JP7497045B2 - 脂質様ナノ複合体及びその使用 - Google Patents
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Description
概要
リピドイド合成に使用される全ての化学物質を、別途記載のない限り、さらに精製せずに、Sigma-Aldrichから購入した。(-30)GFP-Creリコンビナーゼ、S.pyogenes Cas9(spCas9)、及びsgRNAを、Wang at al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2016,113,2868-2873(“Wang”)に報告されるプロトコールに従って生成した。10%のウシ胎児血清(FBS、Sigma-Aldrich)及び1%のペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Sigma-Aldrich)中で、HeLa-DsRed及びGFP-HEK細胞を培養した。全ての1H NMRスペクトルは、フーリエ変換モードで動作するBruker AVIII 500MHz NMR分光計で記録された。ナノ粒子の流体力学的サイズ及び多分散性指数を、ゼータ-PALS粒径分析器(Brookhaven Instruments)で測定した。Heyes et al.,J.Controlled Release,2005,107,276-287に報告されるプロトコールに従って、蛍光プローブとして2-(p-トルイジニナフタレン-6-スルホン酸)(TNS、Sigma-Aldrich)を使用して、リピドイドの見かけのpKa値を決定した。TEM測定をFEI Technai透過型電子顕微鏡で実施した。BZ-X分析器蛍光顕微鏡を使用して、組織スライスの蛍光画像を取得した。
ねじ蓋式テフロンライニングガラスバイアル中で、頭部アミン(Sigma-Aldrich)をアクリラート尾部(例えば、O17O、O17S、及びO17Se)と1:2.4のモル比、70℃で48時間混合した。Teledyne Iscoクロマトグラフィーシステムを使用して、粗生成物を精製した。
リピドイドを、タンパク質または核酸を送達するためのナノ粒子に加工した。要約すると、リピドイドを酢酸ナトリウム緩衝液(25mM、pH5.2)と混合し、超音波浴中で30分間超音波処理し、続いて、さらに30分間激しくボルテックスして、脂質様ナノ粒子またはLNPに形成した。こうして得られたLNPを4℃で保存した。タンパク質/LNP複合体化のために、PBS緩衝液(25mM、pH7.4)中でLNPを、Wangに報告されるプロトコールに従って(-30)GFP-CreまたはCas9:sgRNAと混合し、室温で30分間インキュベートした。
ヒト赤血球(hRBC)をPBS緩衝液で3回洗浄し、1000rpmで5分間遠心分離した後、回収した。得られた貯蔵液(約10%v/vのhRBC)をPBS緩衝液中で3倍に希釈して、アッセイ溶液を得た。90μLのアッセイ溶液を10μLのLNP溶液(リピドイドの最終濃度=3.3mg/L)と混合し、37℃で60分間インキュベートした。次に、試料を再度1000rpmで10分間遠心分離した。10μLの上清を90μLのPBS緩衝液にさらに希釈し、マイクロプレートリーダーを使用して、405nmでの吸光度(OD405)が記録された。PBS緩衝液及びTriton X-100(1%v/v)を、それぞれ陰性対照及び陽性対照として使用した。
細胞内取り込み研究では、HeLa-DsRed細胞を2×104細胞/ウェルの密度で48ウェルプレートに播種した。37℃、5%のCO2で24時間インキュベートした後、(-30)GFP-Cre/LNPナノ粒子を細胞に添加し、蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリー(BD FACS Calibur、BD Science、カリフォルニア)分析(GFPの緑色発光)前に6時間インキュベートした。最終(-30)GFP-Creタンパク質濃度は、25nMであり、リピドイド濃度は、3.3mg/Lである。遺伝子組み換え機能研究のために、HeLa-DsRed細胞を同じ条件で処置し、送達の24時間後にフローサイトメトリーにより、DsRedの赤色蛍光発光を分析した。
CRISPR/Cas9遺伝子ノックアウト研究では、GFP-HEK細胞を2×104細胞/ウェルの密度で48ウェルプレートに播種した。24時間のインキュベーション後、Cas9:sgRNA/LNPナノ粒子を細胞に添加し、4時間インキュベートし、続いて、培地を交換した。48時間のインキュベーション後、GFPからの緑色発光をフローサイトメトリーで分析した。最終Cas9:sgRNA RNP濃度は、25nMであり、リピドイド濃度は、3.3mg/Lであった。
細胞生存率を標準MTTアッセイで測定した。HeLa-DsRedまたはGFP-HEK細胞を5×103細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種した。(-30)GFP-Cre/LNPまたはCas9:sgRNA/LNPナノ粒子を、24時間のインキュベーション後に添加した。タンパク質の最終濃度は、25nMであり、LNPは、3.3mg/Lである。24時間または48時間インキュベートした後、MTT試薬(30μLのPBS緩衝液中の5mg/mL)を添加し、細胞を37℃でさらに4時間インキュベートした。次に、細胞培地を慎重に除去し、200μLのDMSOを添加した。DMSO溶液を別の96ウェルプレートに移し、570nmでの吸光度がマイクロプレートリーダーで記録された。全ての実験を4回ずつ実施した。
配合されたLNP(リピドイド/コレステロール/DOPE/DSPE-PEG2k=16/4/1/4、重量比)をタンパク質の搭載及びマウスへの注射のために調製した。12時間の明/暗サイクルの、温度及び湿度が制御された施設に、Ai14マウスを収容した。各群の2匹のマウスに、0日目及び5日目に(-30)GFP-Cre/LNP製剤を注射した(各注射に対して100μgのタンパク質)。全ての群から心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓を含む器官を注射の20日後に収集した。組織を4%のパラホルムアルデヒド(PFA)で一晩固定した後、10μmのスライスに切断した。スライスを収集し、蛍光イメージングのためにDAPIで染色した。
下記の手順に従って、式(I)の脂質様化合物、すなわち、リピドイドから、特定の脂質様ナノ粒子(LNP)を調製した。
市販のアミン頭部、例えば、化合物10、17、及び63を化学量論的にアクリラート尾部O17O、O17S、またはO17Seと混合した。こうして得られた混合物を70℃で48時間撹拌した。図1を参照のこと。リピドイドをTeledyne Iscoクロマトグラフィーシステムで精製し、1H NMR及びESI-MSにより特性決定し、上表に示されるように、アミン価(X)及びO17Y(R-O17Y、Yは、O、SまたはSeである)としてコード化した。76-O17O、76-O-17S、及び76-O17Seの代表的な1H NMR及びESI-MSスペクトルは、図2a及び2bに示される。
上記の簡単な超音波処理及びボルテックス手順に従って、酢酸ナトリウム緩衝液(25mM、pH5.2)中で、リピドイドナノ粒子(LNP)を作製した。LNPの流体力学的サイズ及び多分散性指数(PDI)を動的レーザー散乱(DLS)分析で測定した。図2cに示されるように、O、S、及びSeエーテル含有LNPのほとんどは、100~300nmの平均された流体力学的直径(<Dh>)及び細胞内タンパク質送達用途に適する0.1~0.3の範囲のPDIを有した。さらに、図2cにも示されるように、取り込まれたカルコゲン原子が水溶液中での超分子自己集合挙動に及ぼす影響に起因して、O17O尾部を含むLNPの約53%、O17S LNPの約82%、及びO17Se LNPの約65%が、200nm未満の<Dh>を有することが判明した。76-O17O(<Dh>は170.1nmであり、μ2/Г2は0.37である)、76-O17S(<Dh>は114.3nmであり、μ2/Г2は0.24である)、及び76-O17Se(<Dh>は129.4nmであり、μ2/Г2は0.18である)LNPの代表的なサイズ分布プロファイルは、図2dに示される。
以下のように、タンパク質送達への実施例1で調製されたLNPの影響を評価する研究を実施した。
負に過剰に荷電したGFP多様体に融合しているCreリコンビナーゼタンパク質((-30)GFP-Cre)をモデルカーゴタンパク質として使用した。(-30)GFP-Creタンパク質は、静電引力及び他のタイプの超分子相互作用を介して、カチオン性LNPと複合体化することが可能であった。LNPの細胞取り込みは、Wangで報告されるような細胞内GFP蛍光強度の直接分析で決定することができる。HeLa-DsRed細胞をこの研究で使用し、これは、以下の研究で送達されたタンパク質の機能研究を容易にするために、Cre媒介性組み換えによる赤色蛍光DsRedを発現した。
こうして調製された51のO、S、及びSeエーテル含有リピドイドのライブラリーを利用して、LNP及び細胞内タンパク質送達効果間の構造活性相関を研究した。
以下のように、遺伝子組み換え及び細胞毒性について、(-30)GFP-Creタンパク質送達への実施例1で調製されたLNPの影響を評価する研究を実施した。
以下のように、Ai14マウスにおける遺伝子組み換えのためのGFP-Cre送達への実施例1で調製されたLNPの影響を評価する研究を実施した。
以下のように、ゲノム改変のためのCas9:sgRNA RNPの送達への実施例1で調製されたLNPの影響を評価する研究を実施した。
ブランク及びカーゴ搭載リピドイドナノ粒子の調製
リピドイドを全ての送達用途のためのナノ粒子に加工した。要約すると、リピドイドを酢酸ナトリウム緩衝液(25mM、pH5.2)と混合し、超音波浴中で30分間超音波処理し、続いて、さらに30分間激しくボルテックスした。調製したままのブランクLNPを4℃で保存した。Cy5-RNA/LNP、mRNA/LNP、及びタンパク質/LNPの複合体化では、本発明者らが以前に報告した手順に従って、PBS緩衝液(pH7.4)中で、ブランクリピドイドナノ粒子をRNA分子または(-30)GFP-Creタンパク質と混合し、使用前にさらに30分間、室温でインキュベートした。ナイルレッドのカプセル化の代表的な手順は、以下の通りである:アセトン中の5μLのナイルレッド貯蔵液を空のバイアルに添加し、次に、これを真空オーブンに入れて、有機溶媒を完全に除去した。次に、所定量のブランクLNP貯蔵液(1.0mg/mL)をバイアルに添加した。混合物を超音波浴中で40分間超音波処理し、室温で一晩撹拌した。必要に応じてPBSで希釈することにより、チオール誘発放出研究及び細胞インキュベーションのために、ナイルレッドの最終濃度を、それぞれ6.6×10-7mol L-1及び6×10-7mol L-1に調整した。CPT及びDiO/DiI FRETペアのカプセル化の代表的な手順は、以下の通りである:MeOH中の100μLのDiO/DiI貯蔵液を空のバイアルに入れ、真空オーブンに入れて有機溶媒を除去した。次に、200μLのメタノール中のリピドイド(2.0mg)をバイアルに添加し、撹拌して均質溶液を生成した。次に、継続的に撹拌しながら、600μLのDI水を10分滴加した。得られた混合物をDI水に対して24時間透析し(Thermo Scientific Slide-A-Lyzer透析カセット、MWCO=3500Da)、新しい水を4時間毎に交換した。カルセイン及びドキソノルビシン塩酸塩のカプセル化のための代表的な手順は、次の通りである:事前に計算された量のカルセインまたはDI水中のDox貯蔵液を酢酸ナトリウム緩衝液で800μLに希釈し、それぞれ、メタノール(5mg/mL)中でリピドイドの自己組織化プロセスを誘発するために選択溶媒として使用した。搭載されなかったカルセインまたはDoxを、DI水に対する透析により除去した(Thermo Scientific Slide-A-Lyzer透析カセット、MWCO=3500Da)。
細胞内取り込み研究では、HeLaまたはHeLa-DsRed細胞を、2×104細胞/ウェルの初期播種密度で48ウェルプレートに播種した。37℃、5%のCO2で24時間インキュベートした後、NRまたは(-30)GFP-Cre搭載ナノ粒子を細胞に添加し、蛍光顕微鏡(BZ-X分析器)観察及びフローサイトメトリー(BD FACS Calibur、BD Science、カリフォルニア)分析(NRの赤色蛍光発光及びGFPの緑色蛍光発光)前に一定時間(1~8時間)インキュベートした。NRの最終濃度は、6×10-7mol L-1である。(-30)GFP-Creタンパク質濃度の最終濃度は、25~100×10-9mol L-1である。低分子抗がん剤送達では、HeLa細胞を、5×103細胞/ウェルの初期播種密度で96ウェルプレートに播種した。37℃、5%のCO2で24時間インキュベートした後、Dox、CPT、またはOxa搭載ナノ粒子を細胞に添加し、8時間インキュベートし、続いて、培地交換を行った。次に、細胞生存率分析の前に、細胞をさらに40時間インキュベートした。mRNA送達では、HeLa、B16F10、HEK293、NIH3T3、またはJurkat細胞を、2×104細胞/ウェルの初期播種密度で48ウェルプレートに播種した。37℃、5%のCO2で24時間インキュベートした後、mRNA搭載ナノ粒子を細胞に添加し、蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリー分析の前にさらに24時間インキュベートした。タンパク質送達では、HeLa-DsRed細胞を、2×104細胞/ウェルの初期播種密度で48ウェルプレートに播種した。37℃、5%のCO2で24時間インキュベートした後、(-30)GFP-Creタンパク質搭載ナノ粒子を細胞に添加し、8時間インキュベートし、続いて、完全培地交換を行った。次に、蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリー分析前に、細胞をさらに16時間(合計24時間のインキュベーション)インキュベートした。
標準のMTTアッセイを使用して、HeLa及びHeLa-DsRedの細胞生存率を測定した。96ウェルプレート中で、ブランクまたはカーゴ搭載ナノ粒子と共にHeLa細胞またはHeLa-DsRed細胞をインキュベートした後、MTT試薬(30μLのPBS緩衝液中の5mg/mL)を添加し、細胞を37℃でさらに4時間インキュベートした。次に、細胞培養培地を慎重に除去し、200μLのDMSOを各ウェルに添加した。次に、DMSO溶液を清浄な96ウェルプレートに移し、570nmでの吸光度がマイクロプレートリーダーで記録された。全ての実験を4回ずつ実施した。
in vitroトランスフェクション研究と同様に、mRNAまたはタンパク質の搭載及びin vivoでの送達のためのリピドイドナノ粒子を調製した。12時間の明/暗サイクルの、温度及び湿度が制御された施設に、Ai14マウスを収容した。各群の3匹のマウスに、Cre mRNA搭載または(-30)GFP-Creタンパク質搭載LNP製剤を(静脈内または筋肉内)注射した。注射後10日目(筋肉内注射)または14日目(静脈内注射)に、全ての群由来の心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓を含む臓器を収集した。組織を4%パラホルムアルデヒド(PFA)中で一晩固定し、30%スクロースで脱水した後、OCTで凍結し、10~15μmのスライスに切断した。次に、蛍光イメージングのために、スライスを収集して、DAPIで染色した(BZ-Xアナライザー蛍光顕微鏡法)。
コレステリルクロロホルメート(10.71g、23.85mmol)を無水DCM(50mL)に溶解させ、PY-SS-NH2(4.47g、23.99mmol)及びTEA(3.71g、36.69mmol)のDCM溶液に0℃で滴加した。反応混合物を一晩撹拌し、移動相として酢酸エチル、ジクロロメタン、及びn-ヘキサンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製の後、Py-SS-Cholを淡黄色粘性固体(4.89g、収率約34.26%)として得た。
Py-SS-Chol(3.55g、5.93mmol)及び酢酸(600μL)をDCM(100mL)に溶解させた。次に、2-メルカプトエタノール(0.51g、6.52mmol)を滴加し、連続的に撹拌しながら、反応混合物をさらに24時間35℃に維持した。移動相として酢酸エチル及びn-ヘキサンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、OH-SS-Cholを精製し、無色固体を得た(2.74g、収率約81.63%)。
OH-SS-Chol(2.41g、4.26mmol)及びTEA(0.65g、6.39mmol)を無水DCM(100mL)に溶解させた。塩化アクリロイル(0.46g、5.11mmol)を0℃で滴加した。反応混合物を一晩撹拌し、移動相として、酢酸エチル、ジクロロメタン、及びn-ヘキサンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製の後に、OCholBを無色固体(2.52g、収率約95.68%)として得た。
リピドイドを全ての送達用途のためのナノ粒子に加工した。図10Bに示されるように、ほとんどのナノ粒子は、70~300nmの範囲の平均直径及びPDI0.1~0.3を示した。OCholB尾部を有するリピドイドから自己組織化されたLNPのサイズは、本発明者らが以前に報告したアルキル鎖を有するLNPライブラリーと同様である。比較的低いPDI値は、これらのナノ粒子の均一性を示した。
OCholB LNPのチオール誘発性分解及び解離を時間依存性DLS測定及びTEM観察で研究した。通常、図11Aに示されるように、細胞内還元条件に類似する以前の研究に広く使用される1,4-ジチオスレイトール(DTT)10mMの存在下で、25本発明者らは、75-OCholB、76-OCholB、及び77-OCholBの相対サイズの増加が、インキュベーション期間に応じて漸進的に増加した(最初の2時間で、それぞれ566.4%、498.5%、及び1591.4%)ことを観察した。次に、ナノ粒子のサイズは通常、75-OCholBを除いて、次の4時間にわたって維持され、これは、6時間でサイズが1315.7%増加したことを示した。次に、DTTで処理されたLNPの代表的な形態をTEMで調査し、画像は図11Bに示される。図10Cに示されるような適切に形成された小胞構造の不存在及びアモルファス構造を有するマイクロメートルスケールの大きな凝集体(DLS測定から得られた結果と一致する;図11A)が、75-OCholB、76-OCholB、及び77-OCholB LNPについて観察された。小胞構造の破壊は、OCholBリピドイドのチオール交換及びジスルフィド結合開裂反応に起因すると考えられる。次に、本発明者らは、血清中のチオール含有分子(例えば、アルブミン、システイン、ホモシステイン、システイニルグリシンなど)が、これらのジスルフィド結合含有LNPの構造的崩壊を誘導し得るかどうかを調査した。血清中に存在した低分子及び高分子の遊離チオールに類似する20μMのL-システイン(Cys)の存在下でのLNPの安定性を調査した。図11Aに示されるように、本発明者らは、全ての3つの試験LNPのためのこの研究の範囲にわたって1時間間隔のいずれかで、流体力学的直径の25%未満の変化を観察し、実際には、6時間のインキュベーション後の75-OCholB、76-OCholB、及び77-OCholBに対して、それぞれ、12.2%、14.6%、及び7.2%のサイズ減少が観察された。システインで処理されたLNPのサイズ変化は、未処理の対照群と比較した場合、わずかな差異を示し(図11A)、血清中の遊離チオール濃度に類似する条件下でのOCholB LNPの良好な安定性を示した。さらに、10mMのDTTまたは20μMのCysのいずれかの存在下で24時間インキュベートした後のOCholB LNPの相対的なサイズ変動を決定した。結果が、図11Cに示される。10mMのDTTで及び24時間の処理後、75-OCholB、78-OCholB、及び304-OCholB LNPは、最大のサイズ変化を示し、平均流体力学的直径の2872.4%、4642.8%、及び3849.6%の増加が観察され;76-OCholB、77-OCholB、80-OCholB、及び81-OCholB LNPについて、766.9%~1266.4%の中程度のサイズ増加が記録されたが;87-OCholB(210.3%)及び90-OCholB(179.5%)の両方は、TEM画像に基づいて一貫した小胞を形成できず(図10C)、24時間にわたり最小のサイズ増加を示した。他方では、20μMのシステインと共に24時間インキュベートされた全てのLNPは、未処置の対照群と同様に、最小のサイズ変化を示した(図11C)。これらの結果は、細胞内及び細胞外の還元可能な環境に関連してこれらのOCholB LNPの分解の動態を実証した。サイズ変化の程度は、種々のアミン頭部群を有するリピドイド間で変動し、全てのリピドイドは、システイン(血清中のモデリング条件)よりもDTT(細胞内条件のモデリング)により応答した。さらに、OCholB LNPは、低濃度のチオール(20μMのシステイン処理に類似する)の存在下で比較的良好な安定性を示し、これは、これらの新しいLNPが全身薬物送達に使用することができることを示す。
次に、様々な物理的特性を有するカーゴ分子をカプセル化するナノキャリアとしてのOCholB LNPの機能を研究した。この文脈では、代表的な低分子疎水性カーゴとしてのクマリン(励起(Ex.)350nm、発光(Em.)448nm)及びナイルレッド(NR;Ex.520nm、Em.613nm)、代表的な低分子親水性カーゴとしてのカルセイン(Ex.475nm、Em.529nm)、ならびに代表的な高分子親水性カーゴとしての(-30)GFP-Cre組み換え蛍光タンパク質(Ex.420nm、Em.510nm)及び二本鎖Cy5標識RNA(Cy5-RNA、13kDa;Ex.625nm、Em.672nm)をモデルカーゴとして使用した。研究では、モデル脂質担体として75-OCholBを選択した。図11Dは、全てのカーゴを75-OCholB LNPにうまく搭載することができることを示した。疎水性相互作用(クマリン及びNR)、静電相互作用(カルセイン、(-30)GFP-Cre、及びCy5-RNA)、または物理的カプセル化のいずれかにより、カーゴ分子をLNPに搭載した。さらに、図3Dに示されるように、モデルとして、疎水性蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)ペア、DiO、及びDiI(Ex.425nm、Em.504nm(DiO)、及び578nm(DiI))を使用して、カーゴ分子の同時カプセル化を行うこともでき、これは、併用療法のために、これらのOCholB LNPを使用して複数のタイプの生物活性分子を同時に搭載する可能性を実証する。30超分子相互作用(例えば、静電相互作用及び水素結合)を利用すること、ならびに/または自己組織化プロセス中にカーゴをカプセル化することにより、低分子及び高分子親水性分子の両方(例えば、ゲノム編集プラットフォーム及び細胞シグナル阻害剤)は、新たに開発されたLNPで、容易に搭載及び送達することができる。
低分子疎水性(ナイルレッド)及び親水性(カルセイン)蛍光色素及び高分子蛍光組み換えタンパク質((-30)GFP-Cre)搭載OCholB LNPを使用して、細胞(HeLa及びHeLa-DsRed細胞株)の内在化研究を行った。最初に、時間依存性DLS及び蛍光測定を使用して、カーゴ搭載LNPの安定性を調査した。図12Aに示されるように、FRETペアDiO及びDiIカプセル化LNP(DiO-DiI/75-OCholB、DiO-DiI/76-OCholB、及びDiO-DiI/77-OCholB)の蛍光強度は、7日間の保管後にFRET比(I575/I575+I505)のわずかな変動を示した。
OCholB LNPを使用して、疎水性及び親水性の両方の低分子薬物を送達する可能性を調査した。ドキソルビシン塩酸塩(Dox)(水溶性)、ならびにカンプトテシン(CPT)及びオキサリプラチン(Oxa)(非水溶性)をLNPにカプセル化し(実験のセクションを参照のこと)、HeLa細胞に対して試験した。Dox(Ex.495nm、Em.594nm)及びCPT(Ex.360nm、Em.446nm)搭載75-OCholB LNPの吸収及び蛍光発光スペクトルを試験することにより、低分子薬物の良好なカプセル化を実証し、Dox及びCPTの特徴的な吸光度及び発光ピークが、図13Aに示されるように観察された。対応する標準曲線を使用して、薬物搭載含有量(DLC%=[W搭載薬物]/[W搭載薬物+Wリピドイド]*100%)を、Dox及びCPTに対してそれぞれ19.2%及び5.2%と決定した。次に、フローサイトメトリーを使用して8時間曝露した後、Dox搭載75-OCholB LNP(Dox/75-OCholB)の内在化を研究した。図13Bに示されるように、カルセイン(図12E)及び(-30)GFP-Cre(図4f)とは際立って対照的に、遊離Doxは、8時間のインキュベーション後にHeLa細胞に容易に内在化することができる。Dox/75-OCholBで処置されたHeLa細胞はまた、遊離Doxで処置された細胞と同等の平均蛍光強度を示し、未処置の対照細胞と比較して約28.9倍大きく、Dox/75-OCholBナノ粒子がこの条件下でDoxの細胞内送達に効率的であり得ることが示された。
メッセンジャーRNA送達は、がん治療、タンパク質補充療法、及び神経障害の処置に大きな可能性を有する。42GFP mRNA及び種々の細胞株(HeLa、B16F10、HEK-293、NIH/3T3、及びJurkat)を使用して、OCholB LNPを使用したmRNAの細胞内送達を研究した。最初に、HeLa細胞を使用して、LNP/mRNAの重量比を最適化した。図14Aに示されるように、0.86μg mL-1でのmRNAの最終濃度を固定すること及びLNP/mRNA重量比を0/1(すなわち、遊離mRNA、LNPなし)から15/1に増加させることにより、LNP/mRNA比が1/1未満である場合、24時間の曝露後に、最小GFP+細胞を決定した(LNP/mRNA=0/1、0.5/1、及び1/1に対して、それぞれ、0.7%、0.8%、及び1.4%のGFP+細胞を決定した)。GFP+集団における漸増は、比が2/1から15/1に増加する時に観察され、2/1、5/1、10/1、及び15/1のLNP/mRNA比に対して、24.3%、39.2%、64.7%、及び68.9%のGFP+細胞が記録された。次に、LNP/mRNAの重量比=10/1を、以下のmRNA送達研究のために選択した。mRNA/LNPの投薬量を増加させる時、GFP+細胞の継続的な増加(3.3%~76.3%)が観察されたので、GFP mRNAの細胞内送達はまた、0.027~1.5μg mL-1のmRNAの濃度範囲に用量依存することが判明した(図14B)。次に、全ての完全置換OCholB LNPの細胞内送達効率をHeLa細胞に対して試験し、Lpf2k及びネイキッドGFP mRNAを対照として使用した(LNP/mRNA=10/1;[mRNA]=0.86μg mL-1;24時間の曝露)。図14Dに示されるように、ネイキッドmRNAは、わずかなGFP+細胞を誘導し、これは、未処置の細胞に匹敵するが、Lpf2kは、98.1%のGFP+HeLa細胞と共に、mRNA送達に非常に効率的である。OCholB LNPに関して、75-OCholB(GFP+細胞の62.0%)、76-OCholB(79.8%)、77-OCholB(73.5%)、78-OCholB(67.1%)、80-OCholB(55.6%)、81-OCholB(51.6%)、及び304-OCholB(52.1%)は全て、有効であると決定される。mRNA/LNP(mRNA/75-OCholB、mRNA/76-OCholB、及びmRNA/77-OCholB)で処置されたHeLa細胞の代表的な蛍光画像は、図14Cに示される。未処置のHeLa細胞と比較すると、ナノ粒子がインキュベートされた細胞から、強い緑色蛍光シグナルが記録され、これは、図14Dに示されるようなフローサイトメトリーデータと一致する。一方で、87-OCholB(6.1%)及び90-OCholB(2.5%)の両方は、HeLa細胞へのGFPmRNA送達に非効率的であることが判明し、これは、蛍光レポーターとしてのNR(図12C)及び(-30)GFP-Creタンパク質(図12F)を使用した内在化研究と一致する。送達性能の一貫性が、これらのOCholB LNPに存在し得ることが明らかであり、非活性LNPの内在化効果は、搭載カーゴの特性に関係なく最小のままであった。
タンパク質及びペプチドベースの治療法は、特異性が比較的高く、オフターゲット効果が低いため、過去30年間に多大な注目を集めている。がん、感染症、炎症、及び変性疾患の処置のための製剤が開発されている。タンパク質及びペプチドの有効な細胞内送達方法はさらに、それらの治療法を拡大し得る。OCholB LNPを使用したタンパク質の細胞内送達が、カーゴとしての(-30)GFP-Creタンパク質及び蛍光レポーターとしてのGFPを使用して、以前の内在化研究においてうまく実証されており、HeLa-DsRed細胞株及び蛍光レポーターとしてのDsRedタンパク質を使用して、機能性研究を実行した。
ブランク(図10E及び13C)とカーゴ(GFP mRNA及びゲノム編集タンパク質)搭載(図14E及び15D)OCholB LNPの両方は、in vitroで比較的高い生体適合性を示した。Balb/cマウスを使用する血清生化学的試験を通じて、体重変化ならびに腎臓及び肝臓の生物学的機能を測定することにより、OCholB LNPのin vivo毒性をさらに調査した。1日目及び5日目に、4-6週齢のBalb/cマウス(n=3)に、ブランク75-OCholB、76-OCholB、及び77-OCholB LNPを尾静脈経由で注射した(各注射に対して50μgのLNP)。体重を14日間監視し、14日目に、血液を収集及び分析した。図16Aに示されるように、未処置の対照群と比較して、LNP(75-OCholB、76-OCholB、及び77-OCholB)が注射されたマウスの体重は、研究全体にわたってわずかな差異を示した。LNPが注射されたマウスのクレアチニン、尿素、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、及びアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)の血清濃度は、対照マウスと非常に類似していた(図16B)。
Cre-loxPシステム及びトランスジェニックAi14マウスモデルをin vivoゲノム編集研究で使用した。図17Aに示されるように、このマウスモデルは、赤色蛍光タンパク質であるtdTomatoの転写を防止する、遺伝的に統合されたloxP隣接STOPカセットを有する。Creリコンビナーゼ媒介性遺伝子再編成が生じた時、STOPカセットを除去して、蛍光tdTomatoレポータータンパク質の発現を生じさせ得る。
概要
リピドイド合成に使用される化学物質であるアムホテリシンBならびに肝毒性及び腎毒性の評価に使用される市販のキットをSigma-Aldrichから購入した。1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[アミノ(ポリエチレングリコール)-2000](DSPE-PEG2000アミン)をアバンティに注文した。1%のペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco)及び10%のウシ胎児血清(FBS、Sigma-Aldrich)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Sigma-Aldrich)中で、HEK293細胞を培養した。AmBナノ粒子の流体力学的サイズ及び多分散性指数(PDI)を、Zeta-PALS粒径分析器(Brookhaven Instruments)で測定した。AmBカプセル化物の濃度、RBC溶血、及び細胞生存率をpectraMax M2eマイクロプレートリーダーで測定した。AmBカプセル化物を凍結乾燥機(Labconco)で凍結乾燥した。ヒト全血を、Reaserch Blood Component,LLCに注文した。C.albicansの株(SC5314)を、Tufts medical centerの分子生物学及び微生物部門のCarol A.Kumamoto教授の研究室から入手した。組織試料(100mg)をBeadBugマイクロチューブホモジナイザー(Benchmark scientific)で粉砕した。AmBの血漿及び組織濃度を、Tufts Universityの化学学科の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)(Agilent 1200)で測定した。雌BALB/cマウス(6-8週齢、体重20~30g)及び雌Sprague Dawleyラット(8~10週齢、体重200~250g)をCharles Riverに注文した。この研究の動物プロトコールは、Tufts Universityの施設内動物管理及び使用委員会(IACUC)に承認され(B2018-73)、in vivo実験は全て、承認された動物ケアガイドラインに基づいて実施された。
AmBカプセル化物を以下の通り調製した:要約すると、1mgの各リピドイドを、既に300μlのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解させた1mgのAmBと混合した。混合物を30分間超音波処理し、次に、それぞれが完全に溶解するまで、10分間ボルテックスした。次に、AmBナノ粒子を、エタノールに溶解した10mg/mLのDSPE-PEGを1:6.8のモル比(DSPE-PEG対リピドイド)と共に製剤化した。対照群として、AmBナノ粒子を、DSPE-PEGと共に製剤化しなかった。700rpmで連続的に均質化しながら、600μlの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)を含有するガラス瓶に、各溶液を滴下した。次に、透析バッグ(MWCO:3500Da)を4時間使用して、蒸留水に対して溶液をさらに透析し、600rpm/分の撹拌速度でDMSO及び酢酸ナトリウム緩衝液を除去した。AmBカプセル化物を2mlのガラス瓶に移して、2週間の視覚的な透明性を観察した。記録されたデータは、独立して実施された3つの実験の平均である。
AmBナノ粒子の安定性を評価するために、1及び2週間のエンドポイントに、粒径及びPDIを動的光散乱(DLS)で分析した。数のサイズ分布に基づいて、平均サイズ(nm)及びPDIを決定した。測定前に、AmBナノ粒子を脱イオン水中に10倍希釈で分散させた。同じ条件で、試料当たり60sの3回の実施を、90°の検出角度で行った。全てのナノ粒子を調製し、3回ずつ測定した。
搭載されたAmBの量を定量するために、SpectraMax M2eで、DMSOに溶解させた種々のAmB濃度(0.001~1.0mg/mL)の吸光度を研究することにより、AmB濃度の回帰検量線を計算した。UV-Vis吸収スペクトルのために、300~450nmの範囲の波長を選択した。DMSOにナノ粒子を溶解させることにより、リポソームにカプセル化されたAmBの量を測定し、次に、波長392nmでの吸光度を測定した。線形回帰検量線、次に、以下の等式:薬物搭載含有量(%)=W搭載×100/Wポリマー+W搭載(式中、W搭載は、カプセル化後にリポソーム中に搭載されたAmBの重量であり、Wポリマーは、リピドイドの重量である)に従って、AmBの薬物搭載含有量(DLC)を計算した。記録されたデータは、独立して実施された3つの実験の平均である。
酵母の培養液希釈抗真菌感受性試験のための標準的方法に従って、最小阻止濃度(MIC)及びC.albicans(SC5314)株を使用して、in vitroでのAmBカプセル化物の抗真菌効果を試験した。要約すると、酵母をサブローデキストロース寒天(SDA)プレート上で成長させ、水に接種して、1~5×106の酵母細胞/mLの最終接種濃度を得た。C.albicans細胞懸濁液を、RPMI-MOPS成長培地中に1:20で希釈し、100μlを0.125~32μg/mL及び0.109375μg/mL~14.0μg/mLの範囲の連続濃度のAmBを含有するマイクロリットルのトレイに分注した。薬物不含培地及び接種物を含有する3つのウェルを、陽性対照及び陰性対照として使用した。接種させたプレートを35℃で48時間インキュベートした。各ウェル中の成長を、24時間及び48時間で視覚的に推定した。MICは、C.albicansの視覚的な成長を妨げるAmBの最低濃度であると記録され、μg/mLで表された。記録されたデータは、独立して実施された3つの実験の平均である。
最適化されたAmBカプセル化物をスクリーニングするために、高用量のAmBカプセル化物が、毒性評価に必要とされた。AmBカプセル化物を凍結防止剤で凍結乾燥し、次に、濾過された脱イオン水で適切な容量に再構成し、続いて、振とうして、均質なリポソーム分散液を得た。上述のように溶血を実施した。6±2℃で保存された健康なボランティアから入手した静脈血。全血を遠心分離し(1600×gで30分)、上清をピペッティングして、廃棄した。次に、RBCをpH7.4の等張PBSで3回洗浄し、2%の貯蔵液で、PBS中に細かく分散させた。続いて、90μlのRBC懸濁液を、種々のAmBカプセル化物、遊離AmB、及びFungizone(登録商標)を含有するPBS 10μlと3回混合した。最終のAmBの濃度は、全てのナノ粒子中に、それぞれ、200、100、50、及び25μg/mLであった。次に、各試料を37℃でインキュベートした。1時間のインキュベーション後、溶血を停止させ、溶解しなかったRBCを遠心分離(5000xgで5分)で除去した。SpectraMax M2eで、540nmでのヘモグロビンの吸収を読み取ることにより、溶血の程度を決定する分析のために、上清を収集した。溶血(%)=(Abs-Abs0)×100/(Abs100-Abs0)(式中、Absは、AmBカプセル化物の吸光度であり、Abs100は、1%のTriton X100試料で処理された100%の溶解試料の吸光度であり、Abs0は、PBSで処理された未溶解試料の吸光度である。
ヒト胎児腎臓HEK293細胞を使用して、AmBカプセル化物の細胞生存率を評価した。細胞をウェル当たり5×103の細胞で96ウェル組織培養プレートに移し、薬物処置前に37℃で24時間インキュベートし、これは、種々の濃度のAmBカプセル化物、遊離AmB、及びFungizone(登録商標)(AmB200、100、50、及び25μg/mLに相当する)を含有する。30μLのMTT貯蔵液(5mg/mL)を各ウェルに添加し、プレートを37℃で4時間インキュベートした。培地を捨てた後、200μlのDMSOを添加して、MTTから変換された青色ホルマザン結晶を溶解させた。SpectraMax M2eで、570nmでの吸光度を測定することにより、細胞生存率を評価した。細胞生存率は、以下の等式:細胞生存率(%)=Abst/Absc×100%(式中、Abstは、薬物処置ウェルの吸光度であり、Abscは、薬物処置なしの対照の吸光度である)を使用して、薬物処置なしの対照ウェルから得られた吸光度で計算されたパーセンテージとして表された。
この実験では、6匹の雌Sprague Dawleyラットは、水の入手は自由にして約12時間一晩絶食させ、2群に無作為に分けた。Fungizone(登録商標)の最大耐量(MTD)が2mgのAmB/kgであることを考慮して、スクリーニングされたAmBカプセル化物またはFungizone(登録商標)のいずれかを、ラットに、AmB 2mg/kgに相当する単回用量で尾静脈経由で静脈内投与した。各群の血液試料(約0.5ml)を、投与後の各時点(10、30分間、及び1、2、4、6、8、12、24、36時間)で、眼窩穿刺によりヘパリン処理チューブ中に収集した。各血液試料を10000rpmで10分間遠心分離し、血漿をAmB濃度の決定のために収集した。2部のメタノールを1部の血漿に添加した。混合物を5分間ボルテックスし、続いて、遠心分離した(13000g、4℃、及び30分)。上述のように、上清をHPLC用に収集した。各試料のHPLC分析を、モジュール式液体クロマトグラフシステム(Agilent(商標))で実施した。移動相は、アセトニトリル及び10mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.0(40:60、v/v)で構成され、流速は、1mL/分に維持した。4.6×100mm、3.5μmサイズのeclipse plus C18逆相カラムで、化合物を分離させた。AmBの相対保持時間は、4分であった。流出液を、408nmで監視した。血漿AmB濃度を線形回帰検量線から計算した。Zhangにより設計されたPksソフトウェアの非コンパートメント薬物動態分析を使用して、AmB血漿中濃度対時間データを評価した。
組織分布研究のために、24匹のBALB/cマウスを4群(n=6)に無作為に分けた。3つの群に、それぞれ、10mg、5mg、2mgのAmB/kgの単回用量で、スクリーニングされたAmBカプセル化物を尾静脈経由で注射した。1つの群に、2mgのAmB/kgの単回用量でFungizone(登録商標)を静脈内注射した。各群の3匹のマウスをCO2吸入で死亡させ、組織(肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓、及び脳)を、それぞれ、投与の48時間及び72時間後に取り出し、それらがさらに処理されるまで-80℃に維持する。組織試料(100mg)を粉砕し、BeadBug組織ホモジナイザー(2分、4000rpm)で、高速で200μlのDI水で均質化した。2部のメタノールを1部のホモジネートに添加した。得られた混合物を、2分間ボルテックスし、続いて、遠心分離した(13000g、4℃、及び30分)。HPLC分析用に、薬物動態分析と同じ方法で、上清を使用した。
15匹の雌BALB/cマウスを5群(n=3)に無作為に分けた。3つの群に、それぞれ、10mg、5mg、2mgのAmB/kgの単回用量のスクリーニングされたAmBカプセル化物を尾静脈経由で注射した。1つの群を、2mgのAmB/kgの単回用量のFungizone(登録商標)を用いる同じ方法で投与した。対照群にPBSを注射した。注射の48時間及び72時間後に、血液試料(約0.2mL)を下顎静脈穿刺により収集し、4℃で凝固させ、次に、5000rpmで10分間遠心分離して、血清を収集する。腎臓及び肝臓の生化学的パラメータを、製造者のガイドラインに従って実施して、クレアチニン(Cr)、血中尿素窒素(BUN)、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)を含む腎毒性及び肝毒性調査を分析した。濃度を各キットの回帰検量線に基づいて計算した。
平均±標準偏差(SD)として表された全てのデータ。Prismソフトウェア(Graph Prism7.0 Software Inc.米国カリフォルニア州)を使用して、3群以上を比較するための二元配置分散分析(ANOVA)、続いて、Turkey-Kramer多重比較検定、及び2群を比較するためのstudent t検定で、群間の差異を評価した。差異は、p<0.05の時に、有意であるとみなされた。一方、凡例に記載される対照群に対して、*p<0.05及び**p<0.001。
AmBは、水性及び有機溶媒に可溶でない。生理学的pHでの水溶性は、1mg/L未満である。両親媒性の特性は、効率的で経済的な送達の課題とした。両親媒性の特徴は、ラクトン環の無極性側及び極性側から生じるが、両性特性は、イオン化可能なカルボキシル基及びアミン基の存在によるものである(図18a)。最初に、AmBを種々のリピドイド75-O14B、78-O14B、または87-O14Bで製剤化し、不透明な懸濁液を得たが、全てが、図2に示されるように1週間未満に沈殿した。粒径は、劇的に増加した。PDIは、2週間の終わりに0.7超まで増加する。言うまでもなく、粒径は、薬物動態及び毒性に重要な役割を果たす。直径が100nmを超える粒径が、血漿タンパク質と容易に相互作用するので、RESで容易に認識し、Amphocil(登録商標)などの血液からより迅速に排除することができる。しかし、粒径が小さすぎると、糸球体濾過及びFungizone(登録商標)などの薬物腎排泄を増加させ得る。ナノ粒子の最適化可能なサイズは、50~100nmである。
以前に報告されるように、DMSOに溶解したAmBは、UV範囲で3つの主要な分光光度ピークを示した。AmB濃度を392nmでの適切に希釈した比の吸光度で測定し、0.9985と同等の相関係数を用いる検量線で計算した。AmBカプセル化物のDLCは、38.9~49.9%であり、図21aに示されるように、リポソームとのAmBの優れた会合が示された。AmB/Q78-O14B-Fは、これらのカプセル化物の中で約49.9%の最高のDLCを示した。極性及び分配係数に依存するDLC効率は、リポソーム膜における局在を決定した。AmBが両親媒性であるので、水-脂質界面に隣接するアシル炭化水素鎖に属する(図18a)。
AmBは、真菌細胞膜中のエルゴステロールに高い親和性を有し、細孔形成、細胞間イオンの漏出、最終的に、真菌細胞死がもたらされる。24及び48時間のインキュベーションを用いるMIC試験は、酵母菌株C.albicans(SC5314)に対する遊離AmB及びFungizone(登録商標)と比較した場合、全てのAmBカプセル化物のMICが低いことが示された(図21b)。Fungizone(登録商標)のMICは、0.875μg/mLであり、C.albicansに対して、48時間のインキュベーション後の遊離AmBは、1.75μg/mLであった(図21b)。全てのAmBカプセル化物の中では、AmB/Q78-O14B-Fは、最も低いMIC(0.29±0.13μg/mL)を示し、これは、図21bに示されるように、遊離AmBのほぼ6分の1であり、Fungizone(登録商標)の3分の1であった(p<0.05)。4級アミノ基に特徴的な構造は、真菌細胞膜におけるAmB濃度の増加及びAmBとの相乗的な抗真菌効果により、より高い抗真菌効果に寄与し得る。
AmBカプセル化物の毒性を評価するために、種々の濃度のAmBにより誘導される溶血を、遊離AmB及びFungizone(登録商標)と比較した。遊離AmBは、100及び200μgのAmB/mLで、それぞれ、ほぼ80.69±2.39%及び102.47±1.04%の溶血を示した(図22a)。Fungizone(登録商標)は、同じ濃度のAmBで、ほぼ52.05±9.83%及び68.84±10.28%の溶血を示した。図22aに示されるように、AmBカプセル化物の溶血特性は、AmB/Q75-O14B-Fカプセル化物を除いて、200μgのAmB/mLまでは、ほとんど影響を受けなかった。これは、200μgのAmB/mLで21.39±3.58%を示す(p<0.05)。従って、二重層の単層から放出されたAmBは、ミセル製剤よりも低かったので、AmBカプセル化物は、Fungizone(登録商標)よりも血液毒性が低かった。Fungizone(登録商標)のミセルは、脂質二重層に比べて比較して、比較的弱い障壁があり、Fungizone(登録商標)の薬剤は、AmBカプセル化物よりも入手しやすく、ヘモグロビン及びカリウムの漏出が早くなる。Fungizone(登録商標)の溶血が増加する別の理由は、界面活性剤として作用するデオキシコール酸ナトリウムの構成成分が、溶血自体を誘導し得ることである。
図22bは、25~200μgのAmB/mLの範囲の濃度のAmBカプセル化物、Fungizone(登録商標)、及び遊離AmBの細胞生存率を示す。遊離AmB及びFungizone(登録商標)は、低濃度でも、24時間のインキュベーション後にのみ、HEK293に対して明らかな細胞毒性を示した。QLDと共に製剤化された後、AmB/(Q75-O14B,Q78-O14B,Q87-O14B)カプセル化物の細胞生存率は、AmB/(75-O14B,78-O14B 87-O14B)-Fカプセル化物と比較して、わずかに減少した。同時に、全てのAmBナノ粒子の細胞生存率は、Fungizone(登録商標)及び遊離AmBと比較した場合、劇的に増加した(p<0.05)。DSPE-PEGで製剤化した後、AmB/(Q75-O14B,Q78-O14B,Q87-O14B)-Fカプセル化物の細胞生存率は、200μgのAmB/mLまでは、70~80%のままであった。これはおそらく、生体適合性であり比較的毒性のないDSPE-PEGに寄与し、これは、AmBの正のアミノ基と相互作用して、二重層のイオン複合体を形成することが可能である。別の理由は、QLDが、AmBを有効にカプセル化して、ゆっくりと持続的なAmBの放出及び毒性の低減をもたらすことである。
薬物動態は、組織内の薬物の蓄積に影響を与える。薬物動態プロファイルを比較するために、AmB/Q78-O14B-F及びFungizone(登録商標)を、ラットに2mgのAmB/kg体重の用量で静脈内注射した。推定された血漿濃度対時間プロファイルは、図23aに示され、対応する平均薬物動態パラメータは、表1にまとめられた。
ナノ粒子が血液循環を離れると、薬剤がどこに行き、特定の組織にどれだけ留まるかを知ることが非常に重要である。その理由は、組織が全身性真菌感染症の主要な部位でもあるからである。48時間及び72時間の静脈内投与後の組織分布の結果は、図23b~23eに示された。AmB 5mg/kg及び2mg/kgと同等の単回用量のAmB/Q78-O14B-Fを投与した場合、全てのマウスは生存していた。AmB 10mg/kgのAmB/Q78-O14B-F及びFungizone(登録商標)2mg/kgと同等の用量で投与された場合、各群は、1匹の死亡したマウスを有する。
in vivo毒性評価の結果は、AmB/Q78-O14B-Fが、対照群と比較して、2mgまたは5mgのAmB/kgのいずれかの用量で処置されたマウスで、肝臓(ALT及びAST)ならびに腎臓(Cr及びBUN)機能に影響を与えなかったことを示唆した(図24)。結果は、2mgまたは5mgのAmB/kgのAmB/Q78-O14B-Fで処置されたマウスの腎臓におけるAmB濃度蓄積の低減と一致した(図23e)。従って、糸球体濾過が低減し、腎毒性が最小限に抑えられる。しかし、AmB/Q78-O14B-Fは、用量を10mgのAmB/kgに上昇させた場合、Cr及びBUNレベルまたは肝臓酵素AST及びALTを増加させた。全てが対照群と比較して有意差がある(p<0.05)(図24)。
清浄なガラスバイアル中で、フッ素含有尾部(2.5当量)をアミン頭部(1当量)と混合した。48時間継続的に撹拌しながら、混合物を70℃未満に維持した。次に、反応を停止させ、移動相としてメタノール及びジクロロメタンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、粗生成物を精製した。
上記の種々のフッ素鎖を有する脂質のGFP陽性細胞及びDsRed陽性細胞のパーセンテージの結果は、図25及び図26の棒グラフにまとめられる。
本明細書に開示される特徴は全て、任意の組み合わせで、組み合わせてもよい。本明細書に開示される各特徴は、同じ、同等の、または同様の目的を果たす代替の特徴で置き換えられてもよい。従って、別途明記のない限り、開示の各特徴は、一般的な一連の同等または同様の特徴の例示にすぎない。
最後に、本発明の好ましい実施態様を項分け記載する。
[実施形態1]
式(I)の化合物
親水性頭部であるAは、
R a 、R a ’、R a ”、及びR a ”’のそれぞれは独立して、H、C 1 -C 20 アルキル、C 2 -C 20 アルケニル、C 2 -C 20 アルキニル、C 3- C 20 シクロアルキル、C 1 -C 20 ヘテロアルキル、C 1 -C 20 ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;Zは、C 1 -C 20 二価脂肪族ラジカル、C 1 -C 20 二価ヘテロ脂肪族ラジカル、二価アリールラジカル、または二価ヘテロアリールラジカルであり、
Bは、C 1 -C 24 アルキル、C 2 -C 24 アルケニル、C 2 -C 24 アルキニル、C 3 -C 24 シクロアルキル、C 1 -C 24 ヘテロアルキル、C 1 -C 24 ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリール、または
R 1 及びR 2 のそれぞれは、C 1 -C 20 二価脂肪族ラジカルであり、
R 3 及びR 4 のそれぞれは独立して、HもしくはC 1 -C 10 アルキルであるか、またはR 3 及びR 4 は、それらが結合している原子と共に、C 3 -C 10 シクロアルキルを形成し、
R 5 は、C 1 -C 24 アルキル、C 2 -C 24 アルケニル、C 2 -C 24 アルキニル、C 3 -C 24 シクロアルキル、C 1 -C 24 ヘテロアルキル、C 1 -C 24 ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
Wは、O、S、またはSeであり、
Vは、結合、O、S、またはSeであり、
リンカーであるXは、
L 1 、L 2 、L 3 、及びL 4 のそれぞれは独立して、結合、O、S、またはNR c であり;Gは、O、S、またはNR d であり;Qは、OR f 、SR g 、またはNR h R i であり;r及びtのそれぞれは独立して、1~6であり、R c 、R d 、R f 、R g 、R h 、及びR i のそれぞれは独立して、H、C 1 -C 10 アルキル、C 1 -C 10 ヘテロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
mは、0または1であり、但し、VがSである場合、mは、1である)。
[実施形態2]
Aが、
[実施形態3]
Bが、
[実施形態4]
Xが、
R c 及びR d のそれぞれが独立して、HまたはC 1 -C 10 アルキルである、請求項1~3に記載の化合物。
[実施形態5]
R 1 及びR 2 のそれぞれが、C 1 -C 4 二価脂肪族ラジカルであり;R 3 及びR 4 のそれぞれが独立して、HまたはC 1 -C 4 アルキルであり;R 5 がC 1 -C 20 アルキルである、請求項1~4に記載の化合物。
[実施形態6]
Wが、O、S、またはSeであり;Vが結合である、請求項1~5に記載の化合物。
[実施形態7]
W及びVのそれぞれが独立して、OまたはSeであり、mが0である、請求項1~5に記載の化合物。
[実施形態8]
W及びVのそれぞれが、OまたはSであり;mが1である、請求項1~5に記載の化合物。
[実施形態9]
Aが、以下のアミンのうちの1つから形成されるアミノ部分である、請求項1~8に記載の化合物:
Aが、以下のアミンのうちの1つから形成されるアミノ部分である、請求項1~8に記載の化合物。
Aが、
Bが、
R 1 及びR 2 のそれぞれが、C 1 -C 4 二価脂肪族ラジカルであり;R 3 及びR 4 のそれぞれが独立して、HまたはC 1 -C 4 アルキルであり;R 5 がC 1 -C 20 アルキルである、請求項1~10に記載の化合物。
[実施形態12]
Aが、以下のアミンのうちの1つから形成されるアミノ部分である、請求項1~11のいずれかに記載の化合物:
Aが、以下のアミンのうちの1つから形成されるアミノ部分である、請求項1~11のいずれかに記載の化合物:
Wが、O、S、またはSeであり;Vが結合である、請求項11~13のいずれかに記載の化合物。
[実施形態15]
W及びVのそれぞれが独立して、OまたはSeであり、mが0である、請求項11~13のいずれかに記載の化合物。
[実施形態16]
W及びVのそれぞれがOであり、mが1である、請求項11~13のいずれかに記載の化合物。
[実施形態17]
式(I)の化合物
親水性頭部であるAは、
R a 、R a ’、R a ”、及びR a ”’のそれぞれは独立して、H、C 1 -C 20 アルキル、C 2 -C 20 アルケニル、C 2 -C 20 アルキニル、C 3- C 20 シクロアルキル、C 1 -C 20 ヘテロアルキル、C 1 -C 20 ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;Zは、C 1 -C 20 二価脂肪族ラジカル、C 1 -C 20 二価ヘテロ脂肪族ラジカル、二価アリールラジカル、または二価ヘテロアリールラジカルであり、
Bは、C 1 -C 24 アルキル、C 2 -C 24 アルケニル、C 2 -C 24 アルキニル、C 3 -C 24 シクロアルキル、C 1 -C 24 ヘテロアルキル、C 1 -C 24 ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリール、または
R 1 が、C 1 -C 20 二価脂肪族ラジカルであり、
R 2 が、結合またはC 1~ C 20 二価脂肪族ラジカルであり、
R 3 及びR 4 のそれぞれは独立して、HもしくはC 1 -C 10 アルキルであるか、またはR 3 及びR 4 は、それらが結合している原子と共に、C 3 -C 10 シクロアルキルを形成し、
R 5 が、
R 6 は、結合またはC 1 -C 20 二価脂肪族ラジカルであり;R b 及びR b ’はそれぞれ、Fであるか、またはR b 及びR b ’は、それらが結合している原子と共に、C=Oを形成し;R 7 は、Fまたは脂肪族脂質部分であり;L 1 及びL 2 のそれぞれは独立して、結合、O、S、またはNR c であり、R c は、H、C 1 -C 10 アルキル、C 1 -C 10 ヘテロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;nは、1~20であり;
W及びVのそれぞれが独立して、結合、O、S、またはSeであり、
リンカーであるXは、
L 3 、L 4 、L 5 、及びL 6 のそれぞれは独立して、結合、O、S、またはNR c であり;Gは、O、S、またはNR d であり;Qは、OR f 、SR g 、またはNR h R i であり;r及びtのそれぞれは独立して、1~6であり、R c 、R d 、R e 、R f 、R g 、R h 、及びR i のそれぞれは独立して、H、C 1 -C 10 アルキル、C 1 -C 10 ヘテロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
mが0または1である)。
[実施形態18]
Aが、
Bが、
[実施形態19]
R 1 及びR 2 のそれぞれが、C 1 -C 4 二価脂肪族ラジカルであり;R 3 及びR 4 のそれぞれが独立して、HまたはC 1 -C 4 アルキルである、請求項17または18に記載の化合物。
[実施形態20]
L 1 及びL 2 のそれぞれが結合であり、R b 、R b ’、及びR 7 のそれぞれがFである、請求項17~19のいずれかに記載の化合物。
[実施形態21]
R 2 、W、及びVのそれぞれが結合であり、mが0である、請求項17~20のいずれかに記載の化合物。
[実施形態22]
Aが、
Bが、
[実施形態23]
R 1 が、C 1 -C 4 二価脂肪族ラジカルであり;Xが、
R c 及びR d のそれぞれが独立して、HまたはC 1 -C 10 アルキルである、請求項22に記載の化合物。
[実施形態24]
Aが、以下のアミンのうちの1つから形成されるアミノ部分である、請求項23に記載の化合物:
Aが、以下のアミンのうちの1つから形成されるアミノ部分である、請求項23に記載の化合物:
R 6 が、C 1 -C 4 二価脂肪族ラジカルであり、L 1 及びL 2 のそれぞれが独立して、OまたはNR c であり、R c が、HまたはC 1 -C 10 アルキルであり;R b 及びR b ’が、それらが結合している原子と共に、C=Oを形成し;nが1または2であり;R 7 が脂肪族脂質部分である、請求項17に記載の化合物。
[実施形態27]
R 7 が、コレステロールから形成される脂肪族脂質部分である、請求項26に記載の化合物。
[実施形態28]
R 1 及びR 2 のそれぞれが、C 1 -C 4 二価脂肪族ラジカルであり;Xが、
R c 及びR d のそれぞれが独立して、HまたはC 1 -C 10 アルキルであり;W及びVのそれぞれが独立して、O、S、またはSeであり;mが0である、請求項26に記載の化合物。
[実施形態29]
Aが、以下のアミンのうちの1つから形成されるアミノ部分である、請求項27に記載の化合物:
Aが、以下のアミンのうちの1つから形成されるアミノ部分である、請求項27に記載の化合物:
ナノ複合体を含む医薬組成物であって、前記ナノ複合体が、請求項1~16のいずれかに記載の化合物及びタンパク質または核酸から形成され、前記ナノ複合体が、50nm~1000nmの粒径を有し、前記化合物が、非共有結合相互作用、共有結合、またはその両方を介して前記タンパク質または核酸に結合する、医薬組成物。
[実施形態32]
前記タンパク質が、GFP-CreまたはCRISPR/Cas9である、請求項31に記載の医薬組成物。
[実施形態33]
ナノ複合体を含む医薬組成物であって、前記ナノ複合体が、請求項17~30のいずれかに記載の化合物及びタンパク質または核酸から形成され、前記ナノ複合体が、50nm~1000nmの粒径を有し、前記化合物が、非共有結合相互作用、共有結合、またはその両方を介して前記タンパク質または核酸に結合する、医薬組成物。
[実施形態34]
前記タンパク質が、GFP-CreまたはCRISPR/Cas9である、請求項33に記載の医薬組成物。
[実施形態35]
病状を処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項31または32に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
[実施形態36]
病状を処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項33または34に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
[実施形態37]
ナノ複合体を含む医薬組成物であって、前記ナノ複合体が、請求項1~16のいずれかに記載の化合物及び低分子から形成され;前記ナノ複合体が、50nm~1000nmの粒径を有し、前記化合物が、非共有結合相互作用、共有結合、またはその両方を介して、前記低分子に結合する、医薬組成物。
[実施形態38]
前記低分子が、抗真菌剤または化学療法剤である、請求項37に記載の医薬組成物。
[実施形態39]
前記低分子が、ボルテゾミブ、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、ダコミチニブ、ダウノルビシン塩酸塩、シタラビン、フルオロウラシル、イリノテカン塩酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、メトトレキサート、パクリタキセル、ビンクリスチン硫酸塩、エピルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、レナリドマイド、イブルチニブ、アビラテロン酢酸エステル、エンザルタミド、ペメトレキセド、パルボシクリブ、ニロチニブ、エベロリムス、ルキソリチニブ、エピルビシン、ピリルビシン、イダルビシン、バルルビシン、アムルビシン、ブレオマイシン、フレオマイシン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、ストレプトゾテシン、ペントスタチン、ミトサン(Mitosanes)マイトマイシンC、エンジインカリケアマイシン、グリコシドレベッカマイシン、マクロライドラクトンエポチヒロン(epotihilones)、イクサベピロン、ペントスタチン、サリノスポラミドA、ビンブラスチン、ビンクリスチン、エトポシド、テニポシド、ビノレルビン、ドセタキセル、カンプトテシン、ハイカムチン、ペデリン、テオペデリン(Theopederins)、アナミド(Annamides)、トラベクテジン、アプリジン、及びエクテイナシジン743(ET743)からなる群より選択される、請求項37に記載の医薬組成物。
[実施形態40]
前記低分子が、アムホテリシンBまたはドキソルビシンである、請求項37に記載の医薬組成物。
[実施形態41]
ナノ複合体を含む医薬組成物であって、前記ナノ複合体が、請求項17~30のいずれかに記載の化合物及び低分子から形成され;前記ナノ複合体が、50nm~1000nmの粒径を有し、前記化合物が、非共有結合相互作用、共有結合、またはその両方を介して、前記低分子に結合する、医薬組成物。
[実施形態42]
前記低分子が、抗真菌剤または化学療法剤である、請求項41に記載の医薬組成物。
[実施形態43]
前記低分子が、ボルテゾミブ、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、ダコミチニブ、ダウノルビシン塩酸塩、シタラビン、フルオロウラシル、イリノテカン塩酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、メトトレキサート、パクリタキセル、ビンクリスチン硫酸塩、エピルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、レナリドマイド、イブルチニブ、アビラテロン酢酸エステル、エンザルタミド、ペメトレキセド、パルボシクリブ、ニロチニブ、エベロリムス、ルキソリチニブ、エピルビシン、ピリルビシン、イダルビシン、バルルビシン、アムルビシン、ブレオマイシン、フレオマイシン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、ストレプトゾテシン、ペントスタチン、ミトサンマイトマイシンC、エンジインカリケアマイシン、グリコシドレベッカマイシン、マクロライドラクトンエポチヒロン、イクサベピロン、ペントスタチン、サリノスポラミドA、ビンブラスチン、ビンクリスチン、エトポシド、テニポシド、ビノレルビン、ドセタキセル、カンプトテシン、ハイカムチン、ペデリン、テオペデリン、アナミド、トラベクテジン、アプリジン、及びエクテイナシジン743(ET743)からなる群より選択される、請求項41に記載の医薬組成物。
[実施形態44]
前記低分子が、アムホテリシンBまたはドキソルビシンである、請求項41に記載の医薬組成物。
[実施形態45]
病状を処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項37~40のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
[実施形態46]
病状を処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項41~44のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
Claims (14)
- R5がC1-C20アルキルである、請求項1に記載の化合物。
- WがOまたはSである、請求項1または2に記載の化合物。
- WがOである、請求項1または2に記載の化合物。
- WがSである、請求項1または2に記載の化合物。
- WがSeである、請求項1または2に記載の化合物。
- ナノ複合体を含む医薬組成物であって、前記ナノ複合体が、請求項1~8のいずれか一項に記載の化合物及びタンパク質または核酸から形成され、前記ナノ複合体が、50nm~1000nmの粒径を有し、前記化合物が、非共有結合相互作用、共有結合、またはその両方を介して前記タンパク質または核酸に結合する、医薬組成物。
- 前記タンパク質が、GFP-CreまたはCRISPR/Cas9である、請求項9に記載の医薬組成物。
- ナノ複合体を含む医薬組成物であって、前記ナノ複合体が、請求項1~8のいずれか一項に記載の化合物及び低分子から形成され;前記ナノ複合体が、50nm~1000nmの粒径を有し、前記化合物が、非共有結合相互作用、共有結合、またはその両方を介して、前記低分子に結合する、医薬組成物。
- 前記低分子が、抗真菌剤または化学療法剤である、請求項11に記載の医薬組成物。
- 前記低分子が、ボルテゾミブ、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、ダコミチニブ、ダウノルビシン塩酸塩、シタラビン、フルオロウラシル、イリノテカン塩酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、メトトレキサート、パクリタキセル、ビンクリスチン硫酸塩、エピルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、レナリドマイド、イブルチニブ、アビラテロン酢酸エステル、エンザルタミド、ペメトレキセド、パルボシクリブ、ニロチニブ、エベロリムス、ルキソリチニブ、エピルビシン、ピリルビシン、イダルビシン、バルルビシン、アムルビシン、ブレオマイシン、フレオマイシン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、ストレプトゾテシン、ペントスタチン、ミトサン(Mitosanes)マイトマイシンC、エンジインカリケアマイシン、グリコシドレベッカマイシン、マクロライドラクトンエポチヒロン(epotihilones)、イクサベピロン、ペントスタチン、サリノスポラミドA、ビンブラスチン、ビンクリスチン、エトポシド、テニポシド、ビノレルビン、ドセタキセル、カンプトテシン、ハイカムチン、ペデリン、テオペデリン(Theopederins)、アナミド(Annamides)、トラベクテジン、アプリジン、及びエクテイナシジン743(ET743)からなる群より選択される、請求項11に記載の医薬組成物。
- 前記低分子が、アムホテリシンBまたはドキソルビシンである、請求項11に記載の医薬組成物。
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