JP2004510830A - 標的化された治療用薬剤 - Google Patents

Abstract

標的化部、治療部または処置部および結合担体からなる治療用薬剤および造影剤を提供する。結合担体は、従来の結合法では提供されない付加的利点を治療用薬剤に賦与する。本発明の好ましい薬剤は、脂質構築物、小胞、リポソームまたは重合リポソームを含む。治療部または処置部は、放射性同位体、化学療法剤、プロドラッグ、毒物または細胞毒性を示すタンパク質をコードする遺伝子である場合もある。好ましくは、本発明の薬剤は更に、治療用薬剤または造影剤に付加的利点を賦与する安定化部を含む。

Description

【０００１】
発明の技術分野
本発明は、標的化部、治療部または処置部および結合担体からなる治療用薬剤並びに造影剤に関するものである。本発明の好ましい薬剤は、脂質構築物、小胞、リポソームまたは重合リポソームを含む。治療部または処置部は、共有結合的または非共有結合的手段で薬剤と結合することができる。治療部または処置部は、放射性同位体、化学的療法剤、プロドラッグ、毒物または細胞毒性を示すタンパク質をコードする遺伝子である場合もある。好ましくは、薬剤は更に、治療用薬剤または造影剤に付加的利点を賦与する安定化部を含む。安定化部は共有結合的または非共有結合的手段で薬剤と結合することができる。好ましくは、安定化部はデキストランであり、好ましくは脂質構築物、小胞、リポソームまたは重合リポソームの表面に被膜を形成する。好ましい態様では、結合担体は重合リポソームである。結合担体は、治療用薬剤に、従来の結合方法では提供されない付加的利点を賦与する。
【０００２】
発明の背景
工業化社会では、死亡の主な原因の１つとしてがんが残されている。米国では心臓病に次いで、がんが死亡の第２の非常に一般的な原因で、１９９７年では死亡の約４分の１の原因となる。明らかに、がんについて新規で効果的な処置は健康に顕著な利益を提供するだろう。がんに対して示される幅広い様々な処置の中で、標的化治療薬は相当有望な見込を有している。原則的には、細胞毒薬剤が特異的にがん性組織を標的化しているならば健康な組織は影響されないかまたは病理組織よりかなり影響受ける程度は少ないので、細胞毒性薬剤が相当より高用量でも患者は耐えられるだろう。
【０００３】
モノクローナル抗体の高度な特異性により、細胞毒性薬剤に結合した抗体が標的がん処置治療用に提案された。特に固体腫瘍は、腫瘍を含むがん化細胞および腫瘍に供給する脈管系の両方において特定抗原を発現するが、それは腫瘍細胞および脈管に独自であるか、或いは正常な細胞および脈管系と比較して腫瘍細胞および脈管系において過剰に発現されるかどちらかである。そこで、腫瘍抗原または腫瘍脈管系抗原に特異的抗体を細胞毒薬剤に結合させれば、病理部位への高度な特異性を提供するだろう。そのような抗原の一群は細胞接着分子（ＣＡＭＳ）と呼ばれるタンパク質のファミリーで、様々な生理的および病気のプロセスにおいて内皮細胞により発現される。Ｒｅｉｓｆｅｌｄの“がん免疫治療におけるモノクローナル抗体”、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ＩＩ， （１９９２） １２（２）： ２０１−２１６、およびＡｒｃｈｅｌｏｓ ｅｔ ａｌ．の“細胞間接着分子ＩＣＡＭ−１に対する抗体による実験的自己免疫脳脊髄炎の阻止”、Ａｎｎ．ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ （１９９３） ３４（２）： １４５−１５４。ＣＡＭを含む多重内皮リガンドおよび受容体は、炎症および新生物のような様々な病理の間に上方制御されることが分かっているので、それらは標的化戦略に関する魅力的な候補品である。
【０００４】
他の可能性ある標的はインテグリンである。インテグリンは細胞表面糖タンパク質の一群で、細胞接着を仲介し、様々な生物プロセスで起こる細胞接着相互作用の媒介物質である。インテグリンは非共役的に結合したαおよびβポリペプチドのサブユニットからなるヘテロ２量体である。最近少なくとも１１種の異なるαサブユニットが同定され、少なくとも６種の異なるβサブユニットが同定されている。種々なαサブユニットは種々のβサブユニットと結合でき、別個のインテグリンを形成する。α_ｖβ_３と確認されたインテグリン（同様にビトロネクチン受容体として知られている）は、限定されるものではないが、腫瘍転移、固体腫瘍成長（新生物）、骨粗鬆症、ページェト病、悪性液性高カルシウム血症、腫瘍起因性血管形成を含む血管形成、抗血管形成、網膜症、黄斑変性、慢性関節リウマチを含む関節炎、歯周病、乾癬および平滑筋細胞移動（例えば再発狭窄症）が含まれる種々の容態または病状で役割を果たすインテグリンとして確認された。加えて、そのようなインテグリン阻害剤は抗ウイルス剤、抗真菌剤および抗菌剤として有用であることが見出されている。そこで、α_ｖβ_３を選択的に阻害または拮抗する治療剤はそのような病状を治療する際に有用であろう。α_ｖβ_３インテグリンは、フィブリノーゲン（Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ． ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， Ｖｏｌ．８０ （１９８３） ２４１７）、フィブロネクチン（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｖｏｌ．７１ （１９８３） ６１９−６２４）およびウイルブランド病因子（Ｒｕｇｇｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， Ｖｏｌ．７９ （１９８２） ６０３８）のようなマトリックス高分子を含有する数多くのＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）に結合する。ＲＧＤ配列を含有する化合物は細胞外マトリックスリガンドを模して細胞表面受容体に結合する。しかしながら、多くのＲＧＤペプチドは一般的にＲＧＤ依存インテグリンに対し非選択的であることも知られている。例えば、α_ｖβ_３に結合する多くのＲＧＤは、α_ｖβ_５、α_ｖβ_１およびα_ＩＩｂβ_ＩＩＩａにも結合する。血小板α_ＩＩｂβ_ＩＩＩａ（フィブリノーゲン受容体としても知られている）の拮抗作用はヒトにおいて血小板凝集を阻止することが知られている。
【０００５】
数多くの抗インテグリン抗体が知られている。Ｄｏｅｒｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９６ ２７１： ２４４３は、α_ｖβ_５インテグリンに対する阻止抗体が生体外でＩＧＦ−１からの刺激に応じてＭＣＦ−７ヒト乳がん細胞の移動を阻害することを報告した。Ｇｕｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ． Ｓｕｒｇｅｒｙ １９９５ ８２： １１９２は、α_ｖβ_１およびα_ｖβ_５に対する抗体が生体外でヒト乳がん癌腫細胞系Ｈｓ５７８ＴおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１による化学浸潤を阻害することを報告している。Ｌｅｈｍａｎ ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９４ ５４： ２１０２は、モノクローナル抗体（６９−６−５）がα_ｖβ_３を含む幾つかのα_ｖインテグリンと反応し、結腸癌腫細胞のビトロネクチンを含む多くの基質への接着を阻止することを示している。Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４ ２６４： ５６９では、抗α_ｖβ_３モノクローナル抗体によるインテグリン活性の阻害が、ヒトＭ２１メラノーマ断片による鶏胚漿（絨毛）尿膜の腫瘍誘起血管形成を阻止することを示した。Ｃｈｕｎｔｈａｒａｐａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ． Ｒｅｓ． １９９３ ２０５： ３４５では、α_ｖβ_３複合体を認識するモノクローナル抗体９Ｇ２．１．３およびＩＯＣ４．１．３を開示しているが、後者のモノクローナル抗体は破骨細胞を例外としてα_ｖβ_３を発現する全ての組織には弱く結合するかまたは全く結合せず、生体内における骨の病気治療に有用であることを示唆した。前者のモノクローナル抗体は幾つかのがんにおける治療剤として可能性をもつことが示唆された。
【０００６】
Ｇｉｎｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第５，３０６，６２０号は、インテグリンと反応することで、リガンドに対するインテグリンの結合親和性が増加する抗体を開示している。それだけで、それらのモノクローナル抗体はメラノーマ腫瘍を固定して転移を防止するのに有用であるといわれている。Ｂｒｏｗｎの米国特許第５，０５７，６０４号は、α_ｖβ_３インテグリンヘのモノクローナル抗体の使用を開示し、それはタンパク質を含有するＲＧＤ配列を認識する受容体と結合してＲＧＤ仲介の食作用亢進を阻害する。Ｐｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第５，１４９，７８０号は、インテグリンβサブユニットのＲＧＤエピトープと相同なタンパク質およびβ_３サブユニットに結合して、インテグリン−リガンド結合を阻害するモノクローナル抗体を開示している。その作用は凝集および幾つかの炎症反応のような接着−惹起ヒト反応に対しての治療で有用であるといわれている。
【０００７】
Ｃａｒｒｏｎの米国特許第６，１７１，５８８号は、細胞接着、破骨細胞−仲介の骨吸収、再発狭窄症、眼血管新生および血管腫の成長並びに新生物細胞または腫瘍成長および内転移のようなα_ｖβ_３−仲介の現象を阻止する方法において使用することができるモノクローナル抗体を記載している。記載された他の利用は、新生物および腫瘍関連血管床を支えるα_ｖβ_３を妨害するか失わせるために抗体が仲介した標的化および治療剤の送達である。加えて、この発明のモノクローナル抗体は、α_ｖβ_３担持新生物または腫瘍関連血管床のＮＭＲまたは免疫シンチグラフィーによる視覚化または画像化に用いることができる。
【０００８】
標的治療法の例は様々な特許公報および科学的報文に記載されている。国際特許出願ＷＯ９３／１７７１５では腫瘍脈管系関連抗原の認識を通して固体腫瘍塊の脈管系を標的とした診断または治療用薬剤を伴う抗体につき説明している。国際特許出願ＷＯ９６／０１６５３および米国特許第５，８７７，２８９号では、抗体を用いた凝血薬の部位特異的送達により、生体内での腫瘍脈管系の凝固のための方法および組成物を記載し、一方、国際特許出願ＷＯ９８／３１３９４は凝固および腫瘍処置用の組織因子組成物の利用を記載している。国際特許出願ＷＯ９３／１８７９３および米国特許第５，７６２，９１８号および第５，４７４，７６５号では血管内皮細胞に結合する多アニオン性ポリマーに連結したステロイドを記載している。国際特許出願ＷＯ９１／０７９４１および米国特許第５，１６５，９２３号ではリジンＡのような腫瘍細胞に対する抗体に結合した毒物を記載している。米国特許第５，６６０，８２７号、第５，７７６，４２７号、第５，８５５，８６６号および第５，８６３，５３８号も腫瘍脈管系処置の方法を記載している。国際特許出願ＷＯ９８／１０７９５およびＷＯ９９／１３３２９は薬剤が腫瘍を標的とするのに使用できる腫瘍自動追尾分子につき記載している。
【０００９】
Ｔａｂａｔａ ｅｔ ａｌ．のＩｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ １９９９ ８２： ７３７−４２では、抗体を増殖する血管に放射性同位体を送達するために抗体を用いている。Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ ＆ＲａｊｏｔｔｅのＡｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０００ １８： ８１３−２７；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ， Ａｄｖ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９９ ７６： １−２０では、薬剤が血管形成新脈管系を標的とする戦略につき再検討している。一方で、Ａｒａｐ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８ ２７９： ３７７−８０では、腫瘍血管を標的とするペプチドの選定を記載している。
【００１０】
そのような系に使用される典型的な配置は、標的化部を治療部と単結合させるかまたは比較的短い化学リンカーで連結するということに留意すべきである。そのようなリンカーの例には、ＳＭＣＣ（サクシニミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）または米国特許第４，８８０，９３５号に開示されたリンカーおよびオリゴペプチドスペーサーが含まれる。カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシサクシンイミド試薬は、直接的に治療部および標的化部を、適した反応性化学基で接続するのに使用される。
【００１１】
遺伝子治療手法において異種遺伝子の送達にカチオン性有機分子を用いることが文献で報告されている。全てのカチオン性化合物がＤＮＡと複合体になり、遺伝子移入を容易にするわけではない。最近の主な戦略はカチオン性分子の日常的スクリーニングである。過去に用いられた化合物型には、ポリエチレンアミン、エチレンジアミンカスケードポリマーおよびポリブレンのようなカチオン性ポリマーが含まれる。全体では正電荷をもつポリリジンなどのタンパク質も同じように使用された。化合物の最大群は、ＤＯＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ−ｃｈｏｌおよびＤＯＳＰＡを含むカチオン性脂質である。これらの薬剤の全ては効果あることが知られているが、毒性や薬剤の製造における必要経費のような潜在的問題で悩みがある。カチオン性リポソームは遺伝子移入研究に関しては最近最も知られている系である。カチオン性リポソームは２種の機能を供する：ＤＮＡを分解から保護し、細胞に入るＤＮＡの量を増加させる。カチオン性リポソーがいかに機能するかを説明できる機構はまだ全てが正確に描かれていないが、そのようなリポソームは生体外および生体内研究で有用であることが判明している。しかしながら、これらのリポソームは幾つかの重大な制限により悩みがある。その制限には低形質移入効率、脂質の製造における必要経費、ＤＮＡと複合化する際のコロイドの不安定性および毒性が含まれている。
【００１２】
標的化部を治療部と比較的小さなリンカーで結合させたものは相当注目されているが、リンカーとして大きな粒子を用いるものは余り注目はされていない。典型的にはリンカーは治療部と標的化部を結合する役割をするだけで、リンカーの性質についての一般的な配慮は、結合される物質を妨害しないという、例えば免疫グロブリンの抗原結合部位においては連結点としないことに集中されている。
【００１３】
リポソームのような生体適合性材料の大きな微粒子集合体は薬物および常磁性体コントラスト剤を投与する際のキャリアーとして使用されていた。米国特許第５，０７７，０５７号および第５，２７７，９１４号は、水に溶けにくい薬物を送達するためのリポソームまたは明確なサイズの粒子を有する脂質粒子懸濁液、特に非プロトン性溶媒に可溶な脂質の調製を教示している。米国特許第４，５４４，５４５号では、前もって選定した器官に対してリポソームをより特異的にするために、修飾したコレステロール誘導体を含む外層を有するリン脂質リポソームを教示している。米国特許第５，２１３，８０４号は、薬物のような捕集した薬剤を含有するリポソーム組成物を教示しているが、それは小胞形成脂質および親水性生体適合性ポリマーで修飾した小胞形成脂質の１〜２０モルパーセントからなり、その大きさは体内分布および循環半減期を制御する大きさにしてある。米国特許第５，２４６，７０７では、捕捉したタンパク質およびポリペプチドのような水溶性生体分子の放出速度を制御する生物活性材料のリン脂質被覆した微結晶性粒子を教示している。米国特許第５，１５８，７６０号は、ヘモグロビンのような放射活性標識タンパク質を被包したリポソームを教示している。
【００１４】
米国特許第５，５１２，２９４および第６，０９０，４０８号および第６，１３２，７６４号（内容は本明細書に援用される）は種々な生物的応用に対し重合リポソームの使用を説明している。記載される１つの態様は、治療用薬剤を局所治療に関して特異的生体部位に処置用化合物を直接送達するために、治療用化合物（例えば、タンパク質、ホルモンまたは薬物）に結合するか被包したような標的化重合リポソームについてである。リポソームの組成を記載している他の公報には、米国特許第５，６６３，３８７号、第５，４９４，８０３号および第５，４６６，４６７号が含まれる。タンパク質および酵素の非共有固定化に関しては、重合脂質を含有するリポソームがＳｔｏｒｒｓ ｅｔ ａｌ．の“常磁性重合リポソーム：磁気共鳴画像用の合成、キャラクタリゼーションおよび応用”Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． （１９９５） １１７（２８）： ７３０１−７３０６；およびＳｔｏｒｒｓ ｅｔ ａｌ．の“新規再循環ＭＲコントラスト剤としての常磁性重合リポソーム”ＪＭＲＩ （１９９５） ５（６）： ７１９−７２４に記載されている。Ｗｕ ｅｔ ａｌ．の“放射免疫治療および画像化に用いるための金属−キレートデンドリマー抗体構造体”、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ （１９９４） ４（３）： ４４９−４５４は、デンドリマーに基づく化合物を目指した発表である。
【００１５】
治療用薬剤の体内での再循環に対する必要性は、必要とする治療効果を与えるために標的部位で充分な濃度になるように細網内皮系による急速な細胞内取込みおよび腎臓による急速なろ過を避けることであると認識されている。磁気共鳴コントラスト剤による経験で、循環半減期についての有用な情報が提供されている。ジエチレントリアミンペンタ酢酸ガドリニウムのような小さな分子は腎臓排泄により循環時間を制限してしまう傾向があり、一方、直径が８００ｎｍより大きい多くのリポソームは細網内皮系で迅速に除去される。これらの問題を解決する試みとして、ジエチレントリアミンペンタ酢酸ガドリニウム誘導体化した多糖類、ポリペプチドおよびタンパク質のような高分子材料の使用が必要とされた。これらの薬剤は化学修飾してもまだ長い再循環時間および活性標的化の両方を提供する汎用性を達成していない。
【００１６】
安定化
肝臓での早い除去を避けるためおよび他の安定化効果のためにリポソームと重合合物の会合につき説明されてきた。例えば、Ｄａｄｅｙの米国特許第５，９３５，５９９号ではリポソームおよび塩の形のアニオン性部分を複数有するポリマーを含有しているポリマー会合リポソームにつき記載している。ポリマーは合成でも天然由来でもよい。ポリマー会合リポソームは血管系に留まる時間が延長された。
【００１７】
多糖類は重合性安定剤の一種である。Ｃａｌｖｏ Ｓａｌｖｅ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，８４３，５０９号では、脂質−多糖類複合体の形成を通じてコロイダル系の安定化および２つの成分：水可溶性および正荷電多糖類並びに負荷電リン脂質の組合せを包含するコロイド系の調製に関する手順の開発について記載している。安定化はイオン性複合体：アミノ多糖類−リン脂質の界面での生成を通じて生じる。Ｃａｌｖｏ Ｓａｌｖｅ ｅｔ ａｌ．により利用された多糖類にはキチンおよびキトサンが含まれる。
【００１８】
デキストランは安定化特性が検討された他の多糖類である。Ｃａｎｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．のＪ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． １９９９， ４４： １４０−４８では、デキストランまたは官能基化デキストランはコレステロールで疎水化され、それがリポソーム形成の間でリポソームの脂質二重層中に固定され、デキストランで被覆されたリポソームを生じることを報告している。これらのリポソームは培養においてヒト内皮細胞と特異的に相互作用を行った。Ｌｅｔｏｕｒｎｅｕｒ ｅｔ ａｌ．のＪ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０００， ６５： ８３−９１では、抗増殖性官能基化デキストリン被覆リポソームは血管平滑筋細胞に対する標的化薬剤として用いられる。Ｕｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．のＰｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９１： ５４２６−３０ （１９９４）およびＵｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．のＣｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４２： １５１８−２６ （１９９６）は、デキストランによるポリスチレンビーズの被覆およびリガンド、核酸およびタンパク質のデキストラン−ポリスチレン複合体への付着を記載している。
【００１９】
デキストランは金属ナノ粒子を被覆するためにも用いられ、そのようなナノ粒子は造影剤として主に使用された。例えば、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．のＲａｄｉｏｌｏｇｙ ２０００， ２１４： ５６８−７４では、げっ歯類モデルにおいて長循環デキストリン被覆酸化鉄ナノ粒子を腫瘍細胞が好んで取り込むが、同じ程度に腫瘍会合マクロファージおよび血管形成の部分の内皮細胞では相当低い程度であるが取り込む。Ｇｒｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第４，７７０，１８３号では、造影剤として使用するための１０〜５０００Åの超常磁性金属酸化物粒子につき記載している。粒子はデキストランまたは他の適したポリマーで被覆されているのがよく、標的器官において粒子の取り込みおよび滞留時間を最適化する。患者の血流に注射されたデキストラン被覆酸化鉄粒子は、例えば肝臓に局在化する。Ｇｒｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．は同じようにデキストラン被覆粒子は健常細胞も好んで吸収するががん性細胞よりは少ない取り込みである。
【００２０】
画像処理
磁気共鳴画像処理（ＭＲＩ）はＸ線とは違い、イオン化放射線を伴わない画像処理法である。ＭＲＩは体躯の横断画像を、例えば軸方向、冠状、矢状および直交のような種々の走査面にて作成するのに用いることができる。ＭＲＩは体躯の画像を作成するのに磁場、高周波エネルギーおよび磁場勾配を使用する。組織間のコントラストまたはシグナル強度差は主にＴ１（縦方向）およびＴ２（横断方向）の緩和値並びに組織におけるプロトン濃度を反映する。コントラスト媒質を使用して患者のある部位におけるシグナル強度を変化させるには、幾つかの可能な方法が利用できる。例えば、コントラスト媒質をＴ１、Ｔ２またはプロトン濃度のいずれかを変化させるように設計することができる。
【００２１】
一般的に言えば、ＭＲＩはコントラスト剤の使用が必要とされる。コントラスト剤を使用しないでＭＲＩを実施すると、得られる画像において周囲の組織から目的の組織を差別化するのが難しいであろう。過去にＭＲＩ用の常磁性コントラスト剤に注目が集まった。常磁性コントラスト剤は不対電子を含有する材料を必要とする。主磁場内では不対電子は小磁石として作用し縦方向面（Ｔ１）および横断面（Ｔ２）の緩和の速度を増加させる。常磁性コントラスト剤は典型的には金属イオン、例えば遷移金属を含み、それは不対電子原を供する。しかしながら、これらの金属イオンは一般的に毒性もある。例えば、フェライトは経口投与するとしばしば鼓腸と共に嘔吐の症状を起こし、血清の鉄が一時的に上昇する。Ｇｄ−ＤＴＰＡで錯体化しているガドリニウムイオンは遊離形では非常に毒性が高い。胃において高まる酸性（低ｐＨ）および腸で高まるアルカリ性を含む胃腸管での色々な環境は、錯体から遊離イオンの分断および分離する可能性が増加するであろう。毒性を減らす工夫は、金属を典型的には配位子とキレート化させることである。
【００２２】
超音波は、例えば微小血管系のような脈管系を含む体躯の種々な部位を検討する際の、他の価値ある診断的画像処理手法である。超音波は他の診断手法より一定の有利な点を供する。例えば、核医学およびＸ線を含む診断法は一般的に患者のイオン化放射線への曝露を伴う。そのような放射線はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）およびタンパク質を含む細胞下の物質に損傷を起こす。超音波はそのような潜在的に損傷させる放射線を伴わない。加えて、超音波は精密で高価な装置を必要とするＣＴおよびＭＲＩを含む他の診断法に比べて低価格である。
【００２３】
超音波では患者は音波に曝される。一般的に音波は体の組織への吸収、組織を通過または組織の反射により失われる。組織の音波反射は一般的に後方散乱または反射率と言われ超音波画像を現す基礎をなす。これに関して、音波は異なる体組織からは異なる反射が起こる。この反射率差は観測する特定の組織の構成および密度を含む種々な因子による。超音波は一般的に１〜１０メガヘルツまでの周波数を持つ音波が検出できる変換器による反射波差の検出を必要とする。検出された音波は画像にまとめることができ、それを数量化し、数量化した音波を研究する組織の画像に変換する。
【００２４】
今まで検討してきた診断手法に関して、超音波は同じようにコントラスト剤の使用が必要となる。コントラスト剤の例には、例えば固体粒子の懸濁液、乳化液体滴およびガス封入バブル（例えばＨｉｌｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第４，４６６，４４２号および公開された国際特許出願ＷＯ９２／１７２１２およびＷＯ９２／２１３８２を参照されたい）が含まれる。Ｗｉｄｄｅｒ ｅｔ ａｌ．の公開された国際特許出願ＥＰ−Ａ−０３２４９３８は、アルブミン、ヘモグロビンおよびコラーゲンのような熱変性性生体適合タンパク質から作られる安定化マイクロバルブ型超音波画像化剤を開示している。
【００２５】
液体−ガス界面からの音波の反射は非常に効率的である。従って、ガス封入バブルを含むリポソームまたは小胞はコントラスト剤として有効である。以降詳しく検討するように、コントラスト剤としてのリポソームの有効性は、例えばバブルのサイズおよび／または柔軟性を含む種々な因子に依存する。
【００２６】
先行技術で公開されたリポソームの多くは望ましくないことに安定性に欠けている。それゆえに、先行技術のリポソームは生体内で破裂して、例えば時宜でないときに含有している全ての治療用および／または診断用薬剤の放出が起こる。リポソームの安定性を改良するために様々な研究が行われてきた。その研究には例えば、その中の膜または壁にアルブミンのようなタンパク質または架橋で明らかに強化した材料を含むリポソームの調製が含まれる。生分解性架橋剤で架橋したタンパク質を含むリポソームを公開しているＫｌａｖｅｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．のＷＯ９２／１７２１２を参照されたい。Ｍｏｓｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ．が１９９１年における医学磁気共鳴学会（ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）Ｎａｐｐａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ大会で行った講演は、“マイクロバブル：新規ＭＲ感受性コントラスト剤”と題した要旨に纏められている。Ｍｏｓｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ．が記載したマイクロバブルは、ヒトアルブミンの外皮で被覆した空気を含んでいる。あるいは、膜はタンパク質ではなく生分解性化合物で架橋された化合物を含むことができる。Ｋｌａｖｅｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．のＷＯ９２／１７４３６、ＷＯ９３／１７７１８およびＷＯ９２／２１３８２を参照されたい。
【００２７】
発明の概要
本発明は、標的化部、治療部または処置部および結合担体からなる治療用薬剤並びに造影剤に関する。本発明の好ましい薬剤は、脂質構築物、小胞、リポソームまたは重合リポソームを含む。治療部または処置部は、共有結合的または非共有結合的手段で結合担体と結合することができる。治療部または処置部は、放射性同位体、化学療法剤、プロドラッグまたは毒物である場合もある。最も好ましい態様では、結合担体は重合リポソームである。結合担体は、治療用薬剤に、従来の結合方法では提供されない付加的利点を賦与する。
【００２８】
また本発明は、標的化部、造影部および場合により結合担体からなる血管標的化造影剤に関するものである。本発明は更に標的化部、検出部および場合により結合担体からなる診断用薬剤に関する。
【００２９】
また本発明は、前記治療用薬剤および造影剤の調製方法に関する。
また本発明は、本発明の治療用薬剤を含む治療用組成物に関する。
【００３０】
また本発明は、本発明の治療用薬剤を使用する処置方法に関する。
また本発明は、本発明の造影剤を含む造影用組成物に関する。
【００３１】
また本発明は、がんの診断方法を含む、本発明の造影剤の使用方法に関する。
また本発明は、診断アッセイにおいて用いる方法および試薬に関する。
【００３２】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、脂質構築物、標識化部および治療部または処置部からなる治療用薬剤並びに造影剤に関する。図１はそのような３成分系の概略図を示す。結合担体５０は標識化部５２および治療部５１を有している。各標識化部５２および治療部５１の複数のコピーを各結合担体５０に付着させることができる。標的化部５２は、血管を標的とした治療用薬剤全体をその標的５３に結合させるのに役立つ。
【００３３】
本明細書で用いる「脂質構築物」は、脂質、リン脂質、または脂質が水性懸濁液中でとることが知られている種々の異なる構造配置を含むそれらの誘導体を含有する構造物である。これらの構造には、限定されるものではないが、脂質二重層小胞、ミセル、リポソーム、乳濁液、脂質のリボンまたはシートが含まれ、医薬品的に許容されることが知られている様々な薬物および成分と複合体を構成していてもよい。好ましい態様では、脂質構築物はリポソームである。通常のアジュバントにはとりわけコレステロールおよびα−トコフェロールが含まれる。脂質構築物は、当業者がある特定の応用に求められる特徴を提供すると認識するものを単独で、またはいずれかの組合せで用いることができる。加えて、脂質構築物、小胞およびリポソーム形成の技術的側面は当技術分野で周知であり、当該分野で通常実施されるいずれの方法も本発明で使用することができる。治療部または処置部は、共有結合的または非共有結合的手段で薬剤と結合することができる。本明細書で用いるように、結合手段は共有結合的または非共有結合的相互作用で付着する。
【００３４】
治療部
「治療部」という用語は、処置した被験者で治療効果を有する、分子、分子集合体または高分子のいずれかを意味し、処置した被験者は動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。「治療効果」という用語は、病態を逆転させ、病態を抑え、病態の進展を遅くし、病態を改善し、病態の症状を和らげまたは処置した被験者にとって他の有利な結果となる効果を意味する。治療部には、限定されるものではないが、ドキソルビシンおよび他の化学療法剤のような薬物、低分子治療薬、リシンのような毒物、放射性同位体、細胞毒性を示すタンパク質をコードする遺伝子およびプロドラッグ（不活性型で体内に導入され、生体位で活性化する薬物）が含まれる。治療部として有用な放射性同位体については、Ｋａｉｒｅｍｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ． ３５： ３４３−５５ （１９９６）に記載されており、Ｙ−９０、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｂｉ−２１３、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｓｃ−４７、Ｇａ−６７、Ｒｈ−１０５、Ｐｒ−１４２、Ｎｄ−１４７、Ｐｍ−１５１、Ｓｍ−１５３、Ｈｏ−１６６、Ｇｄ−１５９、Ｔｂ−１６１、Ｅｕ−１５２、Ｅｒ−１７１、Ｒｅ−１８６およびＲｅ−１８８が含まれる。
【００３５】
リポソーム
本明細書で用いるように、脂質は、分子の疎水性部分が水相から隔離されて水中で自然に組織立った構造を形成するような両親媒性の特徴を示す薬剤を意味する。本発明の意味において、脂質は、脂肪または脂肪性材料と同様の特徴を有するいかなる物質でもよい。概して、この型の分子は広範な非極性領域を有し、大多数は水溶性で極性の頭部と呼ばれる親水性基も有する。リン脂質は細胞膜の主な構成成分となる脂質である。典型的なリン脂質親水性基には、ホスファチジルコリン部分およびホスファチジルエタノールアミン部分が含まれる。一方、典型的な疎水性基には、ジアセチレンを含む種々の飽和および不飽和脂肪酸部分が含まれる。水中でのリン脂質の混合物は、リン脂質分子が自然に組織化して、使用する条件に応じて様々な特徴的相となる。これらには二重構造が含まれ、二重構造ではリン脂質の親水性基が二重層の外側で水と相互作用し、疎水性基は二重層の内側で隣接分子の類似した基と相互作用する。そのような二重層構造は極めて安定で、細胞膜の主な土台を形成する。
【００３６】
二重層構造は、小胞またはリポソームと呼ばれる、閉じた球状殻様構造を形成することもできる。本発明に用いるリポソームは、従来の種々のリポソーム調製技術のいずれかを用いて調製できる。当業者であれば容易に明らかなように、このような従来の技術には超音波処理、キレート透析、ホモジナイゼーション、溶媒の押出しと組合せた注入、凍結解凍押出し成形、微小乳化などが含まれる。これらの技術は他と同様に、例えば米国特許第４，７２８，５７８号、英国特許出願Ｇ．Ｂ．２１９３０９５Ａ、米国特許第４，７２８，５７５号、米国特許第４，７３７，３２３号、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８５／０１１６１、Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， Ｖｏｌ．８５８， ｐｐ．１６１−１６８ （１９８６）、Ｈｏｐｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， Ｖｏｌ．８１２， ｐｐ．５５−６５ （１９８５）、米国特許第４，５３３，２５４号、Ｍａｈｅｗ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１４９， ｐｐ．６４−７７ （１９８７）、Ｍａｈｅｗ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， Ｖｏｌ．７５， ｐｐ．１６９−１７４ （１９８４）、およびＣｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．２２， ｐｐ．４７−５５ （１９８７）、および１９８９年１０月２７日に出願された米国シリアル番号第４２８，３３９号で検討されている。上述の特許、刊行物および特許出願の各々の開示は、本明細書にその全体が援用される。国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８５／０１１６１または１９８９年１０月２７日に出願された米国シリアル番号第４２８，３３９号に記載されたものと同様な無溶媒系は、リポソーム構築物を調製するのに使用できる。これらの手順に従って、ガス状前駆体または固体若しくは液体のコントラスト増強剤をその中に被包させたリポソームを調製できる。
【００３７】
本発明のリポソームを調製するのに用いることができる材料には、当業者にリポソームの構築に好適であると知られているいずれかの材料またはそれらの組合せが含まれる。用いる脂質は天然でも合成由来でもよい。そのような材料には、限定されるものではないが、コレステロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、リゾ脂質、脂肪酸、スフィンゴミエリン、グリコスフィンゴ脂質、グルコ脂質、糖脂質、スルファチド、アミドを伴う脂質、エーテルおよびエステル結合脂肪酸、重合性脂質のような脂質並びにそれらの組合せが含まれる。当業者が認識するように、リポソームは組み込まれた糖脂質、複合炭水化物、タンパク質または合成ポリマーの存在下または非存在下において、従来の手順により合成できる。リポソームの表面は、当業者であれば容易に明らかな手順を用いて、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリマーで修飾することもできる。脂質は金属に付着するための表面官能基を含有し、治療部として役立つ放射性同位体または他の材料のキレート化に供することができる。脂質または脂質の組合せおよび脂質マトリックス内に組み込まれる結合される材料が、生理的に適切な条件下で二重層を形成するのであれば、いかなる種の脂質を用いることもできる。当業者が認識するように、リポソームの組成は、得られるリポソームの生体内分布およびクリアランス特性を調節するために変更することができる。
【００３８】
これらの構造体における膜二重層が典型的には水性容量を被包し、被包化された容積と外部溶液の間に透過性バリアを形成する。水溶液中に分散した脂質は自然に二重層を形成し、炭化水素の尾部を内部に向け、極性頭部を水と相互作用するように外部に向ける。混合物を簡単に混合すると、通常多層ラメラ小胞（ＭＬＶ）、直径１〜１０μｍ（１０００〜１０，０００ｎｍ）のタマネギ状形態に多数の二重層を有する構造物を生成する。これらの構造物は、超音波処理または他の当該技術分野で公知の方法により、平均直径約３０〜３００ｎｍの単層ラメラ小胞（ＵＶ）を形成する。しかしながら、例えば生体内の最大循環時間の見地から、５０〜２００ｎｍの範囲が最適と考えられる。実際の平衡直径は、使用するリン脂質の性質およびコレステロールのような他の脂質の組み込み程度により、たいてい決定される。リポソームの標準形成方法は、当該技術分野に公知であり、例えばリポソームの商業的製造方法は、Ｒｏｎａｌｄ Ｃ． Ｇａｍｂｌｅの米国特許第４，７５３，７８８号およびＫｅｖｉｎ Ｒ． Ｂｒａｃｋｅｎの米国特許第４，９３５，１７１号に記載されている。
【００３９】
ＭＬＶまたはＵＶのように、リポソームは動物およびヒトにおける薬剤送達用の媒体として価値があることが判明している。小親水性分子およびポリペプチドを含む活性薬物は、リポソームの水性コアに捕捉され、一方、疎水性物質はリポソーム膜に溶解させることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡのような他の分子は、遺伝子治療応用のために、リポソームの外側に付着させてもよい。リポソーム構造体は容易に注射することができ、除放性および特定の細胞型または体の部位への薬物送達の両方の土台を形成することができる。ＭＬＶは、主にそれらが比較的大きいために、通常迅速に細網内皮系（肝臓および脾臓）で取り込まれる。本発明は、典型的には、循環系内で数時間残留し、標的細胞による内部移行後に分解する小胞を使用する。これらの要件のために、製剤には直径２００ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ未満のＵＶを使用するのが好ましい。
【００４０】
結合担体
「結合担体」という用語は、Ａ）治療部および標的化部を結合するのに役立ち、Ｂ）血管標的化治療用薬剤に、単に治療部および標識化部を非常に近接させた状態に維持する以外に、更なる有用な特性を与える、いずれかの部（ｅｎｔｉｔｙ）を意味する。これら付加的利点の例としては、限定されるものではないが：１）以下のいずれかを付着させる能力として定義される多価性、ｉ）血管標的化治療用薬剤に複数の治療部を付着させ（即ち、同一治療部を数個単位、または異なる治療部を１つ以上の単位）、標的部位に送達される治療部の有効な「運搬量（ｐａｙｌｏａｄ）」を増加させる能力；ｉｉ）血管標的化治療用薬剤に複数の標的化部を付着させる（即ち、異なる治療部を１つ以上の単位、または好ましくは同一標的化部を数個単位）能力；またはｉｉｉ）本文のｉ）およびｉｉ）の両方を付着させる能力；並びに２）粒子の大きさを変化させて細網内皮系による特定のクリアランス速度を達成することを含む改良された循環寿命、が含まれる。治療部の有効な運搬量とは、薬剤の標的への結合現象当たりの標的部位へ送達される治療部の数をいう。運搬量は特定の治療部および標的に依存するであろう。運搬量は薬剤の結合現象当たり約１送達分子程度と少ない場合もある。金属イオンの場合、運搬量は結合現象当たり約１〜１０^３送達分子とすることができる。運搬量は、結合現象当たり１０^４モル分子送達程度にできるよう意図されている。運搬量は結合現象当たり約１〜約１０^４分子の間で変化させることができる。
【００４１】
好ましい結合担体は生体適合性ポリマー（デキストランなど）または生体適合性成分の高分子集合体（リポソームなど）である。結合担体の例としては、限定されるものではないが、リポソーム、重合リポソーム、他の脂質小胞、デンドリマー、ポリエチレングリコール集合体、キャップ化ポリリジン、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、デキストランおよび被覆ポリマーが挙げられる。好ましい結合担体は重合リポソームである。重合リポソームは、米国特許第５，５１２，２９４号に記載されている。他の好ましい結合担体はデンドリマーである。
【００４２】
結合担体は、関連する特定の化学に依存した種々の方法により、標的化部および治療部へカップリングさせることができる。カップリングは共有結合または非共有結合であり得る。標的化部および治療部を結合担体にカップリングさせるのに好適な種々の方法は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， ”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９６；およびＳ．Ｓ． Ｗｏｎｇによる”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ”， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３に見出すことができる。特異なカップリング方法には、限定されるものではないが、２官能性リンカーの使用、カルボジイミド縮合、ジスルフィド結合形成、および特定の結合ペアの使用が含まれる。特定の結合ペアは、例えばビオチン−アビジン相互作用のように、結合ペアの一方は結合担体上にあり、ペアの他方は治療部または標的化部上にある。
【００４３】
重合リポソームは自己集合した脂質分子の凝集体で、粒子径および表面化学に関し顕著な可変性を提供する。重合リポソームは、本明細書にその全体が援用される米国特許第５，５１２，２９４号および第６，１３２，７６４号に記載されている。重合性脂質の疎水性尾部基は、紫外線または他のラジカル、アニオン性若しくはカチオン性の開始種（ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｅｓ）に曝されると不可逆的に架橋または重合する、ジアセチレン基のような重合性基で誘導体化され、一方リポソーム表面における官能基の分布は維持される。得られる重合リポソーム粒子は細胞膜または他のリポソームとの融合により安定化し、酵素的分解に対しても安定化する。重合リポソームの大きさは、押出し成形または当業者に公知の他の方法で調節できる。重合リポソームは重合性脂質からなるが、飽和性および非アルキンの不飽和性脂質をも含む。重合リポソームは、親水性露出表面に異なる官能基を提供する脂質の混合物であり得る。例えば、幾つかの親水性頭部基は、例えばビオチン、アミン、シアノ、カルボン酸、イソチオシアネート、チオール、ジスルフィド、α−ハロカルボニル化合物、α，β−不飽和カルボニル化合物およびアルキルヒドラジンなどの表面官能基を有することができる。これらの基は、所望の細胞表面分子への特異的標的化および付着のために、抗体、リガンド、タンパク質、ペプチド、炭水化物、ビタミン、核酸またはそれらの組合せのような標的化部の付着に、並びに薬物、治療効果を有する遺伝子をコードする核酸または放射性同位体のような治療部の付着に使用することができる。他の頭部基は、重合リポソーム粒子が付着する特異的生体分子またはその近隣の生体部位と相互作用するために、例えば抗体、ホルモンおよび薬物のような付着したまたは被包した治療部を有することができる。他の親水性頭部基は、金属に付着するために、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、エチレンジニトリルテトラ酢酸、テトラアゾシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、ポルフォリイン（ｐｏｒｐｈｏｒｙｉｎ）キレートおよびシクロヘキサン−１，２−ジアミノ−Ｎ，Ｎ’−ジアセテート、並びにこれらの化合物の誘導体の表面官能基を有することができ、治療部として役立つ放射性同位体または他の材料のキレート化に供せられる。キレート化頭部基を伴う脂質の例は、本明細書にその全体が援用される米国特許第５，５１２，２９４号に提供されている。
【００４４】
数多くの治療部を、生体内で標的表面に接着させるために、数個から約一千個の標的化部を有する１つの重合リポソームに付着させることができる。複数の標的化部で運ばれる改良された結合は、生体内の内皮細胞受容体への細胞接着をブロックするために治療的に使用することもできる。これら受容体をブロックすることは、炎症のような病理過程を制御したり、転移がんを制御するのに有用であり得る。例えば、多価シアリルＬｅｗｉｓ Ｘ誘導体化リポソームは好中球の結合をブロックするのに使用でき、重合リポソーム上のＶＣＡＭ−１に対する抗体は例えばＴ細胞のようなリンパ球結合をブロックするのに使用できる。
【００４５】
図２および図３は、重合リポソームを作製する際に使用する重合性脂質分子を概略的に示している。両親媒性脂質分子は極性頭部基６０および疎水性尾部基６１を有している。脂質の尾部は、ジアセチレン、オレフィン、アセチレン、ニトリル、アルキルスチレン、エステル、チオール、アミドおよびα、β不飽和カルボニル化合物のような重合性官能基６２を有し、ＵＶ光線のような電磁気源または化学的若しくは熱的手段による照射で重合するリポソームを形成する。図２は、尾部基６１上の特定の位置Ａ、ＢおよびＣに位置し得る重合性官能基を示す。図３に示すように、頭部基および尾部基は、長さが可変性のスペーサー部６３で結合されている。ｍで示したスペーサー部の長さは、粒子表面からの活性薬剤の距離を調節してその活性機能をより利用できるようにしている。スペーサー部は２官能性脂肪族化合物で、ヘテロ原子または２官能性芳香族化合物を含むことができる。好ましいスペーサー部は、例えば長さが可変性のポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリグリシン、アミノカプロン酸のような２官能性脂肪族化合物、または２官能性芳香族化合物のような化合物である。頭部基は、金属をキレートさせるためのジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、イソチオシアナト−ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＩＴＣ−ＤＴＰＡ）、エチレンジニトリルテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、テトラアゾシクロドデカン１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、シクロヘキサン−１，２−ジアミノ−Ｎ，Ｎ’−ジアセテート（ＣＨＴＡ）、ＭＸ−ＤＴＰＡ（イソチオシアナト−ベンジル−メチル−ジエチレントリアミンペンタ酢酸）若しくはシトレート、または特定の細胞表面受容体または抗原決定基に対するリガンド、抗体、ペプチドまたは炭水化物のような生物活性標的化薬剤をカップリングさせるためのビオチン、アミン、カルボン酸およびアルキルヒドラジンのような表面官能基６４を有する。
【００４６】
一般的に、重合リポソームに用いるのに好適な脂質は、治療部または標的化部を付着させるための活性頭部基、活性頭部基の接近可能性のためのスペーサー部；自己集合してリポソームとなるため疎水性尾部；およびリポソームを安定化する重合性基を有している。
【００４７】
図４に示したような長さが可変性のポリエチレングリコールスペーサーを介してジエチレントリアミンペンタ酢酸に結合したペンタコサジイン酸を含有するユニークな脂質が合成される。これらの両親媒性分子は、重合性ジアセチレン部を含有する脂質尾部に結合した頭部として金属キレートを有する。スペーサー長は、市販の長さが可変性のポリエチレングリコール誘導体を選択することにより調節することができる。
【００４８】
具体的には、図４に示すような化合物は、脂質ペンタコサジイン酸（ＰＤＡ）のＮＨＳエステルをトリエチレングリコールジアミンおよびテトラエチレングリコールジアミンスペーサーと反応させることにより合成して相応するＰＥＧ_ｍ−ＰＤＡアミド、ｍ＝１または２を形成し、それからＰＥＧ_ｍ−ＰＤＡアミドをジエチレントリアミンペンタ酢酸ジ無水物（ＤＴＰＡＡ）と反応させてジエチレントリアミンペンタ酢酸−ビス（トリまたはテトラエチレングリコール−ペンタコサジイン酸）ジアミド（ＤＴＰＡ−ビス−（ＰＥＧ_ｍ−ＰＤＡ）、ｍ＝１または２ジアミド）を形成する。その後ジアミドは、トリ塩化ガドリニウム、トリ塩化ジスプロシウムまたはテクニシウム若しくはインジウムの誘導体のような金属イオン源Ｍで処理してポリエチレンスペーサー（ｍ１およびｍ＝２）を有する図４に示すような両親媒性金属キレートを形成する。図４および反応物として図５に示すジアミド−ランタニドキレートを、図５に示すジアセチレン性コリン（ＤＡＰＣ、Ｒ＝ＣＨ_３）またはジアセチレン性エタノールアミン（Ｒ＝Ｈ）のマトリックス脂質、ペンタコサジイン酸（ＰＤＡ）またはＰＤＡの誘導体と、重合リポソーム上に所望の金属表面密度を生じる量で混合する。マトリックス脂質は種々の条件下で重合性リポソームを形成し、生体内細胞膜のトポロジーに非常によく類似したものである。
【００４９】
図５および図６に生成物として示す重合リポソームを形成するために、図４に示す金属キレート化ジアミドを、有機溶媒中の図５に示すようなＤＡＰＣまたは図６に示すようなＰＤＡのマトリックスでドープ処理する。有機溶媒を蒸発させ、乾燥脂質膜を全脂質１５ｍＭのような公知脂質濃度まで所望の緩衝液または水で水和する。得られる懸濁液を、ＤＡＰＣまたはＰＤＡに関するゲル−液晶相転移より高い温度、Ｔｍ＝４０℃においてプローブチップ超音波処理器を用いて超音波処理をする。乳化した小胞またはリポソームの殆ど透明で無色の溶液が製造される。透過型電子顕微鏡および原子力顕微鏡によれば、これらのリポソームの直径は平均２０〜２００ｎｍであると測定された。これらの大きさは、Ｔｍより高い温度にて、明確な多孔性を有するポリカーボネートフィルターを通おして押出し成形することにより減少できる。リポソームは溶液を氷床で４℃まで冷却し、ＵＶランプにて２５４ｎｍで照射することで重合される。あるいは、リポソームを室温で照射し、その後はＵＶ照射を継続しながら冷却することができる。図５および図６に生成物として図示する生成重合リポソームは、共役エン−インのジアセチレンポリマーから生じる中心が４９０ｎｍおよび５１０ｎｍの可視吸収帯を有するＤＡＰＣを使うとオレンジ色であるが、一般的に５４０ｎｍおよび６３０ｎｍ付近の吸収帯を有するＰＤＡを用いると青色である。これらのリポソームは、加熱若しくは超音波処理後、または長期間室温に放置若しくは有機溶媒で処理後、分子がそれらの表面に結合すると青色から赤色への転移を起こすことができる。この転移は、こうした条件に対する検出系を開発するのに有用であろう。
【００５０】
標識化重合リポソームは、ビオチン化リポソームまたはビオチン化抗体がアビジンを通して付着する負荷電リポソームから製造されたが、それはビオチンに対して高い親和性および高正電荷を有している。ビオチン−アビジン架橋に加えて、抗体−アビジン結合体はイオン交換と類似した電荷−電荷相互作用により重合リポソームに付着できる。市販のジアセチレングリセロホスホエタノールアミン（ＤＡＰＥ）脂質は、図７に示すようなビオチンアミドカプロエートＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはパラニトロフェノールエステルのような市販のビオチン化剤でアミン末端脂質をアセチル化することでそのビオチン化類似体に転換される。ビオチン化重合リポソームは、図８および図９にそれぞれ示すようなＰＤＡ，ＤＡＰＥまたはＤＡＰＣのいずれかの脂質のマトリックス中でビオチン化脂質を組込むことにより製造する。負荷電重合リポソームは、マトリックス脂質としてペンタコサジイン酸または他の負荷電脂質を用いて構築することができる。
【００５１】
本明細書で有用なリポソームには、多様な官能基性を有するリポソームの幅広い群が含まれ、それには図１０に示すアミンのような正荷電基、図１１に示すカルボキシレートのような負荷電基および図１２に示す双性イオンのような中性基が含まれる。これらの基は体内分布、血液プール半減期および粒子の非特異的接着を調整するのに重要である。
【００５２】
ビオチン・アビジンサンドイッチで付着したビオチン化抗ＶＣＡＭ−１抗体を伴うビオチン化重合リポソームは上記の方法で製造した。この標的化重合リポソームは、炎症の際に上方制御される内皮細胞表面上の白血球接着受容体であるＶＣＡＭ−１に結合する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ組織構造は、重合リポソームとアレルギー性自己免疫脳炎のマウスから得た炎症を起こした脳幹組織との間の特異的相互作用を示した。そのようなビオチン化抗体被覆重合リポソームの形成および生体内での細胞受容体へのそれらの付着を図１４に図示する。図１４に示すように、官能基７４を有するビオチン化抗体７０は、アビジンまたはストレプトアビジンのブリッジ７２を介してビオチン化脂質表面７１に付着し、抗体被覆重合リポソーム７３を形成する。抗体７０の官能基７４は生体内で内皮受容体７５に付着し、それにより外部検出用に重合リポソームを内皮に付着させる。
【００５３】
抗体は「直接」方法で付着させることもできる。例えば、リポソームを含む脂質は、酸化型抗体およびオリゴ糖上のアルデヒドと反応するアミンまたはヒドラジン誘導体のような基を含有することができる。図１５のアミンおよび図１６のヒドラジンの頭部を含有するリポソームは本目的のために構築されている。抗体はイオン交換のような電荷−電荷相互作用で付着させることもできる。この場合、抗体はアビジンのような正荷電タンパク質に結合され、この複合体イオンは負荷電重合リポソーム上で交換することができる。
【００５４】
抗体結合重合リポソームは、生体外および生体内で、特異的体組織と関連する特異的分子並びに特異的身体機能および病理と関連する特異的分子の標的化を達成する。これは標的化重合リポソーム上のＭＲＩコントラスト剤を用いて示されており、標的化重合リポソームの体内分布の直接的証拠を提供している。したがって重合リポソームは治療処置用の薬剤の標的送達に適している。種々の治療部は生体内の特定の部位への送達用に被包され、または重合リポソームの表面に付着させることができる。コントラスト強化剤も運搬する標的特異的薬物運搬重合リポソームを用いて、薬剤送達は同時に磁気共鳴画像処理により視覚化できる。
【００５５】
脈管構造内で再循環する標的化重合リポソームには、細胞接着分子または他の細胞表面受容体と相互作用を行い、望む位置に多くの標的化重合リポソームを保つ内皮の抗原が含まれる。重合リポソーム中の治療部が高濃度であれば、薬物または他の治療部を高濃度に部位特異的に送達でき、他の組織への負担を最小限にする。本明細書に記載される重合リポソームは、生体内でその全体性を維持し、血液プールで再循環するのに特に良く適しており、硬くて細胞膜とは簡単には融合せず抗体／標的化部および治療部の両方に対し付着用の足場として役に立つ。大きさの分布、粒子の硬さおよび重合リポソームの表面特徴は細網内皮系による迅速なクリアランスを避けるように仕上げ、表面は血管内での再循環時間を更に増やすためにエチレングリコールで改質することができる。１つの態様では重合リポソームはラットで約２０時間の血液半減期を有することが見出された。
【００５６】
１つの態様では、付着した特異的受容体標的化用の付着モノクローナル抗体を有する部位特異性重合リポソームは、細胞間接着分子−１であるＩＣＡＭ−１を発現する細胞に治療部を送達する際に使用することができる。この標識は多発性硬化症の動物モデルであるげっ歯類実験的自己免疫性脳炎では上方制御されている。
【００５７】
他の好ましい結合担体はデンドリマーである。デンドリマーは中心部から明確な分岐を伴うポリマーである（例えば「星型ポリマー」）。従来のポリマーとは対称的にデンドリマーは高度に分岐した、単分散高分子となる傾向があり、即ち分子量は、従来の直線または分岐ポリマーのような範囲ではなく、非常に良く定まったものである傾向がある。デンドリマーは米国特許第４，５０７，４６６号、第４，５５８，１２０号、第４，５６８，７３７号、第４，５８７，３２９号、第４，６３１，３３７号、第４，６９４，０６４号、第４，７３７，５５０号および第４，８５７，５９９号、並びに多くの他の特許および特許公報に記載がある。デンドリマーの構造、合成および特徴はＫｉｍ ａｎｄ Ｚｉｍｍｅｒｍａｎの“生化学におけるデンドリマーの応用”、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９８） ２（６）： ７３３−４２；Ｔａｍ ａｎｄ Ｓｐｅｔｚｌｅｒの“構造ブロックとして非保護化ペプチドを用いたペプチドデンドリマーおよび分岐人工タンパク質の調製への化学選択的方法”、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ （１９９５） １（３）： １２３−３２；Ｆｒｅｃｈｅｔの“官能性ポリマーおよびデンドリマー：反応性、分子構造および界面エネルギー”、Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９４） ２６３（５１５４）： １７１０−５；Ｌｉｕ ａｎｄ Ｆｒｅｃｈｅｔの“薬剤送達用のデンドリマー設計”、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ （１９９９） ２（１０）： ３９３４０１；Ｖｅｒｐｒｅｋ ａｎｄ Ｊｅｚｅｋの“ペプチドおよび糖ペプチドデンドリマー。第一部”、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９９） ５（１）： ５−２３；Ｖｅｐｒｅｋ ａｎｄ Ｊｅｚｅｋの“ペプチドおよび糖ペプチドデンドリマー。第二部”、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９９） ５（５） ２０３−２０；Ｔｏｍａｌｉａ ｅｔ ａｌ．の“星状デンドリマー：原子から肉眼で見える物質までの大きさ、形状、表面化学、トポロギーおよび柔軟性の分子レベルでの制御”、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｎｇｌｉｓｈ （１９９０） ２９（２）： １３８−１７５；Ｂｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．の“デンドリマーについて：構造、物理的性質および応用”、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ （１９９９） ９９（７）： １６６５−１６８８；Ｆｉｓｃｈｅｒ ａｎｄ Ｖｏｇｔｌｅの“デンドリマー：設計から応用まで−発展の報告”、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９９９） ３８（７）： ８８５９０５；Ｒｏｏｖｅｒｓ ａｎｄ Ｃｏｍａｎｉｔａの“デンドリマーおよびデンドリマーポリマーハイブリッド”、Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９９） １４２： １７９−２２８；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈの“機能的デンドリマー：独自の生体模倣”、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ （１９９８） ４（８）： １３５３−１３６１およびＭａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．の“デンドリマー類−好奇心から新技術への進展”、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９８） ２３（１）： １−５６、などにおいて概説されている。デンドリマーの合成はデンドリマーの大きさ、形状、表面化学、柔軟性および内部トポロジーに関して制御しながら典型的には反復合成サイクルを用いる。結合物質として用いるのに適しているデンドリマーの例については、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．の“放射性免疫治療および画像処理に用いる金属−キレートデンドリマー抗体構成体”、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ （１９９４） ４（３）： ４４９−４５４。
【００５８】
デンドリマーは種々の化学的結合手法を使用して結合担体として容易に使用されて、標的化部および治療部を付着させることができる。例えば、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）結合をその中心に有するデンドリマーを開示する米国特許第６，０２０，４５７号では、デンドリマーは特許中に記述されている方法により構築することができる。デンドリマーの最外層はアミンまたはカルボキシル基のような反応基で覆うことができる。これらの反応基はそれから標的化部または治療部（または、ある場合は両方）のどちらかで誘導体化できる。中心のジスルフィド結合はチオールに還元でき、追加物質をチオール官能基性により付着することができる。このことは、治療部をデンドリマー性結合担体の外側の層に付着してあれば、還元でチオール官能基性を生成すれば標的化部が遊離−ＳＨ基により付着することができる。そのような標的化部の１つの例は、Ｎ末端−ヨードアセチル化ペプチド（ペプチドはより大きなタンパク質のホルモンまたは生物活性断片であってもよい）で、それは標準固相法により容易に合成される。ヨードアセチル基は遊離チオール官能基性と反応し、治療部誘導体化結合担体と標的化部（ペプチド）の結合化が生じる。
【００５９】
重合リポソーム粒子は同じように非特異的接着および細網内皮系取り込みを制御する群を含有することができる。例えば、リポソームのＰＥＧ化は循環寿命を延長することが示されている；国際特許出願ＷＯ９０／０４３８４を参照されたい。
【００６０】
重合リポソームの脂質成分は、標準で公知の手法で個々に精製および特徴づけすることができ、その後最終粒子を製造する制御方式で結合できる。重合リポソームは自然の細胞膜を模したり、エチレングリコール誘導体のような官能基性を呈するように構築することができ、それらの潜在的免疫性を減少させることができる。それに加えて、重合リポソームは明確な二重層を持ち、それは透過型電子顕微鏡および原子力顕微鏡のような公知の物理的手法で特徴を表すことができる。
【００６１】
安定化部
本発明の薬剤は場合により安定化部を含有する。本明細書で使用するように「安定化剤」は、小胞の表面に安定化部を会合させ、および／または次いで治療部または標的化剤を会合させる化学的官能基性を場合により含有する、高分子またはポリマーを称する。ポリマーは生体適合性でなければならない。本発明のリポソームを安定化するのに有用なポリマーは、天然、半合成（変性天然物）または合成由来であってもよい。本発明で使用される安定化部の数多くは入手可能なもので、キサンタンガム、アカシア、寒天、アガロース、アルギン酸、アルギナート、アルギン酸ナトリウム、カラギーナン、ゼラチン、グアーガム、トラガカンス、ローカストビーン、バソリン、カーラヤ、アラビアゴム、ペクチン、カゼイン、ベントナイト、未精製ベントナイト、精製ベントナイト、ベントナイトマグマおよびコロイド状ベントナイトが含まれる。
【００６２】
他の天然系ポリマーには、例えばアラビナン、フラクタン、フカン、ガラクタン、ガラクツロナン、グルカン、マンナン、キシラン（例えばイヌリンのような）、レバン、フコイダン、カラゲナン、ガラトカロロース、ペクチン酸、ペクチンのような天然由来の多糖類で、アミロース、プルラン、グリコーゲン、アミロペクチン、セルロース、デキストラン、デキストロース、デキストリン、グルコース、ポリグルコース、ポリデキストロース、プストラン、キチン、アガロース、ケラチン、コンドロイチン、デルマタン、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンタンガム、デンプンを含み、以下のアルドース、ケトース、酸類またはアミンの１つ以上を含んだ他の種々な天然ホモポリマーまたはヘテロポリマーが含まれる：エリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、デキシトロース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、フラクトース、ソルボース、タガトース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、マルトース、セロビオース、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルクロン酸、グルコン酸、グルカル酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、グルコサミン、ガラクトサミンおよびノイラミン酸およびそれらの天然由来誘導体。他の適したポリマーにはアルブミンのようなタンパク質、ポリアルギネートおよびポリラクチド−グリコリドコポリマー、セルロース、セルロース（微晶質）、メチルセルロース、ヒドキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースカルシウム塩が含まれる。
【００６３】
典型的な半合成ポリマーにはカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩１２、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロースおよびメトキシセルロースが含まれる。本発明に使用できる他の半合成ポリマーにはカルボキシデキストラン、アミノデキストラン、デキストランアルデヒド、キトサンおよびカルボキシメチルキトサンが含まれる。
【００６４】
典型的な合成ポリマーには、ポリ（エチレンイミン）および誘導体、ポリホスファゼン、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイトポリマー、ポリエチレン（例えば、ポリエチレングリコールのようにプルロニック（登録商標）と称してＢＡＳＦ（Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ， Ｎ．Ｊ．）から市販されている化合物、ポリオキシエチレンおよびポリエチレンテレフタレートのようなもの）、ポリプロピレン（例えば、ポリプロピレングリコールのようなもの）、ポリウレタン（例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ塩化ビニルおよびポリビニルピロリドンのようなもの）、ナイロンを含むポリアミド、ポリスチレン、ポリ乳酸、フッ化炭化水素ポリマー、フッ化炭素系ポリマー（例えば、ポリテトラフルオロエチレンのようなもの）、アクリレート、メタアクリレートおよびポリメチルメタクリレートおよびその誘導体、ポリソルベート、カーボマー９３４Ｐ、マグネシウムアルミニウムシリケト、アルミニウムモノステアレート、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポビドン、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールが含まれる。小胞組成物を安定化するのにポリマーを使用した小胞の調製方法は、本明細書にその全体が援用されるＵｎｇｅｒの米国特許第５，２０５，２９０号で記載され言及された技術と組合せてみれば当業者には容易に明らかとなるだろう。
【００６５】
好ましい態様では、安定化部はデキストランである。他の好ましい態様では、安定化部はアミノデキストランのような改質デキストランである。理論で束縛はされないが、デキストランはＰＥＧと同じような方式でリポソームの循環回数を増加できると考えられる。他の好ましい態様では、以下のポリマーおよびその誘導体が使用される。ポリ（ガラクツロン酸）、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、ポリ（Ｌ−グルタミン酸−Ｌ−チロシン）、ポリ［（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸］，ポリ（イノシン酸カリウム塩）、ポリ（Ｌ−リジン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エタンスルホン酸ナトリウム塩）、ポリ（メチルヒドロシロキサン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルポリピロリドン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ラクチド）、ポリ（ラクチド−共−グリコリド）およびヒアルロン酸。他の好ましい態様では、コポリマーが小胞または他の分子に付着するための少なくとも１つの反応部位および好ましくは複数の反応部位を有するモノマーを含むコポリマー。
【００６６】
幾つかの態様では、ポリマーは標的化剤、治療部またはＤＴＰＡおよびその誘導体のようなキレート化剤の付着用のヘテロまたはホモ２官能基性結合剤として作用する。
【００６７】
１つの態様では、安定化部は共有結合的方法で小胞と会合している。他の態様では、安定化部は非共有結合的方法で小胞と会合している。標的化部をリポソームに付着させるための共有結合的方法は、当技術分野では公知であり、実施例の項で説明してある。
【００６８】
標的化部とリポソームを付着させる非共有結合的方法には、限定されるものではないが、イオン性、水分子または他の溶媒による仲介を含めた水素結合相互作用、疎水性相互作用またはそれらのいずれかの組合せが含まれる。
【００６９】
好ましい態様では、安定化剤はリポソーム、重合リポソームまたは他の結合担体上に被膜を形成する。
【００７０】
標的化部
「標的化部」という用語は、生物標的に特異的に結合する分子、高分子または分子集合を称する。標的化部の例には、限定されるものではないが、抗体（抗体由来のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびｓｃＦｖのような特異的結合力を保持している抗体断片および他の抗体由来分子）；ホルモンまたは受容体に特異的に結合する他の分子のような受容体結合リガンド；細胞機能に影響を及ぼし、免疫、炎症または造血の反応と関連する細胞間の相互作用を調節するポリペプチドであるサイトカイン；酵素阻害剤のような酵素に結合する分子；核酸リガンドまたはアプタマー；およびビオチンまたはイミノビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジンのような特異的結合相互作用する１つ以上の要素が含まれる。好ましい標的化部は血管細胞で見出だされる受容体または抗原に特異的に結合する分子である。より好ましくは受容体、脈管由来血管形成系または受容体の細胞で見出される抗原または標識、腫瘍性脈管系に関連する抗原または標識に特異的に結合する分子である。腫瘍性脈管系に関連する受容体、抗原または標識は、腫瘍内に位置するか貫通しているか腫瘍の内部または外部周辺に閉じ込められている血管の細胞にて発現できる。１つの態様では、本発明は既存物または腫瘍血管床に以前から存在するもの、または腫瘍血管床からの誘起漏出物を利用する；本態様では、腫瘍細胞抗原も循環で腫瘍間質容量に移動してきた薬剤の直接的な標的とされ得る。
【００７１】
他の標的化部は、内皮受容体、組織或いは体液または受容体を通して接近できる他の標的或いは組織中、近隣の細胞または体液中において上方制御されている他の標的を目標とする。例えば、眼に薬物を送達するようにデザインした担体に付着した標的化部は硝子体、脈絡膜または強膜に注射ができる；または関節に薬物を送達するようにデザインした担体に付着した標的化薬剤は滑液に注射できる。
【００７２】
重合リポソームに付着した標的化部または本発明の結合担体には、限定されるものではないが、炭水化物のような小分子リガンドおよび米国特許第５，７９２，７８３号（小分子リガンドは、本明細書では約１００ダルトン以下の分子量の有機分子として定義され、血管標的または血管細胞標識用のリガンドとして役立つ）で開示されたような化合物で；抗体および成長因子のようなタンパク質；ＲＧＤ−含有ペプチド（例えば、米国特許第５，８６６，５４０号に記載）、ボンベシンまたはガストリン放出ペプチド、米国特許第５，４０３，４８４号に記載されているのようなファージ表示手法で選択したペプチドおよび腫瘍発現受容体に相補的に新規にデザインしたペプチド；抗原決定基；または他の受容体標的化基が含まれる。これらの頭部基は重合リポソームの体内分布、非特異的接着および血液プール中での寿命を調節するのに使用できる。例えば、表面に付着させたβ−Ｄ−ラクトースは図１３に示すように循環血液と接触する肝臓の細胞中で見出されるアシアロ糖タンパク質（ＡＳＧ）を目標とする。糖脂質は標的化部として使用できるように、表４に示すように市販の脂質（ＤＡＧＰＥ）またはＰＥＧ−ＰＤＡアミンをそのイソシアナートと転換し、その後にトリエチレングリコールジアミンスペーサーで処理してアミン末端チオカルバメート脂質を製造し、それを炭水化物リガンドのパラ−イソチオシアノフェニルグルコシドで処理して望む標的化糖脂質を製造した。本合成はリポソームおよびリガンドの内部構造または外殻を形成する脂質と細胞表面の受容体に結合するリガンドの間に間隔を形成する水溶性で柔軟性のあるスペーサー分子を提供し、リガンドが細胞表面にあるタンパク質受容体に容易に接近できるようにする。炭水化物リガンドは還元糖またはパラ−ニトロフェニルグルコシドのようなグリコシドから誘導できるが、広い範囲のそれらは市販で入手できるか化学的或いは酵素的方法を用いて容易に構築することができる。炭水化物リガンドで被覆した重合リポソームは、上記および図１３に示したように適した量の個々の脂質を混合し、超音波処理、押出し成形およびろ過することで製造できる。適切な炭水化物誘導体化重合リポソームは、標的化糖脂質およびＰＤＡ，ＤＡＰＣまたはＤＡＰＥのような賦形用脂質を約１〜３０モルパーセントを有していて、金属キレート化剤脂質でバランスをとる。他の脂質は重合リポソームの中に含まれていてリポソーム形成を保ち、高コントラストおよび再循環を確保する。
【００７３】
幾つかの実施態様では、標的化部はリポソームの目標を細胞表面にする。治療部または造影剤の送達はリポソームの細胞内取り込みで起こさせることができる。そのような送達は当該技術分野では公知である。例えばＭａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ．の抗腫瘍薬物の標的送達用の免疫リポソーム、Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ． Ｒｅｖ． （１９９９） ４０： １０３−２７を参照されたい。
【００７４】
１つの実施態様では、付着は共有方法である。他の実施態様では、付着は非共有方法である。例えば、抗体標的化部は図１４で示したように、ビオチン−アビジンビオチン化抗体サンドイッチで付着できるから、市販のビオチン化抗体が被覆重合リポソームで使用できるようになる。当発明で使用する特異な脈管系標的化薬剤には、（限定されるものではないが）抗ＶＣＡＭ−１抗体（ＶＣＡＭ＝血管細胞接着分子）；抗ＩＣＡＭ−１抗体（ＩＣＡＭ＝細胞間接着分子）；国際特許出願ＷＯ８９／０５１５５およびＣｈｅｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．のＪ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２： １７７０３−１１ （１９８７）に記載されているＬＭ６０９のような抗インテグリン抗体（例えば、α_ｖβ_３インテグリンに対して指向する抗体）；国際特許出願ＷＯ／９８３３９１９およびＷｕ ｅｔ ａｌ．のＰｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５（１１）： ６０３７−４２ （１９９８）に記載されているＶｉｔａｘｉｎ；およびＰ−およびＥ−セレクチン、プレイオトロピン並びにエンドシアリン、エンドグリン、ＶＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体および前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に対して指向する抗体が含まれる。
【００７５】
本発明の１つの態様では、血管標的化治療用薬剤は腫瘍細胞を直接目標とする薬剤と結合する。本態様は、腫瘍を取巻く新脈管系がときに高透過性または「漏出性」であり、血流からの材料が腫瘍周りの間質空間に直接通過させることを利用する。或いは、血管標的化治療用薬剤それ自身が腫瘍脈管系で透過性を誘導する。例えば、薬剤が放射活性治療部を輸送する場合、血管組織に結合してその組織を照射すれば血管上皮の細胞死が次いで起こり、脈管構造の全体性が弱体化する。
【００７６】
従って、１つの態様では血管標的化治療用薬剤は２種の標的化部を有している：血管標識に直接向かう標的化部および腫瘍細胞標識に直接向かう標的化部である。他の態様では、抗腫瘍薬剤は血管標的化治療用と共に投与される。抗腫瘍薬剤は血管標的化治療用薬剤と同時に投与、或いは血管標的化治療用薬剤の投与後に投与することができる。特に、血管標的化治療用薬剤が腫瘍の領域における血管全体性を弱体化することに依存しているならば、抗腫瘍剤の投与は腫瘍脈管系への最大損傷という点で好ましい行為である。
【００７７】
抗腫瘍薬剤はシスプラチンのような従来の抗腫瘍治療薬；抗Ｈｅｒ２／神経鞘抗体（例えば、ヘルセプチン）のような腫瘍標識に対して指向する抗体；または本明細書で血管−標的化治療用薬剤として説明したが脈管系よりは腫瘍細胞を標的とするもののような３部分薬剤でありえる。種々の腫瘍標識に対して指向するモノクローナル抗体の要約は本明細書にその全体が援用される米国特許第６，０９３，３９９号の表１に示してある。一般的に、血管標的化治療用薬剤が腫瘍の領域の血管全体性を弱体化するときは、腫瘍細胞に直接作用する薬剤なら如何なるものでも効果は増進させることができる。
【００７８】
小胞の大きさは、例えば診断および／または治療用途を含んだ特定の使用目的に応じて調整することができる。結合担体の大きさは容易に操作でき、血管標的化治療用薬剤の全体の大きさは、薬剤がその望ましい特性を維持するのに充分な大きさを保持する限り、病変部位において粒子が透過性（「漏出性」）脈管系を通過する最適な通路に適合させることができる。従って、粒子の大きさを望みに応じて３０、５０、１００、１５０、２００、３００または３５０ｎｍにできる。それに加えて、粒子の大きさは透過性脈管系を通り抜けることができない大きさの粒子を最初の投与でさせるように選択でき、次いで透過性脈管系を通り抜けられる大きさの粒子を１回以上追加投与を行う。小胞の大きさは好ましくは直径約３０ナノメートル（ｎｍ）〜約４００ｎｍの範囲がよく、全ての組合せおよび小組合せの範囲はその内である。より好ましくは、小胞は約１０ｎｍ〜約５００ｎｍの直径を有し、より好ましいのは約４０ｎｍ〜約１２０ｎｍの直径である。特別な使用、例えば脈管系の磁気共鳴画像処理を含む血管内での使用では、小胞は直径で約５００ｎｍ以下であるのが好ましく、より小さな小胞が好まれて、例えば小胞は直径で約１００ｎｍ以下が好ましい。これらのより小さな小胞は微小脈管系のような細血管に拡散できる一方、同時に血管チャンネル内では血球が小胞の横を滑らかに通過するのに充分な空間または余地が備わるように工夫されている。
【００７９】
本発明の１つの主なる焦点は、がんを治療するために腫瘍の脈管系に対する血管標的化治療用薬剤の使用であり、一方、本発明の薬剤は血管新生または他の異常な血管成長が病変に伴うか或いは寄与する全ての病気に使用することができる。血管成長に関連する病気には、これに限らないが固体腫瘍；白血病のような血液に生じる腫瘍；腫瘍の転移；血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマおよび血管拡張性肉芽腫のような良性腫瘍；慢性関節リウマチ；乾癬；慢性炎症；例えば糖尿病性網膜症、未熟児の網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生性緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシスのような眼血管系疾患；動静脈先天異常；虚血性肢体血管形成；オスラー−ウエーバー症候群；心筋血管新生；プラーク状血管新生；毛細血管拡張症；血管線維腫および創傷肉芽が含まれる。内皮細胞の過剰または異常刺激の病気には、これに限らないが腸癒着、アテローム性動脈硬化症、再発狭窄症、強皮症および肥厚性瘢痕、即ちケロイドなどが含まれる。
【００８０】
投与媒体、用量および投与経路の違いは薬剤の最適投与用に決定できる；例えば、固体腫瘍を治療するのには腫瘍の部位の近いところへ注射するのが好ましい。これらの病状の治療では、上述のごとく血管標的化治療用薬剤を病変部位の間質性空間に特異的に送達するために病変部位における新生血管の透過性を利用することができる。
【００８１】
治療用組成物
本発明は同様に本発明の治療用薬剤を含む治療用組成物に関する。本発明の組成物は医薬品に許容される添加物、アジュバントおよび／または担体のような他の成分を含むことができる。例えば、本発明の組成物には、治療を受ける動物が耐えられる医薬品添加物を処方することができる。そのような添加物の例には、水、生理的食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、マンニトール、ハンク溶液および他の水溶性生理的平衡塩溶液が含まれる。脂肪油、ゴマ油、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような非水溶性担体もまた使用してよい。他の有用な処方には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのような増粘剤を含有する懸濁液が含まれる。添加剤は同様に等張性および化学安定性を増進する物質のような添加剤を少量含有することができる。緩衝液の例にはリン酸緩衝液、重炭酸緩衝液、トリス緩衝液、ヒスチジン、シトレートおよびグリシンまたはその混合物が含まれ、保存剤の例にはチメロサール、ｍ−またはｏ−クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールが含まれる。標準的処方は、注射できる液体または注射用の懸濁液または溶液として適した液体に溶かすことができる固体のいずれかにできる。そこで、非液体処方では、医薬用添加物はデキストロース、ヒト血清アルブミン、保存剤他を含み、投与の前にそれに滅菌水または生理的食塩水を加えることができる。
【００８２】
本発明の１つの態様では、組成物にはアジュバントまたは担体のような免疫増強剤を含むことができる。アジュバントは、一般的にある特定の抗原に動物の免疫反応を増強する典型的な物質である。適したアジュバントには、限定されるものではないが、フロインドアジュバント；他の細菌性細胞膜成分；アルミニウムに基づく塩類；カルシウムに基づく塩類；シリカ；ポリヌクレオチド；毒素；血清タンパク質；ウイルス被膜タンパク質；他の細菌由来調製物；ガンマインターフェロン；ハンターのチターマックスアジュバント（Ｖａｘｃｅｌ． ＴＭ．， Ｉｎｃ． Ｎｏｒｃｒｏｓｓ， Ｇａ）；リビアジュバント（Ｒｉｂｉ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｍｏｎｔ．から入手可能）およびサポニン並びにＱｕｉｌ Ａの如きそれらの誘導体のようなブロックコポリマーアジュバントが含まれる。担体は処置する動物中で治療用組成物の半減期を増加させる典型的化合物である。適した担体には、これに限らないが重合徐放性処方、生分解性移植体、リポソーム、細菌、ウイルス、油脂、エステルおよびグリコールが含まれる。
【００８３】
本発明の１つの態様は本発明の組成物を動物にゆっくりと放出できるような制御的徐放性処方である。本明細書に用いたように、制御的徐放性処方は徐放性媒体中に本発明の組成物を含む。適している制御的徐放性媒体には、限定されるものではないが、生体適合性ポリマー、他の重合性マトリックス、カプセル、ミクロカプセル、ミクロ粒子、ボーラス製剤、浸透用ポンプ、拡散用手段、リポソーム、リポスフェアーおよび経皮性送達系が含まれる。本発明の他の制御的徐放性処方には、動物に投与するとそのまま固体またはゲルを形成する液体を含む。好ましい制御的徐放性処方は生分解性（即ち、生体内崩壊性である）である。
【００８４】
一般的に、当発明で使用される治療用薬剤は効果量を動物に投与する。一般的に、効果量とは（１）処置する病気の徴候を緩和する、または（２）処置される病気において処置との関わりで薬理的変化を導くかのどちらかで効果的な量である。がんについては、効果量には：腫瘍の大きさの縮小；腫瘍成長の遅延；転移を防止または阻止；または疾患動物の余命延長が含まれる。
【００８５】
治療用薬剤の治療的効果量は、望む効果を起こすのに充分な量または用量、および部分的にはがんの型および部位、患者の体格および容態と共に当業者であれば容易に分かる他の因子に依存する。用量は単回量としてまたは例えば数週間のコースで分割するような数回量として与えることができる。
【００８６】
本発明はまた、本発明の治療用組成物を用いる処置方法に関する。方法はその投与を必要としている被験者への治療用薬剤の投与を含んでいる。
【００８７】
本発明の治療用薬剤は、非経口、局所、経口または、例えば皮内、注射またはエアロゾルなどでの局所投与を含むいずれの適した方法でも投与できる。本発明の好ましい態様では、薬剤は注射で投与される。その注射でいずれの患部にも局所的に投与できる。治療用組成物は、投与方法によって種々な単位用量形状で投与できる。例えば、動物の経口投与に適した単位用量形状には、粉末、錠剤、ピルおよびカプセルが含まれる。本発明の治療用組成物用の好ましい送達方法には静脈注射および例えば注射または局所投与による局所投与が含まれる。送達の特定方式には、本発明の治療用組成物を本発明の添加剤中に処方することができる。本発明の治療用薬剤はいずれの動物、好ましくは哺乳類そしてより好ましくはヒトに投与することができる。
【００８８】
投与の特定な方式は処置する状態によるだろう。本発明の薬剤の投与はいずれかの体液を経由し、いずれの目標或いはいずれの組織へは体液により到達するだろうことを意図している。
【００８９】
本発明の細胞表面標的化治療用薬剤の好ましい投与の経路は、静脈或いはリンパ系への投与を含んだ静脈内、腹腔内および皮下注射である。本発明の主なる焦点は血管標的薬剤であるが、原則として標的薬剤は、例えば滑液、眼液または脊髄液などの他の体液、体組織および体躯腔に存在する標識に焦点を当てて設計することができる。こうして、例えば薬剤は脊髄液に投与でき、そこでは抗体は脊髄液から到達できる病変部位を目標とする。鞘内送達、即ち脊髄および脳を浸している脊髄液への投与は、例えば脳脊髄液（ＣＳＦ）−血液関門の脈絡叢内皮に存在する標的の場合に適している。
【００９０】
体液を介した投与としての処置経路の一例としては、処置すべき病気の１つに慢性関節リウマチがある。本発明の態様では、本発明は慢性関節リウマチで悩んでいる人々の炎症を起こしている滑膜を処置する治療用薬剤を提供する。治療用薬剤のこのタイプは放射線滑膜切除剤である。慢性関節リウマチに罹っている個人は可動関節または滑膜関節の破壊を経験していて、相当な痛みおよび身体上の障害を生ずる。病気はこれらの患者の多くで手（中手指節）、肘、腕、くるぶしおよび肩で発生し、半分以上が冒された膝関節を有している。処置をしないと、関節内層はますます炎症が進み、痛みを生じ、動作を失いそして関節軟骨の破壊が起こる。化学薬剤、外科処置および放射線が炎症性滑膜を攻撃および破壊または除去するのに使われているが全て欠点がある。
【００９１】
放射線滑膜切除剤の濃度は特定の使用で変化するが、満足に放射線滑膜除去を供するには充分量が存在する。例えば、腰部の放射線滑膜切除では薬剤の濃度は手首関節の放射線滑膜切除で使用するより一般的には高い。放射線滑膜切除用組成物は、好ましくは実質的に同位体半減期の２０倍の間関節に残存するように投与するが、より短い滞留でも放射性核種の漏出が少なく、漏出した放射性核種が体から迅速に取除かれるのであれば、より短い時間の滞留でも許容される。
【００９２】
放射線滑膜切除用組成物はそのような手法では通常の遣り方で使用される。例えば、膝関節の処置の場合では適切な放射滑膜切除を供するために膝関節に充分な量の放射線滑膜切除組成物を注入する。使用できる多くの異なる手法があり、処置する関節に応じて適切な手法は変化する。膝関節についての例は、例えばＪ． Ｃ． Ｈａｒｂｅｒｔ， Ｊ． Ｓ． ＲｏｂｅｒｔｓｏｎおよびＫ． Ｄ． ＲｅｉｄによるＮｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｔｈｉｅｍｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， ｐｐ．１７２−３に見出される。
【００９３】
滑膜を経る投与の経路は同様に変形性関節症の処置でも有用である。変形性関節症は、軟骨の破壊で激しい痛みを生じ、冒された関節は使用できなくなる病気である。年齢が１つの強力な危険因子であるが、大きな外傷および繰返しの多い関節使用が更なる危険因子である。病気の主な特徴は関節の薄化、軟骨の軟化、軟骨の潰瘍および骨の摩滅である。標的担体の注入による薬剤の滑液への送達は炎症を抑え、分解性酵素の阻害および痛みが減少することが本発明の本態様で想像できることである。
【００９４】
投与の他の経路は眼液を経るものである。眼において網膜は光感受性組織の薄層で、眼の後側の内部に並んでいる。光が眼に入ると、角膜およびレンズにより網膜上に焦点が合う。網膜はその後に光画像を電気的刺激に変換し、それが視神経を通って脳に送られる。
【００９５】
角膜斑は網膜の非常に小さな領域で、中心視覚および色覚を受け持っている。角膜斑により読んだり、運転したり、細かい仕事を行うことができる。角膜斑の周りは、側視覚および夜視覚を受け持つ辺縁網膜である。角膜の変性は網膜、基礎組織または隣接組織の損傷または分解である。角膜の変性は視覚に鋭敏さの減少および読みおよび細かい「クローズアップ」視覚の減損の主な原因である。加齢関連角膜斑変性（ＡＲＭＤ）は老年における法的盲の最も通常の原因である。
【００９６】
角膜斑変性の最も普通の形状は「乾性」または退行性角膜斑変性と呼ばれ、血管および他の構造または角膜斑領域の網膜の基礎である神経組織の薄化からの結果である。より重度の形状は「湿性」または網膜の滲出性変性と言われる。この形態では、脈絡膜層（網膜の下の層で、網膜に栄養を供給している）の血管が、２つの組織の間にある薄い保護膜を突破している。これらの血管は網膜の下で直接的に制御を受けずに急速に異常成長して漏出、出血が生じ、いつかは網膜に瘢痕組織ができて中心視覚が重度に失われる。この工程を脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）と言う。
【００９７】
ＣＮＶは劣った予後を有する状態である；熱レーザー光凝結を用いた効果的処置は、病変の検出および境界マッピング結果に依存する。血管造影法は傷ついた血管からの漏出を検出するのに使われているが、血管が大きく判然としない床を有し、下方へ突き出して網膜の中まで届き、色素化した上皮と結合できるので、しばしばＣＮＶは従来の血管造影図で示されるより大きい。
【００９８】
血管新生緑内障、眼ヒストプラスマ症候群、近視、糖尿病、翼状片および感染症および炎症を含む他の眼病では、血管新生が視覚喪失を生じる。ヒストプラスマ症候群では、眼背面の内部ライニングの脈絡膜層で一連の現象が起こり、脈絡膜の局所炎症および関係する網膜の機能損失を伴う結果として傷跡並びに盲点の生成となる（暗点）。幾つかの場合、脈絡膜層は刺激を受けて新しい血管を生じるが、それは通常の血管より相当脆い。新しい血管は出血を起こし新たな瘢痕および上にある網膜の機能損失を伴う傾向がある。糖尿病性網膜症は脈絡膜血管より網膜に関わり、出血、血管不規則性および白っぽい滲出物を生じる。網膜の血管新生は最も重度の形態で生じるであろう。眼の脈管系を標的とすると、標的は脈管系のどちらの側面にも存在するだろうことは理解しておくべきである。
【００９９】
本発明の薬剤を眼の組織へ送達するには、静脈内、眼および局所を含む多くの形がありうる。眼局所投与には、本発明の薬剤は水溶性懸濁眼用滴剤のような水溶性眼滴剤、粘性眼用滴剤、水溶液、乳濁液、軟膏などの形状で調製できる。そのような処方の調製に適している添加剤は当業者であれば公知である。眼に対する徐放性送達系の場合、徐放性送達系は瞼の下に滴下したり、結膜、強膜、網膜、眼神経鞘または眼球内か眼窩内へ注入してもよい。眼に薬剤の硝子体内送達は同様に企てた。その様な硝子体内送達法は当業者であれば公知である。送達はＡｖｅｒｙの米国特許第６，２５１，０９０号に記載されているような器具による送達も含んでよい。
【０１００】
更なる態様では、本発明の治療用薬剤は遺伝子治療で有用である。本明細書で用いる語句「遺伝子治療」は関心のある遺伝物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を遺伝的または後天的獲得の病気または容態を処置または防ぐために宿主に移入させることを称する。関心ある遺伝物質は生成物（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは機能性ＲＮＡ）をコードしていて、その生体内での生成物が望んだものである。例えば、関心ある遺伝物質はホルモン、受容体、酵素または治療に価値あるポリペプチドをコードすることができる。ある特定の態様では、対象発明は非ウイルス遺伝子治療に用いる脂質分子の部類を利用し、それは本明細書にその全体が援用されるＨｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．の米国特許第６，１６９，０７８号に記載されているような核酸と複合化でき、そこではジスルフィドリンカーが脂質の極性頭部と親油性尾部基の間に供せられている。
【０１０１】
本発明のこれらの治療用化合物は効果的にＤＮＡと複合化し、ＤＮＡが細胞膜を通過して異種ＤＮＡで形質転換させる細胞の細胞内空隙に移入するのを容易にする。更に、これらの脂質分子は細胞質中の異質ＤＮＡの遊離を容易することにより、ヒトまたは動物における遺伝子治療において遺伝子形質移入を増加させる。
【０１０２】
カチオン性脂質−ポリアニオン性の高分子凝集体は当該技術分野では公知の種々の方法で形成できる。代表的な方法はＦｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．の前出文献；Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．の前出文献；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．の前出文献；Ｂａｎｇｈａｍ， Ａ． ｅｔ ａｌ．のＭｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３： ２３８， １９６５；Ｏｌｓｏｎ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．のＢｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ５５７： ９， １９７９；Ｓｚｏｋａ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．のＰｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７５： ４１９４， １９７８；Ｍａｙｈｅｗ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．のＢｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙ． Ａｃｔａ ７７５： １６９， １９８４；Ｋｉｍ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．のＢｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ７２８： ３３９， １９８３；およびＦｕｋｕｎａｇａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．のＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １１５： ７５７， １９８４で開示されている。一般的に凝集体は、（１）カチオン性脂質または（２）コリピッドと混合したカチオン性脂質のいずれかからなる脂質粒子に、次いでポリアニオン性高分子を室温（約１８から２６℃）で脂質粒子に添加して調製することができる。一般的に、条件は保護基を脱保護に導かないように選ぶ。１つの態様では、混合物は約１０分〜約２０時間にて凝集体とするが、約１５から６０分が都合良く用いられる。他の期間は特有な脂質タイプに適している。複合体はより長い時間をかけて形成してもよいが、形質移入効率を更に高めるにはより長い複合化期間では通常得られないだろう。
【０１０３】
本発明の化合物および方法は、例えばポリヌクレオチドのような望ましい分子を標的細胞に細胞間送達をするのに使用できる。望ましいポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡ或いはその類似体から成り立つ。本発明を用いて送達された望ましいポリヌクレオチドは、例えばプロモーター配列などの制御機能をもつ、またはポリペプチドをコード化したヌクレオチドのように異なる機能または活性を備えたヌクレオチド配列から成り立つことができる。望ましいポリヌクレオチドは、細胞中で他のヌクレオチド配列に対しアンチセンスであるヌクレオチド配列を同じように与える。例えば、望ましいポリヌクレオチドが細胞に転写されると、細胞中では他のヌクレオチド配列にアンチセンスである配列を持つポリヌクレオチドを供することができる。アンチセンス配列はセンス鎖配列と細胞内でハイブリッド形成する。アンチセンス配列を供するポリヌクレオチドは普通の熟練技術者であれば容易に調製できる。細胞に送達された望ましいポリヌクレオチドは細胞中で二重鎖ＤＮＡと三重複合体を形成することができるヌクレオチドを同じように含む。
【０１０４】
画像処理
本発明は医療診断において重要な性質を表示する造影剤に関する。より詳しくは、本発明は、ガドリニウムのような磁気共鳴画像処理コントラスト剤、超音波造影剤またはＴｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｇａ−６７、Ｒｈ−１０５、Ｉ−１２３、Ｎｄ−１４７、Ｐｍ−１５１、Ｓｍ−１５３、Ｇｄ−１５９、Ｔｂ−１６１、Ｅｒ−１７１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８およびＴｌ−２０１のような核造影剤に関する。
【０１０５】
本発明は同じように生体内の異常な症状を診断する方法を提供するが、それは異常な症状に関連する分子を標的とする標的化画像強化重合粒子を複数の異常な症状に接触している体液への導入、異常な症状に関連する分子へ付着する標的化画像強化重合粒子および異常な症状に関与する分子に付着する標的化画像強化重合粒子の生体内での画像処理を含む。
【０１０６】
診断
本発明は更に診断目的用の方法および試薬を提供する。本発明で意図する診断検定法には、これに限らないが受容体結合検定法、抗体検定法、免疫組織化学検定法、フローサイトメトリー検定法、ゲノム科学および核酸検出検定法である。高処理量スクリーニングアレー法および検定法も同様に目論んでいる。
【０１０７】
本発明は生体外検定法用の種々な方法を提供する。例えば、本発明による抗体結合重合リポソームは溶液中の特異な抗原に対する超高感度の診断検定法を提供する。分光学的に明確なイオンにキレート化したキレート化剤頭部を有する本発明の重合リポソームは、リガンドおよび受容体に基づく検定法と共に免疫検定法に高感度を提供する。発蛍光団頭部を有する本発明の重合リポソームは細胞表面にある糖タンパク質を検出する方法を供する。
【０１０８】
診断用検定法で有用なリポソームは本明細書にその全体が援用される米国特許第６，０９０，４０８号に「重合脂質診断剤の利用」という標題で、米国特許第６，１３２，７６４号では「標的重合リポソーム診断および処置薬剤」という標題で記載されている。
【０１０９】
本発明の１つの態様では、標的化重合リポソーム粒子は複数のリポソーム形成脂質の集合体を含み、各々のリポソーム形成脂質はリポソーム形成脂質に２官能性リンカー部分で結合した活性親水性頭部、およびリポソーム形成脂質の複数近接疎水性尾部基の重合性官能基で重合した重合性官能基を有する疎水性尾部基、少なくとも親水基頭部の一部は特異的生物分子に付着するための付着性標的活性物質を有する。他の態様では、標的化重合リポソーム粒子は画像コントラスト強化剤に付着して標的画像強化重合リポソーム粒子を形成するための表面官能基をもつ２つ目の親水性頭部分を有する。更に他の態様では、親水性頭部基の一部は、粒子が付着する特異的生物分子またはその近くの生物部位と相互作用を行う治療薬に付着或いは治療薬をカプセル化する表面官能基を有する。
【０１１０】
本発明は、生体外での異常な症状に関わる分子を標的とする本発明のリポソームの複数を異常な病変に接触している液体へ導入すること、異常な症状に関与する分子に付着する標的重合リポソーム粒子および異常な病変に関わる分子に付着した標的重合リポソーム粒子の生体外での検出を含む、異常な病変を検定する方法を提供する。
【０１１１】
例示的な脂質構築物および使用
重合小胞
実施例１４で説明したように調製したキレート化用重合小胞（ＣＰＶ）は脂質１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル）−ｓｙ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＢｉｓＴ−ＰＣ，６）（図２９）および１〜５モルパーセントのジエチレントリアミントリ酢酸（ＤＴＴＡ）脂質誘導体（５）（図２９）を含有するジアセチレンで、押出し成形およびＵＶ光による重合を行うと、動的光散乱法で測定するとき平均直径６０〜８０ｎｍの粒子が生成した。ジアセチレン脂質はＵＶ光に曝露すると架橋し、交互に炭素−炭素の二重および三重結合からなる高度に共役した主鎖を生じる（Ｄ． Ｓ． Ｊｈｏｎｓｔｏｎ， Ｓ． Ｓａｎｇｈｅｒａ， Ｍ． Ｐｏｎｓ， Ｄ． Ｃｈａｐｍａｎ， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ６０２， ５７−６９ （１９８０））。
【０１１２】
ペプチドおよび抗体の小胞への付着
全てがヒトα_ｖβ_３インテグリンに結合する、ポプチドＧＲＧＳ、げっ歯類抗体ＬＭ６０９（Ｐ． Ｃ． Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９６， １８１５−２２ （１９９５））またはヒト化抗体Ｖｉｔａｘｉｎ（Ｈ． Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５， ６０３７−４２ （１９９８））を、実施例２０および２１に説明したようにＥＤＡＣ化学を用いて重合小胞の表面カルボキシ基に付着させたが、それはタンパク質またはペプチド上に存在するＮ末端アミノ基またはリジンのアミンのような求核基とアミド結合形成を生じる（Ｇ． Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９６））。ＣＰＶに付着した他の抗体にはＬＭ６０９、げっ歯類抗ヒトα_ｖβ_３インテグリン抗体（Ｂｒｏｏｋｓ， １９９５，既出）およびα_ｖインテグリンサブユニットとＫＤＲ或いはＦＫ−１で知られているＶＥＧＦ受容体２を含むマウス内皮タンパク質に対し特異的なラット抗体が含まれる。得られた７５〜１５０ｎｍの結合体は、サイズ排除クロマトグラフィーで非結合抗体またはペプチド類から結合体を完全分離で精製した。
【０１１３】
精製抗体ＣＰＶ結合体上の抗体の存在は実施例２０で説明するようなサンドイッチＥＬＩＳＡで、抗ＣＰＶ結合体を捕らえる抗ヒトＩｇＧ抗体および抗体を検出するＨＲＰ−抗ヒトＩｇＧ抗体結合体を用いて確認した。１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する溶離緩衝液を用いた更なる結合体の精製は、この条件では非共有結合の抗体は小胞に接着しないことから結合が共有結合であることを示した。
【０１１４】
Ｖｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶおよびＧＲＧＤＳペプチド−ＣＰＶの標的化は、フィブリノーゲンへのＭ２１ヒトメラノーマ細胞のα_ｖβ_３インテグリン媒介結合の阻害および実施例２２で説明するように精製α_ｖβ_３インテグリンとの結合検定法により更に示された。イットリウム−９０で標識したＶｉｔａｘｉｎ−およびＧＲＧＤＳペプチド−ＣＰＶは濃度依存の様式で精製インテグリン被覆９６穴プレートと結合した（図Ｘ）。本検定法は、標的である抗体またはペプチドおよびイットリウム−９０が同一の小胞に結合しているときだけシグナルを生じる。Ｖｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶはＭ２１細胞のフィブリノーゲンとの接着を１１μｇ／ｍＬのＩＣ５０で阻害し、これは０．７ｎｍＶｉｔａｘｉｎに相当する。Ｖｉｔａｘｉｎに対するＩＣ５０は２ｎｍで、抗体なしのＣＰＶはフィブリノーゲンへのＭ２１細胞の接着を阻害しない。
【０１１５】
三価金属の小胞への付着
天然由来のイットリウム−８９と共に同位体イットリウム−９０およびインジウム−１１１は、実施例１５で説明した如く脂質５のトリ酢酸ＤＴＴＡ頭部基にキレートすることで重合小胞またはリポソームに付着する。標識効率は９８％より大で、イットリウム−９０についての結合容量は脂質のｍｇ当たり約１０ｍＣｉである。ＣＰＶおよびＶｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶの金属結合容量は差がないので、ＥＤＡＣを用いても抗体およびペプチドを付着するのに用いる条件下でキレート化するＤＴＴＡ基の濃度を著しくは変更しない。イットリウム−９０結合効率に対するｐＨの効果を酢酸塩、ＭＥＳおよびＨＥＰＥＳ緩衝液で試験を行なったが、ｐＨ５〜７ではｐＨ非依存であった。ＣＰＶは同様にインジウム−１１１で標識でき、ガンマ−線放射同位体は通常生体内画像処理研究に使用される。標識効率は、ＣＰＶのｍｇ当たり５０〜５００μＣｉの負荷量レベルでは９０〜９８％であった。高金属結合容量であるので、ＣＰＶは同様にイットリウム−９０およびインジウム−１１１を同時に結合する。ＣＰＶのｍｇ当たり各同位体０．１または１ｍＣｉによる連続的負荷試験は両同位体で９５〜９９％結合であった。
【０１１６】
ＤＴＴＡキレート剤の小胞への特異的標識は、ＣＰＶ−^９０Ｙ複合体を弱いキレート化剤シトレートおよび強いキレート剤ジエチルアミントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）と共にＤＴＴＡ−脂質濃度０．５６〜５６０μＭでインキュベーションして示した。金属複合体は５００ｍＭシトレートの存在下で安定であり、１ｍＭＤＴＰＡの存在下小胞−^９０Ｙ複合体の３０分間インキュベーションでもイットリウムの約９０％は保持された。ＢｉｓＴ−ＰＣからのみ、またはＢｉｓＴ−ＰＣとカルボキシル官能基性の唯一源として５〜３０モルパーセントのスクシニル化ホスファチジルエタノールアミン頭部の両方を含有するもので調製した重合小胞は、シトレートの存在下ではイットリウム−９０とは効率的に結合しない。これらの結果は、安定な小胞−イットリウム複合体の形成にはトリ酢酸頭部によるイットリウム−９０ヘの配位が必要であることを示唆している。
【０１１７】
ＣＰＶ溶液中のＤＴＴＡ頭部の濃度は小胞の表面に存在するときは、著しくは変化しないようにみえる。この結論は２〜２０００倍過剰のＤＴＰＡの存在下におけるＣＰＶ−^９０Ｙの安定性からと同様にキレート化剤脂質の滴定でキレート剤の濃度測定値と濃度計算値が一致することからも得られる。実験は実施例１８および１９で説明したように実施した。これらの滴定実験はＣＰＶに「コールド」イットリウム−８９を添加し、イットリウム−９０同位体の添加および小胞に結合したイットリウム−９０の測定の両方を次に行なった。イットリウム−８９の量を増加するに従って、ＣＰＶ上の結合部位が飽和してイットリウム−９０の結合が阻害される結果、イットリウム−９０の結合が減少する。イットリウム−９０がもはや結合しないイットリウム−８９の濃度がキレート部位の濃度に等しい。あるいは、イットリウム−９０のトレーサー量をイットリウム−８９に加え、過剰のイットリウム−８９を含むこの混合物を小胞に添加して滴定を行う。測定した溶液中に存在するＤＴＴＡ頭部の濃度は計算濃度値と良い一致をした。ＤＴＴＡ−脂質２の１および５モルパーセントを含有するＣＰＶについて、計算濃度０．１１および０．５５ｍＭはＤＴＴＡキレート化剤の濃度測定０．５および０．１ｍＭと良く一致する。
【０１１８】
インテグリン標的化小胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ標的化
イットリウム−９０と効率よく結合しているＶｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶおよびＲＧＤペプチド−ＣＰＶ結合体は、実施例２１で説明した如く生体外での放射測定結合試験法にてα_ｖβ_３インテグリンを標的とする。典型的な検定法では、Ｖｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶ結合体はＣＰＶ結合体のミリグラム当たり０．１〜５ｍＣｉのイットリウム−９０で標識し、この溶液を６，１２，２５および５０μｇ／ｍＬと連続的に希釈した。Ｖｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶ−^９０Ｙ複合体をヒトα_ｖβ_３インテグリンと９６穴プレートでインキュベーションすると、濃度の関数としてシグナル対バックグラウンド比が最大で２７０対１である直線応答のシグナルが生じた。これに加えて、ＣＰＶ溶液に加えたイットリウム−９０の量はこの検定法では観測されたシグナルと直接相関関係がみられる。係数５の定差であるイットリウム−９０の量、０．２、１および５ｍＣｉについて、結合試験で得た相応するシグナルもＶｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶ−^９０Ｙ複合体の６〜６０μｇ／ｍＬにつき係数５．０±０．３で差があった。図３０に図で示したこれらの結果は、生体外ではイットリウム−９０結合が制御可能であることを示し、それ故に生体内で標的ＣＰＶにより送達された用量は効能および毒性を最適化するように制御できるであろう。
【０１１９】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける抗体−ＣＰＶ−同位体の結合体の安定性
血清中での結合体の安定性を評価するために、５モルパーセントのキレート剤５およびＢｉｓＴ−ＰＣ６を含有したＶｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶ−^９０Ｙ複合体を３７℃でウサギ血清中にてインキュベートし、キレート剤５、コレステロールおよび卵ホスホコリン（Ｖｉｔａｘｉｎ―ＣＬ−^９０Ｙ複合体）をモル比５／２８／６７で含有したＶｉｔａｘｉｎ−ＰＣ／コレステロールキレート化リポソームとの比較を放射測定α_ｖβ_３インテグリン結合検定法で比較した。Ｖｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶ結合体はＶｉｔａｘｉｎ−ＣＬ−^９０Ｙ複合体より顕著に安定であった（図３１）。Ｖｉｔａｘｉｎ−ＰＣ／コレステロールリポソームの約０．４時間に対してＶｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶ−^９０Ｙ結合体は血清での半減期が４．８時間であった。脂質５および６を含有するＶｉｔａｘｉｎ−リポソーム−^９０Ｙ結合体は重合しておかないと血清中では安定ではなく、図３１に示すように相当する重合小胞の５分の１のシグナルを与えた。
【０１２０】
イットリウム−９０放射はＶｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶ結合体の免疫活性には影響しない。放射性同位体に曝露されている間における放射標識結合体の免疫活性の損失である放射分解を、標識化Ｖｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶ結合体ｍｇ当たりイットリウム−９０を０．５，１および２ｍＣｉで標識したＶｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶで試験を行った。抗体ミリグラム当たりで計算した相当負荷レベルはＶｉｔａｘｉｎのミリグラム当たりイットリウム−９０は約２０，４０および８０ｍＣｉである。４℃にてｐＨ７．４の５ｍＭシトレートを含有する５０ｍＭヒスチジン緩衝液中でＶｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶ−^９０Ｙ結合体１ｍｇ／ｍＬを６０日間保存した後、結合体をα_ｖβ_３インテグリンによるＥＬＩＳＡで分析し、イットリウム無しの対照または天然由来イットリウム−８９の５０μＭと比較した。全ての複合体はイットリウム無しではＶｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶのＥＬＩＳＡシグナルの９３〜９７％を保持した。５０μＭイットリウム−８９で標識した複合体はイットリウム無しの対照と比較してＥＬＩＳＡ応答で９７％を保持した。図３２で示したこれらの結果は、イットリウムはＶｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶ結合体の免疫反応性に顕著には影響しないことを示唆する。
【０１２１】
ウサギのＶｘ２癌腫の画像処理
α_ｖβ_３インテグリンを目標とするＣＰＶの蓄積はＶｘ２ウサギ癌腫モデルにおいて再現性よく示された。これらの研究では、ＣＰＶ結合体は半減期６７時間のガンマー線放射同位体であるインジュウム−１１１で標識され、大腿部に同じような大きさのＶｘ２腫瘍を持った複数のウサギに投与した。注射直後および８，２４，４８および７２時間後に得た連続的画像は、７２時間後では全身カウントの２２％が腫瘍にあり（図２８Ｂ）、非標的小胞での約３％と比較して顕著に腫瘍に蓄積する（図２８Ａ）ことを示した。インジュウム−１１１が蓄積する他で顕著な部位は肝臓内であった。
【０１２２】
ベータ線放射同位体イットリウム−９０および他の同位体の送達につき、標的ナノスケール放射結合体は新規で有望な薬剤である。これらの結合体は，ジエチレントリアミントリ酢酸（ＤＴＴＡ）頭部を含有する金属キレート化重合小胞（ＣＰＶ）から組み立てる。ＣＰＶはこの頭部を高モルパーセントで含有するので、ＤＴＴＡのカルボキシル基は標的薬剤の結合および金属イオンの結合の両方で使用される。表面カルボキシル基を活性化するために水可溶のカルボジイミドＥＤＡＣを用いた結合化は、ＣＰＶおよびＶｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶの金属結合容量に差が無いのでイットリウム結合には顕著な効果はない。標的ＣＰＶへのイットリウムの付着は室温でＣＰＶへ同位体を加えるとできて、効率は９８％より大きい。そこで、ＣＰＶ−９０Ｙ複合体からの未結合同位体の精製は必要ではない。これらの薬剤は同じようにインジウム−１１１で標識でき、標的部位への到達を観測できる可能性がある。
【０１２３】
ＣＰＶは高い金属イオン結合容量を有する。５モルパーセントの脂質を含有する粒子について、大きさで６０〜１５０ｎｍの範囲の粒子は、ＤＴＴＡ頭部基の表面積は１，２−ジステアロイルホスファチジルコリンにつき報告されている（Ｐ．Ｂａｌｇａｖｙ ｅｔ ａｌ．のＢｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １５１２， ４０−５２ （２００１））６５Å^２と同じであると仮定した計算に基づくと、約１６００〜９０００ＤＴＴＡ−脂質分子を含有する。小胞のミリグラム当たり２５μｇの抗体にて調製した抗体−ＣＰＶ結合体は反応収率を４０〜９０％として小胞当たり平均約２〜５個の抗体を含有する。
【０１２４】
腫瘍脈管系の内皮にて上方制御されているタンパク質を高分子の目標とする治療は、標的は容易に近づきやすいが、固体腫瘍における間質圧力は高く拡散速度が低いので標的化腫瘍細胞を目標とするのは難しい（Ｒ． Ｋ． Ｊａｉｎ， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ４６， １４９−６８ （２００１））。高分子の目標を内皮標識とするために、インテグリン結合ペプチドＧＲＧＤＳまたはヒト化抗体Ｖｔａｘｉｎを用いてα_ｖβ_３インテグリンを標的とする小胞を調製した。かくして、生体外−標的化は小分子および異なる抗体の両方をＣＰＶに付着させることで達成される。
【０１２５】
Ｖｉｔａｘｉｎ―ＣＰＶの免疫反応性は、精製α_ｖβ_３インテグリンによるＥＬＩＳＡではＶｉｔａｘｉｎと比べてやや影響を受けた。同一の抗体濃度でＶｉｔａｘｉｎに比べＶｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶ結合体は２〜６分の１のシグナルを与えた。しかしながら、この検定法は親和性の測定はしないので、シグナルでの減少は結合動力学またはこの検定法における結合要素、即ち抗体のインテグリン認識部位および抗体のＦｃ領域の一つ或いは両方のいずれかで損傷を受けた結合における緩やかな変化の結果であろう。
【０１２６】
Ｖｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶまたはＧＲＧＤＳ−ＣＰＶは生体外でのα_ｖβ_３インテグリンを標的にする。精製α_ｖβ_３インテグリンへの結合に加えて、これらの結合体はフィブロネクチンの精製α_ｖβ_３インテグリンへの結合と共にＭ２１メラノーマ細胞のフィブリノーゲンへの結合を阻害する。これらの結果は、インテグリン−標的ＣＰＶが受容体のその天然基質への結合を阻害し、これらの結合体は精製インテグリンおよび細胞インテグリンの両方を認識することを示す。
【０１２７】
イッテリウム−９０で標識したＶｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶまたはＧＲＧＤＳ−ＣＰＶは同様に生体内でインテグリン標的に結合する。精製α_ｖβ_３インテグリンへの結合は緩衝溶液およびウサギとヒト血清の両方の存在下で達成されることは生体外での標的への結合を血清が著しく妨害しないことで、生体内での標的化の可能性を示した。小胞ｍｇ当たり０．２，１および５ｍＣｉの^９０Ｙで標識したＶｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶは、精製α_ｖβ_３インテグリンへの放射測定結合試験においてシグナルに期待された増加が起こり、イットリウム−９０結合は生体外で制御可能であることを示した。そこで、生体内での標的ＣＰＶにより送達される用量を、効能および毒性において最適化するように制御できる。
【０１２８】
ＣＰＶはイットリウム−９０および血清の存在下で安定である。Ｖｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶ−^９０Ｙ複合体は、脂質のｍｇ当たり０．５〜２ｍＣｉ、抗体ｍｇ当たり２０〜８０ｍＣｉに相当する量レベルにおける放射分解の結果、免疫反応性の顕著な損失は示さない。それとは反対に、抗体−^９０Ｙ複合体についての免疫反応性は７２時間での抗体ｍｇ当たり４ｍＣｉの負荷量レベルにおいては７２％減少したと報告された（Ｑ． Ａ． Ｓａｌａｋｏ， Ｒ． Ｔ． Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ， Ｓ． Ｊ． ＤｅＮａｒｄｏ， Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ３９， ６６７−７０ （１９９８））。ウサギ血清では、Ｖｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶ−^９０Ｙ複合体およびＧＲＧＤＳ−ＣＰＶ−^９０Ｙ複合体の両方は約２６０分の半減期を持ち、それはＶｉｔａｘｉｎ並びにステロイルに基づくホスファチジルコリン、コレステロールおよびＤＴＴＡ−キレート剤である１，２−ジミリストイル−ｓｙ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミドトリアミンテトラ酢酸からなるＶｉｔａｘｉｎ−リポソーム結合体の半減期より約１０倍長い。キレート剤５を用いて調製した同じような小胞は同一条件ではおなじように低い安定性をしめした。安定性は小胞、Ｖｉｔａｘｉｎ−小胞複合体および小胞−^９０Ｙ複合体の安定性と関連する。サイズ排除クロマトグラフィーによる小胞−^９０Ｙ複合体のウサギ血清中での安定性の試験は、シグナル損失は主に小胞からのイットリウムの解離の結果であった。イットリウムの複合体からの解離は、ホスファチジルエタノールアミンリサミンローダミンＢ脂質を含有して調製した小胞は同一条件において血清中でそのままであることから、小胞の不安定性とは関連していないようである。この結論は小胞が血清中でもそのままで残ることを示した^１４Ｃ標識脂質での研究で更に支持されている（Ｑ． Ｆ． Ａｈｋｏｎｇ， Ｃ． Ｔｉｌｃｏｃｋ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｒａｄ． Ａｐｐｌ． Ｉｎｓｔｒｕｍ． Ｂ１９， ８３１−４０ （１９９２））。
【０１２９】
実施例
実施例１
異なる保護をされた分岐ポリリジン高分子結合担体の合成
リジン−ｔ−ブチルエステルは、市販のリジン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ）およびイソブチレンから、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ａｎｄ ＢｏｄａｎｓｚｋｙがＴｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， １９８４， ｐｐ．４８〜４９に記載した手順で容易に合成される。Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｎ−ε−Ｆｍｏｃ−リジンＯ−Ｐｆｐエステル（Ｎ−α，ε，−ジ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リジンペンタフルオロフェニルエステル、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を、リジンｔ−ブチルエステルと反応させてＮ−α−（Ｎ’−α−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−ε−Ｆｍｏｃ−リジル）−Ｎ−ε−（Ｎ”−α−Ｆｍｏｃ−Ｎ”−ε−Ｆｍｏｃ−リジル）リジンｔ−ブチルエステルを作製する。更なる分岐を望むなら、Ｆｍｏｃ基をピペリジンで除去し、得られる脱保護アミンを再びＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｎ−ε−Ｆｍｏｃ−リジンＯ−Ｐｆｐエステルと反応させる；この工程はリジン部分のアミノ基からの分岐が望ましいレベルに達するまで繰り返す。
【０１３０】
カルボキシル基での分岐はＮ−α−Ｆｍｏｃ−グルタミン酸α−，γ−ｔ−ブチルエステルまたはＮ−α−Ｆｍｏｃ−アスパラギン酸α−，β−ｔ−ブチルエステルを用いることにより容易に達成される。ジ−ｔ−ブチルエステルは、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨまたはＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）およびイソブチレンから、上記リジンのエステル化方法を用いて容易に調製される。その後Ｆｍｏｃ基をアミノ酸から除去すると（グルタメート誘導体では）グルタミン酸α−，γ−ｔ−ブチルエステルを生じる。分岐リジンのｔ−ブチル基は９５％トリフルオロ酢酸を用いて除去する。グルタミン酸α−，γ−ｔ−ブチルエステルのアミノ基を、ジイソプロピルカルボジイミドおよび１−ヒドロキシベンゾトリアゾール活性化化学を用いて分岐リジンの遊離カルボン酸と縮合させる。カルボキシル基での更なる分岐が望まれるのであれば、９５％ＴＦＡ脱保護およびカップリングのサイクルを繰り返すことができる。
【０１３１】
得られる分岐リジン／グルタメート高分子はＦｍｏｃ保護アミノ基を含有するが、それは選択的にピペリジンで脱保護することができ、そしてｔ−ブチル保護カルボキシル基は、９５％トリフルオロ酢酸により選択的に脱保護できる。これら異なる保護をされた基は、分子のある特定の位置で治療部を、他の特定の位置で標的化部を付着するのに用いることができる。
【０１３２】
実施例２
ポリ（Ｇｌｕ−Ｌｙｓ）ポリマーの合成
結合担体として使用するのに好適な他のポリペプチドポリマーは、ポリ（グルタミン酸−リジン）（ポリ（グルタミル−リジン）またはポリ（ＥＫ））である。Ｎ−α−Ｆｍｏｃグルタミン酸ｙ−ベンジルエステル（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ）とＮ−ε−ＣＢＺリジンｔ−ブチルエステル（Ｈ−Ｌｙｓ（Ｚ）−ｔＢｕ）（両試薬ともＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡから市販されている）を、ジイソプロピルカルボジイミドおよび１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いて連結させる。得られるジペプチドであるＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｌｙｓ（Ｚ）−ｔＢｕはピペリジン、ついで９５％トリフルオロ酢酸により脱保護することができ、Ｈ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＨを生ずる。その後ジペプチド単位はカルボジイミドにより、または他の縮合法で事由に重合し、種々の鎖長の混合物を生成できる。あるいは、規定の長さを望む場合は、アミノ末端をピペリジンで脱保護することによりＨ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯｔＢｕを与え、カルボキシル末端を９５％トリフルオロ酢酸で脱保護することによりＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＨを与えると、２つのジペプチドをカルボジイミドにより縮合させることが可能となり、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯｔＢｕを与える。このサイクルの繰り返しにより、規定の長さのポリ（Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｌｙｓ（Ｚ））を与えることができる。ランダムポリマーまたは規定の長さのポリマーのどちらであっても、グルタミン酸上のベンジル保護基およびリジン上のＣＢＺ保護基を、Ｈ_２／Ｐｄまたは液体ＨＦ若しくはトリフルオロメタンスルホン酸のような強酸のいずれかを用いて同時に除去することができる。これにより、遊離アミノ基および遊離カルボキシル基の両方を、標的化部分および治療用部分を付着させる際に有用に使用できるようにする。遊離アミノ基は、カルボキシレート基の誘導体化において反応を防止するために、ペプチド化学の分野における標準的方法を用いて、Ｂｏｃ、ＢｐｏｃまたはＦｍｏｃ基で再保護することができる。
【０１３３】
実施例３
キレート化剤脂質および重合リポソームＩの調製
Ｇｄ^＋３およびＰＤＡ頭部を有する重合性脂質を、６６０ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２中でペンタコサジイン酸（ＰＤＡ， Ｌａｎｃａｓｔｅｒ；１０．０ｇ、２６．７ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ， Ａｌｄｒｉｃｈ；５．００ｇ、４３．４ｍｍｏｌ）および塩酸１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＡＣ， Ａｌｄｒｉｃｈ；６．０１ｇ、３１．３ｍｍｏｌ）を室温で攪拌することにより、スクシンイミジルエステルを初めに調製することによって合成し、遮光した。反応に伴って薄層クロマトグラフィー（ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ、８／１）を行い、約５時間で反応が完了したと判断した。溶液を水、１％ＨＣｌ、飽和重炭酸ナトリウムおよび塩水で洗浄した。その後有機相をＭｇＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、そして減圧下で濃縮すると、Ｎ−スクシンイミジル−１０，１２−ペンタコサジイン酸エステルが僅かに黄色の固体として得られた（１０．８４ｇ；２３．０ｍｍｏｌ；８６％）。
【０１３４】
スクシンイミジルエステルをＣＨ_２Ｃｌ_２（２５０ｍｌ）に溶解し、その後１，１１−ジアミノ−３，６，９−トリオキシウンデカン（９．１３ｇ、６１．６ｍｍｏｌ；Ｔｅｘａｃｏ）の攪拌ＣＨ_２Ｃｌ_２（１１０ｍｌ）溶液中に緩やかに１６時間かけて室温で１滴ずつ添加し、遮光した。得られた溶液を濃厚なスラリーになるまで濃縮し、ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ（１／０から８／１）の傾斜溶離法を用いたシリカゲルによるクロマトグラフィーを行った。均一画分を集め、減圧下で蒸発させると、所望の脂質である（１’−Ｎ−，１１’−アミノ−３’， ６’−ジオキシウンデカノイル）−１０，１２−ペンタコサジインアミドを、白色固体として得た（４．４０ｇ；３８．１％）。この生成物は、純粋な場合固体状態で自然発生的に重合するので注意して取扱わねばならない。４℃の溶液ではより安定であるが、調製後はできるだけ早く使用すべきである。
【０１３５】
上で調製したアミノアミド（４．４０ｇ；８．７８ｍｍｏｌ）およびＤＴＰＡ（１．５６ｇ：４．３７ｍｍｏｌ）をピリジン（２５ｍｌ）中で一晩攪拌し、遮光した。溶媒を蒸発させ、メタノールと共に２回蒸発乾固させた残留物は、ピリジンが無くなって油状となった。残留物をアセトンに溶解し、生成物を４℃で一晩保存して溶液から沈殿させた。ろ過することにより、所望のキレート化剤脂質である、ビス−Ｎ−［２−エチル−Ｎ’−カルボキシメチル，Ｎ’―カルボキシメチル（１’−Ｎ’’’， １１’−Ｎ’’’’−３’，６’−ジオキシウンデカノイル）アミド−１”，１２”―ペンタコサジインアミド］−グリシンが白色の非晶性粉末として生じた（３．３０ｇ；５５％）。更なる精製はメタノールからの結晶化で達成することができる（４０ｍｇ／ｍｌ；融点１２８．５〜１２９．５℃（分解））。
【０１３６】
上記のように調製したキレート化剤脂質を、メタノール中でＧｄＣｌ_３・６Ｈ_２ＯまたはＤｙＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ（０．９５〜０．９８当量）とともに加熱した。溶媒を蒸発させ、残留物をメタノールと共に蒸発させて、生成したＨＣｌの痕跡を全て除去した。得られたランタニドキレート脂質、ビス−Ｎ−［２−エチル−Ｎ’−カルボキシメチル，Ｎ’―カルボキシメチル（１’−Ｎ’’’，１１’−Ｎ’’’’−３’，６’−ジオキシウンデカノイル）アミド−１’’，１２’’―ペンタコサジインアミド］−グリシン−ランタニド、ガドリニウムまたはジスプロシウム複合体は、その後４℃でメタノール性溶液として保存し遮光した。合成したキレートの正体はＦＡＢ−ＭＳで確認した。
【０１３７】
常磁性重合脂質を、上記で調製した常磁性重合性脂質とジ−トリコサジイノイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を１：９モル比で有機溶媒メタノールおよびクロロホルム（１／３）中で混合し、溶媒を蒸発させ、蒸留水で再水和させて３０ｍＭジアセチレン（１５ｍＭ全脂質）を作製した。出力２　１／２単位に設定した４５０Ｗプローブチップ型超音波処理器（Ｖｉｒｓｏｎｉｃ ４７５， Ｖｉｒｔｉｓ Ｃｏｒｐ．， Ｇａｒｄｉｎｅｒ， Ｎ．Ｙ．）にて３０から６０分間、温度制御せずに超音波処理した後、脂質凝集体の懸濁液をサーモバレル押出し成形機（Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ， Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ， ＢＣ）を用いて、５６℃にて孔径０．１μｍの２枚のポリカーボネートフィルター（Ｐｏｒｅｔｉｃｓ， Ｌｉｖｅｍｏｒｅ， ＣＡ）を通して１０回押し出した。この溶液をペトリ皿上に湿った半融解氷状で薄く広げ、揺り動かしながら溶液上１ｃｍから２２００μワット／ｃｍ^２ＵＶランプで照射した。溶液は、ＤＡＰＣを用いると１時間照射過程にて、ポリマーの共役エン−イン系による可視光の吸収によりオレンジ色に変色した。常磁性重合リポソームは０．２μｍ滅菌フィルターを容易に通過し、使用まで溶液中で保存した。この方法で調製した常磁性重合脂質懸濁液は４℃で数週間安定であることが判明した。
【０１３８】
常磁性重合リポソームの大きさおよび形状は透過型電子顕微鏡および原子力顕微鏡で確認された。それらは短径が膜孔と似かよっており、長径は約５０パーセント大きい長楕円形である。
【０１３９】
実施例４
キレート化剤脂質および重合リポソームＩＩの調製
ＤＡＰＣを用いる代わりにペンタコサジイン酸（ＰＤＡ）を充填剤脂質として使用する他は実施例３の手順に従った。溶液は１時間照射過程で青色になった。得られた重合リポソームは実施例３で報告したのと同様の一般的特性を有していた。
【０１４０】
実施例５
抗体結合重合リポソームＩ
特定の免疫グロブリンに対する抗体である抗ヤギγ−ＩｇＧを重合リポソームに結合させてｉｎ ｖｉｔｒｏでの診断応用に用いる抗体結合重合リポソームを形成した。
【０１４１】
脂質成分：６０％ペンタコサジイン酸充填剤脂質、２９．５％キレート化剤脂質、１０％アミン末端脂質および０．５％ビオチン化脂質を、指示量で混ぜ合わせ、溶媒を蒸発させた。水を加えてアシル鎖が３０ｍＭの溶液を得た。その後、脂質／水混合物を少なくとも１時間超音波処理した。超音波処理の間、溶液のｐＨをＮａＯＨで７〜８の間に維持し、温度は超音波処理により生じる熱でゲル−液晶相転移点より上に維持した。リポソームを湿潤氷床の上に置いたペトリ皿に移し、少なくとも１時間２５４ｎｍで照射して重合させた。重合リポソームを、０．２μフィルターに通した後回収した。抗体結合重合リポソームを形成するために、アビジン２．３μｇをビオチン化抗体１４．９μｇとリン酸緩衝生理食塩水中で約１：３モル比で混ぜ合わせ、室温で１５分間インキュベートした。この溶液を上で形成した重合リポソーム１５０μＬと混ぜ合わせ、４℃で一晩インキュベートして抗体結合重合リポソームを形成させた。４０μｌアリコット中の全抗体結合重合リポソーム数は、光散乱、並びに粒子とタンパク質の大きさおよび調製に用いた脂質量に基づく理論計算により測定すると、約１．４×１０^１１個であることが判明した。抗体結合重合リポソームをＣｏｕｌｔｅｒ Ｎ４＋サブミクロン粒子分析計を用いた光子相関分光分析で分析すると、平均直径は２６２ｎｍであることが示された。その後凝集性抗体であるヤギＩｇＧ９．６μｇを上で調製した抗ヤギγ−ＩｇＧ結合重合リポソームの４０μｌアリコットに加え、約１時間インキュベートした。このインキュベーション後、抗体結合重合リポソームの５３％が凝集していたことは、光子相関分光分析で測定したとき１１４５ｎｍの平均直径を有する新たな粒子群の出現により示された。これにより抗体結合重合リポソームは溶液中での特異な抗原の存在に関する簡便で高感度なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを提供する。
【０１４２】
実施例６
キレート化剤脂質および重合リポソームＩＩＩの調製
ＤＴＰＡキレート剤頭部を含有する脂質は、本明細書にその全体を援用するＳｔｏｒｒｓ ｅｔ ａｌ．， ”Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｄ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ： Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ”， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． （１９９５） １１７ （２８）： ７３０１−７３０６の７３０５〜７３０６頁間の節に、化合物４および１ｂに関して記載されているように構築され、Ｅｕ^＋３イオンへキレート化され、１％のレベルで重合リポソームを形成させた。分光学的に異なるイオンに対する種々の好適なキレート剤は当該技術分野に公知であり、例えば米国特許第４，２５９，３１３号；第４，８５９，７７７号；第４，８０１，５０４号；第４，７８４，９１２号；および第４，８０１，７２２号に記載されている。ユーロピウム標識重合リポソームを連続的に緩衝液で希釈し、時間分解蛍光分光分析を用いて検出したところ、ＥＬＩＳＡに基づく系ではＥｕ^＋３標識重合リポソームの濃度が１０^−２１モルまで検出できた。
【０１４３】
実施例７
重合リポソームＩＶの調製
ペンタコサジイン酸に基づく重合リポソームは負電荷を有するように構築した。検出には外因性蛍光プローブは使用せず、重合リポソーム固有の蛍光である５３０〜６８０ｎｍの発光のみに依拠した。重合リポソームは、荷電部に結合するタンパク質であるＰ−セレクチンを発現する内皮細胞と共にインキュベートし、その後フローサイトメトリーを用いて分析した。フローサイトメトリーは内皮細胞に接着する重合リポソームを検出した。
【０１４４】
実施例８
重合リポソームＶの調製
例えばＴｅｘａｓ Ｒｅｄのようなフルオロフォア頭部を含有する脂質を構築した。好適な脂質は、例えばＰＤＡ（ＰＥＧ）_３−ＮＨ_２／カルボン酸およびヒドラジン誘導体であり、好適なフルオロフォア頭部は例えばＴｅｘａｓ ＲｅｄおよびＦＩＴＣである。この材料を重合リポソームに０．５％のレベルで導入した。Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ塩化スルホニル２００μｇのアセトニトリル溶液を、ｐＨ９の０．０１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液中アシル鎖で３０ｍＭの重合リポソーム６００μｌに加え、室温で２時間反応させた。その後標識重合リポソームを、溶離液としてＰＢＳを用いたゲルろ過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５， Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）で精製した。そして抗ＩＣＡＭ−１抗体を実施例４で説明したのと同じ方法でＴｅｘａｓ Ｒｅｄ標識重合リポソームに付着させ、ＩＣＡＭ−１を発現している活性化内皮細胞と共にインキュベートし、蛍光顕微鏡を用いて解析した。このアプローチを用いると、１０^５〜１０^６のＴｅｘａｓ Ｒｅｄ分子を各抗体に連結させることができ、アッセイの感度が飛躍的に向上する。抗体結合重合リポソームが活性化内皮に結合しているのを容易に見ることができ、細胞表面の糖タンパク質をアッセイするための方法論が簡単になる。
【０１４５】
実施例９
抗体結合重合リポソームＩＩ
モノクローナル抗体を常磁性重合リポソームに結合させるために、ビオチン化脂質を含有する常磁性重合リポソームを構築した。そしてビオチン結合タンパク質であるアビジンを用いて、粒子表面上のビオチンとビオチン化抗体とを架橋した。あるいは、アニオン性重合リポソーム粒子を構築して、アビジンのようなカチオン性タンパク質に結合した抗体を粒子上で交換してもよい。
【０１４６】
脂質成分：６０％ペンタコサジイン酸充填剤脂質、２９．５％Ｇｄ^＋３キレート化剤脂質、１０％アミン末端脂質および０．５％ビオチン化脂質を、指示量で混ぜ合わせ、溶媒を蒸発させた。水を加えてアシル鎖が３０ｍＭの溶液を得た。その後、脂質／水混合物を少なくとも１時間超音波処理した。超音波処理の間、溶液のｐＨはＮａＯＨで７〜８の間に維持し、温度は超音波処理により発生する熱でゲル−液晶相転移点より上に維持した。リポソームを湿潤氷床の上に置いたペトリ皿に移し、２５４ｎｍのＵＶで少なくとも１時間照射して重合させた。常磁性重合リポソームを、０．２μｍフィルターを通した後回収した。得られた常磁性重合リポソームは暗青色で、５４４ｎｍ、５８８ｎｍおよび６３８ｎｍ（λ_ｍａｘ）で吸収バンドを示した。緩和な加熱により常磁性重合リポソームは４９８ｎｍおよび５３８ｎｍに吸収極大を有する赤色に変化した。本研究で使用した全ての常磁性重合リポソームは赤色の形状に転換させた。
【０１４７】
抗体結合常磁性重合リポソームを形成させるために、リン酸緩衝生理食塩水中でアビジン２．３μｇをビオチン化抗体１４．９μｇと約１：３モル比で混ぜ合わせ、室温で１５分間インキュベートした。この溶液を上で形成したアシル鎖で５．６ｍＭの常磁性重合リポソーム１５０μＬと混ぜ合わせて、４℃で一晩インキュベートすると、抗細胞接着分子抗体−アビジンとビオチン化重合リポソームとの結合体が形成した。
【０１４８】
図１７は、上述のように形成した抗体結合常磁性重合リポソーム（ＡＣＰＬ）の概略を示す。
【０１４９】
実施例１０
抗体結合重合リポソームＩＩＩ
実施例９で調製したようなビオチン化常磁性重合リポソームへのモノクローナル抗体の付着をゲル電気泳動および免疫検出法を用いて確認した。
【０１５０】
ゲル電気泳動については、試料を非変性条件下、泳動バッファーに２５ｍＭトリス、１９０ｍＭグリシン、ｐＨ７．５を用いて０．６５％アガロースゲルで泳導した。ゲルを４５％メタノールおよび１０％酢酸の溶液中で１５分間固定し、水で一晩リンスし、１％のウサギ正常血清中で室温で２時間インキュベートし、アビジン（Ｓｉｇｍａ）またはγ−免疫グロブリン（Ｖｉｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）に対するアルカリホスファターゼ結合抗体の１：１０００ＰＢＳ希釈液と共に４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳを数回交換しながらリンスした後、ゲルは、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍトリス、５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ９．５中、酵素基質である５−ブロモ４−クロロ３−インドリルリン酸０．１６ｍｇ／ｍｌおよびニトロブルーテトラゾリウム０．３２ｍｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）中で、ゲルが適当に現像されるまで室温でインキュベートした。反応を１ｍＭ ＥＤＴＡでリンスすることにより停止させた。常磁性重合リポソームは発色団を含有しているので、染色せずに可視化された。
【０１５１】
抗アビジンアルカリホスファターゼを用いた図１８のゲル電気泳動は、レーン１において、０．５μｇアビジンが濃く染色されることを示した。これは見かけ上の等電点でローディングウェルからゆっくり移動したものである。レーン２は常磁性重合リポソームの５μＬ試料が分離したバンドとして陽極方向へ移動したことを示した。約１：３モル比のアビジン４μｇおよび非ビオチン化抗ＣＡＭ抗体２６．２５μｇを、全量６０．５μＬのＰＢＳ中において４℃で４８時間インキュベートした。この溶液の３．２μＬアリコットを１６μＬの常磁性重合リポソームに添加し、約１週間４℃でインキュベートした。上で調製した、常磁性重合リポソームをアビジンおよび非ビオチン化抗ＣＡＭ抗体とプレインキュベートしたものの５μＬ試料は、レーン３において、アビジンがリポソームのバンドと共に移動することを示した。これはアビジンが常磁性重合リポソームの表面に結合していることを示している。遊離のアビジンはウェル付近には検出されなかった。抗体結合常磁性重合リポソームは、ビオチン化抗ＣＡＭ抗体を用いた以外は上記方法で調製し、抗体とアビジン−常磁性重合リポソーム複合体との結合により抗体結合常磁性重合リポソームが形成された。ビオチン化抗ＣＡＭ抗体結合重合リポソームの５μＬ試料は、レーン４において、遊離のアビジンが検出されないことを示した。これはアビジンが常磁性重合リポソームに結合していることを示している。しかしながら、アビジンバンドがリポソームとともに見られないのは、抗体の粒子表面への結合が、抗アビジンアルカリホスファターゼ免疫検出抗体の複合体への結合を妨害していることを示唆している。
【０１５２】
常磁性重合リポソームへの抗体結合を評価する抗体結合抗ＩｇＧアルカリホスファターゼによる免疫検出に関し、常磁性重合リポソーム調製および抗体／アビジンインキュベーションを、抗アビジンアルカリホスファターゼ免疫検出に対して上述したように実施した。図１９はレーン１においてビオチン化抗ＣＡＭ抗体の２．５μｇアリコットが陰極へ明確なバンドとして移動するのを示す。上述の常磁性重合リポソームの５μＬ試料は、レーン２において、内因性発色団により可視化された陽極への移動を示した。アビジンおよび非ビオチン化抗体とプレインキュベートした常磁性重合リポソームの５μＬ試料は、全量２．２μｇの抗体を含むが、レーン３において遊離の抗体バンドを示した。これは、非ビオチン化抗体がアビジン−常磁性重合リポソーム複合体と結合しないことを示している。アビジンおよびビオチン化抗体とプレインキュベートした常磁性重合リポソームの５μＬ試料は、全量２．２μｇの抗体を含むが、レーン４において遊離の抗体バンドが検出されないことを示した。これは、ビオチン化抗体のアビジン常磁性重合リポソームとの結合が抗体結合常磁性重合リポソームを形成したことを示している。
【０１５３】
本実施例は、抗体結合常磁性重合リポソームが競合的ＥＬＩＳＡアッセイにおいて機能を果たすことを示す。可溶性ＩＣＡＭ−１で被覆したＥＬＩＳＡプレート上でインキュベートした抗ＩＣＡＭ−１抗体結合常磁性重合リポソームは、遊離のモノクローナル抗ＩＣＡＭ−１抗体の結合を阻害することを示した。
【０１５４】
実施例１１
蛍光タグ抗体結合常磁性重合リポソームを用いた細胞結合検定法
蛍光タグした抗体結合常磁性重合リポソームを用いた細胞結合検定法を行って、抗ＩＣＡＭ−１抗体結合常磁性重合リポソームが生体外では抗原を認識できることを示した。実施例９で調製した常磁性重合リポソームをＴｅｘａｓ Ｒｅｄ発蛍光団（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と結合させた。アセトン中の２００μｇのＴｅｘａｓ Ｒｅｄ塩化スルホニルを、ｐＨ９の０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液中のアシル鎖が３０ｍＭの常磁性重合リポソーム６００μｇに加え、室温で２時間反応した。標識常磁性重合リポソームをそれからＰＢＳを溶離液としたゲルろ過（ＳｈｅｐｈａｄｅｘＧ−２５１　Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で精製した。蛍光常磁性重合リポソームはそれから前実施例で説明したような抗ＩＣＡＭ−１抗体に結合させた。
【０１５５】
内皮細胞であるｂＥｎｄ３を１００ｍｍのプラスチック製ペトリ皿に播種し、コンフルエントまで生育させた。ＩＣＡＭ−１の発現を誘発するのに使用する２４〜４８時間前に、細胞を１μｇ／ｍｌの細菌性リポ多糖で約２４〜４８時間刺激した。構成的に低いレベルでのみ接着分子を発現する非刺激細胞を対照として使用した。培地は細胞から吸引し、プレートはＨａｎｋ’平衡塩溶液で３０分間洗浄し、ＰＢＳで３回洗い、それから１ｃｍ^２穴に分割した。穴は室温にて約３時間ＰＢＳ中で０．５％ウシ血清アルブミンと前インキュベートし、次いで抗体結合常磁性重合リポソームの１：１００および１：１０００希釈液の各５０μｌを加えて穴をカバーした。抗体結合常磁性重合リポソームを細胞と２時間室温でインキュベートとし、その後０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳで５分間２回、ＰＢＳで４分間４回洗浄した。蛍光顕微鏡を用いると、蛍光タグ抗ＩＡＭ−１抗体結合常磁性重合リポソームが、細菌性リポ多糖でＩＣＡＭ−１発現を誘発するように刺激した培養内皮細胞に結合しているのが見られ、図２０で示すように各細胞膜の形態の輪郭を描いていた。この結合は図２１に図で示した。非特異的抗免疫グロブリン抗体を抗ＩＣＡＭ−１に置換すると、蛍光抗体結合常磁性重合リポソームは刺激された細胞には結合しないことが観察された。
【０１５６】
同様に、ＩＣＡＭ−１の低レベルのみ発現する非刺激の細胞は抗ＩＣＡＭ−１蛍光性抗体結合常磁性重合リポソームを結合しない。
【０１５７】
実施例１２
抗結合常磁性重合リポソームによる生体外での内皮ＣＡＭｓの標的化
抗結合常磁性重合リポソームが、生体内で内皮ＣＡＭｓを標的にできること、および実質的に常磁性共鳴画像処理向上させることの両方ができることを示すために、マウスにおける脳炎症の良く立証されたモデルの試験を行った。
【０１５８】
実験的自己免疫脳炎は、主に小脳、脳幹および脊髄などの中枢神経白質における強い血管周囲のリンパ／単球性炎症のプロセスで特徴付けられる、上行性の脳脊髄炎である。この系は多発性硬化症に関する動物モデルとして臨床的関心があり、実験的自己免疫脳炎における炎症細胞輸送に関与する受容体の性質は良く検討されてきた。実験的自己免疫脳炎マウス脳の微小血管系におけるＩＣＡＭ−１の発現は臨床での病気の開始時に上方制御されることが示されている。ＩＣＡＭ−１受容体は白血球の炎症内皮への付着を媒介し、活性化白血球および刺激された毛細血管の内皮上並びに中枢神経系全体の小静脈に存在する。その発現は炎症性浸潤物に関わる脈管に限らない。組織学的研究では、血液−脳障壁は病気の開始時および麻痺後が明らかな４８時間は全体性が維持されていることは以前示された。急性実験的自己免疫脳炎モルモットにおける血液−脳障壁を乗り越えたリポソーム通過に関する以前の磁気共鳴および蛍光顕微鏡研究では、リポソームは不全となった血−脳障壁を通過し、脳実質に到達することができないことを示した。
【０１５９】
そこで、ＩＣＡＭ−１受容体を実験的自己免疫脳炎におけるＩＣＡＭ−１が上方制御され、ＩＣＡＭ−１の発現が１０倍である早期において標的化させた。
【０１６０】
蛍光性標識抗ＩＣＡＭ−１抗体結合常磁性重合リポソームが段階２の実験的自己免疫脳炎であるマウスの脳脈管系に生体内で結合することを高分解能磁気共鳴で粒子の位置を示し、蛍光顕微鏡で確認できた。
【０１６１】
実験的自己免疫脳炎をプロテオリピッドタンパク質免疫プロトコールによりＳＪＬ／Ｊマウスで誘起した。段階２の病気の臨床症状は明らかで、尾の麻痺および手足の衰弱がありとき、前の実施例で調製した蛍光抗ＩＣＡＭ−１抗体結合常磁性重合リポソームを尾の静脈から１，２ｍｇ／ｋｇ Ｇｄ^＋３および８９０μｇ抗体／ｋｇである１０μｌ／ｇを注入し、２４時間再循環させた。マウスはその後屠殺し、ＰＢＳで灌流した。脳を取り出し、矢状面で半分に切断し、半分は直接蛍光顕微鏡分析用に１０μｍの薄切片で凍結し、他の半分はｐＨ７のＰＢＳ中で４％のパラホルムアルデヒド中で固定して高分解能磁気共鳴画像処理に用いた。
【０１６２】
３つに分けた試験では、７匹の疾病マウス全匹に蛍光抗ＩＣＡＭ−１抗体結合重合リポソームを注射すると、小脳、脳幹および脊髄の蛍光顕微鏡分析により中枢神経系脈管系への抗体結合重合リポソーム結合が陽性であることが全匹で示された。図２２はヘマトキシリンで対比染色した典型的なマウス小脳の蛍光顕微鏡像で、複数の血管が炎症性湿潤物で囲まれていることを示している。矢印で示した抗ＩＣＡＭ−１抗体結合常磁性重合リポソームは小毛細血管（ＳＶ）に結合しているが、大きな中心細動脈は蛍光に対して陰性なので結合していないことが蛍光で分かった。これは細静脈および毛細管で上方制御され、細動脈またはより太い血管では発現しないＩＣＡＭ−１の発現と一致している。炎症浸潤物には関係しない細血管に蛍光抗ＩＣＡＭ−１重合リポソームが結合したことは、浸潤化および非浸潤化血管の両方でＩＣＡＭ−１発現が組織的に見られるのと一致することは同様に注目される。
【０１６３】
６匹の対照：３匹の健常な動物は抗ＩＣＡＭ−１抗体結合常磁性重合リポソーム；２匹の疾病動物は抗トリニトロフェノール抗体結合常磁性重合リポソームを投与し、１頭の疾病動物はＳＪＬ／Ｊマウスでは発現しない抗原を標的とした抗Ｖβ１１Ｔ細胞受容体抗体結合常磁性重合リポソームを投与したが、蛍光顕微鏡により全匹で重合リポソーム結合が見られなかった。
【０１６４】
実施例１３
抗ＩＣＡＭ−１抗体結合常磁性重合リポソームの磁気共鳴画像処理
高分解能磁気共鳴画像処理を、抗ＩＣＡＭ−１抗体結合常磁性重合リポソームを含有している前の実施例で用いた段階２の実験的自己免疫脳炎に罹ったマウス二匹の相補的半分で作った。疾患に罹っていない半分の脳の高分解能Ｔ１およびＴ２強調像を、３ＤＦＴスピンエコーパルス系列を用いた９．４Ｔ　ＭＲスキャナー（ＧｅｎｅｒａｌＥｌｅｃｔｒｉｃ）で得た。
【０１６５】
Ｔ１強調像についてのパラメータはＴＲ２００ｍｓ、ＴＥ４ｍｓ、１ＮＥＸ，マトリックス２５６×２５６×２５６および１ｃｍの視野で、ボクセルサイズは各次元で約４０μｍとなった。Ｔ１強調取込み時間は走査当たり約７時間であった。Ｔ２強調パラメータはＴＲ１０００ｍｓ、ＴＥ２０ｍｓ、８ＮＥＸ，マトリックス２５６×２５６×２５６であった。Ｔ２強調走査時間は約１２時間であった。図２３では実験的自己免疫脳炎マウスのＴ２強調走査を示したが、大脳（冠状）および小脳（軸面）の正常な解剖学的形態を示すために重合リポソームの注射なしで行った。図２４では抗ＩＣＡＭ−１抗体結合常磁性重合リポソームを注射した自己免疫脳炎マウスのＴ１強調走査から得た代表的な切片を示した。びまん性血管周辺増進が脳全体、小脳および大脳で見られ、特に著しいコントラストは僅かに血管新生した小脳白質（Ｗ）および高度な血管の灰質（ｇ）間に見られた。図２５では同様に抗ＩＣＡＭ−１抗体結合常磁性重合リポソームを注射した健常マウスのＴ１強調走査法から得た代表的な切片を示したが、増進は見られなかった。
【０１６６】
シグナル強度測定は画像分析プログラムＶｏｘｅｌ　Ｖｉｅｗ／Ｕｌｔｒａ２．２（Ｖｉｔａｌ　Ｉｍａｇｅ，Ｉｎｃ．，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，Ｉｗｏａ）を用いて行った。各マウス脳につき、３つの切片を分析用に選んだ。各切片については、小脳灰質、大脳灰質および小脳白質のシグナルを、これら組織の其々の内で関心ある経路の少なくとも５つの大きな領域を手動で描いて測定した。３つの切片からのシグナル強度測定を平均して各組織切片の平均シグナル強度値とし、個々のシグナル強度値の標準偏差による加重平均とした。マウス脳間の組織シグナル強度における差は両側スチューデントのｔ検定を用いて評価した。統計的有意差レベルはＰ＜０．０５とした。結果は図２６に示した。対照と比較して、実験の抗ＩＣＡＭ−１抗体結合常磁性重合リポソームを注射した実験的自己免疫脳炎感染マウスの磁気共鳴走査は、小脳では約３２％、大脳皮質では２８％そして少し減少して小脳白質では約１８％と、磁気共鳴シグナル強度において相当な増加を示した。灰質シグナルが増加した結果、灰質と白質の間のコントラストが改善された。これは実験的自己免疫脳炎に冒されている小脳の中で特に言えることである。
【０１６７】
上記実施例は抗体結合常磁性重合リポソームが病気で上方制御された細胞接着分子に送達できることを示したものである。これは、例えば数多くの病変に関連する内皮抗原のような特異な標的生理活性の生体内での画像処理を与える際の新規標的特異磁気共鳴コントラスト増進剤を提供することになる。
【０１６８】
実施例１４
キレート化重合小胞（ＣＰＶ）の調製
１００ｍＬの丸底フラスコに、２０ｍｇ／クロロホルムｍＬのＢｉｓＴ−ＰＣ脂質６（図２９）１１ｍＬ（２２０ｍｇ、２４０μモル）、５ｍｇ／クロロホルムｍＬのＤＴＴＡ脂質５の３ｍＬ（１５ｍｇ、１１μモル）を加えた。クロロホルムはロータリーエバポレーターで約６０℃にて除去した。水（１０ｍＬ）を加え、溶液をドライアイス／アセトン混合物で固化するまで冷凍した。ｐＨを０．５Ｍ　ＮａＯＨの２０μＬを加えることで８に調整した。凍結解凍プロセスを３回または透明な溶液が得られるまで繰返した。この溶液を８０℃に加熱したサーモバレル押出し成形機（Ｌｉｐｅｘ　Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ、Ｉｎｃ．）中で３０ｎｍのポリカーボナートフィルターをアルゴンにて７５０ＰＳＩに加圧して通過させた。小胞の大きさは動的光散乱法（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）で測定した。脂質を含有するジアセチレンの重合は、小胞を１０×１ポリスチレン皿（ＶＷＲ）中で２〜４℃まで冷却し、携帯用ＵＶ照射器を用い約３．８ｍＷ／ｃｍ^２で照射して行った。橙色小胞は５００ｎｍでの光学濃度は水中で小胞１ｍｇ／ｍＬにつき約０．４ＡＵであった。黄色小胞を１２℃での重合で調製したが、水中で小胞１ｍｇ／ｍＬにつき光学濃度は１ＡＵであった。脂質５、コレステロールおよび卵ホスファチジルコリン（５／２８／６７モルパーセント）を含有するリポソームは重合なしで調製した。
【０１６９】
実施例１５
キレート化小胞への金属結合
５０ｍＭ　ＨＣｌに溶かした塩化イットリウム−９０、塩化インジウム−１１１（１０〜２０ｍＣｉ）を５０ｍＭクエン酸（ｐＨ４）で希釈して５０ｍＣｉ／ｍＬの溶液とした。５ｍＭクエン酸塩を含有する５０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ７）中の９０μＬ小胞溶液に１００〜２００μＣｉを含有する１０μＬの同位体溶液を加えた。溶液を室温で３０分間インキュベートし、１００Ｋ　ＭＷＣＯスピンフィルターカートリッジ（Ｎａｎｏｓｅｐ）に添加し、それを卓上型遠心分離機に入れた。３０００ｒｐｍで９０〜１２０分間回転した後、同位体をＣａｐｉｎｔｅｃ　ＣＲＣ−１５Ｒキューリーメーターを用いて定量した。小胞−同位体複合体を含有するカートリッジのフィルター部を取り出し、残存する非結合同位体を定量した。これらの値を用い結合した金属のパーセントまたは小胞ｍｇ当たりに結合した同位体の量を計算した。
【０１７０】
実施例１６
ＩＣＰ−ＭＳ
イットリウム−９０を、崩壊生成物ジルコニウム−９０につきＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　ＥＬＡＮ６１００ＤＲＣ付誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰＭＳ）により測定した。イットリウム試料または同じマトリックス中でイットリウム無しの試料を上記の如く希釈し、更に５％濃硝酸を含む３回蒸留した水で希釈した。
【０１７１】
実施例１７
キレート剤濃度の測定
キレート剤濃度は変動するイットリウム−８９中の一定イットリウム−９０（１００μＣｉ）を用いて測定し、イットリウム−９０が約１μＭである２０〜１０００μＭの全イットリウム濃度を得た。端的には、イットリウム−９０（５０ｍＭ ＨＣｌの１００μＬに２０ｍＣｉ）または５０ｍＭ ＨＣｌ中の塩化イットリウム−８９を５０ｍＭ ＨＣｌの５０μＬおよび５０ｍＭクエン酸ナトリウムの３５０μＬで希釈した。典型的な検定法では、イットリウム−８９溶液（１００〜２００μＣｉ，４μＬ）、イットリウム−８９溶液（５μＬ）、１０ｍＭクエン酸ナトリウムを含むｐＨ７．４の１００ｍＭヒスチジン緩衝液（２５μＬ）、水（１６μＬ）および５ｍＭクエン酸ナトリウムを含むｐＨ７．４の５０ｍＭヒスチジン緩衝液（５０μＬ）中の２ｍｇ／ｍＬのＣＰＶ（５０μＬ）である。小胞に結合したイットリウムを上述のように測定し、キレート剤濃度は結合したイットリウム％対イットリウム濃度のプロットを外挿して定量する。その代わりとしては、キレート剤濃度は、種々な量のイットリウム−８９を、その次にイットリウムー９０を小胞に加えて測定した。
【０１７２】
実施例１８
抗体の小胞への付着
抗体を実施例１５で調製したキレート化小胞に本実施例で説明するように付着させる。小胞（２５ｍｇ／ｍＬ，４０μＬ）の水溶液に、ｐＨ８の５００ｍＭほう酸緩衝液（１０μＬ）、Ｖｉｔａｘｉｎ（５ｍｇ／ｍＬ，５μＬ）、水（４２．５μＬ）およびＥＤＡＣ（２００ｍＭ，２．５μＬ）を添加した。溶液を室温で１８時間インキュベートし、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４で平衡としたＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ４Ｂのサイズ排除クロマトグラフィーで未反応の抗体から精製した。画分を集め、抗体につき以下に説明するようにＥＬＩＳＡで定量した。小胞を含有する画分はＵＶ／ＶＩＳ分光分析で同定した。
【０１７３】
実施例１９
ペプチドの小胞への付着
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＧＲＧＤＳ）につき本実施例で説明するように小胞へペプチドを付着させた。小胞（２０ｍｇ／ｍＬ，１００μＬ）の水溶液に水（７０μＬ）、ｐＨ７の５００ｍＭ ＭＯＰＳ（１０μＬ）およびペプチドＧＲＧＤＳ２５ｍＭ（１０μＬ）を加えた。ＥＤＡＣ（８μＬ，５００ｍＭ）を加え、溶液を１８時間インキュベートした。結合体は透析（１０Ｋ　ＭＷＣＯ）または上記のようなサイズ排除クロマトグラフィーで精製した。ＲＧＤペプチド結合は、２００ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ５０ｍＭほう酸塩緩衝液ｐＨ８を用いたＴｏｓｏＨａａｓ　ＴＳＫ　Ｇ２５００　ＰＷｘｌカラムによる２１４ｎｍのＨＰＬＣで観測した。
【０１７４】
実施例２０
抗体−小胞結合体のＥＬＩＳＡ
小胞上の抗体の存在は、本実施例で説明するようにＥＬＩＳＡで立証された。ラットまたはマウス抗体については、相応する抗種抗体を用いた。９６穴プレートを一夜ＰＢＳ緩衝液中２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＦｃ（γ）抗体（ＫＰＬ）で被覆した。穴は３００μＬの洗浄溶液（Ｗａｌｌａｃ　Ｄｅｌｆｉａ　Ｗａｓｈ）で３回洗浄し、２００μＬの乳ブロッキング溶液（ＫＰＬ）で室温にて１時間遮断をした。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４に濃度１〜１００μｇ／ｍＬにした抗体−小胞結合体（５０μＬ）を添加した。ＲＴで１時間インキュベーションをした後、穴を３回洗浄した。ブロッキング溶液中に１μｇ／ｍＬにしたヤギ抗ヒトＦｃ（γ）抗体−ＨＲＰ結合体（ＫＰＬ）を添加した。室温で１時間インキュベーションした後、穴を二回洗浄し、Ｌｕｍｉｇｌｏ蛍光基質（ＫＰＬ，５０μＬ）を加えた。１分インキュベーションした後、シグナルをＷａｌｌａｃ　Ｖｉｃｔｏｒ蛍光リーダーを用いて観測した。
【０１７５】
実施例２１
抗体−ＣＰＶ−^９０Ｙ結合体およびペプチド−ＣＰＶ−^９０Ｙ結合体の生体外での標的化
抗体またはペプチド、ＣＰＶおよびイッテリウム−９０からなる無処置の三者からなる複合体を必要とする標的化を、α_ｖβ_３インテグリンに特異的な放射測定結合検定法を用い生体外で示した。簡潔に言えば、α_ｖβ_３インテグリン（Ｃｈｅｎｍｉｃｏｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）で被覆した９６穴プレートをＢＳＡで遮断した。抗α_ｖβ_３インテグリン抗体−リポソーム−イットリウム−９０複合体の０〜１００μｇ／ｍＬまたはそれに相当するペプチド複合体を含有するウサギ血清または緩衝液の試料を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、イットリウム−９０をＭｉｃｒｏｂｅｔａシンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ）で測定した。
【０１７６】
実施例２２
細胞接着阻害検定法
細胞接着の阻害につき修正プロトコールを用いて実施した（Ａ．Ｈｏｗｌｅｔｔ，Ｅｄ．，Ｉｎｔｅｇｒｉｎ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｖｏｌ．１２９（Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９）。９６穴プレートをＰＢＳ中に１μｇ／ｍＬのフィブリノーゲン１００μＬで一夜４℃にて被覆した。溶液を除去し、プレートを２００μＬＰＢＳ（３×）で洗浄した。１０％ＦＢＳ、グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０成長培養液中でコンフルエンシーになるまで生育したＭ２１ヒトメラノーマ細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび１％のグルコースを含有するＰＢＳ中でインキュベートして剥離した。細胞は遠心分離でペレット化し、検定用培養液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有するＲＰＭＩ１６４０、ｐＨ７．５，１ｍＭ ＭｇＣｌ_２，１ｍＭ ＣａＣｌ_２，０．２５ｍＭ ＭｎＣｌ_２および０．１ＢＳＡ）で２回洗浄し、６６０，０００細胞／ｍＬに懸濁した。検定用培養液中のＶｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶまたはＧＲＧＤＡ−ＣＰＶを希釈し、５０μＬを各穴に加え、次いで５０μＬの細胞溶液を添加した。３７℃にて５％ＣＯ_２で１時間インキュベーションした後、プレートはＰＢＳ２００μＬで３回洗浄し、７０％エタノール１００μＬを３０分間加えた。１時間後、エタノールを除き、０．２％クリスタルバイオレットを３０分間加えた。プレートを２００μＬの脱イオン化水で４回洗浄し、１％ＳＤＳを１００μＬを６０分間加えた。Ｗａｌｌａｃ　Ｖｉｃｔｏｒ　プレートリーダーを用い５９０ｎｍでの吸光度を測定した。ＩＣ５０につきＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ処理を使用して測定した。
【０１７７】
実施例２３
抗インテグリン抗体結合常磁性重合リポソームの抗体結合画像処理の生体外でのＭＲ研究
α_ｖβ_３インテグリン（ＬＭ６０９）に対するげっ歯類抗体を重合ジアセチレン小胞（ＰＶｓ）に結合させてＡｂ−ＰＶｓを形成させ、前に示した脈管系上のインテグリンの上方制御で示したウサギ腫瘍モデル（Ｖｘ２腫瘍）にて評価した。Ｖｘ２癌腫細胞をニュージーランド白系ウサギの大腿部筋肉に播種または皮下注射した。ウサギは明白な腫瘍ができるまで念入りに観察する。生体でのＭＲ研究用として、明白な腫瘍（直径約１〜３ｃｍ）を持つウサギに５ｍｌ／ｋｇ（全脂質で約３０ｍＭ）の抗α_ｖβ_３（ＬＭ６０９）−標識ＡｂＰＶｓ（１ｍｇ抗体／ｋｇ，０．００５ｍｍｏｌＧｄ^＋３／ｋｇ）または対照のイソタイプ対応対照抗体を有するＡｂＰＶｓのどちらかを静脈注射した。ＭＲ画像処理は四肢コイルおよび次の画像パラメータを用いた１．５Ｔ　ＧＥ　Ｓｉｇｍａ　ＭＲ画像装置を使用して実施した：ＴＲ＝３００ｍｓ、ＴＥ＝１８ｍｓ、ＮＥＸ＝２、ＦＯＶ＝１６ｃｍ、２５６×２５６マトリックス、切片厚さ＝３ｍｍ。ＭＲ画像はコントラスト剤の直前およびコントラスト剤注入直前、直後、注入後３０分、１時間および２４時間に、冠状面で得た。ウサギは最後のＭＲ画像試験の直後に安楽死させ、腫瘍組織を免疫組織化学的研究用に採取した。図２７はＬＭ６０９標識ＡｂＰＶｓを注射したウサギが持っていたＶｘ２癌腫のＭＲ所見を図示した。コントラスト剤注射後の直後、３０分および１時間では腫瘍または腫瘍周辺の顕著な増強はコントラスト剤注入前の画像（図２７Ａ、前（Ａ））と比較して起きていないが、コントラスト剤注入後２４時間では腫瘍周辺の増強が顕著に見ることができる。
【０１７８】
イソタイプ対応対照はコントラスト剤注入後２４時間で両方の腫瘍モデルにおいては低度のコントラスト増強が示された（図２７Ｂにおいて前（Ｃ）に対して前（Ｄ）を比較）。
【０１７９】
実施例２４
ウサギにおけるＶｘ２癌腫の核シンチグラフィー
ＣＰＶおよびＣＰＶ結合体の放射標識は上記のように、^１１１ＩｎＣｌ_３（Ｄｕｐｏｎｔ　ＮＥＮ）で０．２５および０．５ｍＣｉ／ｋｇの間および１０ｍｇＣＰＶ／ｋｇの用量を得るように標識して行った。大腿筋肉にＶｘ２癌腫を持つウサギ（Ｄ．Ａ．Ｓｉｐｋｉｎｓ等，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４，６２３〜６（１９９８））を計量し、ケタミン（３５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラザン（４ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔した。放射標識したＣＰＶ溶液（約２ｍＬ）を耳静脈周辺から投与した。シンチスキャンは静脈注射直後および注射後８，２４，４８および７２時間に得た。上半身および後側四半部の平面画像を、中エネルギーコリメーターおよび１７４〜２４７ｋｅｖに設定した２０％エネルギーウインドウを備えたガンマー線写真機にて１５分間で集めた。
【０１８０】
実施例２５
受容体標的分子放射免疫治療法
腫瘍血管新生につき受容体標的分子放射免疫治療法を開発する基盤としてＡｂ−ＰＶｓの使用を同様に研究した。イットリウム−９０（^９０Ｙ）、および腫瘍誘起血管新生で上方制御されるインテグリンα_ｖβ_３に結合するマウスＭＡｂであるＬＭ６０９の高運搬量を輸送する粒子を設計して、腫瘍新脈管系を除去する放射免疫治療法を検討した。Ｖｘ２癌腫細胞を３６匹のニュージーランド白系ウサギの大腿部に移植した。腫瘍の成長はウサギの連続ＭＲ画像処理でモニターした。腫瘍成長の７日後、単回の大量瞬時投与治療（４ｍｇ重合小胞／ｋｇ、０．１ｍｇ／ＭＡｂのｋｇおよび０．６ｍＣｉ／ｋｇ^９０のイットリウム）を静脈注射した。^９０Ｙを伴う標的重合ナノ粒子は腫瘍の成長速度を非処置対照と比べて約５０％低減した。ＭＡｂ単独および重合小胞単独では腫瘍成長には影響がなかった。放射活性のないＭＡｂ結合小胞では腫瘍成長への効果はみられないので^９０Ｙは必要である。他の対照には^９０Ｙの有りおよび無しの非標的小胞および^９０Ｙ無しのＭＡｂ標的小胞が含まれるが、その全てが腫瘍成長への効果は僅かまたは無しであった。これらの結果はＭＡｂ標的化腫瘍血管新生で標識した重合小胞に高イットリウム運搬量を用いた放射免疫治療法は、固体腫瘍の治療に際して実行可能な戦略であることを示した。
【０１８１】
【発明の効果】
本明細書で述べた全ての参考文献、出版物、特許および特許出願はその全容を参照により本明細書中に援用してある。上述の特許は明解性および理解の目的で図表および実施例により幾らかの詳細を説明したが、当技術分野の当業者であれば特定の変更および修正は実際には役に立つことは明らかである。そこで、説明および実施例は、添付請求項で詳細に説明した本発明の目的を制限するものと解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の血管標的化治療用薬剤とその標的との相互作用を概略的に示している。
【図２】図２は、本発明の１態様である重合性脂質分子を概略的に示している。
【図３】図３は、本発明の１態様である重合性脂質分子を概略的に示している。
【図４】図４は、本発明の１態様である重合性脂質分子を概略的に示している。また、本発明の１態様である金属キレート化剤脂質の合成を示している。
【図５】図５は、本発明の１態様である充填剤脂質、ＤＡＰＣ、ＤＡＰＥまたはＰＤＡと、図４に示す金属キレート化剤脂質からの重合リポソームの形成を示している。
【図６】図６は、本発明の１態様である充填剤脂質、ＤＡＰＣ、ＤＡＰＥまたはＰＤＡと、図４に示す金属キレート化剤脂質からの重合リポソームの形成を示している。
【図７】図７は、本発明の１態様であるビチオン化キレート化剤脂質の合成を示している。
【図８】図８は、ＰＤＡおよびＤＡＰＣまたはＤＡＰＥを用いたビチオン化重合リポソームの形成を示している。
【図９】図９は、ＰＤＡおよびＤＡＰＣまたはＤＡＰＥを用いたビチオン化重合リポソームの形成を示している。
【図１０】図１０は、正荷電した官能基を有する重合リポソームの形成を示している。
【図１１】図１１は、負荷電した官能基を有する重合リポソームの形成を示している。
【図１２】図１２は、双生イオン化官能基を有する重合リポソームの形成を示している。
【図１３】図１３は、ラクトース標的化基を有する重合リポソームの形成を示している。
【図１４】図１４は、抗体を付着させた重合リポソームの形成を概略的に示しており、７１はビオチン表面を伴うリポソームであり、７２はビオチン結合タンパク質であり、そして７０および７４はビオチン化抗体を含む。
【図１５】図１５は、還元的アミン化を介したアミンおよびアルキルヒドラジンを介したヒドラゾン形成による、酸化型抗体の直接的付着に用いることができるリポソームの形成を示している。
【図１６】図１６は、還元的アミン化を介したアミンおよびアルキルヒドラジンを介したヒドラゾン形成による、酸化型抗体の直接的付着に用いることができるリポソームの形成を示している。
【図１７】図１７は、実施例９で調製したような抗体結合重合リポソームを概略的に示したものである。
【図１８】図１８は、実施例１０に記載の、抗アビジンアルカリホスファターゼを用いたゲル電気泳動のカラー写真である。
【図１９】図１９は、実施例１０に記載の、抗ＩｇＧアルカリホスファターゼを用いたゲル電気泳動のカラー写真である。
【図２０】図２０は、実施例１１に記載の、蛍光抗体結合重合リポソームの細胞結合を示すカラー蛍光顕微鏡写真である。
【図２１】図２１は、図２０に示す細胞結合を概略的に示している。
【図２２】図２２は、実施例１２に記載の、毛細血管に結合した抗ＩＣＡＭ−１抗体結合重合リポソームを示すマウス小脳のカラー蛍光顕微鏡写真である。
【図２３】図２３は、実施例１３に記載の、重合リポソームを注射していない実験的自己免疫脳炎マウスの脳切片の磁気共鳴画像である。
【図２４】図２４は、実施例１３に記載の、抗ＩＣＡＭ−１抗体結合重合リポソームを注射した実験的自己免疫脳炎マウスの脳切片の磁気共鳴画像である。
【図２５】図２５は、実施例１３に記載の、抗ＩＣＡＭ−１抗体結合重合リポソームを注射した健常マウスの脳切片の磁気共鳴画像である。
【図２６】図２６は、実施例１３に記載の、磁気共鳴画像強度測定を示す棒グラフである。
【図２７】図２７Ａは、ウサギの大腿筋におけるＶ２癌腫のＭＲ画像であり、抗α_ｖβ_３標識ＡｂＰＶの皮下注射前（Ａ）、および注射後２４時間（Ｂ）を示す。一方、図２７Ｂは、実施例２３に記載の、図２７Ａに対してアイソタイプが合致した対照のＭＲ画像を示す。
【図２８】図２８Ａは、非標的化ＣＰＶ−^ＩＩＩＩｎによる処理のウサギモデルにおけるＣＰＶ−^ＩＩＩＩｎ結合体を伴うＶｘ２癌腫の画像を示している。図２８Ｂは、α_ｖβ_３インテグリン標的化ＬＭ６０９−ＣＰＶ−^ＩＩＩＩｎを伴うＶｘ２癌腫の画像を示しており、腫瘍（下部左）におけるＬＭ６０９−ＣＰＶ−^ＩＩＩＩｎ複合体の蓄積を示している。
【図２９】図２９は、本発明の１態様である重合性脂質分子を概略的に示している。また、トリ酢酸キレート化剤脂質［ＰＤＡ−ＰＥＧ_３］_２ＤＴＴＡ５およびＢｉｓＴ−ＰＣ６（１，２−ビス（１０，１２トリコサジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）の構造を示している。
【図３０】図３０は、Ｖｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶ結合体単位ｍｇ当たり０．１６、０．８０および４ｍＣｉイットリウム−９０のイットリウム−９０（^９０Ｙ）を負荷したＶｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶ−^９０Ｙ複合体に対する、α_ｖβ_３インテグリン結合放射アッセイを示している。ヒトα_ｖβ_３インテグリンで被覆し、３％ＢＳＡでブロックした９６穴プレートを、Ｖｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶ−^９０ＹまたはＣＰＶ−^９０Ｙ複合体とともに１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、イットリウム−９０放射をシンチレーションプレートリーダーで測定した。
【図３１】図３１は、キレート化剤５およびＢｉｓＴ−ＰＣ脂質６（５／９５モル比）を含有するＶｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶ−^９０Ｙ結合体並びに卵ＰＣ、コレステロールおよびキレート化剤５をモル比６７／２８／５で含有するＶｉｔａｘｉｎ−リポソーム−^９０Ｙ複合体（Ｖｉｔａｘｉｎ−ＣＬ−^９０Ｙ）について、ウサギ血清中、３７℃における血清安定性に対する小胞組成物の効果を示している。
【図３２】図３２は、Ｖｉｔａｘｉｎ−ＣＰＶ複合体の免疫応答性に対するイットリウム−９０の効果を、イットリウム非存在下および５０μＭイットリウム−８９存在下の対照と比較して示している。イットリウム−９０負荷は小胞単位ｍｇ当たりｍＣｉイットリウム−９０として表す。小胞を標識後、複合体を４℃で６０日間保存し、α_ｖβ_３インテグリンへの結合をＥＬＩＳＡでアッセイした。

Claims (32)

1. 病理部位に結合する標的化部；結合担体；および治療部を含む標的化された治療用薬剤。
2. 標的化部が病理部位に関連する新脈管構造に結合する、請求項１に記載の標的化された治療用薬剤。
3. 標的化部が、内皮受容体、または体液を通して接近できる組織に結合する、請求項１に記載の標的化された治療用薬剤。
4. 標的化部が、組織中または体液近接の若しくは体液中の細胞で上方制御される受容体に結合する、請求項１に記載の標的化された治療用薬剤。
5. 病理部位が腫瘍である、請求項１に記載の標的化された治療用薬剤。
6. 標的化部が抗体である、請求項１に記載の標的化された治療用薬剤。
7. 抗体がα_ｖβ_３マーカーに対する抗体である、請求項６に記載の標的化された治療用薬剤。
8. 抗体が、抗ＩＣＡＭ−１抗体、ＬＭ６０９抗体およびＶｉｔａｘｉｎ抗体からなる群より選択される、請求項６に記載の標的化された治療用薬剤。
9. 標的化部がペプチドである、請求項１に記載の標的化された治療用薬剤。
10. ペプチドがＲＧＤアミノ酸配列を含有する、請求項９に記載の標的化された治療用薬剤。
11. 標的化部が小分子リガンドである、請求項１に記載の標的化された治療用薬剤。
12. 標的化部が炭水化物である、請求項１に記載の標的化された治療用薬剤。
13. 結合担体が、リポソーム、重合リポソーム、他の脂質小胞、デンドリマー、ポリエチレングリコール集合体、ポリリジン、キャップ化ポリリジン、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、デキストランおよび被覆ポリマーからなる群より選択される、請求項１に記載の標的化された治療用薬剤。
14. 結合担体が、多価性、増加した循環寿命および増加した運搬量からなる群より選択される特性を薬剤に賦与する、請求項１に記載の標的化された治療用薬剤。
15. 更に安定化部を含む、請求項１に記載の標的化された治療用薬剤。
16. 安定化部がデキストランである、請求項１５に記載の標的化された治療用薬剤。
17. 治療部が、薬物、毒物、プロドラッグおよび放射性同位体からなる群より選択される、請求項１に記載の標的化された治療用薬剤。
18. 治療部が放射性同位体である、請求項１に記載の標的化された治療用薬剤。
19. 放射性同位体が、ヨード−１２５、イットリウム−９０、イットリウム−８９、インジウム−１１１、テクネチウム−９９ｍおよびユーロピウム−１５２からなる群より選択される、請求項１８に記載の標的化された治療用薬剤。
20. 放射性同位体がキレート化基を介して結合部に付着される、請求項１８に記載の標的化された治療用薬剤。
21. キレート化基が、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、ＩＴＣ−ＤＴＰＡ、ＭＸ−ＤＴＰＡおよびシトレート並びにＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、ＩＴＣ−ＤＴＰＡ、ＭＸ−ＤＴＰＡおよびシトレートの誘導体からなる群より選択される、請求項２０に記載の標的化された治療用薬剤。
22. 治療部が、化学療法剤、毒物およびプロドラッグからなる群より選択される、請求項１に記載の標的化された治療用薬剤。
23. 投与を必要とする被験者に請求項１に記載の標的化された治療用薬剤を投与する工程を含む、血管新生を伴う疾患の治療方法。
24. 標的化された治療用薬剤を投与する工程が、病理に関連する脈管構造の統合性に障害を生じさせる、請求項２３に記載の方法。
25. 標的化された治療用薬剤が、更なる標的に対する標的化部も有している、請求項２３に記載の方法。
26. 更なる標的ががん細胞マーカーである、請求項２５に記載の方法。
27. 更なる治療用薬剤を、標的化された治療用薬剤の投与と同時にまたは引き続いて投与する工程を更に含む、請求項２３に記載の方法。
28. 更なる治療用薬剤を、標的化された治療用薬剤の投与と同時にまたは引き続いて投与する工程を更に含む、請求項２４に記載の方法。
29. 結合担体が、更なる材料を被包することができる、請求項１に記載の標的化された治療用薬剤。
30. 結合担体に被包される更なる材料が、核酸、薬物、毒物、プロドラッグ、放射性同位体および細胞毒性を示すタンパク質をコードする遺伝子を含む群より選択される、請求項２９に記載の標的化された治療用薬剤。
31. 結合担体が、更なる材料を結合担体の表面に付着させることができる、請求項１に記載の標的化された治療用薬剤。
32. 結合担体の表面に付着される更なる材料が、核酸、薬物、毒物、プロドラッグ、放射性同位体および細胞毒性を示すタンパク質をコードする遺伝子を含む群より選択される、請求項３１に記載の標的化された治療用薬剤。

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