로부터 선택될 수 있다. 숙주 세포의 예는 원핵생물 혹은 진핵생물성 단세포 유기체의 것들, 예컨대, 박테리아(예컨대, 대장균 균주(Escherichia coli strain), 바실러스 종(Bacillus spp.)(예컨대, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)) 등), 효모 또는 진균(예컨대, 사카로마이세스 세레비시애에(S.　cerevisiae), 피치아 종(Pichia spp.) 등)을 포함하고, 이러한 기타 숙주 세포가 이용될 수 있다. 포유동물(예컨대, CHO, HEK 등)을 포함하는 척추동물, 곤충 등과 같은 고차 유기체로부터 원래 유래되는 숙주 세포의 예는 발현 숙주 세포로서 이용될 수 있다.
적절한 포유류 세포주는, HeLa 세포(예컨대, 미국 미생물보존센터(American Type Culture Collection: ATCC) 번호 CCL-2), CHO 세포(예컨대, ATCC 번호 CRL9618 및 CRL9096), CHO DG44 세포(Urlaub (1983) Cell 33:405), CHO-K1 세포(ATCC CCL-61), 293 세포(예컨대, ATCC 번호 CRL-1573), 베로(Vero) 세포, NIH 3T3 세포(예컨대, ATCC 번호 CRL-1658), Huh-7 세포, BHK 세포(예컨대, ATCC 번호 CCL10), PC12 세포(ATCC 번호 CRL1721), COS 세포, COS-7 세포(ATCC 번호 CRL1651), RAT1 세포, 마우스 L 세포(ATCC 번호 CCLI.3), 인간 배아 신장(HEK) 세포(ATCC 번호 CRL1573), HLHepG2 세포 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
관심 대상 특정 발현 시스템은 박테리아, 효모, 곤충 세포 및 포유류 세포 유래 발현 시스템을 포함한다.
발현된 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 임의의 적절한 수단에 의해 회수될 수 있다. 또한, 임의의 편리한 단백질 정제 절차가 이용될 수 있으며, 이때 적절한 단백질 정제 방법은, 단백질 정제에 대한 지침(Guide to Protein Purification)(Deuthser ed.) (Academic Press, 1990)에 기술되어 있다. 예를 들어, 용해물은 목적으로 하는 폴리펩타이드를 발현하는 발현 벡터를 포함하는 세포로부터 제조되고, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피 등을 이용해서 정제될 수 있다.
폴리펩타이드의 변형 방법
소정의 실시형태에 있어서, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드를 먼저 변형시키는 일 없이 관심 대상 모이어티에 컨쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 관심 대상 모이어티(예컨대, 커플링 모이어티를 포함하는 모이어티, 예컨대, 본 명세서에 기재된 바와 같은 피라잘리논 또는 피라잘리논 유도체)에 대한 컨쥬게이트에 적합한 1개 이상의 반응성 기를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 폴리펩타이드는 관심 대상 모이어티에 컨쥬게이션되기 전에 변형될 수 있다. 폴리펩타이드의 변형은 관심 대상 모이어티에의 컨쥬게이션을 위하여 적합한 1개 이상의 반응성 기를 함유하는 변형된 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.
몇몇 경우에, 폴리펩타이드는 관심 대상 모이어티(예컨대, 커플링 모이어티를 포함하는 모이어티, 예컨대, 본 명세서에 기재된 바와 같은 피라잘리논 또는 피라잘리논 유도체)에의 컨쥬게이션을 위하여 적합한 1개 이상의 반응성 기를 제공하기 위하여 1개 이상의 아미노산 잔기에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 내로 도입된 카보닐은 아미노옥시- 및 하이드라자이드-보유 화합물 등과 같은 α-친핵체와 선택적으로 반응될 수 있다. 증대된 반응속도, 부위 특이성 및 컨쥬게이트 안정성을 지니는 단백질 상에 카보닐 작용기에 대해서 선택적인 화학은 개선된 바이오컨쥬게이트를 초래하고, 본 명세서에 개시된 바와 같은 새로운 생성물 및 치료적 표적에의 접근을 제공할 수 있다.
소정의 실시형태에 있어서, 폴리펩타이드는 알데하이드 태그(즉, 표지)를 포함하도록 변형될 수 있다. "알데하이드 태그" 또는 "ald-태그"란, 2-폼일글라이신 잔기(본 명세서에서 "fGly"로 지칭함)를 함유하는 폼일글라이신 생성 효소(FGE)의 작용에 의해 전환될 수 있거나 전환된, 설파타제 모티프로부터 유래된 아미노산 서열을 함유하는 아미노산 서열을 의미한다. FGE에 의해 생성된 fGly 잔기는 "폼일글라이신"으로서 문헌에서 종종 지칭된다. 달리 말하면, "알데하이드 태그"란 용어는, "전환되지 않은" 설파타제 모티프(즉, 시스테인 혹은 세린 잔기가 전환될 수는 있지만 FGE에 의해 fGly로 전환되지 않은 설파타제 모티프, 예컨대, 서열을 지니는 설파타제 모티프: L(C/S)TPSR)를 포함하는 아미노산 서열뿐만 아니라 "전환된" 설파타제 모티프(즉, 시스테인 혹은 세린 잔기가 FGE의 작용에 의해 fGly로 전환된 설파타제 모티프, 예컨대, L(fGly)TPSR)를 지칭하기 위하여 본 명세서에서 이용된다. 설파타제 모티프에 대한 폼일글라이신 생성 효소(FGE)의 작용의 맥락에서 이용되는 "전환"은, 설파타제 모티프 내의 시스테인 혹은 세린 잔기의 폼일글라이신(fGly) 잔기로(예컨대, Cys에서 fGly로, 또는 Ser에서 fGly로)의 생화학적 변형을 지칭한다. 알데하이드 태그의 추가적인 양상 및 부위-특이적 단백질 변형에서의 그의 용도는 미국 특허 제7,985,783호에 기재되어 있으며, 이 문헌의 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입된다.
fGly를 포함하도록 폴리펩타이드의 전환은 세포계(생체내) 또는 무세포 방법(시험관내)에 의해 달성될 수 있다. 마찬가지로, 컨쥬게이션을 위해 적합한 폴리펩타이드를 제조하기 위한 폴리펩타이드의 변형(예컨대, 컨쥬게이션에 적합한 반응성 기를 함유하는 폴리펩타이드를 제조하기 위한 변형)은 세포계(생체내) 또는 무세포 방법(시험관내)에 의해 달성될 수 있다.
대안적으로, 단리된 비변형 폴리펩타이드는 적절한 효소를 결여하는 숙주 세포에서 재조합 생산 후에 또는 합성 제조에 의해 단될 수 있다. 단리된 폴리펩타이드는 이어서 fGly를 포함하는 폴리펩타이드의 소망의 변형을 제공하는 조건 하에 적절한 효소와 접촉될 수 있다. 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 열, pH 조절, 카오트로픽 제제(예컨대, 요소 등), 유기 용매(예컨대, 탄화수소: 옥탄, 벤젠, 클로로폼) 등) 및 적절한 효소와 접촉된 변성된 단백질에 의해 펴질 수 있다. 변형된 폴리펩타이드는 적절한 조건 하에 다시 접힐 수 있다.
몇몇 경우에, fGly 잔기를 함유하는 변형된 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 화합물(예컨대, 커플링 모이어티를 함유하는 화합물, 예컨대, 본 명세서에 기재된 바와 같은 피라잘리논 또는 피라잘리논 유도체)과 fGly의 반응에 의해 관심 대상 모이어티에 컨쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, fGly-함유 폴리펩타이드는 제조 공급원(예컨대, 재조합 숙주 세포 제조, 합성 제조)으로부터 단리되어, 폴리펩타이드에 약물 혹은 다른 모이어티의 컨쥬게이션을 제공하기에 적합한 조건 하에서 반응 파트너-함유 약물 또는 다른 모이어티(예컨대, 검출 가능한 표지)와 접촉될 수 있다. 예를 들어, 반응 파트너-함유 약물 또는 다른 모이어티는 반응성 모이어티(예컨대, 본 명세서에 기재된 바와 같은 피라잘리논 또는 피라잘리논 유도체)를 포함할 수 있다. 피라잘리논-함유 약물 또는 다른 모이어티는 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 컨쥬게이트를 제조하기 위하여 폴리펩타이드와 반응할 수 있다. 예를 들어, 도 1은 본 발명의 실시형태들에 따른 폴리펩타이드 컨쥬게이트의 개략도를 도시한다. 도 1A는 환식 커플링 모이어티를 포함하는 폴리펩타이드 컨쥬게이트의 제조를 위한 반응식을 도시한다. 도 1A에서, fGly를 포함하는 폴리펩타이드는 환식 커플링 모이어티를 포함하는 폴리펩타이드 컨쥬게이트를 제조하기 위하여 환식 커플링 모이어티(예컨대, 피라잘리논 또는 피라잘리논 유도체)와 반응한다. 도 1B는 비환식 커플링 모이어티를 포함하는 폴리펩타이드 컨쥬게이트의 제조 반응식을 도시한다. 도 1B에서, fGly를 포함하는 폴리펩타이드는 비환식 커플링 모이어티를 포함하는 폴리펩타이드 컨쥬게이트를 제조하기 위하여 비환식 커플링 모이어티와 반응한다.
몇몇 경우에, fGly 잔기를 함유하는 변형된 폴리펩타이드는, 제한 없이, 이하의 화합물들 중 하나 등과 같은 화합물과 fGly의 반응에 의해 관심 대상 모이어티에 컨쥬게이트될 수 있다:
Figure pct00018
(디메돈);
Figure pct00019
(멜드럼의 산);
Figure pct00020
(바비투르산);
Figure pct00021
(테트론산); 또는
Figure pct00022
(4-하이드록시-6-메틸-2H-피란-2-온).
폴리펩타이드 컨쥬게이트
폴리펩타이드는 광범위한 모이어티의 부착을 제공하기 위하여 컨쥬게이션이 실시될 수 있다. 관심 대상 모이어티의 예는, 약물, 검출 가능한 표지, 소분자, 수용성 중합체, 펩타이드 등(본 명세서에서 "페이로드"(payload) "카고"라고도 지칭됨)을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명은 위에서 기재된 바와 같이 폴리펩타이드 컨쥬게이트를 제공한다.
관심 대상 모이어티는 폴리펩타이드의 잔기와 반응하기 위한 반응 파트너의 성분으로서 제공된다. 소정의 실시형태에 있어서, 폴리펩타이드 컨쥬게이션 방법은 폴리펩타이드에 적합한 반응 조건과 양립 가능하다. 예를 들어, 반응 조건은 물을 포함하는 반응 혼합물을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 반응 혼합물은, 예를 들어, pH 4 내지 11, 또는 pH 5 내지 10, 또는 pH 6 내지 9, 또는 pH 6 내지 8 등(이들로 제한되는 것은 아님)과 같은, 폴리펩타이드와 양립 가능한 pH를 지닐 수 있다. 소정의 경우에, 반응 혼합물은 pH 7을 지닌다. 몇몇 실시형태에 있어서, 반응 조건은 폴리펩타이드와 양립 가능한 온도에서 수행된다. 예를 들어, 반응 조건은, 20℃ 내지 45℃, 예컨대, 25℃ 내지 40℃, 또는 30℃ 내지 40℃, 또는 35℃ 내지 40℃의 온도일 수 있다. 몇몇 경우에, 반응 조건은 실온(예컨대, 25℃)이다. 몇몇 경우에, 반응 조건은 37℃의 온도이다.
본 발명에 의하면, 당업자라면 본 명세서에서 상정되는 바와 같은 폴리펩타이드에의 컨쥬게이션을 위한 반응 파트너를 제공하기 위하여 각종 모이어티의 어느 것이라도 용이하게 채택할 수 있다. 당업자라면 pH 및 입체구조적 간섭(즉, 관심 반응 파트너와의 반응에 대한 변형된 아미노산 잔기의 접근성)과 같은 인자가 중요함을 인지할 것이다. 최적 컨쥬게이션 조건을 제공하기 위해 반응 조건을 변형시키는 것은 충분히 당업자의 기술 범위 내이며, 당업계에서 통상적인 것이다. 컨쥬게이션이 살아있는 세포 내 또는 상에 존재하는 폴리펩타이드를 이용하여 수행되는 경우, 생리학적으로 양립되는 조건이 선택된다. 예를 들어, 반응이 일어나기에 충분한 시간 동안, 세포에 의해 용인되는 기간 내(예를 들어, 약 30분 내지 1시간)에 pH가 일시적으로 하락될 수 있다. 세포 표면 상에서 폴리펩타이드의 변형을 수행하기 위한 생리학적 조건은 세포-표면 아자이드를 보유하는 세포의 변형에서 케톤-아자이드 반응에서 사용되는 것과 유사할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,570,040호 참조).
소정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 폴리펩타이드 컨쥬게이트를 포함하되, 이때, 폴리펩타이드는 항체이다. 그와 같이, 실시형태는 관심 대상 모이어티에 컨쥬게이트된 항체를 포함하며, 이때 관심 대상 모이어티에 컨쥬게이트된 항체를 "항체 컨쥬게이트"라 지칭한다. Ig 폴리펩타이드는 일반적으로 적어도 Ig 중쇄 불변 영역 또는 Ig 경쇄 불변 영역을 포함하고, Ig 가변 영역(예컨대, VL 영역 및/또는 VH 영역)을 더 포함할 수 있다. Ig 중쇄 불변 영역은 임의의 중쇄 동형(isotype)의 Ig 불변 영역, 비자연 발생적 Ig 중쇄 불변 영역(컨센서스 Ig 중쇄 불변 영역을 포함함)을 포함한다. Ig 불변 영역은, 관심 대상 모이어티가 Ig 불변 영역의 용액-접근 가능한 루프 영역에 혹은 그에 인접하여 존재할 경우에, 관심 대상 모이어티에 컨쥬게이트되도록 변형될 수 있다.
몇몇 경우에, 본 발명의 항체 컨쥬게이트는, 1) 하나 이상의 관심 대상 모이어티에 컨쥬게이트된 Ig 중쇄 불변 영역 및 하나 이상의 관심 대상 모이어티에 컨쥬게이트된 Ig 경쇄 불변 영역; 2) 하나 이상의 관심 대상 모이어티에 컨쥬게이트된 Ig 중쇄 불변 영역 및 관심 대상 모이어티에 컨쥬게이트된 Ig 경쇄 불변 영역; 또는 3) 관심 대상 모이어티에 컨쥬게이트된 Ig 중쇄 불변 영역 및 하나 이상의 관심 대상 모이어티에 컨쥬게이트된 Ig 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 대상 항체 컨쥬게이트는 또한 가변 VH 및/또는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 위에서 기재된 바와 같이, 하나 이상의 관심 대상 모이어티는, 단일의 아미노산 잔기(예컨대, 단일의 아미노산 잔기에 컨쥬게이트된 1개 혹은 2개의 관심 대상 모이어티)에서 Ig 중쇄 불변 영역 또는 Ig 경쇄 불변 영역에 컨쥬게이트될 수 있거나, 또는 2개 이상의 상이한 아미노산 잔기에서 Ig 중쇄 불변 영역 및/또는 Ig 경쇄 불변 영역에 컨쥬게이트될 수 있다.
본 발명의 항체 컨쥬게이트는, 컨쥬게이트된 모이어티로서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 다양한 화합물, 예컨대, 약물(예컨대, 펩타이드 약물, 소분자 약물 등), 수용성 중합체, 검출 가능한 표지, 합성 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
항체 컨쥬게이트는, 위에서 기재된 바와 같이, 예컨대, 암 세포 상에 존재하는 항원; 자가면역 세포 상에 존재하는 항원; 병원성 미생물 상에 존재하는 항원; 바이러스 감염된 세포(예컨대, 인간 면역 결핍 바이러스 감염된 세포) 상에 존재하는 항원, 예컨대, CD4 또는 gp120; 병에 걸린 세포 상에 존재하는 항원 등을 포함하는 다양한 항원-결합 특이성의 어느 것이라도 지닐 수 있다. 예를 들어, 항체 컨쥬게이트는, 위에서 언급된 바와 같이, 항원이 세포의 표면 상에 존재하는 경우, 항원을 결합할 수 있다. 본 발명의 항체 컨쥬게이트는, 적절한 결합 친화도, 예컨대, 5 x 10-6M 내지 10-7M, 10-7M 내지 5 x 10-7M, 5 x 10-7M 내지 10-8M, 10-8M 내지 5 x 10-8M, 5 x 10-8M 내지 10-9M, 또는 10-9M보다 큰 결합 친화도를 지니는 항원을 결합할 수 있다.
비제한적인 예로서, 대상 항체 컨쥬게이트는 암 세포 상에 존재하는 항원(예컨대, 종양-특이적 항원; 암 세포 상에 과발현되는 항원 등)을 결합할 수 있고, 컨쥬게이트된 모이어티는 세포독성 화합물(예컨대, 세포독성 소분자, 세포독성 합성 펩타이드 등)일 수 있다. 예를 들어, 대상 항체 컨쥬게이트는, 컨쥬게이트된 모이어티가 세포독성 화합물(예컨대, 세포독성 소분자, 세포독성 합성 펩타이드 등)인 경우, CD19에 대해서 특이적일 수 있다. 다른 예로서, 대상 항체 컨쥬게이트는, 컨쥬게이트된 모이어티가 세포독성 화합물(예컨대, 세포독성 소분자, 세포독성 합성 펩타이드 등)일 수 있는 경우, CD22에 대해서 특이적일 수 있다.
추가의 비제한적인 예로서, 대상 항체 컨쥬게이트는 바이러스로 감염된 세포 상에 존재하는 항원을 결합할 수 있고(예컨대, 항원이 바이러스에 의해 암호화되는 경우; 항원이 바이러스에 의해 감염된 세포 유형 상에 발현되는 경우 등), 컨쥬게이트된 모이어티는 바이러스 융합 저해제일 수 있다. 예를 들어, 대상 항체 컨쥬게이트는 CD4를 결합할 수 있고, 컨쥬게이트된 모이어티는 바이러스 융합 저해제일 수 있다. 다른 예로서, 대상 항체 컨쥬게이트는 gp120을 결합할 수 있고, 컨쥬게이트된 모이어티는 바이러스 융합 저해제일 수 있다.
본 발명의 실시형태들은 또한 폴리펩타이드가 운반 단백질인 폴리펩타이드 컨쥬게이트를 포함한다. 예를 들어, 운반 단백질은 약물-함유 스캐폴드를 제공하기 위하여 약물에 공유적으로 그리고 부위-특이적으로 결합될 수 있다. 운반 단백질은 약물(예컨대, 펩타이드, 소분자 약물 등), 검출 가능한 표지 등과 같은 관심 대상 공유 결합 분자에 부위-특이적으로 컨쥬게이트될 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, 약물-스캐폴드 컨쥬게이트는 약물의 증대된 혈청 반감기를 제공할 수 있다.
일반적으로 "운반 단백질"은 본 명세서에 개시된 바와 같이 변형되기 쉬운 생물학적으로 불활성인 단백질이며, 생리학적 환경에서 운반 단백질 내의 변형된 아미노산 잔기를 통해서(예컨대, 알데하이드 표지된 운반 단백질의 전환된 설파타제 내에서 옥심 또는 하이드라존 결합을 통해서) 운반 단백질에 컨쥬게이트된 관심 대상 모이어티의 용매-접근 가능한 제시를 제공할 수 있다. "생물학적으로 불활성"이란, 운반 단백질이 인간 대상체에 투여되는 등과 같이 적절한 대상체에게 투여될 경우 임상적으로 무의미하거나 검출가능하지 않은 생물학적 활성을 발휘하는 것을 나타내는 것을 의미한다. 따라서, 운반 단백질은, 예를 들어, 낮은 면역원성이거나, 유의한 혹은 검출가능한 표적화 특성을 나타내지 않고(예컨대, 특정 수용체에 결합 시 유의한 혹은 검출가능한 표적화 특성을 나타내지 않고), 알데하이드-표지된 운반 단백질에 컨쥬게이트된 모이어티(예컨대, 약물 또는 검출 가능한 표지)의 활성을 간섭할 수 있는 거의 혹은 전혀 검출가능하지 않은 생물학적 활성을 나타내는 점에서 생물학적으로 불활성이다. "낮은 면역원성"이란, 운반 단백질이 대상체, 예를 들어, 포유동물 대상체, 예컨대, 인간 대상체에게 투여 시 거의 혹은 전혀 검출가능하지 않은 면역 반응을 유도하는 것을 의미한다. 운반 단백질은 단량체 혹은 다량체(예컨대, 이량체) 형태로 제공될 수 있다.
변형되기 쉬운 다수의 상이한 용매-접근가능한 부위(따라서 관심 대상 모이어티에의 컨쥬게이션)를 제공하는, 접혔을 때 3차원 구조를 지니는 운반 단백질이 관심 대상이다. 일반적으로, 관심 대상 운반 단백질은 관심 대상 컨쥬게이트된 모이어티 혹은 모이어티들의 활성 및 생물학적 이용 가능성을 제공하기 위하여 충분히 공간적으로 분리된 방식으로 용매 접근가능한 표면 상에 관심 대상 컨쥬게이트된 모이어티의 제시를 제공하기 위하여 3차원적으로 접힌 구조 및 크기를 지닌 것들이다. 운반 단백질은 운반 단백질에 컨쥬게이트될 모이어티(예컨대, 약물 또는 검출 가능한 표지)를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 많은 인자에 따라서 선택될 수 있다.
따라서, 광범위한 폴리펩타이드의 어느 것이라도 본 발명의 운반 단백질 컨쥬게이트에서 이용하기 위한 운반 단백질로서 이용하기에 적합할 수 있다. 이러한 운반 단백질은 자연-발생적 아미노산 서열, 자연-발생적 폴리펩타이드의 단편, 및 비자연 발생적 폴리펩타이드 및 그의 단편을 지니는 것들을 포함한다.
운반 단백질의 예는, 알부민 및 그의 단편(예컨대, 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민 등), 트랜스페린 및 그의 단편(예컨대, 인간 트랜스페린), 및 포유류 Fc 수용체, 특히 인간 Fc 수용체에 대한 감소된 결합을 지니는 Fc 단편(예를 들어, 항체(예컨대, IgG), 예컨대, 포유류 항체, 예컨대, 인간 항체의 변형된 Fc 단편)를 포함한다. 감소된 Fc 수용체 결합을 지니는 변형된 Fc 단편의 예는 허셉틴(Herceptin)(트라스투주맙) 및 리툭산(Rituxan)(리툭시맙)의 Fc 단편에 의해 예시되며, 이는 감소된 Fc 수용체 결합을 제공하는 점 돌연변이를 포함한다(예컨대, 문헌[Clynes et al., Nature Medicine (2000), 6, 443-446] 참조). 대안적으로 혹은 부가적으로, Fc 단편의 동형은 목적으로 하는 수준의 Fc 수용체 결합(예컨대, IgG1 또는 IgG3보다 오히려 IgG4 동형 인간 중쇄 불변 영역의 Fc 단편의 사용)에 따라서 선택될 수 있다(예컨대, 문헌[Fridman FASEB J 1991 Sep; 5 (12): 2684-90] 참조). 일반적으로, 운반 단백질은 적어도 약 4 kDa(예컨대, 약 50개의 아미노산 잔기 길이), 통상 적어도 약 25 kDa일 수 있고, 보다 큰 크기일 수 있다(예컨대, 트랜스페린은 90kDa의 분자량을 지니는 한편, Fc 단편은 30kDa 내지 50kDa의 분자량을 지닐 수 있다).
본 명세서에 기재된 컨쥬게이트는, 형광 또는 에피토프 표지화를 이용하는 가시화(예컨대, 본 명세서에 기재된 화합물 및 컨쥬게이트에 컨쥬게이션을 위한 반응성 기를 장착한 금 입자를 이용하는 전자 현미경); 단백질 고정화(예컨대, 단백질 마이크로어레이 제작); 단백질 동력학 및 위치추적 연구 및 응용; 및 관심 대상 모이어티(예컨대, 모 단백질의 반감기를 향상시키는 모이어티(예컨대, 폴리(에틸렌 글라이콜))를 지닌 단백질의 컨쥬게이션, 표적화 모이어티(예컨대, 작용 부위에의 전달을 증대시키기 위한 것), 및 생물학적으로 활성인 모이어티(예컨대, 치료적 모이어티)를 포함하는 다양한 용도를 위하여 이용될 수 있다.
폴리펩타이드 컨쥬게이트는 광범위한 기능 혹은 특징들 중 하나 이상을 제공하는 모이어티 또는 모이어티들에 컨쥬게이트된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일반적으로 모이어티의 예는, 이하의 것들: 검출 가능한 표지(예컨대, 형광 표지); 광-활성화 동력학 모이어티(예컨대, 아조벤젠 매개 포어 폐쇄, 아조벤젠 매개 구조 변화, 포토디케이징(photodecaging) 인지 모티프); 수용성 중합체(예컨대, 페길화); 정제 태그(예컨대, 친화성 크로마토그래피에 의한 단리를 용이하게 하기 위함(예컨대, FLAG 에피토프의 부착); 멤브레인 국소화 도메인(예컨대, 지질 또는 글라이코포스파티딜이노시톨(GPI)형 앵커); 고정 태그(예컨대, 선택적 부착을 포함하는 표면으로의 폴리펩타이드의 부착을 촉진함); 약물(예컨대, 항체로의 약물의 부착을 통해 약물 표적화를 촉진함); 표적화된 전달 모이어티(예컨대, 표적 수용체(예를 들어, 바이러스 부착, 리포솜 상에 존재하는 표적화 단백질의 부착 등을 촉진함)로의 결합을 위한 리간드) 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
구체적인 비제한적인 예가 이하에 제공된다.
폴리펩타이드에 대한 컨쥬게이션용의 약물
폴리펩타이드에 대해서 컨쥬게이트하기 위한 반응 파트너로서, 많은 수의 약물이 이용되기 적합하거나 또는 사용하기에 적합하게 되도록 변형될 수 있다. 약물의 예로는 소분자 약물 및 펩타이드 약물을 포함한다. 이와 같이 해서, 본 발명은 약물-폴리펩타이드 컨쥬게이트를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "소분자 약물"은 관심대상의 약제학적 활성을 나타내고, 일반적으로 분자량이 약 800 Da 이하 또는 2000 Da 이하인 화합물, 예컨대, 유기 화합물을 지칭하지만, 상기 화합물은 최대 5kDa의 분자를 포괄할 수 있고, 무려 약 10 kDa일 수 있다. 무기 소분자는 탄소원자를 함유하지 않은 분자를 가리키고, 반면 유기 소분자는 적어도 1개의 탄소원자를 함유하는 화합물을 가리킨다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "펩타이드 약물"은 아미노산 함유 중합체성 화합물을 지칭하며, 이것은 자연 발생적 및 비-자연 발생적 펩타이드, 올리고펩타이드, 환식 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질뿐만 아니라 펩타이드 모방체를 포괄하는 것을 의미한다. 펩타이드 약물은 화학적 합성에 의해 획득되거나 또는 유전자 암호화된 공급원(예를 들어, 재조합체 공급원)으로부터 생성될 수 있다. 펩타이드 약물은 분자량 범위를 지닐 수 있고, 200 Da 내지 10 kDa 또는 그 이상의 분자량일 수 있다.
몇몇 경우에, 약물은 암 화학요법제이다. 예를 들어, 폴리펩타이드가 종양 세포에 대한 특이성을 지니는 항체(또는 그의 단편)인 경우, 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형되어 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 이것은 이어서 암 화학요법제에 컨쥬게이트될 수 있다. 암 화학요법제는 암 세포의 증식을 감소시키고, 세포독성제 및 세포 증식 억제제를 아우르는 비-펩타이드성(즉, 비-단백질계) 화합물을 포함한다. 화학요법제의 비제한적인 예는 알킬화제, 나이트로조유레아, 항대사물질, 항종양 항생물질, 식물 (빈카) 알칼로이드 및 스테로이드 호르몬을 포함한다. 펩타이드성 화합물 또한 사용될 수 있다.
적절한 암 화학요법제는 돌라스타틴 및 그의 활성 유사체 및 유도체; 및 아우리스타틴 및 그의 활성 유사체 및 유도체를 포함한다. 예컨대, WO 96/33212, WO 96/14856 및 미국 특허 제6,323,315호 참조. 예를 들어, 돌라스타틴 10 또는 아우리스타틴 PE는 본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트에 포함될 수 있다. 적절한 암 화학요법제는 또한 마이탄시노이드 및 그의 활성 유사체 및 유도체(예를 들어, EP 1391213; 및 문헌[Liu et al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623] 침저); 및 두오카르마이신 및 그의 활성 유사체 및 유도체(예를 들어, 합성 유사체, KW-2189 및 CB 1-TM1 포함)를 포함한다.
세포 증식을 감소시키는 역할을 하는 제제들은 당업계에 알려져 있고 널리 사용된다. 이와 같은 제제에는 질소 머스타드, 나이트로조유레아, 에틸렌이민 유도체, 알킬 설포네이트 및 트라이아젠 등과 같은 알킬화제, 예컨대, 비제한적으로, 메클로레타민, 사이클로포스파마이드(사이톡산(Cytoxan)(상표명)), 멜팔란(L-사르코라이신), 카무스틴(BCNU), 로무스틴(CCNU), 세무스틴(메틸-CCNU), 스트렙토조신, 클로로조토신, 유라실 머스타드, 클로르메틴, 이포스파마이드, 클로람부실, 피포브로만, 트라이에틸렌멜라민, 트라이에틸렌티오포스포라민, 부설판, 다카바진 및 테모졸로마이드를 포함한다.
항대사물질 제제에는 엽산 유사체, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 아데노신 데아미나아제 저해제, 예컨대, 비제한적으로 시타라빈(시토사-U(CYTOSAR-U)), 시토신 아라비노사이드, 플루오로유라실(5-FU), 플록스유리딘(FudR), 6-티오구아닌, 6-머캅토퓨린(6-MP), 펜토스타틴, 5-플루오로유라실(5-FU), 메토트렉세이트, 10-프로파길-5,8-디데아자폴레이트(PDDF, CB3717), 5,8-다이데아자테트라하이드로엽산(DDATHF), 류코보린, 플루다라빈 포스페이트, 펜토스타틴 및 젬시타빈을 포함한다.
적절한 천연생성물 및 이들의 유도체(예를 들어, 빈카 알칼로이드, 항종양 항생물질, 효소, 림포카인 및 에피포도필로톡신)는, 아라-C(Ara-C), 파클리탁셀(탁솔(Taxol)(등록상표)), 도세탁셀(탁소테레(Taxotere)(등록상표)), 데옥시코포마이신, 미토마이신-C, L-아스파라기나제, 아자티오프린; 브레퀴나르; 알칼로이드, 예컨대, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신 등; 포도필로톡신, 예컨대, 에토포사이드, 테니포사이드 등; 항생제, 예컨대, 안트라사이클린, 다우노루비신 염산염(다우노마이신, 루비도마이신, 세루비딘), 이다루비신, 독소루비신, 에피루비신 및 몰폴리노 유도체 등; 페녹시존 비스사이클로펩타이드, 예컨대, 닥티노마이신; 염기성 글라이코펩타이드, 예컨대, 블레오마이신; 안트라퀴논 글라이코사이드, 예컨대, 플리카마이신(미트라마이신); 안트라세네디온, 예컨대, 미톡산트론; 아지리노피롤로 인돌다이온, 예컨대, 미토마이신; 거대환식 면역억제제, 예컨대, 사이클로스포린, FK-506(타크롤리무스, 프로그라프), 라파마이신 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
기타 항증식 세포독성 약제는 나벨벤, CPT-11, 아나스트라졸, 레트라졸, 카페시타빈, 레록사핀, 사이클로포스파마이드, 이포사마이드 및 드로록사핀이다.
항증식 활성을 갖는 미세소관 영향 제제(microtubule affecting agent) 또한 사용하기에 적합하고, 비제한적으로, 알로콜히친(NSC406042), 할리콘드린 B(NSC 609395), 콜히친(NSC 757), 콜히친 유도체(예를 들어, NSC 33410), 돌스타틴 10(NSC 376128), 마이탄신(NSC 153858), 리족신(NSC 332598), 파클리탁셀(탁솔(Taxol)(등록상표)), 탁솔(Taxol) 유도체, 도세탁셀(탁소테레(Taxotere)(등록상표)), 티오콜히친(NSC 361792), 트리틸 시스테린, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 천연 및 합성 에포틸론, 예컨대, 비제한적으, 에포틸론 A, 에포틸론 B, 디스코데르몰라이드; 에스트라무스틴, 노코다졸 등을 포함한다.
사용하기에 적합한 호르몬 조절제 및 스테로이드(합성 유사체 포함)는, 비제한적으로, 부신피질스테로이드, 예컨대, 프레드니손, 덱사메타손 등; 에스트로겐 및 프로게스테론, 예컨대, 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트, 에스트라다이올, 클로미펜, 타목시펜 등; 및 부신피질 억제제, 예컨대. 아미노글루테티이미드; 17α-에티닐에스트라다이올; 다이에틸스틸베스트롤, 테스토스테론, 플루옥시메스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 테스토락톤, 메틸프레드니솔론, 메틸-테스토스테론, 프레드니솔론, 트하이암시놀론, 클로로트라이아니센, 하이드록시프로게스테론, 아미노글루테티미드, 에스트라무스틴, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 류프롤라이드, 플루타마이드(드로게닐(Drogenil)), 토레미펜(파레스톤(Fareston)) 및 졸라덱스(Zoladex)(등록상표)를 포함한다. 에스트로겐은 증식 및 분화를 자극하고; 따라서, 에스트로겐 수용체에 결합된 화합물이 이와 같은 활성을 차단하는데 사용된다. 코르티코스테로이드는 T 세포 증식을 저해할 수 있다.
기타 적절한 화학요법 제제는 금속 복합체, 예컨대, 시스플라틴(시스-DDP), 카보플라틴 등; 요소, 예컨대, 하이드록시우레아; 및 하이드라진, 예컨대, N-메틸하이드라진; 에피도필로톡신; 토포아이소머라제 저해제; 프로카바진; 미톡산트론; 류코보린; 테가푸르 등을 포함한다. 기타 관심대상 항증식제는 면역억제제, 예컨대, 마이코페놀산, 탈리도마이드, 데속시스페르구알린, 아자스포린, 레플루노마이드, 미조리빈, 아자스피란(SKF 105685); 이레사(Iressa)(등록상표)(ZD 1839, 4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-메톡시-6-(3-(4-몰리닐)프로폭시)퀴나졸린) 등을 포함한다.
탁산이 사용하기에 적합하다. "탁산"은 모든 활성 탁산 유도체 또는 전구약물뿐만 아니라 파클리탁셀을 포함한다. "파클리탁셀"(이것은 본 명세서에서 유사체, 제형 및 유도체, 예컨대, 도세탁셀, 탁솔(TAXOL)(등록상표), 탁소테레(TAXOTERE)(등록상표)(도세탁셀의 제형), 파클리탁셀의 10-데스아세틸 유사체 및 파클리탁셀의 3'N-데스벤조일-3'N-t-뷰톡시카보닐 유사체를 포함하는 것으로 이해되어야 함)은 당업자에게 잘 알려진 수법들을 활용하여 쉽게 제조되거나(또한 WO 94/07882, WO 94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076; 미국 특허 제5,294,637호; 제5,283,253호; 제5,279,949호; 제5,274,137호; 제5,202,448호; 제5,200,534호; 제5,229,529호; 및 EP 590,267 참조), 또는 다양한 상업적 공급원, 예를 들어, 미주리주의 세인트루이스시에 소재한 시그마 케미컬사(Sigma Chemical Co.)(탁서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia)로부터의 T7402; 또는 탁서스 얀나넨시스(Taxus yannanensis)로부터의 T-1912)에서 획득될 수 있다.
파클리탁셀은 파클리탁셀의 화학적으로 입수 가능한 일반적 형태를 가리킬 뿐만 아니라, 유사체 및 유도체(예를 들어, 위에서 언급된 탁소테레(Taxotere)(등록상표), 도세탁셀) 및 파클리탁셀 컨쥬게이트(예를 들어, 파클리탁셀-PEG, 파클리탁셀-덱스트란 또는 파클리탁셀-자일로스) 또한 가리키는 것이 이해되어야 한다.
"탁산"이란 용어는 또한 잘 알려진 다양한 유도체가 포함되는데, 예컨대, 친수성 유도체 및 소수성 유도체가 모두 포함된다. 탁산 유도체는, 비제한적으로 국제특허출원 공개 제WO 99/18113호에 기술된 갈락토스 및 만노스 유도체; WO 99/14209에 기술된 피페라지노 및 기타 유도체; WO 99/09021, WO 98/22451 및 미국 특허 제5,869,680호에 기술된 탁산 유도체; WO 98/28288에 기술된 6-티오 유도체; 미국 특허 제5,821,263호에 기술된 설펜아마이드 유도체; 및 미국 특허 제5,415,869호에 기술된 탁솔 유도체를 포함한다. 추가로 이것은 파클리탁셀의 전구약물을 포함하는데, 비제한적으로 WO 98/58927; WO 98/13059; 및 미국 특허 제5,824,701호에 기술된 것들을 포함한다.
사용하기에 적합한 생물학적 반응 조절제는 (1) 티로신 키나제(RTK) 활성의 저해제; (2) 세린/트레오닌 키나제 활성의 저해제; (3) 종양-관련 항원 길항제, 예컨대, 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항체; (4) 세포자멸사 수용체 효능제; (5) 인터류킨-2; (6) IFN-α; (7) IFN-γ; (8) 집락-자극 인자; 및 (9) 혈관형성의 저해제를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
반응 파트너를 함유시키기 위한 약물의 변형 방법
폴리펩타이드에 컨쥬게이트되는 약물은 폴리펩타이드와의 반응을 위한 반응 파트너를 혼입시키도록 변형될 수 있다. 약물이 펩타이드 약물인 경우, 반응성 모이어티(예컨대, 아미노옥시 또는 하이드라자이드는 N-말단 영역, N-말단, C-말단 영역, C-말단, 또는 펩타이드에 대해 내부의 위치에 위치될 수 있다. 예를 들어, 예시적 방법은 아미노옥시기를 갖는 펩타이드 약물을 합성하는 것을 포함한다. 이러한 예에서, 펩타이드는 Boc-보호된 전구체로부터 합성된다. 펩타이드의 아미노기는 카복실산기 및 옥시-N-Boc기를 포함하는 화합물과 반응할 수 있다. 일례로서, 펩타이드의 아미노기는 3-(2,5-다이옥소피롤리딘-1-일옥시)프로판산과 반응한다. 카복실산기 및 옥시-N-보호기를 포함하는 화합물에 대한 다른 변이는 알킬렌 링커 및 알킬렌 링커 상의 치환체 내에 상이한 수의 탄소를 포함할 수 있다. 펩타이드의 아미노기와 카복실산기 및 옥시-N-보호기를 포함하는 화합물 사이의 반응은 표준 펩타이드 커플링 화학을 통해 발생한다. 사용될 수 있는 펩타이드 커플링 시약의 예는, DCC(다이사이클로헥실카보다이이미드), DIC(다이아이소프로필카보다이이미드), 다이-p-톨루오일카보다이이미드, BDP(1-벤조트라이아졸 다이에틸포스페이트-1-사이클로헥실-3-(2-몰폴리닐에틸)카보다이이미드), EDC(1-(3-다이메틸아미노프로필-3-에틸-카보다이이미드 하이드로클로라이드), 시아누릭 플루오라이드, 시아누릭 클로라이드, TFFH(테트라메틸 플루오로폼아미디늄 헥사플루오로포스포스페이트), DPPA(다이페닐포스포르아지데이트), BOP(벤조트라이아졸-1-일옥시트리스(다이메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트), HBTU(O-벤조트라이아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트), TBTU(O-벤조트라이아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트), TSTU(O-(N-숙신이미딜)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트), HATU(N-[(다이메틸아미노)-1-H-1,2,3-트라이아졸로[4,5,6]-피리딘-1-일메틸렌]- -N-메틸메탄아미늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥사이드), BOP-Cl(비스(2-옥소-3-옥사졸리디닐)포스피닉 클로라이드), PyBOP((1-H-1,2,3-벤조트라이아졸-1-일옥시)-트리스(피롤리디노)포스포늄 테트라플루오로포스페이트), BrOP(브로모트리스(다이메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트), DEPBT(3-(다이에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트라이아진-4(3H)-온) PyBrOP(브로모트리스(피롤리디노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트)를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 비제한적인 예로서, HOBt 및 DIC가 펩타이드 커플링 시약으로 사용될 수 있다.
아미노-옥시 작용기를 노출시키기 위한 탈보호가 N-보호기를 포함하는 펩타이드 상에 수행된다. 예를 들어, N-옥시숙신이미드기의 탈보호는 환식 아마이드기에 대한 표준 탈보호 조건에 따라 발생한다. 탈보호 조건은 문헌[Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Chemistry, 3rd Ed., 1999, John Wiley & Sons, NY and Harrison et al]에서 찾을 수 있다. 특정 탈보호 조건은 하이드라진 시약, 아미노 시약, 또는 수소화붕소나트륨을 포함한다. Boc 보호기의 탈보호는 TFA를 이용하여 발생할 수 있다. 탈보호를 위한 다른 시약은 하이드라진, 메틸하이드라진, 페닐하이드라진, 수소화붕소나트륨 및 메틸아민을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 생성물 및 중간생성물은 통상적인 수단, 예를 들어, HPLC 정제에 의해 정제될 수 있다.
당업자라면 pH 및 입체 장애(즉, 관심 반응 파트너와의 반응에 대한 아미노산 잔기의 접근성)와 같은 요인이 중요함을 인지할 것이다. 최적 컨쥬게이션 조건을 제공하기 위해 반응 조건을 변형시키는 것은 충분히 당업자의 기술 범위 내이며, 당업계에서 통상적인 것이다. 컨쥬게이션이 살아있는 세포 내 또는 상에 존재하는 폴리펩타이드를 이용하여 수행되는 경우, 생리학적으로 양립되는 조건이 선택된다. 예를 들어, 반응이 발생하기에 충분한 시간 동안, 그러나 그 세포에 의해 용인되는 기간 내(예를 들어, 약 30분 내지 1시간)에 pH가 일시적으로 하락될 수 있다. 세포 표면 상에서 폴리펩타이드의 변형을 수행하기 위한 생리학적 조건은 세포-표면 아자이드를 보유하는 세포의 변형에서 케톤-아자이드 반응에서 사용되던 것들과 유사할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,570,040호 참조).
본 명세서에 개시된 화합물 또는 컨쥬게이트와의 반응 파트너로 작용하는 α-친핵체 기를 함유하거나 함유하도록 변형된 소분자 화합물이 또한 본 발명의 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트에서 약물로서의 사용을 위하여 상정된다. 일반적 방법이 관심 화합물을 합성하는데 유용한 화학 합성 반응식 및 조건에 대해 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Fifth Edition, Wiley-Interscience, 2001; 또는 Vogel, A Textbook of Practical Organic Chemistry, Including Qualitative Organic Analysis, Fourth Edition, New York: Longman, 1978] 참조).
펩타이드 약물
몇몇 경우에, 컨쥬게이트는 공유적으로 결합된 펩타이드를 포함한다. 적합한 펩타이드는 세포독성 펩타이드; 혈관신생성 펩타이드; 항혈관신생성 펩타이드; B 세포를 활성화시키는 펩타이드; T 세포를 활성화시키는 펩타이드; 항바이러스성 펩타이드; 바이러스 융합을 저해하는 펩타이드; 하나 이상의 림프구 집단의 생성을 증가시키는 펩타이드; 항미생물 펩타이드; 성장 인자; 성장 호르몬-방출 인자; 혈관활성 펩타이드; 항염증성 펩타이드; 글루코스 대사를 조절하는 펩타이드; 항혈전성 펩타이드; 항통각수용성 펩타이드; 혈관확장제 펩타이드; 혈소판 응집 억제제; 진통제 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
몇몇 실시형태에 있어서, 펩타이드는 폴리펩타이드의 아미노산 잔기 또는 변형된 아미노산 잔기와 반응성인 기를 포함하도록 화학적으로 합성될 수 있다. 적합한 합성 펩타이드는 약 5개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 또는 100개 초과의 아미노산의 길이를 갖고; 예컨대, 적합한 펩타이드는 5개의 아미노산(aa) 내지 10개의 aa, 10개의 aa 내지 15개의 aa, 15개의 aa 내지 20개의 aa, 20개의 aa 내지 25개의 aa, 25개의 aa 내지 약 30개의 aa, 30개의 aa 내지 40개의 aa, 40개의 aa 내지 50개의 aa, 50개의 aa 내지 60개의 aa, 60개의 aa 내지 70개의 aa, 70개의 aa 내지 80개의 aa, 80개의 aa 내지 90개의 aa, 또는 90개의 aa 내지 100개의 aa의 길이를 갖는다.
소정의 실시형태에 있어서, 펩타이드는 α-친핵체-함유 모이어티(예컨대, 아미노옥시 또는 하이드라자이드 모이어티)를 함유하도록 변형될 수 있고, 예컨대, fGly-함유 폴리펩타이드와 반응되어, 폴리펩타이드 및 펩타이드가 하이드라존 또는 옥심 결합에 의해 각각 연결된 컨쥬게이트가 생성될 수 있다. 폴리펩타이드의 아미노산 잔기 또는 변형된 아미노산 잔기와 반응성인 반응성 기를 포함하는 합성 펩타이드와 같이 펩타이드를 합성하는 방법의 예가 위에 기재되어 있다.
적합한 펩타이드는 hLF-11(락토페린의 11개 아미노산의 N-말단 단편), 항미생물 펩타이드; 그래뉼리신(granulysin), 항미생물 펩타이드; 플렉타신(Plectasin)(NZ2114; SAR 215500), 항미생물 펩타이드; 바이러스 융합 억제제, 예컨대, 퓨제온(Fuzeon)(엔푸버타이드(enfuvirtide)), TRI-1249(T-1249; 예컨대, 문헌[Matos et al. (2010) PLoS One 5:e9830] 참조), TRI-2635(T-2635; 예컨대, 문헌[Eggink et al. (2009) J. Biol. Chem. 284:26941] 참조), T651 및 TRI-1144; C5a 수용체 저해제, 예컨대, PMX-53, JPE-1375 및 JSM-7717; POT-4, 인간 보체 인자 C3 저해제; 판크레에이트(Pancreate)(INGAP 유도체 서열, HIP-인간 프로아일릿(proislet) 단백질); 소마토스타틴; 소마토스타틴 유사체, 예컨대, DEBIO 8609(산바르(Sanvar)), 옥트레오타이드(octreotide), 옥트레오타이드(C2L), 옥트레오타이드 QLT, 옥트레오타이드 LAR, 산도스타틴(Sandostatin) LAR, SomaLAR, 소마툴린(Somatuline)(란레오타이드(lanreotide)), 예컨대, 문헌[Deghenghi et al. (2001) Endocrine 14:29] 참조; TH9507(테사모렐린(Tesamorelin), 성장 호르몬-방출 인자); POL7080(프로테그린(protegrin) 유사체, 항미생물 펩타이드); 릴랙신(relaxin); 코르티코트로핀 방출 인자 효능제, 예를 들어, 유로텐신(urotensin), 소바진(sauvagine) 등; 열 충격 단백질 유도체, 예를 들어, DiaPep277; 인간 면역결핍 바이러스 진입 저해제; 열 충격단백질-20 모방체(mimic), 예를 들어, AZX100; 트롬빈 수용체 활성화 펩타이드, 예를 들어, TP508(크리살린(Chrysalin)); 유로코르틴(urocortin) 2 모방체(예컨대, CRF2 효능제), 예를 들어, 유로코르틴-2; 면역 활성제, 예를 들어, 자닥신(Zadaxin)(티말파신(thymalfasin); 티모신(thymosin)-α1), 예를 들어, 문헌[Sjogren (2004) J. Gastroenterol. Hepatol. 19:S69] 참조; C형 간염 바이러스(HCV) 진입 저해제 E2 펩타이드, 예를 들어, HCV3; 심방 나트륨배설 펩타이드, 예를 들어, HANP(Sun 4936; 카르페리타이드(carperitide)); 아넥신 펩타이드; 디펜신(항미생물 펩타이드), 예를 들어, hBD2-4; 디펜신(항미생물 펩타이드), 예를 들어, hBD-3; 디펜신(항미생물 펩타이드), 예를 들어, PMX-30063; 히스타틴(histatin)(항미생물 펩타이드), 예를 들어, 히스타틴-3, 히스타틴-5, 히스타틴-6 및 히스타틴-9; 히스타틴(항미생물 펩타이드), 예를 들어, PAC-113; 인돌리시딘(indolicidin)(항미생물 펩타이드), 예를 들어, MX-594AN(옴니가닌(Omniganin); CLS001); 인돌리시딘(항미생물 펩타이드), 예를 들어, 옴니가드(Omnigard)(MBI-226; CPI-226); 항미생물 펩타이드, 예를 들어, 곤충 세크로핀(cecropin); 항미생물 펩타이드, 예를 들어, 락토페린(탈락토페린(talactoferrin)); LL-37/카텔리시딘(cathelicidin) 유도체(항미생물 펩타이드), 예를 들어, P60.4(OP-145); 마가이닌(magainin)(항미생물 펩타이드), 예를 들어, 펙시가난(Pexiganan)(MSI-78; 수포넥스(Suponex)); 프로테그린(protegrin)(항미생물 펩타이드), 예를 들어, IB-367(이세가난(Iseganan)); 아간(agan) 펩타이드; 베타-나트륨배뇨 펩타이드, 예를 들어, 나트레코르(Natrecor), 또는 노라탁(Noratak)(네시리타이드(Nesiritide)), 또는 울라리타이드(ularitide); 바이발라루딘(bivalarudin)(안지오맥스(Angiomax)), 트롬빈 저해제; C 펩타이드 유도체; 칼시토닌(calcitonin), 예를 들어, 미아칼신(Miacalcin)(포르티칼(Fortical)); 엔케팔린 유도체; 적혈구생성-자극 펩타이드, 예를 들어, 헤마타이드(Hematide); 틈새 이음 조정자, 예를 들어, 다네갭타이드(Danegaptide)(ZP1609); 가스트린-방출 펩타이드; 그렐린(ghrelin); 글루카곤-유사 펩타이드; 글루카곤-유사 펩타이드-2 유사체, 예를 들어, ZP1846 또는 ZP1848; 글루코사미닐 무라밀 다이펩타이드, 예를 들어, GMDP; 당펩타이드 항생제, 예를 들어, 오리타반신(Oritavancin); 테이코플라닌(teicoplanin) 유도체, 예를 들어, 달바바신(Dalbavancin); 생식샘자극호르몬 방출 호르몬(GnRH), 예를 들어, 졸라덱스(Zoladex)(루폰(Lupon)) 또는 트립토렐린(Triptorelin); 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제 뎁시펩타이드(depsipeptide), 예를 들어, PM02734(이르발렉(Irvalec)); 인테그린, 예를 들어, 엡티피바타이드(eptifibatide); 인슐린 유사체, 예를 들어, 휴물로그(Humulog); 카할라리드 뎁시펩타이드(kahalalide depsipeptide), 예를 들어, PM02734; 칼리크레인(kallikrein) 저해제, 예를 들어, 칼비터(Kalbitor)(에칼란타이드(ecallantide)); 항생제, 예를 들어, 텔라반신(Telavancin); 지질펩타이드, 예를 들어, 큐비신(Cubicin) 또는 MX-2401; 황체형성 호르몬 분비 호르몬(LHRH), 예를 들어, 고세렐린(goserelin); LHRH 합성 데카펩타이드 효능제 유사체, 예를 들어, 트레이스타(Treistar)(트립토렐린(triptorelin) 파모에이트); LHRH, 예를 들어, 엘리가드(Eligard); M2 단백질 통로 펩타이드 저해제; 메트렐렙틴(metreleptin); 멜라노코르틴 수용체 효능제 펩타이드, 예를 들어, 브레말라노타이드(bremalanotide)/PT-141; 멜라노코르틴(melanocortin); 무라밀 트라이펩타이드, 예를 들어, 메팍(Mepact)(미파무르타이드(mifamurtide)); 미엘린 염기성 단백질 펩타이드, 예를 들어, MBP 8298(디루코타이드(dirucotide)); N형 전압-작동 칼슘 통로 차단제, 예를 들어, 지코노타이드(Ziconotide)(프리알트(Prialt)); 부갑상샘 호르몬 펩타이드; 부갑상샘 유사체, 예를 들어, 768974; 펩타이드 호르몬 유사체, 예를 들어, UGP281; 프로스타글란딘(prostaglandin) F2-α 수용체 저해제, 예를 들어, PDC31; 프로테아제 저해제, 예를 들어, PPL-100; 수르팍신(surfaxin); 트로모브스폰딘-1(thromobspondin-1)(TSP-1) 모방체, 예를 들어, CVX-045 또는 ABT 510; 혈관작용성 장 펩타이드; 바소프레신; Y2R 효능제 펩타이드, 예를 들어, RG7089; 오바인펩타이드(obinepeptide); 및 TM30339를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
검출 가능한 표지
본 발명의 컨쥬게이트, 화합물 및 방법은 폴리펩타이드에 검출 가능한 표지를 컨쥬게이트시키는데 이용될 수 있다. 검출 가능한 표지의 예는 형광 분자(예컨대, 자가형광 분자, 시약과 접촉 시 형광을 발하는 분자 등), 방사성 표지(예컨대, 111In, 125I, 131I, 212B, 90Y, 186Rh 등), 바이오틴(예컨대, 바이오틴 및 아비딘의 반응을 통해 검출됨); 형광 태그; 조영 시약 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 검출가능한 표지는 또한 항체 결합, 예를 들어, 검출가능하게 표지된 항체의 결합 또는 샌드위치-타입 검정을 통한 결합된 항체의 검출에 의해 검출될 수 있는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 검출 가능한 표지의 추가의 예는, 염료 표지(예컨대, 발색단, 형광단, 예컨대, 비제한적으로, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)(등록상표) 형광 염료(예컨대, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)(등록상표) 350, 405, 430, 488, 532, 546, 555, 568, 594, 595, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700, 750, 790 등)), 생물리학 프로브(스핀 표지(spin label), 핵자기공명(NMR) 프로브), 포스터 공명 에너지 전달(FRET)형 표지(예컨대, 형광단/켄처(quencher) 쌍의 적어도 하나의 일원을 포함하는 FRET 쌍의 중 적어도 하나의 일원), 생물발광 공명 에너지 전달(BRET)형 표지(예를 들어, BRET 쌍 중 적어도 하나의 일원), 면역검출가능 태그(예컨대, FLAG, His(6) 등), 국소 태그(예컨대, 조직 또는 분자 세포 수준에서의 표지화된 폴리펩타이드의 회합(예컨대, 하나의 조직 유형 또는 특정 세포막과의 회합)을 확인하기 위함) 등) 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
표적 부위에 전달하기 위한 모이어티의 부착
본 발명의 실시형태들은 또한 약리학적 활성을 제공할 수 있거나, 다른 분자의 전달을 위한 표적으로 작용할 수 있는, 표적 부위(예컨대, 세포)에 전달하기 위한, 비제한적으로, 약물(예컨대, 소분자 약물), 독소 또는 기타 분자 등과 같은 1종 이상의 모이어티에 컨쥬게이트된 폴리펩타이드를 포함한다.
또한, 결합 파트너(예를 들어, 리간드, 수용체의 리간드-결합 부분, 리간드의 수용체-결합 부분 등)의 쌍 중 하나를 포함하는 컨쥬게이트가 상정된다. 예를 들어, 컨쥬게이트는 바이러스 수용체로서 작용하고, 바이러스 외피 단백질 또는 바이러스 캡시드 단백질과의 결합 시 변형된 폴리펩타이드가 발현되는 세포 표면에 대한 바이러스의 부착을 촉진시키는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 대안적으로, 컨쥬게이트는 변형된 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포의 검출 및/또는 분리를 촉진시키는 항체(예를 들어, 단클론성 항체)에 의해 특이적으로 결합되는 항원을 포함할 수 있다.
지지체에 대한 표적 분자의 부착
본 발명의 방법은 고체 기재(예컨대, 검정을 촉진시키기 위함)에 대한 폴리펩타이드의 부착을 촉진시키기 위한 모이어티, 또는 용이한 분리를 촉진시키기 위한 모이어티(예컨대, 자기 비드에 결합된 항체에 의해 인지되는 합텐)에 대한 폴리펩타이드의 컨쥬게이션을 제공할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법은 소정의 배향으로 어레이(예를 들어, 칩)에 대한 단백질의 부착을 제공하는데 사용된다. 예를 들어, 선택된 부위(예를 들어, N-말단 또는 N-말단 근처)에서 변형된 폴리펩타이드가 생성될 수 있고, 그 변형된 폴리펩타이드에 모이어티를 전달하기 위해 본 발명의 방법, 컨쥬게이트 및 화합물이 사용된다. 이후, 상기 모이어티는 지지체(예를 들어, 고체 또는 반고체 지지체, 특히 고-처리량 검정에서 마이크로칩으로 사용하기에 적합한 지지체)에 폴리펩타이드를 고정시키기 위한 부착 부위로 사용될 수 있다.
수용성 중합체
몇몇 경우에, 컨쥬게이트는 공유적으로 연결된 수용성 중합체를 포함한다. 특정 관심 모이어티가 수용성 중합체이다. "수용성 중합체"는 물에 가용성이고, 일반적으로 실질적으로 비-면역원성이며, 통상 약 1,000 달톤을 초과하는 원자 분자량을 갖는 중합체를 지칭한다. 본 명세서에 기재된 방법, 컨쥬게이트 및 화합물은 폴리펩타이드에 하나 이상의 수용성 중합체를 부착시키는데 사용될 수 있다. 폴리펩타이드, 예컨대, 약제학적으로 활성(치료적) 폴리펩타이드에 수용성 중합체(예를 들어, PEG)의 부착이 요망될 수 있는데, 이는 이러한 변형이 증가된 단백질분해 안정성 및/또는 감소된 신장 청소의 결과로서 혈청 반감기를 증가시킴으로써 치료 지수를 증가시킬 수 있기 때문이다. 추가로, 하나 이상의 중합체의 부착(예를 들어, 페길화)은 단백질 약제의 면역원성을 감소시킬 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 수용성 중합체는 5,000 Da 초과, 10,000 Da 초과, 20,000 초과 내지 500,000 Da, 40,000 Da 초과 내지 300,000 Da, 50,000 Da 초과 내지 70,000 Da, 예컨대, 60,000 Da 초과의 유효 유체역학 분자량을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 수용성 중합체는 10 kDa 내지 20 kDa, 20 kDa 내지 25 kDa, 25 kDa 내지 30 kDa, 30 kDa 내지 50 kDa, 또는 50 kDa 내지 100 kDa의 유효 유체역학 분자량을 갖는다. "유효 유체역학 분자량"은 수성-기반 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 결정되는 중합체 사슬의 유효 수-용매화된 크기를 의도한다. 수용성 중합체가 폴리알킬렌 옥사이드 반복 단위, 예를 들어, 에틸렌 옥사이드 반복 단위를 갖는 중합체 사슬을 함유하는 경우, 각각의 사슬은 약 200 Da 내지 약 80,000 Da, 또는 약 1,500 Da 내지 약 42,000 Da, 예컨대, 2,000 내지 약 20,000 Da의 원자 분자량을 가질 수 있다. 특별히 언급되지 않는 한, 분자량은 원자 분자량을 나타내는 것을 의도한다. 선형, 분지형, 및 말단 하전된 수용성 중합체(예를 들어, PEG)가 사용될 수 있다.
폴리펩타이드에 부착되는 모이어티로서 유용한 중합체는 광범위한 분자량, 및 중합체 서브유닛을 가질 수 있다. 이들 서브유닛은 생물학적 중합체, 합성 중합체, 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 이러한 수용성 중합체의 예는 덱스트란 및 덱스트란 유도체, 예를 들어, 덱스트란 설페이트, P-아미노 가교 결합 덱스트린, 및 카르복시메틸 덱스트린, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 예를 들어 메틸셀룰로스 및 카복시메틸셀룰로스, 전분 및 덱스트린, 및 전분의 유도체 및 하이드로일락테스(hydroylactes), 폴리알킬렌 글라이콜 및 이의 유도체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글라이콜, 메톡시폴리에틸렌 글라이콜, 폴리에틸렌 글라이콜 동종중합체, 폴리프로필렌 글라이콜 동종중합체, 에틸렌 글라이콜과 프로필렌 글라이콜의 공중합체를 포함하며, 상기 동종중합체 및 공중합체는 하나의 말단에서 알킬기, 헤파린 및 헤파린의 단편, 폴리비닐 알코올 및 폴리비닐 에틸 에터, 폴리비닐피롤리돈, 아스파르트아마이드, 및 폴리옥시에틸화 폴리올, 덱스트란 및 덱스트란 유도체, 덱스트린 및 덱스트린 유도체로 치환되거나 비치환된다. 특별히 언급되는 수용성 중합체의 다양한 유도체가 또한 고려되는 것이 인지될 것이다.
상기 기재된 것과 같은 수용성 중합체는, 폴리알킬렌 옥사이드 기반 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글라이콜 "PEG"를 포함한다(예컨대, 문헌["Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications", J. M. Harris, Ed., Plenum Press, New York, N.Y. (1992); 및 "Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications", J. M. Harris and S. Zalipsky, Eds., ACS (1997)]; 및 국제 특허 출원들: WO 90/13540, WO 92/00748, WO 92/16555, WO　94/04193,WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28937, WO 95/11924, WO 96/00080, WO 96/23794, WO 98/07713, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/30727, WO 99/32134, WO 99/33483, WO 99/53951, WO 01/26692, WO 95/13312, WO 96/21469, WO 97/03106, WO 99/45964, 및 미국 특허 제4,179,337호; 제5,075,046호; 제5,089,261호; 제5,100,992호; 제5,134,192호; 제5,166,309호; 제5,171,264호; 제5,213,891호; 제5,219,564호; 제5,275,838호; 제5,281,698호; 제5,298,643호; 제5,312,808호; 제5,321,095호; 제5,324,844호; 제5,349,001호; 제5,352,756호; 제5,405,877호; 제5,455,027호; 제5,446,090호; 제5,470,829호; 제5,478,805호; 제5,567,422호; 제5,605,976호; 제5,612,460호; 제5,614,549호; 제5,618,528호; 제5,672,662호; 제5,637,749호; 제5,643,575호; 제5,650,388호; 제5,681,567호; 제5,686,110호; 제5,730,990호; 제5,739,208호; 제5,756,593호; 제5,808,096호; 제5,824,778호; 제5,824,784호; 제5,840,900호; 제5,874,500호; 제5,880,131호; 제5,900,461호; 제5,902,588호; 제5,919,442호; 제5,919,455호; 제5,932,462호; 제5,965,119호; 제5,965,566호; 제5,985,263호; 제5,990,237호; 제6,011,042호; 제6,013,283호; 제6,077,939호; 제6,113,906호; 제6,127,355호; 제6,177,087호; 제6,180,095호; 제6,194,580호; 제6,214,966호 참조).
예시적 관심 중합체는, 화학식 -(CH2-CH2-O)-의 에틸렌 옥사이드 반복 단위를 포함하는 폴리아마이드 알킬렌 옥사이드 및 폴리알킬렌 옥사이드를 포함하는, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리아마이드 알킬렌 옥사이드, 또는 이들의 유도체를 함유하는 중합체를 포함한다. 추가의 예시적 관심 중합체는 화학식 -[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n- 또는 -[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-의 약 1,000 달톤을 초과하는 분자량을 갖는 폴리아마이드를 포함하며, 상기 식에서, X 및 Y는 동일하거나 상이할 수 있고 분지형이거나 선형일 수 있는 2가 라디칼이고, n은 2 내지 100, 일반적으로 2 내지 50의 별개의 정수이고, X 및 Y 중 하나 또는 둘 모두는 선형이거나 분지형일 수 있는 생체적합성의 실질적으로 비-항원성인 수용성 반복 단위를 포함한다. 추가의 예시적 수용성 반복 단위는 화학식 -(CH2-CH2-O)- 또는 -(O-CH2-CH2)-의 에틸렌 옥사이드를 포함한다. 상기 수용성 반복 단위의 수는 유의하게 다양할 수 있고, 상기 단위의 일반적인 수는 2 내지 500, 2 내지 400, 2 내지 300, 2 내지 200, 2 내지 100, 가장 일반적으로 2 내지 50이다. 예시적인 실시형태는 X 및 Y 중 한쪽 또는 양쪽 모두가 -((CH2) n1-(CH2-CH2-O)n2-(CH2)- 또는 -((CH2)n1-(O-CH2-CH2)n2-(CH2) n-1-)로부터 선택되되, 상기 식에서, n1은 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 가장 일반적으로 1 내지 3이고, n2는 2 내지 50, 2 내지 25, 2 내지 15, 2 내지 10, 2 내지 8, 가장 일반적으로 2 내지 5인 것이다. 추가의 예시적 실시형태는, X가 -(CH2-CH2)-이고, Y가 -(CH2-(CH2-CH2-O)3-CH2-CH2-CH2)- 또는 -(CH2-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-CH2)-인 것이다.
중합체는 하나 이상의 스페이서 또는 링커를 포함할 수 있다. 스페이서 또는 링커의 예는, 수용성 중합체에서 사용되는 하나 이상의 반복 단위, 다이아미노 및/또는 이산 단위, 천연 또는 비천연 아미노산 또는 이들의 유도체를 포함하는 선형 또는 분지형 모이어티뿐만 아니라, 예를 들어, 18개 이하의 탄소 원자 또는 심지어 추가적인 중합체 사슬을 함유할 수 있는, 알킬, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로아릴, 알콕시 등을 포함하는 지방족 모이어티를 포함한다.
중합체 모이어티, 또는 존재 시 중합체 모이어티의 스페이서 혹은 링커 중 하나 이상은 생체안정적이거나 생체분해성인 중합체 사슬 또는 단위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 반복 결합을 갖는 중합체는 결합 불안정성에 따라 생리학적 조건 하에서 다양한 정도의 안정성을 갖는다. 이러한 결합을 갖는 중합체는 저분자량 유사체의 공지된 가수분해 속도를 기초로 하여 생리학적 조건 하에서 이들의 상대 가수분해 속도에 의해, 예를 들어, 폴리우레탄(-NH-C(O)-O-) > 폴리오쏘에스터(-O-C((OR)(R'))-O-) > 폴리아마이드(-C(O)-NH-)와 같이 덜 안정적인 것으로부터 더 안정적인 것으로 분류될 수 있다. 유사하게, 표적 분자에 수용성 중합체를 부착시키는 결합 시스템은 카보네이트(-O-C(O)-O-) > 에스터(-C(O)-O-) > 우레탄(-NH-C(O)-O-) > 오쏘에스터(-O-C((OR)(R'))-O-) > 아마이드(-C(O)-NH-)와 같이 덜 안정적인 것으로부터 더 안정적인 것과 같이 생체안정적이거나 생체분해성일 수 있다. 일반적으로, 설페이트기의 불안정성에 따라 설페이트화 다당류의 사용을 피하는 것이 요망될 수 있다. 또한, 폴리카보네이트 및 폴리에스터를 사용하는 것이 덜 요망될 수 있다. 이들 결합은 예로서 제공되며, 중합체 사슬에서 사용가능한 결합의 유형 또는 본 명세서에 개시된 변형된 알데하이드 표지된 폴리펩타이드에서 유용한 수용성 중 합체의 결합 시스템을 제한하고자 하는 것이 아니다.
제형
본 발명의 컨쥬게이트(항체 컨쥬게이트를 포함함)는 각종 상이한 방식으로 제형화될 수 있다. 일반적으로, 컨쥬게이트가 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트인 경우, 컨쥬게이트는 폴리펩타이드에 컨쥬게이트되는 약물, 치료될 병태, 및 이용되는 투여 경로와 양립되는 방식으로 제형화된다.
컨쥬게이트(예컨대, 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트)는 임의의 적합한 형태, 예컨대, 약제학적으로 허용되는 염의 형태로 제공될 수 있고, 임의의 적합한 투여 경로, 예컨대, 경구, 국소 또는 비경구 투여 경로를 위해 제형화될 수 있다. 컨쥬게이트가 액체 주사가능 물질(예를 들어, 이들이 정맥내 또는 조직내로 직접 투여되는 실시형태)로 제공되는 경우, 컨쥬게이트는 즉석 사용 가능한(ready-to-use) 투여 형태, 또는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제로 이루어진 재구성가능한 저장-안정성 분말 또는 액체로 제공될 수 있다.
컨쥬게이트를 제형화시키는 방법은 당업계에서 이용가능한 것들로부터 적합화될 수 있다. 예를 들어, 컨쥬게이트는 치료적 유효량의 컨쥬게이트 및 약제학적으로 허용되는 담체(예컨대, 염수)를 포함하는 약제학적 조성물로 제공될 수 있다. 약제학적 조성물은 선택적으로 다른 첨가물(예컨대, 완충제, 안정화제, 보존제 등)을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제형은, 포유동물에의 투여에 적합한 것, 특히 인간에의 투여에 적합한 것들이다.
치료 방법
본 발명의 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트는 모 약물(즉, 폴리펩타이드로의 컨쥬게이션 전의 약물)의 투여에 의한 치료에 적용가능한 대상체의 병태 또는 질환의 치료에서의 용도를 찾을 수 있다. "치료"는 숙주가 걸린 병태와 관련된 증상의 적어도 개선이 달성되는 것을 의미하며, 여기서 개선은 적어도 파라미터, 예를 들어, 치료 중인 병태와 관련된 증상의 정도의 감소를 나타내는 넓은 의미로 사용된다. 이와 같이, 치료는 또한 병리적 병태 또는 적어도 이와 관련된 증상이 완전히 억제되고, 예를 들어, 발생이 예방되거나 중지되고, 예를 들어, 종결되어, 숙주가 병태, 또는 적어도 병태를 특징으로 하는 증상으로부터 더 이상 고통받지 않는 상황을 포함한다. 따라서, 치료는 (i) 예방, 즉, 임상 증상을 발생시키지 않음, 예컨대, 유해한 상태로의 질환 진행의 예방을 포함하는, 임상 증상의 발달 위험의 감소; (ii) 억제, 즉, 임상 증상의 발달 또는 추가 발달의 정지, 예를 들어, 활성 질병의 완화 또는 완전한 억제; 및/또는 (iii) 경감, 즉, 임상 증상의 퇴행을 야기시킴을 포함한다.
암의 맥락에서, "치료하는"이란 용어는 고형 종양의 성장을 감소시키고, 암세포의 복제를 억제시키고, 전체 종양 부하를 감소시키고, 암과 관련된 하나 이상의 증상을 개선시키는 것 중 어느 하나 또는 전부를 포함한다.
치료되는 대상체는 요법을 필요로 하는 것일 수 있으며, 치료되는 숙주는 모 약물을 이용한 치료에 적용가능한 숙주이다. 따라서, 다양한 대상체가 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트를 이용한 치료에 적용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 대상체는 "포유동물"이며, 특히 관심 있는 것은 인간이다. 다른 대상체는 가정용 애완동물(예컨대, 개 및 고양이), 가축(예컨대, 소, 돼지, 염소, 말 등), 설치류(예컨대, 마우스, 기니 픽 및 래트, 예컨대, 질환의 동물 모델)뿐만 아니라 비-인간 영장류(예컨대, 침팬지 및 원숭이)를 포함할 수 있다.
투여되는 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트의 양은 모 약물의 용량 및/또는 투여 요법의 지침을 기초로 하여 초기에 결정될 수 있다. 일반적으로, 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트는 결합된 약물의 표적화된 전달 및/또는 향상된 혈청 반감기를 제공할 수 있고, 이에 따라 투여 요법에서의 감소된 용량 또는 감소된 투여 중 적어도 하나를 제공할 수 있다. 따라서, 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트는 본 발명의 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트에서 컨쥬게이션되기 전의 모 약물에 비해 투여 요법에서 감소된 용량 및/또는 감소된 투여를 제공할 수 있다.
또한, 위에서 언급된 바와 같이, 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트는 약물 전달의 조절된 화학량론을 제공할 수 있으므로, 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트의 투여량은 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트 기준에 의해 제공되는 약물 분자의 수를 기초로 하여 계산될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 다수의 용량의 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트가 투여된다. 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트의 투여 빈도는, 예컨대, 증상의 중증도 등과 같은 다양한 요인 중 임의의 요인에 따라 다양할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, 폴리펩타이드-약물 컨쥬게이트는 매월 1회, 매월 2회, 매월 3회, 격주 1회(qow), 매주 1회(qw), 매주 2회(biw), 매주 3회(tiw), 매주 4회, 매주 5회, 매주 6회, 격일 1회(qod), 매일 1회(qd), 매일 2회(qid), 또는 매일 3회(tid) 투여된다.
암을 치료하는 방법
본 발명은 암을 갖는 개체에 암 화학요법제를 전달하는 방법을 제공한다. 이 방법은 암종, 육종, 백혈병 및 림프종을 포함하는 매우 다양한 암을 치료하는데 유용하다.
본 발명의 방법을 이용하여 치료될 수 있는 암종은 식도 암종, 간세포 암종, 기저 세포 암종(피부암의 형태), 편평세포 암종(다양한 조직), 방광 암종, 예를 들어, 이행 세포 암종(방광의 악성 신생물), 기관지 암종, 결장 암종, 결장직장 암종, 위 암종, 폐 암종, 예를 들어, 폐의 소세포 암종 및 비소세포 암종, 부신피질 암종, 갑상샘 암종, 췌장 암종, 유방 암종, 난소 암종, 전립선 암종, 샘암종, 한선 암종, 피지샘 암종, 유두 암종, 유두샘암종, 낭샘암종, 수질 암종, 신장세포 암종, 유관 상피내 암종 또는 담관 암종, 융모막암종, 고환종, 배아암종, 윌름스 종양, 자궁경부 암종, 자궁 암종, 고환 암종, 골형성 암종, 상피 암종 및 비인두 암종 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법을 이용하여 치료될 수 있는 육종은 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 척삭종, 골원성 육종, 골육종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 윤활막종, 중피종, 유잉육종, 평활근육종, 횡문근육종, 및 다른 연성 조직 육종을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법을 이용하여 치료될 수 있는 다른 고형 종양은 신경아교종, 별아교세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희소돌기아교세포종, 메난지오마(menangioma), 흑색종, 신경모세포종, 및 망막모세포종을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법을 이용하여 치료될 수 있는 백혈병은 a) 만성 골수증식 증후군(다능성 조혈간세포의 신생물성 장애); b) 급성 골수성 백혈병(다능성 조혈간세포 또는 제한된 계통 잠재성의 조혈 세포의 신생물 형질전환); c) 만성 림프구 백혈병(CLL; 면역학적 미성숙 및 기능적 부전 소림프구의 클론 증식), 예를 들어, B-세포 CLL, T-세포 CLL 전림프구성 백혈병 및 털세포 백혈병; 및 d) 급성 림프모구 백혈병(림프모구의 누적을 특징으로 함)을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 방법을 이용하여 치료될 수 있는 림프종은 B-세포 림프종(예컨대, 버킷 림프종); 호지킨 림프종; 비-호지킨 B 세포 림프종 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
실시예
이하의 실시예는 본 발명을 제조하고 이용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위하여 제시되며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니고, 하기 실험이 수행된 모든 실험이거나 유일한 실험인 것을 나타내고자 하는 것도 아니다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하려고 노력하였으나, 일부 실험 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 표시하지 않는 한, 부(part)는 중량부이며, 분자량은 중량 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이며, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다. bp, 염기쌍(들); kb, 킬로베이스(들); pl, 피코리터(들); s 또는 sec, 초(들); min, 분(들); h 또는 hr, 시간(들); aa, 아미노산(들); kb, 킬로베이스(들); bp, 염기쌍(들); nt, 뉴클레오타이드(들); i.m., 근육내(로); i.p., 복강내(로); s.c, 피하(로) 등과 같은 표준 약어가 사용될 수 있다.
일반적인 합성 절차
개시된 화합물을 합성하는데 유용한 통상 공지된 화학 합성 반응식 및 조건을 제공하는 많은 일반적인 문헌을 입수 가능하다(예컨대, 문헌[Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Fifth Edition, Wiley-Interscience, 2001; 또는 Vogel, A Textbook of Practical Organic Chemistry, Including Qualitative Organic Analysis, Fourth Edition, New York: Longman, 1978] 참조).
본 명세서에 기재된 바와 같은 화합물은 크로마토그래피, 예컨대, HPLC, 분취용 박층 크로마토그래피, 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 당업계에 공지된 임의의 정제 프로토톨에 의해 정제될 수 있다. 예컨대, 정상 상 및 역상뿐만 아니라 이온 수지를 포함하는, 임의의 적절한 정지상이 이용될 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, 개시된 화합물은 실리카겔 및/또는 알루미나 크로마토그래피를 통해 정제된다. 예컨대, 문헌[Introduction to Modern Liquid Chromatography, 2nd Edition, ed. L. R. Snyder and J. J. Kirkland, John Wiley and Sons, 1979; 및 Thin Layer Chromatography, ed E. Stahl, Springer-Verlag, New York, 1969] 참조.
본 발명의 화합물의 제조 공정들 중 어느 하나 동안, 관련된 분자들의 어느 하나 상에 민감성 혹은 반응성 기를 보호하는 것이 필요 및/또는 요망될 수 있다. 이것은, 예컨대, 문헌[J. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London and New York 1973, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", Third edition, Wiley, New York 1999, "The Peptides"; Volume 3 (editors: E. Gross and J. Meienhofer), Academic Press, London and New York 1981, "Methoden der organischen Chemie", Houben-Weyl, 4th edition, Vol. 15/l, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, H.-D. Jakubke and H. Jescheit, "Aminosauren, Peptide, Proteine", Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach, and Basel 1982, 및/또는 Jochen Lehmann, "Chemie der Kohlenhydrate: Monosaccharide and Derivate", Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974] 등에서와 같이 표준 작업에 기재된 바와 같은 통상의 보호기에 의해 달성될 수 있다. 보호기는 당업계로부터 공지된 방법을 이용해서 편리한 후속 단계에서 제거될 수 있다.
본 발명의 화합물은, 종래의 합성 방법에 의해 제조된 출발 물질 및/또는 상업적으로 입수 가능한 출발 물질을 이용해서 각종 상이한 합성 경로를 통해서 합성될 수 있다. 본 명세서에 개시된 화합물을 합성하는데 이용될 수 있는 각종 합성 경로의 예가 이하의 반응식에 기술되어 있다.
3-메틸 피라잘리논 화합물의 합성
3-메틸 피라잘리논 화합물은 이하의 반응식 1에 예시된 바와 같이 합성되었다:
반응식 1
Figure pct00023
화합물 20(퍼플루오로페닐 4-(3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피아졸-1-일)벤조에이트(Pz-PFP))은 다음과 같이 화합물 10으로부터 합성되었다. 에틸 아세테이트 2㎖ 및 DMF 12㎖ 중 4-(3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피아졸-1-일)벤조산(429mg, 1.97 m㏖)의 용액에 에틸 아세테이트 1㎖ 중 펜타플루오로페놀(725mg, 3.94 m㏖)을 첨가하고 이 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. 이 용액에 EtOAc 1㎖ 중 DCC 405㎎(1.97 m㏖)을 첨가하였다. 이 용액을 0℃에서 1시간 교반하고 나서, 4시간에 걸쳐서 실온으로 가온시켰다. 조질의 반응 혼합물을 PTFE 시린지 필터를 통해 여과시키고 10g 바이오타지 실리카겔 샘플릿(Biotage Silica Gel Samplet)에 장입하여, 10%-100% EtOAc:Hex 구배를 이용하는 크로마토그래피를 실시하여 무색 고체를 수득하였다. 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 8.28 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.15 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.52 (s, 2H), 2.27 (s, 3H). 19F NMR (400MHz, CDCl3) δ -152.4 (d, J = 18.8 Hz), -158.1 (t, J = 23.2 Hz), -162.4 (dd, J = 23.2, 18.8 Hz). LRMS (ESI) C17H9F5N2O3 [M+H]+에 대한 계산치: 385.06; 확인치 385.1.
화합물 30(3-(4-(3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피아졸-1-일)벤즈아미도)-링커-산)은 다음과 같이 화합물 20으로부터 합성하였다. 4㎖ 바이알에 0.5㎎(1.36 μ㏖) Pz-PFP를 주입하고, 여기에, DMA 중 1㎎(1.24 μ㏖)의 H2N-링커-CO2H의 용액 200㎕를 첨가하고 나서, 16㎕ 중에 용해된 0.21㎎(2.48 μ㏖)의 NaHCO3를 첨가하였다. 이 용액을 하룻밤 교반하였다. 이 반응물을 1M HCl로 pH 3으로 산성화시키고, DCM을 이용해서 3회 추출하였다. 합한 유기 상을 이어서 염수로 1회 세척하고 MgSO4 상에서 건조시켰다. 조질의 반응 혼합물의 정제는 C18 역상 HPLC(칼럼 유형, 칼럼 크기, 구배)를 이용해서 2부분으로 수행하였다.
화합물 50(3-(4-(3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피아졸-1-일)벤즈아미도)-링커-아마이드-카고)는 다음과 같이 화합물 30으로부터 합성하였다. 4㎖ 바이알에 2.0 μ㏖(1당량)의 3-(4-(3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피아졸-1-일)벤즈아미도)-링커 산을 주입하고, 여기에 2당량의 DIPEA 및 2.0 μ㏖의 HATU를 첨가하고 나서 DMA 200㎕ 중 2.0 μ㏖의 H2N-카고를 첨가하였다. 이 용액을 3시간 동안 교반하고 나서, 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제시켰다.
3-(tert-뷰틸) 피라잘리논 화합물이ㅡ 합성
3-(tert-뷰틸) 피라잘리논 화합물은 하기 반응식 2에 예시된 바와 같이 합성되었다:
반응식 2
Figure pct00024
화합물 80(4-(3-(tert-뷰틸)-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)벤조산)은 다음과 같이 화합물 60 및 70으로부터 합성하였다. 40㎖ 바이알에 400㎎의 4-하이드라진벤조산 염산염(2.13 m㏖, 1당량)을 주입하고 나서, 아세트산 5㎖ 및 380㎕(2.13 m㏖)의 에틸 4,4-다이메틸-3-옥소펜타노에이트를 첨가하고 가열 환류시켰다. 이 반응물을 16시간 동안 교반하고 나서, 실온으로 냉각시키자, 이때 황색 결정이 형성되었다. 결정을 여과에 의해 수집하고, 냉 아세트산으로 세척하고, 하룻밤 펌핑하였다.
화합물 90(퍼플루오로페닐 4-(3-(tert-뷰틸)-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)벤조에이트)은 다음과 같이 화합물 80으로부터 합성하였다. 에틸 아세테이트 2㎖ 및 DMF 12㎖ 중 4-(3-(tert-뷰틸)-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)벤조산(1.97 m㏖)의 용액에 에틸 아세테이트 1㎖ 중 펜타플루오로페놀(3.94 m㏖)을 첨가하고, 이 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. 이 용액에 EtOAc 1㎖ 중 405㎎(1.97 m㏖)의 DCC을 첨가하였다. 이 용액을 0℃에서 1시간 동안 교반하고 나서, 4시간에 걸쳐서 실온으로 가온시켰다. 조질의 반응 혼합물을, PTFE 시린지 필터를 통해서 여과시키고 10g 바이오타지 실리카겔 샘플릿에 장입하여, 10%-100% EtOAc:Hex 구배를 이용하는 크로마토그래피를 실시하여 무색 고체를 수득하였다.
화합물 100(4-(3-(tert-뷰틸)-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)벤즈아미도)-링커 산)은 다음과 같이 화합물 90으로부터 합성하였다. 4㎖ 바이알에 퍼플루오로페닐 4-(3-(tert-뷰틸)-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)벤조에이트(2 μ㏖)를 주입하고, DMA 중 1㎎(2 μ㏖)의 H2N-링커-CO2H의 용액 200㎕을 첨가하고 나서, 16㎕에 용해된 0.21㎎(3 μ㏖) NaHCO3를 첨가하였다. 이 용액을 하룻밤 교반하였다. 이 반응물을 1M HCl로 pH 3으로 산성화시키고, DCM으로 3회 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 1회 세척하고 MgSO4 상에서 건조시켰다. 조질의 반응 혼합물의 정제는 C18 역상 HPLC(칼럼 유형, 칼럼 크기, 구배)를 이용해서 2부분으로 수행하였다.
화합물 120(4-(3-(tert-뷰틸)-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)벤즈아미도)-링커-아마이드-카고)은 다음과 같이 화합물 100으로부터 합성하였다. 4㎖ 바이알에 2.0 μ㏖(1당량)의 4-(3-(tert-뷰틸)-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)벤즈아미도)-링커 산을 주입하고, 여기에 2당량의 DIPEA 및 2.0 μ㏖(1당량)의 HATU를 첨가하고 나서, DMA 200㎕ 중 2.0 μ㏖의 H2N-카고를 첨가하였다. 이 용액을 3시간 동안 교반하고 나서 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제시켰다.
3,4-다이메틸 피라잘리논 화합물의 합성
3,4-다이메틸 피라잘리논 화합물은 하기 반응식 3에 예시된 바와 같이 합성되었다:
반응식 3
Figure pct00025
화합물 140(4-(3,4-다이메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)벤조산)은 다음과 같이 화합물 60 및 130으로부터 합성하였다. 40㎖ 바이알에 400㎎의 4-하이드라진벤조산 염산염(2.13 m㏖, 1당량)을 주입하고 나서 아세트산 5㎖ 및 2.13 m㏖의 에틸 2-메틸-3-옥소부타노에이트를 첨가하고 가열 환류시켰다. 이 반응물을 16시간 동안 교반하고 나서 실온으로 냉각시키자, 분홍색 결정이 형성되었다. 이 결정을 여과에 의해 수집하고, 냉 아세트산으로 세척하고, 하룻밤 펌핑하였다.
화합물 150(퍼플루오로페닐 4-(3,4-다이메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)벤조에이트)은 다음과 같이 화합물 140으로부터 합성하였다. 에틸 아세테이트 2㎖ 및 DMF 12㎖ 중 4-(3,4-다이메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)벤조산(1.97 m㏖)의 용액에 에틸 아세테이트 1㎖ 중 펜타플루오로페놀(3.94 m㏖)을 첨가하고, 이 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. 이 용액에 EtOAc 1㎖ 중 405㎎(1.97 m㏖)의 DCC를 첨가하였다. 이 용액을 0℃에서 1시간 동안 교반하고 나서 4시간에 걸쳐서 실온으로 가온시켰다. 조질의 반응 혼합물 PTFE 시린지 필터를 통해 여과시키고 나서, 10g 바이오타지 실리카겔 샘플릿에 장입하고, 10%-100% EtOAc:Hex 구배를 이용하는 크로마토그래피를 실시하여 무색 고체를 수득하였다.
화합물 160(4-(3,4-다이메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)벤즈아미도)-링커 산)은 다음과 같이 화합물 150으로부터 합성하였다. 4㎖ 바이알에 퍼플루오로페닐 4-(3,4-다이메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)벤조에이트(2 μ㏖)를 주입하고, 여기에 DMA 중 2 μ㏖ H2N-링커-CO2H의 용액 200㎕를 첨가하고 나서, 16㎕에 용해된 0.21㎎(3 μ㏖)의 NaHCO3를 첨가하였다. 이 용액을 하룻밤 교반하였다. 이 반응물을 1M HCl로 pH 3으로 산성화시키고 DCM으로 3회 추출하였다. 합한 유기 층을 이어서 염수로 1회 세척하고, MgSO4 상에서 건조시켰다. 조질의 반응 혼합물의 정제는 C18 역상 HPLC(칼럼 유형, 칼럼 크기, 구배)를 이용해서 2 부분으로 수행하였다.
화합물 180(4-(3,4-다이메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)벤즈아미도)-링커-아마이드-카고)은 다음과 같이 화합물 160으로부터 합성하였다. 4㎖ 바이알에 2.0 μ㏖(1당량)의 4-(3,4-다이메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)벤즈아미도)-링커 산을 첨가하고, 여기에 DMA 100㎕ 중 2당량의 DIPEA 및 2.0 μ㏖(1당량)의 HATU를 첨가하고 나서, DMA 200㎕ 중 2.0 μ㏖의 H2N-카고를 첨가하였다. 이 용액을 3시간 동안 교반하고 나서 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제시켰다.
3-메틸 피라잘리논 화합물의 합성
3-메틸 피라잘리논 화합물은 이하의 반응식 4에 일반적으로 예시된 바와 같이 합성되었다:
반응식 4
Figure pct00026
일반적인 반응식 4는 다음과 같이 더욱 상세히 기재된 반응에 따라서 수행되었다:
Figure pct00027
tert-뷰틸 3-(2-(2-옥소에톡시)에톡시)프로파노에이트: 1.67 m㏖(707㎎)의 데스-마틴 페리오디난(Dess-Martin Periodinane)이 주입된 오븐 건조된 20㎖ 바이알에 3.34 m㏖(270㎕)의 피리딘에 이어서 DCM 2㎖를 첨가하고, 균질해질 때까지 초음파처리하였다. 이 용액에 DCM 3㎖ 중 용해된 1.39 m㏖의 tert-뷰틸 3-(2-(2-하이드록시에톡시)에톡시)프로파노에이트를 첨가하고, 3시간 동안 교반 후, DCM 5㎖, 10% 수성 Na2S2O3 5㎖ 및 포화 수성 NaHCO3 5㎖를 첨가하였다. 이 용액을 5분 동안 교반하고 나서, 포화 수성 NaHCO3 1x5㎖에 이어서 염수 1x5㎖로 추출하였다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 회전 증발에 의해 농축시키고 나서, 10-100% 에틸 아세테이트:헥산 구배를 이용하는 실리카겔 상에서 크로마토그래피를 실시하여, 목적으로 하는 생성물 291.4㎎을 90%의 수율로 수득하였다.
Figure pct00028
tert-뷰틸-2-(2-(2-(3-(tert-뷰톡시)-3-옥소프로폭시)에톡시)에틸리덴) 하이드라진카복실레이트: 톨루엔 1㎖ 중 tert-뷰틸 3-(2-(2-옥소에톡시)에톡시) 프로파노에이트(0.659 m㏖, 153㎎)의 용액에 tert-뷰틸 카바자이트(0.659 m㏖)를 첨가하였다. 이 용액을 균질해질 때까지 가열하고, 48시간 동안 유지하였다. 이 반응 혼합물을 농축시키고, 이 조질물을 다음 단계로 진행시켰다.
Figure pct00029
tert-뷰틸 2-(2-(2-(3-(tert-뷰톡시)-3-옥소프로폭시)에톡시)에틸) 하이드라진카복실레이트: 메탄올(2㎖) 중 tert-뷰틸-2-(2-(2-(3-(tert-뷰톡시)-3-옥소프로폭시)에톡시)에틸리덴) 하이드라진카복실레이트(0.659 m㏖) 및 아세트산(0.659 m㏖)의 용액에 MeOH 1㎖ 중 0.725 m㏖의 NaBH3CN을 첨가하고, 하룻밤 교반하였다. 이 반응물을 이어서 포화 수성 NaHCO3 1㎖로 반응 중지시키고, 에틸 아세테이트 3x5㎖로 추출하였다. 유기물들을 합하여 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과 후 농축시키고 나서, 10%-100% 에틸 아세테이트:헥산을 이용하는 실리카겔 상에서 크로마토그래피를 실시하여, 목적으로 하는 생성물을 얻었다.
Figure pct00030
3-(2-(2-하이드라지닐에톡시)에톡시)프로판산: 95:5 TFA:물의 용액을, tert-뷰틸 2-(2-(2-(3-(tert-뷰톡시)-3-옥소프로폭시)에톡시)에틸)하이드라진카복실레이트가 주입된 4㎖ 바이알에 주입하였다. 이 반응물을 45분 동안 유지하고 나서 진공 중 농축시켰다. 이 물질은 후속의 단계에서 조질물로서 이용되었다.
Figure pct00031
3-(2-(2-(3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)에톡시)에톡시)프로판산: 40㎖ 바이알에 3-(2-(2-하이드라지닐에톡시)에톡시)프로판산을 주입하고 나서, 아세트산 5㎖ 및 에틸 4,4-다이메틸-3-옥소펜타노에이트를 첨가하고 가열 환류시켰다. 이 반응물을 16시간 동안 교반하고 나서 실온으로 냉각시켰다. 이 용액을 진공 중 농축시키고, 10-100% 구배를 이용하는 실리카겔 상에서 크로마토그래피를 실시하여, 목적으로 하는 생성물을 수득하였다.
Figure pct00032
퍼플루오로페닐 3-(2-(2-(3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)에톡시)에톡시)프로파노에이트: 에틸 아세테이트 10㎖ 중 3-(2-(2-(3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)에톡시)에톡시)프로판산(2 m㏖)의 용액에 에틸 아세테이트 1㎖ 중 펜타플루오로페놀(4 m㏖)을 첨가하고 0℃로 냉각시켰다. 이 용액에 EtOAc 1㎖ 중 DCC(2 m㏖)를 첨가하였다. 이 용액을 0℃에서 1시간 동안 교반하고 나서, 4시간에 걸쳐서 실온으로 가온시켰다. 이 조질의 반응 혼합물을 PTFE 시린지 필터를 통해 여과시키고, 10g 바이오타지 실리카겔 샘플릿(노스캐롤라이나주의 샬럿시에 소재한 바이오타지사(Biotage))에 장입하여, 10%-100% EtOAc:Hex 구배를 이용하는 크로마토그래피를 실시하여 무색 고체를 수득하였다.
Figure pct00033
N-"카고"-3-(2-(2-(3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)에톡시)에톡시) 프로판아마이드: 4㎖ 바이알에 퍼플루오로페닐 3-(2-(2-(3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)에톡시)에톡시)프로파노에이트를 주입하고, 여기에 DMA 중 H2N-카고의 용액 500㎕를 첨가하고 나서, 50㎕에 용해된 2당량의 NaHCO3를 첨가하고 4시간 동안 교반하였다. 조질의 반응물을, 10-100% 에틸 아세테이트:헥산 구배를 이용하는 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적으로 하는 생성물을 수득하였다.
실시예 1:
실험은 이하의 반응식 5에 따라서 형광 검출 가능한 표지와 피라잘리논 커플링 모이어티를 포함하는 컨베이어를 제조하기 위하여 수행되었다.
반응식 5
Figure pct00034
4㎖ 바이알에 0.5㎎(1.36 μ㏖)의 Pz-PFP를 주입하고 여기에 DMA 중 1㎎(1.24 μ㏖)의 용액 200㎕를 첨가하고 나서 16㎕ 중에 용해된 0.21㎎(2.48 μ㏖)의 NaHCO3를 첨가하였다. 이 용액을 3일 동안 교반하였다. 조질의 반응 혼합물의 정제를 C18 역상 HPLC(애질런트 포로셸(Agilent poroshell) 120, 4.6mm x 50mm, 60% AcCN:40% H20 내지 100% AcCN)를 이용해서 2부분으로 수행하여 자색 필름 0.8㎎을 수득하였다. LRMS (ESI) C17H9F5N2O3에 대한 계산치 [M-H]-: 1005.32; 확인치 1005.1.
실시예 2:
라이게이션 시약(ligation reagent)을 이용한 FGly-함유 펩타이드의 컨쥬게이션
이하의 시약들을 합하여 1, 2, 4 및 5시간에 분획을 취하여, 반응은 C18 RP HPLC에 의해 215㎚에서 생성물 형성에 대해서 모니터링하였다:
밀리큐 워터(MilliQ water) 중 10mM H2N-GPSVFPL(fGly)TPSR-OH 10㎕;
1xDPBS, pH 7.4 (80㎕) 또는 10 mM KOAc, pH 4.6 (80㎕); 및
1:3 MeCN:밀리큐 워터 중 50mM Pz(10㎕).
컨쥬게이션 반응의 결과는 도 2A에 도시되어 있다. 도 2A는 출발 물질(fGly 13량체 및 화합물 80)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 상이한 시점(1, 2, 4 및 5시간)에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다. 13분에 있는 피크는 폴리펩타이드에 대한 작용화된 화합물의 단일 부가를 나타낸다. 도 2B는 작용화된 화합물과 반응하는 알데하이드-표지된 항체의 개략도이다. 도 2B에 도시된 바와 같이, 단일의 작용화된 화합물은 알데하이드-표지된 항체 내의 각 fGly 잔기에 컨쥬게이트된다.
실시예 3:
화학량론적 변동
이하의 시약들을 합하여, 2시간 및 24시간에 분획을 취하여, 반응은 C18 RP HPLC에 의해 215㎚에서 생성물 형성에 대해서 모니터링하였다:
밀리큐 워터 중 10mM H2N-GPSVFPL(fGly)TPSR-OH(8㎕);
1xDPBS(62㎕); 및
밀리큐 워터 중 20mM Pz-CO2H(2㎕).
컨쥬게이션 반응 결과는 도 3a에 도시되어 있다. 도 3a는 출발 물질(fGly 13량체 및 출발 물질 커플링 화합물(SM))에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 상이한 시점(pH 7.4 및 pH 4.6에서 2 및 24시간)에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다. 약 14분에 있는 두 피크는 폴리펩타이드에 대한 화합물 SM의 이중 부가를 나타낸다. 도 3b는 위와 동일 반응 조건을 이용한 fGly 6량체 펩타이드에 대한 커플링 화합물(SM)의 컨쥬게이션을 도시한다. 얻어진 컨쥬게이션은 LC-MS/MS에 의해 모니터링하였고, 이중 부가 생성물이 반응으로부터의 유일한 생성물로서 확인되었다. 도 3c는 화합물 SM과 반응하는 알데하이드-표지된 항체의 개략도이다. 도 3c에 도시된 바와 같이, 두 화합물이 알데하이드-표지된 항체 내의 각 fGly 잔기에 컨쥬게이트되어 있다.
실시예 4:
라이게이션 시약을 이용한 C-말단 알데하이드-표지된 항-HER2 항체의 컨쥬게이션
1㎖ 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)에서, 1xDPBS 완충제 중 항-HER2의 6.8μM 용액 20㎕를 1xDPBS 중 0.5% MeCN 중 Pz 0.68mM 용액 20㎕에 첨가하였다. 이 용액을 37℃에서 16시간 동안 유지시키고 나서, 환원시키고, 알킬화 후, 트립신을 이용해서 분해시켰다. 생성물 형성은 액체 크로마토그래피 다중 반응 모니터링 질량 분광법(LC-MRM-MS)에 의해 분석되었다.
결과는 도 4에 도시되어 있다. 도 4a는 화합물 C 또는 화합물 D를 이용해서 수행된 컨쥬게이션을 나타낸 개략도를 도시한다. 도 4b는 액체 크로마토그래피 다중 반응 모니터링 질량 분광법(LC-MRM-MS)에 의해 분석된 출발 물질 및 생성물 형성의 비를 도시한다. 화합물 D를 이용한 출발 물질의 소실은 화살표로 강조되어 있다. 화합물 C는 동일한 반응 조건 하에서 항체와 유의하게 반응하지 않았다.
실시예 5:
라이게이션 시약을 이용한 C-말단 알데하이드 표지된 HER2에 대한 변형된-AF594의 컨쥬게이션
이하의 Pz-AF594 당량, 즉, 1, 2, 5, 10, 100 또는 200당량의 Pz-AF594를 1.35μM 항-HER2에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 이 샘플을 이어서 SDS-PAGE 겔로 전기영동 분리시켰다.　 AF594 형광은 이미지퀀트(ImageQuant) LAS 4000을 이용해서 검출하고 총 단백질은 쿠마씨 염색을 이용해서 검출하였다.
도 5a는 작용화된 검출 가능한 표지의 합성에 대한 반응식을 도시한다. 도 5b는 항체에 대한 작용화된 검출 가능한 표지의 컨쥬게이션 반응의 개략도를 도시한다. 결과는 도 5c에 도시되어 있다. 도 5c는 반응의 결과를 나타내는 SDS-PAGE 겔의 이미지를 표시한다. SDS-PAGE는 표지된 중쇄를 경쇄로부터 분리하는데 이용되었다. 검출 가능한 표지의 컨쥬게이트는 형광 영상화에 의해 결정되었다.
실시예 6:
항체-검출 가능한 표지 컨쥬게이트의 안정성
Pz-AF594(151 당량)를 6.6μM 항-HER2와 37℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 이 반응 혼합물로부터 미반응 Pz-AF594를 크기 배제 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 얻어진 항체-형광단 컨쥬게이트를 혈장 또는 혈청(인간 및 마우스 둘 다)에서 4℃ 또는 37℃에서 8일 동안 인큐베이팅하였다.　SDS-PAGE를 이용해서 컨쥬게이트를 분석하였다.　컨쥬게이트의 존재는 0.5초 노광 혹은 2초 노광에서 형광 사진에 의해 결정하였다.　어느 사례에서도 유리(free) 염료는 관찰되지 않았고 컨쥬게이트는 분해되지 않았다(도 6 참조).
실시예 7:
Pz-Ph-2PEG-메이탄신
실험은 이하의 반응식 6에 따라 메이탄신 및 피라잘리논(Pz) 커플링 모이어티를 포함하는 컨쥬게이트를 제조하기 위하여 수행하였다.
반응식 6
Figure pct00035
화합물 270(아미노-2PEG-메이탄신)은 다음과 같이 화합물 260으로부터 합성하였다. MA 100㎕ 중 28.2 μ㏖의 화합물 260(Fmoc-N-2PEG-메이탄신)의 용액에 564 μ㏖의 피페리딘을 첨가하고 2시간 동안 교반하였다. 조질의 반응물을 1% MeCN:물(10 칼럼 용적)에 이어서 50% MeCN:물(10 칼럼 용적)의 단계 구배를 이용하는 플래쉬 크로마토그래피(C18)에 의해 정제시켜 생성물 화합물 270을 22% 수율로 얻었다. LRMS (ESI) C39H57ClN4O12에 대한 계산치 [M+H]+: 809.3; 확인치 809.3.
화합물 280(Pz-Ph-2PEG-메이탄신)은 다음과 같이 화합물 270으로부터 합성하였다. 오븐-건조된 1㎖ 바이알에 120㎕ 중 6.06 μ㏖ 화합물 270을 주입하고 나서 80㎕ 중 6.06 μ㏖의 Pz-PFP(화합물 20, 퍼플루오로페닐 4-(3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피아졸-1-일)벤조에이트) 및 물 21㎕ 중 15.4 μ㏖의 NaHCO3를 첨가하였다. 이 반응물을 4시간 동안 교반하고 나서, 역상 HPLC에 의해 정제시켜 0.9㎎의 화합물 280을 수득하였다. LRMS (ESI) C50H65ClN6O14에 대한 계산치 [M+Na]+: 1031.4; 확인치 1031.5.
알데하이드-표지된 항체(A)는 2.5% DMA에서, pH 7, 37℃에서 PBS 중 Pz-Ph-2PEG-메이탄신과 반응하였다. 이 반응 혼합물은 24시간 후에 소수성 상호작용 칼럼(HIC)에 의해 분석되었다(도 7, 하부 패널). 모노-컨쥬게이트(B)와 다이-컨쥬게이트(D) 단백질 컨쥬게이트 둘 다 관찰되었다. 도 7은 또한 알데하이드-표지된 항체(A)의 소수성 상호작용 칼럼(HIC) 자취를 도시한다(도 7, 상부 패널).
실시예 8:
일반적인 합성 경로
본 발명의 피라잘리논-카고(Pz-카고) 작제물은 이하의 일반적인 합성 경로에 따라서 합성하였다. 예를 들어, β-케토에스터를 카복실산 유도체로부터 합성하고, 목적으로 하는 Pz-카고 작제물을 이어서 얻어지는 β-케토에스터로부터 합성하였다. 일반적인 합성 경로의 예들이 하기 반응식 7에 표시되어 있다.
반응식 7
β-케토에스터에 대한 일반적인 경로
Figure pct00036
Pz-카고 작제물에 대한 일반적인 경로
Figure pct00037
친핵성 트랩-피라잘리논 커플링 모이어티
친핵성 트랩-피라잘리논 커플링 모이어티는 이하의 실시예 9 내지 14에 표시된 반응식에 따라서 합성하였다. 친핵성 트랩-피라자이논 커플링 모이어티는, 이하의 실시예 9 내지 14에 더욱 상세히 나타낸 바와 같이, 티오-Pz, 나이트로-Pz, 아미노-Pz, 페놀-Pz, 알코올-Pz 및 퓨란-Pz 커플링 모이어티를 포함하였다.
실시예 9:
티오-Pz 커플링 모이어티
티오-Pz 친핵성 트랩 커플링 모이어티는 이하의 반응식 8에 따라서 합성하였다.
반응식 8
Figure pct00038
3-(트리틸티오)프로프라논산(A1) - 건조 튜브를 구비한 2-구 100㎖ 둥근 바닥 플라스크에 트리틸-클로라이드(1.927g, 6.9 m㏖) 및 무수 톨루엔 6㎖를 주입하였다. 3-티오프로프리온산(720㎕, 8.3m㏖)을 적가 첨가 후, 이 불균질한 혼합물을 16시간 동안 교반하여 백색 석출물을 얻었다. 이 석출물을 여과에 의해 수집하고 냉 톨루엔으로 세척하고 나서 진공 하 건조시켜 목적으로 하는 생성물 1.875g을 얻었다. 이 생성물은 추가의 정제 없이 이용되었다.
1H NMR (400MHz, DMSO) 12.24 (s, 1H), 7.25 (m, 15H), 2.28 (t, J = 6.8Hz, 2H), 2.17 (t, J = 6.8Hz, 2H).
에틸 3-옥소-5-(트리틸티오)펜타노에이트(A2) - 무수 DCM 1.6㎖ 중 3-(트리틸티오)프로프라논산(287mg, 0.824 m㏖), 멜드럼의 산(118.7mg, 0.824 m㏖) 및 4-다이메틸아미노피리딘의 용액을 0℃로 냉각시켰다. 이 용액에 무수 DCM 중 N,N'-다이사이클로헥실카보다이이미드(100mg, 0.819mmol) 0.7㎖를 첨가하였다. 이 반응물을 0℃에서 30분 동안 유지하고 나서, 실온으로 가온시키고 5시간 동안 유지시켰다. 이 반응물을 이어서 DCM 10㎖로 희석시키고 분액 깔때기로 옮겼다. 유기 상을 1M HCl(수성) 3x10㎖, 염수 3x10㎖로 세척하였다. 유기 상을 수집하고 나서 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과 후, 감압 하에 증발시켰다. 얻어진 오일을 이어서 무수 에탄올 10㎖에 용해시키고, 16시간 동안 환류시켰다. 조질의 반응물을 감압 하에 증발시키고, 10g 바이오타지 실리카겔 샘플릿에 장입하고, 33%-100% 헥산:DCM 구배를 이용하는 크로마토그래피를 실시하여 목적으로 하는 생성물 174.1㎎을 생성하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) 7.43 (app d, J = 9.2 Hz, 6H), 7.31 (app t, J = 7.2 Hz, 6H), 7.22 (app t, J = 7.2 Hz, 3H), 4.17 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.30 (s, 2H), 2.45 (m, 4H), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LRMS (ESI) C26H26O3S [M+Na]+에 대한 계산치: 441; 확인치 441.
1-메틸-3-(2-(트리틸티오)에틸)-1H-피라졸-5(4H)-온(A3) ― 메틸하이드라진(10.8㎕, 0.205mmol), 에틸 3-옥소-5-(트리틸티오)펜타노에이트(85.6mg, 0.205 m㏖) 및 무수 에탄올 1㎖를 50℃에서 16시간 동안 가열하였다. 조질의 반응물을 50-100% 헥산:에틸 아세테이트 구배를 이용하는 크로마토그래피를 실시하여 목적으로 하는 생성물 52.3㎎을 64% 수율로 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) 7.44 (app d, J = 8 Hz, 6H), 7.31 (m, 6H), 7.24 (m, 3H), 3.26 (s, 2H), 2.97 (s, 2H), 2.43 (t, J = 6.4 Hz 2H), 1.28 (t, J = 6.4 Hz, 2H).
3-(2-머캅토에틸)-1-메틸-1H-피라졸-5(4H)-온(A4) - DCM 4㎖ 중 1-메틸-3-(2-(트리틸티오)에틸)-1H-피라졸-5(4H)-온(46.3mg, 0.116 m㏖)의 용액에 물 0.1㎖, 트라이아이소프로필실란 0.1㎖ 및 트라이플루오로아세트산 0.8㎖를 첨가하였다. 이 반응물을 1시간 동안 교반하고 나서, 진공 중 농축시켰다. 이 조질의 혼합물을 0-10% 메탄올:DCM을 이용하는 크로마토그래피를 실시하여 목적으로 하는 생성물 20.2㎎을 생성하였다.
LRMS (ESI) C6H10N2OS [M+H]+에 대한 계산치: 159; 확인치 159.
화합물 A8(티오-Pz-2PEG-메이탄신)은 다음과 같이 반응식 9에 따라 화합물 A2 및 화합물 270(아미노-2PEG-메이탄신)으로부터 합성하였다.
반응식 9
Figure pct00039
에틸 2-(5-옥소-3-(2-(트리틸티오)에틸)-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)아세테이트(A5) - 에탄올 10㎖ 중 에틸 3-옥소-5-(트리틸티오)펜타노에이트(A2)(499㎎, 1.24 m㏖), 에틸 2-하이드라진일아세테이트(191㎎, 1.23 m㏖), 트라이에틸아민(17㎕, 0.124 m㏖)의 용액을 50℃에서 2시간 동안 유지시켰다. 조질의 반응물을 진공 중 농축시키고, 33-60% 헥산:에틸 아세테이트 구배를 이용하는 실리카겔 상에서 크로마토그래피를 실시하여, 목적으로 하는 생성물 320.6㎎을 생성하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) 7.44 (app d, J = 8 Hz, 6H), 7.31 (m, 6H), 7.24 (m, 3H), 4.40 (s, 2H), 4.21 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.03 (s, 2H), 2.44 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.37 (t, J = 6.8 Hz 2H), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 2H).
2-(5-옥소-3-(2-(트리틸티오)에틸)-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)아세트산(A6) ― THF:MeOH:물(2:3:1) 1㎖ 중 에틸 2-(5-옥소-3-(2-(트리틸티오)에틸)-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)아세테이트(A5)(97.8mg, 0.207 m㏖)의 용액에 수산화리튬 10.7㎎을 첨가하였다. 이 반응물을 2시간 동안 유지하고 나서, 물 40㎖와 에틸 에터 40㎖ 간에 분액시켰다. 수성 층을 pH 2로 산성화시키고, DCM 3x60㎖로 세척하였다. 유기 상을 합하여, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과 후, 진공 중 농축시켜, 목적으로 하는 생성물 65.5㎎을 수득하였으며, 이것은 추가의 정제 없이 이용되었다.
1H NMR (400MHz, DMSO) 7.33 (m, 12H), 7.25 (m, 3H), 5.01 (s, 1H), 4.47 (s, 2H), 2.35 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.28 (t, J = 7.2 Hz 2H).
Trt-티오Pz-2PEG-메이탄신(A7) ― DMF 100㎕ 중 아미노-2PEG-메이탄신(270)(18.5㎎, 0.0229 m㏖), 2-(5-옥소-3-(2-(트리틸티오)에틸)-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)아세트산(A6)(6.8㎎, 0.0153 m㏖), 2,4,6-트라이메틸피리딘 (0.0153 m㏖)의 0℃ 용액에 COMU((1-사이아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시) 다이메틸아미노-몰폴리노-카베늄) 6.8㎎을 첨가하였다. 이 반응물을 0℃에서 30분 동안 유지시키고 나서 실온으로 30분에 걸쳐서 가온시켰다. 얻어진 반응 혼합물을 EtOAc 10㎖로 희석시키고 나서 분액 깔때기로 옮겼다. 유기 상을 1M HCl 3x10㎖, 포화 NaHCO3 3x10㎖ 및 3x10㎖ 염수로 세척하였다. 유기 상을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과 후 진공 중 농축시켰다. 조질의 반응물을 5-12% 메탄올:DCM 구배를 이용하는 실리카겔 상에서 크로마토그래피를 실시하여, 목적으로 하는 생성물 8.8㎎을 수득하였다.
LRMS (ESI) C65H79ClN6O14S [M+Na]+에 대한 계산치: 1257.5; 확인치 1257.5.
티오-Pz-2PEG-메이탄신(A8) ― Trt-티오Pz-2PEG-메이탄신(A7)(8.8㎎)을 400㎕의 DCM에 용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. 이 용액에 10㎕의 트라이아이소프로필실란, 10㎕의 물 및 80㎕의 트라이플루오로아세트산을 첨가하였다. 이 반응물을 0℃에서 1시간 동안 유지시켰다. 조질의 반응물을 5-67% MeCN:물 구배를 이용하는 역상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적으로 하는 생성물 4㎎을 수득하였다.
LRMS (ESI) C46H65ClN6O14S [M-H]-에 대한 계산치: 991.4; 확인치 991.1.
실시예 10:
나이트로-Pz 커플링 모이어티
나이트로-Pz 친핵성 트랩 커플링 모이어티는 이하의 반응식 10에 따라서 합성하였다.
반응식 10
Figure pct00040
tert-뷰틸 4-나이트로부타노에이트(B1) ― 나이트로메탄 50㎖ 중 tert-뷰틸 아크릴레이트(4.4㎖, 30 m㏖)의 용액을 -20℃로 냉각시켰다. 이 용액에 1,1,3,3-테트라메틸구아니딘(T㎎) 0.6㎖를 첨가하고 -20℃에서 3시간 동안 교반하였다. 이 반응물을 DCM 175㎖로 희석시키고, 분액 깔때기로 옮겨서 염수 5x100㎖로 세척하였다. 유기 상을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과 후 진공 중 농축시켰다. 조질의 생성물을 진공 증류(190밀리토르(mtorr), 65℃)에 의해 정제시켜 목적으로 하는 생성물 1.27g을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) 4.84 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.41 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.29 (tt, J = 6.8, 6.8 Hz, 2H), 1.47 (s, 9H).
4-나이트로부탄산(B2) ― DCM 2㎖ tert-뷰틸 4-나이트로부타노에이트(B1)의 용액에 트라이플루오로아세트산 1㎖를 첨가하고, 3시간 동안 교반하였다. 톨루엔(4㎖)을 이 반응 혼합물에 첨가하고, 이어서 진공 중 농축시켰다. 이것을 2회 반복하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) 4.52 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.57 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.33 (tt, J = 6.8, 6.8 Hz, 2H).
메틸 6-나이트로-3-옥소헥사노에이트(B3) ― 4-나이트로부탄산(233㎎, 1.75 m㏖)(B2), 염화옥살릴 225㎕ 및 톨루엔 5㎖의 용액을 80℃에서 19시간 동안 가열하고 나서, 진공 중 농축시켰다. 조질의 반응 혼합물을 3x5㎖의 톨루엔으로 공비혼합하였다. 얻어진 오일을 무수 DCM 1.6㎖ 중에 용해시키고, 멜드럼의 산(199㎎) 및 4-다이메틸아미노피리딘(323㎎)의 0℃ 용액에 20분에 걸쳐서 적가 방식으로 첨가하였다. 첨가 시, 이 용액을 실온으로 가온시키고, 90분 동안 유지시켰다. 반응 혼합물을 DCM 60㎖ 중에 용해시키고, 1M HCl 3x40㎖ 및 염수 2x40㎖로 세척하였다. 유기 상을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과 후 진공 중 농축시켰다. 얻어진 오일을 이어서 10㎖의 메탄올에 용해시키고, 65℃에서 16시간 동안 가열하였다. 이 반응 혼합물을 이어서 진공 중 농축시키고, 33-100% 헥산:에틸 아세테이트 구배를 이용하는 실리카겔 상에서 크로마토그래피를 실시하여, 목적으로 하는 생성물 189㎎을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) 4.46 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.76 (s, 3H), 3.49 (s, 2H), 2.76 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.32 (tt, J = 6.8, 6.8 Hz, 2H).
1-메틸-3-(3-나이트로프로필)-1H-피라졸-5(4H)-온(B4) ― 에탄올 3㎖ 중의 189㎎의 메틸 6-나이트로-3-옥소헥사노에이트(B3) 및 57.8㎕의 메틸하이드라진의 용액을 50℃에서 5시간 동안 교반하였다. 이 반응물을 진공 중 농축시키고, 0-100% 에틸 아세테이트:아세토나이트릴 구배를 이용해서 실리카겔 상에서 크로마토그래피하여 목적으로 하는 생성물 91㎎을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) 4.54 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.62 (s, 3H), 3.21 (s, 2H), 2.54 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.38 (tt, J = 6.8, 6.8 Hz, 2H). LRMS (ESI) C7H11N3O3 [M+H]+에 대한 계산치: 186; 확인치 186.
실시예 11:
아미노-Pz 커플링 모이어티
아미노-Pz 친핵성 트랩 커플링 모이어티는 이하의 반응식 11에 따라서 합성하였다.
반응식 11
Figure pct00041
에틸 5-((tert-뷰톡시카보닐)아미노)-3-옥소펜타노에이트(C1) ― 무수 DCM 5㎖ 중 N-Boc-아미노프로프리온산(480㎎, 2.54 m㏖), 멜드럼의 산(2.54 m㏖), 4-다이메틸아미노피리딘(DMAP)(2.79 m㏖)의 용액을 0℃로 냉각시켰다. 이 용액에 무수 DCM 2㎖ 중 N,N'-다이사이클로헥실카보다이이미드(2.79 m㏖)를 첨가하였다. 이 용액을 0℃에서 3시간 동안 유지시키고, DCM 40㎖로 희석시키고 나서 분액 깔때기로 옮겼다. 유기 상을 1M HCl 2x15㎖, 염수 2x15㎖로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과 후 진공 중 농축시켰다. 조질의 반응물을 이어서 에탄올 7㎖에 용해시키고, 80℃에서 16시간 동안 가열하였다. 이 반응 혼합물을 진공 중 농축시키고, 0-90% 에틸 아세테이트:헥산 구배를 이용하는 실리카겔 상에서 크로마토그래피를 실시하여, 목적으로 하는 생성물 287.5㎎을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) 4.99 (bs, 1H), 4.22 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.46 (s, 2H), 3.39 (app q, J = 6 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 6 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.30 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
tert-뷰틸 (2-(1-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-3-일)에틸)카바메이트(C2) ― 에탄올 1㎖ 중 에틸 5-((tert-뷰톡시카보닐)아미노)-3-옥소펜타노에이트(C1) 287.5㎎ 및 메틸하이드라진 58.3㎕의 용액을 65℃에서 5시간 동안 가열하였다. 이 반응물을 진공 중 농축시키고 0-15% 메탄올:DCM 구배를 이용하는 실리카겔 상에서 크로마토그래피를 실시하여, 목적으로 하는 생성물 223.8㎎을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) 4.89 (bs, 1H), 3.44 (app q, J = 6.4 Hz, 2H), 3.29 (s, 3H), 3.24 (s, 2H), 2.57 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H). LRMS (ESI) C11H19N3O3 [M+H]+에 대한 계산치: 242; 확인치 242.
3-(2-아미노에틸)-1-메틸-1H-피라졸-5(4H)-온·염산염(C3) ― 메탄올 1㎖ 중 tert-뷰틸 (2-(1-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-3-일)에틸)카바메이트(C2) 77.7㎎의 용액에 3M 메탄올성 HCl 0.8㎖를 첨가하였다. 이 반응물을 18시간 동안 유지하고 나서, 이 반응물을 진공 중 농축시켜 목적으로 하는 생성물 73.5㎎을 그의 HCl염으로서 수득하였다.
1H NMR (400MHz, d3-MeOD) 3.77 (s, 3H), 3.32 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.10 (t, J = 7.6 Hz, 2H). LRMS (ESI) C6H11N3O [M+H]+에 대한 계산치: 142; 확인치 142.
실시예 12:
페놀-Pz 커플링 모이어티
페놀-Pz 친핵체 트랩 커플링 모이어티는 이하의 반응식 12에 따라서 합성하였다.
반응식 12
Figure pct00042
3-(2-하이드록시페닐)-1-메틸-1H-피라졸-5(4H)-온(D1) ― 에탄올 4㎖ 중 메틸하이드라진(165㎕, 3.15 m㏖) 및 4-하이드록시쿠마린(170mg, 1.05 m㏖)을 70℃로 48시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각 후, 아세트산 200㎕를 첨가하고, 이 혼합물을 진공 중 농축시켰다. 조질의 반응물을, 0-100% DCM:에틸 아세테이트 구배를 이용하는 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적으로 하는 생성물 120㎎을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) 10.01 (s, 1H) 7.35 (app td, J = 8.4, 1.6 Hz, 1H), 7.19 (app dd, J = 7.8, 1.6 Hz, 1H), 7.04 (app dd, J = 8.2, 0.8 Hz, 1H), 6.95 (app td, J = 8, 1.2 Hz, 1H), 3.71 (s, 2H), 3.43 (s, 3H). LRMS (ESI) C10H10N2O2 [M+H]+에 대한 계산치: 191; 확인치 191.
실시예 13:
알코올-Pz 커플링 모이어티
알코올-Pz 친핵성 트랩 커플링 모이어티는 이하의 반응식 13에 따라서 합성하였다.
반응식 13
Figure pct00043
3-(하이드록시메틸)-1-메틸-1H-피라졸-5(4H)-온(E1) ― 메틸하이드라진(1.16 m㏖) 및 테트론산(1.16 m㏖, 115.5㎎)의 용액을 에탄올 1㎖ 중에서 75℃로 20시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각 시 결정이 형성되었다. 이 결정을 회수하고, 냉 에탄올로 세척하고, 건조시켜, 목적으로 하는 생성물 45.5㎎을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) 4.83 (s, 2H), 4.58 (s, 1H), 3.17 (s, 3H). LRMS (ESI) C5H8N2O2 [M+H]+에 대한 계산치: 129; 확인치 129.
실시예 14:
퓨란-Pz 커플링 모이어티
퓨란-Pz 친핵성 트랩 커플링 모이어티는 이하의 반응식 14에 따라서 합성하였다.
반응식 14
Figure pct00044
에틸 4-(3-(퓨란-3-일)-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)벤조에이트(F1) ― 에틸 3-(퓨란-3-일)-3-옥소프로파노에이트(1.46 m㏖) 및 4-하이드라지노벤조산 염산염의 용액을 에탄올 5.5㎖ 중에서 20시간 동안 환류시켰다. 실온으로 냉각 시, 이 반응 혼합물을 진공 중 농축시키고, 3-60% 에틸 아세테이트:헥산 구배를 이용하는 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제시켜, 생성물 122.4㎎을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) 8.10 (m, 4H), 7.97 (dd, J = 1.6, 0.8 Hz, 1H), 7.55 (dd, J = 2.0, 1.6 Hz, 1H), 6.90 (dd, J = 2.0, 0.8 Hz, 1H), 4.40 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.78 (s, 2H), 1.43 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LRMS (ESI) C16H14N2O4 [M+H]+에 대한 계산치: 299; 확인치 299.
친핵체 트랩-피라잘리논 커플링 모이어티
친핵체 트랩-피라잘리논 커플링 모이어티는 이하의 실시예 15 및 16에 표시된 반응식에 따라서 합성하였다. 친핵체 트랩-피라자이논 커플링 모이어티는, 이하의 실시예 15 내지 16에 더욱 상세히 나타낸 바와 같이, EtO2C-Pz 및 MeO2C-CH2-Pz 커플링 모이어티를 포함하였다.
실시예 15:
EtO 2 C-Pz 커플링 모이어티
에틸 에스터-피라잘리논(EtO2C-Pz) 친핵체 트랩 커플링 모이어티는 이하의 반응식 15에 따라서 합성하였다.
반응식 15
Figure pct00045
에틸 1-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-3-카복실레이트(G1) - 165㎕의 메틸하이드라진, 660㎎의 소듐 다이에틸 옥살로아세테이트, 179㎕의 아세트산 및 6㎖의 에탄올의 용액을 50℃에서 20시간 동안 가열하였다. 이 반응물을 실온으로 냉각시키고, 진공 중 농축시키고 나서, 3% 메탄올:DCM을 이용하는 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제시켜, 목적으로 하는 생성물 120㎎을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) 5.97 (s, 1H), 4.34 (q, J = 7.2Hz, 2H), 3.72 (s, 3H), 1.32 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LRMS (ESI) C7H10N2O3 [M+H]+에 대한 계산치: 171; 확인치 171.
실시예 16:
MeO 2 C-CH 2 -Pz 커플링 모이어티
메틸 아세테이트-피라잘리논(MeO2C-CH2-Pz) 친핵체 트랩 커플링 모이어티는 이하의 반응식 16에 따라서 합성하였다.
반응식 16
Figure pct00046
메틸 2-(1-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-3-일)아세테이트(H1) - 에탄올 12㎖ 중 다이메틸 하이드라진 338㎕, 1.12g의 다이메틸-1,3-아세톤다이카복실레이트의 용액을 50℃에서 20시간 동안 가열하였다. 이 반응물을 실온으로 냉각시키고, 진공 중 농축시키고 나서, 5% 메탄올:DCM을 이용하는 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제시켜, 목적으로 하는 생성물 796㎎을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) 3.77 (s, 3H), 3.50 (s, 2H), 3.89 (s, 2H), 3.32 (s, 3H). LRMS (ESI) C7H10N2O3 [M+H]+에 대한 계산치: 171; 확인치 171.
fGly-함유 펩타이드에 대한 피라잘리논 커플링 모이어티의 컨쥬게이션
실험은 본 발명의 실시형태들에 따라 위에서 기재된 피라잘리논 커플링 모이어티에 fGly-함유 펩타이드를 컨쥬게이트시키기 위하여 수행되었다.
실시예 17:
티오-Pz 커플링 모이어티와의 FGly-함유 펩타이드의 컨쥬게이션
이하의 시약들을 합하여 3시간 및 15시간에 분획들을 취하고, 반응은 C18 RP HPLC에 의해 215㎚에서 생성물 형성에 대해서 모니터링하였다:
밀리큐 워터 70㎕,
10xDPBS 10㎕
DMA 중 50mM 화합물 A4 10㎕,
1mM H2N-GPSVFPL(fGly)TPSR-OH 10㎕.
생성물(I2, I3 및 I4)을 HPLC를 통해 단리시키고, LC-MS/MS법을 이용해서 4000 QTRAP 상에서 분석하였다. 전구체 및 생성물 이온은 목적으로 하는 생성물의 형성을 나타내었다.
컨쥬게이션 반응 결과는 도 8a 내지 도 8d에 도시되어 있다. 도 8a는 출발 물질(fGly 12량체 및 화합물 A4)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 상이한 시점(3 및 15시간)에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다. 도 8b는 컨쥬게이션 반응으로부터 생성물 I2의 LC-MS/MS 분석이다. 도 8c는 컨쥬게이션 반응으로부터의 생성물 I3의 LC-MS/MS 분석이다. 도 8d는 컨쥬게이션 반응으로부터의 생성물 I4의 LC-MS/MS 분석이다.
실시예 18:
아미노-Pz 커플링 모이어티와의 FGly-함유 펩타이드의 컨쥬게이션
이하의 시약들을 합하여 4시간 및 16시간에 분획들을 취하고, 반응은 C18 RP HPLC에 의해 215㎚에서 생성물 형성에 대해서 모니터링하였다:
밀리큐 워터 70㎕
10xDPBS 10㎕
DMA 중 50mM 화합물 C3 10㎕
1mM H2N-GPSVFPL(fGly)TPSR-OH 10㎕.
생성물은 HPLC를 통해 단리시키고 ESI-MS에 의해 분석하였다. 두 생성물은, 모 이온이 존재하는 것[M+H]+에 부가해서, 주된 이온이 [M+3]/3+인 이중 부가 생성물 C4인 것으로 확인되었다.
LRMS (ESI) C68H107N21O18 [M+H]+에 대한 계산치: 1506.8; 확인치 1506.8; C68H107N21O18 [M+3]/3+에 대한 계산치: 502.9; 확인치 503.0.
컨쥬게이션 반응 결과는 도 9a 내지 도 9c에 도시되어 있다. 도 9a는 출발 물질(fGly 12량체 및 화합물 C3)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 상이한 시점(4 및 16시간)에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다. 도 9b 및 도 9c는 컨쥬게이션 반응으로부터의 생성물 C4의 LC-MS/MS 분석이다.
실시예 19:
페놀-Pz 커플링 모이어티와의 FGly-함유 펩타이드의 컨쥬게이션
이하의 시약들을 합하여 시간 경과에 따라서 분획들을 취하고, 반응은 C18 RP HPLC에 의해 215㎚에서 생성물 형성에 대해서 모니터링하였다:
밀리큐 워터 70㎕,
10xDPBS 10㎕ 또는 500mM 인산염 완충액(pH 8.5) 10㎕,
DMA 중 50mM 화합물 D1 10㎕,
1mM H2N-GPSVFPL(fGly)TPSR-OH 10㎕.
생성물은 HPLC를 통해 단리시키고 ESI-MS에 의해 분석하였다. 생성물은 이중 부가 생성물과 단일 부가 생성물인 것으로 확인되었다. 이중 부가에 대한 주 이온은, 모 이온이에 존재하는 것[M+H]+에 부가해서, [M+2]/2+였고, 단일 부가에 대한 주 이온은, 모 이온이 존재하는 것[M+H]+에 부가해서, [M+H+Na]/2+였다.
컨쥬게이션 반응 결과는 도 10a 내지 도 10d에 도시되어 있다. 도 10a는 출발 물질(fGly 12량체 및 화합물 D1)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 시간 경과에 따른 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다. 도 10b 및 도 10c는 컨쥬게이션 반응으로부터의 이중 부가 생성물의 LC-MS/MS 분석이다. 도 10d는 컨쥬게이션 반응으로부터의 단일 부가 생성물의 LC-MS/MS 분석이다.
이중 부가 생성물
LRMS (ESI) C76H105N19O20 [M+H]+에 대한 계산치: 1604.8; 확인치 1605.7; C76H105N19O20 [M+2]/2+에 대한 계산치: 802.9; 확인치 802.9.
단일 부가 생성물
LRMS (ESI) C66H95N17O18 [M+H]+에 대한 계산치: 1414.7; 확인치 1414.4; C66H95N17O18 [M+H+Na]/2+에 대한 계산치: 718.9; 확인치 718.9.
실시예 20:
EtO 2 C-Pz 커플링 모이어티와의 FGly-함유 펩타이드의 컨쥬게이션
이하의 시약들을 합하여 0.5시간, 5시간 및 10시간에 분획들을 취하고, 반응은 C18 RP HPLC에 의해 215㎚에서 생성물 형성에 대해서 모니터링하였다:
밀리큐 워터 70㎕,
10xDPBS 10㎕,
DMA 중 50mM 화합물 G1 10㎕,
1mM H2N-GPSVFPL(fGly)TPSR-OH 10㎕.
생성물은 HPLC를 통해 단리시키고 ESI-MS에 의해 분석하였다. 주 생성물은 이중 부가 생성물인 것으로 확인되었다. 이중 부가에 대한 주 이온은 모 이온이었다.
LRMS (ESI) C70H105N19O22 [M+H]+에 대한 계산치: 1564.8; 확인치 1564.7.
컨쥬게이션 반응 결과는 도 11a 및 도 11b에 도시되어 있다. 도 11a는 출발 물질(fGly 12량체 및 화합물 G1)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 0.5, 5 및 10시간에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다. 도 11b는 컨쥬게이션 반응으로부터의 이중 부가 생성물의 LC-MS/MS 분석이다.
실시예 21:
MeO 2 C-CH 2 -Pz 커플링 모이어티와의 FGly-함유 펩타이드의 컨쥬게이션
이하의 시약들을 합하여 1시간, 5.5시간 및 10시간에 분획들을 취하고, 반응은 C18 RP HPLC에 의해 215㎚에서 생성물 형성에 대해서 모니터링하였다:
밀리큐 워터 70㎕,
10xDPBS 10㎕,
DMA 중 50mM 화합물 H1 10㎕,
1mM H2N-GPSVFPL(fGly)TPSR-OH 10㎕.
생성물은 HPLC를 통해 단리시키고 ESI-MS에 의해 분석하였다. 주 생성물은 이중 부가 생성물인 것으로 확인되었다. 이중 부가에 대한 주 이온은 모 이온이었다.
LRMS (ESI) C70H105N19O22 [M+H]+에 대한 계산치: 1564.8; 확인치 1564.7.
컨쥬게이션 반응 결과는 도 12a 및 도 12b에 도시되어 있다. 도 12a는 출발 물질(fGly 12량체 및 화합물 H1)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 1, 5.5 및 10시간에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다. 도 12b는 컨쥬게이션 반응으로부터의 이중 부가 생성물의 LC-MS/MS 분석이다.
fGly-함유 펩타이드에 대한 친핵체의 컨쥬게이션
대조 실험은 이하의 실시예에서 더욱 상세히 기재된 바와 같이 각종 친핵체에 대한 fGly-함유 펩타이드의 컨쥬게이션을 위하여 수행되었다.
실시예 22:
디메돈과의 FGly-함유 펩타이드의 컨쥬게이션
이하의 시약들을 합하여 1.5시간, 11.5시간 및 48시간에 분획들을 취하고, 반응은 C18 RP HPLC에 의해 215㎚에서 생성물 형성에 대해서 모니터링하였다:
밀리큐 워터 70㎕,
10xDPBS 10㎕,
DMA 중 50mM 디메돈 10㎕,
1mM H2N-GPSVFPL(fGly)TPSR-OH 10㎕.
생성물은 HPLC를 통해 단리시키고 ESI-MS에 의해 분석하였다. 주 생성물은 이중 부가 생성물인 것으로 확인되었다.
LRMS (ESI) C72H109N15O20 [M+H]+에 대한 계산치: 1504.8; 확인치 1504.7.
컨쥬게이션 반응 결과는 도 13a 및 도 13b에 도시되어 있다. 도 13a는 출발 물질(fGly 12량체 및 디메돈)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 상이한 시점(1.5, 11.5 및 48시간)에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다. 도 13b는 컨쥬게이션 반응으로부터의 이중 부가 생성물의 LC-MS/MS 분석이다.
실시예 23:
멜드럼의 산과의 FGly-함유 펩타이드의 컨쥬게이션
이하의 시약들을 합하여 2시간 및 14시간에 분획들을 취하고, 반응은 C18 RP HPLC에 의해 215㎚에서 생성물 형성에 대해서 모니터링하였다:
밀리큐 워터 70㎕,
10xDPBS 10㎕ 또는 500mM 인산염 완충액(pH 8.5) 10㎕,
DMA 중 50mM 멜드럼의 산 10㎕
1mM H2N-GPSVFPL(fGly)TPSR-OH 10㎕.
생성물은 HPLC를 통해 단리시키고 ESI-MS에 의해 분석하였다. 주 생성물은 단일 부가 생성물인 것으로 확인되었다.
LRMS (ESI) C62H93N15O20 [M+H]+에 대한 계산치: 1368.7; 확인치 1368.5.
컨쥬게이션 반응 결과는 도 14a 및 도 14b에 도시되어 있다. 도 14a는 출발 물질(fGly 12량체 및 멜드럼의 산)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 상이한 시점(2 및 14시간)에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다. 도 14b는 컨쥬게이션 반응으로부터의 단일 부가 생성물의 LC-MS/MS 분석이다.
실시예 24:
바비투르산과의 FGly-함유 펩타이드의 컨쥬게이션
이하의 시약들을 합하여 2시간, 6.5시간 및 10시간에 분획들을 취하고, 반응은 C18 RP HPLC에 의해 215㎚에서 생성물 형성에 대해서 모니터링하였다:
밀리큐 워터 70㎕,
10xDPBS 10㎕ 또는 500mM 인산염 완충액(pH 8.5) 10㎕,
DMA 중 50mM 바비투르산 10㎕,
1mM H2N-GPSVFPL(fGly)TPSR-OH 10㎕.
생성물은 HPLC를 통해 단리시키고 ESI-MS에 의해 분석하였다. 모든 생성물은 단일 부가 생성물인 것으로 확인되었다.
LRMS (ESI) C62H93N15O20 [M+H]+에 대한 계산치: 1352.7; 확인치 1352.5.
컨쥬게이션 반응 결과는 도 15a 내지 도 15d에 도시되어 있다. 도 15a는 출발 물질(fGly 12량체 및 바비투르산)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 상이한 시점(2, 6.5 및 10시간)에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다. 도 15b 내지 도 15d는 컨쥬게이션 반응으로부터의 단일 부가 생성물의 LC-MS/MS 분석이다.
실시예 25:
테트론산과의 FGly-함유 펩타이드의 컨쥬게이션
테트론산은 이하의 반응식 17에 따른 케토-에놀 호변이성질체화를 겪는다.
반응식 17
Figure pct00047
이하의 시약들을 합하여 2.5시간 및 14.5시간에 분획들을 취하고, 반응은 C18 RP HPLC에 의해 215㎚에서 생성물 형성에 대해서 모니터링하였다:
밀리큐 워터 70㎕,
10xDPBS 10㎕ 또는 500mM 인산염 완충액(pH 8.5) 10㎕,
DMA 중 50mM 테트론산 10㎕
1mM H2N-GPSVFPL(fGly)TPSR-OH 10㎕.
테트론산과의 fGly-함유 펩타이드의 컨쥬게이션은 관찰되지 않았다. 반응 결과는 도 16에 도시되어 있다. 도 16은 출발 물질(fGly 12량체 및 테트론산)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 상이한 시점(2.5 및 14.5시간)에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다.
실시예 26:
피론 유도체와의 FGly-함유 펩타이드의 컨쥬게이션
4-하이드록시-6-메틸-2-피론은 이하의 반응식 18에 따른 케토-에놀 호변이성질체화를 겪는다.
반응식 18
Figure pct00048
이하의 시약들을 합하여 1.5시간 및 13.5시간에 분획들을 취하고, 반응은 C18 RP HPLC에 의해 215㎚에서 생성물 형성에 대해서 모니터링하였다:
밀리큐 워터 70㎕,
10xDPBS 10㎕ 또는 500mM 인산염 완충액(pH 8.5) 10㎕,
DMA 중 50mM 4-하이드록시-6-메틸-2-피론 10㎕,
1mM H2N-GPSVFPL(fGly)TPSR-OH 10㎕.
4-하이드록시-6-메틸-2-피론과의 fGly-함유 펩타이드의 컨쥬게이션은 관찰되지 않았다. 반응 결과는 도 17에 도시되어 있다. 도 17은 출발 물질(fGly 12량체 및 4-하이드록시-6-메틸-2-피론)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 상이한 시점(1.5 및 13.5시간)에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다.
실시예 27:
퓨라논과의 FGly-함유 펩타이드의 컨쥬게이션
이하의 시약을 합하여 1.5, 6 및 10시간에 분획을 취하여, 반응은 C18 RP HPLC에 의해 215㎚에서 생성물 형성에 대해서 모니터링하였다:
밀리큐 워터 70㎕,
10xDPBS 10㎕ 또는 500mM 인산염 완충액(pH 8.5) 10㎕,
DMA 중 50mM 2(5H)-퓨라논 10㎕,
1mM H2N-GPSVFPL(fGly)TPSR-OH 10㎕.
2(5H)-퓨라논과의 fGly-함유 펩타이드의 컨쥬게이션은 관찰되지 않았다. 반응 결과는 도 18에 도시되어 있다. 도 18은 출발 물질(fGly 12량체 및 2(5H)-퓨라논)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 상이한 시점(1.5, 6 및 10시간)에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다.
실시예 28:
(페닐설포닐)아세토나이트릴과의 FGly-함유 펩타이드의 컨쥬게이션
이하의 시약들을 합하여 0.5시간 및 12.5시간에 분획들을 취하고, 반응은 C18 RP HPLC에 의해 215㎚에서 생성물 형성에 대해서 모니터링하였다:
밀리큐 워터 70㎕,
10xDPBS 10㎕ 또는 500mM 인산염 완충액(pH 8.5) 10㎕,
DMA 중 50mM (페닐설포닐)아세토나이트릴 10㎕,
1mM H2N-GPSVFPL(fGly)TPSR-OH 10㎕.
(페닐설포닐)아세토나이트릴(PhSO2-CH2-CN)에 의한 fGly-함유 펩타이드의 컨쥬게이션은 관찰되지 않았다. 이 반응의 결과는 도 19에 도시되어 있다. 도 19는 출발 물질(fGly 12량체 및 (페닐설포닐)아세토나이트릴)에 이어서 반응 혼합물들을 포함하는 상이한 시점(0.5 및 12.5시간)에서의 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다.
실시예 29:
나이트로메틸 페닐 설폰과의 FGly-함유 펩타이드의 컨쥬게이션
이하의 시약들을 합하여 1시간 및 13시간에 분획들을 취하고, 반응은 C18 RP HPLC에 의해 215㎚에서 생성물 형성에 대해서 모니터링하였다:
밀리큐 워터 70㎕,
10xDPBS 10㎕ 또는 500mM 인산염 완충액(pH 8.5) 10㎕,
DMA 중 50mM 나이트로메틸 페닐 설폰 10㎕,
1mM H2N-GPSVFPL(fGly)TPSR-OH 10㎕.
나이트로메틸 페닐 설폰(PhSO2-CH2-NO2)과의 fGly-함유 펩타이드의 컨쥬게이션은 관찰되지 않았다. 이 반응의 결과는 도 20에 도시되어 있다. 도 20은 출발 물질(fGly 12량체 및 나이트로메틸 페닐 설폰)에 이어서 상이한 시점(1시간 및 13시간)에서의 반응 혼합물을 포함하는 일련의 RP HPLC 자취를 도시한다.
알데하이드-표지된 항체에 대한 피라잘리논 라이게이션 시약의 컨쥬게이트
실험은 본 발명의 실시형태들에 따라 위에서 기재된 피라잘리논 라이게이션 시약에 대한 알데하이드-표지된 항체의 컨쥬게이트를 수행하였다.
실시예 30:
Pz-Ph-2PEG-메이탄신과의 알데하이드-표지된 항체의 컨쥬게이션
Pz-Ph-2PEG-메이탄신은 상기 실시예 7에 따라 합성하였다.
알데하이드-표지된 항체(A)를 pH 7, 37℃에서 2.5% DMA와 함께 PBS 중 Pz-Ph-2PEG-메이탄신과 반응시켰다. 이 반응 혼합물은 24시간 후 소수성 상호작용 칼럼(HIC)에 의해 분석하였다(도 7, 하부 패널). 모노-컨쥬게이트(B)와 다이-컨쥬게이트(D) 단백질 컨쥬게이트가 둘 다 관찰되었다. 도 7은 또한 알데하이드-표지된 항체(A)의 소수성 상호작용 칼럼(HIC) 자취를 도시한다(도 7, 상부 패널).
Pz-변형된 mAb의 MS 특성규명
컨쥬게이트된 항체를 50mM DTT로 37℃에서 30분 동안 환원시켰다. 환원된 샘플을 4000 QTRAP를 지니는 라인에서 70℃에서 PLRP HPLC 칼럼 상에서 분리하였다. MS1 스펙트럼이 얻었고, 바이오애널라이스트 소프트웨어(Bioanalylst software)를 이용해서 탈회선시켰다(deconvoluted). 항체의 경쇄는 변형을 보이지 않은 반면, 중쇄는 주 생성물이 2개의 Pz-Ph-2PEG-메이탄신 모이어티의 부가에 상당하는 것을 나타내었다(도 21).
실시예 31:
티오-Pz-2PEG-메이탄신과의 알데하이드-표지된 항체의 컨쥬게이션
티오-Pz-2PEG-메이탄신은 상기 실시예 9에 따라 합성하였다.
알데하이드-표지된 항체(A)를 pH 7, 37℃에서 2.5% DMA와 함께 PBS 중 티오-Pz-2PEG-메이탄신과 반응시켰다. 이 반응 혼합물은 5.5시간 후 소수성 상호작용 칼럼(HIC)에 의해 분석하였다(도 22). 단지 모노-컨쥬게이트(B 및 C) 단백질 컨쥬게이트만이 관찰되었다. 도 22는 알데하이드-표지된 항체(A), 약물 항체 비(DAR) 1인 단백질(B), 및 DAR 2인 단백질(C)의 소수성 상호작용 칼럼(HIC) 자취를 도시한다.
컨쥬게이트된 항체를 50mM DTT로 37℃에서 30분 동안 환원시켰다. 환원된 샘플을 4000 QTRAP를 지니는 라인에서 70℃에서 PLRP HPLC 칼럼 상에서 분리하였다. MS1 스펙트럼이 얻었고, 바이오애널라이스트 소프트웨어를 이용해서 탈회선시켰다. 항체의 경쇄는 변형을 보이지 않은 반면, 중쇄는 컨쥬게이트된 생성물을 나타내었다(도 23).
추가적인 피라잘리논 커플링 모이어티
추가적인 피라잘리논계 커플링 모이어티는 이하의 실시예에 기재된 바와 같이 합성될 수 있다.
실시예 32:
N-비스-피라잘리논 커플링 모이어티
N-비스-피라잘리논(N-비스-Pz) 커플링 모이어티는 반응식 19에 따라서 합성될 수 있다.
반응식 19
Figure pct00049
문헌[Graham, et al., JACS, 1954, 76, 3993-3995]에 기재된 절차의 변형을 이용해서, 4-(비스(5-옥소-1-페닐-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-3-일)아미노)부탄산은 n-부탄올 20㎖ 중에서 페닐-3-아미노-5-피라졸론(20g), γ-아미노뷰티르산(25g)을 3일 동안 환류 하에 가열함으로써 제조한다. 석출물을 수집하여 아세트산으로 산성화시키고, 뜨거운 에탄올로부터 재결정화시켜 목적으로 하는 생성물(AA) 5g을 수득한다. 카고-보유 N-비스-피라졸론(BB)은 다음과 같이 합성된다. 4㎖ 바이알에 DMA 200㎕ 중 2.0 μ㏖의 화합물 BB, 2당량의 H2N-카고, 2당량의 DIPEA 및 1당량의 HATU를 주입한다. 이 용액은 1시간 동안 교반하고 나서 역상 크로마토그래피에 의해 정제시킨다.
실시예 33:
C-비스-피라잘리논 커플링 모이어티
C-비스-피라잘리논(C-비스-Pz) 커플링 모이어티는 반응식 20 내지 22에 따라서 합성될 수 있다.
반응식 20
Figure pct00050
다이메틸 4-(6-아지도헥실)-3,5-다이옥소헵탄다이오에이트(CC) - 300㎖ 둥근 바닥 플라스크에 10 m㏖의 4-(6-클로로헥실)-3,5-다이옥소피멜산 다이메틸 에스터(Reihm, et. al., Org. Biomol. Chem., 2008, 6, 3079-3084), 25 m㏖의 아자이드화나트륨 및 50㎖의 DMF를 주입한다. 이 반응물을 16시간 동안 교반하고 나서 물(200㎖)로 반응중지시킨다. 이 반응물을 Et2O(200㎖)로 3회 추출한다. 합한 유기물을 이어서 물(150㎖)로 2회 그리고 염수(200㎖) 1회 세척한다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과 후, 감압 하에 용매를 제거한다. 조질의 반응 혼합물을 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적으로 하는 생성물(CC)을 얻는다.
(3E,5E)-다이메틸 4-(6-아지도헥실)-3,5-비스(2-(tert-뷰톡시카보닐)-2-메틸하이드라조노)헵탄다이오에이트(DD) - 20㎖ 바이알에 10 m㏖의 화합물 CC, N,N-Boc-1-메틸하이드라진(25 m㏖), 및 10㎖의 에탄올을 주입한다. 이 반응물을 50℃에서 12시간 동안 교반하고, 진공 중 농축시키고 나서, 추가의 정제 없이 이용한다.
반응식 21
Figure pct00051
3,3'-(7-아지도헵탄-1,1-다이일)비스(1-메틸-1H-피라졸-5(4H)-온)(EE) - 20㎖ 바이알에 5m㏖의 화합물 DD 및 에탄올 중 TFA 10% 용액 10㎖를 주입한다. 이 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하고 나서, 50℃에서 4시간 동안 가열한다. 실온으로 냉각 시, 이 반응물을 진공 중 농축시키고, 3x5㎖의 톨루엔으로 공비혼합한다. 조질의 반응 혼합물을 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적으로 하는 생성물(EE)을 수득한다.
3,3'-(7-아미노헵탄-1,1-다이일)비스(1-메틸-1H-피라졸-5(4H)-온) (FF) - 20㎖ 바이알에 5 m㏖의 화합물 EE, 8 m㏖의 트라이페닐포스핀, 30 당량의 물, 및 5㎖의 DCM을 주입한다. 이 반응물을 12시간 동안 교반하고, 진공 중 농축시키고 나서, 0-100% 물:MeCN 구배를 이용하는 역상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적으로 하는 생성물(FF)을 수득한다.
반응식 22
Figure pct00052
C-비스-Pz-카고(GG) - 4㎖ 바이알에 DMA 200㎕ 중 2.0 μ㏖의 화합물 FF, 1당량의 HO2C-카고, 2당량의 DIPEA 및 1당량의 HATU을 주입한다. 이 용액을 1시간 동안 교반하고 나서, 0-100% 물:MeCN 구배를 이용하는 역상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적으로 하는 생성물(GG)을 수득한다.
실시예 34:
Pz-CH 2 -Pz' 상이한 페이로드
2개의 상이한 모이어티에 컨쥬게이트된 비스-피라잘리논(Pz-CH2-Pz') 커플링 모이어티는 반응식 23 및 24에 따라서 합성될 수 있다.
반응식 23
Figure pct00053
화합물 HH - 화합물 HH는 2 m㏖의 화합물 다이메틸 3,5-다이옥소헵탄다이오에이트(Reihm, et. al., Org. Biomol. Chem., 2008, 6, 3079-3084)를 에탄올 1㎖ 중 1 m㏖의 보호된 알킬하이드라진과 2시간 동안 혼합함으로써 합성한다. 이 반응물을 진공 중 농축시키고, 이것은 추가의 정제 없이 이용한다.
화합물 II - 20㎖ 바이알에 0.5 m㏖의 화합물 HH, 0.5 m㏖의 보호된 알킬하이드라진 및 5㎖의 에탄올을 주입한다. 이 반응물을 2시간 동안 교반하고 나서, 진공 중 농축시켰다. 조질의 반응물은 추가의 정제 없이 이용된다.
반응식 24
Figure pct00054
화합물 JJ - 4㎖ 바이알에 0.1 m㏖의 화합물 II 및 1㎖의 DCM을 주입한다. 이 용액에, 100㎕의 물, 100㎕의 트라이아이소프로필실란, 800㎕의 트라이플루오로아세트산을 첨가하고, 이 반응물을 1시간 동안 실온에서 교반한다. 조질의 반응물을 0-100% 물:MeCN 구배를 이용하는 역상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적으로 하는 생성물(JJ)을 수득한다.
실시예 35:
말로노나이트릴-Pz
말로노나이트릴-Pz 커플링 모이어티는 반응식 25에 따라서 합성될 수 있다.
반응식 25
Figure pct00055
실시예 36:
α-치환된-피라잘리논
α-치환된-Pz 커플링 모이어티는 반응식 26에 따라서 합성될 수 있다.
반응식 26
Figure pct00056
에틸 2-(4-플루오로-3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)아세테이트(KK) ― 에탄올 10㎖ 중 에틸 2-플루오로아세토아세테이트(1.23 m㏖), 에틸 2-하이드라진일아세테이트(1.23 m㏖), 트라이에틸아민(17㎕, 0.124 m㏖)의 용액을 50℃에서 2시간 동안 유지시킨다. 이 조질의 반응물을 진공 중 농축시키고, 33-60% 헥산:에틸 아세테이트 구배를 이용하는 실리카겔 상에서 크로마토그래피를 실시하여, 목적으로 하는 생성물(KK)을 수득한다.
2-(4-플루오로-3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)아세트산(LL) ― 수산화리튬(10.7㎎)을 2:3:1 THF:MeOH:물 1㎖ 중 화합물 KK(0.207 m㏖)의 용액에 첨가한다. 이 반응물을 2시간 동안 유지시키고 나서, 물 40㎖와 에틸 에터 40㎖ 간에 분액시킨다. 수성 층을 pH 2로 산성화시키고, DCM 3x60㎖로 세척한다. 유기 상들을 합하여, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과 후, 진공 중 농축시켜, 목적으로 하는 생성물(LL)을 수득하고, 이것은 추가의 정제 없이 이용한다.
플루오로-Pz-카고(MM) - COMU(6.8㎎)를 DMF 100㎕ 중 H2N-2PEG-May(화합물 270)(18.5㎎, 0.0229 m㏖), 2-(4-플루오로-3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)아세트산(LL)(0.0153 m㏖), 2,4,6-트라이메틸피리딘(0.0153 m㏖)의 0℃ 용액에 첨가한다. 이 반응물을 0℃에서 30분 동안 유지하고 나서 실온으로 30분에 걸쳐서 가온시킨다. 얻어진 반응 혼합물을 EtOAc 10㎖로 희석시키고 나서 분액 깔때기로 옮긴다. 유기 상을 1M HCl 3x10㎖, 포화 NaHCO3 3x10㎖ 및 염수 3x10㎖로 세척한다. 유기 상을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과 후 진공 중 농축시킨다. 조질의 반응물을 5-12% 메탄올:DCM 구배를 이용하는 실리카겔 상에서 크로마토그래피를 실시하여 목적으로 하는 생성물을 수득한다.
본 발명은 그의 특정 실시형태들을 참조하여 설명되었지만, 본 발명의 진정한 사상 및 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 변화가 이루어질 수 있고, 등가물이 치환될 수 있음이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 목적, 사상 및 범위에 대해 특정 상황, 재료, 물질의 조성, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 적합화시키기 위해 많은 변형이 이루어질 수 있다. 이러한 모든 변형은 하기에 첨부되는 특허청구범위의 범주 내에 포함되도록 의도된다.

Claims (52)

  1. 하기 화학식의 적어도 하나의 변형된 아미노산 잔기를 포함하는, 컨쥬게이트:
    Figure pct00057

    식 중,
    X는 N, NH, O, S, CH 또는 CH2이고;
    Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 N, O 및 S로부터 선택되며;
    n은 1 또는 2이고;
    R2는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되며;
    R3은 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실 아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고;
    R4는 선택적이고, 만약 존재한다면, 수소, 하이드록실, 할로겐, 사이아노, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 아실, 카복실 및 카복실 에스터로부터 선택되며;
    R5는 선택적이고, 만약 존재한다면, 수소 또는 하이드록실이며; 그리고
    R6은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실 아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고,
    W1 및 W2 중 한쪽은 폴리펩타이드이고, 다른 한쪽은 약물 또는 검출 가능한 표지(detectable label)이며,
    점선은 선택적 결합을 나타내고,
    R4-탄소와 R5-탄소 사이의 점선이 이중 결합일 때, n은　1이고 R4와 R5는 존재하지 않으며, 그리고
    n이 2일 때, R4-탄소와 R5-탄소 사이의 점선은 이중 결합이 아니고 R5는 존재하지 않는다.
  2. 제1항에 있어서, Y1은 N인, 컨쥬게이트.
  3. 제1항에 있어서, Y2는 O인, 컨쥬게이트.
  4. 제1항에 있어서, R2는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴인, 컨쥬게이트.
  5. 제1항에 있어서, R2는 메틸, t-뷰틸 또는 아릴인, 컨쥬게이트.
  6. 제1항에 있어서, R4-탄소와 R5-탄소 사이의 점선은 이중 결합이고, n은　1이며, 그리고 R4와 R5는 존재하지 않는, 컨쥬게이트.
  7. 제1항에 있어서, R4-탄소와 R5-탄소 사이의 점선은 이중 결합이 아니고, n은　1이며, 그리고 R5는 하이드록실인, 컨쥬게이트.
  8. 제1항에 있어서, n은 2이고, R4-탄소와 R5-탄소 사이의 점선은 이중 결합이 아니며, R5는 존재하지 않는, 컨쥬게이트.
  9. 제1항에 있어서, X와 Y1 사이의 점선이 결합이므로, 상기 변형된 아미노산 잔기는 하기 화학식을 가지는, 컨쥬게이트:
    Figure pct00058
    .
  10. 제1항에 있어서, X와 Y1 사이의 점선이 결합이 아니므로, 변형된 아미노산 잔기는 하기 화학식을 가지는, 컨쥬게이트:
    Figure pct00059
    .
  11. 제1항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 형광단(fluorophore)을 포함하는, 컨쥬게이트.
  12. 제1항에 있어서, W1은 상기 약물 또는 상기 검출 가능한 표지이고, 그리고 W2는 상기 폴리펩타이드인, 컨쥬게이트.
  13. 제1항에 있어서, W1은 상기 폴리펩타이드이고, 그리고 W2는 상기 약물 또는 상기 검출 가능한 표지인, 컨쥬게이트.
  14. 하기 화학식의 화합물:
    Figure pct00060

    식 중,
    R2는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고;
    R3은 하이드록실, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 아실, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 치환된 헤테로사이클릴 및 -R9W로부터 선택되며;
    R7은 수소, 하이드록실, 할로겐, 사이아노, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 아실, 카복실, 및 카복실 에스터로부터 선택되고;
    R9는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되며; 그리고
    W는 약물, 검출 가능한 표지 및 폴리펩타이드로부터 선택된다.
  15. 제14항에 있어서, R2는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴인, 화합물.
  16. 제14항에 있어서, R2는 메틸, t-뷰틸 또는 아릴인, 화합물.
  17. 제14항에 있어서, R3은 치환된 알킬 또는 치환된 아릴인, 화합물.
  18. 제17항에 있어서, R3은 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아미노아실, 아마이드, 치환된 아마이드, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 각각 독립적으로 선택된 1개 이상의 기로 치환된, 화합물.
  19. 제14항에 있어서, R3은 알킬아마이드 또는 치환된 알킬아마이드인, 화합물.
  20. 제14항에 있어서, R3은 -R9W인, 화합물.
  21. 제14항에 있어서, R7은 수소인, 화합물.
  22. 제14항에 있어서, R7은 할로겐인, 화합물.
  23. 제14항에 있어서, R7은 알킬 또는 치환된 알킬인, 화합물.
  24. 제14항에 있어서, 상기 화합물은,
    4-(3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)벤조산(화합물 10);
    3-(2-머캅토에틸)-1-메틸-1H-피라졸-5(4H)-온(화합물 A4);
    3-(2-(2-(3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)에톡시)에톡시)프로판산(화합물 230);
    퍼플루오로페닐 3-(2-(2-(3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)에톡시)에톡시)프로파노에이트(화합물 240); 및
    N-"카고"(cargo)-3-(2-(2-(3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-1H-피라졸-1-일)에톡시)에톡시) 프로판아마이드(화합물 250)로 이루어진 군으로부터 선택된, 화합물.
  25. 하기 화학식의 화합물:
    Figure pct00061

    식 중,
    R2는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고;
    R7은 수소, 하이드록실, 할로겐, 사이아노, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 아실, 카복실, 및 카복실 에스터로부터 선택되며;
    R8은 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아마이드, 치환된 아마이드, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 치환된 헤테로사이클릴 및 -R9W로부터 선택되고;
    R9는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되며; 그리고
    W는 약물, 검출 가능한 표지 및 폴리펩타이드로부터 선택된다.
  26. 제25항에 있어서, R2는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴인, 화합물.
  27. 제25항에 있어서, R2는 메틸, t-뷰틸 또는 아릴인, 화합물.
  28. 제25항에 있어서, R7은 수소인, 화합물.
  29. 제25항에 있어서, R7은 할로겐인, 화합물.
  30. 제25항에 있어서, R7은 알킬 또는 치환된 알킬인, 화합물.
  31. 제30항에 있어서, R8은 -R9W인, 화합물.
  32. 하기 화학식의 1종 이상의 화합물을 포함하는 컨쥬게이트:
    Figure pct00062

    식 중,
    X1 및 X2는 각각 독립적으로 N 및 CH로부터 선택되고;
    Y1 및 Y3은 각각 독립적으로 N 및 S로부터 선택되며;
    Y2 및 Y4는 각각 독립적으로 N, O 및 S로부터 선택되고;
    R2 및 R10은 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되며;
    R3 및 R11은 각각 독립적으로 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실 아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고; 그리고
    W1a, W1b 및 W2는 각각 독립적으로 약물, 검출 가능한 표지 및 폴리펩타이드로부터 선택된다.
  33. 제32항에 있어서, Y1 및 Y3은 N인, 컨쥬게이트.
  34. 제32항에 있어서, R2 및 R10은 각각 독립적으로 알킬, 치환된 알킬, 아릴 및 치환된 아릴로부터 선택되는, 컨쥬게이트.
  35. 제32항에 있어서, R2 및 R10은 각각 독립적으로 메틸, t-뷰틸 및 아릴로부터 선택되는, 컨쥬게이트.
  36. 제32항에 있어서, Y2 및 Y4는 O인, 컨쥬게이트.
  37. 제32항에 있어서, W1a 및 W1b는 각각 독립적으로 상기 약물 및 상기 검출 가능한 표지로부터 선택되고, 그리고 W2는 상기 폴리펩타이드인, 컨쥬게이트.
  38. 컨쥬게이트를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은,
    제14항의 화합물 및 반응성 기를 포함하는 제2 화합물을 반응 혼합물로 배합하는 단계로서, 상기 배합은 상기 화합물과 상기 제2 화합물의 반응성 기 간의 반응을 촉진시키기에 적합한 반응 조건 하에 수행되어 컨쥬게이트를 형성하는, 상기 배합하는 단계; 및
    상기 반응 혼합물로부터 상기 컨쥬게이트를 단리시키는 단계를 포함하는, 컨쥬게이트의 제조방법.
  39. 제38항에 있어서, R3은 -R9W이고, W는 상기 약물 또는 상기 검출 가능한 표지이며, 그리고 상기 제2 화합물은 상기 폴리펩타이드인, 컨쥬게이트의 제조방법.
  40. 제38항에 있어서, R3은 -R9W이고, W는 폴리펩타이드이며, 그리고 상기 제2 화합물은 상기 약물 또는 상기 검출 가능한 표지인, 컨쥬게이트의 제조방법.
  41. 제38항에 있어서, 상기 반응성 기는 반응성 알데하이드기 또는 반응성 케톤기를 포함하는, 컨쥬게이트의 제조방법.
  42. 제38항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 물을 포함하는, 컨쥬게이트의 제조방법.
  43. 제38항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 pH 7을 지니는, 컨쥬게이트의 제조방법.
  44. 제38항에 있어서, 상기 반응 조건은 37℃의 온도인, 컨쥬게이트의 제조방법.
  45. 약제학적 조성물로서,
    제1항의 컨쥬게이트; 및
    약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  46. 대상체에게 컨쥬게이트를 전달하는 방법으로서, 상기 방법은,
    유효량의 제1항의 컨쥬게이트를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에게 컨쥬게이트의 전달 방법.
  47. 대상체의 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은,
    제1항의 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 병태를 가진 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 투여는 상기 대상체의 상기 병태를 치료하는 데 효과적인, 대상체의 병태의 치료 방법.
  48. 하기 화학식의 화합물을 포함하는 컨쥬게이트:
    Figure pct00063

    식 중,
    X는 N 또는 CH이고;
    R3 및 R11은 각각 독립적으로 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 아실, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴 및 -R9W로부터 선택되며;
    R7 및 R12은 각각 독립적으로 수소, 하이드록실, 할로겐, 사이아노, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 아실, 카복실, 및 카복실 에스터로부터 선택되고;
    R9는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되며;
    R13은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 아실, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드 및 -R14W로부터 선택되고;
    R14는 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되며; 그리고
    W는 약물, 검출 가능한 표지 및 폴리펩타이드로부터 선택된다.
  49. 제48항에 있어서, X는 N인, 컨쥬게이트.
  50. 제48항에 있어서, X는 CH인, 컨쥬게이트.
  51. 제48항에 있어서, R3 및 R11은 각각 독립적으로 메틸 및 페닐로부터 선택되는, 컨쥬게이트.
  52. 제48항에 있어서, R13은 H 또는 치환된 알킬인, 컨쥬게이트.
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