MXPA03010893A - Sistema de suministro para acidos nucleicos. - Google Patents

Abstract

Los liposomas para seleccionar como blanco al receptor de integrina av??3 comprenden un anfifilo cationico tal como un lipido cationico, un lipido neutro, y un lipido para seleccion de blanco. El lipido para seleccion de blanco incluye un antagonista de integrina av??3 no peptidico.

Description

SISTEMA DE SUMINISTRO PARA ACIDOS NUCLEICOS CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se refiere al suministro in vivo de genes y de ácidos nucleicos similares hacia sitios seleccionados como blanco. De manera más particular, esta invención se refiere al suministro de genes mediado por liposomas a vasos sanguíneos angiogénicos .

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las integrinas son una clase de receptores celulares que se sabe unen las proteínas de la matriz extracelula , y que por lo tanto median las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular, generalmente conocidas como eventos de adhesión celular. Aunque en la literatura se describen muchas integrinas y los ligandos que unen una integrina, aún sigue sin dilucidar la función biológica de muchas de las integrinas. Los receptores de integrina constituyen una familia de proteínas que comparten las características estructurales de los complejos de glicoproteína heterodiméricos no covalentes formados a partir de subunidades a y ß, Cheresh y Mecham, eds . Integríns : Molecular and Biological Responses to the Extracellular atrix, Academic Press, Inc., San Diego, CA 92101 (1994) . Horton, Int. J. Exp . Pathol . , 71:741-759 (1990) . Aún siguen bajo investigación las funciones de adhesión celular específicas que desempeñan estas integrinas en muchas de las interacciones celulares en tejidos. Las interacciones de la matriz endotelial participan durante la angiogénesi s , la formación de nuevos vasos sanguíneos. Un receptor de adhesión celular, conocido como integrina ?ß3 se encuentra sobre la superficie de células endoteliales activadas que participan en la angiogenesis. Es bien sabido que la angiogénesis es también un requisito para el crecimiento y metástasis de tumor maligno. En ausencia de angiogénesis se suprime la expansión local del tumor. Además, se sabe que la expresión de un marcador de angiogénesis específico, la integrina ?ß3, se correlaciona con el grado del tumor. Se ha descubierto que los liposomas catiónicos que portan un antagonista no peptídico de integrina como un agente para selección de blanco pueden suministrar ácidos nucleicos tales como genes a los vasos sanguíneos angiogénicos . Los ácidos nucleicos seleccionados de manera apropiada pueden suprimir o incrementar el crecimiento de vasos sanguíneos según se desee, y por lo tanto pueden proveer medios para el tratamiento de enfermedades dependientes de la angiogenesis.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION Mediante la presente invención se proveen liposomas para selección de blanco que incluyen un antagonista no peptídico del receptor de integrina y un ácido nucleico. Estos liposomas para selección de blanco son útiles para el suministro selectivo de ácidos nucleicos, tales como genes, secuencias de oligonucleótido de antisentido, ADN, ARN, y similares, a un sitio objetivo predeterminado, por ejemplo, un vaso sanguíneo angiogénico ín vivo, cuando se introducen ya sea en forma sistémica o local . De esta manera se pueden suministrar ácidos nucleicos seleccionados a vasos sanguíneos angiogénicos, para mediar la absorción de ácidos nucleicos por parte de las células del endotelio vascular para la expresión o para el suministro de antisentido. Se puede lograr la perturbación del crecimiento de vasos sanguíneos nuevos. Además, mediante la selección apropiada del ácido nucleico que será suministrado, se puede inducir, si se desea, el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. De manera más particular, un liposoma para seleccionar como blanco al receptor de integrina a?ß3 es una nanopartí cula que tiene un tamaño no mayor de 100 nm aproximadamente y que es una vesícula unilaminar o multilaminar que comprende un anfífilo catiónico tal como un lípido catiónico, un lípido neutro, un lípido para selección de blanco que tiene un dominio para seleccionar como blanco a la integrina ?ß3, y un dominio hidrofóbico, y un ácido nucleico tal como un gen, una secuencia de oligonucleót ido de antisentido, una secuencia de ADN, una secuencia de ARN, y similares. De manera opcional, el liposoma para selección de blanco, también puede incluir un lípido neutro. En el lípido para selección de blanco, el dominio para selección de blanco puede estar unido directamente al dominio hidrofóbico. De manera alternativa, el dominio para selección de blanco puede estar unido en forma covalente a un dominio de enlace hidrofílico (enlazador de superficie), el cual a su vez, est unido en forma covalente al dominio hidrofóbico. El ácido nucleico está complejado con el anfífilo catiónico presente en el liposoma. El dominio para selección de blanco incluye un antagonista no peptidico de la integrina ?ß3. En el liposoma para selección de blanco, el anfífilo catiónico, tal como un lípido catiónico, está presente en una cantidad en el intervalo de 1 aproximadamente hasta 50 por ciento molar aproximadamente y el dominio para selección de blanco del lípido para selección de blanco está presente en una cantidad en el intervalo de 1 aproximadamente hasta 20 por ciento molar aproximadamente, tomando como base las moles totales de lípido en el liposoma. Los lípidos que constituyen al liposoma para selección de blanco pueden tener grupos funcionales susceptibles de oligomeri zación y/o polimerización en sus porciones hidrofóbicas respectivas, y por lo menos una porción de dichos lípidos presente en el liposoma se puede entrelazar una con otra a través de dichos grupos. Si se desea, el lípido catiónico también puede tener grupos susceptibles de entrelazamiento. De manera alternativa, el lípido catiónico puede estar libre de grupos susceptibles de entrelazamiento . Se pueden utilizar los liposomas para selección de blanco de la presente invención para el suministro de ácidos nucleicos para tratar cáncer, enfermedades inflamatorias, enfermedades oculares y similares. Dichos liposomas para selección de blanco también se pueden utilizar para suministrar genes para identificar objetivos terapéuticos en vasos sanguíneos . Los liposomas para selección de blanco de esta invención son nanopartículas de unión múltiple no mayores de 250 nanómetros aproximadamente, de preferencia desde 40 hasta 100 nanómetros aproximadamente, los cuales incluyen un lipido catiónico o citofectina, junto con un ácido nucleico complejado con el mismo. Se puede representar un lipido preferido para selección de blanco como L-X-K, en la cual L es el dominio para selección de blanco, por ejemplo, un antagonista del receptor de integrina tal como el antagonista del receptor de a?ß3 , y similares, X es un dominio hidrofílico que sirve como un enlazador de superficie para un dominio hidrofóbico K. De manera alternativa, el lipido para selección de blanco se puede representar mediante L-K en la cual el dominio L para selección de blanco está unido directamente al dominio hidrofóbico K. Los antagonistas no peptídicos del receptor de integrina, L, apropiados para los propósitos de la presente invención, a valores de pH fisiológicos, son zwitteriones que tienen un grupo catiónico y un grupo aniónico que pueden interactuar con o unirse a un receptor de integrina. Los grupos catiónico y aniónico están separados uno del otro mediante un grupo separador, tal como un grupo aromático bivalente. La separación entre el grupo catiónico y el grupo aniónico en la molécula del antagonista de receptor está en el intervalo de 10 aproximadamente hasta 100 Angstroms aproximadamente, y puede ser provisto por ácidos alcoxibenzoicos , compuestos bicíclicos o triciclicos, compuestos espirocí clicos , y similares, en tanto que un grupo catiónico y un grupo aniónico separados a partir de los mismos queden disponibles para interactuar con un receptor de integrina a valores de pH fisiológicos. Los antagonistas de receptor de integrina apropiados puede representarse esquemáticamente de la siguiente manera : GRUPO GRUPO CATIONICO ANIONICO Un antagonista no peptídico del receptor de ?ß3 ilustrativo está representado por la fórmula en la cual el grupo amino libre (NH2) está disponible para unir covalentemente el antagonista al dominio hidrofóbico del liposoma, ya sea directamente, o a través de un grupo enlazador de superficie. Otros antagonistas no peptídicos del receptor v 3 apropiados que son útiles para los propósitos de la presente invención cuando están unidos a un dominio hidrofílico de un lípido para selección de blanco se describen en las patentes E.U.A. No. 5,561,148, No. 5,776,973 y No. 6,204,280 y en las publicaciones de patente WO 00/63178, WO 01/10841, WO 01/14337, WO 01/14338, WO 97/45137, WO 98/35949 y WO 00/26212. La combinación del antagonista L no peptídico del receptor de integrina y el enlazador de superficie opcional X constituye una molécula o grupo para seleccionar como blanco al receptor de a? 3 apropiado para que se conjugue con un portador de ácido nucleico, tal como un liposoma catiónico y similares. El liposoma para selección de blanco resultante se asocia después con un ácido nucleico predeterminado, por ejemplo, un gen, mediante formación de complejo con el mismo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS En las figuras, La figura 1 ilustra de manera esquemática un liposoma para selección de blanco de la presente invención . La figura 2 es una ilustración de un liposoma entrelazado para selección de blanco de la presente invención. La figura 3 es una ilustración de otro liposoma entrelazado para selección de blanco de la presente invención. La figura 4 ilustra de manera esquemática los liposoraas para selección de blanco que circulan sistémicamente . La figura 5 ilustra de manera esquemática la recolección de liposomas para selección de blanco en sitios angiogénicos . Las figuras 6 y 7 ilustra de manera esquemática el suministro de ADN, tal como un gen, a las células seleccionadas como blanco. La figura 8 ilustra de manera esquemática una prueba de adhesión apropiada para la evaluación de los antagonistas de a?ß3. La figura 9 es una representación gráfica de datos obtenidos utilizando la prueba de adhesión mostrada en la figura 8 y que muestra que un liposoma para selección de blanco de la presente invención se une a un receptor de a?ß3. La figura 10 es una representación gráfica de datos que muestra el suministro efectivo del gen de la proteína verde fluorescente (GFP) dirigido a células que expresan a?ß3 in vivo utilizando un liposoma para selección de blanco de la invención; se demuestra que los liposomas para selección de blanco que portan el gen transfectan las células en una manera dependiente de a?ß3,· las células utilizadas son células de melanoma de humano M21 y M21L; las células 21 expresan la integrina a?ß3 mientras que las células M21L no expresan la integrina a?ß3 (a?-nulo) . La figura 11 es una representación gráfica de datos que demuestran la selección de blanco selectiva in vivo del gen de luciferasa de luciérnaga a células de la vasculatura de tumor que expresan ?ß3 utilizando un liposoma para selección de blanco de la invención; se demuestra que los portadores del gen dirigido transfectan las células tumorales en una manera dependiente de ?ß3 ; las células utilizadas son células de melanoma de humano M21 y M21L, implantadas en ratón; las células M21 expresan la integrina a?ß3 mientras que las células M21L no expresan la integrina a?ß3. La figura 12 es una representación gráfica de datos que demuestran la inhibición y regresión, in vivo, del crecimiento de tumor en tumores establecidos debido a la administración de un liposoma para selección de blanco unido al gen que expresa una proteína Raf mutante inhibidora de angiogénesis . La figura 13 es una representación gráfica de datos que demuestran la inhibición y regresión, in vivo, del crecimiento de tumor en tumores establecidos debido a la administración de un liposoma para selección de blanco unido al gen que expresa una proteína Raf mutante inhibidora de angiogénesis . La figura 14 presenta una microfotografí que demuestra el suministro in vivo de un gen que codifica para GFP a vasos sanguíneos angiogénicos en una CAM de pollo utilizando un liposoma para selección de blanco de la invención. La figura 15 presenta una microfotografí a que demuestra el suministro in vivo a vasos sanguíneos en un ojo de ratón, de un gen que codifica para GFP, mediante inyección intra-vítreo de un liposoma para selección de blanco de la invención unido al gen. La figura 16 presenta una microfotografía que demuestra la apoptosis neovascular in vivo mediante suministro mediado por liposoma de un gen que codifica para Raf mutante a vasos sanguíneos angiogénicos en retinas de ratón. La figura 17 presenta el esquema de síntesis 1 del liposoma para selección de blanco, que muestra en forma detallada que la síntesis del intermedio clave del conjugado 12 de lípido trivalente-antagonista de integrina; y La figura 18 muestra el esquema de reacción 2 de síntesis del liposoma para selección de blanco, el cual indica la formación de los liposomas para selección de blanco nanoparticulados (NPs) mediante auto-ensamblado y polimerización de los hipidos apropiados a partir del conjugado 12 de lípido trivalente -antagonista de integrina.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS En las figuras 1-3 y 18 se ilustran los liposomas para selección de blanco de la presente invención, y están constituidos por un antagonista del receptor de integrina, por ejemplo un antagonista del receptor avp3/ unido a un lapido, y un portador para un ácido nucleico, por ejemplo un anfxfilo catiónico tal como un lípido catiónico. El liposoma también puede contener un lípido de relleno neutro o zwitteriónico . El lipido para selección de blanco tiene un dominio para selección de blanco que incluye un antagonista del receptor de integrina a?ß3 unido covalentemente a un dominio idrofóbico . El dominio para selección de blanco puede estar unido directamente al dominio hidrofóbico, o el dominio para selección de blanco puede estar unido a un dominio hidrofílico tal como un grupo enlazador (enlazador de superficie), el cual a su vez, está unido a un dominio hidrofóbico. Los antagonistas del receptor de integrina apropiados para los propósitos de la presente invención son zwitteriones a valores de pH fisiológicos y tienen un grupo catiónico y un grupo aniónico que pueden interactuar con, o unirse a, un receptor de integrina. Los grupos catiónico y aniónico están separados uno del otro mediante un grupo separador, tal como un grupo aromático divalente. La separación entre el grupo catiónico y el grupo aniónico en la molécula de antagonista del receptor está en el intervalo de 10 aproximadamente hasta 100 Angstroms aproximadamente, y puede ser provisto por ácidos p-alcoxibenzoicos , compuestos bicíclicos o tricíclicos, compuestos espirocíclicos , y similares, en tanto que un grupo catiónico y un grupo aniónico separados de los mismos estén disponibles para que interactúen con un receptor de integrina a valores de pH fisiológicos. El término "arilo", tal como se utiliza en la presente invención y en las reivindicaciones anexas, significa un radical hidrocarburo que contiene por lo menos un anillo aromático de 6 átomos de carbono, y el cual también puede contener sustituyentes tipo hidrocarburo lineal, ramificado, o cíclico. El término "heteroarilo" significa un radical que comprende por lo menos un anillo aromático que contiene carbono-heteroátomo, y el cual puede contener también sustituyentes tipo hidrocarburo lineal, ramificado o cíclico, en el cual el heteroátomo puede ser cualquier elemento seleccionado a partir de los grupos designados por la IUPAC como 15 (grupo de nitrógeno) y 16 (grupo del oxígeno) de la tabla periódica de los elementos, incluyendo radicales heterocíclicos aromáticos de dichos compuestos tal como los descritos en L.A. Paquette, Principies of Modern Heterocyclic Che istry, Benj amin/Cummings Publishing Company, Inc. (1968), cuyas descripciones relevantes se incorporan en la presente invención para referencia. Cuando se hace referencia en la presente invención a grupos arilo y heteroarilo estos pueden estar no sustituidos o pueden estar sustituidos. El término "heterocíclico " , tal como se utiliza en la presente invención y en las reivindicaciones anexas, significa un radical que comprende por lo menos un anillo no aromático que contiene carbono -heteroátomo , y el cual puede contener además sustituyentes tipo hidrocarburo lineal, ramificado o cíclico, en el cual el heteroátomo puede ser cualquier elemento seleccionado a partir de los grupos designados por la IUPAC como 15 (grupo de nitrógeno) y 16 (grupo del oxígeno) de la tabla periódica de los elementos, incluyendo radicales heterocíel icos no aromáticos de dichos compuestos tal como los descritos en Paquette, supra , cuyas descripciones relevantes se incorporan en la presente invención para referencia. Los grupos heterocíclicos pueden estar no sustituidos o pueden estar sustituidos con grupos alquilo o con grupos funcionales reactivos tales como halógenos, grupos tipo amino, grupos tipo hidroxilo, grupos tipo ácido carboxílico, grupos tipo ácido sulfónico, y similares . El término "alquilo" tal como se utiliza en la presente invención y en las reivindicaciones anexas, se refiere a una porción de hidrocarburo, el cual puede ser lineal, ramificado, o puede contener una estructura de anillo carbocíel ico . El término "alquenilo" tal como se utiliza en la presente invención y en las reivindicaciones anexas, se refiere a un grupo alquilo que tiene por lo menos un doble enlace carbono- carbono . El término "alquinilo" , tal como se utiliza en la presente invención y en las reivindicaciones anexas, se refiere a un grupo alquilo que tiene por lo menos un triple enlace carbono - carbono . El término "sustituido" , tal como se utiliza en la presente invención y en las reivindicaciones anexas, significa el reemplazo de uno o más átomos de hidrógeno de uno o más de los radicales anteriores con un grupo alquilo, un grupo fenilo, o un grupo funcional tal como los grupos hidroxilo, alcoxílo, amino, nitroso, nitro, azo, azido, amido, carboxilo, oxo, tiol, sulfoxilo, sulfonilo, fosfinilo, fosfonilo, fluoro, cloro, bromo, yodo, y grupos similares, tales como los descritos en . Pánico et al. Ed. , A Guide To IUPAC Nomenclature of Organic Compounds , Blackwell Science Ltd. (1993), cuyas descripciones relevantes se incorporan para referencia en la presente invención. El término "liposoma" , tal como se utiliza en la presente invención y en las reivindicaciones anexas, se refiere a un glóbulo cuyas paredes son moléculas de lípido que pueden estar o pueden no estar copolimerizadas una con otra. El término "lípido", tal como se utiliza en la presente invención y en las reivindicaciones anexas, se refiere a cualquier miembro del grupo de aceites, grasas, sustancias oleosas que característicamente son solubles en solventes relativamente no polares, pero que únicamente son muy poco solubles en solventes acuosos. Los lípidos constituyen una de las cuatro clases principales de compuestos encontrados en tejidos vivos e incluyen ácidos grasos, grasas neutras tales como triacilgliceroles, ésteres de ácido graso, y jabones, alcoholes (de ácido graso) y ceras de cadena larga, esfingoides y otras bases de cadena larga, glucolípidos , fosfolípidos , esfingolípidos , carotenos, poliprenoles , esteróles, y similares, así como terpenos e isoprenoides similares. El término "citofectina" , tal como se utiliza en la presente invención y en las reivindicaciones anexas, indica un lípido catiónico apropiado para el suministro de genes y su expresión, constituido por un grupo de cabeza catiónico unido mediante un enlazador a un dominio o porción hidrofóbica . El término "neutro", tal como se utiliza en la presente invención y en las reivindicaciones anexas, con referencia a lipidos incluye lipidos sin carga, por ejemplo, colesterol y similares, así como lipidos zwitteriónicos , por ejemplo, dioleil-fosfatidiletanolamina , dioleilfosfatidilcolina , y similares . El término " colesterilo " , tal como se utiliza en la presente invención y en las reivindicaciones anexas, se refiere a porciones de hidrocarburo tipo esteroide derivadas de, o estructuralmente similares al colesterol. El término "antagonista del receptor de integrina" , tal como se utiliza en la presente invención y en las reivindicaciones anexas, se refiere a un compuesto no peptídico que se une selectivamente a, y antagoniza un receptor de una integrina, por ejemplo, el receptor ?ß3 , el receptor vp5 el receptor ocvp6/ y similares. Uno de dichos compuestos antagonistas de a?ß3 ilustrativo se representan mediante la fórmula: en la cual el grupo amino libre (NH2) está disponible para unir covalentemente el antagonista al dominio hidrofóbico del liposoma a través de un grupo enlazador de superficie tal como un ácido carboxílico y u otro grupo activo apropiado. Otros antagonistas no peptídicos del receptor a?ß3 apropiados que son útiles para los propósitos de la presente invención, cuando están unidos directa o indirectamente a un dominio hidrofóbico de un lípido para selección de blanco se describen en las patentes E.U.A. No. 5,561,148, No. 5,776,973 y No. 6 , 204, 280 y en las publicaciones de patente WO 00/63178, WO 01/10841, WO 01/14337, WO 01/14338, WO 97/45137, WO 98/35949 y WO 00/26212, cuyas descripciones relevantes se incorporan para referencia en la presente invención. Dichos antagonistas del receptor a p3 se ilustran a continuación: y similares, como los descritos en el documento WO 01/14338; y similares, como los descritos en el documento WO 01/14337; y similares, como los descritos en el documento WO 00/63178; similares, como los descritos en el documento 01/10841; con la condición que dichos compuestos incluyan, o estén modificados para que incluyan, un grupo funcional o un grupo formador de estructura en puente que se pueda hacer reaccionar con un enlazador de superficie o dominio hidrofóbico para formar un lipido para selección de blanco. Dichas modificaciones son bien conocidas en la técnica química. Por ejemplo, una de las porciones aromáticas de los compuestos ilustrados anteriormente pueden sustituirse químicamente con un grupo amino, hidroxi o tiol para obtener medios para unión a un enlazador de superficie. De manera alternativa, los grupos aromáticos pueden estar sustituidos con un ácido carboxílico y el enlazador de superficie puede ser, por ejemplo, un compuesto sustituido con amino. El antagonista no peptídico del receptor de integrina se une covalentemente al enlazador de superficie hidrofílico o directamente al dominio hidrofóbico utilizando técnicas químicas convencionales que aseguren el enlace covalente del antagonista al enlazador de superficie o al dominio hidrofóbico. Las reacciones químicas que dan como resultado dichos enlaces son bien conocidas en la técnica e implican el uso de grupos funcionales complementarios en el enlazador de superficie o en el dominio hidrofóbico y en el ligando del antagonista de integrina. De preferencia, los grupos complementarios en el enlazador de superficie o en el dominio hidrofóbico se seleccionan con relación a los grupos funcionales disponibles en el ligando para unión, o que se pueden introducir en el ligando para unión. De nuevo, dichos grupos funcionales complementarios son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la reacción entre un ácido carboxílico y una amina primaria o secundaria en presencia de agentes activadores bien conocidos, apropiados, dan como resultado la formación de un enlace tipo amida el cual puede unir covalentemente el ligando al enlazador de superficie o al dominio hidrofóbico; la reacción entre un grupo amina y un grupo halogenuro de sulfonilo da como resultado la formación de un enlace tipo sulfonamida el cual puede unir covalentemente el ligando al enlazador de superficie o al dominio hidrofóbico; y la reacción entre un alcohol o un grupo fenol y un alquilo o un halogenuro de arilo da como resultado la formación de un enlace tipo éter el cual puede unir covalentemente al ligando del antagonista de integrina al enlazador de superficie o al dominio hidrofóbico. De manera alternativa, el antagonista del receptor de integrina puede incluir un dominio hidrofóbico tal como un grupo alquilo de Ca 8 ~~ C3o , un grupo alquenilo de C18-C30, un grupo alquinilo de C1S-C30, un grupo colestirilo, y similares. El dominio hidrofóbico, con o sin un enlazador de superficie intercalado está unido al antagonista del receptor. de integrina en una posición que conserva la interacción del sitio de unión del receptor y específicamente que permite que el antagonista se oriente por sí mismo para unirse al sitio de unión del receptor de integrina. Dichas posiciones y protocolos de síntesis para unión son bien conocidas en la técnica. Los antagonistas del receptor de integrina ?ß3 preferidos que incluyen, o que pueden estar unidos a, un dominio hidrofóbico son representados por las fórmulas (I) y (II) : en las cuales en la fórmula (I) , R1 y R2 son cada uno hidrógeno, o juntos forman un grupo 1,2-fenileno (C6H ) formador de puente o un grupo etileno (-CH=CH-) formador de puente; X es -C(0)- o un enlace covalente,- n es 1, 2, o 3; Z1 es -C(0)-R3; -C(0)OR3, o S02R3 ; y R3 es fenilo, fenilo sustituido, piridilo, bencilo, bencilo sustituido, halógeno- alquilo de ??-C4 , alquilo de C2-C30, alquenilo de C2-C30, alquinilo de C2-C30 o colesterilo ; y en' las cuales en la fórmula (II) , R4 y R5 son cada uno hidrógeno, o juntos forman un enlace covalente; Y es -C (O) - ó -,CH2-; Z2 es -C(0)-Rs; -C(0)OR6, o S02Rs; R6 es fenilo, fenilo sustituido, piridilo, bencilo, bencilo sustituido, halógeno-alquilo de C1-C4, alquilo de C2-C30, alquenilo de C2-C30, alquinilo de C2-C30 o colesterilo; y Het es 2-piridilo o 2 - imidazolilo . Los ejemplos no limitativos de antagonistas del receptor de integrina de la fórmula (I) incluyen los compuestos la, Ib, Ic, Id, le, y If, siguientes. La preparación de estos compuestos particulares se describe en la publicación del PCT WO 98/35949. Los ejemplos no limitativos de antagonistas del receptor de integrina de la fórmula (II) incluyen los compuestos lia, Ilb, lie, lid, lie, y Ilf, siguientes. La preparación de estos compuestos particulares se describe en la publicación del PCT WO 00/26212.

?? Los antagonistas del receptor de integrina a?ß3 preferidos tienen una masa molecular (PM) en el intervalo de 200 aproximadamente hasta 800 daltons aproximadamente, de manera más preferida desde 450 hasta 610 daltons aproximadamente, cuando no están unidos covalentemente a un dominio hidrofóbico de un lípido para selección de blanco. El antagonista del receptor de integrina a?ß3, cuando está unido covalentemente a, o incluye un dominio hidrofóbico , en combinación con un lipido catiónico, provee un liposoma catiónico que es biocompatible y sustancialmente no inmunogénico . La actividad biológica del liposoma para selección de blanco puede ser sensible a la valencia, geometría, composición, tamaño, flexibilidad o rigidez, etc., del enlazador de superficie hidrofílico, si está presente, y a su vez, de la configuración global del liposoma para selección de blanco, así como del carácter hidrofílico relativo del enlazador de superficie, y similares. Por consiguiente, el enlazador de superficie hidrofílico, cuando está presente, se elige de preferencia para llevar al máximo la actividad biológica del liposoma para selección de blanco. Se puede elegir al enlazador de superficie para incrementar la actividad biológica de la molécula para selección de blanco. En general, el enlazador de superficie se puede elegir a partir de cualquier construcción de molécula orgánica que oriente al antagonista hacía su sitio de unión. En este sentido, el enlazador de superficie puede considerarse como un "bastidor" sobre el cual se acomodan uno o más antagonistas de integrina con el fin de obtener el resultado de orientación deseado. La orientación puede incluir, por ejemplo, presentar 3 O el antagonista a una distancia apropiada desde la superficie del liposoma para permitir la interacción efectiva del antagonista con el sitio activo del receptor de integrina. Por ejemplo, se pueden lograr orientaciones diferentes incluyendo en el bastidor grupos que contengan grupos raonocíclicos o policí clicos , incluyendo grupos arilo y/o grupos heteroarilo, o estructuras que incorporen uno o más enlaces múltiples carbono-carbono (grupos alquenilo, alquenileno, alquinilo o alquinileno) . Otros grupos también pueden incluir oligómeros y polímeros que sean especies de cadena ramificada o recta. En las modalidades preferidas, la rigidez es impartida por la presencia de grupos cíclicos (por ejemplo arilo, heteroarilo, cicloalquilo, heterocíel ico , etc.) . En otra modalidad preferida, el anillo es un anillo de seis o de diez eslabones. En modalidades aún más preferidas, el anillo es un anillo aromático tal como, por ejemplo, fenilo o naftilo. La estructura cristalina de la porción extracelular de la integrina ?ß3, cuando se asocia con un antagonista de integrina, se describe en el documento de Xiong et al., Science 296: 151-155 (2002) . Los antagonistas del receptor de integrina ?ß3 utilizados en la práctica de la presente invención tienen una estructura que nteractúa con el receptor de integrina av 3 en una manera similar a la interacción descrita por Xiong et al. El experto en la técnica puede controlar fácilmente las diferentes características hidrofílicas del enlazador de superficie, así como la presencia o ausencia de porciones cargadas en el liposoma. Por ejemplo, se puede modificar la naturaleza hidrofóbica de un enlazador de superficie obtenido a partir de hexametilendiamina (H2N (CH2) sNH2) o de poliaminas relacionadas para que sea sustancialmente más hidrofílico reemplazando el grupo alquileno con un grupo poli (oxialquileno) tal como poli (etilenglicol ) , poli (propilenglicol ) y similares. Se pueden modificar las propiedades del enlazador de superficie mediante la adición o inserción de grupos auxiliares dentro o sobre el enlazador de superficie, por ejemplo, para cambiar la solubilidad de los liposomas (en agua, grasas, lípidos, fluidos biológicos, etc.), propiedades hidrofóbicas , propiedades hidrofílicas, flexibilidad del enlazador de superficie, propiedades antigénicas, estabilidad, y similares. Por ejemplo, la introducción de uno o más grupos poli (etilenglicol ) (PEG) sobre o dentro del enlazador de superficie incrementa las propiedades hidrofílicas y la solubilidad en agua del liposoma nanoparticulado , incrementa tanto el peso molecular como el tamaño molecular y, dependiendo de la naturaleza del enlazador de superficie, podría incrementar también el tiempo de retención in vivo. Además, el PEG puede incrementar las propiedades antigénicas e incrementar potencialmente la rigidez global del enlazador de superficie . En la práctica de esta invención son útiles los grupos auxiliares que puedan incrementar la solubilidad en agua/propiedades hidrofílicas del liposoma. Por lo tanto, está dentro del campo de la presente invención el utilizar grupos auxiliares tales como, por ejemplo, unidades repetitivas pequeñas de etilenglicoles , propilenglicoles , alcoholes, polioles (por ejemplo, glicerina, propoxilato de glicerol, sacáridos, incluyendo monosacáridos , ol igosacáridos , etc.), carboxilatos (por ejemplo, unidades repetitivas pequeñas de ácido glutámico, ácido acrílico, etc.), aminas (por ejemplo, tetraetilen-pentamina) , y similares, para incrementar la solubilidad en agua y/o propiedades hidrofílicas del liposoma de esta invención. En modalidades preferidas, el grupo auxiliar utilizado para mejorar la solubilidad en agua/propiedades hidrofílicas es un poliéter. El grupo auxiliar puede estar unido a una enlazador de superficie en el lipido para selección de blanco, o puede estar unido a otros lípidos en el liposoma tal como el lipido catiónico o un lipido neutro de relleno, por ejemplo. La incorporación de grupos auxiliares lipofílicos dentro de la estructura del enlazador de superficie para incrementar las propiedades lipofílicas y/o propiedades hidrofóbicas de los liposomas descritos en la presente invención también está dentro del campo de esta invención. Los grupos lipofílicos útiles con los enlazadores de superficie de esta invención incluyen, a manera de ejemplo únicamente, grupos arilo y heteroarilo no sustituidos o sustituidos, pero por lo menos están sustituidos con un grupo que permita su unión covalente al enlazador de superficie. Otros grupos lipofílicos útiles con los enlazadores de superficie de esta invención incluyen derivados de ácido graso que no formen bicapas en medio acuoso hasta que se alcancen concentraciones relativamente más altas. Se puede manipular la flexibilidad del enlazador de superficie mediante la inclusión de grupos auxiliares que sean voluminosos y/o rígidos. La presencia de grupos voluminosos o rígidos puede impedir la libre rotación alrededor de los enlaces en el enlazador de superficie, los enlaces entre el enlazador de superficie y el grupo o grupos auxiliares, o los enlaces entre el enlazador de superficie y los grupos funcionales. Los grupos rígidos pueden incluir, por ejemplo, aquellos grupos cuya labilidad conformacional está restringida por la presencia de anillos y/o enlaces múltiples dentro del grupo, por ejemplo, grupos arilo, heteroarilo, cicloalquilo , cicloalquenileno , y grupos heterocíclicos . Otros grupos que pueden impartir rigidez incluyen grupos tipo polipéptido tales como las cadenas de oligoprolina o poliprolina. La rigidez también se puede impartir en forma electrostática. Por lo tanto, si los grupos auxiliares están cargados ya sea positivamente o negativamente, los grupos auxiliares cargados en forma similar forzarán al enlazador de superficie presentador hacia una configuración que permita obtener la distancia máxima entre cada una de las cargas similares. El costo energético de llevar los grupos con cargas similares más cerca uno del otro tenderá a mantener al enlazador de superficie en una configuración que mantenga la separación entre los grupos auxiliares con carga similar. De manera adicional, los grupos auxiliares que tienen cargas opuestas tenderán a ser atraídos hacia sus contrapartes con cargas opuestas y potencialmente podrían entrar en enlaces iónicos tanto intermoleculares como intramoleculares. Este mecanismo no covalente tenderá a mantener al enlazador de superficie en una conformación que permita la unión entre los grupos con cargas opuestas. La adición de grupos auxiliares que estén cargados, o como alternativa, que tengan una carga latente cuando se desprotegen, después de la adición al enlazador de superficie, incluyendo la desprotección de un grupo carboxilo, hidroxilo, tiol o amino mediante un cambio en pH, oxidación, reducción u otro mecanismo conocido por los expertos en la técnica que dé como resultado la remoción del grupo protector, está dentro del campo de esta invenció . La rigidez también puede ser impartida mediante formación de puentes de hidrógeno e internos o mediante colapso hidrofobico. Los grupos voluminosos pueden incluir, por ejemplo, átomos grandes, iones (por ejemplo, yodo, azufre, iones metálicos, etc.) o grupos que contengan átomos grandes, grupos policíclicos , incluyendo grupos aromáticos, grupos no aromáticos y estructuras que incorporen uno o más enlaces múltiples carbono-carbono (por ejemplo, alquenos y alquinos) . Los grupos voluminosos también pueden incluir oligómeros y polímeros que sean especies de cadena recta o ramificada. Se espera que las especies que sean ramificadas provean una mayor rigidez a la estructura que la provista por especies de cadena recta de peso molecular similar. En algunas modalidades, la rigidez es impartida por la presencia de grupos cíclicos (por ejemplo, arilo, heteroarilo, cicloalquilo , heterocíel ico , etc.) . En otras modalidades, el enlazador de superficie comprende uno o más anillos de seis eslabones. Incluso en otras modalidades, el anillo es un grupo arilo tal como, por ejemplo, fenilo o naftilo. La selección apropiada de un grupo enlazador de superficie que provea orientación apropiada, rotación restringida/no restringida, el grado deseado de propiedades hidrofóbicas/propiedades hidrofílicas , etc. está bien dentro de la habilidad del experto en la técnica. La eliminación o reducción de las propiedades antigénicas de las nanopartí culas descritas en la presente invención también está dentro de la habilidad del experto en la técnica. En algunos casos, se puede eliminar o reducir las propiedades antigénicas de una nanopart ícula mediante el uso de grupos tales como, por ejemplo, grupos poli (etilenglicol ) . El portador de ácido nucleico es un anfífilo catiónico tal como un lípido catiónico, un liposoma catiónico, o una micela que tenga grupos catiónicos, que sea capaz de unirse a un ácido nucleico normalmente por interacción con secuencias de ácido nucleico cargadas negativamente para formar complejos capaces de entrar a la célula. Los liposomas para selección de blanco se ilustran en las figuras 1, 2, 3 , 17 y 18. Los lípidos catiónicos apropiados para los propósitos de la presente invención ( citofectinas ) quedan ilustrados por cloruro de 1 , 2 -dioleoiloxi-3 - (N, , N- trimetilamonio) propano (DOTAP) , bromuro de dimet ildioctadecilamonio (DDAB) , cloruro de dioleoil-dimet i1amonio , dioleoil -L- a- fosfat idiletanolamina (DOPE) , N-colest eriloxicarbaril - 3 , 7 , 12 -triazapenta-decan-1 , 15-diamina (CTAP) , y similares. Un lípido catiónico preferido es DOTAP. Otros lípidos catiónicos apropiados se describen en Miller, Angew. Chem. Int. Ed. 37:1768-1785 (1998), de aquí en adelante en la presente invención "Miller", y Cooper et al., Chem. Eur. J. 4(1) : 137-151 (1998), incorporado en la presente invención para referencia hasta el grado pertinente. El liposoma para selección de blanco de la presente invención puede estar entrelazado, parcialmente entrelazado, o libre de entrelazamiento. Los liposomas entrelazados pueden incluir componentes entrelazados así como componentes no entrelazados. Un liposoma no entrelazado para selección de blanco de ejemplo de la presente invención es una mezcla de lípidos que incluye DOTAP (lípido catiónico) , colesterol (lípido neutro) , polietilen-glicol (un componente auxiliar hidrofílico) tal como PEG-350 (un polioxietileno que tiene 350 unidades repetitivas de oxietileno) y un antagonista no peptídico del receptor de integrina unido covalentemente a, o que incluye, un lípido. De preferencia, la relación de DOTAP a colesterol a polie ilenglicol es de aproximadamente 1:1:0.12 respectivamente, y el lípido que contiene al antagonista no peptídico del receptor de integrina (lípido para seleccionar como blanco a la integrina) está incluido en una cantidad suficiente para proveer una avidez relativamente alta para la integrina a?ß3. De preferencia el liposoma para selección de blanco incluye al lípido para seleccionar como blanco a la integrina en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20% molar tomando como base las moles totales de componentes lípidos en el liposoma, de manera más preferida desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 12% molar. Un liposoma entrelazado para selección de blanco preferido de la presente invención incluye un lípido z itteriónico o neutro polimerizable , un lípido polimerizable para seleccionar como blanco a la integrina y un lipido catiónico polimerizable apropiado para unir un ácido nucleico. En otra modalidad preferida, el liposoma entrelazado para selección de blanco incluye un lípido zwitteriónico o neutro polimerizable, un lípido polimerizable para seleccionar como blanco a la integrina y un lípido catiónico no polimerizable. El liposoma que contiene lípidos polimeri zables puede ser entrelazado, por ejemplo, mediante la adición de un iniciador de polimerización por radicales libres apropiado, mediante irradiación con una longitud de onda apropiada de luz ultravioleta, o mediante otros métodos conocidos en la técnica de polimerización. Los liposomas catiónicos apropiados o citofectinas se pueden conseguir comercialmente y también se pueden preparar como se describe en Sipkins et al., Nature Medicine, 1998, (5) : (1998) , 623-626 o como se describe en Mi 11er, supra . Los liposomas catiónicos se pueden formar ya sea a partir de un anfífilo catiónico individual o a partir de una combinación de un anfífilo catiónico y de un lipido neutro, por ejemplo, a partir de 3,3- [N- (?' ,?' -dimetilaminoetano) carbamoil] -colesterol y dioleil L- -fosfatidil-etanolamina . Las características hidrofílicas se derivan de la presencia de un fosfato, un fosfonato, un carboxilato, un sulfato, un sulfonato, un sulfhidrilo , un amino, un nitro, un hidroxilo, u otros grupos similares, los cuales son bien conocidos en la técnica. Las propiedades hidrofóbicas pueden ser conferidas por la inclusión de grupos que incluyen, pero que no se limitan a, grupos hidrocarburo alifáticos de cadena larga saturados u no saturados de hasta 20 átomos de carbono y dichos grupos sustituidos con uno o más grupos arilo, heteroarilo, cicloalquilo , y/o grupo (s) heterocí clicos .

Los lípidos preferidos son fosfoglicéridos y esf ingolípidos . Los ejemplos representativos de fosfoglicéridos incluyen fosfatidilcolina , fosfatidil-etanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol , ácido fosfatídico, palmitoiloleoil - fosfatidilcolina, lisofosfatidil -colina, lisofosfatidiletanolamina, di-palmitoilfosfatidilcolina, dioleoil-fosfatidilcolina, distearoilfosfatidilcolina, y dilinoleoilfosfatidilcolina. Los compuestos que carecen de grupos fosfatados, tales como las familias de esf ingolípidos y glucoesfingolípidos , también están dentro del grupo designado como lípido. De manera adicional, los lípidos anfipáticos descritos anteriormente pueden estar mezclados con otros lípidos incluyendo triglicéridos y esteróles tales como colesterol, colesteroles modificados, y similares. Los antagonistas del receptor de integrina pueden incluir un dominio hidrofóbico o pueden estar unidos al enlazador de superficie o directamente a un dominio hidrofóbico en cualquier posición apropiada, por ejemplo, en el extremo terminal de una cadena lineal o en cualquier posición intermedia de la misma, en tanto que el enlazamiento no interfiera con la unión del antagonista al receptor de integrina. Los antagonistas del receptor de integrina también pueden incluir, o estar provistos con, un grupo bivalente opcional forraador de puente para facilitar la unión al enlazador de superficie, si se desea. La figura 1 ilustra en forma esquemática un liposoma para selección de blanco como una partícula con forma esférica que tiene sitios de unión a ácido nucleico y sitios para seleccionar como blanco a la integrina sobre la superficie de la partícula. La figura 2 ilustra un liposoma entrelazado para selección de blanco de la presente invención. La figura 3 ilustra otro liposoma entrelazado para selección de blanco, en el cual el lípido catiónico está presente en el liposoma, pero no esta entrelazado al mismo. La preparación de esta modalidad de liposoma para selección de blanco se describe con mayor detalle en la sección de Materiales y Métodos más adelante en la presente invención. Dicho liposoma entrelazado presenta, en su superficie más externa, grupos catiónicos obtenidos a partir de las porciones colina, capaces de unir ácidos nucleicos, y sitios de unión al receptor de integrina obtenidos a partir de los grupos del antagonista de integrina unidos a un enlazador de superficie hidrofílico. Los ácidos nucleicos pueden unirse a la nanopartícula de liposoma entrelazada poniendo en contacto un ácido nucleico cargado negativamente con el grupo catiónico presente en el liposoma, por ejemplo mezclando el ácido nucleico y el liposoma para selección de blanco en un medio acuoso farmacéuticamente aceptable a pH fisiológico. Los liposomas para selección de blanco complejados con ácido nucleico formados de esta manera son absorbidos fácilmente por las células que presentan integrina que se ponen en contacto con los liposomas para selección de blanco tanto in vitro como in vivo. La relación de cargas positivas del liposoma para selección de blanco a cargas negativas del ácido nucleico de preferencia es mayor de 1.2 aproximadamente. Para la selección como blanco o antagonismo selectivo de las integrinas, tales como las integrinas ?ß3, los compuestos y composiciones de la presente invención se pueden administrar en una cantidad terapéuticamente efectiva por vía parenteral, por vía oral, mediante inhalación, o por vía tópica en formas de dosificación unitarias junto con portadores, vehículos y coadyuvantes farmacéuticamente aceptables. El término "parenteral", tal como se utiliza en la presente invención, incluye administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, intra-esternal , intraocular (por ejemplo intra-vítreo) , e intraperitoneal , así como administración mediante técnicas de infusión. Se puede utilizar cualquier vía de administración apropiada. La composición farmacéutica que incluye un ácido nucleico unido a nanopart ícula de la presente invención se administra en una dosis efectiva para el tratamiento pretendido. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente las cantidades terapéuticamente efectivas requeridas para tratar una condición médica particular, o inhibir el progreso de la misma, utilizando estudios preclínicos y clínicos conocidos en el campo médico. El término "cantidad terapéuticamente efectiva", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a aquella cantidad de ingrediente activo que evoca la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o humano, buscada por un médico o un investigador . El término "inhibir," tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a una reducción, interrupción o detención de la condición médica, pero no necesariamente indica una eliminación total de la condición. Una capacidad de supervivencia prolongada de un paciente, por y para sí mismo, indica que la condición médica está benéficamente controlada. Los regímenes de dosificación para los ácidos nucleicos unidos al liposoma para selección de blanco de la presente invención o las composiciones que contienen a los mismos, se basan en varios factores tales como la edad, peso, sexo, y tipo de condición médica del paciente, la gravedad de la condición, la vía de administ ación, y la actividad antagonista de la molécula para selección de blanco o del ligando particular utilizado. El régimen de dosificación puede variar en función de los factores antes mencionados. Los niveles de dosis en el orden de aproximadamente 0.01 miligramos hasta aproximadamente 1000 miligramos por kilogramo de peso corporal son útiles en el tratamiento de las condiciones médicas antes mencionadas. Los niveles de dosis preferidos están en el intervalo de aproximadamente 0.01 miligramos hasta aproximadamente 100 miligramos por kilogramo de peso corporal . Para la administración mediante inyección, se formula una composición que contenga un liposoma para selección de blanco que representa la presente invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como agua, solución salina, o una solución acuosa de dextrosa. Para inyección, una dosis diaria típica es de aproximadamente 0.01 miligramos hasta aproximadamente 100 miligramos por kilogramo de peso corporal, inyectada diariamente como una sola dosis o como dosis múltiples dependiendo de los factores antes mencionados. Para inhibir la angiogénesis, por ejemplo, se administra a un paciente en necesidad de inhibición de angiogénesis una cantidad terapéuticamente efectiva de un liposoma para selección de blanco que representa la presente invención y que porta un ácido nucleico tal como un ácido ribonucleico (ARN) o un ácido desoxirribonucleico (ADN) que pueda expresar una proteína o péptido inhibidor de angiogénesis. El ácido nucleico administrado entra después al núcleo de una célula y expresa una proteína objetivo en las células del endotelio vascular. Se proveen los siguientes ejemplos no limitativos para ilustrar adicionalmente los diversos aspectos de la invención. El experto en la técnica reconocerá que se pueden hacer modificaciones de los ejemplos y modalidades ilustradas descritas en la presente invención sin alejarse del alcance y campo de la invención.

Materiales y métodos Preparación de nanopartí culas La construcción de liposomas para selección de blanco multivalentes que se unen a las integrinas comienza con el diseño y síntesis de la molécula de lípido pol imeri zable 12 para seleccionar como blanco a la integrina (Figura 17; Esquema de reacción 1) . Se protege al grupo amino de la taurina 1 como el derivado benciloxicarbonilo (CBZ) para obtener el compuesto 2, seguido por formación del cloruro de sulfonilo 3 y copulación al éster metílico del ácido ter-butoxicarbonil diaminopropionico 4 para obtener el compuesto 5. La saponificación del compuesto 5 provee el compuesto 6 y la remoción del grupo ter-butoxi-carbonilo (BOC) produce al intermediario clave 7. La copulación del compuesto 7 al derivado de ácido benzoico 8 provee el compuesto 9, el cual se hidrogena para desproteger la amina y reducir simul áneamente el anillo de pirimidina para obtener el conjugado 10 de antagonista del receptor de integrina -enlazador. La síntesis del compuesto 8 ha sido descrita previamente por Duggan et al. J". Med. Chem. , 2000, 43, 3736-3745, cuyas descripciones relevantes se incorporan en la presente invención para referencia. La copulación de tres equivalentes del compuesto 10 al lípido quelante 11 de ácido tricarboxílico utilizando hexafluorofosfato de benzotriazol-l-iloxitris (dimetil -atnino) fosfonio (BOP) provee el lípido trivalente clave 12 antagonista de integrina. La preparación del compuesto 11 ha sido descrita previamente por Storrs et al. J. Magn. Reson. Imaging, 1995, 5, 719-724, cuya descripción relevante se incorpora en la presente invención para referencia. El tratamiento del compuesto 11 con metóxido de sodio en metanol permite obtener el compuesto 15 (es decir, la sal trisódica del compuesto 11) . El complejo lípido 14 quelante de europio se sintetiza calentando el compuesto 15 con una solución de tricloruro de europio en la manera descrita por Storrs, et. al., supra . El esquema de reacción 2, en la figura 18, indica la formación de liposomas entrelazados para selección de blanco (NPs) mediante auto-ensamble y polimerización de los lípidos apropiados como fue descrito previamente por Storrs, et. al., supra. Los liposomas entrelazados para selección de blanco de ejemplo se sintetizan combinando el antagonista de integrina- lípido trivalente 12, con el fosfolípido zwitteriónico de diacetileno 13, y el complejo de lípido 14 quelante de europio en una solución de cloroformo. El compuesto 14 se agrega a una concentración de 1% en peso a todas las formulaciones con el fin de visualizar las partículas utilizando espectroscopia de fluorescencia. A esta solución de llpidos en cloroformo se agrega ya sea el lipido quelante aniónico 15 o el lípido cationico 16 (DOTAP) con el fin de variar la carga de superficie. Se controla la densidad en superficie de los antagonistas de integrina sobre los NP variando la cantidad del compuesto 12 en el liposoma. Para formar vesículas, se evaporan hasta sequedad las soluciones de lípido combinadas y se secan al alto vacío para eliminar cualquier solvente residual para formar una película de lípido. La película de lípido seca se hidrata hasta una densidad de lípido conocida (30 mM) utilizando agua desionizada. La suspensión resultante se somete después a tratamiento sónico a temperaturas por encima de la transición de fase de gel-cristal líquido (Tm 64°C), siguiendo el procedimiento de Leaver et al. Biochim. Biophys . Acta, 1983, 732, 210-218, utilizando un sonicador con punta de sonda mientras se mantiene el pH entre 7.0 y 7.5. Después de una hora aproximadamente de tratamiento sónico, la solución se torna transparente. Las vesículas se polimerizan después enfriando la solución hasta 0°C sobre un lecho de hielo húmedo e irradiando la solución a 254 nm aproximadamente con una lámpara portátil de UV durante 2 horas aproximadamente. Los liposomas resultantes (NP1 hasta NP6) son de color amarillo-naranja y tienen dos bandas de absorción visibles centradas a 490 nm y 535 nm y que surgen del polímero de diacetileno eno-ino conjugado. El diámetro promedio de los NP está entre 40 nm y 50 nm según se determina mediante dispersión de luz dinámica (DLS ) . El potencial zeta está entre -42 y -53 mV para el NP1 hasta NP4 (es decir NP1-NP4 tienen carga negativa) y entre +35 y +43 mV para NP5 y NP6 (es decir NP5 y NP6 están cargados positivamente) respectivamente (Brookhaven Instruments, Holtsville, NY) . Los liposomas son estables durante meses sin cambios significativos en las propiedades físicas y biológicas cuando se formulan para aplicaciones in vivo utilizando 150 mM de cloruro de sodio, 50 mM de histidina, y soluciones de dextrosa al 5%. En el siguiente cuadro 1 se proveen las composiciones de los liposomas NP1 hasta NP6, expresadas como % molar de los componentes 12 (lípido para selección de blanco) , 13 (lípido zwitteriónico) , 15 (lípido quelante aniónico) , y 16 (lípido catiónico; DOTAP) .

CUADRO 1 Composición de liposoma NP1-NP6 Liposoma % molar de % molar de ir molar de % molar de lípido para lipido lípido lípido selección de zwitteriónico aniónico catiónico blanco P1 10 80 10 0 NP2 1 89 10 0 NP3 0.1 90 10 0 NP4 0 90 10 0 NP5 10 80 0 10 MP6 o 90 0 10 Los liposomas se construyen mediante polimerización de las vesículas utilizando 0.1, 1 y 10 % molar del compuesto 12 complejo de antagonista de integrina-lípido y del compuesto 13 como se indica en la figura 18, incorporando en los liposomas los materiales adicionales 14, 15 y 16 antes de la polimerización para variar la densidad de carga de superficie y permitir que los liposomas se puedan visualizar mediante fluorescencia. Por simplicidad, el compuesto 13, el cual es opcional, y constituye únicamente el 1% molar del liposoma, no se muestra en la figura 18. Los materiales que contienen 10% molar del compuesto 12 (NP1 y NP5) tienen la más alta afinidad para el sitio de unión a la integrina a?ß3.

En una prueba de unión a integrina competitiva utilizando espectroscopia de fluorescencia por resolución en tiempo, ésta tomó cerca de 100 veces del ligando 10 libre (65 µ?) para reducir la unión de los NP1 y la integrina tß3 en un 50%, a pesar del hecho que tiene solamente el equivalente de 0.5 µ? del antagonista 10 de integrina sobre su superficie. En una prueba in vitro para la inhibición de adhesión celular utilizando la unión de células de melanoma M21 a?ß3 -posi ivas a placas recubiertas con vitronectina , la GI50 para el ligando 10 libre es de 60 µ?. En un contraste muy agudo, la CI50 para la partícula aniónica NP1 es de 0.27 µ? equivalentes del compuesto 10 sobre su superficie. Esto representa una avidez cerca de 200 veces más grande hacia la superficie celular cuando el ligando 10 está en los NP en comparación con el ligando libre. Para la partícula catiónica NP5 , la CI50 es de 0.35 µ? equivalentes del compuesto 10 lo cual es una avidez aproximadamente 180 veces mayor cuando se compara con el ligando libre como se muestra en el siguiente cuadro 2. Por lo tanto, sin considerar la carga de superficie, los NP tienen una avidez incrementada en aproximadamente 180-200 veces hacia las integrinas cuando se compara con el ligando monomérico. Este resultado demuestra que se presenta una interacción robusta entre la superficie del NP y la superficie de la célula. Esta interacción es independiente de la carga de superficie sobre los NP y está directamente relacionado con una interacción receptor-ligando específica. Se puede obtener un incremento de avidez de aproximadamente dos ordenes de magnitud mediante la presentación multivalente de un antagonista de integrina sobre la superficie de los NP en comparación con el ligando libre. Cuando la cantidad de compuesto 12 en las formulaciones de NP se reduce en 10 veces y en 100 veces hasta 1% molar 0.1% molar tal como en NP2 y NP3 respectivamente, la capacidad para bloquear la adhesión celular se reduce en aproximadamente uno y dos órdenes de magnitud, respectivamente como se muestra en el siguiente cuadro CUADRO 2 Propiedades físicas y biológicas de los liposomas NP1-NP6 Prueba de Efecto de la . Prueba de adhesión mult valencia Tamaño Potencial inhibición celular CI50 Material (mm) zeta competitiva CI50 (µ? de (µ? de 10) (uM de 10 [10] libre/ [10] en en los NP) los NP) NPl 45.1 ± 0,6 -42 65 0.27 237 NP2 42.8 + 1.5 -49 24 7 9 CUADRO 2 (cont . ) Prueba de Efecto de la Prueba de adhesión muí ivalencía Potencial Tamaño inhibición celular CI50 Material zeta (mm) competitiva CI50 (mV) (µ? de (µ? de 10) (uM de 10 [10] libre/ [10] en en los NP) los NP) NP3 44.4 ± 0 -53 1 30.5 2 Sin NP4 45.4 ± 0 -49 NA NA inhibición NP5 41.7 ± 2 35 60 0.35 183 Sin NPS 35-8 + 0 43 NA NA inhibición El liposoma NP5 representa un liposoma entrelazado para selección de blanco de ejemplo de la presente invención.

Métodos generales de síntesis Todos los reactivos y solventes utilizados son de grado reactivo. Las evaporaciones de solvente se efectúa a presión reducida provista a partir de una aspiradora doméstica o una bomba de vacío de transmisión directa Welch a <40°C. Los espectros 1H y 13C-RMN se registran en un aparato JEOL FX90Q a 90 MHz para los espectros de protón y a 23 MHZ aproximadamente para los espectros de carbono en CDC13, CD3OD, D20 o combinaciones de los mismos como se describe para cada caso. (Nota: aunque solubles en CDCI3, la adición de CD3OD a los lípidos inhibe la formación de micelas invertidas y por lo tanto provee espectros más definidos) . Los espectros se estandarizan a CHC13 residual (7.25 ppm) para los experimentos de 1H y la línea central de CDCl3 (77.00 ppm) para los experimentos de 13C. La espectrometría de masas MALDI-TOF se efectúa en un instrumento PerSeptive DE instrument (Espectrometría de Masas, El Instituto Para Investigaciones Scripps, La Jolla, CA) . La CCF se efectúa en gel de sílice Merck 60 F254 (0.2 mm; EM Separations, Wakefield, RI ) soportada en placas de vidrio y las placas reveladas se asperjan en forma rutinaria con sulfato cérico (1%) y molibdato de amonio (2.5%) en ácido sulfúrico al 10% y se calientan hasta aproximadamente 150°C. Otros reveladores incluyen yodo (uso general) , ninhidrina al 0.5% en acetona (para aminas) , y luz ultravioleta (para cromóforos UV) .

Sal sódica de N-benciloxicarbonil- taurina (2) Se disuelve taurina 1 (aproximadamente 40 g, 320 mmoles) , en solución de hidróxido de sodio 4N (80 mi) y agua (aproximadamente 200 mi) . A esta solución se agrega cloruro de benciloxicarbonilo, (aproximadamente 48 mi, 330 mmoles) mediante goteo, con agitación vigorosa durante un periodo de aproximadamente 4 horas. El pH de la solución se mantiene alcalino mediante la adición de solución de bicarbonato de sodio al 10% (aproximadamente 300 mi,) y solución de hidróxido de sodio 4N (aproximadamente 45 mi) . La mezcla de reacción obtenida se lava después con éter dietílico (aproximadamente 1000 mi) y la capa acuosa se evapora hasta sequedad mediante evaporación giratoria, y se seca adicionalmente al alto vacío con pentóxido de fósforo durante la noche para producir aproximadamente 12.7 g (14%) del compuesto 2. """H-RMN (D20) : a 7.50 (5H, s, Ar-H) , 5.21 (2H, s, Ar-CH2) , 3.62 (2H, t, CH2), 3.14 (2H, t, CH2) .

Cloruro de 2-benciloxicarbonilamidoetansulfonilo ( 3 ) Se suspende la sal sódica de N-CBZ- taurina 2 (aproximadamente 12.7 g, 32 mmoles) en éter dietílico seco (aproximadamente 30 mi) bajo una presión positiva de argón y se trata con pentacloruro de fósforo (aproximadamente 7 g, 33.6 mmoles) en 5 porciones en un lapso de aproximadamente 15 minutos. La reacción se agita durante 4 horas aproximadamente a temperatura ambiente. El solvente se elimina mediante evaporación giratoria. Se agrega agua helada (aproximadamente 10 mi) y el residuo obtenido se tritura después de enfriar el matraz y los contenidos en un baño de hielo. Se agrega más agua helada (aproximadamente 50 mi) , y el producto solidifica. Los sólidos se recolectan mediante filtración, se lavan con agua helada (aproximadamente 20 mi) , y se secan con pentóxido de fósforo durante la noche para producir aproximadamente 6.95 g (78%) del compuesto 3. 1H-RMN (CDC13) : d 7.35 (5H, s, Ar-H) , 5.12 (2H, s, Ar-CH2) , 3.89 (2H, t, CH2) que se traslapan con 3.85 (2H, t , CH2) . 3-butiloxicarbonilamido-2- (S) -benciloxicarbonil-amidoetilsulfonamidopropionato de metilo (5) Una mezcla del cloruro de sulfonilo 3 (21.6 g aproximadamente, 78 mmoles) y 3 -N-butoxicarbonilamido-2 -aminopropionato de metilo (4, aproximadamente 9.96 g, 39.2 mmoles) en tetrahidrofurano anhidro (THF, 150 mi) bajo una presión positiva de argón se enfría en un baño de hielo. A esta solución se agrega N-metilmorfolina (aproximadamente 16 mi, 145 mmoles) en THF anhidro (aproximadamente 275 mi) mediante goteo durante un periodo de aproximadamente 30 minutos utilizando un embudo de adición previamente secado y bajo una presión positiva de argón. Después de agitar durante 1 hora aproximadamente en el baño de hielo, se observa mediante CCF que sustancialmente todo el cloruro de sulfonilo (Rf = 0.65) ha sido consumido (eluyente: acetato de etilo/hexano 1:1) . Sin embargo aún está presente ácido diaminopropionico sin reaccionar (Rf= 0.1, aspersión de ninhidrina) . Se agrega más cloruro de sulfonilo (aproximadamente 5.0 g, 18 mmoles) durante un periodo de aproximadamente 3 horas. El producto de reacción obtenido se filtra después y se somete a evaporación giratoria para eliminar el solvente y se disuelve en acetato de etilo (aproximadamente 100 mi), se lava con ácido clorhídrico diluido frío (aproximadamente 20 mi), solución saturada de bicarbonato de sodio (aproximadamente 20 mi), y después con solución saturada de cloruro de sodio (aproximadamente 20 mi), y después se seca con sulfato de sodio anhidro. El solvente se elimina mediante evaporación giratoria, y el residuo producido se seca al vacío durante la noche. El residuo seco se recristaliza disolviendo primero en acetato de etilo y agregando después un volumen igual de hexano para obtener el éster metílico 5 como un sólido incoloro, aproximadamente 13.4 g (aproximadamente 74%) . ^?-???G (CDC13) : d 7.36 (5H, s, Ar-H) , 5.83 (1H, d, NH) , 5.55 (1H, t, H) , 5.12 (2H, s, Ar-CH2), 5.06 (1H, t, NH) , 4.26 (2H, m, CH) , 3.79 (3H, s, CH3) , 3.70 (2H, dd, CH2) , 3.26 (2H, dd, CH2) , 1.43 (9H, S, (CH3) 3) · Acido 3 -butiloxicarbonilamido-2 - (S) -benciloxi-carbonilamidoe il sulf onamidoprop iónico ( 6 ) Se enfría en un baño de hielo una solución del éster metílico 5 (aproximadamente 13.3 g, 25.9 mmoles) en tetrahidrofurano (aproximadamente 160 mi) . A esta solución se agrega una solución de hidróxido de litio (aproximadamente 5.42 g, 128 mmoles) en agua helada (160 mi) . La mezcla de reacción producida se calienta lentamente hasta temperatura ambiente mediante remoción del baño de hielo y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 1 hora aproximadamente. El solvente orgánico se elimina después mediante evaporación giratoria. La porción acuosa residual se lava con éter dietílico (aproximadamente 20 mi) y después se acidula hasta pH 4 aproximadamente utilizando ácido clorhídrico diluido. Esta solución se enfría en un baño de hielo, después se mezcla con acetato de etilo (aproximadamente 100 mi) , y después se acidula adicionalmente .hasta pH 1 aproximadamente utilizando ácido clorhídrico diluido helado e inmediatamente se extrae con acetato de etilo (aproximadamente 2x200 mi) . La capa de acetato de etilo se lava con salmuera (aproximadamente 50 mi) y se seca con sulfato de sodio anhidro. El solvente se elimina después mediante evaporación giratoria, y el residuo obtenido se seca al alto vacío durante la noche para obtener aproximadamente 13.3 g de un sólido espumoso, el cual se recristaliza con hexano/acetato de etilo (1:1) para obtener aproximadamente 11.6 g (89.7%) del compuesto 6. 1H - RMN (CDC13) : 6 7.33 (5H, s, Ar-H) , 6.12 (1H, d, NH) , 5.68 (1H, t, NH) , 5.26 (1H, t, NH] , 5.1 (2H, s, Ar-CH2) , 4.24 (2H, m, CH2) , 3.67 (2H, t, CH2) , 3.27 (2H, t, CH2) , 1.45 (9H, s, C(CH3)3) .

Acido 3 -amino-2- (S) -benciloxicarbonilamido-etilsulfonamidopropiónico (7) Se trata N-BOC-p-aminoácido 6 (aprox. 11.5 g, 25.8 mmoles) con ácido trifluoroacético (aproximadamente 68 mi) en cloruro de metileno (aproximadamente 350 mi) durante aproximadamente 1.5 horas y después se evapora, mediante evaporación giratoria, hasta sequedad. El residuo obtenido se disuelve en agua (aproximadamente 200 mi) y se liofiliza para obtener aproximadamente 10.9 g (98.8%) del compuesto 7 como un sól ido . 1H-RMN (CDCI3) : 6 7.30 (5H, s, Ar-H) , 6.07 (1H, d, NH) , 5.61 (1H, t, NH) , 5.20 (1H, t, NH) , 5.17 (2H, s, Ar-CH2) , 4.11 (2H, m, CH2) , 3.53 (2H, t, CH2) , 3.32 (2H, t , CH2) . DCI-MS para CiaHis sOgS : m/z (ion) 346 (M+H) (calculado para C13Hi9N305S + H, m/ z 346) . 4 - [ 2 - ( irimidin- 2 - ilamino ) et iloxi ] benzoil - 2 -(S ) -benciloxicarbonilamidoetilsulfonamido-ß -alaniña (9) Se disuelven el derivado de ácido benzoico 8 (6.4 g aproximadamente, 24.7 mmoles) y N-hidroxisuccin-imida (aproximadamente 3.6 g, 31 mmoles) en sulfóxido de dimetilo anhidro (aproximadamente 110 mi) , bajo una presión positiva de argón, y se enfría en un baño de hielo. A esta solución se agrega clorhidrato de 1 - (3 - (dimet i lamino) propil ) - 3 - et ilcarbodi - imida (4.9 g aproximadamente, 25.6 mmoles) . La solución se agita a una temperatura helada durante 1 hora y después se permite que se caliente hasta temperatura ambiente. La agitación se continúa a temperatura ambiente durante otras 24 horas aproximadamente. A la mezcla que se produce se agrega una solución del ß-aminoácido 7 (aproximadamente 12.2 g, 25.8 mmoles) seguido por N-met ilmorfolina . La mezcla de reacción producida se agita bajo argón durante 3 días aproximadamente. La mezcla resultante se vierte después en agua (aproximadamente 1 litro) , se acidula con ácido clorhídrico diluido hasta pH 1.5 aproximadamente, y se extrae con acetato de etilo (aproximadamente 5 x 500 mi) . La fase orgánica combinada se lava con solución saturada de cloruro de sodio (aproximadamente 50 mi) y después se seca con sulfato de sodio anhidro. El solvente se elimina mediante evaporación giratoria. El residuo obtenido se tritura en acetato de etilo, se filtra, y después se seca al alto vacío para obtener aproximadamente 10.5 g (72.5%) del compuesto 9. 2H- MN (DMSO-dg) : d 8.30 (2H, d, Ar-H) , 7.99 (2H, d, Ar-H) , 7.34 (5H, s, Ar-H) , 7.00 (2H, d, Ar-H) , 6.60 (1H, dd, Ar-H) , 5.01 (2H, s, CH2) 4.15 (1H, t, CH) , 3.67 (2H, t, CH2) , 3.56 (2H, t, CH2) 3.17 (2H, t, CH2) . 4- [2- (3,4,5, 6- tetrahidropirimidin-2-ilamino) -etiloxi] benzoil-2- (S) -aminoetilsulfonamido-P-alanina (10) Se disuelve una solución del derivado de pirimidina 9 (aproximadamente 3.7 g, 6.4 mmoles) en ácido acético (aproximadamente 190 mi) y ácido clorhídrico concentrado (aproximadamente 17 mi ) . La solución obtenida se mezcla con 10% de paladio sobre carbón (aproximadamente 1.62 g) y se hidrogena a 3.16 kg/cm2 de gas hidrógeno aproximadamente durante 5 horas aproximadamente. La mezcla producida se filtra después a través de celita y se lava con agua. El solvente se elimina mediante evaporación giratoria, y el residuo obtenido se seca al alto vacío. El residuo seco se disuelve en agua (aproximadamente 100 mi) , se ajusta el pH a 7 aproximadamente con solución 1N de hidróxido de sodio, y después se evapora, mediante evaporación giratoria, hasta sequedad. El residuo obtenido se disuelve en metanol (aproximadamente 20 mi) y se filtra. El material filtrado se evapora mediante evaporación giratoria, se disuelve en agua (aproximadamente 275 mi) y se liofiliza. El producto liofilizado obtenido se recristaliza después con agua para obtener aproximadamente 2.96 g (aproximadamente 78.9%) del producto 10. XH-RMN (D20) : d 7.80 (2H, d, Ar-H) , 7.14 (2H, d, Ar-H) , 4.49 (1H, s, CJÍaHb) , 4.28 (2H, t, CH2) , 3.94 (1H, dd, CHaHb) , 3.61 (6H, m, CH2) , 3.32 (4H, t, CH2) , 1.90 (2H, t , CH2) . ES-MS para Ci3H28NsOsS: m/z (ión) 457 (M+H) (calculado para C18H28NsOsS + H, m/z 457) .

[ (PDA-PEG3) 2-DTPA- (CONHPM) 3] (12) Se disuelve ( PDA- PEG3 ) 2 -DTPA- ( COOH) aproximadamente 69 rag, 50 µtt???ß?) en CH3CN anhidro (aproximadamente 5 mi) , CH2C12 anhidro (aprox. 2 mi) y Et3N (aproximadamente 1 mi) en un matraz de fondo redondo de 3 cuellos, que se seca previamente a la flama y se llena con argón. A la solución resultante se agrega el reactivo BOP (aproximadamente 134 mg, 150 µt???e?) , y la mezcla producida se agita bien durante 5 minutos para obtener una solución de lípido. Se prepara una solución del compuesto 10 (aproximadamente 69 mg, 150 moles) en un frasco seco lleno con argón, en una mezcla de CH3CN anhidro (aproximadamente 5 mi) y dimet ilformamida anhidra (DMF) (aproximadamente 2 mi) . La solución del compuesto 10 se agrega a la solución de lípido utilizando una jeringa seca con agitación continua. La mezcla de reacción producida de esta manera se agita durante 10 horas en la oscuridad. El análisis de CCF (solvente: CHC13, CH30H, H20, y CH300H muestra la desaparición completa del material de partida (Rf = 0.53) . Se presenta un producto mayor (Rf = 0.2) y 5 productos menores (Rf < 0.18) . El solvente se elimina mediante evaporación giratoria, y el residuo obtenido se seca al alto vacío durante aproximadamente 24 horas para obtener un producto crudo . El producto crudo se purifica mediante HPLC de fase normal utilizando una columna de sílice semi -preparativa , velocidad de flujo de 5 ml/min aproximadamente (sistema de gradiente que empieza con 100% de CHCl3 durante aproximadamente 5 minutos, después 75% de CHCl3/25% de CH3OH durante 10 minutos, después 50% de CHCl3/50% de CH3OH durante 10 minutos, después 25% de CHCl3/75% de CH30H durante aproximadamente 10 minutos, y por último durante aproximadamente 20 minutos con 100% de CH30H) . Se combinan las fracciones (tiempo de retención 35 a 37 minutos) que contienen al producto mayor y se evaporan mediante evaporación giratoria para eliminar el solvente, y el residuo obtenido se seca al alto vacío durante 24 horas aproximadamente para obtener aproximadamente 35.5 mg (26.5%) del producto deseado. MALDI - F S de alta resolución: m/z 2681.4711 (calculado para C13oH2o9N25029S3 + H, m/z 2681.4882) .

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Prueba de adhesión celular El estudio de inhibición de adhesión celular se efectúa en placas revestidas con vitronectina utilizando la línea celular M21 de melanoma de humano. Se incuban por separado los liposomas muí tivalentes NP1-NP6 así como el ligando monomérico 10 con células M21 y se aplican sobre placas de 48 cavidades revestidas con vi tronect ina . Después de 1 hora aproximadamente de incubación, se lavan las cavidades, y las células adheridas se tiñen con una solución de cristal violeta y se mide la densidad óptica (DO) a 590 nin aproximadamente. La DO medida es proporcional al número de células unidas a la placa de vitronectina y se gráfica contra la concentración del componente 10 sobre la superficie de los NP en formulaciones diferentes para calcular la CI50. La figura 8 muestra de manera esquemática la prueba de adhesión celular en la cual se mezclan células de melanoma de humano M21, las cuales expresan a <??ß3, con liposomas conjugados en forma covalente a un antagonista (ligando) de integrina o al ligando solo. Las células se colocan después en placas con vitronectina, se lavan y se tiñen. Después se cuenta el número de células unidas utilizando una contadora de placa. La figura 9 es una presentación gráfica de datos obtenidos utilizando la prueba de adhesión mostrada en la. figura 8 y que muestra que los liposomas unidos al antagonista de integrina inhiben fuertemente la adhesión celular (CI50 = 1 µ?) , mientras que el antagonista sólo (ligando) es mucho menos efectivo para inhibir la adhesión celular (CI50 = 0.5 mM) .

EJEMPLO 2 Prueba de transfección in vitro Se complejan treinta nanomoles aproximadamen e de cada uno de los liposomas catiónicos NP5 y NP6, con o sin ligando para seleccionar como blanco a a? 3 conjugado covalentemente , respectivamente, con 2µg aproximadamente de ADN plásmido que codifica para la proteína verde fluorescente (GFP) en solución de dextrosa al 5% y después se expone a células de melanoma in vitro durante 1 hora aproximadamente. Se evalúa la eficiencia de transfección contando el número de células fluorescentes en comparación con el número total de células después de 24 horas. Las células utilizadas son células de melanoma de humano M21 y M21L. Las células M21 expresan a la integrina a?ß3 mientras que las células M21L no expresan a la integrina a?ß3 (otv-nula) . Como se muestra en la figura 10 las células que expresan a? (M21) tratadas con el liposoraa dirigido (NP5) complejado con el gen de GFP presentan un grado de transfección de 5 veces o mayor (> 125,000 células /millón) en comparación con células que expresan ccv tratadas con liposomas no dirigidos (NP6) (sin antagonista; aproximadamente 25,000 células/ millón) o ADN solo (sin liposoma, aproximadamente 12,000 células/millón). En contraste, las células av-nulas (M21L) no presentan incorporación preferencial del gen de GFP, con lo que se obtienen niveles relativamente bajos de transfección (25,000 células/ millón, o menos) sin tomar en cuenta el tratamiento recibido. Por lo tanto, se demuestra que los portadores de gen dirigidos transfectan las células en una forma dependiente de ?ß3.

EJEMPLO 3 Suministro de genes mediado por liposoma para selección de blanco dirigido a tumor in vivo Se complejan electrostáticamente 450 nanomoles aproximadamente de cada uno de NP5 y NP6, con aproximadamente 30 g de cada uno de los ADN plásmidos que codifican para la luciferasa de luciérnaga en aproximadamente 200 µ? cada uno de solución de dextrosa al 5% y después cada una de las soluciones de ADN complejado con liposoma se inyecta por vía intravenosa en animales que tienen aproximadamente 150 mm3 de melanomas subcutáneos que carecen de la expresión de a?ß3 (M21L) . Los animales se sacrifican después de 24 horas aproximadamente, se extirpan los órganos y tumores descritos, y se evalúan respecto a la actividad de luciferasa. La actividad de luciferasa se evalúa utilizando el estuche de prueba para luciferasa Bright-Glo (Promega Corp., Madison, WI) de conformidad con las instrucciones del fabricante excepto que los órganos enteros se muelen utilizando un molino para tejidos en una cantidad de reactivo para lisis Bright-Glo normalizado con respecto al peso del órgano. Como se muestra en la figura 11, el liposoma dirigido (NP5) , complejado con el gen de luciferasa, presenta una expresión altamente selectiva en el tejido tumoral con respecto a los tejidos pulmonar, hepático, y cardiaco, con un nivel de expresión de aproximadamente 4 picogramos de luciferasa/mg de tejido en comparación con niveles de sub-picogramo/mg de tejido en los otros tejidos evaluados. El liposoma no dirigido (NP6) , complejado con la luciferasa, es inefectivo para transfectar cualquiera de los tejidos. La adición de un exceso de aproximadamente 20 veces de ligando de antagonista de integrina inhibe efectivamente la transfección de las células por el ligando dirigido.

EJEMPLO 4 El suministro mediado por liposoma para selección de blanco de genes de Raf imitantes a la vasculatura tumoral ocasiona la regresión de melanomas es ablecidos Se inyectan melanomas carentes de la expresión de a?ß3 por vía subcutánea en el flanco y se permite que crezcan hasta aproximadamente 70 mm3 , momento en el cual se inyecta a los ratones por vía intravenosa cualquiera de 200 µ? de solución de dextrosa al 5% (control) , liposoma dirigido NP5 y complejado ya sea con 30 µg aproximadamente de ADN plásmido que codifica para una forma negativa dominante, mutante de la cinasa Raf (Raf -???µ) en 200 µ?ß de solución de dextrosa al 5% o complejado a un vector de lanzadera que no codifica para ninguna molécula de ADN en 200 µ? de solución de dextrosa al 5%. Aproximadamente 15 días después, de nuevo se inyecta a los tumores con los mismos tratamientos. Se mide el tamaño del tumor en los puntos de tiempo indicados en la figura 12 utilizando la fórmula: volumen de tumor = (diámetro mínimo)2 * diámetro máximo/2.

Como se muestra en la figura 12, el tratamiento de ratones que portan tumores de melanoma de aproximadamente 70 mm3 de volumen inicial con el liposoma para selección de blanco NP5 complejado con la forma negativa dominante, mutante de la cinasa Raf (Raf-ATPfi) , conduce a un incremento inicial en el volumen del tumor de aproximadamente 550 mm3 , seguido por una regresión de los tumores después de 30 días aproximadamente, los cuales se nivelan hasta un estado constante de aproximadamente 200 mm3 en volumen alrededor del día 35 (marcado "partícula/Raf ( - ) " en la figura 12) . Este tamaño de tumor de estado constante se mantiene durante 30 días adicionales, momento en el cual finaliza el experimento. En los ratones tratados con el liposoma para selección de blanco NP5 (sin gen) sólo (marcado "partícula/lanzadera"), o con el gen de Raf mutante sólo (sin liposoma) , los tumores continúan creciendo a través del periodo completo de 35 días, sin ninguna indicación de cualquier regresión. En la medida en la que los tumores carezcan de la expresión de a?ß3, pero que las células del endotelio neovascular expresen a vp3, es muy probable que la reducción en el crecimiento del tumor se deba a la inhibición de angiogénesis en la vasculatura tumoral .

EJEMPLO 5 El suministro mediado por liposoma para selección de blanco de genes de Raf mutantes a la vasculatura tumoral ocasiona la regresión de melanomas establecidos Se tratan los tumores como en el ejemplo 4, excepto que se permite que los tumores crezcan hasta aproximadamente 300 mm3 antes del tratamiento inicial, punto en el cual estos se inyectan con cualquiera de (a) 450 nanomoles aproximadamente de liposoma NP5 para selección de blanco y complejado electros ticamente con 30 µg aproximadamente de ADN plásmido que codifica para Raf -???µ en 200 µ? aproximadamente de solución de dextrosa al 5%, (b) aproximadamente 450 nanomoles de liposoma NP6 no dirigido complejado electrostáticamente con 30 µg aproximadamente de ADN plásmido que codifica para af -???µ en 200 µ? de solución de dextrosa al 5%, o (c) aproximadamente 450 nanomoles de liposoma NP para selección de blanco complejado electrostáticamente con 30 g aproximadamente de ADN plásmido que codifica para Raf-ATP mezclado con un exceso de aproximadamente 20 molar de un ligando competidor para la integrina a?ß3 en aproximadamente 200 µ? de solución de dextrosa al 5%. Las mediciones de tumor se toman en los puntos de tiempo indicados en la figura 13, en la cual (a) se marca como "Raf (-)", (b) se marca como "no dirigido", (c) se marca como "exceso". También se incluye un control sin tratamiento . Como se muestra en la figura 13, el tratamiento de ratones que tienen tumores de melanoma con volumen inicial de 300 mm3 , con el liposoma NP5 para selección de blanco complejado con la forma negativa, dominante, mutante de la cinasa Raf (Raf-???µ) , después de un periodo de crecimiento inicial también conduce a una regresión del volumen del tumor en comparación con un grupo de control sin tratamiento .

EJEMPLO 6 El suministro mediado por liposoma para selección de blanco es selectivo para vasos angiogénicos Se complejan aproximadamente 300 nanomoles de NP5 con aproximadamente 20 µ de ADN plásmido que codifica para la proteína verde fluorescente (GFP) en aproximadamente 50 µ? de solución de dextrosa al 5% y después se inyecta por vía intravenosa en embriones de pollo cuyas membranas co ioalantóicas (CAM) se han expuesto previamente a un disco de filtro saturado con 1 mg/ml de bFGF durante aproximadamente 24 horas para estimular la angiogénesis . Un día después de la inyección del complejo, se recolecta el tejido de la CAM, se lava con PBS, se fija en paraformaldehído al 4% y se examina respecto a la presencia de fluorescencia. Los resultados se presentan en la figura 14. La GFP se localiza en niveles elevados en la vasculatura de las CAMs como se puede observar a partir de las microfotograf ías en la figura 14.

EJEMPLO 7 El suministro mediado por liposoma para selección de blanco de genes de Raf mutante a la vasculatura del tumor induce la apoptosis de la vasculatura y la subsiguiente muerte celular del tumor Se inyectan por vía subcutánea melanomas que carecen de la expresión de ?ß3 en los flancos de ratones. Se permite que los tumores resultantes crezcan hasta 200 mm3 aproximadamente, punto en el cual se inyectan a los ratones, por vía intravenosa, aproximadamente 450 nanomoles de NP5 y complejado ya sea con 30 µg aproximadamente de ADN plásmido que codifica para Raf-ATP o con un vector de lanzadera en aproximadamente 200 µ? de solución de dextrosa al 5%. Los tumores se extirpan después de 72 horas aproximadamente, se fijan en paraformaldehído al 4%, se seccionan y se tiñen respecto al factor de von Willebrand (un marcador de vasos sanguíneos) y a apoptosis utilizando el método TUNEL para detectar ADN fragmentado (Intergen Corp, Purchase, NY) . Las microfotograf í as mostradas en la figura 15 indican que los tumores expuestos a la nanopart í cula/vector de lanzadera (control) presentan una densidad relativamente alta de vasos sanguíneos con pocas células sometidas a apoptosis . En contraste, la mayoría de vasos sanguíneos en los tumores expuestos a ??5/?^?-???µ experimentan apoptosis y se mueren regiones grandes del tumor a distancias fijas desde los vasos que experimentan apoptosis, posiblemente debido a una perfusión insuficiente.

EJEMPLO 8 El suministro mediado por liposoma para selección de blanco es selectivo para vasos angiogénicos En el ratón, brotan ramificaciones colaterales provenientes de los capilares del plexo superficial de la retina, que penetran hacia el interior de la retina y forman un plexo vascular profundo entre los días 8 (P8) y 10 (PIO) posteriores al nacimiento. En este estudio, en el día PIO se inyecta a los ratones, por vía intra - itreo , el liposoma NP5 para selección de blanco complejado con aproximadamente 0.15 µ9 de ADN plásmido que codifica para la proteína verde fluorescente en aproximadamente 1 µ? de solución de dextrosa al 5% y después se inyecta por vía intra-ví treo . Aproximadamente 24 horas después de la inyección de NP5 complejado con el gen de GFP, se sacrifican los ratones y las retinas se someten a inmunotinción con anticuerpos ant i - colágeno IV ligados a rodamina (un marcador vascular) y se evalúan mediante microscopía de barrido láser de 2 fotones para detectar el nivel relativo de GFP en los vasos sanguíneos de la retina. Las microfotograf ías en la figura 16 muestran que la GFP se localiza en niveles altos en la vasculatura de la retina. Se pueden efectuar numerosas variaciones y modificaciones de las modalidades y ejemplos descritos anteriormente sin alejarse del alcance y campo de las características novedosas de la invención. No se pretenden o se deben inferir limitaciones con respecto a las modalidades específicas ilustradas en la presente invención. Se pretende que las reivindicaciones anexas cubran todas de dichas modificaciones debido a que caen dentro del campo de las reivindicaciones.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito el presente invento se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes : REIVINDICACIONES 1.- Un liposoma para seleccionar como blanco al receptor de integrina a?ß3 caracterizado porque comprende : un anfífilo catiónico; un lípido neutro; un lípido para selección de blanco que tiene un dominio para selección de blanco y un dominio idrofóbico unido al dominio para selección de blanco; y un ácido nucleico complejado con el lípido catiónico ; el lípido catiónico est presente en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50 por ciento molar, y el lípido para selección de blanco está presente en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20 por ciento molar, los valores de por ciento molar se basan en las moles totales de lípido en el liposoma, y el dominio para selección de blanco incluye un antagonista no peptídico de integrina ?ß3. 2. - El liposoma de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anfífilo catiónico es un lípido catiónico. 3. - El liposoma de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque por lo menos una porción de los lípidos presentes en el liposoma tiene grupos funcionales que se entrelazan uno con el otro . 4. - El liposoma de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el antagonista no peptídico de integrina a?ß3 es un zwitterión a valores de pH fisiológico, que tiene un grupo catiónico y un grupo aniónico separados uno del otro mediante un grupo separador que provee una separación entre los grupos aniónico y catiónico en el intervalo de aproximadamente 10 Angstroms hasta aproximadamente 100 Angstroms . 5. - El liposoma de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el grupo separador incluye un grupo aromático divalente. 6. - El liposoma de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico es ADN. 7. - El liposoma de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico es un gen. 8. - El liposoma de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico es una secuencia de ol igonucleótido de antisentido . 9. - El liposoma de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico es ARN. 10. - El liposoma de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el liposoma tiene un tamaño de partícula no mayor de 250 nanómetros aproximadamente. 11. - El liposoma de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el liposoma tiene un tamaño de partícula en el intervalo de aproximadamente 40 nanómetros hasta aproximadamente 100 nanómetros. 12. - El liposoma de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el liposoma tiene un tamaño de partícula en el intervalo de aproximadamente 75 nanómetros hasta aproximadamente 100 nanómetros . 13. - El liposoma de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el liposoma tiene un tamaño de partícula en el intervalo de aproximadamente 40 nanómetros hasta aproximadamente 65 nanómetros. 14. - El liposoma de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista no peptídico de integrina ?ß3 tiene una masa molecular en el intervalo de aproximadamente 455 Daltons hasta aproximadamente 605 Daltons. 15. - El liposoma de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista no peptídico de integrina ?ß3 tiene una masa molecular en el intervalo de aproximadamente 200 Daltons hasta aproximadamente 800 Daltons. 16. - El liposoma de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el antagonista no peptídico de integrina a?ß3 se representa mediante la fórmula (I) en la cual en la fórmula (I) , R1 y R2 son cada uno hidrógeno, o juntos forman un grupo 1,2-fenileno (C6H4) formador de puente o un grupo etileno (-CH=CH-) formador de puente; X es -C(0)- o un enlace covalente; n es 1 , 2 , o 3 ; Z1 es -C(0)-R3; -C(0)OR3, o S02R3; y R3 es fenilo, fenilo sustituido, piridilo, bencilo, bencilo sustituido, halógeno-alquilo de Cj-C4 , alquilo de C2-C30, alquenilo de C2-C30 / alquinilo de C2-C30 o colesterilo. 17.- El liposoma de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el antagonista no peptídico de integrina ?ß3 se representa mediante la fórmula en la cual en la fórmula (II) , R4 y R5 son cada uno hidrógeno, o juntos forman un enlace covalente; Y es -C(O)- ó -CH2-; Z2 es -C(0)-Rs; -C(0)ORs, o S02R6; R6 es fenilo, fenilo sustituido, piridilo, bencilo, bencilo sustituido, halógeno-alquilo de Ci-C4, alquilo de C2-C3o/ alquenilo de C2-C30, alquinilo de C2-C30 o colesterilo; y Het es 2-piridilo o 2-imidazol ilo . 18.- El liposoma de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque está libre de llpidos entrelazados, y porque tiene un tamaño de partícula en el intervalo de aproximadamente 75 nanómetros hasta aproximadamente 100 nanómetros. 19. - El liposoma de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el liposoma incluye lípidos entrelazados y tiene un tamaño de partícula en el intervalo de aproximadamen e 40 nanómetros hasta aproximadamente 65 nanómetros. 20. - El liposoma de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el lípido para selección de blanco y el lípido neutro están por lo menos parcialmente entrelazados uno con otro y el anfífilo catiónico está sustancialmente libre de entrelazamien o . 21. - El liposoma de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el lípido catiónico es cloruro de 1 , 2 -dioleoiloxi -3 - (?,?,?-trimetilamonio ) -propano. 22. - El liposoma de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque comprende también un poli (et ilenglicol ) que tiene desde 250 hasta aproximadamente 500 unidades repetidas de oxíetileno. 23. - El liposoma de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el poli (etilenglicol) comprende aproximadamente 350 unidades repetidas de oxietileno. 2 . - El liposoma de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende cloruro de 1 , 2 -dioleoiloxi - 3 - (N, N, N- rimet ilamonio) -propano, colesterol y poli (etilenglicol) , en una relación de aproximadamente 1:1:0.12 respectivamente. 25. - El liposoma de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el ácido nucleico puede expresar una proteína o péptido en una célula en la cual se introduce el liposoma. 26. - El liposoma de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el ácido nucleico puede expresar una proteína o péptido inhibidor de angiogenesis . 27. - El liposoma de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la proteína inhibidora de angiogenesis es una proteína Raf . 28.- Un método para introducir un ácido nucleico al interior de una célula que presenta integrina ?ß3 que comprende poner en contacto dicha célula con un liposoma para seleccionar como blanco al receptor de integrina a?ß3 de conformidad con la reivindicación 1. 29. - El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el antagonista no peptídico del receptor de integrina a?ß3 es un antagonista selectivo del receptor de integrina ?ß3. 30. - El método de conformidad con la reivindicación 28, caracte izado porque el antagonista del receptor de integrina a?ß3 tiene, a valores de pH fisiológico, un grupo catiónico y un grupo aniónico que se pueden unir a un receptor de integrina, y en el cual los grupos catiónico y aniónico están separados uno del otro mediante un grupo separador que provee una separación en el intervalo de aproximadamente 10 Angstroms hasta aproximadamente 100 Angstroms entre el grupo catiónico y el grupo aniónico del antagonista. 31. - Un método para inhibir angiogénesis caracterizado porque comprende administrar a un paciente en necesidad de inhibición de angiogénesis una cantidad terapéuticamente efectiva de un liposoma para seleccionar como blanco al receptor de integrina ?ß3 de conformidad con la reivindicación 1 que pueda expresar una proteína o péptido inhibidor de angiogénesis . 32. - El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el antagonista no peptídico del receptor de integrina a?ß3 es un antagonista del receptor de integrina ' a?ß3 selectivo . 33.- El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el antagonista del receptor de integrina a?ß3 tiene, a valores de pH fisiológico, un grupo catiónico y un grupo aniónico que se pueden unir a un receptor de integrina, en el cual los grupos catiónico y aniónico están separados uno del otro mediante un grupo separador que provee una separación en el intervalo de aproximadamente 10 Angstroms hasta aproximadamente 100 Angstroms entre el grupo catiónico y el grupo aniónico del antagonista. 34. - El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el liposoma se administra por vía intraocular para el tratamiento de una enfermedad ocular angiogénica. 35. - El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el liposoma se administra por vía intravenosa. 36. - El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el liposoma se administra mediante inyección en un tumor. 37. - Un método para inhibir el crecimiento de tumor caracterizado porque comprende administrar a un paciente en necesidad de inhibición de crecimiento del tumor una cantidad terapéuticamente efectiva de un liposoma para seleccionar como blanco al receptor de integrina a?ß3 de conformidad con la reivindicación 1 que pueda expresar una proteína o péptido inhibidor de angiogénesis . 38. - El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el antagonista no peptídico del receptor de integrina a?ß3 es un antagonista del receptor de integrina ?ß3 selectivo . 39. - El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el antagonista del receptor de integrina a?ß3 tiene, a valores de pH fisiológico, un grupo catiónico y un grupo aniónico que se pueden unir a un receptor de integrina, en el cual los grupos catiónico y aniónico están separados uno del otro mediante un grupo separador que provee una separación en el intervalo de aproximadamente 10 Angstroms hasta aproximadamente 100 Angstroms entre el grupo catiónico y el grupo aniónico del antagonista. 40. - El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el liposoma se administra por via intravenosa. 41.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el liposoma se administra mediante inyección en un tumor. 42. - Un método para inducir apoptosis en células del endotelio vascular caracterizado porque comprende poner en contacto células del endotelio vascular con una cantidad efectiva inductora de apoptosis de un liposoma para seleccionar como blanco al receptor de integrina a?ß3 de conformidad con la reivindicación 1 que pueda expresar una proteína o péptido inductor de apoptosis. 43. - El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la proteína inductora de apoptosis es una proteína Raf .