JP4323949B2 - 核酸用送達系 - Google Patents

Description

本発明は、米国政府、国立予防衛生研究所（ＮＩＨ）、助成金１Ｒ３７ＣＡ５０２８６および１Ｒ０１ＣＡ８６３１２の政府支援によりなされたものであり、米国政府は本発明に一定の権利を有している。

本発明は、インビボ標的部位への遺伝子および核酸類の送達に関する。より具体的には、本発明は、血管形成性血管へのリポソーム媒介による遺伝子送達に関する。

インテグリンは、細胞外マトリックス蛋白質と結合することが知られた細胞受容体の１種であり、したがって細胞接着事象と一般に称される細胞−細胞および細胞−細胞外マトリックスの相互作用を媒介する。インテグリンと結合する多くのインテグリン類およびリガンド類が文献に記載されているが、多くのインテグリン類の生物学的機能は依然として分かりにくい。インテグリン受容体は、αサブユニットとβサブユニットから形成される非共有結合ヘテロ二量体の糖蛋白複合体という共通した構造的特徴を有する蛋白質の一系統群を構成している：Ｃｈｅｒｅｓｈ ＆ Ｍｅｃｈａｍ編集、「Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州９２１０１（１９９４）」、Ｈｏｒｔｏｎ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．、７１：７４１〜７５９頁（１９９０）。これらインテグリン類が組織内の多くの細胞相互作用において演じている特異的な細胞接着の役割の研究が依然として続けられている。

内皮マトリックス相互作用は、血管形成時、新生血管形成の役割を演じる。α_ｖβ_３インテグリンとして知られている細胞接着受容体は、血管形成に寄与する活性化内皮細胞の表面上に見出されている。

血管形成はまた、悪性腫瘍の成長および転移にとって必要条件であることが知られている。血管形成がないと、局所腫瘍の拡大が抑制される。また、特異的な血管形成マーカー、α_ｖβ_３インテグリンの発現は、腫瘍程度と相関することが知られている。

標的剤としての非ペプチド系インテグリンアンタゴニストを担持するカチオンリポソーム類は、遺伝子などの核酸類を血管形成血管に送達できることを見出した。適切に選択された核酸類は、所望にしたがって血管増殖を抑制または亢進でき、したがって、血管形成依存性疾患の治療手段を提供する。

非ペプチド系インテグリン受容体アンタゴニストと核酸を含む標的リポソーム類が、本発明により提供される。全身または局所に導入された場合、これらの標的リポソーム類は、予め決められた標的部位、例えば、インビボ血管形成血管への遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸類の選択的送達にとって有用である。このように選択された核酸類は血管形成血管に送達され、発現またはアンチセンス送達のために血管内皮細胞の核酸類の取り込みを媒介することができる。新生血管の増殖中断が達成できる。また所望ならば、送達される核酸の適切な選択によって、血管増殖を誘導できる。

より具体的には、α_ｖβ_３インテグリン受容体標的リポソ−ムは、約１００ナノメートル以下のサイズを有するナノ粒子であり、カチオン脂質などのカチオン両親媒性物質、中性脂質、α_ｖβ_３インテグリン標的ドメインと疎水性ドメインを有する標的脂質、および遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列などの核酸を含む単層または複層ベシクルである。標的リポソームはまた場合によっては、中性脂質を含むこともできる。前記標的脂質において、標的ドメインは、疎水性ドメインに直接結合できる。あるいは、前記標的ドメインは、親水性結合ドメイン（表面リンカー）に共有結合でき、これが次に疎水性ドメインに共有結合する。前記核酸をリポソームに存在するカチオン両親媒性物質と複合化する。前記標的ドメインとしては非ペプチド系α_ｖβ_３インテグリンアンタゴニストが挙げられる。

前記標的リポソームにおいて、カチオン性脂質などのカチオン両親媒性物質は、前記リポソーム内脂質の全モル数を基準として約１モルパーセントから約５０モルパーセントの範囲量で存在し、標的脂質の標的ドメインは約１モルパーセントから約２０モルパーセントの範囲量で存在する。標的リポソームを構成する脂質は、それぞれの疎水性部にオリゴマー化可能な官能基および／または重合化可能な官能基を有することができ、リポソーム中に存在するこのような脂質の少なくとも一部はこのような基を介して互いに架橋できる。カチオン脂質はまた、所望ならば、架橋可能な基を有することもできる。あるいは、カチオン脂質は、架橋可能な基を有さないこともできる。

本明細書中の標的リポソ−ム類を核酸類の送達に利用して、ガン、炎症疾患、眼疾患などを治療することができる。このような標的リポソーム類を、血管中の治療標的物を同定するために遺伝子送達に利用することもできる。

本発明の標的リポソーム類は、約２５０ナノメートル以下、好ましくは約４０ナノメートルから約１００ナノメートルの大きさの複数結合ナノ粒子であり、それらと複合化した核酸と共にカチオン脂質またはサイトフェクチンを含んでいる。好ましい標的脂質は、Ｌ−Ｘ−Ｋとして表すことができ、式中Ｌは、標的ドメイン、例えば、α_ｖβ_３受容体アンタゴニストなどのインテグリン受容体アンタゴニストであり、Ｘは、疎水性ドメインＫに対する表面リンカーとして寄与する親水性ドメインである。あるいは、標的脂質は、標的ドメインＬが疎水性ドメインＫに直接結合されているＬ−Ｋにより表すことができる。

生理的ｐＨ値において本発明の目的に好適な非ペプチド系インテグリン受容体アンタゴニストは、インテグリン受容体と相互作用または結合できるカチオン基とアニオン基を有する両性イオンである。前記カチオン基とアニオン基は、二価の芳香族基などのスペーサー基により互いに分離されている。受容体アンタゴニスト分子上のカチオン基とアニオン基との間の間隔は、約１０オングストロームから約１００オングストロームの範囲であり、互いに間隔をあけられたカチオン基とアニオン基が、生理的ｐＨ値でインテグリン受容体と相互作用するように利用し得る限り、アルコキシ安息香酸、二環式または三環式化合物またはスピロ環化合物などによって提供できる。好適なインテグリン受容体アンタゴニストは、以下のとおり図式的に表すことができる：

例示の非ペプチド系α_ｖβ_３受容体アンタゴニストは式：

により表され、
式中、遊離アミノ基（ＮＨ_２）は、アンタゴニストをリポソームの疎水性ドメインに直接、または表面リンカー基を介して共有結合させるために利用される。

標的脂質の親水性ドメインに結合される場合の本目的に有用な他の好適な非ペプチド系α_ｖβ_３受容体アンタゴニストは、米国特許第５，５６１，１４８号、米国特許第５，７７６，９７３号および米国特許第６，２０４，２８０号、および特許公報ＷＯ００／６３１７８、ＷＯ０１／１０８４１、ＷＯ０１／１４３３７、ＷＯ０１／１４３３８、ＷＯ９７／４５１３７、ＷＯ９８／３５９４９およびＷＯ００／２６２１２に記載されている。

非ペプチド系インテグリン受容体アンタゴニストＬと場合によっては表面リンカーＸとの組合わせは、カチオンリポソームなどの核酸担体への接合に好適なα_ｖβ_３受容体標的分子または基を構成する。次に生成した標的リポソームは、予め決められた核酸、例えば遺伝子と複合化することによりそれを伴う。

本発明の標的リポソーム類は、図１〜３と図１８に説明され、インテグリン受容体アンタゴニスト、例えば脂質に結合されたα_ｖβ_３受容体アンタゴニストおよび核酸の担体、例えばカチオン脂質などのカチオン両親媒性物質によって構成される。リポソームはまた、中性または両性イオンフィラー脂質を含むことができる。

前記標的脂質は、疎水性ドメインに共有結合したα_ｖβ_３インテグリン受容体アンタゴニストを含む標的ドメインを有する。前記標的ドメインは疎水性ドメインに直接結合できるか、または標的ドメインはリンカー基（表面リンカー）などの親水性ドメインに結合でき、これが次に疎水性ドメインに結合する。

本目的に好適なインテグリン受容体アンタゴニストは、生理的ｐＨ値での両性イオンであり、インテグリン受容体と相互作用または結合できるカチオン基とアニオン基を有する。前記カチオン基とアニオン基は、二価の芳香族基などのスペーサー基により互いに分離される。受容体アンタゴニスト分子上のカチオン基とアニオン基間の間隔は、約１０オングストロームから約１００オングストロームの範囲であり、互いに間隔をあけられたカチオン基とアニオン基が生理的ｐＨ値でインテグリン受容体と相互作用するように利用し得る限り、ｐ−アルコキシ安息香酸、二環式または三環式化合物またはスピロ環化合物などによって提供できる。

本明細書中および添付の特許請求の範囲に用いられる用語の「アリール」とは、少なくとも１個の６−炭素芳香族環を含有する炭化水素基を意味し、さらに直鎖、分枝状または環式炭化水素置換基を含むことができる。用語の「ヘテロアリール」とは、少なくとも１個の炭素−ヘテロ原子含有芳香族環を含む基を意味し、さらに直鎖、分枝状または環式炭化水素置換基を含むことができ、前記へテロ原子は、周期律表の１５（窒素基）および１６（酸素基）としてＩＵＰＡＣにより指定された群から選択された任意の元素であり得、Ｌ．Ａ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ、「Ｐｒｉｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，（１９６８）に開示されている化合物などの芳香族ヘテロ環基を含み、その関連開示は参照により本明細書に組み込まれている。本明細書中に言及されたアリール基とヘテロアリール基は無置換であっても、または置換されていてもよい。

本明細書中および添付の特許請求の範囲に用いられる用語の「ヘテロ環」とは、少なくとも１個の炭素−ヘテロ原子含有非芳香族環を含む基を意味し、さらに直鎖、分枝状または環式炭化水素置換基を含むことができ、前記へテロ原子は、周期律表の１５（窒素基）および１６（酸素基）としてＩＵＰＡＣにより指定された群から選択された任意の元素であり得、Ｐａｑｕｅｔｔｅ、上記文献に開示されている化合物などの非芳香族ヘテロ環基を含み、その関連開示は参照により本明細書に組み込まれている。ヘテロ環基は無置換であっても、あるいはアルキル基またはハロゲン、アミノ基、水酸基、カルボン酸基、スルホン酸基などの反応性官能基で置換されていてもよい。

本明細書中および添付の特許請求の範囲に用いられる用語の「アルキル」とは、直鎖状、分枝状、または炭素環式環構造を含むことができる炭化水素部分を言う。

本明細書中および添付の特許請求の範囲に用いられる用語の「アルケニル」とは、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を有するアルキル基を言う。

本明細書中および添付の特許請求の範囲に用いられる用語の「アルキニル」とは、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を有するアルキル基を言う。

本明細書中および添付の特許請求の範囲に用いられる用語の「置換された」とは、上記基の１個における１個以上の水素原子を、Ｒ．Ｐａｎｉｃｏら編集、「Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ ＩＵＰＡＣ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．（１９９３）に記載されているようなアルキル基、フェニル基、または水酸基、アルコキシル基、アミノ基、ニトロソ基、ニトロ基、アゾ基、アジド基、アミド基、カルボキシル基、オキソ基、チオール基、スルホキシル基、スルホニル基、ホスフィニル基、ホスホニル基、フルオロ基、クロロ基、、ブロモ基、ヨード基などの官能基などと置換することを意味し、その関連開示は参照により本明細書に組み込まれている。

本明細書中および添付の特許請求の範囲に用いられる用語の「リポソーム」とは、互いに共重合化していても、してなくてもよい脂質分子の壁を有する小球を言う。

本明細書中および添付の特許請求の範囲に用いられる用語の「脂質」とは、比較的非極性溶媒に可溶性であるが、水性溶媒にはかろうじて可溶性であることが特徴であるオイル、脂肪、脂肪様物質群の任意の物質を言う。脂質は、生体組織に見出される４つの主要な分類群の１つを構成しており、脂肪酸類、トリアシルグリセロール類などの中性脂肪、脂肪酸エステル類およびセッケン、長鎖（脂肪族）アルコール類およびワックス類、スフィンゴイド類および他の長鎖塩基類、糖脂質類、リン脂質類、スフィンゴ脂質類、カロテン類、ポリプレノール類、ステロール類など、並びにテルペン類、イソプレノイド類などを含む。

本明細書中および添付の特許請求の範囲に用いられる用語の「サイトフェクチン」とは、
リンカーによって疎水性ドメインまたは疎水性部分に結合されたカチオン先端基から作製され、遺伝子送達および遺伝子発現に好適なカチオン脂質を意味する。

本明細書中および添付の特許請求の範囲に用いられ、脂質で言及される用語の「中性」とは、非電荷脂質、例えばコレステロールなど、並びに両性イオン脂質、例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリンなどを含む。

本明細書中および添付の特許請求の範囲に用いられる用語の「コレステリル」とは、コレステロールから誘導されるか、またはそれと構造的に類似のステロイド系炭化水素部分を言う。

本明細書中および添付の特許請求の範囲に用いられる用語の「インテグリン受容体アンタゴニスト」とは、インテグリンの受容体と、例えば、α_ｖβ_３受容体、α_ｖβ_５受容体、α_ｖβ_６受容体などと選択的に結合し、またそれらと拮抗する非ペプチド系化合物を言う。

例示されるこのようなα_ｖβ_３アンタゴニスト化合物は、式：

によって表され、
式中、遊離アミノ基（ＮＨ_２）は、カルボン酸基および／または他の好適な活性基などの表面リンカー基を介してアンタゴニストをリポソームの疎水性ドメインに共有結合させるために利用される。

標的脂質の疎水性ドメインに直接または間接的に結合される場合、本目的に有用な他に例示される非ペプチド系α_ｖβ_３受容体アンタゴニストは、米国特許第５，５６１，１４８号、米国特許第５，７７６，９７３号および米国特許第６，２０４，２８０号、および特許公報ＷＯ００／６３１７８、ＷＯ０１／１０８４１、ＷＯ０１／１４３３７、ＷＯ０１／１４３３８、ＷＯ９７／４５１３７、ＷＯ９８／３５９４９およびＷＯ００／２６２１２に記載されており、その関連開示は参照により本明細書中に組み込まれている。このようなα_ｖβ_３受容体アンタゴニストは下記に例示される。すなわち、
ＷＯ０１／１４３３８に記載されている、

など；
ＷＯ０１／１４３３７に記載されている、

など；
ＷＯ００／６３１７８記載されている、

など；
ＷＯ０１／１０８４１に記載されている、

などがある。但し、このような化合物は、表面リンカーまたは疎水性ドメインと反応できる官能基または架橋基を含むか、あるいは含むように修飾され、標的脂質を形成するものである。このような修飾は化学業界でよく知られている。例えば、上記に例示された化合物の芳香族部分の１つは、アミノ基、水酸基またはチオール基で化学的に置換でき、表面リンカーに結合手段を与える。あるいは、芳香族基はカルボン酸により置換でき、表面リンカーは、例えば、アミノ置換基であってもよい。

従来の化学技術を用いて、非ペプチドインテグリン受容体アンタゴニストが親水性表面リンカーにまたは疎水性ドメインに直接共有結合し、表面リンカーまたは疎水性ドメインへのアンタゴニストの共有結合を提供する。このような結合を生じる化学反応は当業界でよく知られており、表面リンカーまたは疎水性ドメイン上の補助的官能基およびインテグリンアンタゴニストリガンドの利用を伴う。表面リンカーまたは疎水性ドメイン上の補助的官能基は、結合のためのリガンド上で利用できるか、または結合のためのリガンド上に導入できる官能基に関連して選択されることが好ましい。このような補助的官能基もまた当業界でよく知られている。例えば、好適なよく知られた活性化剤の存在下、カルボン酸と第一級または第二級アミンとの反応は、リガンドを表面リンカーまたは疎水性ドメインに共有結合できるアミド結合の形成をもたらし；アミン基とハロゲン化スルホニル基との反応は、リガンドを表面リンカーまたは疎水性ドメインに共有結合できるスルホンアミド結合の形成をもたらし；アルコール基またはフェノール基とハロゲン化アルキルまたはハロゲン化アリールとの反応は、インテグリンアンタゴニストのリガンドを表面リンカーまたは疎水性ドメインに共有結合できるエーテル結合の形成をもたらす。

他に、インテグリン受容体アンタゴニストは、Ｃ_１８〜Ｃ_３０アルキル基、Ｃ_１８〜Ｃ_３０アルケニル基、Ｃ_１８〜Ｃ_３０アルキニル基、コレステリル基などの疎水性ドメインを含むことができる。

介在表面リンカーを有する、または有さない疎水性ドメインは、受容体結合部位の相互作用を保持する位置にインテグリン受容体アンタゴニストに結合し、具体的には、そのことによりアンタゴニストはインテグリン受容体結合部位に結合するようにそれ自体方向づけできる。結合のためのこのような位置と合成プロトコルは当業界によく知られている。

疎水性ドメインを含むかまたはそれと共有結合できる、好ましいα_ｖβ_３インテグリン受容体アンタゴニストは、式（Ｉ）および（ＩＩ）によって表される。

式（Ｉ）において、Ｒ^１およびＲ^２は、各々水素であるか、または架橋１，２−フェニレン（Ｃ_６Ｈ_４）基または架橋エチレン基（−ＣＨ＝ＣＨ−）を一緒に形成し；Ｘは−Ｃ（Ｏ）−または共有結合であり；ｎは１、２または３であり；Ｚ^１は−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ^３、またはＳＯ_２Ｒ^３であり；Ｒ^３はフェニル、置換フェニル、ピリジル、ベンジル、置換ベンジル、Ｃ_１〜Ｃ_４ハロアルキル、Ｃ_２〜Ｃ_３０アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_３０アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_３０アルキニル、またはコレステリルであり；および
式（ＩＩ）において、Ｒ^４およびＲ^５は、各々水素であるか、または共有結合を一緒に形成し；Ｙは−Ｃ（Ｏ）−または−ＣＨ_２−であり；Ｚ^２は−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^６、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ^６またはＳＯ_２Ｒ^６であり；Ｒ^６はフェニル、置換フェニル、ピリジル、ベンジル、置換ベンジル、Ｃ_１〜Ｃ_４ハロアルキル、Ｃ_２〜Ｃ_３０アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_３０アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_３０アルキニル、またはコレステリルであり；Ｈｅｔは２−ピリジルまたは２−イミダゾリルである。

式（Ｉ）のインテグリン受容体アンタゴニストの非限定的例としては、下記の化合物Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、ＩｅおよびＩｆが挙げられる。これらの具体的化合物の調製は、ＰＣＴ公報ＷＯ９８／３５９４９に記載されている。

式（ＩＩ）のインテグリン受容体アンタゴニストの非限定的例としては、下記の化合物ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩｃ、ＩＩｄ、ＩＩｅおよびＩＩｆが挙げられる。これらの具体的化合物の調製は、ＰＣＴ公報ＷＯ００／２６２１２に記載されている。

標的脂質の疎水性ドメインに共役結合されていない場合、好ましいα_ｖβ_３インテグリン受容体アンタゴニストは、約２００ダルトンから約８００ダルトン、より好ましくは約４５０ダルトンから約６１０ダルトンの範囲の分子量（ＭＷ）を有する。

疎水性ドメインに共有結合されているか、またはそれを含んでいる場合、α_ｖβ_３インテグリン受容体アンタゴニストは、カチオン脂質と組合わされて生体適合性および実質的に非免疫原性であるカチオンリポソームを提供する。標的リポソームの生物活性は、親水性表面リンカーが存在するならば、その原子価、幾何構造、組成物、サイズ、可撓性、剛性などに、そして次に標的リポソームの総合的形状並びに表面リンカーの相対的親水性などに鋭敏であり得る。したがって、親水性表面リンカーは、存在する場合、標的リポソームの生物活性を最大にするように選択することが好ましい。前記表面リンカーは、標的分子の生物活性を高めるように選択できる。一般に、表面リンカーは、アンタゴニストは、アンタゴニストをその結合部位に方向づける任意の有機分子構成物から選択できる。この点から、表面リンカーは１種以上のインテグリンアンタゴニストが、所望の方向づけの結果をもたらすためにその上に配置される「枠組み」と考えることができる。例えば、方向づけには、リポソーム表面から好適な距離でアンタゴニストを存在させることができ、アンタゴニストとインテグリン受容体の活性部位との効果的な相互作用を可能にすることが含まれる。

例えば、種々の方向づけは、アリール基および／またはヘテロアリール基などの単環基または多環基、または１個以上の炭素−炭素多重結合（アルケニル基、アルケニレン基、アルキニル基またはアルキニレン基）を組入れている構造など、を含有する枠組み基に含ませることにより達成できる。他の基は、分枝鎖または直鎖物質であるオリゴマー類およびポリマー類を含むこともできる。好ましい実施態様において、剛性は、環式基（例えば、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロ環など）の存在により付与される。他の好ましい実施態様において、前記環は６員環または１０員環である。さらにまた好ましい実施態様において、前記環は、例えばフェニルまたはナフチルなどの芳香環である。

インテグリンアンタゴニストを伴っている場合、α_ｖβ_３インテグリンの細胞外部分の結晶構造は、Ｘｉｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２９６：１５１〜１５５頁（２００２）に記載されている。本発明の実施に利用されるα_ｖβ_３インテグリン受容体アンタゴニストは、Ｘｉｏｎｇらにより記載された相互作用と同様な挙動でα_ｖβ_３インテグリン受容体と相互作用する構造を有する。

表面リンカーの種々の親水性特性、並びにリポソーム上の電荷部分の有無を、当業者により容易に制御できる。例えば、ヘキサメチレンジアミン（Ｈ_２Ｎ（ＣＨ_２）_６ＮＨ_２）または関連ポリアミン類から誘導された表面リンカーの疎水性は、アルキレン基をポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）などのポリ（オキシアルキレン）基で置換することにより実質的により親水性になるように修飾できる。

表面リンカーの性質は、表面リンカー内へまたは表面リンカー上への補助基の付加または挿入により修飾でき、例えば、リポソーム類の溶解性（水、脂肪、脂質、生体液などの中）、疎水性、親水性、表面リンカーの可撓性、抗原性、安定性などを変えることができる。例えば、表面リンカー上へまたは表面リンカー内への１種以上のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）基の導入により、ナノ粒子リポソームの親水性と水溶性を増大し、分子量と分子サイズの双方を増大し、なおかつ、表面リンカーの性質に依って、インビボ保持時間を増加することもできる。さらに、ＰＥＧは、抗原性を減少させることができ、表面リンカーの全体的剛性を潜在的に高める。

リポソームの水溶性／親水性を高めることができる補助基は、本発明を実施する上で有用である。したがって、例えば、エチレングリコール類、プロピレングリコール類、アルコール類、ポリオール類（例えば、グリセリン、グリセロールプロポキシラート、単糖、オリゴ糖を含む糖類など）、カルボン酸塩類（例えば、グルタミン酸、アクリル酸などの小さな反復単位）、アミン類（例えば、テトラエチレンペンタミン）などの小さな反復単位のような補助基を利用することは本発明の範囲内にあり、本発明のリポソームの水溶性および／または親水性を高める。好ましい実施態様において、水溶性／親水性を向上させるために用いられる補助基はポリエーテルである。前記補助基は、標的脂質上の表面リンカーに結合できるか、あるいは例えば、カチオン脂質または中性フィラー脂質などのリポソーム中の他の脂質に結合できる。

本明細書中に記載されたリポソーム類の脂溶性および／または疎水性を高めるために、表面リンカー構造内への脂溶性補助基の組入れもまた、本発明の範囲内にある。本発明の表面リンカーに有用な脂溶性基は、例としてのみ、非置換または置換アリール基およびヘテロアリール基が挙げられるが、少なくとも表面リンカーへの共有結合を可能にする基で置換される。本発明の表面リンカーに有用な他の脂溶性基としては、比較的高濃度に到達するまで水性媒体中で二層を形成しない脂肪酸誘導体が挙げられる。

表面リンカーの可撓性は、かさ高いおよび／または剛性補助基を含むことによって操作できる。かさ高いまたは剛性基の存在によって、表面リンカー内の結合、表面リンカーと補助基間の結合または表面リンカーと官能基間の結合に関する自由回転を妨害できる。例えば、剛性基は、配座不安定性が、例えばアリール基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、へテロ環基内の環および／または多重結合の存在により制限される基を含むことができる。剛性を付与できる他の基としては、オリゴ鎖またはポリプロリン鎖などのポリペプチド基が挙げられる。

剛性はまた、静電的に付与できる。したがって、補助基が正または陰に荷電している場合、同様に荷電補助基は、プレゼンター表面リンカーを同様の各電荷間が最大距離になる配置にさせる。同様に荷電した基を互いに近接させるエネルギー消費により、同様に荷電した補助基間の間隔を維持する配置に、表面リンカーが保持される傾向を示すと思われる。さらに、反対電荷を担持する補助基は、反対に荷電した相手に結合する傾向となり、分子間および分子内イオン結合の双方に入れる可能性がある。この非共有機構により、反対に荷電した基の間の結合を可能にする配置に表面リンカーを保持する傾向となる。表面リンカーへの付加後、荷電した、あるいは脱保護時に潜在的電荷を担持する補助基の付加は、ｐＨの変化、酸化、還元または保護基の除去をもたらす当業者に知られた他の機構によるカルボキシル基、水酸基、チオール基またはアミノ基の脱保護を含み、本発明の範囲内にある。

剛性はまた、内部水素結合または疎水性崩壊によって付与できる。

かさ高い基は、例えば、大型原子、イオン類（例えば、ヨウ素イオン、硫黄イオン、金属イオンなど）または大型原子を含む基、芳香族基、非芳香族基などの多環基および１個以上の炭素−炭素多重結合（例えば、アルケン類やアルキン類）を組入れている構造を含むことができる。かさ高い基として、分枝鎖または直鎖物質であるオリゴマー類またはポリマー類を挙げることもできる。分枝状の物質は、分子量が同様の直鎖物質よりも大きな剛性構造を提供することが予想される。

幾つかの実施態様において、剛性は、環式基（例えば、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロ環など）の存在によって付与される。他の実施態様において、前記表面リンカーは１個以上の６員環を含む。さらに他の実施態様において、前記環は、例えば、フェニルまたはナフチルなどのアリール基である。

好適な方向付け、制限／無制限の回転、疎水性／親水性の所望の程度などを提供する表面リンカー基の適切な選択は、十分に当業者の範囲にある。本明細書に記載されたナノ粒子の抗原性の排除または軽減もまた、当業者の範囲にある。ある場合において、ナノ粒子の抗原性は、例えば、ポリ（エチレングリコール）基などの基の使用により排除または軽減できる。

核酸担体は、カチオン脂質、カチオンリポソーム、またはカチオン基を有するミセルなどのカチオン両親媒性物質であり、通常負に荷電している核酸配列との相互作用によって核酸に結合でき、細胞に入る能力を有する複合体を形成する。標的リポソーム類を、図１、２、３、１７および１８に例示している。

本発明の目的に好適なカチオン脂質（サイトフェクチン類）は、塩化１，２−ジオレオイルオキシ−３−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、塩化ジオレオイルジメチルアンモニウム、ジオレオイル−Ｌ−α−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、Ｎ−コレステリルオキシカルバリル−３，７，１２−トリアザペンタデカン−１，１５−ジアミン（ＣＴＡＰ）などにより例示される。好ましいカチオン脂質は、ＤＯＴＡＰである。他の好適なカチオン脂質は、Ｍｉｌｌｅｒ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３７：１７６８〜１７８５頁（１９９８）、以後「Ｍｉｌｌｅｒ」、およびＣｏｏｐｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．４（１）：１３７〜１５１頁（１９９８）に記載されており、関連する範囲で参照により本明細書中に組み込まれている。

本発明の標的リポソームは架橋、部分的架橋ができ、または架橋がなくてもよい。架橋されたリポソーム類は、架橋成分並びに非架橋成分を含むことができる。

本発明の例示の非架橋標的リポソームは、ＤＯＴＡＰ（カチオン脂質）、コレステロール（中性脂質）、ＰＥＧ−３５０（３５０個のオキシエチレン反復単位を有するポリオキシエチレン）などのポリエチレングリコール（親水性補助成分）、および脂質に共有結合されたまたは脂質を含む非ペプチド系インテグリン受容体アンタゴニストを含む脂質混合物である。ＤＯＴＡＰ対コレステロール対ポリエチレングリコールの比率は、約１：１：０．１２であることが好ましく、非ペプチド系インテグリン受容体アンタゴニスト含有脂質（インテグリン標的脂質）は、α_ｖβ_３インテグリンに対して比較的高結合活性を提供するのに十分な量で含まれる。好ましくは、標的リポソームは、リポソーム中の脂質成分の全モル数を基準として約１モルパーセントから約２０モルパーセントの範囲量で、より好ましくは約８モルパーセントから約１２モルパーセントの範囲量でインテグリン標的脂質を含む。

本発明の好ましい架橋標的リポソームとしては、核酸を結合するのに好適な重合性両性イオン脂質または中性脂質、重合性インテグリン標的脂質および重合性カチオン脂質が挙げられる。

他の好ましい実施態様において、架橋された標的リポソームとしては、重合性両性イオン脂質または中性脂質、重合性インテグリン標的脂質、および非重合性カチオン脂質が挙げられる。

リポソーム含有重合性脂質は、例えば、好適なフリーラジカル重合開始剤の添加、紫外線の好適波長での照射、すなわち重合化技術で知られた他の方法により架橋できる。

好適なカチオンリポソーム類またはサイトフェクチン類は、商品入手でき、またＳｉｐｋｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９８年、４（５）：（１９９８）、６２３〜６２６頁に記載されたとおり、またはＭｉｌｌｅｒの上記文献に記載されたとおり調製できる。

カチオンリポソーム類は、カチオン両親媒性物質単独またはカチオン両親媒性物質と中性脂質との組合わせ、例えば、３，３−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロールとジオレイルＬ−α−ホスファチジル−エタノールアミンとから形成できる。

親水性特性は、当業界によく知られているリン酸塩基、ホスホン酸塩基、カルボン酸塩基、硫酸塩基、スルホン酸塩基、、スルフィジル基、アミノ基、ニトロ基、水酸基、または他の同様な基の存在から誘導する。疎水性は、限定しないが、２０個の炭素原子までの長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基、並びに１個以上のアリール基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基、および／またはヘテロ環基によって置換されたこのような基を含むことにより付与できる。好ましい脂質は、ホスホグリセリド類およびスフィンゴ脂質である。ホスホグリセリド類の代表例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンおよびジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられる。スフィンゴ脂質やグリコスフィンゴ脂質族などのリン含有基を欠く化合物はまた、脂質として指定された群の中に入る。さらに、上記の両親媒性脂質は、トリグリセリド類などの他の脂質や、コレステロール、修飾コレステロールなどのステロール類と混合できる。

インテグリン受容体アンタゴニストは、疎水性ドメインを含むことができるか、または表面リンカーに結合できるか、あるいは、その結合がインテグリン受容体に対するアンタゴニストの結合を妨げない限り、任意の好適な位置、例えば直鎖の末端、またはその中間位置で疎水性ドメインに直接結合できる。インテグリン受容体アンタゴニストは、所望ならば、場合によっては二価の架橋基も含むか、またはそれが提供され、表面リンカーへの付加を促進する。

図１は、粒子表面上に核酸結合部位およびインテグリン標的部位を有する球形粒子としての標的リポソームを図式的に示す。

図２は、本発明の架橋標的リポソームを示す。図３は、他の架橋された標的リポソームを示し、カチオン脂質がリポソームに存在するが、それに架橋されていない。この標的リポソーム調製の実施態様を、本明細書中の下記の材料と方法の節に詳細に説明する。このような架橋されたリポソームは、その外面上に、核酸を結合できるコリン部分から誘導されるカチオン基、親水性表面リンカーに結合したインテグリンアンタゴニスト基から誘導されたインテグリン受容体結合部位を提供する。

核酸類は、生理的ｐＨで製剤的に許容できる水性媒体中、核酸と標的リポソームとを混合することなどにより、負に荷電した核酸をリポソーム上に存在するカチオン基と接触させることにより架橋リポソームのナノ粒子に結合できる。そのように形成された核酸複合化標的リポソーム類は、インビトロおよびインビボ双方で標的リポソーム類と接触させるインテグリン提示細胞により容易に取り出すことができる。

正に荷電した標的リポソーム対負に荷電した核酸の比率は、好ましくは１以上、より好ましくは少なくとも約１．２である。

α_ｖβ_３インテグリンなどのインテグリン類の選択的標的化または拮抗作用の目的で、本発明の化合物および組成物は、製剤的に許容できる担体、賦形剤および補助剤と共に単位剤形で非経口的、経口的吸入により、または局所的に、治療有効量で投与できる。本明細書中に使用される用語の「非経口的」とは、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、胸骨内投与、眼内投与（例えば、硝子体内）、および腹腔内投与、並びに輸液法による投与を含む。

任意の好適な投与経路が利用できる。本発明のナノ粒子結合核酸を含む薬剤組成物を、所期の治療に有効な用量で投与する。特定の病状を治療するか、またはその進行を阻害するために必要な治療有効量は、医療技術において知られている前臨床および臨床試験を用いて当業者によって容易に決定される。

本明細書中に用いられる用語の「治療有効量」とは、医師または研究者により求められた組織、器官、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を引き出す有効成分量を言う。

本明細書中に用いられる用語の「阻害する」とは、病状の遅延、中断または停止
を言うが、病状の完全除去を必ずしも指していない。患者の生存延長の可能性はそれ自体、病状が有益に抑えられていることを示す。

本発明の標的リポソーム結合核酸またはそれを含有する組成物の用法用量は、患者の年令、体重、性別および病状のタイプ、病状の重症度、投与経路、並びに使用される具体的な標的分子またはリガンドのアンタゴニスト活性などの幾つかの因子に基いている。前記用法用量は、前記因子に依って変えることができる。体重１キログラム当たり約０．０１ミリグラムから約１０００ミリグラム程度の投与量が、前記病状を治療する上で有用である。好ましい投与量は、体重１キログラム当たり約０．０１ミリグラムから約１００ミリグラムの範囲である。

注射投与用に、本発明を具体的に実施する組成物を含有する標的リポソームは、水、生理食塩水、または水性デキストロース溶液などの製剤的に許容できる担体により製剤化される。注射用の典型的な毎日の用量は、体重１キログラム当たり約０．０１ミリグラムから約１００ミリグラムであり、前記因子に依って単回投与または頻回投与で毎日注射される。

例えば、血管形成を阻害するために、血管形成阻害を必要とする患者は、本発明を具体的に実施し、血管形成阻害蛋白質またはペプチドを発現できるリボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）などの核酸を担持する標的リポソームの治療有効量が投与される。次に投与された核酸は細胞核に入り、血管内皮細胞中の標的蛋白質を発現する。

以下の非限定的実施例を、本発明の種々の態様をさらに説明するために提供する。本明細書中に開示された実施例の変更および説明された実施態様は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく成し得ることが、当業者により認識されるであろう。

材料と方法
ナノ粒子の調製
インテグリン類に結合する多価標的リポソーム類の構築は、重合性脂質インテグリン標的分子１２（図１７；スキーム１）の設計および合成から始まる。タウリン１のアミノ基は、そのベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）誘導体として保護して２を得る、次いで塩化スルホニル３を形成し、ｔ−ブトキシカルボニルジアミノプロピオン酸メチルエステル４と結合させて化合物５を得た。５のけん化により、化合物６を得、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）の除去により、重要中間体７を得た。７と安息香酸誘導体８とのカップリングにより化合物９を得、これに水素添加してアミンを脱保護すると同時に、ピリミジン環を還元して、インテグリン受容体アンタゴニスト−リンカー複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）１０を得た。化合物８の合成は、以前にＤｕｇｇａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２０００年、４３、３７３６〜３７４５頁により記載されており、その関連開示は参照により本明細書中に組み込まれている。ヘキサフルオロリン酸ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム（ＢＯＰ）を用いて、３当量の１０とトリカルボン酸キレーター脂質１１とのカップリングにより、重要な三価インテグリンアンタゴニスト脂質１２を得た。化合物１１の調製は、以前にＳｔｏｒｒｓら、Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｉｍａｇｉｎｇ、１９９５年、５、７１９〜７２４頁により記載されており、その関連開示は参照により本明細書中に組み込まれている。メタノール中ナトリウムメトキシドによる１１の処理により、化合物１５（すなわち、１１のトリナトリウム塩）を得た。ユウロピウムキレーター脂質複合体１４は、上記文献のＳｔｏｒｒｓらにより記載されたトリ塩化ユウロピウムの溶液と共に１５とを加熱することにより合成された。

図１８のスキーム２には、上記文献のＳｔｏｒｒｓらにより以前に記載された適切な脂質の自己組立ておよび重合化による架橋標的リポソーム類（ＮＰ）の形成が略述されている。例示の架橋標的リポソーム類は、三価の脂質−インテグリンアンタゴニスト１２とジアセチレン両性イオンリン脂質１３と、クロロホルム溶液中のユウロピウム−キレーター脂質複合体１４とを組合わせることにより合成した。蛍光分光法を用いて粒子を可視化するために、化合物１４を１重量パーセントで全製剤に添加した。表面電荷を変えるためにこのクロロホルム脂質溶液に、アニオンキレーター脂質１５またはカチオン脂質１６（ＤＯＴＡＰ）のいずれかを加えた。前記ＮＰ類上のインテグリンアンタゴニストの表面密度は、リポソーム中の化合物１２の量を変えることにより制御された。

ベシクルを形成するために、組合わせた脂質溶液を蒸発乾固し、高度真空下乾燥して残った溶媒の全てを除去し、脂質膜を形成した。乾燥脂質膜を、脱イオン水を用いて、知られている脂質密度（３０ｍＭ）に水和した。生じた懸濁液を、次に７．０から７．５の間のｐＨを維持しながらプローブ−チップ超音波器を用いるＬｅａｖｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９８３年、７３２、２１０〜２１８頁の方法に従って、ゲル液体結晶相転移温度（Ｔ_ｍ６４℃）以上で超音波処理した。超音波処理の約１時間後、溶液は透明になった。次に湿った氷のベッド上で溶液を０℃に冷却し、手動ＵＶランプにより約２５４ｎｍで溶液を約２時間照射することにより、ベシクルを重合化した。生じたリポソーム類（ＮＰ１からＮＰ６）は黄橙色であり、４９０ｎｍと５３５ｎｍに中心を有し、共役エン−インジアセチレンポリマーから生じる２本の可視吸収バンドを有した。ＮＰ類の平均直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定すると４０ｎｍと５０ｎｍとの間であった。ζ電位は、それぞれにＮＰ１からＮＰ４（すなわち、ＮＰ１〜ＮＰ４は負に荷電していた）に関しては−４２ｍＶから−５３ｍＶとの間であり、ＮＰ５とＮＰ６（すなわち、ＮＰ５とＮＰ６は正に荷電していた）に関しては＋３５ｍＶから＋４３ｍＶとの間であった（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ニューヨーク州ホルツビル）。前記リポソ−ムを、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭヒスチジンおよび５％デキストロース溶液を用いてインビボ適用のために製剤化した場合、物理的および生物学的に性質において、有意な変化がなく数ヶ月間安定であった。

リポソーム類ＮＰ１からＮＰ６の組成物は下記表１に示され、成分１２（標的脂質）、１３（両性イオン脂質）、１５（アニオンキレート化剤脂質）、および１６（カチオン脂質；ＤＯＴＡＰ）のモル％として表示されている。

図１８に略述したように、リポソーム類は、０．１モル％、１モル％および１０モル％のインテグリンアンタゴニスト脂質複合体化合物１２および化合物１３と共に、重合前にリポソーム類に組入れられた追加物質１４、１５および１６を用いてベシクルを重合化することにより構築し、表面電荷密度を変えて前記リポソーム類を蛍光により可視化させた。場合によって１モル％だけのリポソームを含む化合物１３は、簡略のため図１８に示していない。１０モル％の化合物１２（ＮＰ１とＮＰ５）を含有した物質は、インテグリンα_ｖβ_３結合部位に最高の親和性を有した。時間分解蛍光分光法を用いる競合的インテグリン結合アッセイにおいて、ＮＰ１がその表面上に有しているインテグリンアンタゴニスト１０は０．５μＭ当量だけであるという事実にもかかわらず、ＮＰ１類とα_ｖβ_３インテグリンとの結合を５０％減少させるために遊離リガンド１０（６５μＭ）を１００倍以上要した。ビトロネクチン被覆プレートに結合するα_ｖβ_３陽性Ｍ２１メラノーマ細胞を用いた細胞接着阻害のインビトロアッセイにおいて、遊離リガンド１０のＩＣ５０は６４μＭであった。厳密な対比において、アニオン粒子ＮＰ１のＩＣ５０は、０．２７μＭ当量の化合物１０が表面上に存在する。これは、１０がＮＰ類上にある場合、遊離リガンドと比較して細胞表面に対して２００倍以上大きな結合活性を表している。カチオン粒子ＮＰ５に関して、ＩＣ５０は０．３５μＭ当量の化合物１０であり、下表２に示すように遊離リガンドと比較すると、およそ１８０倍大きな結合活性である。このように、表面電荷にかかわらず、ＮＰ類は、モノマーリガンドと比較すると、インテグリン類に対しておよそ１８０〜２００倍増加の結合活性を有した。この結果は、強固な相互作用がＮＰ表面と細胞表面との間に生じることを証明している。この相互作用は、ＮＰ類上の表面電荷に依存し、特定の受容体リガンド相互作用に直接関連する。結合活性の大きさにおいておよそ２オーダーの増加は、遊離リガンドと比較して、ＮＰ類表面に多価インテグリンアンタゴニストが存在することにより達成できる。ＮＰ製剤中の化合物１２量が、ＮＰ２およびＮＰ３の場合のようにそれぞれ１０倍および１００倍減少して１モル％および０．１モル％になると、下表２に示すようにそれぞれ、細胞接着の阻止能はおよそ１桁および２桁減少した。

リポソームＮＰ５は、本発明の例示の架橋結合された標的リポソームを表す。

一般合成法
溶媒および試薬は、全て試薬等級を用いた。溶媒蒸発は、施設内真空またはＷｅｌｃｈ直接駆動真空ポンプから得られる減圧下、≦４０℃で実施した。^１Ｈおよび^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、各実施例で記載されるＣＤＣｌ_３、ＣＤ_３ＯＤ、Ｄ_２Ｏまたはそれらの混合液中、プロトンスペクトルでは９０ＭＨｚ、カーボンスペクトルでは約２３ＭＨＺでＪＥＯＬ ＦＸ９０Ｑ上で記録した（注：ＣＤＣｌ_３に溶解するが、ＣＤ_３ＯＤの脂質への添加は、転化ミセルの形成を防ぐのでシャープなスペクトルを得た）。スペクトルは、^１Ｈ実験では残余のＣＨＣｌ_３（７．２５ｐｐｍ）、^１３Ｃ実験ではＣＤＣｌ_３（７７．００ｐｐｍ）の中心線を参照とした。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ ＤＥ装置（質量分析、Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、カリフォルニア州ラジョラ）上で実施した。ＴＬＣは、ガラス背面のＭｅｒｃｋ ６０ Ｆ２５４（０．２ｍｍ；ＥＭ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、ロードアイランド州ウェークフィールド）上で実施し、展開されたプレートは、１０％硫酸水中硫酸セリウム（１％）およびモリブデンアンモニウム（２．５％）で型どおりスプレーして約１５０℃に加熱した。他の発色法としては、ヨウ素（一般用）、アセトン中０．５％ニンヒドリン（アミン用）、紫外線（ＵＶ発色団用）が挙げられる。

Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−タウリンナトリウム塩（２）。タウリン１（約４０ｇ、３２０ミリモル）を４Ｎ水酸化ナトリウム溶液（８０ｍＬ）および水（約２００ｍＬ）に溶解した。この溶液に、塩化ベンジルオキシカルボニル（約４８ｍＬ、３３０ミリモル）を、約４時間激しく攪拌しながら滴下により加えた。溶液のｐＨは、１０％重炭酸ナトリウム溶液（約３００ｍＬ）および４Ｎ水酸化ナトリウム溶液（約４５ｍＬ）の添加によりアルカリ性を維持した。得られた反応混合物を次に、ジエチルエーテル（約１０００ｍＬ）で洗浄し、水層を回転式蒸発で乾固し、さらに五酸化リン上で高度真空下で一晩乾燥して約１２．７ｇ（１４％）の２を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）：δ７．５０（５Ｈ，ｓ，Ａｒ−Ｈ）、５．２１（２Ｈ，ｓ，Ａｒ−ＣＨ_２）、３．６２（２Ｈ，ｔ，ＣＨ_２）、３．１４（２Ｈ，ｔ，ＣＨ_２）。

塩化２−ベンジルオキシカルボニルアミドエタンスルホニル（３）。Ｎ−ＣＢＺ−タウリンナトリウム塩２（約１２．７ｇ、３２ミリモル）を、乾燥ジエチルエーテル（約３０ｍＬ）中、アルゴン陽圧下で懸濁し、五塩化リン（約７ｇ、３３．６ミリモル）を５回に分け、約１５分かけて処理した。反応液を周囲温度で約４時間攪拌した。溶媒を回転式蒸発で留去した。氷水（約１０ｍＬ）を加えて、得られた残渣をフラスコ冷却後、氷水浴中の内容物を粉砕した。さらに氷水（約５０ｍＬ）を加えて生成物を固化した。固体をろ取し、氷水（約２０ｍＬ）で洗浄し、五酸化リンで一晩乾燥して約６．９５ｇ（７８％）の３を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ７．３５（５Ｈ，ｓ，Ａｒ−Ｈ）、５．１２（２Ｈ，ｓ，Ａｒ−ＣＨ_２）、３．８９（２Ｈ，ｔ，ＣＨ_２）が３．８５（２Ｈ，ｔ，ＣＨ_２）と重なっている。

３−ブトキシカルボニルアミド−２−（Ｓ）−ベンジルオキシカルボニルアミドエチルスルホンアミドプロピオン酸メチル（５）。無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、１５０ｍＬ）中、アルゴン陽圧下で塩化スルホニル３（約２１．６ｇ、７８ミリモル）と３−Ｎ−ブトキシカルボニルアミド−２−アミノプロピオン酸メチル（４、約９．９６ｇ、３９．２ミリモル）との混合物を氷浴中で冷却した。この溶液に、無水ＴＨＦ（約２７５ｍＬ）中のＮ−メチルモルホリン（約１６ｍＬ、１４５ミリモル）を、予め乾燥した滴下ロートを用いてアルゴン陽圧下で約３０分間かけて滴下により加えた。氷浴中約１時間撹拌後、実質的に塩化スルホニル（Ｒ_ｆ＝０．６５）の全てを消費したことをＴＬＣ（溶出液：酢酸エチル／ヘキサン１：１）により観察した。しかしながら、未反応のジアミノプロピオン酸（Ｒ_ｆ＝０．１、ニンヒドリンスプレー）が依然として存在していた。さらに塩化スルホニル（約５．０ｇ、１８ミリモル）を約３時間かけて加えた。次に得られた反応生成物をろ過、溶媒を回転式蒸発留去、酢酸エチル（約１００ｍＬ）に溶解して冷却希塩酸（約２０ｍＬ）で洗浄、飽和重炭酸ナトリウム溶液（約２０ｍＬ）で洗浄、次いで飽和食塩溶液（約２０ｍＬ）で洗浄してから無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を回転式蒸発で留去し、生成残渣を真空下一晩乾燥した。乾燥残渣を最初に酢酸エチルに溶解し、次に同量のヘキサンを加えることによって再結晶化させて、約１３．４ｇ（約７４％）のメチルエステル５を無色固体として得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ７．３６（５Ｈ，ｓ，Ａｒ−Ｈ）、５．８３（１Ｈ，ｄ，ＮＨ）、５．５５（１Ｈ，ｔ，ＮＨ）、５．１２（２Ｈ，ｓ，Ａｒ−ＣＨ_２）、５．０６（１Ｈ，ｔ，ＮＨ）、４．２６（２Ｈ，ｍ，ＣＨ）、３．７９（３Ｈ，ｓ，ＣＨ_３）、３．７０（２Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２）、３．２６（２Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２）、１．４３（９Ｈ，ｓ，（ＣＨ_３）_３）。

３−ブトキシカルボニルアミド−２−（Ｓ）−ベンジルオキシカルボニルアミドエチルスルホンアミドプロピオン酸（６）。メチルエステル５（約１３．３ｇ、２８．９ミリモル）のテトラヒドロフラン（約１６０ｍＬ）溶液を氷浴で冷却した。この溶液に、氷水（１６０ｍＬ）中の水酸化リチウム（約５．４２ｇ、１２８ミリモル）溶液を加えた。生成した反応混合物を、氷浴を取り外すことによってゆっくりと周囲温度まで温め、混合物を周囲室温で約１時間攪拌した。有機溶媒を回転式蒸発で留去した。残渣の水性部分をジエチルエーテル（約２０ｍＬ）で洗浄してから、希塩酸を用いて約ｐＨ４の酸性にした。この溶液を氷浴で冷却し、次いで酢酸エチル（約１００ｍＬ）と混合してから、さらに氷冷希塩酸を用いて約ｐＨ１の酸性にし、直ちに酢酸エチル（約２ｘ２００ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル層をブライン（約５０ｍＬ）で洗浄して無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を回転式蒸発で留去し、生成残渣を高度真空下一晩乾燥して、約１３．３ｇの泡状固体を得、ヘキサン／酢酸エチル（１：１）から再結晶して約１１．６ｇ（８９．７％）の６を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ７．３３（５Ｈ，ｓ，Ａｒ−Ｈ）、６．１２（１Ｈ，ｄ，ＮＨ）、５．６８（１Ｈ，ｔ，ＮＨ）、５．２６（１Ｈ，ｔ，ＮＨ）、５．１（２Ｈ，ｓ，Ａｒ−ＣＨ_２）、４．２４（２Ｈ，ｍ，ＣＨ_２）、３．６７（２Ｈ，ｔ，ＣＨ_２）、３．２７（２Ｈ，ｔ，ＣＨ_２）、１．４５（９Ｈ，ｓ，Ｃ（ＣＨ_３）_３）。

３−アミノ−２−（Ｓ）−ベンジルオキシカルボニルアミドエチルスルホンアミド−プロピオン酸（７）。Ｎ−ＢＯＣ−β−アミノ酸６（約１１．５ｇ、２５．８ミリモル）をメチレンクロリド（約３５０ｍＬ）中のトリフルオロ酢酸（約６８ｍＬ）で１．５時間処理してから、回転式蒸発で乾固した。得られた残渣を水（約２００ｍＬ）に溶解し、凍結乾燥して約１０．９ｇ（９８．８％）の７を固体として得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ７．３０（５Ｈ，ｓ，Ａｒ−Ｈ）、６．０７（１Ｈ，ｄ，ＮＨ）、５．６１（１Ｈ，ｔ，ＮＨ）、５．２０（１Ｈ，ｔ，ＮＨ）、５．１７（２Ｈ，ｓ，Ａｒ−ＣＨ_２）、４．１１（２Ｈ，ｍ，ＣＨ_２）、３．５３（２Ｈ，ｔ，ＣＨ_２）、３．３２（２Ｈ，ｔ，ＣＨ_２）。Ｃ_１３Ｈ_１９Ｎ_３Ｏ_６Ｓに対するＤＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ（イオン）３４６（Ｍ＋Ｈ）（Ｃ_１３Ｈ_１９Ｎ_３Ｏ_６Ｓ＋Ｈの計算値，ｍ／ｚ ３４６）。

４−［２−（ピリミジン−２−イルアミノ）エチルオキシ］ベンゾイル−２−（Ｓ）−ベンジルオキシカルボニルアミドエチルスルホンアミド−β−アラニン（９）。

安息香酸誘導体８（約６．４ｇ、２４．７ミリモル）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（約３．６ｇ、３１ミリモル）とをアルゴン陽圧下で無水ジメチルマルホクシド（約１１０ｍＬ）に溶解し、氷浴で冷却した。この溶液に、塩酸１−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）−３−エチルカルボジイミド（約４．９ｇ、２５．６ミリモル）を加えた。この溶液を氷冷温度で１時間攪拌してから、周囲室温まで温めた。攪拌を室温でさらに約２４時間続けた。生成混合物をβ−アミノ酸７（約１２．２ｇ、２５．８ミリモル）の溶液に続いてＮ−メチルモルホリンを加えた。生成反応混合物をアルゴン下、約３日間攪拌した。次に生じた混合物を水（約１Ｌ）にあけて、希塩酸で約ｐＨ１．５の酸性にし、酢酸エチル（約５ｘ５００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を飽和食塩溶液（約５０ｍＬ）で洗浄してから無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を回転式蒸発で留去した。得られた残渣を酢酸エチル中で粉砕、ろ過してから高度真空下乾燥して、約１０．５ｇ（７２．５％）の９を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ８．３０（２Ｈ，ｄ，Ａｒ−Ｈ）、７．９９（２Ｈ，ｄ，Ａｒ−Ｈ）、７．３４（５Ｈ，ｓ，Ａｒ−Ｈ）、７．００（２Ｈ，ｄ，Ａｒ−Ｈ）、６．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ａｒ−Ｈ）、５．０１（２Ｈ，ｓ，ＣＨ_２）、４．１５（１Ｈ，ｔ，ＣＨ）、３．６７（２Ｈ，ｔ，ＣＨ_２）、３．５６（２Ｈ，ｔ，ＣＨ_２）、３．１７（２Ｈ，ｔ，ＣＨ_２）。

４−［２−（３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イルアミノ）エチルオキシ］ベンゾイル−２−（Ｓ）−アミノエチルスルホンアミド−β−アラニン（１０）。ピリミジン誘導体９（約３．７ｇ、６．４ミリモル）溶液を酢酸（約１９０ｍＬ）と濃塩酸（約１７ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を１０％パラジウム炭素（約１．６２ｇ）と混合して、約４５ｐｓｉの水素ガスで約５時間水素化した。次に生成混合物をセライトを通してろ過し、水洗した。溶媒を回転式蒸発で留去した。得られた残渣を高度真空下で乾燥した。乾燥残渣を水（約１００ｍＬ）に溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨを約７に調製してから、回転式蒸発で乾固した。得られた残渣をメタノール（約２０ｍＬ）に溶解してろ過した。ろ取物を回転式留去し、水（約２７５ｍＬ）に溶解して凍結乾燥した。次に得られた凍結乾燥生成物を水から再結晶して約２．９６ｇ（約７８．９％）の生成物１０を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）：δ７．８０（２Ｈ，ｄ，Ａｒ−Ｈ）、７．１４（２Ｈ，ｄ，Ａｒ−Ｈ）、４．４９（１Ｈ，ｓ，ＣＨ_ａＨ_ｂ）、４．２８（２Ｈ，ｔ，ＣＨ_２）、３．９４（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_ａＨ_ｂ）、３．６１（６Ｈ，ｍ，ＣＨ_２）、３．３２（４Ｈ，ｔ，ＣＨ_２）、１．９０（２Ｈ，ｔ，ＣＨ_２）。Ｃ_１３Ｈ_２８Ｎ_６Ｏ_６Ｓに対するＥＳ−ＭＳ：ｍ／ｚ（イオン）４５７（Ｍ＋Ｈ）（Ｃ_１８Ｈ_２８Ｎ_６Ｏ_６Ｓ＋Ｈの計算値，ｍ／ｚ ４５７）。

［（ＰＤＡ−ＰＥＧ３）_２−ＤＴＰＡ−（ＣＯＮＨＰＭ）_３］（１２）。（ＰＤＡ−ＰＥＧ３）_２−ＤＴＰＡ−（ＣＯＯＨ）_３（約１１、６９ｍｇ、５０マイクロモル）を、予め火炎乾燥してアルゴンで満たされた３頚ＲＢフラスコ中、無水ＣＨ_３ＣＮ（約５ｍＬ）、無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（約２ｍＬ）とＥｔ_３Ｎ（約１ｍＬ）に溶解した。生じた溶液に、ＢＯＰ試薬（約１３４ｍｇ、１５０マイクロモル）、生成混合物を５分間よく攪拌して脂質溶液を得た。１０（約６９ｍｇ、１５０マイクロモル）の溶液をアルゴンで満たされた乾燥バイアル中、無水ＣＨ_３ＣＮ（約５ｍＬ）と無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（約２ｍＬ）に混合して調製した。１０の溶液の攪拌を続けながら、乾燥シリンジを用いて脂質溶液に加えた。そのように生成された反応混合物を暗所で１０時間攪拌した。ＴＬＣ（溶媒：ＣＨＣｌ_３、ＣＨ_３ＯＨ、Ｈ_２ＯおよびＣＨ_３ＣＯＯＨは出発物質（Ｒ_ｆ＝０．５３）の完全消失を示した）。１種の主生成物（Ｒ_ｆ＝０．２）と５種の副生成物（Ｒ_ｆ＜０．１８）があった。溶媒を回転式蒸発により留去し、得られた残渣を高度真空下、約２４時間乾燥して粗製生成物を得た。前記粗製生成物を、半分取用シリカカラム、流速約５ｍＬ／分を用いる正常相ＨＰＬＣ（１００％ＣＨＣｌ_３の出発で約５分間、次いで７５％ＣＨＣｌ_３／２５％ＣＨ_３ＯＨで約１０分間、５０％ＣＨＣｌ_３／５０％ＣＨ_３ＯＨで約１０分間、次に２５％ＣＨＣｌ_３／７５％ＣＨ_３ＯＨで約１０分間、最後に１００％ＣＨ_３ＯＨで約２０分間の勾配系）により精製した。主生成物を含んだフラクション（保持時間＝３５分から３７分）を合わせて回転式蒸発を行って溶媒を留去し、得られた残渣を高度真空下で約２４時間乾燥して約３５．５ｍｇ（２６．５％）の所望の生成物を得た。高分解ＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳ：ｍ／ｚ２６８１．４７１１（Ｃ_１３０Ｈ_２０９Ｎ_２５Ｏ_２９Ｓ_３＋Ｈの計算値、ｍ／ｚ２６８１．４８８２）。

細胞接着アッセイ
細胞接着阻害試験は、ヒトメラノーマ細胞株Ｍ２１を用いてビトロネクチン被覆プレート上で行った。多価リポソーム類ＮＰ１〜ＮＰ６並びにモノマーリガンド１０を、別にＭ２１細胞と共に温置し、ビトロネクチン被覆の４８個のウェルプレートに塗布した。約１時間温置後、ウェルを洗浄し、接着細胞をクリスタルバイオレット溶液で染色し、約５９０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定した。測定されたＯＤはビトロネクチンプレートに結合した細胞数に比例した。これを種々製剤中のＮＰ類表面上の成分１０の濃度に対してプロットし、ＩＣ５０を計算した。

図８は、α_ｖβ_３を発現するＭ２１ヒトメラノーマ細胞を、インテグリンアンタゴニスト（リガンド）またはリガンド単独に共有結合したリポソームと混合した細胞接着アッセイを図式的に示している。次に細胞をビトロネクチンプレート上に乗せて洗浄し、染色した。次に結合細胞数をプレートカウンタを用いてカウントした。

図９は、図８に示された接着アッセイを利用して得られたデータをグラフに表したもので、およびインテグリンアンタゴニストに結合したリポソーム類が細胞接着を強く阻害するが（ＩＣ５０＝１μＭ）、一方、アンタゴニスト単独（リガンド）は、細胞接着の阻害に対しはるかに効果が少なかった（ＩＣ５０＝０．５ｍＭ）ことを示している。

インビトロでのトランスフェクションアッセイ
α_ｖβ_３標的リガンドとそれぞれ共役結合させた、またはさせない約３０ナノモルのカチオンリポソーム類ＮＰ５とＮＰ６を、５％デキストロース中、約２μｇのプラスミドＤＮＡコード化グリーン蛍光蛋白（ＧＦＰ）にそれぞれ複合化し、次にインビトロでメラノーマ細胞に約１時間曝露させた。２４時間後、全細胞数と比較して蛍光細胞数をカウントすることによりトランスフェクション効率をアッセイした。用いた細胞は、ヒトメラノーマ細胞Ｍ２１およびＭ２１Ｌであった。Ｍ２１細胞は、α_ｖβ_３インテグリンを発現するが、Ｍ２１Ｌ細胞は、α_ｖβ_３インテグリンを発現しない（α_ｖ−ゼロ）。

図１０に示すように、ＧＦＰ遺伝子と複合化した標的リポソーム（ＮＰ５）で処理されたα_ｖ発現細胞（Ｍ２１）は、非標的リポソーム（ＮＰ６）（アンタゴニストなし；約２５，０００個の細胞／１００万）またはＤＮＡ単独（リポソームなし、約１２，０００個の細胞／１００万）で処理されたα_ｖ−発現細胞と比較して、５倍以上のトランフェクション程度（＞１２５，０００個の細胞／１００万）を示した。対比として、α_ｖ−ゼロ細胞（Ｍ２１Ｌ）は、ＧＦＰ遺伝子の優先的な取り込みを示さず、処理を受けたにもかかわらず、相対的に低レベルのトランスフェクション（２５，０００個の細胞／１００万未満）であった。このように、標的遺伝子担体は、α_ｖβ_３依存の挙動で細胞をトランスフェクションすることが示される。

標的リポソーム−媒介遺伝子送達はインビボ腫瘍を標的にする
各約４５０ナノモルのＮＰ５とＮＰ６を、各約２００μｌの５％デキストロース中、各３０μｇのプラスミドＤＮＡコード化ホタルルシフェラーゼに静電気的に複合化し、次いで各リポソーム複合化ＤＮＡ溶液を、α_ｖβ_３発現を欠如している約１５０ｍｍ^３の皮下メラノーマ（Ｍ２１Ｌ）を有する動物に静脈内注射した。約２４時間後、動物を殺処理し、記載の器官および腫瘍を切除し、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。全器官を、器官重量基準に合わせたＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ溶解剤の量で組織粉砕機を用いて粉砕したこと以外、製造元の説明書に従ってルシフェラーゼ活性を、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ用キット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ、ウィスコンシン州マジソン）を用いてアッセイした。

図１１に示されるように、ルシフェラーゼ遺伝子と複合した標的リポソーム（ＮＰ５）は、肺蔵組織、肝臓組織および心臓組織関連の腫瘍組織に高選択的発現を示し、約４ピコグラムのルシフェラーゼ／ｍｇ組織の発現レベルを有したが、それに比して他の評価組織ではサブピコグラム／ｍｇ組織のレベルであった。ルシフェラーゼと複合化した非標的リポソーム（ＮＰ６）は、いずれの組織のトランスフェクションにも無効であった。約２０倍過剰の溶解性インテグリンアンタゴニストリガンドの添加は、標的リガンドによる細胞のトランスフェクションを効果的に阻害した。

腫瘍血管退化樹立メラノーマに対する変異体Ｒａｆ遺伝子の標的化リポソーム媒介送達
α_ｖβ_３発現欠如メラノーマ（Ｍ２１Ｌ）をわき腹に皮下注射し、約７０ｍｍ^３まで成長させ、その時点でマウスを、２００μＬの５％デキストロース（対照）、あるいは２００μＬの５％デキストロース中、Ｒａｆキナーゼ（Ｒａｆ−ＡＴＰ^μ）の変異体優性の陰性形をコード化する約３０μｇのプラスミドＤＮＡに複合化されるか、または２００μＬの５％デキストロース中、いずれのＤＮＡもコード化しないシャトルベクターに複合化させた標的リポソームＮＰ５のいずれかを静脈内注射した。約１５日後、腫瘍を再度同じ処理で注射した。腫瘍サイズを、式：腫瘍容積＝（最小直径）^２＊最大直径／２を用いて図１２に示された時点で測定した。

図１２に示すように約７０ｍｍ^３の初期容量のメラノーマ腫瘍を有するマウスを、Ｒａｆキナーゼ（Ｒａｆ−ＡＴＰ^μ）の変異体優性の陰性形で複合化された標的リポソームＮＰ５により処理すると、約５５０ｍｍ^３の腫瘍容量の初期増加となり、引続き約３０日後に腫瘍は退化し、３５日目までに横ばいになり約２００ｍｍ^３の定常状態とになった（図１２の標識された「粒子／Ｒａｆ（−）」）。この定常状態の腫瘍サイズはさらに３０日間維持されたが、この時点で実験は終了した。標的リポソームＮＰ５（遺伝子なし）単独（標識化「粒子／シャトル」）または変異体Ｒａｆ遺伝子単独（リポソームなし）で処理されたマウスにおいて、腫瘍は、退化を示すことなく、３５日の全期間を通して成長し続けた。腫瘍がα_ｖβ_３発現を欠き、しかも新生血管内皮細胞がα_ｖβ_３を発現する限り、腫瘍成長の減少は、腫瘍血管の血管形成阻害による可能性が大きい。

腫瘍血管退化樹立メラノーマに対する変異体Ｒａｆ遺伝子の標的化リポソーム媒介送達
腫瘍を初期処理前に約３００ｍｍ^３まで成長させたこと以外、実施例４のとおり処理され、その時点でマウスを、（ａ）約２００μＬの５％デキストロース中、Ｒａｆ−ＡＴＰ^μをコード化する約３０μｇのプラスミドＤＮＡに静電気的に複合化された約４５０ナノモルの標的リポソームＮＰ５、（ｂ）２００μＬの５％デキストロース中、Ｒａｆ−ＡＴＰ^μをコード化する約３０μｇのプラスミドＤＮＡに静電気的に複合化された約４５０ナノモルの非標的リポソームＮＰ６、または（ｃ）約２００μＬの５％デキストロース中、インテグリンα_ｖβ_３に対し約２０モル過剰の競合リガンドと混合したＲａｆ−ＡＴＰ^μをコード化する約３０μｇのプラスミドＤＮＡに静電気的に複合化された約４５０ナノモルの標的リポソームＮＰのいずれかを注射した。腫瘍測定値は、図１３に示された時点でとられ、（ａ）は標識された「Ｒａｆ（−）」であり、（ｂ）は標識された「非標的」であり、（ｃ）は標識された「過剰」である。処理なしの対照も含めた。

図１３に示されるように、３００ｍｍ^３の初期容量のメラノーマ腫瘍を有するマウスの、Ｒａｆキナーゼ（Ｒａｆ−ＡＴＰ^μ）の変異体優性の陰性形で複合化された標的リポソームＮＰ５による処理により、初期成長期間後、処理なしの対照群に比して腫瘍容量の退化が導かれた。

標的化リポソーム媒介送達は形成血管に選択的である
約３００ナノモルのＮＰ５を、約５０μＬの５％デキストロース中、グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）をコード化する約２０μｇのプラスミドＤＮＡに複合化し、次いで１ｍｇ／ｍｌｂＦＧＦで飽和されたフィルタディスクに漿尿膜（ＣＡＭ）を約２４時間予め曝露したひよこ胎仔中に静脈内注射して血管形成を刺激した。複合体注射１日後、ＣＡＭ組織を採取し、ＰＢＳで洗浄、４％パラホルムアルデヒドで固定して蛍光の存在を調べた。この結果を図１４に示す。

ＧＦＰは、図１４の顕微鏡写真から見られるようにＣＡＭ類の血管中へ高度に局在化していた。

腫瘍血管に対する変異体Ｒａｆ遺伝子の標的化リポソーム媒介送達は、血管アポトーシスおよびその後の腫瘍細胞死を誘導する
発現欠如のメラノーマα_ｖβ_３を、マウスのわき腹に皮下注射した。生じた腫瘍を、約２００ｍｍ^３まで成長させ、その時点でマウスに、約２００μＬの５％デキストロース中、Ｒａｆ−ＡＴＰ^μまたはシャトルベクターをコード化する約３０μｇのプラスミドＤＮＡに複合化させた約４５０ナノモルのＮＰ５を静脈内注射した。腫瘍は約７２時間後切除し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、切片化し、フラグメント化ＤＮＡを検出するＴＵＮＥＬ法（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ Ｃｏｒｐ、ニューヨーク州パーチェス）を用いてｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（血管マーカー）およびアポトーシス用に染色した。

図１５に示された顕微鏡写真は、ナノ粒子／シャトルベクター（対照）に曝露された腫瘍ではアポトーシスを受ける細胞がほとんどない血管が比較的高密度であることを示した。対比的に、ＮＰ５／Ｒａｆ−ＡＴＰ^μに曝露された腫瘍中の血管の大部分はアポトーシスを受けており、腫瘍の広い領域が、恐らく不十分な血流のため、アポトーシスしている血管から一定の距離で死滅しつつあった。

標的リポソーム媒介送達は形成血管に選択的である
マウスにおいて、側副枝は表面網状組織の網膜毛細血管から発芽し、網膜に浸透し、生後８日目（Ｐ８）から１０日目（Ｐ１０）の間に深い血管網を形成する。本試験において、マウスを約１μＬの５％デキストロース中、グリーン蛍光蛋白質をコード化する約０．１５μｇのプラスミドＤＮＡに複合化された標的リポソームＮＰ５によりＰ１０に硝子体内に注射し、次いで硝子体内注射した。ＧＦＰ遺伝子で複合化されたＮＰ５の注射約２４時間後、マウスを殺処理し、網膜をローダミン結合の抗コラーゲンＩＶ抗体（血管マーカー）で免疫染色し、２フォトンレーザー走査顕微鏡により評価して網膜血管中ＧＦＰの相対レベルを検出した。

図１６の顕微鏡写真は、ＧＦＰが網膜血管構造に高度に局在化していたことを示す。

上記実施態様および実施例の多数の変更および修飾を、本発明の新規な特徴の精神と範囲から逸脱することなく実施することができる。本明細書中に説明された具体的実施形態に関係して限定は意図されておらず、または推測すべきではない。添付の特許請求の範囲は、請求項の範囲内に入る全てのこのような変更を包含するように意図されている。

本発明の標的リポソームを図式的に示す図である。 本発明の架橋標的リポソームを示す図である。 本発明の他の架橋標的リポソームを示す図である。 全身的に循環する標的リポソームを図式的に示す図である。 血管形成部位に集まる標的リポソームを図式的に示す図である。 遺伝子などのＤＮＡの標的細胞への送達を図式的に示す図である。 遺伝子などのＤＮＡの標的細胞への送達を図式的に示す図である。 α_ｖβ_３アンタゴニストの試験に好適な接着アッセイを図式的に示す図である。 図８に示された接着アッセイを利用して得られたデータ、および本発明の標的リポソームがα_ｖβ_３受容体に結合することを示すグラフである。 本発明の標的細胞を利用して、インビボα_ｖβ_３発現細胞を標的にした有効なグリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子送達を示すデータを示すグラフである。遺伝子を担持する標的リポソームが、α_ｖβ_３依存の挙動で細胞をトランスフェクションすることが示され；使用細胞は、ヒトメラノーマ細胞Ｍ２１およびＭ２１Ｌであり；Ｍ２１細胞はα_ｖβ_３インテグリンを発現するが、Ｍ２１Ｌ細胞はα_ｖβ_３インテグリンを発現しない（α_ｖ−ゼロ）。 本発明の標的細胞を利用した、α_ｖβ_３発現腫瘍血管系細胞に対するホタルルシフェラーゼ遺伝子の選択的インビボ標的を実証するデータを示すグラフである。標的遺伝子担体は、α_ｖβ_３依存の挙動で腫瘍細胞をトランスフェクションすることが示され；使用細胞は、マウスに移植されたヒトメラノーマ細胞Ｍ２１およびＭ２１Ｌであり；Ｍ２１細胞はα_ｖβ_３インテグリンを発現するが、Ｍ２１Ｌ細胞はα_ｖβ_３インテグリンを発現しない。 血管形成阻害変異体Ｒａｆ蛋白質を発現する遺伝子に結合された標的リポソ−ムの投与により、樹立腫瘍における腫瘍成長のインビボ阻害と退化を証明するデータを示すグラフである。 血管形成阻害変異体Ｒａｆ蛋白質を発現する遺伝子に結合された標的リポソ−ムの投与により、樹立腫瘍における腫瘍成長のインビボ阻害と退化を証明するデータを示すグラフである。 本発明の標的リポソームを利用して、ひよこＣＡＭ中の血管形成血管への遺伝子コード化ＧＦＰのインビボ送達を証明する顕微鏡写真を示す図である。 遺伝子に結合した本発明の標的リポソームの硝子体内注射により、遺伝子コード化ＧＦＰのマウス眼内血管へのインビボ送達を証明する顕微鏡写真を示す図である。 遺伝子に結合した本発明の標的リポソームの硝子体内注射により、遺伝子コード化ＧＦＰのマウス眼内血管へのインビボ送達を証明する顕微鏡写真を示す図である。 マウス網膜の血管形成血管に、遺伝子コード化変異体Ｒａｆの標的リポソーム媒介送達によってインビボ新生血管アポトーシスを証明する顕微鏡写真を示す図である。 重要中間体の三価脂質−インテグリンアンタゴニスト複合体１２の合成を詳述する、標的リポソーム合成スキーム１を示す図である。 三価脂質−インテグリンアンタゴニスト複合体１２から適切な脂質の自己構築および重合によってナノ粒子標的リポソーム類（ＮＰ）の形成を略述する、標的リポソーム合成スキーム２を示す図である。

Claims (27)

1. カチオン両親媒性物質、
   中性脂質、
   標的ドメインおよび標的ドメインに結合した20個の炭素原子までの長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基、並びに１個以上のアリール基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基、および／またはヘテロ環基により置換された20個の炭素原子までの長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基から選択される基を含む疎水性ドメインを有する標的脂質、および
   カチオン脂質と複合化された核酸
   を含み、
   前記標的脂質は、下記構造で表される化合物１２であり、
   

   

   前記カチオン脂質は、リポソーム中の脂質の全モル数を基準とするモルパーセント値で、１モルパーセントから５０モルパーセントの範囲の量で存在し、前記標的脂質は、１モルパーセントから２０モルパーセントの範囲の量で存在し、および標的ドメインが非ペプチド系α_ｖβ_３インテグリンアンタゴニストを含み、該非ペプチド系α _ｖ β _３ インテグリンアンタゴニストは下記化合物からなる群から選択される、
   

   

   

   

   

   

   

   ［式（Ｉ）において、Ｒ^１およびＲ^２は、各々水素であるか、または架橋１，２−フェニレン（Ｃ_６Ｈ_４）基または架橋エチレン基（−ＣＨ＝ＣＨ−）を一緒に形成し；Ｘは−Ｃ（Ｏ）−または共有結合であり；ｎは１、２または３であり；Ｚ^１は−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ^３、またはＳＯ_２Ｒ^３であり；Ｒ^３はフェニル、置換フェニル、ピリジル、ベンジル、置換ベンジル、Ｃ_１〜Ｃ_４ハロアルキル、Ｃ_２〜Ｃ_３０アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_３０アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_３０アルキニル、またはコレステリルであり；および
   式（ＩＩ）において、Ｒ^４およびＲ^５は、各々水素であるか、または共有結合を一緒に形成し；Ｙは−Ｃ（Ｏ）−または−ＣＨ_２−であり；Ｚ^２は−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^６、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ^６またはＳＯ_２Ｒ^６であり；Ｒ^６はフェニル、置換フェニル、ピリジル、ベンジル、置換ベンジル、Ｃ_１〜Ｃ_４ハロアルキル、Ｃ_２〜Ｃ_３０アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_３０アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_３０アルキニル、またはコレステリルであり；Ｈｅｔは２−ピリジルまたは２−イミダゾリルである。］
   α_ｖβ_３インテグリン受容体を標的にしたリポソ−ム。
2. 前記カチオン両親媒性物質がカチオン脂質である請求項１に記載のリポソーム。
3. リポソーム中に存在する脂質の少なくとも一部が互いに架橋する官能基を有する請求項２に記載のリポソーム。
4. 前記非ペプチド系α_ｖβ_３インテグリンアンタゴニストが、１０オングストロームから１００オングストロームの範囲でカチオン基とアニオン基の間に間隔を提供するスペーサー基により互いに間隔をあけられたカチオン基とアニオン基を有し、生理的ｐＨ値で両性イオンである請求項２に記載のリポソーム。
5. 前記スペーサー基が二価の芳香族基を含む請求項４に記載のリポソーム。
6. 前記核酸がＤＮＡである請求項１に記載のリポソーム。
7. 前記核酸が遺伝子である請求項１に記載のリポソーム。
8. 前記核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチド配列である請求項１に記載のリポソーム。
9. 前記核酸がＲＮＡである請求項１に記載のリポソーム。
10. 前記リポソームが２５０ナノメートル以下の粒径を有する請求項１に記載のリポソーム。
11. 前記リポソームが４０ナノメートルから１００ナノメートルの範囲の粒径を有する請求項１に記載のリポソーム。
12. 前記リポソームが７５ナノメートルから１００ナノメートルの範囲の粒径を有する請求項１に記載のリポソーム。
13. 前記リポソームが４０ナノメートルから６５ナノメートルの範囲の粒径を有する請求項１に記載のリポソーム。
14. 前記非ペプチド系α_ｖβ_３インテグリンアンタゴニストが、４５５ダルトンから６０５ダルトンの範囲の分子量を有する請求項１に記載のリポソーム。
15. 前記非ペプチド系α_ｖβ_３インテグリンアンタゴニストが、２００ダルトンから８００ダルトンの範囲の分子量を有する請求項１に記載のリポソーム。
16. 前記非ペプチド系α_ｖβ_３インテグリンアンタゴニストが、式（Ｉ）
    

    

    ［式（Ｉ）において、Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ水素であるか、架橋１，２−フェニレン（Ｃ_６Ｈ_４）基または架橋エチレン基（−ＣＨ＝ＣＨ−）を一緒に形成し；Ｘは−Ｃ（Ｏ）−または共有結合であり；ｎは１、２または３であり；Ｚ^１は−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ^３またはＳＯ_２Ｒ^３であり；およびＲ^３はフェニル、置換フェニル、ピリジル、ベンジル、置換ベンジル、Ｃ_１〜Ｃ_４ハロアルキル、Ｃ_２〜Ｃ_３０アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_３０アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_３０アルキニルまたはコレステリルである。］
    により表される請求項２に記載のリポソーム。
17. 前記非ペプチド系α_ｖβ_３インテグリンアンタゴニストが、式（ＩＩ）
    

    

    ［式（ＩＩ）において、Ｒ^４およびＲ^５はそれぞれ水素であるか、共有結合を一緒に形成し；Ｙは−Ｃ（Ｏ）−または−ＣＨ_２−であり；Ｚ^２は−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^６、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ^６またはＳＯ_２Ｒ^６であり；Ｒ^６はフェニル、置換フェニル、ピリジル、ベンジル、置換ベンジル、Ｃ_１〜Ｃ_４ハロアルキル、Ｃ_２〜Ｃ_３０アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_３０アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_３０アルキニルまたはコレステリルであり；およびＨｅｔは２−ピリジルまたは２−イミダゾリルである。］
    により表される請求項２に記載のリポソーム。
18. 架橋脂質がなく、７５ナノメートルから１００ナノメートルの範囲の粒径を有する請求項２に記載のリポソーム。
19. 前記リポソームが架橋脂質を含み、４０ナノメートルから６５ナノメートルの範囲の粒径を有する請求項２に記載のリポソーム。
20. 前記標的脂質および中性脂質が、互いに少なくとも部分的に架橋しており、カチオン性両親媒性物質は実質的に架橋がない請求項１に記載のリポソーム。
21. 前記カチオン脂質が塩化１，２−ジオレオイルオキシ−３−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム）プロパンである請求項２に記載のリポソーム。
22. ２５０から５００のオキシエチレン反復単位を有するポリ（エチレングリコール）をさらに含む請求項２１に記載のリポソーム。
23. 前記ポリ（エチレングリコール）が３５０のオキシエチレン反復単位を含む請求項２２に記載のリポソーム。
24. １：１：０．１２の比率で、それぞれ塩化１，２−ジオレオイルオキシ−３−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム）プロパン、コレステロールおよびポリ（エチレングリコール）を含む請求項２に記載のリポソーム。
25. 前記核酸が、リポソームを導入した細胞内において蛋白質またはペプチドを発現できる請求項２に記載のリポソーム。
26. 前記核酸が血管形成阻害蛋白質またはペプチドを発現できる請求項２５に記載のリポソーム。
27. 血管形成阻害蛋白質がＲａｆ蛋白質である請求項２６に記載のリポソーム。

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