BR112020015796A2 - nanocomplexos semelhantes a lipídios e usos dos mesmos - Google Patents

nanocomplexos semelhantes a lipídios e usos dos mesmos Download PDF

Info

Publication number
BR112020015796A2
BR112020015796A2 BR112020015796-1A BR112020015796A BR112020015796A2 BR 112020015796 A2 BR112020015796 A2 BR 112020015796A2 BR 112020015796 A BR112020015796 A BR 112020015796A BR 112020015796 A2 BR112020015796 A2 BR 112020015796A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
piperazine
fact
ocholb
gfp
lnps
Prior art date
Application number
BR112020015796-1A
Other languages
English (en)
Inventor
Qiaobing Xu
Yamin Li
Original Assignee
Trustees Of Tufts College
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Trustees Of Tufts College filed Critical Trustees Of Tufts College
Publication of BR112020015796A2 publication Critical patent/BR112020015796A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C219/00—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C219/02—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C219/04—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C219/06—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the hydroxy groups esterified by carboxylic acids having the esterifying carboxyl groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/575—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of three or more carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, ergosterol, sitosterol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0045—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent agent being a peptide or protein used for imaging or diagnosis in vivo
    • A61K49/0047—Green fluorescent protein [GFP]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1658—Proteins, e.g. albumin, gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/24—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having more than one carboxyl group bound to the carbon skeleton, e.g. aspartic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/08—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hydrocarbon radicals, substituted by hetero atoms, attached to ring carbon atoms
    • C07D207/09—Radicals substituted by nitrogen atoms, not forming part of a nitro radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D233/56—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, attached to ring carbon atoms
    • C07D233/58—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, attached to ring carbon atoms with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, attached to ring nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D295/04—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms
    • C07D295/12—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly or doubly bound nitrogen atoms
    • C07D295/125—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly or doubly bound nitrogen atoms with the ring nitrogen atoms and the substituent nitrogen atoms attached to the same carbon chain, which is not interrupted by carbocyclic rings
    • C07D295/13—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly or doubly bound nitrogen atoms with the ring nitrogen atoms and the substituent nitrogen atoms attached to the same carbon chain, which is not interrupted by carbocyclic rings to an acyclic saturated chain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

São divulgados os compostos da Fórmula (I) abaixo: (I), em que cada uma das variáveis A, B, X, W, V, R1-R5 e m está definida neste documento. Também são divulgadas composições farmacêuticas contendo um nanocomplexo, em que o nanocomplexo é formado por um dos compostos e uma proteína, um ácido nucleico, ou uma pequena molécula; e métodos de tratamento de uma condição médica com uma das composições farmacêuticas.

Description

NANOCOMPLEXOS SEMELHANTES A LIPÍDIOS E USOS DOS MESMOS REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO
[0001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente Provisória U.S. Nº de série 62/625,153, depositado em 1 de fevereiro de 2018, cujos conteúdos são incorporados neste documento por referência.
APOIO GOVERNAMENTAL
[0002] Esta invenção foi feita com apoio governamental sob o subsídio 1452122 concedido pela National Science Foundation, subsídios EB027170 e TR002636 concedidos pelo National Institutes of Health e subsídio N00014-16-1- 2550 concedido pela Marinha dos Estados Unidos. O governo tem determinados direitos sobre a invenção.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0003] A terapêutica baseada em proteína é usada para manipulação transitória e precisa das funções celulares devido às suas altas especificidades e baixos efeitos fora do alvo. Por exemplo, a proteína 9 associada à repetição palindrômica curta regularmente interespaçada, isto é, CRISPR/Cas9, demonstra alta flexibilidade e especificidade para edição do genoma, seja por meio de deleção, inserção, ativação e repressão de genes ou via modificação epigenética. CRISPR/Cas9 facilita a modelagem de doenças e a identificação de novos tratamentos para vários distúrbios genéticos e doenças infecciosas.
[0004] Uma proteína como a CRISPR/Cas9 deve ser distribuída ao seu sítio alvo, ou seja, um alvo intracelular, para atingir os efeitos terapêuticos. No entanto, tem sido um desafio de longa data desenvolver carreadores seguros e eficientes para a distribuição intracelular de proteínas terapêuticas.
[0005] Os métodos convencionais para distribuição de proteínas incluem técnicas mecânicas/físicas (por exemplo, microinjeção, eletroporação e injeção hidrodinâmica) e modificações bioquímicas baseadas em carreadores (por exemplo, peptídeos de sinal de localização nuclear, lipídios ou nanocomplexos semelhantes a lipídios e conjuntos poliméricos). As técnicas mecânicas/físicas, embora não necessitem de carreadores, mostram-se invasivas, levantando questões práticas para aplicação in vivo. Por outro lado, os carreadores usados em modificações bioquímicas, embora sejam capazes de distribuir proteínas intracelularmente, exibem limitações significativas, por exemplo, baixa eficiência de transfecção e alta citotoxicidade.
[0006] Existe a necessidade de desenvolver um novo carreador sem as limitações mencionadas acima para distribuir uma proteína ao seu sítio alvo.
SUMÁRIO
[0007] A presente invenção se refere a certos compostos lipofílicos para formar nanocomplexos semelhantes a lipídios que podem ser usados para distribuir uma proteína, por exemplo, CRISPR/Cas9, ao seu sítio alvo. Inesperadamente, esses nanocomplexos semelhantes a lipídios demonstram maior eficiência de transfecção e menor citotoxicidade do que Lipofectamine 2000 (Lpf2k), um agente comercial comumente usado para distribuição de proteínas.
[0008] Em um aspecto desta invenção, ele cobre dois conjuntos de compostos semelhantes a lipídios de fórmula (I) abaixo: (I).
[0009] Em um conjunto, referindo-se à fórmula (I), A é uma cabeça hidrofílica selecionada dentre , , , ,e , onde cada Ra, Ra’, Ra”, e Ra”’, independentemente, é H, C1-C20 alquil, C2-C20 aquenil, C2-C20 alquinil, C3-C20 cicloalquil, C1-C20 heteroalquil, C1-C20 heterocicloalquil, aril, ou heteroaril; e Z é um radical alifático bivalente C1-C20, um radical heteroalifático bivalente C1-C20, um radical aril bivalente, ou radical heteroaril bivalente; B é C1-C24 alquil, C2-C24 alquenil, C2-C24 alquinil, C3-C24 cicloalquil, C1-C24 heteroalquil, C1-C24 heterocicloalquil, aril, ou heteroaril, ou ; cada R1 e R2, independentemente, é um radical alifático bivalente C1-C20; cada R3 e R4, independentemente, é H ou C1-C10 alquil, ou R3 e R4, juntamente com o átomo ao qual estão ligado, formam C3-C10 cicloalquil; R5 é C1-C24 alquil, C2-C24 alquenil, C2-
C24 alquinil, C3-C24 cicloalquil, C1-C24 heteroalquil, C1-C24 heterocicloalquil, aril, ou heteroaril; W é O, S, ou Se; V é uma ligação, O, S, ou Se; X, um ligante peptídico, é ou , em que cada L1, L2, L3, e L4, independentemente, é uma ligação, O, S, ou NRc; G é O, S, ou NRd; Q é ORf, SRg, ou NRhRi; e cada f r e t, independentemente, é 1-6, cada Rc, Rd, Rf, Rg, Rh, e Ri, independentemente, sendo H, C1-C10 alquil, C1-C10 heteroalquil, aril, ou heteroaril; e m é 0 ou 1, dado que m é 1 quando V é S.
[0010] Em outro conjunto, referindo-se à fórmula (I) novamente, A é uma cabeça hidrofílica selecionada dentre , , , , e , onde cada Ra, Ra’, Ra”, e Ra”’, independentemente, é H, C1-C20 alquil, C2- C20 alquenil, C2-C20 alquinil, C3-C20 cicloalquil, C1-C20 heteroalquil, C1-C20 heterocicloalquil, aril, ou heteroaril; e Z é um radical alifático bivalente C 1-C20, um radical heteroalifático bivalente C1-C20, a radical aril bivalente, ou um radical heteroaril bivalente; B é C1-C24 alquil, C2-C24 alquenil, C2-C24 alquinil, C3-C24 cicloalquil, C1-C24 heteroalquil, C1-C24 heterocicloalquil, aril, ou heteroaril, ou ; R1 é um radical alifático bivalente C1-C20; R2 é uma ligação ou radical alifático bivalente C1-C20; cada R3 e R4, independentemente, é H ou C1-C10 alquil, ou R3 e R4, juntamente com o átomo ao qual estão ligados, formam C3-C10 cicloalquil; R5 é , em que R6 é uma ligação ou radical alifático bivalente C1-C20; cada Rb e Rb’ é F ou, Rb e Rb’, juntamente com o átomo ao qual estão ligados, formam C=O; R7 é F ou uma fração lipídica alifática; cada L1 e L2, independentemente, é uma ligação, O, S, ou NRc, Rc sendo H, C1-C10 alquil, C1-C10 heteroalquil, aril, ou heteroaril; e n é 1 a 20; cada W e V, independentemente, é uma ligação, O, S, ou Se; X, um ligante peptídico, é ou , no qual cada L3, L4, L5, e L6, independentemente, é uma ligação, O, S, ou NRc; G é O, S, ou NRd; Q é ORf, SRg, ou NRhRi; e cada r e t, independentemente, é 1-6, cada Rc, Rd, Re, Rf, Rg, Rh, e Ri, independentemente, sendo H, C1-C10 alquil, C1-C10 heteroalquil, aril, ou heteroaril; e m é 0 ou 1.
[0011] Normalmente, os compostos semelhantes a lipídios descritos acima têm A variável como ou , cada Ra e Ra', independentemente, sendo um radical alifático monovalente C1-C10, um radical heteroalifático monovalente C1- C10, um radical aril monovalente ou um radical heteroaril monovalente; e Z sendo um radical alifático bivalente C1-C10, um radical heteroalifático bivalente C1-C10, um radical aril bivalente ou um radical heteroaril bivalente. Estes compostos têm preferencialmente variáveis B como .
[0012] O termo "compostos semelhantes a lipídios" neste documento se refere a compostos que contêm um ou mais grupos de cabeça contendo amina hidrofílica (ou polar) e uma ou mais caudas contendo hidrocarboneto hidrofóbico (ou não polar). Ver, por exemplo, Love et al., PNAS, 2010, 107(5), 1864-1869. O termo "nanocomplexos semelhantes a lipídios" refere-se a nanocomplexos que contêm um dos compostos semelhantes a lipídios. Vide, por exemplo, Wang, et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2014, 53(11), 2893-2898.
[0013] O termo "alifático" neste documento se refere a uma fração de hidrocarboneto saturado ou insaturado, linear ou ramificado, acíclico, cíclico ou policíclico. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, porções de alquil, alquileno, alquenil, alquenileno, alquinil, alquinileno, cicloalquil, cicloalquileno, cicloalquenil, cicloalquenileno, cicloalquinil e cicloalquinileno.
[0014] O termo "fração lipídica alifática" neste documento se refere a uma fração hidrofóbica que contém hidrocarbonetos, álcoois, aldeídos ou ácidos carboxílicos de cadeia longa, saturada ou insaturada, linear ou ramificada, acíclica, cíclica ou policíclica. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, colesterol, desmosterol e lanosterol.
[0015] O termo "alquil" ou "alquileno" refere-se a uma fração de hidrocarboneto saturado, linear ou ramificado, tal como metil, metileno, etileno, etileno, propil, propileno, butil, butilenos, pentil, pentileno, hexil, hexileno, heptil, heptileno, octil, octileno, nonil, nonileno, decil, decileno, undecil, undecileno, dodecil, dodecileno, tridecil, tridecileno, tetradecil, tetradecileno, pentadecil, pentadecileno, hexadecil, hexadecileno, heptadecil, heptadecileno, octadecil, octadecileno, nonadecil, nonadecileno, isocil, icosileno, triacontil e triacotileno. O termo "alquenil" ou "alquenileno" refere-se a uma fração de hidrocarboneto linear ou ramificada que contém pelo menos uma ligação dupla, tal como -CH=CH-CH3 e -CH=CH-CH2-. O termo "alquinil" ou "alquinileno" se refere a uma fração de hidrocarboneto linear ou ramificado que contém pelo menos uma ligação tripla, tal como -CC-CH3 e -CC-CH2-. O termo "cicloalquil" ou "cicloalquileno" refere-se a uma fração de hidrocarboneto cíclico saturado, tal como ciclohexil e ciclohexileno. O termo "cicloalquenil" ou "cicloalquenileno" refere-se a uma fração de hidrocarboneto cíclico não aromático que contém pelo menos uma ligação dupla, tal como ciclohexenil ciclohexenileno. O termo "cicloalquinil" ou "cicloalquinileno" refere-se a uma fração de hidrocarboneto cíclico não aromático que contém pelo menos uma ligação tripla, ciclooctinil e ciclooctinileno.
[0016] O termo "heteroalifático" neste documento se refere a uma fração alifática contendo pelo menos um heteroátomo selecionado a partir de N, O, P, B, S, Si, Sb, Al, Sn, As, Se e Ge.
[0017] O termo "alcoxi" neste documento refere-se a um -O-alquil. Exemplos de alcoxi incluem metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, iso-butoxi, sec- butoxi e terc-butoxi.
[0018] O termo "aril" neste documento se refere a um sistema de anel aromático C6 monocíclico, C10 bicíclico, C14 tricíclico, C20 tetracíclico ou C24 pentacíclico aromático. Exemplos de grupos aril incluem fenil, fenileno, naftil,
naftileno, antracenil, antrcenileno, pirenil e pirenileno. O termo "heteroaril" neste documento se refere a um sistema de anel aromático monocíclico de 5-8 membros, 8-12 membros bicíclico, 11-14 membros tricíclico e 15-20 membros tetracíclico tendo um ou mais heteroátomos (tais como O, N, S, ou Se). Exemplos de grupos heteroaril incluem furil, furileno, fluorenil, fluorenileno, pirrolil, pirrolileno, tienil, tienileno, oxazolil, oxazolileno, imidazolil, imidazolileno, benzimidazolil, benzimidazolileno, tiazolil, tiazolileno, piridil, piridileno, pirimidinil, pirimidileno, quinazolil, quinazolinileno, quinolinil, quinolinileno, isoquinolil, isoquinolileno, indolil e indolileno.
[0019] A menos que especificado de outra forma, alifático, heteroalifático, alcoxi, alquil, alquileno, alquenil, alquenileno, alquinil, alquinileno, cicloalquil, cicloalquileno, cicloalquenil, cicloalquenileno, cicloalquinil, cicloalquinileno, heterocicloalquil, heterocicloalquileno, heterocicloalquenil, heterocicloalquenileno, aril, e heteroaril mencionados neste documento incluem frações substituídas e não substituídas. Possíveis substituintes em cicloalquil, cicloalquileno, cicloalquenil, cicloalquenileni, cicloalquinil, cicloalquinileni, heterocicloalquil, heterocicloalquileno, heterocicloalquenil, heterocicloalquenileno, aril, e heteroaril incluem, mas não estão limitados a, C1-C10 alquil, C2-C10 alquenil, C2-C10 alquinil, C1-C20 alcóxi, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 cicloalquenil, C3-C20 heterocicloalquil, C3-C20 heterocicloalquenil, C1-C10 alcóxi, aril, arilóxi, heteroaril, heteroarilóxi, amino, C1-C10 alquilamino, C2-C20 dialquilamino, arilamino, diarilamino, C1-C10 alquilsulfonamino, arilsulfonamino, C1- C10 alquilimino, arilimino, C1-C10 alquilsulfonimino, arilsulfonimino, hidroxil, halo, tio, C1-C10 alquiltio, ariltio, C1-C10 alquilsulfonil, arilsulfonil, acilamino, aminoacil, aminotioacil, amido, amidino, guanidino, ureído, tioureído, ciano, nitro, nitroso, azido, acil, tioacil, acilóxi, carboxil, e éster carboxílico. Por outro lado, os substituintes possíveis em alifático, heteroalifático, alquil, alquileno, alquenil, alquenileno, alquinil e alquinileno incluem todos os substituintes citados acima, exceto C1-C10 alquil. Cicloalquil, cicloalquileno, cicloalquenil, cicloalquenileno, heterocicloalquil, heterocicloalquileno, heterocicloalquenil, heterocicloalquenileno, aril e heteroaril também podem ser fundidos uns com os outros.
[0020] Os compostos semelhantes a lipídios descritos acima incluem os próprios compostos, bem como seus sais e solvatos, se aplicável. Um sal, por exemplo, pode ser formado entre um ânion e um grupo carregado positivamente (por exemplo, amino) em um composto semelhante a lipídios. Os ânions adequados incluem cloreto, brometo, iodeto, sulfato, nitrato, fosfato, citrato, metanossulfonato, trifluoroacetato, acetato, malato, tosilato, tartarato, fumurato, glutamato, glucuronato, lactato, glutarato e maleato. Da mesma forma, um sal também pode ser formado entre um cátion e um grupo carregado negativamente (por exemplo, carboxilato) em um composto semelhante a lipídio. Os cátions adequados incluem íon sódio, íon potássio, íon magnésio, íon cálcio e um cátion amônio, tal como íon tetrametilamônio. Os compostos semelhantes a lipídios também incluem aqueles sais contendo átomos de nitrogênio quaternário. Um solvato refere-se a um complexo formado entre um composto semelhante a lipídio e um solvente farmaceuticamente aceitável. Exemplos de solventes farmaceuticamente aceitáveis incluem água, etanol, isopropanol, acetato de etila, ácido acético e etanolamina.
[0021] Outro aspecto desta invenção se refere a uma composição farmacêutica contendo um nanocomplexo formado por um composto semelhante a lipídio descrito acima e uma proteína ou um ácido nucleico. Nesta composição, o nanocomplexo tem um tamanho de partícula de 50 a 1000 nm (por exemplo, 50 a 500 nm, 50 a 300 nm e 50 a 180 nm). O composto semelhante a lipídio se liga à proteína ou ácido nucleico por meio de uma interação não covalente, uma ligação covalente ou ambas.
[0022] O termo "proteína" se refere a um polímero de aminoácidos naturais ou não naturais ligados entre si por ligações de amida e tendo um peso molecular de 800 Dalton ou superior. O termo "ácido nucleico" refere-se a um polímero de nucleotídeos ligados entre si por ligações fosfodiéster, tendo um peso molecular de 800 Dalton ou superior. Ambos os polímeros podem ser modificados quimicamente. Exemplos de modificação de proteína incluem PEGuilação e carboxilação de grupos amina em resíduos de lisina neles contidos. Mais especificamente, a carboxilação de proteínas ou peptídeos pode ser conseguida usando anidrido cis- aconítico. Ver Lee et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2009, 48, 5309-5312; Lee et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2010, 49, 2552-2555; e Maier et al., Journal of the American Chemical Society, 2012, 134, 10169-10173.
[0023] O termo "interação não covalente" refere-se a qualquer ligação não covalente, que inclui interação iônica, ligação de hidrogênio, interação de van der Waals e interação hidrofóbica.
[0024] A composição farmacêutica contém tipicamente um carreador farmaceuticamente aceitável. O carreador na composição farmacêutica deve ser "aceitável" no sentido de que seja compatível com o ingrediente ativo da composição (e de preferência, capaz de estabilizar o ingrediente ativo) e não deletério para o sujeito a ser tratado. Um ou mais agentes solubilizantes podem ser utilizados como excipientes farmacêuticos para distribuição de um composto glicosídeo ativo . Exemplos de outros carreadores incluem óxido de silício coloidal, estearato de magnésio, celulose, lauril sulfato de sódio e Amarelo D&C # 10.
[0025] Ainda é compreendido por esta invenção é um método de tratamento de uma condição médica, por exemplo, uma doença pulmonar. O método inclui uma etapa de administração a um sujeito em necessidade de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica acima descrita.
[0026] Os detalhes da invenção estão estabelecidos na descrição abaixo. Outras características ou vantagens da presente invenção serão evidentes a partir dos seguintes desenhos e descrição detalhada das várias modalidades, e também a partir das reivindicações anexas.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0027] A Figura 1 é uma representação esquemática da síntese de compostos semelhantes a lipídios (lipidoides) e encapsulação de proteínas em nanopartículas de lipidoides. (a) Encapsulação de GFP-Cre e Cas9:sgRNA com carga negativa em nanopartículas lipidóides catiônicas sintéticas (LNPs) para distribuição de proteína intracelular e edição de genoma. (b) Via sintética e nomenclatura de lipidoides. (c) Estruturas químicas das cabeças de amina para a síntese de lipidoides.
[0028] A Figura 2 é uma representação esquemática da caracterização de lipidoides e LNPs. (a) e (b) 1H NMR e espectros de ESI-MS de 76-O17O, 76-O17S e 76-O17Se (ver compostos semelhantes a lipídios exemplares abaixo). (c) Análise estatística do diâmetro hidrodinâmico médio (<Dh>) distribuição de LNPs. (d) Distribuições de diâmetro hidrodinâmico típicas de LNPs 76-O17O, 76-O17S e 76-
O17Se.
[0029] A Figura 3 é uma representação esquemática de outra caracterização de lipidoides e LNPs. (a) e (b) Imagens típicas de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e variações de tamanho relativo de LNPs 76- O17O, 76-O17S e 76-O17Se (barra de escala sendo 100 nm). (c) Intensidades de emissão fluorescente e razões FRET de LNPs 76-O17Se carregados com DiO/DiI durante o armazenamento.
[0030] A Figura 4 é uma representação esquemática da triagem in vitro de LNPs para distribuição de proteína. (a) Imagens típicas de proteína (-30)GFP-Cre e células HeLa-DsRed tratadas com LNPs 76-O17O, 76-O17S e 76-O17Se carregadas com (-30)GFP-Cre. Barra de escala = 200 μm. (b) Porcentagem de células GFP-positivas mostradas para 51 LNPs testados. Os pontos de dados marcados em vermelho para LNPs induziram alto nível de transfecção. (c) As caudas (O17O, O17S e O17Se) influenciaram a atividade de transfecção da proteína (-30)GFP-Cre.
[0031] A Figura 5 é uma representação esquemática da relação estrutura- atividade para LNPs. (a) e (b) Os valores aparentes de pKa e a capacidade de ruptura da membrana da bicamada de fosfolipídios influenciaram a eficiência de distribuição da proteína (-30)GFP-Cre. (c) Taxas de acerto relativas de LNPs eficazes com nenhuma, uma ou duas propriedades. (d) Taxas de acerto relativas de LNPs eficazes com caudas O17O, O17S ou O17Se.
[0032] A Figura 6 mostra a eficiência da distribuição de (-30)GFP-Cre com LNPs. (a) Expressão de DsRed de células HeLa-DsRed tratadas com (-30)GFP- Cre e (-30)GFP-Cre carregados com LNPs. (b) Viabilidade celular de células HeLa- DsRed tratadas com (-30)GFP-Cre e (-30)GFP-Cre carregados com LNPs
[0033] A Figura 7 é uma representação esquemática de imagens de fluorescência típicas de seções de pulmões obtidas de camundongos Ai14 tratados com PBS e GFP-Cre/LNPs (a primeira coluna sendo 4', 6-diamidino-2-fenilindol ou DAPI; a segunda coluna sendo tdTomato; a terceira coluna mostrando a fusão da primeira e da segunda colunas; e a barra de escala sendo 100 μm).
[0034] A Figura 8 mostra a eficiência da distribuição de Cas9:sgRNA com LNPs. (a) Nocaute de GFP de células GFP-HEK tratadas com Cas9:sgRNA e
Cas9:sgRNA/LNPs. (b) Viabilidade celular de células GFP-HEK tratadas com Cas9:sgRNA e Cas9:sgRNA/LNPs.
[0035] A Figura 9 é uma apresentação esquemática de lipidoides combinatórios baseados em colesterol e responsivos à redução para distribuição intracelular. (A) Estruturas químicas de lipidoides catiônicos e grupos de cabeça de amina. (B) Nanopartículas de lipidoides como uma plataforma versátil para drogas anticâncer, mRNA e entrega de proteínas.
[0036] A Figura 10 mostra a caracterização de lipioides e nanopartículas. (A) Espectros MALDI-TOF de lipidoides. (B) Diâmetro hidrodinâmico e polidispercidade de nanopartículas lipidoides medidas por DLS. (C) Imagens TEM de nanopartículas lipidoides. Barra de escala = 200 nm. (D) Mudança de tamanho relativo de nanopartículas em branco sob armazenamento. (E) Testes de citotoxicidade de nanopartículas OcholB, O16B e Lpf2k. P <0,05, teste t de student.
[0037] A Figura 11 mostra avariação morfológica desencadeada por tiol e a liberação da carga. (A) Variação de tamanho relativo dependente do tempo das nanopartículas lipidoide com tratamento com DTT e cisteína. (B) Imagens TEM de nanopartículas lipidoides tratadas com DTT. Barra de escala = 600 nm. (C) Mudança de tamanho relativo da nanopartícula lipidoide após 24 h de tratamento com DTT. (D) Espectros de emissão fluorescente de cargas carregadas de nanopartículas. (E) Perfil de liberação de NR dependente do tempo. (F) Intensidade fluorescente de nanopartículas lipidoides encapsuladas com calceína tratadas com DTT ou cisteína. (G) Teste de ligação de RNA de nanopartículas lipidoides com e sem tratamento com DTT.
[0038] A Figura 12 mostra o estudo de internalização de nanopartículas lipidoides carregadas com carga. (A) Variação da razão FRET dependente do tempo de nanopartículas carregadas com DiO-DiI. (B) Porções de células NR+ dependentes do tempo de células HeLa tratadas com nanopartículas carregadas de NR. (C) Porções de células NR+ de nanopartículas lipidoide após 8 h de exposição. (D) Imagens fluorescentes de células HeLa tratadas por nanopartículas carregadas com NR. Barra de escala = 100 μm. (E) Intensidade fluorescente média de células HeLa tratadas com calceína livre ou encapsulada em nanopartículas. (F) Eficiências de transfecção de proteína (-30)GFP-Cre por nanopartículas lipidoides contra células HeLa-DsRed. (G) Intensidade fluorescente média, (H) histograma de citometria de fluxo, (I) imagens fluorescentes e (J) imagens de campo claro de células HeLa-DsRed tratadas com (-30)GFP-Cre/LNPs. Barra de escala = 110 μm.
[0039] A Figura 13 mostra adistribuição intracelular de drogas anticâncer. (A) Espectros de absorção e emissão fluorescente de nanopartículas carregadas com CPT e Dox. (B) Intensidade fluorescente média de células HeLa tratadas com Dox livres e encapsuladas em nanopartículas. (C) Citotoxicidade dependente da dose de Dox livre, e nanopartículas carregadas com Dox e em branco. (D) Citotoxicidade de CPT e Oxa livres e encapsulados em nanopartículas.
[0040] A Figura 14 mostra a distribuição intracelular de mRNA. (A) Razão de peso de LNP/mRNA e (B) eficácia de transfecção dependente da dose de mRNA. (C) Imagens fluorescentes de células HeLa tratadas com mRNA/LNPs. Barra de escala = 100 μm. (D) Eficiência de transfecção e (E) citotoxicidade de mRNA/LNPs. (F) Imagens de campo claro de células HeLa tratadas com mRNA/LNPs. Barra de escala = 110 μm. Distribuição de (G) Cre mRNA e (H) Cas9 mRNA e sgRNA por OCholB LNPs.
[0041] A Figura 15 mostra adistribuição intracelular da proteína de edição do genoma. (A) Estudo do mecanismo de internalização. (B) Eficiência de edição de genoma, (C) histograma de citometria de fluxo, (D) citotoxicidade e (E) imagens de campo claro de células HeLa-DsRed tratadas com (-30)GFP-Cre/LNPs. Escala = 200 μm. (F) A eficácia da edição do genoma foi plotada contra a viabilidade celular para cada condição testada.
[0042] A Figura 16 mostra os testes de toxicidadein vivo. Análise do (A) peso corporal dependente do tempo e (B) bioquímica de sangue de camundongos Balb/c injetados com LNPs em branco.
[0043] A Figura 17 mostra a distribuição de mRNA e proteína para edição do genoma in vivo usando camundongos Ai14 adultos. (A) recombinação de genes mediada por Cre. Protocolos usados para (B) injeções intramusculares e (C) intravenosas. Imagens fluorescentes de (D) proteína intramuscular/LNPs (barra de escala = 270 μm) e (E) músculos esqueléticos injetados com mRNA/LNPs intramusculares (barra de escala = 270 μm). Imagens fluorescentes de (F) pulmões de camundongos injetados com controle e proteína intravenosa/LNPs (barra de escala = 135 μm) e (G) baços de camundongos injetados com mRNA/LNPs por via intravenosa (barra de escala = 190 μm). Canal vermelho na imagem original, tdTomato; Canal azul na imagem original, DAPI. As imagens nos painéis superiores são de camundongos injetados com nanopartículas e as imagens nos painéis inferiores são de camundongos de controle não tratados.
[0044] A Figura 18 é uma apresentação esquemática que mostra (a) Encapsulação de AmB em nanopartículas lipidoides catiônicas sintéticas e efeito em células de fungo. (d) Os lipidoides quaternizados foram sintetizados combinatórios das moléculas de amina e alquil-epóxido, os lipidoides são nomeados como segue (números de carbono da cauda)-(número de amina)
[0045] A Figura 19 mostraos estados de estabilidade visual após a preparação: encapsulados AmB/(75-O4B, 78-O14B, 87-O14B) demonstraram suspensão opaca e todos precipitados dentro de 1 semana, AmB/(75-O14B, 78- O14B, 87-O14B)-F encapsula soluções translúcidas demonstradas após a preparação e não homogeneiza ao final de 2 semanas, encapsulados AmB/(Q75- O14B, Q78-O14B, Q87-O14B) e AmB/(Q75-O14B, Q78-O14B, Q87-O14B) -F exibem soluções amarelas transparentes homogêneas e estáveis nas 2 semanas seguintes.
[0046] A Figura 20 mostra (a) tamanhos hidrodinâmicos de encapsulados AmB e Fungizone® após a preparação e nas 2 semanas seguintes (n=9), (b) índices de polidispersidade de encapsulados AmB após a preparação e nas 2 semanas seguintes determinados por DLS (n=9). *p <0,05 e ** p<0,001 v.s. do tamanho de partícula e PDI após a preparação.
[0047] A Figura 21 mostra (a) O DLC de encapsulados AmB e Fungizone® (n=3). (b) O MIC de diferentes encapsulamentos AmB, AmB livre e Fungizone® contra Candida. Albicans (SC5314) após 24h e 48h de incubação na faixa de 14,0 a 0,109375μg/mL (n=9), *P <0,05 v.s. Fungizone®.
[0048] A Figura 22 mostra (a) Hemólise de RBCs humanos por encapsulados AmB, AmB livre e Fungizone® em concentrações equivalentes de AmB (25, 50, 100, 200μg/mL) após 1h de incubação a 37◦C(n=9). (b) Teste de MTT in vitro de diferentes encapsulados AmB, AmB livre e Fungizone® em relação à linhagem de células HEK293 em concentrações equivalentes de AmB (25, 50, 100,
200μg/mL) após 24h de incubação. Todos os dados apresentam-se como média±DP (n=9), *p<0,05 e **p<0,001 v.s. Fungizone®
[0049] A Figura 23 mostra (a) concentrações plasmáticas de AmB após injeção intravenosa de AmB/Q78-O14B-F e Fungizone® a uma dose de 2 mg de AmB/kg para camundongos SD; (b-e) As concentrações de AmB em tecidos de camundongos após 48h e 72h de tratamento intravenoso de AmB/Q78-O14B-F (10mg, 5mg, 2mg AmB/kg, respectivamente) e Fungizone® (2 mg AmB/kg) por HPLC, (b) Fígado, (c) Baço, (d) Pulmão, (e) Rim, *p <0,05 e **p <0,001 v.s. Fungizone®.
[0050] A Figura 24 mostra a toxicidade in vivo de (a) creatinina, (b) BUN, (c) ALT, (d) nível de AST em camundongos BALB/c saudáveis 48h e 72h após administração intravenosa com AmB/Q78-O14B-F na dose de 10 mg, 5 mg e 2 mg de AmB/kg e Fungizone® na dose de 2 mg de AmB/kg (n=3), *p <0,05 e **p <0,001 v.s. Fungizone®.
[0051] A Figura 25 é um gráfico de barras que mostra a porcentagem de células positivas para GFP (GFP +) como uma função do lipidoide contendo flúor usado para distribuição de proteína.
[0052] A Figura 26 é um gráfico de barras que mostra a porcentagem de células DsRed positivas em função do lipidoide contendo flúor usado para a distribuição de proteína.
[0053] A Figura 27 é um gráfico de barras que mostra a porcentagem de células GFP + em função do lipidoide (derivado de lipídios com caudas hidrofóbicas diferentes e sintetizado a partir da amina 200) usado para distribuição de proteína.
[0054] A Figura 28 é um gráfico de barras que mostra a porcentagem de células GFP+ em função do lipidoide (derivado de lipídios sintetizados a partir de diferentes análogos de amina cíclica) usados para a distribuição de proteína.
[0055] A Figura 29 é um gráfico de barras que mostra a luminescência observada decorrente da distribuição de mRNA às células T CD8+ como uma função do lipidoide (derivado de lipídios sintetizados a partir de diferentes análogos de amina contendo imidazol).
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0056] São divulgados em detalhes neste documento compostos semelhantes a lipídio da presente invenção.Mais especificamente, duas modalidades são descritas na ordem abaixo.
[0057] Em uma primeira modalidade, referindo-se à fórmula (I) mostrada acima, A é uma cabeça hidrofílica selecionada dentre , , , ,e , em que cada Ra, Ra’, Ra”, e Ra”’, independentemente, é H, C1-C20 alquil, C2-C20 alquenil, C2-C20 alquinil, C3-C20 cicloalquil, C1-C20 heteroalquil, C1-C20 heterocicloalquil, aril, ou heteroaril; e Z é um radical alifático bivalente C1- C20, um radical heteroalifático bivalente C1-C20, um radical aril bivalente, ou um radical heteroaril bivalente; B é C1-C24 alquil, C2-C24 alquenil, C2-C24 alquinil, C3-C24 cicloalquil, C1-C24 heteroalquil, C1-C24 heterocicloalquil, aril, ou heteroaril, ou ; cada R1 e R2, independentemente é um radical alifático bivalente C1-C20; cada R3 e R4, independentemente, é H ou C1-C10 alquil, ou R3 e R4, juntamente com o átomo ao qual estão ligados, formam C 3-C10 cicloalquil; R5 é C1-C24 alquil, C2-C24 alquenil, C2-C24 alquinil, C3-C24 cicloalquil, C1- C24 heteroalquil, C1-C24 heterocicloalquil, aril, ou heteroaril; W é O, S, ou Se; V é uma ligação, O, S, ou Se; X, um ligante peptídico, é ou , em que cada L1, L2, L3, e L4, independentemente, é uma ligação, O, S, ou NRc; G é O, S, ou NRd; Q é ORf, SRg, ou NRhRi; e cada r e t, independentemente, é 1-6, cada Rc, Rd, Rf, Rg, Rh, e Ri, independentemente, sendo H, C1-C10 alquil, C1-C10 heteroalquil, aril, ou heteroaril; e m é 0 ou 1, dado que m é 1 quando V é S.
[0058] Esta modalidade inclui preferencialmente compostos que têm tipicamente variável A como ou , e a variável B como . Compostos exemplares têm variáveis A, B e R1-R5 como se segue: A é ou ; B é ; cada um de R1 e R2, independentemente, é um radical alifático bivalente C1-C4; cada um de R3 e R4, independentemente, é H ou C1-C4 alquil; e R5 é C1-C20 alquil.
[0059] De preferência, A é uma fração amino formada a partir de uma das seguintes aminas: .
[0060] Conforme descrito acima, X é um ligante peptídico. Exemplos de X incluem, mas não estão limitados a, , ,
,e , e, cada um de Rc e Rd, independentemente, sendo H ou C1-C10 alquil. Estes compostos têm preferencialmente cada um de R1 e R2, independentemente, como um radical alifático bivalente C1-C4; cada um de R3 e R4, independentemente, como H ou C1-C4 alquil; e R5 como C1-C20 alquil.
[0061] Voltando-se para as variáveis W, V e m, esta modalidade pode incluir, com base nessas três variáveis, os seguintes três subconjuntos de compostos.
[0062] O subconjunto (i) inclui os compostos de fórmula (I), em que cada um de W e V, independentemente, é O ou Se; e m é 0.
[0063] Este subconjunto de compostos pode ter sua fração formada a partir de uma das seguintes moléculas: , em que q é um número inteiro de 8-12.
[0064] O subconjunto (ii) inclui os compostos de fórmula (I), em que W é O, S ou Se; V é uma ligação; e m é 0 ou 1.
[0065] Este subconjunto de compostos pode ter sua fração formada a partir de uma das seguintes moléculas:
, em que q é um número inteiro de 8-12.
[0066] O subconjunto (iii) inclui os compostos de fórmula (I), em que cada um de W e V é O ou S e m é 1.
[0067] Este subconjunto de compostos pode ter sua fração formada a partir de uma das seguintes moléculas: , em que q é um número inteiro de 8-12.
[0068] Alternativamente, este subconjunto de compostos pode ter sua fração formada a partir de uma das seguintes moléculas: , em que X é O, S ou NH; R é H ou Me; p é um número inteiro de 0-3; q é um número inteiro de 1-16; e v é um número inteiro de 1-10.
[0069] Na segunda modalidade, referindo-se à fórmula (I) acima novamente, A é uma cabeça hidrofílica selecionada dentre , , , ,e , em que cada Ra, Ra’, Ra”, e Ra”’, independentemente, é H, C1-C20 alquil, C2-C20 alquenil, C2-C20 alquinil, C3-C20 cicloalquil, C1-C20 heteroalquil, C1-C20 heterocicloalquil, aril, ou heteroaril; e Z é um radical alifático bivalente C 1- C20, um radical heteroalifático bivalente C1-C20, um radical aril bivalente, ou um radical heteroaril bivalente; B é C1-C24 alquil, C2-C24 alquenil, C2-C24 alquinil, C3-C24 cicloalquil, C1-C24 heteroalquil, C1-C24 heterocicloalquil, aril, ou heteroaril, ou ; R1 é um radical alifático bivalente C1-C20; R2 é uma ligação ou radical alifático bivalente C1-C20; cada R3 e R4, independentemente, é H ou C1-C10 alquil, ou R3 e R4, juntamente com o átomo no qual estão ligados, formam C3-C10 cicloalquil; R5 é , em que R6 é uma ligação ou radical alifático bivalente C1-C20; cada Rb e Rb’ é F ou, Rb e Rb’, juntamente com o átomo no qual estão ligados, formam C=O; R7 é F ou uma fração lipídica alifática; cada L1 e L2, independentemente, é uma ligação, O, S, ou NRc, Rc sendo H, C1-C10 alquil, C1-C10 heteroalquil, aril, ou heteroaril; e n é 1 a 20; cada W e V, independentemente, é uma ligação, O, S, ou Se; X, um ligante peptídico, é ou , em que cada L3, L4, L5, e L6, independentemente, é uma ligação, O, S, ou NRc; G é O, S, ou NRd; Q é ORf, SRg, ou NRhRi; e cada r e t, independentemente, é 1-6, cada Rc, Rd, Re, Rf, Rg, Rh, e Ri,
independentemente, sendo H, C1-C10 alquil, C1-C10 heteroalquil, aril, ou heteroaril; e m é 0 ou 1.
[0070] Como a primeira modalidade, a segunda modalidade também pode incluir compostos com a variável A como ou e a variável B como .
[0071] Um exemplo de composto desta modalidade tem as variáveis A, B e R1-R4 como se segue: A é ou ; B é ; cada um de R1 e R2, independentemente, é um radical alifático bivalente C1-C4; e cada um de R3 e R4, independentemente, é H ou C1-C4 alquil.
[0072] Novamente, A pode ser uma fração amino formada a partir de uma das seguintes aminas:
1,4-Bis(3-aminopropil)piperazina 1-(2-Aminoetil)piperidina-3-carboxamida piperazina-2-carboxamida 4-Aminopiperidina Dicloridrato de 4-(aminometil)piperidinoinformamidina 1-Amino-4-(2-hidroxietil)piperazina 2-(4-aminopiperidin-1-il)acetamida 1-(2-(Aminoetil)piperazina 2-(Aminometil)piperidina 2-Metilpiperazina 2,3-Dimetilpiperazina 1-Metilpiperazina Piperazina 2-(Trifluorometil)piperazina 2-Oxopiperazina 1-(3-aminopropil)piperazina 1-(3-pirrolidinopropil)piperazina 1-metil-4-(2-piperidin-4-il-etil-)-piperazina 2-(4-Metil-piperazin-1-il)-etilamina 1-Ciclopentilpiperazina 1-(2-diisopropilaminoetil)piperazina .
[0073] Na segunda modalidade, exemplos de X incluem, mas não estão limitados a, , , , , , e , cada um de Rc e Rd, independentemente, sendo H ou C1-C10 alquil. Estes compostos têm preferencialmente cada um de R1 e R2 como um radical alifático bivalente C1-C4; cada um de R3 e R4, independentemente, como H ou C1-C4 alquil; e R5 como C1-C20 alquil.
[0074] Quanto às variáveis W, V e m, a segunda modalidade pode incluir compostos tendo cada um de R2, W e V como uma ligação e m como 0.
[0075] Com referência à variável R5, isto é, , os compostos nesta modalidade podem ter cada um de L 1 e L2 como uma ligação, e cada um de Rb, Rb' e R7 como F. Os compostos exemplares têm sua porção formada a partir de uma das seguintes moléculas: , em que j é um número inteiro de 0-10 e k é um número inteiro de 1-20.
[0076] Alternativamente, esta modalidade inclui aqueles compostos, em que R6 é um radical alifático bivalente C1-C4; cada um de L1 e L2, independentemente, é O ou NRc, Rc sendo H ou C1-C10 alquil; Rb e Rb', juntamente com o átomo ao qual estão ligados, formam C=O; n é 1 ou 2; e R7 é uma fração lipídica alifática. A fração lipídica alifática pode ser colesterol. Compostos exemplares têm sua fração formada a partir de uma das seguintes moléculas:
, em que X é O ou NH e W é O, S ou Se.
[0077] Os compostos semelhantes a lipídios desta invenção podem ser preparados por métodos bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Wang et al., ACS Synthetic Biology, 2012, 1, 403-407; Manoharan et al., WO 2008/042973; e Zugates et al., Patente US 8,071,082.
[0078] A via sintética mostrada abaixo exemplifica a síntese de certos compostos semelhantes a lipídios descritos acima: , em que cada uma das variáveis Ra, R2-R5, X, W, V e m são definidas acima.
[0079] Nesta rota sintética exemplar, um composto amina, isto é, composto D, reage com um composto E de vinilcarbonil para se obter o produto final, isto é, composto F. Composto D amino pode ser um dos Compostos 10, 17, 63, 75-78, 80-82, 87, 90, 93, 103, 304, 306 e 400 descritos acima.
[0080] Outros compostos semelhantes a lipídios desta invenção podem ser preparados usando outros materiais de partida adequados através da via sintética acima descrita e outras conhecidas na técnica. O método estabelecido acima pode incluir uma(s) etapa(s) adicional(is) para adicionar ou remover grupos de proteção adequados a fim de permitir, em última análise, a síntese dos compostos semelhantes a lipídios. Além disso, várias etapas sintéticas podem ser realizadas em uma sequência ou ordem alternativa para se obter o material desejado. As transformações de química sintética e metodologias de grupo de proteção (proteção e desprotecção) úteis na síntese de compostos semelhantes a lipídios aplicáveis são conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, R. Larock,
Comprehensive Organic Transformations (2ª Ed., VCH Publishers 1999); P.G.M. Wuts e T.W. Greene, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis (4ªEd ., John Wiley and Sons 2007); L. Fieser e M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis (John Wiley and Sons 1994); e L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis (2ª ed., John Wiley and Sons 2009) e suas edições subsequentes.
[0081] Certos compostos semelhantes a lipídios podem conter uma ligação dupla não aromática e um ou mais centros assimétricos. Assim, eles podem ocorrer como racematos e misturas racêmicas, enantiômeros individuais, diastereômeros individuais, misturas diastereoméricas e formas isoméricas cis ou trans. Todas essas formas isoméricas são contempladas.
[0082] Conforme mencionado acima, estes compostos semelhante a lipídios são úteis para a distribuição de proteínas ou ácidos nucleicos. Eles podem ser triados preliminarmente quanto à sua eficácia na distribuição de agentes farmacêuticos por um ensaio in vitro e, em seguida, confirmados por experimentos em animais e ensaios clínicos. Outros métodos também serão evidentes para aqueles versados na técnica.
[0083] Para não ser limitado por nenhuma teoria, os compostos semelhantes a lipídios facilitam a distribuição de proteínas ou ácidos nucléicos formando complexos, por exemplo, nanocomplexos e micropartículas. A cabeça hidrofílica de tal composto semelhante a lipídio, com carga positiva ou negativa, liga-se a uma fração de uma proteína ou ácido nucleico que é carregada de forma oposta e sua fração hidrofóbica se liga a uma fração hidrofóbica da proteína ou ácido nucleico. Qualquer ligação pode ser covalente ou não covalente.
[0084] Os complexos descritos acima podem ser preparados usando procedimentos descritos em publicações como Wang et al., ACS Synthetic Biology, 2012, 1, 403-407. Geralmente, eles são obtidos pela incubação de um composto semelhante a lipídios e uma proteína ou ácido nucleico em um tampão, como um tampão de acetato de sódio ou uma solução salina tamponada com fosfato ("PBS").
[0085] Ainda é compreendido por esta invenção uma composição farmacêutica contendo um nanocomplexo formado por um composto semelhante a lipídio descrito acima e uma proteína ou um ácido nucleico. Novamente, o composto semelhante a lipídio se liga à proteína ou ácido nucleico por meio de uma interação não covalente, uma ligação covalente ou ambas.
[0086] Exemplos da proteína ou ácido nucleico incluem, mas não estão limitados a, proteína 9 associada à repetição palindrômica curta regularmente interespaçada (CRISPR/Cas9), Cre recombinase ((-30)GFP-Cre) e Cas9:RNA de guia único (Cas9:sgRNA) ribonucleoproteína (RNP) ou Cas9:sgRNA RNP.
[0087] Ainda dentro do escopo desta invenção está um método de tratamento de uma condição médica, por exemplo, uma doença pulmonar, com a composição farmacêutica acima descrita. O método inclui a administração a um sujeito (por exemplo, um paciente) em necessidade de uma quantidade eficaz da composição farmacêutica.
[0088] O termo "uma quantidade eficaz" refere-se à quantidade de complexos que é necessária para conferir um efeito terapêutico ao sujeito tratado. As doses eficazes irão variar, conforme reconhecido pelos versados na técnica, dependendo dos tipos de doenças tratadas, via de administração, uso de excipiente e a possibilidade de co-uso com outro tratamento terapêutico.
[0089] Para praticar o método da presente invenção, uma composição com os complexos descritos acima pode ser administrada por via parentérica, oral, nasal, retal, tópica ou bucal. O termo "parentérica", conforme utilizado neste documento, refere-se a injeção subcutânea, intracutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-arterial, intrassinovial, intraesternal, intratecal, intralesional ou intracraniana, bem como qualquer técnica de infusão adequada.
[0090] Uma composição injetável estéril pode ser uma solução ou suspensão em um diluente ou solvente não tóxico parentericamente aceitável, como uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão manitol, água, solução de Ringer, e solução isotônica de cloreto de sódio. Além disso, óleos fixos são convencionalmente empregados como solvente ou meio de suspensão (por exemplo, mono- ou diglicerídeos sintéticos). Ácidos graxos, como o ácido oleico e seus derivados glicerídicos são úteis na preparação de injetáveis, assim como óleos naturais farmaceuticamente aceitáveis, como o azeite ou óleo de mamona, especialmente em suas versões polioxietiladas. Estas soluções ou suspensões de óleo também podem conter um diluente ou dispersante alcoólico de cadeia longa, carboximetilcelulose ou agentes dispersantes semelhantes. Outros surfactantes usados normalmente, tais como Tween, Spans e/ou outros agentes emulsificantes ou potencializadores de biodisponibilidade semelhantes que são comumente usados na fabricação de formas de dosagem sólidas, líquidas ou outras farmaceuticamente aceitáveis também podem ser usados para fins de formulação.
[0091] Uma composição para administração oral pode ser qualquer forma de dosagem oralmente aceitável incluindo cápsulas, comprimidos, emulsões e suspensões aquosas, dispersões e soluções. No caso dos comprimidos, os carreadores comumente usados incluem lactose e amido de milho. Agentes lubrificantes, tais como o estearato de magnésio, são também normalmente adicionados. Para administração oral em uma forma de cápsula, os diluentes úteis incluem lactose e amido de milho seco. Quando suspensões ou emulsões aquosas são administradas por via oral, o ingrediente ativo pode ser suspenso ou dissolvido em uma fase oleosa combinada com agentes emulsificantes ou de suspensão. Se desejado, certos agentes edulcorantes, flavorizantes ou de coloração também podem ser adicionados.
[0092] Um aerossol nasal ou composição para inalação pode ser preparada de acordo com técnicas bem conhecidas na técnica de formulação farmacêutica. Por exemplo, tal composição pode ser preparada como uma solução em solução salina, empregando álcool benzílico ou outros conservantes adequados, promotores de absorção para potencializar a biodisponibilidade, fluorcarbonos e/ou outros agentes solubilizantes ou dispersantes conhecidos na técnica.
[0093] Uma composição contendo os nanocomplexos também pode ser administrada na forma de supositórios para administração retal.
EXEMPLOS
[0094] Sem elaboração adicional, acredita-se que uma pessoa versada na técnica pode, com base na descrição acima, utilizar a presente invenção em toda sua extensão. Os exemplos específicos a seguir devem ser, portanto, interpretados como meramente ilustrativos e não limitantes no que diz respeito ao restante desta divulgação de maneira alguma. Materiais e Métodos
Geral
[0095] Todos os produtos químicos usados para a síntese de lipidoides foram adquiridos da Sigma-Aldrich sem purificação adicional, a menos que indicado de outra forma. (-30)GFP-Cre recombinase, S. pyogenes Cas9 (spCas9) e sgRNA foram gerados seguindo os protocolos relatados em Wang et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 2016, 113, 2868-2873 (“Wang”). As células HeLa-DsRed e GFP-HEK foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma- Aldrich) com de soro fetal bovino a 10% (FBS, Sigma-Aldrich) e penicilina- estreptomicina a 1% (Gibco). Todos os espectros de 1H RMN foram registrados em um espectrômetro de RMN AVIII 500 MHz Bruker operado no modo de transformada de Fourier. O tamanho hidrodinâmico e o índice de polidispersidade das nanopartículas foram medidos pelo analisador de tamanho de partícula Zeta- PALS (Brookhaven Instruments). Os valores aparentes de pKa de lipidoides foram determinados usando 2-(ácido p-toluidininaftaleno-6-sulfônico) (TNS, Sigma- Aldrich) como sonda fluorescente seguindo os protocolos relatados em Heyes et al., J. Controlled Release, 2005, 107, 276-287. As medições de TEM foram realizadas em um Microscópio Eletrônico de Transmissão FEI Technai. Imagens de fluorescência de fatias de tecido foram obtidas usando o microscópio de fluorescência BZ-X Analyzer. Síntese de compostos semelhantes a lipídios (ou seja, lipidoides)
[0096] As aminas de cabeça (Sigma-Aldrich) foram misturadas com caudas de acrilatos (por exemplo, O17O, O17S e O17Se) a uma razão molar de 1:2,4 em frascos de vidro revestido de teflon com tampa de rosca por 48 horas a 700 °C. Os produtos brutos foram purificados usando um sistema de cromatografia Teledyne Isco.
[0097] Uma classe de compostos semelhantes a lipídios de fórmula (I) foi sintetizada seguindo a via sintética mostrada abaixo:
trietilamina X = Cl, Br ou I Y = O, S ou Se
[0098] As aminas de cabeça Ra-NH2mostradas no esquema acima foram selecionadas dos Compostos 10, 17, 63, 75-78, 80-82, 87, 90, 93, 103, 304, 306, e
400.
[0099] Mostrados na tabela abaixo estão os códigos, fórmulas químicas e dados analíticos (ESI-MS) de 51 compostos exemplares semelhantes a lipídios ("lipidoides") de fórmula (I). Observe que cada lipidoide é codificado como X-O17Y, em que X representa o número de um composto amino e Y representa O, S ou Se. O código X-O17Y indica que um lipidoide é formado a partir de uma amina do Composto X e uma molécula de lipídio O17Y (Y sendo O, S ou Se).
[0100] Por exemplo, o lipidoide 10-O17O é formado a partir do Composto amina 10 e da molécula de lipídio O17O da seguinte forma:
[0101] Cada código na tabela abaixo contém O17O, O17S ou O17Se, que representa uma das três moléculas:
Código do [M+H]+ Fórmula Química [M+H]+ Cal.
Lipidoide Encontrado 10-O17O C41H82NO7 700,61 700,70 10-O17S C41H82NO5S2 732,56 732,59 10-O17Se C41H82NO5Se2 828,45 828,27 17-O17O C48H88NO8 806,65 806,63 17-O17S C48H88NO6S2 838,60 838,49 17-O17Se C48H88NO6Se2 934,49 934,27 63-O17O C43H87N2O6 727,66 727,67 63-O17S C43H87N2O4S2 759,61 759,62 63-O17Se C43H87N2O4Se2 855,50 855,35 75-O17O C44H89N2O6 741,67 741,71 75-O17S C44H89N2O4S2 773,63 773,69 75-O17Se C44H89N2O4Se2 869,51 869,67 76-O17O C44H87N2O6 739,66 739,74 76-O17S C44H87N2O4S2 771,61 771,69 76-O17Se C44H87N2O4Se2 867,50 867,46 77-O17O C45H89N2O6 753,67 753,75
77-O17S C45H89N2O4S2 785,63 785,64 77-O17Se C45H89N2O4Se2 881,51 881,46 78-O17O C42H85N2O6 713,64 713,79 78-O17S C42H85N2O4S2 745,59 745,57 78-O17Se C42H85N2O4Se2 841,48 841,43 80-O17O C43H87N2O6 727,66 727,68 80-O17S C43H87N2O4S2 759,61 759,70 80-O17Se C43H87N2O4Se2 855,50 855,46 81-O17O C45H91N2O6 755,69 755,71 81-O17S C45H91N2O4S2 787,64 787,64 81-O17Se C45H91N2O4Se2 883,53 883,45 82-O17O C45H89N2O6 753,67 753,88 82-O17S C45H89N2O4S2 785,63 785,70 82-O17Se C45H89N2O4Se2 881,51 881,42 87-O17O C45H91N2O8 787,68 787,71 87-O17S C45H91N2O6S2 819,63 819,52 87-O17Se C45H91N2O6Se2 915,52 915,39 90-O17O C44H87N2O7 755,65 755,96 90-O17S C44H87N2O5S2 787,61 787,59 90-O17Se C44H87N2O5Se2 883,49 883,38 93-O17O C44H84N3O6 750,64 750,69 93-O17S C44H84N3O4S2 782,59 782,69 93-O17Se C44H84N3O4Se2 878,48 878,41 103-O17O C44H89N2O8 773,66 773,72 103-O17S C44H89N2O6S2 805,62 805,53 103-O17Se C44H89N2O6Se2 901,50 901,45 304-O17O C66H133N4O9 1126,01 1125,97 304-O17S C66H133N4O6S3 1173,94 1173,88 304-O17Se C66H133N4O6Se3 1317,77 1317,63 306-O17O C83H164N3O12 1395,23 1395,24
306-O17S C83H164N3O8S4 1459,14 1459,89 306-O17Se C83H164N3O8Se4 1650,92 1650,77 400-O17O C65H130N3O9 1096,98 1096,90 400-O17S C65H130N3O6S3 1144,91 1144,74 400-O17Se C65H130N3O6Se3 1288,74 1288,60
[0102] Uma classe de compostos semelhantes a lipídios de fórmula (I) foi sintetizada seguindo a via sintética mostrada abaixo: trietilamina PPTS = p-toluenossulfonato de piridínio
[0103] Novamente, as aminas de cabeça Ra-NH2 mostradas no esquema acima foram selecionadas dos Compostos 10, 17, 63, 75-78, 80-82, 87, 90, 93, 103, 304, 306, e 400.
[0104] Uma classe de compostos semelhantes a lipídios de fórmula (I) foi sintetizada seguindo a via sintética mostrada abaixo: trietilamina X = O ou NH
[0105] As aminas de cabeça Ra-NH2 mostradas no esquema acima foram selecionadas dos Compostos 10, 17, 63, 75-78, 80-82, 87, 90, 93, 103, 304, 306, e
400. Fabricação de nanocomplexos a partir de lipidoides e proteínas.
[0106] Os lipidoides foram fabricados em nanopartículas para distribuição de proteínas ou ácidos nucleicos. Resumidamente, os lipidoides foram misturados com tampão de acetato de sódio (25 mM, pH 5,2), sonicados por 30 min em banho ultrassônico e seguido por outros 30 min de vórtice vigoroso para formar nanopartículas semelhantes a lipídios ou LNPs. As LNPs assim obtidas foram armazenadas a 4 °C. Para a complexação de proteína/LNP, as LNPs foram misturadas com (-30)GFP-Cre ou Cas9:sgRNA em tampão PBS (25 mM, pH 7,4) seguindo os protocolos relatados em Wang e incubadas à temperatura ambiente por 30 minutos. Avaliação da ruptura da membrana da bicamada fosfolipídica
[0107] Os glóbulos vermelhos humanos (hRBCs) foram lavados com tampão PBS três vezes e colhidos após centrifugação a 1000 rpm durante 5 minutos. A solução mãe resultante (cerca de 10% v/v hRBCs) foi diluída 3 vezes em tampão PBS para obter a solução de ensaio. 90 µL de solução de ensaio foram misturados com 10 µL de soluções de LNPs (concentração final de lipidoides = 3,3 mg/L) e incubados a 37°C por 60 minutos. Em seguida, as amostras foram centrifugadas novamente a 1000 rpm por 10 min. 10 µL do sobrenadante foram posteriormente diluídos em 90 µL de tampão PBS e a absorvância a 405 nm (OD405) foi registrada usando um leitor de microplaca. O tampão PBS e Triton X-100 (1% v/v) foram usados como controles negativo e positivo, respectivamente. Distribuição intracelular de (-30)GFP-Cre/LNP
[0108] Para o estudo de absorção intracelular, células HeLa-DsRed foram semeadas em placa de 48 poços com uma densidade de 2 ×104 células/poço. Após 24 h de incubação a 37 °C, 5% de CO2, nanopartículas de (-30)GFP-Cre/LNP foram adicionadas às células e incubadas por 6h antes da análise de microscopia de fluorescência e citometria de fluxo (BD FACS Calibur, BD Science, CA) (emissão verde da GFP). A concentração de proteína (-30)GFP-Cre final é de 25 nM e a concentração de lipidoide é de 3,3 mg/L. Para o estudo funcional de recombinação gênica, células HeLa-DsRed foram tratadas nas mesmas condições e a emissão de fluorescência vermelha de DsRed foi analisada por citometria de fluxo 24 horas após a distribuição. Distribuição intracelular de Cas9:sgRNA/LNP
[0109] Para o estudo de nocaute do gene CRISPR/Cas9, células GFP-HEK foram semeadas em placas de 48 poços com uma densidade de 2 × 10 4 células/poço. Após 24 h de incubação, as nanopartículas de Cas9:sgRNA/LNP foram adicionadas às células e incubadas por 4 h, seguido de troca de meios. Após 48 h de incubação, a emissão verde da GFP foi analisada por citometria de fluxo. A concentração final de Cas9:sgRNA RNP foi de 25 nM e a concentração de lipidoide foi de 3,3 mg/L. Ensaio de citotoxicidade in vitro.
[0110] A viabilidade celular foi medida pelo ensaio MTT padrão. As células HeLa-DsRed ou GFP-HEK foram semeadas em placas de 96 poços com uma densidade de 5 × 103 células/poço. Nanopartículas de (-30)GFP-Cre/LNP ou Cas9:sgRNA/LNP foram adicionadas após 24 h de incubação. A concentração final de proteína é 25 nM e LNP é 3,3 mg/L. Após incubação por 24 h ou 48 h, o reagente MTT (5 mg/mL, em 30 μL de tampão PBS) foi adicionado e as células foram incubadas por mais 4 h a 37 °C. Os meios de cultura de células foram então cuidadosamente removidos e 200μL de DMSO foram adicionados. A solução de DMSO foi então transferida para outra placa de 96 poços e a absorbância a 570 nm foi registrada por um leitor de microplacas. Todos os experimentos foram realizados em quadruplicado. Distribuição de proteína e in vivo para camundongo Ai14
[0111] LNPs formuladas (lipidoide/colesterol/DOPE/DSPE-PEG2k = 16/4/1/4, razão em peso) foram preparadas para carregamento de proteína e injeção em camundongos. Os camundongos Ai14 foram alojados em uma instalação com temperatura e umidade controlada com um ciclo claro/escuro de 12 horas. Dois camundongos em cada grupo foram injetados com formulações de (- 30)GFP-Cre/LNPs nos dias 0 e 5, com 100 μg de proteína para cada injeção. Órgãos incluindo coração, fígado, baço, pulmão e rim de todos os grupos foram coletados 20 dias após as injeções. Os tecidos foram fixados durante a noite em paraformaldeído a 4% (PFA) antes de serem seccionados em fatias de 10 μm. As fatias foram coletadas e coradas com DAPI para imagens de fluorescência. EXEMPLO 1: Preparação e Caracterização de Nanopartículas Semelhantes a Lipídios (LNPs)
[0112] Certas nanopartículas semelhantes a lipídios (LNPs) foram preparadas a partir de compostos semelhantes a lipídios de fórmula (I), isto é, lipidoides, seguindo os procedimentos descritos abaixo.
Síntese de O17O
[0113] O seguinte esquema foi seguido para sintetizar O17O.
[0114] Hidreto de sódio (0,72 g, 30 mmol) foi adicionado à solução de etilenoglicol (5,6 g, 90 mmol) em DMF anidro (30 mL) e agitado durante 10 min a 0 °C. 1-Bromotetradecano (6,0 g, 20 mmol) e KI (3,3 g, 20 mmol) foram então adicionados e a mistura de reação foi mantida a 95 °C por mais 4 h. Após arrefecimento até a temperatura ambiente, a mistura foi diluída com água fria, extraída com acetato de etila e seca sobre sulfato de sódio anidro. O Composto 1 (3,3 g, rendimento de cerca de 65%) foi obtido após purificação por cromatografia em coluna sobre sílica-gel usando n-hexano/acetato de etila como fase móvel. Em seguida, o composto 1 (3,3 g, 12,8 mmol) e trietilamina (TEA, 1,9 g, 19,2 mmol) foram dissolvidos em DCM anidro (80 mL). Cloreto de acriloil (1,4 g, 15,4 mmol) foi adicionado gota a gota a 0 °C, e a mistura de reação foi agitada durante a noite. Após purificação por cromatografia em coluna, O17O foi obtido como um óleo incolor (3,2 g, rendimento de cerca de 82%). A estrutura de O17Se foi confirmada pelo espectro de 1H NMR registrado em CDCl3. Síntese de O17S
[0115] O seguinte esquema foi seguido para sintetizar O17S .
[0116] A uma solução de 2-mercaptoetanol (1,1 g, 14 mmol) em acetonitrila (20 mL) foi adicionado 1-bromotetradecano (5,0 g, 18 mmol) e carbonato de potássio (3,6 g, 26 mmol). A solução de reação foi agitada durante a noite a 40 °C,
filtrada e concentrada. O Composto 2 (1,8 g, rendimento de cerca de 48%) foi obtido após purificação por cromatografia em coluna sobre sílica-gel usando n- hexano/acetato de etila como fase móvel. De uma maneira semelhante à da preparação de O17O, O17S foi sintetizado e purificado como líquido semelhante a óleo (3,5 g, rendimento de cerca de 75%). A estrutura de O17S foi confirmada pelo espectro de 1H NMR registrado em CDCl3. Síntese de O17Se
[0117] O seguinte esquema foi seguido para sintetizar O17Se.
[0118] Selenocianato de potássio (1,5 g, 10 mmol) foi adicionado em porções a uma solução de 2-bromoetanol (1,6 g, 13 mmol) em acetona (50 mL) em temperatura ambiente. A solução foi aquecida ao refluxo por 2 h. Após resfriamento à temperatura ambiente, o precipitado branco foi removido por filtração e a acetona foi removida por evaporação rotativa sob vácuo. O composto 3 foi então dissolvido em etanol (25 mL) e boro-hidreto de sódio (0,9 g, 24 mmol) foi adicionado lentamente a 0 °C. Após a solução de reação se tornar incolor, 1-bromotetradecano (4,1 g, 15 mmol) foi adicionado através de um funil de gotejamento. A reação foi interrompida adicionando água DI (10 mL) após 30 min. Em seguida, o etanol foi removido sob pressão reduzida, a mistura de reação foi diluída com solução aquosa saturada de cloreto de sódio (50 mL) e extraída com DCM (3 x 50 mL). O composto 5 (1,5 g, rendimento de cerca de 46%) foi obtido após purificação por cromatografia em coluna sobre sílica gel usando n-hexano/acetato de etila como eluição. De uma maneira semelhante à da preparação de O17O e O17S, O17Se foi obtido como um líquido semelhante a óleo (2,7 g, rendimento de cerca de 72%). A estrutura de O17Se foi confirmada pelo espectro de 1H NMR registrado em CDCl3. Síntese de lipidoides
[0119] Cabeças de amina comercialmente disponíveis, por exemplo, Compostos 10, 17 e 63, foram misturadas com caudas de acrilato O17O, O17S ou O17Se estequiometricamente. A mistura assim obtida foi agitada a 70 °C durante 48 h. Consulte a Figura 1. Os lipidoides foram purificados pelo sistema de cromatografia Teledyne Isco, caracterizado por 1H NMR e ESI-MS, e codificados como número de amina (X) e O17Y (R-O17Y, Y sendo O, S ou Se) conforme mostrado na tabela acima. Os espectros de 1H NMR e ESI-MS típicos de 76-O17O, 76-O-17S e 76-O17Se são mostrados nas Figuras 2a e 2b. Fabricação e caracterização de nanopartículas lipidoides.
[0120] As nanopartículas de lipidoides (LNPs) foram fabricadas em tampão de acetato de sódio (25 mM, pH 5,2) seguindo os procedimentos simples de ultrassonicação e vórtice descritos acima. Os tamanhos hidrodinâmicos e índice de polidispersão (PDI) de LNPs foram medidos por análise de espalhamento de laser dinâmico (DLS). Conforme mostrado na Figura 2c, a maioria dos éteres O, S e Se contendo LNPs tinha o diâmetro hidrodinâmico médio (<Dh>) entre 100-300 nm e o PDI na faixa de 0,1-0,3, adequado para aplicação de distribuição de proteína intracelular. Além disso, conforme também mostrado na Figura 2c, verificou-se que cerca de 53% dos LNPs com caudas O17O, cerca de 82% dos LNPs O17S e cerca de 65% dos LNPs O17Se tinham <Dh> inferior a 200 nm, resultou do efeito de átomos de calcogênio incorporados nos comportamentos de automontagem supramolecular em soluções aquosas. Os perfis de distribuição de tamanho típicos de LNPs 76-O17O (<Dh> sendo 170,1 nm, μ2/I 2 sendo 0,37), 76-O17S (<Dh> sendo 114,3 nm, μ2/ I2 sendo 0,24) e 76-O17Se (<Dh> sendo 129,4 nm, μ2/ I2 sendo 0,18) são mostrados na Figura 2d.
[0121] As morfologias das LNPs foram posteriormente estudadas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Conforme mostrado na Figura 3a, partículas esféricas foram observadas nas imagens de LNPs 76-O17O, 76-O17S e 76-O17Se, e os tamanhos médios dos números medidos (145 nm, 94 nm e 133 nm para 76-O17O, 76-O17S e 76-O17Se, respectivamente) são comparáveis com os diâmetros hidrodinâmicos conforme determinado por DLS. Ver Figura 2d. As morfologias de outras LNPs incluindo 80-O17O, 80-O17S e 80-O17Se, também foram examinadas por suas imagens TEM, que mostraram a presença de partículas esféricas. Posteriormente, a estabilidade das LNPs assim preparadas foi examinada por DLS e medições de fluorescência. Conforme mostrado na Figura 3b, as medições DLS dependentes do tempo revelaram que nenhuma agregação evidente das LNPs 76-O17O, 76-O17S e 76-O17Se ocorreu durante cinco dias de armazenamento sob temperatura ambiente, com a mudança de tamanho relativa sendo inferior a ±15%. O par de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), DiO e DiI, LNPs carregadas com 76-O17Se também mostraram variações desprezíveis da razão FRET (I575/(I575+I505)) em cinco dias de armazenamento, conforme mostrado na Figura 3c, que indicou a integridade da estrutura e estabilidade de armazenamento de longo prazo das LNPs. EXEMPLO 2: Avaliação de LNPs para Distribuição de Proteína
[0122] Foi realizado um estudo para avaliar o efeito das LNPs preparadas no EXEMPLO 1 na distribuição de proteínas como se segue. Triagem in vitro de LNPs para distribuição de proteína
[0123] Uma proteína recombinase Cre fundida a uma variante GFP sobrecarregada negativamente ((-30)GFP-Cre) foi usada como uma proteína de carga modelo. A proteína (-30)GFP-Cre foi capaz de se complexar com LNPs catiônicas por meio de atração eletrostática e outros tipos de interações supramoleculares. A captação celular de LNPs pode ser determinada por análise direta da intensidade fluorescente de GFP intracelular, conforme relatado em Wang. As células HeLa-DsRed foram usadas neste estudo, que expressaram DsRed fluorescente vermelha após recombinação mediada por Cre para facilitar o estudo funcional das proteínas distribuídas no estudo a seguir.
[0124] As LNPs carregadas com proteína (-30)GFP-Cre (GFP-Cre/LNPs) foram preparadas em primeiro lugar simplesmente misturando uma quantidade pré- calculada de solução aquosa de LNPs e proteína em condições ambientais. Para a distribuição intracelular, após incubação com nanopartículas de GFP-Cre/LNPs por 6 h, as células GFP-positivas foram observadas por meio de microscopia de fluorescência, colhidas e contadas por citometria de fluxo. Conforme mostrado na Figura 4a, comparando com o grupo de controle, ou seja, célula HeLa-DsRed não tratada, a emissão de fluorescência verde brilhante foi observada a partir de células tratadas com GFP-Cre/Lpf2k (Lpf2k sendo Lipofectamine 2000, um agente de transfecção comercial), GFP-Cre/76-O17O, GFP-Cre/76-O17S e GFP-Cre/76- O17Se. As células tratadas com a proteína nua, (-30)GFP-Cre, no entanto, mostraram emissão de fluorescência desprezível, em comparação com os sistemas de distribuição facilitada por lipídios, o que indicou que a proteína nua (-30)GFP- Cre não poderia entrar de forma eficiente nas células HeLa-DsRed. As eficiências de distribuição da proteína (-30)GFP-Cre intracelular foram ainda quantificadas por citometria de fluxo. Conforme mostrado na Figura 4b, tanto a proteína (-30)GFP- Cre nua quanto o grupo de controle mostraram porções baixas de células GFP- positivas, consistentes com os resultados da microscopia de fluorescência mostrada na Figura 4a.
[0125] Por outro lado, na presença de LNPs, as proporções de células GFP- positivas foram aumentadas, situando-se na faixa de 4-42%, com a maioria delas em torno de 12-18%. As eficiências de distribuição de LNPs foram comparáveis às de Lpf2k (cerca de 31% de células GFP-positivas). Por exemplo, as proporções de células GFP-positivas tratadas com LNPs 400-O17Se, 80-O17Se e 77-O17Se carregadas com proteína (-30)GFP-Cre foram de 42%, 39% e 37%, respectivamente. Investigação da relação estrutura-atividade.
[0126] A biblioteca de lipidoides contendo éter 51 O, S e Se assim preparada foi utilizada para estudar a relação estrutura-atividade entre LNPs e eficácias de distribuição de proteína intracelular.
[0127] Mais especificamente, os lipidoides com mais de 20% de células GFP-positivas tratadas com proteína (-30)GFP-Cre/nanopartículas LNP foram definidos como LNPs eficazes (pontos de dados vermelhos na Figura 4b), em comparação com os LNPs em massa (pontos de dados pretos). A biblioteca de lipidoides foi então categorizada em três grupos de acordo com suas estruturas de cauda hidrofóbica (O17O, O17S e O17Se); cada cauda representava 33,3% da biblioteca. No grupo de LNPs eficazes, 21,4%, 28,6% e 50% dos lipidoides estavam com caudas O17O, O17S e O17Se, respectivamente. Portanto, as taxas de acerto relativas de LNPs com caudas O17O, O17S e O17Se foram -11,9%, -4,7% e 16,7%, respectivamente, em relação à biblioteca inicial (Figura 4c). Em outras palavras, os lipidoides com caudas O17O e O17S foram significativamente sub-representados entre as LNPs com eficácia de distribuição superior a 20%, enquanto os lipidoides com cauda O17Se foram superrepresentados, sugerindo que caudas O17Se foram associadas a LNPs eficazes.
[0128] Foi determinado que as eficiências de distribuição de LNPs estavam relacionadas às estruturas químicas das cabeças de amina, caudas hidrofóbicas, números de substituição e valores aparentes de pKa. Neste estudo, para elucidar ainda mais a relação estrutura-atividade dos éteres O, S, Se contendo lipidoides, os efeitos do valor aparente de pKa e a capacidade de ruptura da membrana da bicamada de fosfolipídios das LNPs foram ainda analisados. Os valores aparentes de pKa foram medidos seguindo os procedimentos relatados anteriormente usando ácido 2-(p-toluidinil)naftaleno-6-sulfônico (TNS) como sonda fluorescente.
[0129] A capacidade de ruptura da membrana da bicamada de fosfolipídios das LNPs foi avaliada usando glóbulos vermelhos humanos (hRBCs) como modelo e hemoglobina como agente repórter cromóforo. A absorbância a 405 nm (OD405) foi registrada para avaliar a quantidade de hemoglobina liberada, usando tampão PBS e Triton X-100 (1% v/v) como controles negativos e positivos, respectivamente, em que valores maiores de OD405 indicam capacidades de ruptura da membrana mais fortes. Conforme mostrado nas Figuras 5a e 5b, os valores aparentes de pKa e OD405 de LNPs foram representados graficamente contra as porcentagens de células GFP-positivas para cada LNP, e verificou-se que a maioria das nanopartículas eficazes (com células GFP-positivas maiores que 20%) estavam localizadas nas regiões de pKa > 5,1 e OD405 > 0,2 (delimitadas com linhas tracejadas azuis nas Figuras 5a e 5b). Após um exame mais aprofundado, verificou- se que essas duas propriedades têm efeitos marcantes sobre as eficiências de transfecção da proteína(-30)GFP-Cre em células HeLa-DsRed. Conforme mostrado na Figura 5c, quando as LNPs possuem ambas as propriedades (ou seja, pKa > 5,1 e OD405 > 0,2), a taxa de acerto relativa para ser capaz de mediar a alta eficiência de transfecção foi de 77%. Quando uma ou duas das propriedades foram removidas das LNPs, a probabilidade de alcançar alta eficiência de transfecção da proteína (-30)GFP-Cre em células HeLa-DsRed caiu significativamente para 8- 33%.
[0130] Além disso, quanto à relação estrutura-atividade, verificou-se que,
para LNPs com caudas O17O, O17S e O17Se, as taxas de acerto relativas dos critérios de eficácia mencionados acima foram -1,9%/-14,6%, 0,99%/4,2%, e 0,99%/10,5%, respectivamente (pKa > 5,1/OD405 > 0,2). Ver Figura 5d. Ficou claro que ambas as propriedades estavam sub-representadas no grupo de LNPs com caudas O17O, consistente com os resultados mostrados na Figura 4c, em que a cauda O17O estava sub-representada no lipidoide eficaz. Enquanto ambas as propriedades de valores elevados de pKa e OD405 foram superrepresentadas no grupo de LNPs com caudas O17S e O17Se.
[0131] Além disso, de acordo com os resultados mostrados nas Figuras 5c e 5d, a capacidade de ruptura da membrana dessas LNPs pareceu ser o fator mais influente na determinação da eficiência de distribuição da proteína (-30)GFP-Cre in vitro em células HeLa-DsRed, em comparação com os valores aparentes de pKa. EXEMPLO 3: Distribuição de Proteína (-30)GFP-Cre para Recombinação de Genes e Citotoxicidade
[0132] Foi realizado um estudo para avaliar o efeito das LNPs preparadas no EXEMPLO 1 na distribuição de proteína (-30)GFP-Cre para recombinação de genes e citotoxicidade como se segue.
[0133] As 12 primeiras LNPs identificadas por meio de experimentos de triagem de distribuição intracelular foram posteriormente testadas para recombinação de genes usando células modelo HeLa-DsRed. A expressão de DsRed da recombinação de genes mediada pela proteína Cre foi analisada após 24 h de co-incubação com a proteína (-30)GFP-Cre livre e LNPs carregados com proteína. Conforme mostrado na Figura 6a, a proteína (-30)GFP-Cre nua não induziu a expressão de DsRed, devido à sua baixa capacidade de internalização, consistente com a observação de microscopia de fluorescência e análise de citometria de fluxo demonstrada na Figura 4a. A maioria das LNPs de teste, por outro lado, distribuiu com eficiência a proteína (-30)GFP-Cre e induziu a recombinação de genes, com 14-46% das células positivas para DsRed.
[0134] Mais especificamente, certas LNPs exibiram altas eficiências de transfecção de proteínas, nomeadamente, 76-O17S (40,8%), 76-O17Se (36,1%), 77-O17S (38,6%), 77-O17Se (31,0%), 78-O17Se (37,8%) e 80-O17S (45,6%). Essas LNPs exibiram eficiências de transfecção maiores ou semelhantes quando comparadas com Lpf2k (33,5%).
[0135] Através do ensaio de MTT contra células HeLa-DsRed, LNPs 76- O17S, 76-O17Se, 77-O17S e 77-O17Se mostraram baixa citotoxicidade, pois mais de 80% das células estavam vivas, em comparação com Lpf2k, 400-O17Se 78- O17Se, 80-O17S e 80-O17Se, dos quais a viabilidade celular era de 67-77%. Ver figura 6b.
[0136] Estes resultados indicam que 76-O17S, 76-O17Se, 77-O17S e 77- O17Se exibiram alta distribuição de proteína intracelular e eficácia de recombinação de genoma mediada por Cre, com menor citotoxicidade do que Lpf2k. EXEMPLO 4: Distribuição de GFP-Cre in vivo para recombinação de genes em Camundongos Ai14
[0137] Foi realizado um estudo para avaliar o efeito das LNPs preparadas no EXEMPLO 1 na distribuição de GFP-Cre para recombinação de genes em camundongos Ai14 como se segue.
[0138] A distribuição de proteínas de edição de genoma in vivo tem potencial terapêutico para o tratamento de uma ampla gama de doenças genéticas. Com base nos resultados da triagem in vitro, este estudo foi conduzido para avaliar o efeito dos éteres O, S e Se acima contendo LNPs na distribuição de proteína (- 30)GFP-Cre in vivo para recombinação de genes mediada por Cre.
[0139] O estudo usou um modelo de camundongo Ai14, que tinha um cassete STOP flanqueado por loxP geneticamente integrado que impede a transcrição da proteína fluorescente vermelha, tdTomato. Após a recombinação de genes mediada por Cre, o cassete STOP foi removido, resultando na expressão de tdTomato. Considerando os diferentes desempenhos de LNPs carregadas de carga in vitro e in vivo, três LNPs com as mesmas cabeças de amina e caudas diferentes (76-O17O, 76-O17S e 76-O17Se) foram testadas neste estudo. LNPs formuladas (lipidoide/colesterol/DOPE/DSPE-PEG2k = 16/4/1/4, razão em peso) foram preparadas. Os camundongos foram injetados (injeção intravenosa) com (-30)GFP- Cre carregado com as LNPs formuladas (GFP-Cre/76-O17O, GFP-Cre/76-O17S e GFP-Cre/76-O17Se) no dia 0 e no dia 5 (100 μg de proteína para cada injeção). Os órgãos incluindo coração, fígado, baço, pulmão e rim foram coletados no dia 20 para medir e analisar a expressão de tdTomato. Conforme mostrado na Figura 7, sob as mesmas condições de preparação e imagem, fortes sinais de tdTomato foram observados nas seções de pulmão de camundongos injetados com GFP- Cre/76-O17S e GFP-Cre/76-O17Se. Imagens de fluorescência com menor ampliação e maior campo de visão foram obtidas. Foi inesperadamente observado que a injeção de GFP/76-O17S e GFP/76-O17Se induziu a recombinação do genoma mediada por Cre de forma eficiente no pulmão, em comparação com o grupo de controle e o grupo tratado com GFP/76-O17O. Portanto, uma composição contendo LNPs desta invenção é útil para o tratamento de doenças pulmonares.
[0140] Notavelmente, tanto os resultados da triagem in vitro quanto os testes in vivo mostraram que os lipidoides com as mesmas cabeças de amina e caudas hidrofóbicas diferentes possuíam propriedades físico-químicas, eficácias de distribuição intracelular e perfis de recombinação do genoma muito diferentes. EXEMPLO 5: Distribuição de RNP Cas9:sgRNA para Modificação de Genoma
[0141] Foi realizado um estudo para avaliar o efeito das LNPs preparadas no EXEMPLO 1 na distribuição de RNP Cas9:sgRNA para modificação de genoma como se segue.
[0142] O RNP Cas9:sgRNA direcionado ao gene repórter GFP genômico e células GFP-HEK foram usados neste estudo. As morfologias de LNPs carregadas com Cas9:sgRNA foram examinadas por TEM, e uma imagem típica de LNP 76- O17Se carregado com Cas9:sgRNA (Cas9:sgRNA/76-O17Se) foi obtida. Para a distribuição intracelular, as células GFP-HEK foram colhidas após o tratamento com nanocomplexos de Cas9:sgRNA/LNPs por 48 h. A eficácia da inativação do gene GFP foi ainda avaliada por citometria de fluxo. Conforme mostrado na Figura 8a, RNP Cas9:sgRNA nu não induziu inativação do gene GFP, enquanto a eficiência de inativação de Cas9:sgRNA/Lpf2k foi relativamente alta, com 63% de células GFP-negativas. Ao usar LNPs contendo éteres O, S e Se como veículos de distribuição, as células GFP-HEK mostraram uma perda de 14% -58% da expressão de GFP. Em particular, 50,2%, 57,7%, 54,7% e 57,4% de inativação de GFP foram observados quando as células foram tratadas com Cas9:sgRNA carregado com LNPs 76-O17Se, 80-O17Se, 81-O17Se e 400-O17Se. Esses lipidoides poderiam distribuir com eficiência as proteínas de edição de genoma em diferentes linhagens celulares de mamíferos in vitro, com base nos resultados da recombinação de genes da proteína Cre em células HeLa-DsRed e inativação do gene GFP de distribuição de RNP Cas9:sgRNA em células GFP-HEK.
[0143] A citotoxicidade in vitro de Cas9:sgRNA/LNPs contra células GFP- HEK também foi avaliada pelo ensaio MTT. Conforme mostrado na Figura 8b, as viabilidades celulares foram determinadas como sendo 67%-119% após a incubação com Cas9:sgRNA/LNPs a 37 °C por 48 h, indicando que certas LNPs não eram citotóxicas para células GFP-HEK, enquanto algumas mostram a viabilidade celular igual à de Lpf2k (viabilidade celular de cerca de 66%) nas mesmas condições experimentais. Também foi observado que duas LNPs com altas eficiências de distribuição de Cas9:sgRNA, ou seja, 80-O17Se e 400-O17Se, exibiram viabilidade celular semelhante à de Lpf2k, ou seja, 68,2% e 66,7% de viabilidade celular para 80-O17Se e 400-O17Se, respectivamente. Inesperadamente, as LNPs 76-O17Se e 81-O17Se mostraram alta eficiência de transfecção de Cas9:sgRNA (50,2% e 54,7%) e baixa citotoxicidade (76,3% e 97,7% de viabilidade celular após 48 h de incubação).
[0144] Estes resultados indicam que as LNPs formadas a partir de compostos semelhantes a lipídios da fórmula (I) exibiram alta eficiência de transfecção de proteínas e baixa citotoxicidade. Materiais e Métodos Preparação de nanopartículas de lipidoides em branco e carregadas com carga
[0145] Os lipidoides foram fabricados em nanopartículas para todas as aplicações de distribuição. Resumidamente, os lipidoides foram misturados com tampão de acetato de sódio (25 mM, pH 5,2), sonicados por 30 min em um banho ultrassônico, seguido por mais 30 min de vigoroso vórtice. As LNPs em branco conforme preparadas foram armazenadas a 4 °C. Para Cy5-RNA/LNP, mRNA/LNP e complexação de proteína/LNP, as nanopartículas de lipidoides em branco foram misturadas com moléculas de RNA ou proteína (-30)GFP-Cre em tampão PBS (pH 7,4) seguindo nossos procedimentos relatados anteriormente e incubadas à temperatura ambiente por mais 30 minutos antes de usar. Os procedimentos típicos para o encapsulamento de vermelho do Nilo são os seguintes: 5 μL de solução estoque de vermelho do Nilo em acetona foram adicionados a um frasco vazio, que foi colocado em um forno a vácuo para remover completamente o solvente orgânico. Em seguida, uma quantidade predeterminada de solução estoque de LNP em branco (1,0 mg/mL) foi adicionada ao frasco. A mistura foi sonicada por 40 min em um banho ultrassônico e agitada durante a noite à temperatura ambiente. A concentração final de vermelho do Nilo foi ajustada para 6,6 × 10-7 mol L-1 e 6 × 10-7 mol L-1 para estudo de liberação desencadeada por tiol e incubação de células, respectivamente, por diluição com PBS conforme necessário. Os procedimentos típicos para o encapsulamento do par CPT e DiO/DiI FRET são os seguintes: 100 μL de solução estoque DiO/DiI em MeOH foi carregado em um frasco vazio e colocado em um forno a vácuo para remover o solvente orgânico. Os lipidoides (2,0 mg) em 200 μL de metanol foram então adicionados ao frasco e agitados para produzir uma solução homogênea. Em seguida, 600 μL de água DI foram adicionados gota a gota em 10 min com agitação contínua. A mistura resultante foi dialisada contra água DI por 24 h (Thermo Scientific Slide-A-Lyzer Dilysis Cassette, MWCO = 3500 Da), e água potável foi substituída a cada 4 h. Os procedimentos típicos para encapsulamento de calceína e cloridrato de doxonorrubicina são os seguintes: quantidades pré-calculadas de calceína ou soluções estoque Dox em água DI foram diluídas em 800 μL com tampão de acetato de sódio e usadas como solventes seletivos para acionar o processo de automontagem de lipidoides em metanol (5 mg/mL), respectivamente. A calceína ou Dox descarregada foi removida por diálise contra água DI (Thermo Scientific Slide-A-Lyzer Dilysis Cassette, MWCO = 3500 Da). Distribuição intracelular de nanopartículas de lipidoides carregadas com carga
[0146] Para o estudo de absorção intracelular, células HeLa ou HeLa-DsRed foram semeadas em placas de 48 poços com uma densidade de semeadura inicial de 2 × 104 células/poço. Após 24 h de incubação a 37 °C, 5% de CO2, NR ou nanopartículas carregadas com (-30)GFP-Cre foram adicionadas às células e incubadas por um certo tempo (1-8 h) antes da observação de microscopia de fluorescência (BZ-X Analyzer) e análise de citometria de fluxo (BD FACS Calibur,
BD Science, CA) (emissão de fluorescência vermelha de NR e emissão de fluorescência verde de GFP). A concentração final de NR é 6 × 10-7 mol L-1. A concentração final de concentração de proteína (-30)GFP-Cre é 25-100 × 10-9 mol L-1. Para a distribuição de drogas anticâncer moleculares pequenas, as células HeLa foram semeadas em placas de 96 poços com uma densidade de semeadura inicial de 5 × 103 células/poço. Após 24 h de incubação a 37 °C, 5% de CO2, as nanopartículas carregadas com Dox, CPT ou Oxa foram adicionadas às células e incubadas por 8 h, seguido de mudança de meio. As células foram então incubadas por mais 40 h antes da análise de viabilidade celular. Para distribuição de mRNA, as células HeLa, B16F10, HEK 293, NIH 3T3 ou Jurkat foram semeadas em placas de 48 poços com uma densidade de semeadura inicial de 2 × 104 células/poço. Após 24 h de incubação a 37 °C, 5% de CO2, as nanopartículas carregadas com mRNA foram adicionadas às células e incubadas por mais 24 h antes da microscopia de fluorescência e análise de citometria de fluxo. Para a distribuição de proteína, as células HeLa-DsRed foram semeadas em placas de 48 poços com uma densidade de semeadura inicial de 2 × 104 células/poço. Após 24 h de incubação a 37 °C, 5% de CO2, as nanopartículas carregadas com (-30)GFP-Cre foram adicionadas às células e incubadas por 8 h, seguido de mudança completa de meio. As células foram então incubadas por mais 16 h (24 h de incubação no total) antes da microscopia de fluorescência e análise de citometria de fluxo. Ensaio de toxicidade in vitro e in vivo
[0147] As viabilidades celulares de HeLa e HeLa-DsRed foram medidas usando o ensaio MTT padrão. Em uma placa de 96 poços, após incubar células HeLa ou HeLa-DsRed com nanopartículas em branco ou carregadas com carga, o reagente MTT (5 mg/mL, em 30 μL de tampão PBS) foi adicionado e as células foram incubadas por mais 4 h a 37 °C. O meio de cultura de células foi então cuidadosamente removido e 200 μL de DMSO foram adicionados a cada poço. A solução de DMSO foi então transferida para uma placa de 96 poços limpa e a absorbância a 570 nm foi registrada por um leitor de microplacas. Todos os experimentos foram realizados em quadruplicado.
[0148] Para estudos de toxicidade in vivo, os pesos corporais de camundongos Balb/c não tratados e injetados com nanopartículas (alojados em uma instalação de temperatura e umidade controlada com um ciclo claro/escuro de 12 h) foram medidos no dia 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 e 14. As funções biológicas dos rins e do fígado foram examinadas pelos testes bioquímicos séricos e as concentrações de creatinina, ureia, aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) foram medidas usando kits de detecção correspondentes (MilliporeSigma) seguindo os protocolos dos fabricantes. Distribuição de proteína e mRNA in vivo para camundongo Ai14
[0149] Semelhante ao estudo de transfecção in vitro, as nanopartículas de lipidoides foram preparadas para mRNA ou carregamento de proteína e distribuição in vivo. Os camundongos Ai14 foram alojados em uma instalação com temperatura e umidade controlada com um ciclo claro/escuro de 12 horas. Três camundongos em cada grupo foram injetados (por via intravenosa ou intramuscular) com formulações de LNPs carregadas com mRNA Cre ou carregadas com proteína (- 30)GFP-Cre. Órgãos incluindo coração, fígado, baço, pulmão e rim de todos os grupos foram coletados no dia 10 (injeção intramuscular) ou 14 (injeção intravenosa) após a injeção. Os tecidos foram fixados durante a noite em paraformaldeído a 4% (PFA) e desidratados em 30%sacarose antes de serem congelados em OCT e selecionados em 10-15 fatias. As fatias foram coletadas e coradas com DAPI para geração de imagens de fluorescência (microscopia de fluorescência com BZ-X Analyzer). EXEMPLO 6: Síntese de Lipidoide de Colesteril, Fabricação e Caracterização de Nanopartículas.
Síntese de Py-SS-Chol
[0150] O cloroformato de colesteril (10,71 g, 23,85 mmol) foi dissolvido em DCM anidro (50 mL) e adicionado à solução de DCM de Py-SS-NH2 (4,47 g, 23,99 mmol) e TEA (3,71 g, 36,69 mmol) gota a gota a 0 °C. A mistura de reação foi agitada durante a noite e Py-SS-Chol foi obtido como um sólido viscoso ligeiramente amarelo (4,89 g, rendimento ~ 34,26%) após purificação por cromatografia em coluna de sílica gel usando acetato de etila, diclorometano e n- hexano como a fase móvel. Síntese de OH-SS-Chol
[0151] Py-SS-Chol (3,55 g, 5,93 mmol) e ácido acético (600 μL) foram dissolvidos em DCM (100 mL). 2-Mecaptoetanol (0,51 g, 6,52 mmol) foi então adicionado gota a gota, e a mistura de reação foi mantida a 35 °C por mais 24 h com agitação contínua. OH-SS-Chol foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel usando acetato de etila e n-hexano como fase móvel e um sólido incolor foi obtido (2,74 g, rendimento ~ 81,63%). Síntese de OCholB
[0152] OH-SS-Chol (2,41 g, 4,26 mmol) e TEA (0,65 g, 6,39 mmol) foram dissolvidos em DCM anidro (100 mL). Cloreto de acriloil (0,46 g, 5,11 mmol) foi adicionado gota a gota a 0 °C. A mistura de reação foi agitada durante a noite e OCholB foi obtido como um sólido incolor (2,52 g, rendimento ~ 95,68%) após purificação por cromatografia em coluna de sílica gel usando acetato de etila, diclorometano e n-hexano como a fase móvel. Síntese de lipidoides
[0153] As caudas de acrilatos contendo colesterol mostradas acima reagiram com as aminas de cabeça Ra-NH2 (ou seja, Compostos 75-78, 80, 81, 87, 90, e 304.) para se obter os seguintes compostos semelhantes a lipídios:
Peso Molecular: 1357,13
Peso Molecular: 1355,12
Peso Molecular: 1369,15
Peso Molecular: 1329,08
Peso Molecular: 1343,11
Peso Molecular: 1371,16
Peso Molecular: 1403,16
Peso Molecular: 1371,12
Peso Molecular: 2049,21 Preparação de nanopartículas de lipidoides em branco e carregadas com carga
[0154] Os lipidoides foram fabricados em nanopartículas para todas as aplicações de distribuição. Conforme mostrado na Figura 10B, a maioria das nanopartículas apresentou diâmetros médios na faixa de 70-300 nm e PDI 0,1-0,3. Os tamanhos das LNPs automontadas a partir de lipidoides com caudas OCholB são semelhantes às nossas bibliotecas de LNP relatadas anteriormente com cadeias alquil. Os valores relativamente baixos de PDI indicaram a uniformidade dessas nanopartículas.
[0155] As morfologias das LNPs totalmente substituídas com OCholB foram então examinadas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Conforme mostrado na Figura 10C, estruturas semelhantes a vesículas esféricas, que são esferas ocas com paredes de bicamada hidrofóbica ensanduichadas por coronas hidrofílicas internas e externas, foram observadas de 75-OCholB, 76-OCholB, 77- OCholB, 78-OCholB, 80-OCholB, 81-OCholB e 304-OCholB. Em contraste, as estruturas vesiculares não foram bem formadas para 87-OCholB e 90-OCholB em comparação com suas contrapartes, e agregados amorfos foram observados em seu lugar. A geração de imagens TEM revelou que as partículas maiores eram 81- OCholB (216,9 nm) e 304-OCholB (394,0 nm), o que é consistente com os resultados da medição DLS conforme mostrado na Figura 10B.
[0156] A citotoxicidade de LNPs totalmente substituídas com OCholB (75- OCholB, 76-OCholB e 77-OCholB) e LNPs O16B (75-O16B, 76-O16B e 77-O16B) foram testadas lado a lado em diferentes condições, ou seja, baixa dosagem/tempo de exposição curto e dosagem mais alta/tempo de exposição longo, contra a linhagem celular HeLa usando o ensaio MTT padrão. Conforme mostrado na Figura 10E, nas condições de baixa dosagem/tempo de exposição curto (ou seja, [lipidoide] = 1,0 ou 3,3 μg mL-1, tempo de exposição = 8 h), todas as LNPs OCholB e O16B mostraram citotoxicidade desprezível, com viabilidade celular >83% relatada para todos os lipidoides (por exemplo, quando [lipidoide] = 3,3 μg mL-1, as viabilidades das células tratadas com 75-OCholB e 75-O16B são 86,5% e 87,7%, respectivamente). Quando a dosagem e a duração da exposição foram aumentadas (ou seja, [lipidoide] = 47 ou 91 μg mL -1, tempo de exposição = 24 h), as células tratadas com LNPs totalmente substituídas OCholB mostraram viabilidades significativamente maiores em comparação com aquelas tratadas com LNPs O16B (quando [lipidoide] = 47 μg mL-1, as viabilidades das células são 75- OCholB/75-O16B = 57,4%/41,9%, 76-OCholB/76-O16B = 65,5%/32,8%, 77- OCholB/77-O16B = 79,6%/29,0%; quando [lipidoide] = 91 μg mL -1, as viabilidades das células são 75-OCholB/75-O16B = 55,1%/29,5%, 76-OCholB/76-O16B = 60,2%/24,3%, 77-OCholB/77-O16B = 64,1%/21,9%). Estes resultados mostram que os lipidoides de colesteril têm citotoxicidade mais baixa em comparação com os lipidoides de cadeia alquílica linear. Além disso, comparamos a biocompatibilidade de nossos LNPs OCholB recentemente desenvolvidos com a do agente de transfecção catiônico amplamente utilizado e comercialmente disponível, lipofectamina 2000 (Lpf2k). Lpf2k é mostrado como altamente eficiente para distribuição de proteínas e ácidos nucleicos; no entanto, sua citotoxicidade costuma ser uma grande preocupação, especialmente quando as células-alvo são expostas a uma dosagem relativamente alta e longa duração de incubação. Conforme mostrado na Figura 10E, quando as células HeLa foram tratadas com 47 e 91 μg mL-1 de Lpf2k por 24 h, suas viabilidades foram determinadas em 8,9% e 6,8%, que são muito mais baixas do que as células tratadas com LNPs OCholB sob as mesmas condições. Acima de tudo, os testes de citotoxicidade in vitro demonstraram a excelente biocompatibilidade das LNPs contendo colesteril (OCholB) recentemente desenvolvidas. EXEMPLO 7: Resposta a Tiol, Carregamento e Liberação Desencadeada de Moléculas Hóspedes.
[0157] A degradação e dissociação desencadeada por tiol das LNPs OCholB foram estudadas por medições DLS dependentes do tempo e observação TEM. Normalmente, conforme mostrado na Figura 11A, na presença de 10 mM de 1,4- ditiotreitol (DTT), que tem sido amplamente utilizado em estudos anteriores para simular condições redutivas intracelulares,25 observamos que o aumento dos tamanhos relativos de 75-OCholB, 76-OCholB e 77-OCholB aumentou gradualmente ao longo da duração da incubação, como 566,4%, 498,5% e 1591,4%, respectivamente, nas primeiras 2 h. O tamanho das nanopartículas foi então tipicamente mantido ao longo das 4 h seguintes, com exceção de 75-OCholB, que mostrou 1315,7% de aumento no tamanho às 6 h. As morfologias típicas de LNPs tratadas com DTT foram então examinadas por TEM e as imagens são mostradas na Figura 11B. A ausência de estruturas vesiculares bem formadas conforme mostrado na Figura 10C e grandes agregados em escalas de micrômetro (que são consistentes com os resultados obtidos a partir de medições DLS; Figura 11A) com estruturas amorfas foram observadas para LNPs 75-OCholB, 76-OCholB e 77-OCholB. A ruptura da estrutura da vesícula é considerada como resultado das reações de troca de tiol e de clivagem da ligação dissulfeto de lipidoides OCholB. Em seguida, investigamos se as moléculas contendo tiol (por exemplo, albumina, cisteína, homocisteína, cisteinilglicina, etc.) no soro podem induzir a desintegração estrutural dessas LNPs contendo ligações dissulfeto. As estabilidades de LNPs na presença de 20 μM de L-cisteína (Cys), que imitam os tiois livres nas moléculas pequenas e macromoléculas apresentadas no soro, foram examinadas. Mostrado na Figura 11A, observamos alterações <25% no diâmetro hidrodinâmico em qualquer um dos intervalos de 1 h ao longo do período deste estudo para todas as três LNPs testadas e, de fato, foram observadas diminuições de 12,2%, 14,6% e
7,2% no tamanho para 75-OCholB, 76-OCholB e 77-OCholB após 6 h de incubação, respectivamente. As alterações de tamanho das LNPs tratadas com cisteína mostraram diferença insignificante quando comparadas com os grupos de controle não tratados (Figura 11A), indicando a boa estabilidade das LNPs OCholB nas condições que simulam a concentração de tiois livres no soro sanguíneo. Além disso, as variações de tamanho relativo das LNPs OCholB após 24 h de incubação na presença de DTT de 10 mM ou Cys de 20 μM foram determinadas e os resultados são mostrados na Figura 11C. Com 10 mM de DTT e após 24 h de tratamento, as LNPs 75-OCholB, 78-OCholB e 304-OCholB apresentaram as maiores alterações de tamanho, com aumento de 2872,4%, 4642,8% e 3849,6% nos diâmetros hidrodinâmicos médios; um aumento de tamanho moderado de 766,9% -1266,4% foi registrado para LNPs 76-OCholB, 77-OCholB, 80-OCholB e 81-OCholB; enquanto 87-OCholB (210,3%) e 90-OCholB (179,5%), que não foram capazes de formar vesículas consistentes com base nas imagens TEM (Figura 10C), mostraram um aumento mínimo de tamanho ao longo de 24 horas. Por outro lado, todas as LNPs incubadas com 20 µM de cisteína por 24 h mostraram alterações de tamanho mínimas, semelhantes aos grupos de controle não tratados (Figura 11C). Esses resultados demonstraram a cinética de degradação dessas LNPs OCholB em relação aos ambientes redutíveis intracelulares e extracelulares. Embora os graus de mudanças de tamanho variem entre os lipidoides com diferentes grupos de cabeça de amina, todos os lipidoides foram mais responsivos ao DTT (condições intracelulares de modelagem) do que à cisteína (condições de modelagem no soro sanguíneo). Além disso, as LNPs OCholB mostraram boa estabilidade relativa na presença de baixas concentrações de tiois (imitado pelo tratamento com cisteína 20 μM), o que indica que essas novas LNPs podem ser usadas para a distribuição sistêmica de drogas. EXEMPLO 8: Encapsulamento de droga usando LNPs OCholB:
[0158] A seguir, foram estudadas as capacidades das LNPs OCholB como nanocarreadores para encapsular moléculas de carga com várias propriedades físicas. Neste contexto, cumarina (Excitação (Ex.) 350 nm, Emissão (Em.) 448 nm) e vermelho do Nilo (NR; Ex. 520 nm, Em. 613 nm) como pequenas cargas hidrofóbicas moleculares representativas, calceína (Ex. 475 nm, Em. 529 nm) como uma carga hidrofílica molecular pequena representativa e proteína fluorescente recombinante (-30)GFP-Cre (Ex. 420 nm, Em. 510 nm) e RNA marcado com Cy5 de fita dupla (Cy5-RNA, 13kDa; Ex. 625 nm, Em. 672 nm) como cargas hidrofílicas macromoleculares representativas foram usadas como cargas modelo. 75-OCholB foi escolhido como o carreador de lipídios modelo no estudo. A Figura 11D mostrou que todas as cargas podem ser carregadas com sucesso nas LNPs 75-OCholB. As moléculas de carga foram carregadas em LNPs por meio de interações hidrofóbicas (cumarina e NR), interações eletrostáticas (calceína, (-30)GFP-Cre e Cy5-RNA) ou encapsulamento físico. Além disso, conforme mostrado na Figura 3D, o encapsulamento simultâneo de moléculas de carga também pode ser alcançado usando o par de transferência de energia de ressonância de fluorescência hidrofóbica (FRET), DiO e DiI (Ex. 425 nm, Em. 504 nm (DiO) e 578 nm (DiI)), como um modelo, que demonstra a possibilidade de usar essas LNPs OCholB para carregar vários tipos de moléculas bioativas simultaneamente para terapias de combinação.30 Tirando vantagens das interações supramoleculares (por exemplo, interação eletrostática e ligação de hidrogênio) e/ou encapsulando cargas durante o processo de automontagem, tanto moléculas hidrofílicas pequenas quanto macromoleculares (por exemplo, plataformas de edição de genoma e inibidores de sinal celular) podem ser prontamente carregadas e distribuídas pelas LNPs recentemente desenvolvidas.
[0159] O comportamento de liberação desencadeada por redução de cargas encapsuladas foi então estudado usando LNPs 75-OCholB carregadas com vermelho do Nilo (NR/75-OCholB), aproveitando a propriedade fotofísica sensível à polaridade microambiental do vermelho do Nilo. Conforme mostrado na Figura 11E, na presença de 1 mM, 5 mM e 10 mM de DTT, 33,5%, 61,7% e 67,4% do vermelho do nilo encapsulado foram liberados do vermelho do nilo/LNPs 75- OCholB dentro de 2 h e 44,0%, 84,2% e 86,4% foram liberados em 6 h de incubação, respectivamente. Enquanto isso, 20 μM de Cisteína tratados com NR/75-OCholB liberou 4,2% do vermelho do Nilo em 2 h e 6,9% em 6 h, o que poderia ser atribuído às alterações estruturais e morfológicas mínimas discutidas anteriormente das LNPs sob o estímulo de baixa concentração de tiois (Figura 11A e 11C). A liberação desencadeada de corante fluorescente hidrofílico, calceína, que possui uma característica de auto-supressão em altas concentrações, foi estudada adicionalmente.31 As intensidades de fluorescência de calceína tratada com DTT (1 mM, 5 mM e 10 mM)/LNPs 75-OCholB aumentaram 4,7-6,4 vezes após 12 h de incubação em comparação com LNPs de controle não tratadas e 20 μM de grupos tratados com cisteína (Figura 11F). Além disso, a afinidade de ligação de LNPs OCholB com carga macromolecular carregada negativamente, Cy5-RNA, foi examinada. Verificou-se que a uma razão de peso de 10/1 (lipidoide/Cy5-RNA), 82,9% das moléculas de RNA poderiam ser complexadas de forma eficiente com LNPs 75-OCholB, enquanto a eficácia de ligação reduzia drasticamente para 15,5% quando partículas tratadas com DTT (10 mM, 24 h) foram usadas (como 84,5% de Cy5-RNA não ligado foi determinado; Figura 11G). Além disso, semelhante ao estudo de responsividade, é razoável que os perfis de liberação da carga possam depender tanto das espécies quanto das concentrações dos regentes contendo tiois. Acima de tudo, LNPs OCholB carregadas com cargas são relativamente estáveis na presença de baixa concentração de tiois e os comportamentos de liberação desencadeada de moléculas de carga com diferentes propriedades físico- químicas (hidrofóbica/hidrofílica, baixo/alto peso molecular, etc.) podem ser esperados. EXEMPLO 9: Estudos de Internalização.
[0160] Os estudos de internalização de células (linhas celulares HeLa e HeLa-DsRed) foram conduzidos usando corantes hidrofóbicos (vermelho do Nilo) e hidrofílicos (calceína) de moléculas pequenas e LNPs OCholP carregadas com proteína recombinante macromolecular fluorescente ((-30)GFP-Cre). As estabilidades das LNPs carregadas com carga foram examinadas primeiro usando DLS dependente do tempo e medições de fluorescência. Conforme mostrado na Figura 12A, a intensidade de fluorescência das LNPs encapsuladas com o par de FRET DiO e DiI (DiO-DiI/75-OCholB, DiO-DiI/76-OCholB e DiO-DiI/77-OCholB) mostrou variações desprezíveis na razão FRET (I575/I575+I505) após 7 dias de armazenamento.
[0161] A cinética de internalização e as eficiências de LNPs OCholB foram então estudadas usando LNPs carregadas com NR e células HeLa. Conforme mostrado na Figura 12B, em comparação com as células de controle não tratadas,
todas as células incubadas com NR/LNPs (NR/75-OCholB, NR/76-OCholB e NR/77-OCholB) mostraram a porcentagem de células NR positivas (NR+) aumentando gradualmente ao longo do tempo, o que significa que o processo de internalização de NR/LNPs é dependente do tempo de exposição ao longo da escala de tempo deste estudo.
Além disso, tanto NR/75-OCholB quanto NR/77- OCholB mostraram um padrão de crescimento populacional NR+ semelhante e diminuição da taxa de crescimento após 4 h de exposição (em 4 h, as porcentagens de NR+ para células tratadas com NR/75-OCholB, NR/76-OCholB e NR/77-OCholB são 85,2%, 65,0% e 90,3%, respectivamente); enquanto que, em geral, NR/76- OCholB apresentou taxa de aumento constante e menor porcentagem de NR + após 8 h em comparação com NR/75-OCholB e NR/77-OCholB.
Em seguida, todas as eficiências de distribuição de NR de oito LNPs OCholB foram determinadas após 8 h de exposição.
Conforme mostrado na Figura 12C, NR/75-OCholB, NR/76- OCholB, NR/77-OCholB, NR/78-OCholB e NR/80-OCholB mostraram as maiores eficiências de distribuição, com 85,2%, 65,0%, 90,3%, 92,3% e 71,4% das células determinadas como NR+; 27,0%, 12,9% e 22,8% de células NR+ foram registradas para NR/81-OCholB, NR/90-OCholB e NR/304-OCholB; NR/87-OCholB mostrou a menor eficácia de transfecção, comparável ao grupo de controle não tratado, o que significa que 87-OCholB não pode distribuir NR de forma eficiente em células HeLa sob as condições testadas.
Imagens fluorescentes representativas de células HeLa tratadas com NR/LNPs (NR/75-OCholB, NR/76-OCholB e NR/77-OCholB) são mostradas na Figura 12D, a partir da qual é facilmente observado que NR foi distribuído nas células e principalmente distribuído no citoplasma, por LNPs OCholB.
Em seguida, foi estudada a internalização do corante fluorescente hidrofílico com carga negativa, a calceína.
Conforme mostrado na Figura 12E, após 8 h de exposição, as moléculas de calceína livres não podem entrar nas células de forma eficiente, o que é consistente com os resultados relatados anteriormente.
As células tratadas com calceína/75-OCholB mostraram uma intensidade fluorescente verde relativamente alta, uma vez que uma intensidade fluorescente média ~ 9,4 vezes maior foi registrada em comparação com as células tratadas com calceína livre.
Estes resultados provaram que a LNP OCholB pode servir como nanocarreadores eficientes para distribuição intracelular de moléculas de carga hidrofílicas e hidrofóbicas.
Em seguida, o uso de LNPs OCholB para a distribuição intracelular de carga macromolecular foi explorado, usando proteína (-30)GFP-Cre recombinante fluorescente e células HeLa-DsRed como sistema modelo.
Conforme mostrado na Figura 12F, (-30)GFP-Cre e Lpf2k carregado com (-30)GFP-Cre ((- 30)GFP-Cre/Lpf2k) foram usados como controles negativos e positivos, uma vez que foi demonstrado que a proteína (-30)GFP-Cre nua não pode entrar nas células e Lpf2k é altamente eficiente para a distribuição de (-30)GFP-Cre.
A eficiência de distribuição foi testada em uma faixa de concentrações de proteína (-30)GFP-Cre (25, 50 e 100 nM), com uma razão lipídio/proteína consistente (ou seja, distribuição com a concentração final de lipídio de 1,7, 3,3 e 6,6 μg mL -1 respectivamente). 33,2%, 43,8% e 74% de células GFP positivas (GFP+) foram registradas para células tratadas com (-30)GFP-Cre/Lpf2k com a concentração de (-30)GFP-Cre de 25 nM, 50 nM e 100 nM, respectivamente.
Na concentração de (-30)GFP-Cre de 25 nM, (-30)GFP-Cre/76-OCholB (66,4%), (-30)GFP-Cre/77-OCholB (66,4%), (- 30)GFP-Cre/80-OCholB (54,7%) e (-30)GFP-Cre/81-OCholB (40,9%) mostraram eficiências de transfecção mais altas do que (-30)GFP-Cre/Lpf2k.
Nas concentrações mais altas de (-30)GFP-Cre (ou seja, 50 nM e 100 nM), (-30)GFP- Cre/75-OCholB (42,3% e 93,1% de células GFP+ com 50 nM e 100 nM respectivamente), (-30)GFP-Cre/76-OCholB (96,3% e 98,7%), (-30)GFP-Cre/77- OCholB (90,7% e 97,9%), (-30)GFP-Cre/78-OCholB (46,1% e 90,1%), (-30)GFP- Cre/80-OCholB (88,9% e 97,0%), e (-30)GFP-Cre/81-OCholB (87,4% e 91,5%) mostraram eficácias de transfecção comparáveis ou ainda maiores do que Lpf2k. 48,8% das células GFP+ foram obtidas a partir de células tratadas com (-30)GFP- Cre/304-OCholB com a concentração de proteína de 100 nM, enquanto ambos 87- OCholB e 90-OCholB carregados com (-30)GFP-Cre mostraram menores eficiências de distribuição em comparação com outras LNPs OCholB.
Este resultado é consistente com os resultados de distribuição de NR de moléculas pequenas conforme mostrado na Figura 12C, indicando que essas duas nanopartículas são provavelmente ineficientes para aplicações de distribuição intracelular.
Embora muitas das LNPs OCholB, bem como Lpf2k possuíssem percentagens de células GFP+ semelhantes (Figura 4F), conforme mostrado na Figura 12G ([lipidoide] = 6,6 μg mL-1 e [(-30)GFP-Cre] = 100 nM), análises adicionais revelaram que as intensidades médias de fluorescência de células tratadas com nanopartículas carregadas com (-30)GFP-Cre variaram significativamente, indicando que algumas das LNPs (75-OCholB, 76-OCholB, 77- OCholB, 80-OCholB e 81-OCholB) são muito mais eficientes do que outras (Lpf2k e 78-OCholB), pois as intensidades médias de fluorescência mais altas representam maior quantidade de proteínas (-30)GFP-Cre que foram distribuídas com sucesso nas células. Os perfis de citometria de fluxo típicos das células HeLa- DsRed tratadas com proteína (-30)GFP-Cre nua e nanopartículas carregadas com (-30)GFP-Cre ((-30)GFP-Cre/75-OCholB, (-30)GFP-Cre/76-OCholB, (-30)GFP- Cre/77-OCholB e (-30)GFP-Cre/Lpf2k) foram mostradas na Figura 12H ([lipidoide] = 6,6 μg mL-1 e [(-30)GFP -Cre] = 100 nM), o que é consistente com os resultados estatísticos mostrados na Figura 12G. Além disso, as imagens fluorescentes representativas da proteína e células HeLa-DsRed tratadas com proteína/nanopartícula também são mostradas na Figura 12I. Sinais de fluorescência verde forte de (-30)GFP-Cre/75-OCholB, (-30)GFP-Cre/76-OCholB, (-30)GFP-Cre/77-OCholB e (-30)GFP-Cre/Lpf2k e sinais desprezíveis de células tratadas e não tratadas com (-30)GFP-Cre firam detectados, o que também é consistente com os resultados da análise de citometria de fluxo. A Figura 12J mostra imagens de campo claras típicas de células tratadas com (-30)GFP- Cre/LNPs ((-30)GFP-Cre/75-OCholB, (-30)GFP-Cre/76-OCholB e (-30)GFP- Cre/77-OCholB) ([lipidoide] = 6,6 μg mL-1 e [(-30)GFP-Cre] = 100 nM) e nenhuma mudança morfológica evidente foi observada em comparação com as células não tratadas, o que demonstra ainda mais a biocompatibilidade das LNPs OCholB. Tomados em conjunto, esses dados indicam que a maioria das LNPs OCholB totalmente substituídas recentemente desenvolvidas são eficientes para a distribuição de cargas hidrofóbicas e hidrofílicas de moléculas pequenas, bem como cargas macromoleculares em células de mamíferos in vitro. EXEMPLO 10: Distribuição Intracelular de Drogas Anticâncer de Moléculas Pequenas.
[0162] Foi explorada a possibilidade de usar LNPs OCholB para distribuir drogas de hidrofóbicas e hidrofílicas de moléculas pequenas. Cloridrato de doxorrubicina (Dox) (solúvel em água) e camptotecina (CPT) e oxaliplatina (Oxa)
(insolúvel em água) foram encapsulados em LNPs (consulte a seção experimental) e testados contra células HeLa. O encapsulamento bem-sucedido de drogas de moléculas pequenas foi demonstrado examinando os espectros de emissão de absorção e fluorescência de LNP 75-OCholB carregada com Dox (Ex. 495 nm, Em. 594 nm) e CPT (Ex. 360 nm, Em. 446 nm), em que foram observados os picos de absorbância e emissão característicos de Dox e CPT, conforme mostrado na Figura 13A. Usando curvas padrão correspondentes, os teores de carregamento de droga (DLC%= [Wdroga carregada]/[Wdroga carregada+Wlipidoide]*100%) foram determinados como 19,2% e 5,2% para Dox e CPT, respectivamente. Em seguida, a internalização de LNP 75-OCholB carregada com Dox (Dox/75-OCholB) foi estudada após 8 h de exposição usando citometria de fluxo. Conforme mostrado na Figura 13B, em nítido contraste com a calceína (Figura 12E) e (-30)GFP-Cre (Figura 4f), Dox livre pode ser prontamente internalizado por células HeLa após 8 h de incubação. As células HeLa tratadas com Dox/75-OCholB também mostraram uma intensidade de fluorescência média comparável às células tratadas com Dox livre e são ~ 28,9 vezes maiores em comparação com as células de controle não tratadas, indicando que as nanopartículas de Dox/75-OCholB podem ser eficientes para a distribuição intracelular de Dox sob esta condição.
[0163] A citotoxicidade dependente da dose foi então examinada. A partir da Figura 13C, o Dox/75-OCholB mostrou um perfil de citotoxicidade dependente da concentração semelhante como Dox livre contra células HeLa (8 h de exposição; ensaio de MTT após 48 h de incubação). Enquanto isso, as LNPs 75-OCholB em branco mostraram toxicidade desprezível nas mesmas condições. As viabilidades celulares tratadas por LNPs em branco se mantiveram >80%, o que valida ainda mais a segurança das LNPs OCholB. Em seguida, as drogas anticâncer hidrofóbicas, CPT e Oxa foram encapsuladas em LNPs 75-OCholB (CPT/75- OCholB e Oxa/75-OCholB) e as viabilidades celulares de células HeLa tratadas com CPT/75-OCholB e Oxa/75-OCholB (ambos com 8 h de exposição; [CPT] = 1,8 μg mL-1; [Oxa] = 2,4 μg mL-1) após 48 h de incubação foram determinadas como 42,4% e 66,9% (Figura 13D). No geral, as LNPs 75-OCholB encapsuladas em Dox e Oxa mostraram toxicidades comparáveis ou até mais altas do que suas contrapartes livres; enquanto o 75-OCholB carregado com CPT foi menos eficiente do que o CPT livre. Isso indica que as propriedades físico-químicas das drogas de carga podem ter um grande impacto sobre o desempenho de distribuição de LNPs OCholB, o que, em princípio, também pode ser verdadeiro para outros sistemas carreadores. EXEMPLO 11: Distribuição Intracelular de mRNA.
[0164] A distribuição de RNA mensageiro tem grande potencial para terapia contra o câncer, terapia de reposição de proteínas e tratamentos de distúrbios neurológicos.42 A distribuição intracelular de mRNA usando LNPs OCholB foi estudada usando mRNA de GFP e diferentes linhagens celulares (HeLa, B16F10, HEK-293, NIH/3T3 e Jurkat). A razão em peso de LNP/mRNA foi otimizada em primeiro lugar usando células HeLa. Conforme mostrado na Figura 14A, fixando a concentração final de mRNA como 0,86 μg mL-1 e aumentando a razão em peso LNP/mRNA de 0/1 (ou seja, mRNA livre, sem LNP) para 15/1, as células GFP + mínimas foram determinadas após 24 h de exposição quando a razão LNP/mRNA é inferior a 1/1 (0,7%, 0,8% e 1,4% das células GFP + foram determinadas para LNP/mRNA = 0/1, 0,5 / 1 e 1/1, respectivamente). Um aumento gradual nas populações GFP+ foi observado quando a razão é aumentada de 2/1 para 15/1, e 24,3%, 39,2%, 64,7% e 68,9% das células GFP+ foram registradas para razões LNP/mRNA de 2/1, 5 / 1, 10/1 e 15/1. A razão em peso de LNP/mRNA = 10/1 foi então escolhida para os seguintes estudos de distribuição de mRNA. A distribuição intracelular de mRNA de GFP também foi considerada dependente da dose na faixa de concentração de mRNA de 0,027-1,5 μg mL-1, pois o aumento contínuo nas células GFP+ (de 3,3% para 76,3%) foi observado ao aumentar a dosagem de mRNA/LNPs (Figura 14B). Em seguida, as eficiências de distribuição intracelular de todas as LNPs OCholB totalmente substituídas foram testadas contra células HeLa, e Lpf2k e mRNA de GFP nu foram usados como controles (LNP/mRNA = 10/1; [mRNA] = 0,86 μg mL-1; exposição de 24 h). Conforme mostrado na Figura 14D, o mRNA nu induziu células GFP+ desprezíveis, que são comparáveis às células não tratadas, enquanto Lpf2k é altamente eficiente para distribuição de mRNA, com 98,1% de células HeLa GFP+. Quanto às LNPs OCholB, 75-OCholB (62,0% das células GFP+), 76-OCholB (79,8%), 77-OCholB (73,5%), 78-OCholB (67,1%), 80-OCholB (55,6%), 81-OCholB (51,6%) e 304-OCholB (52,1%) são todos considerados eficazes. Imagens fluorescentes típicas de células HeLa tratadas com mRNA/LNPs (mRNA/75-OCholB, mRNA/76-OCholB e mRNA/77-OCholB) são mostradas na Figura 14C. Em comparação com células HeLa não tratadas, sinais fluorescentes verdes fortes foram recodificados a partir de células incubadas com nanopartículas, o que é consistente com os dados de citometria de fluxo, conforme mostrado na Figura 14D. Enquanto isso, 87-OCholB (6,1%) e 90-OCholB (2,5%) são considerados ineficientes para distribuição de mRNA de GFP em células HeLa, o que é consistente com os estudos de internalização usando NR (Figura 12C) e proteína (-30)GFP-Cre (Figura 12F) como os repórteres fluorescentes. Foi revelado que a consistência dos desempenhos de distribuição pode existir entre essas LNPs OCholB, e as eficácias de internalização de LNPs não ativas permaneceram mínimas, independentemente das propriedades das cargas carregadas.
[0165] Para examinar o espectro de distribuição das LNPs recentemente desenvolvidas, as LNPs OCholB carregadas com mRNA de GFP foram então expostas a outros quatro tipos de linhagens celulares. As células B16F10 (células de melanoma de camundongo), HEK 293 (células de rim embrionário humano), NIH 3T3 (células de fibroblastos embrionários de camundongo) e Jurkat (células de linfócitos T humanos) foram testadas (LNP/mRNA = 10/1; [mRNA] = 0,86 μg mL -1; exposição de 24 h) e os resultados são mostrados na Figura 14D. Como controle positivo, Lpf2k revelou-se muito eficiente para distribuir mRNA de GFP em células B16F10 (63,2% das células GFP+), HEK 293 (80,1%) e NIH 3T3 (70,1%), embora ligeiramente menos eficiente para células Jurkat (28,7%), que geralmente é considerada uma das linhagens de células mais difíceis de transfectar. Quanto às LNPs OCholB, em geral, 87-OCholB, 90-OCholB e 304-OCholB provaram ser menos eficientes para distribuir mRNA em todas essas linhagens celulares; enquanto outras seis LNPs OCholB foram consideradas muito mais eficientes. Por exemplo, 63,0%, 60,9%, 54,1% e 50,1% das células GFP + foram determinadas a partir de células B16F10, HEK 293, NIH 3T3 e Jurkat tratadas com mRNA/75- OCholB; e os números de células tratadas com mRNA/76-OCholB foram 70,7%, 75,8%, 24,1% e 7,7%, respectivamente. Era óbvio que não apenas os tipos de lipidoides, mas também as linhagens celulares alvo poderiam ter um grande impacto na eficácia de distribuição. No geral, o controle positivo, Lpf2k, é um reagente de transfecção de amplo espectro de atividade relativamente alta; a maioria das LNPs OCholB (6 de 9) também são reagentes de transfecção de amplo espectro eficazes nas condições testadas. Algumas das LNPs OCholB (por exemplo, 75-OCholB, 77-OCholB e 78-OCholB) mostraram vantagens particulares em relação ao Lpf2k em relação à eficácia da distribuição às células Jurkat. Esperava-se que através da otimização da formulação adicional, como a adição de excipientes (lipídios auxiliares como pequenos fosfolipídios moleculares (por exemplo, DOPE e DSPC) e macromoléculas de lipídios (por exemplo, PEG-DSPE e PEG-Ceramida)) nas LNPs e/ou usando procedimentos de automontagem mais controláveis, a eficiência de transfecção melhorada das LNPs OCholB totalmente substituídas pode ser alcançada.
[0166] Em seguida, o ensaio MTT foi conduzido para examinar a citotoxicidade de nanopartículas carregadas com mRNA contra células HeLa. Conforme mostrado na Figura 14E, foi revelado que após 24 h de exposição (lipidoide/mRNA = 10/1; [mRNA] = 0,86 μg mL-1), embora a maior porcentagem de células GFP+ tenha sido obtida do grupo tratado com mRNA/Lpf2k (Figura 14D), o complexo mRNA/Lpf2k mostrou citotoxicidade significativa contra células HeLa, uma vez que a viabilidade celular de 37,5% foi registrada. Por outro lado, todas as LNPs OCholB carregadas com mRNA de GFP mostraram citotoxicidades insignificantes nas mesmas condições (por exemplo, as viabilidades celulares foram determinadas como sendo 84,7%, 94,5% e 100,1% para amostras incubadas de mRNA/75-OCholB, mRNA/76-OCholB, e mRNA/77-OCholB), o que é consistente com estudos de toxicidade anteriores de LNPs OCholB em branco (Figura 10E). Este resultado indica a excelente compatibilidade das LNPs OCholB e a possibilidade de aumentar ainda mais as eficiências de distribuição intracelular, aumentando a dosagem total e/ou o tempo de exposição dos complexos mRNA/LNPs. A partir das imagens de campo claras mostradas na Figura 14F, é óbvio que após 24 h de exposição, alterações morfológicas significativas foram observadas nas células tratadas com mRNA/Lpf2k, enquanto nenhuma variação óbvia foi observada para ambos os mRNA/LNPs (mRNA / 75-OCholB , mRNA / 76- OCholB e mRNA / 77-OCholB) e células tratadas com mRNA nuas, em comparação com o grupo de controle não tratado. Este resultado é consistente com o estudo de viabilidade celular, conforme mostrado na Figura 14E, e validou ainda mais a vantagem de LNPs OCholB como nanocarreadores de transfecção relativamente seguros.
[0167] Em seguida, foi examinada a possibilidade de usar LNPs OCholB para distribuir mRNA para edição de genoma (sistemas Cre-loxP e CRISPR/Cas9). Primeiro, o mRNA Cre foi complexado com LNPs OCholB e testado contra células HeLa-DsRed. As células HeLa-DsRed expressam a proteína fluorescente vermelha, DsRed, apenas após recombinação mediada pela proteína Cre. Após 24 h de incubação com mRNA/LNPs (lipidoide/mRNA = 10/1; [mRNA] = 0,86 μg mL-1), as porções de células DsRed+ foram determinadas por citometria de fluxo. Conforme mostrado na Figura 14G, 75-OCholB, 76-OCholB e 77-OCholB foram todos eficazes, pois 67,2%, 48,7% e 72,8% das células DsRed + foram registradas, respectivamente. Em seguida, o mRNA Cas9 que expressa uma versão da proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes SF370 com um sinal de localização nuclear terminal N e C (NLS) foi carregado em LNPs, juntamente com RNA de guia único (sgRNA) que tem como alvo uma sequência no gene GFP. As células GFP-HEK que expressam de forma constante as proteínas GFP foram usadas como célula modelo neste caso. As células GFP-, indicando uma inativação mediada por Cas9 bem-sucedida da expressão de GFP, foram analisadas usando citometria de fluxo. Após 48 h de incubação (lipidoide/mRNA/sgRNA = 10/1/1; [mRNA] = [sgRNA] = 0,86 μg mL-1), verificou-se que todas as três LNPs testadas (75-OCholB, 76- OCholB e 77-OCholB) foram incapazes de induzir qualquer inativação de GFP evidente sob esta condição. As porções de células GFP- recodificadas para GFP- HEK tratado com LNPs 75-OCholB, 76-OCholB e 77-OCholB carregadas com mRNA e sgRNA foram 6,1%, 7,7% e 4,4%, respectivamente, que são comparáveis àquelas das células de controle não tratadas (7,0%). Os resultados de distribuição intracelular de moléculas de mRNA de GFP, Cre e Cas9 conforme mostrado na Figura 14D e 14G indicaram que as eficácias de mRNA/LNPs são dependentes de ambos os tipos de células testadas e as funções da proteína expressa por moléculas de mRNA de carga. Isso também foi considerado aplicável à distribuição de proteínas em nossos estudos anteriores.
[0168] A fim de demonstrar ainda mais os potenciais da biblioteca de LNPs
OCholB recentemente desenvolvida em aplicações de distribuição intracelular, a otimização da formulação foi explorada para distribuição de mRNA Cas9 melhorada para edição de genoma.
Nesse contexto, duas estratégias foram testadas, ou seja, sintetizar novos lipidoides de cauda OCholB com cauda única em vez de substituição completa, e adicionar lipídios auxiliares (fosfolipídios) em LNPs OCholB totalmente substituídas.
Os lipidoides de cauda única, 75-OCholB-1, 76- OCholB-1 e 76-OCholB-1 foram sintetizados no início seguindo protocolos semelhantes conforme descrito antes e caracterizados por ESI-MS ([75-OCholB- 1+H]+, 736,55; [76-OCholB-1+H]+, 734,64; [77-OCholB-1+H]+, 748,73). As nanopartículas foram então fabricadas usando os mesmos procedimentos de sonicação/vórtice e as LNPs obtidas foram medidas por DLS (75-OCholB-1, <Dh> = 302,6 nm, μ2/I2 = 0,30; 76-OCholB-1, <Dh> = 294,5 nm, μ2/I2 = 0,30; 77-OCholB- 1, <Dh> = 254,2 nm, μ2/I2 = 0,33). As eficácias de distribuição dos LNPs de tailed único foram testadas pela primeira vez usando mRNA de GFP contra células HeLa (lipidoide/mRNA = 10/1; [mRNA] = 0,86 μg mL-1; 24 h de exposição). 69,4%, 72,5% e 68,9% das células GFP+ foram determinadas para as células HeLa tratadas com mRNA/75-OCholB-1, mRNA/76-OCholB-1 e mRNA/77-OCholB-1, respectivamente.
O mRNA Cre também pode ser eficientemente entregue nas células HeLa-DsRed, como 87,3% (mRNA/75-OCholB-1), 82,8% (mRNA/76- OCholB-1) e 81,5% (mRNA/77-OCholB-1) das células foram determinadas como sendo DsRed+ após 24 h de exposição (Figura 14G). No entanto, verificou-se que os LNPs de OCholB de tailed único complexados de mRNA e sgRNA de Cas9 também induziram nocaute de GFP insignificante contra células GFP-HEK.
Os lipidoides OCholB de tailed único mostraram eficácias de distribuição comparáveis ou ligeiramente superiores em relação a GFP e mRNA Cre, enquanto falharam com a distribuição de mRNA e sgRNA de Cas9, semelhante a suas contrapartes de dois tailed.
Em seguida, tentamos adicionar lipídios helper nas formulações de nanopartículas de lipidoides OCholB de dois tailed originais.
Como prova de conceito, DOPE foi misturado com lipidoides OCholB (lipidoide/DOPE = 1/1, razão em peso) e nanopartículas foram fabricadas (anotadas como 75-OCholB-F, 76- OCholB-F e 77-OCholB- F) e carregado com Cas9 mRNA e sgRNA (mRNA/sgRNA = 1/1, razão em peso). Conforme mostrado na Figura 14H, após 48 h de exposição
(lipidoide/mRNA OCholB = 10/1; [mRNA] = 0,86 μg mL-1), 76-OCholB-F mostrou porçãode GFP-semelhante (6,4%) como não tratada (6,3%) e células tratadas com mRNA e sgRNA de Cas9 nu (5,6%). No entanto, uma quantidade aumentada de células nocaute de GFP foi registrada para células GFP-HEK tratadas com 75- OCholB-F e 77-OCholB-F, pois 15,3% e 12,9% das células foram determinadas como sendo GFP-. Esses resultados indicaram que a otimização da formulação de nanopartículas pode ser uma estratégia eficaz para obter melhores desempenhos. No geral, foi observado que as eficácias de nocaute de GFP de LNPs OCholB carregados com mRNA foram relativamente baixas quando comparadas aos nossos resultados de distribuição de ribonucleoproteína (RNP) relatados anteriormente; no entanto, por design molecular adicional (por exemplo, incorporando novos tipos de grupos de cabeça de amina catiônica para expandir a biblioteca combinatória) e otimização estrutural supramolecular (por exemplo, triagem de diferentes espécies, bem como composições de excipientes, otimização de razões de carga/carreador e condições de incubação como duração da exposição e dosagem), distribuição intracelular otimizada e subsequente desempenho de edição do genoma podem ser esperados. EXEMPLO 12: Distribuição intracelular de proteína de edição de genoma.
[0169] Terapêuticas baseadas em proteínas e peptídeos têm atraído muita atenção durante as últimas três décadas devido à sua especificidade relativamente alta e baixos efeitos fora do alvo. Foram desenvolvidas formulações para o tratamento de câncer, infecção, inflamação e doenças degenerativas. Métodos eficazes de distribuição intracelular para proteínas e peptídeos podem expandir ainda mais suas modalidades terapêuticas. Como a distribuição intracelular de proteína usando LNPs OCholB foi demonstrada com sucesso no estudo de internalização anterior usando proteína (-30)GFP-Cre como carga e GFP como o repórter fluorescente, o estudo de funcionalidade foi conduzido usando linhagem celular HeLa-DsRed e proteína DsRed como o repórter fluorescente.
[0170] Nesse contexto, o mecanismo de internalização dos complexos (- 30)GFP-Cre/LNPs foi estudado inicialmente, através da introdução de diferentes inibidores de endocitose, ou seja, sacarose (inibidor de endocitose mediada por clatrina), metil-β-ciclodextrina (M-β-CD, agente depletor de colesterol), dinassoro
(inibidor da dinamina II) e nistatina (inibidor da endocitose mediada por caveolina), seguindo nossos procedimentos relatados anteriormente.
Conforme mostrado na Figura 15A, as eficiências de internalização ([lipidoide] = 6,6 μg mL-1, [(-30)GFP- Cre] = 100 nM; duração da exposição = 6 h) de todas as três proteínas/LNPs testadas ((-30)GFP-Cre/75-OCholB, (-30)GFP-Cre/76-OCholB, (-30)GFP-Cre/77- OCholB) foram significativamente suprimidos por sacarose e dinassoro.
O M-β-CD e a nistatina, por outro lado, não induziram à supressão óbvia da captação celular dessas nanopartículas.
Isso indica que a clatrina e a dinamina desempenham papéis importantes na absorção celular dessa proteína (-30)GFP-Cre complexada com LNPs OCholB.
Comparando com outros estudos de biblioteca combinatória, é claro que mesmo carregados com as mesmas cargas e testados contra a mesma linhagem celular, diferentes lipidoides com diferentes estruturas químicas podem ser internalizados por meio de vias muito distintas.
Em seguida, as eficiências de edição do genoma de (-30)GFP-Cre/LNPs foram determinadas por citometria de fluxo após 24 h de incubação (com 8 h de exposição ao complexo de (-30)GFP- Cre/LNPs). Três concentrações diferentes de complexos de proteína/lipidoide (25 nM/1,7 μg mL-1, 50 nM/3,4 μg mL-1, e 100 nM/6,6 μg mL-1) foram testadas para cada nanopartícula de lipidoide.
Como mostrado na Figura 15B, a proteína (-30)GFP-Cre nua induziu eficácia de edição de genoma insignificante, independentemente das concentrações de proteína; enquanto todas as nanopartículas testadas, incluindo Lpf2k, mostraram um padrão de percentagem de células DsRed + dependente da dose, ou seja, maior concentração de proteína se correlaciona com maior edição do genoma e nível de expressão de DsRed.
Três lipídios foram considerados menos eficientes na distribuição, a saber 87-OCholB, 90-OCholB e 304-OCholB (que também se mostraram ineficientes para distribuição de NR e mRNA). Todos os outros LNPs OCholB totalmente substituídos (75-OCholB, 76-OCholB, 77- OCholB, 78-OCholB, 80-OCholB e 81-OCholB) mostraram células DsRed+ comparáveis ou até muito maiores do que o controle positivo, Lpf2k.
Por exemplo, as células DsRed + foram registradas como 10,5%/24,9%/88,9%, 13,5%/55,4%/88,8% e 27,7%/47,8%/94,7% para (-30)GFP-Cre carregado com 75- OCholB, 76 -OCholB e 77-OCholB, respectivamente, na concentração de proteína de 25, 50 e 100 nM.
Em particular, seis dos LNPs OCholB (75-OCholB, 76-OCholB,
77-OCholB, 78-OCholB, 80-OCholB e 81-OCholB) superaram Lpf2k quando testado a 100 nM de (-30)GFP- Cre, que mostrou ainda a vantagem dos LNPs recém-desenvolvidos.
Além disso, os perfis de citometria de fluxo típicos de (- 30)GFP-Cre/LNPs ((-30)GFP-Cre/75-OCholB, (-30)GFP-Cre/76-OCholB, (- 30)GFP-Cre/77-OCholB), (-30)GFP-Cre/Lpf2k e células (-30)GFP-Cre tratadas com HeLa-DsRed nuas foram mostradas na Figura 15C, a partir das quais as intensidades de sinal fluorescente DsRed aumentadas foram observadas para os sistemas de distribuição baseados em nanopartículas, que são consistentes com os resultados mostrados na Figura 15B.
Em seguida, os perfis de citotoxicidade de (-30)GFP-Cre/LNPs, (-30)GFP-Cre/Lpf2k e (-30)GFP-Cre nu em diferentes concentrações contra células HeLa-DsRed (8 h de exposição; (-30)GFP-Cre/LNPs = 25 nM/1,7 μg mL-1, 50 nM/3,4 μg mL-1e 100 nM/6,6 μg mL-1) são medidos usando ensaio de MTT após 24 h de incubação.
Como mostrado na Figura 15D, em geral, para todas as amostras testadas, as concentrações (-30)GFP-Cre mais altas induziram a viabilidades celulares mais baixas.
Todos os nove LNPs OCholB totalmente substituídos carregados com proteína mostraram viabilidades celulares relativamente altas.
Para células tratadas com (-30)GFP-Cre/75-OCholB, as viabilidades foram determinadas como sendo 95,5%, 91,8% e 83,1%, na concentração de proteína de 25, 50 e 100 nM, respectivamente; os números para (-30)GFP-Cre/76-OCholB e (-30)GFP-Cre/77-OCholB são 97,8%/98,2%/97,2 e 100,9%/96,6%/98,6%. As células tratadas com 78-OChlB, 80-OChlB e 304-OChlB carregadas com (-30)GFP-Cre mostraram 79,1-81,4% de viabilidades a 100 nM de proteína, enquanto todas as outras amostras foram demonstradas como não tóxicas contra HeLa-DsRed células nas condições testadas.
Em forte contraste, Lpf2k mostrou citotoxicidade severa sob as mesmas condições, como 58,9%, 56,7% e 51,2% das viabilidades celulares foram determinadas com a concentração de (-30)GFP-Cre a 25 nM, 50 nM e 100 nM, respectivamente.
Enquanto isso, as mudanças morfológicas das células HeLa-DsRed tratadas com diferentes formulações de nanopartículas foram estudadas e os resultados são mostrados na Figura 15E.
É claro que semelhante às células HeLa tratadas com Lpf2k carregadas com mRNA de GFP (Figura 14F), as células HeLa-DsRed expostas a (-30)GFP- Cre/Lpf2k não eram saudáveis e diminuíram; enquanto aquelas tratadas com
OCholB LNPs ((-30)GFP-Cre/75-OCholB, (-30)GFP-Cre/76-OCholB e (-30)GFP- Cre/77-OCholB) foram menos afetados em comparação com os não tratados e grupos de controle tratados com proteína nua. A percentagem de células DsRed + foi então plotada contra a viabilidade celular correspondente para todas as condições testadas (11 amostras com 3 concentrações diferentes), como mostrado na Figura 15F, com linhas pontilhadas denotando 80% da viabilidade celular e 50% da eficácia de edição do genoma (porção celular DsRed +), respectivamente. As amostras encontradas no quadrante superior esquerdo não são tóxicas e são ineficientes para distribuição; as amostras no quadrante esquerdo inferior são tóxicas e ineficientes; as amostras no quadrante inferior direito são eficientes, mas tóxicas; as amostras no quadrante superior direito não são tóxicas e são eficientes, o que seriam as principais candidatas para estudos posteriores. É claro que Lpf2k (mostrado no círculo roxo pontilhado) em alta concentração é relativamente eficiente para a edição do genoma, embora também seja tóxico para as células- alvo. Por outro lado, a maioria dos LNPs OCholB carregados com (-30)GFP-Cre são quase não tóxicos quando comparados com (-30)GFP-Cre/Lpf2k, semelhante à proteína (-30)GFP-Cre nua. 87-OCholB, 90-OCholB e 304-OCholB (mostrado no círculo azul escuro pontilhado) são menos eficientes para edição do genoma; enquanto a alta eficácia de edição do genoma e excelente tolerabilidade foram alcançadas usando 75-OCholB, 76-OCholB e 77-OCholB (mostrado no círculo verde pontilhado). Acima de tudo, esses resultados indicaram que os LNPs OCholB recentemente desenvolvidos podem servir como nanocarreadores altamente eficientes e seguros para a distribuição da proteína Cre recombinase para edição do genoma in vitro. EXEMPLO 13: Estudo de Toxicidade In Vivo.
[0171] Tanto o branco (Figura 10E e 13C) quanto a carga (mRNA de GFP e proteína de edição de genoma) carregados (Figura 14E e 15D) OCholB LNPs mostraram relativa alta biocompatibilidade in vitro. A toxicidade in vivo dos LNPs OCholB foi ainda examinada medindo a alteração do peso corporal e as funções biológicas do rim e do fígado por meio de testes bioquímicos séricos usando camundongos Balb/c. Camundongos Balb/c de 4-6 semanas de idade (n = 3) foram injetados com LNPs 75-OCholB, 76-OCholB e 77-OCholB em branco (50 μg LNPs para cada injeção) através da veia de cauda no dia 1 e no dia 5, pesos corporais foram monitorados por 14 dias, e o sangue foi coletado e analisado no dia 14. Como mostrado na Figura 16A, em comparação com o grupo de controle não tratado, os pesos corporais de LNPs (75-OCholB, 76-OCholB e 77-OCholB) de camundongos injetados mostraram diferenças insignificantes ao longo do estudo. As concentrações séricas de creatinina, ureia, aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) de camundongos injetados com LNPs foram muito semelhantes aos camundongos de controle (Figura 16B).
[0172] Esses resultados indicaram que esses LNPs OCholB não induziriam alteração significativa do peso corporal ou prejudicariam órgãos por meio da administração sistêmica nas condições testadas, indicando que esses LNPs poderiam ser usados como carreadores seguros para fins de distribuição in vivo. EXEMPLO 14: Proteína e distribuição de mRNA para Edição de Genoma In Vivo. O sistema Cre-loxP e o modelo de camundongo transgênico Ai14 foram usados no estudo de edição do genoma in vivo. Conforme mostrado na Figura 17A, este modelo de camundongo tem um cassete STOP flanqueado por loxP geneticamente integrado que impede a transcrição da proteína fluorescente vermelha, tdTomato. Quando ocorre a reorganização do gene mediada pela Cre recombinase, o cassete STOP pode ser removido, resultando na expressão da proteína repórter tdTomato fluorescente.
[0173] Distribuição local por meio de injeção intramuscular (injeção IM; perna traseira) usando proteína (-30)GFP-Cre e LNPs de 76-OCholB carregados com mRNA Cre (Figura 17B). Camundongos Ai14 (n = 3) receberam uma dose única de (-30)GFP-Cre/LNPs (50 μg de proteína) ou injeção de mRMA/LNPs (10 μg de mRNA) no dia 1 e foram sacrificados no dia 10. Os músculos esqueléticos foram coletados, fixados, criosseccionados e fotografados para análise da expressão do tdTomato (ver seções experimentais). Conforme mostrado na Figura 17D e 17E (canal azul, DAPI; canal vermelho, tdTomato), ao contrário do músculo de controle não tratado, fortes sinais fluorescentes tdTomato de ambos (-30)GFP-Cre/LNPs e músculos injetados de mRNA/LNPs foram registrados. Uma porção maior de células tdTomato positivas foi encontrada nas amostras de músculo injetadas com proteína/LNPs do que a contraparte mRNA/LNPs.
[0174] O OCholB LNPs foi investigado adicionalmente se eles podem induzir edição de genes bem-sucedido in vivo por meio de uma via de administração sistêmica. No início, camundongos Ai14 (n = 3) foram injetados através da veia da cauda (injeção intravenosa (IV)) com (-30) LNPs carregados de proteína GFP-Cre nos dias 1 e 5 (50 μg de proteína para cada injeção; 100 μg no total), então sacrificados no dia 14 para análise (Figura 17C). Neste caso, cinco dos principais LNPs OCholB que demonstraram ser eficazes in vitro como mostrado na Figura 17F são testados, ou seja, 75-OCholB, 76-OCholB, 77-OCholB, 78-OCholB, 80- OCholB. O coração, fígado, baço, pulmão e rim de cada grupo foram coletados e analisados. A eficácia de edição do genoma relativamente alta foi alcançada no pulmão e no baço de camundongos Ai14 injetados com (-30)GFP-Cre/80-OCholB e (-30)GFP-Cre/76-OCholB, respectivamente, como mostrado na Figura 17F. Como a maioria das nano-terapêuticas intravenosas, a proteína (-30)GFP-Cre complexada com nanopartículas OCholB injetadas através da veia de cauda iriam primeiro para o coração, e de lá diretamente para o pulmão. As formulações de nanopartículas (que podem ter complexado com proteínas séricas) podem ser facilmente aprisionadas nas estruturas da vasculatura no leito capilar pulmonar, retardando ou inibindo a redistribuição de LNPs para o fígado, baço e outros órgãos. Durante o transporte in vivo e o processo de redistribuição, alguns dos LNPs carregados de proteína podem entrar com sucesso nas células do pulmão ou baço para induzir a edição do genoma e a cascata de expressão de tdTomato. A degradação, agregação e/ou sequestro de células imunes da proteína de carga e LNPs transportadores reduziriam dramaticamente ou talvez até proibissem eventos de edição do genoma. No entanto, 80-OCholB e 76-OCholB demonstraram ser eficientes para distribuição de proteína (-30)GFP-Cre no pulmão e baço, respectivamente, in vivo por meio de administração sistêmica.
[0175] Em seguida, a entrega de mRNA sistêmico in vivo usando OCholB LNPs foi testada usando um protocolo de injeção intravenosa semelhante (Figura 17C). LNPs de 76-OCholB carregados com mRNA Cre foram injetados no dia 1 e no dia 5 (10 μg mRNA para cada injeção; 20 μg no total) e os camundongos foram sacrificados no dia 14. Todos os principais órgãos (coração, fígado, baço, pulmão e rim) foram coletados e analisados. Conforme mostrado na Figura 17G, uma quantidade significativa de células tdTomato positivas foi registrada no baço e os sinais positivos não foram encontrados em outros órgãos. Observou-se que tanto a proteína (-30)GFP-Cre e o mRNA Cre carregados com 76-OCholB LNPs induziram a edição do genoma no baço, o que indicou que a natureza dos lipidoides carreadores pode impactar o metabolismo e a biodistribuição de todo o sistema de entrega. No geral, as eficácias de edição do genoma de nanopartículas administradas sistemicamente (tanto da proteína (-30)GFP-Cre e LNPs carregados com mRNA Cre) pareciam muito mais baixas do que a da injeção local, o que é compreensível, pois as formulações injetadas através da veia encontrariam muito mais barreiras físicas e bioquímicas. No entanto, ainda vale a pena prosseguir, pois a administração sistêmica fornece uma ampla gama de possibilidades para o tratamento de doenças ou condições humanas. Acima de tudo, esses resultados de edição de genoma in vivo sugeriram a possibilidade de usar LNPs OCholB como nanocarreadores para entregar proteínas funcionais, bem como mRNA in vivo, tanto por meio das vias de administração sistêmica quanto local para fins de edição de genoma. Materiais e Métodos Geral
[0176] Os produtos químicos usados para a síntese de lipidoides, anfotericina B e kits comerciais usados para avaliar a hepatotoxicidade e a nefrotoxicidade foram adquiridos da Sigma-Aldrich. 1,2-distearoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina-N-[amino (polietilenoglicol)-2000](DSPE-PEG2000 Amina) foi encomendado à Avanti. As células HEK293 foram cultivadas em meio de águia modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma-Aldrich) com 1% de penicilina- estreptomicina (Gibco) e 10% de soro fetal bovino (FBS, Sigma-Aldrich). Tamanhos hidrodinâmicos e índices de polidispersidade (PDI) de nanopartículas AmB foram medidos por analisador de tamanho de partícula Zeta-PALS (Brookhaven Instruments). A concentração, hemólise de RBC e viabilidade celular de encapsulados AmB foram medidos por leitores de microplaca SpectraMax M2e. Os encapsulados AmB foram liofilizados por liofilizador (Labconco). O sangue total humano foi encomendado à Reaserch Blood Component, LLC. A cepa de C.
albicans (SC5314) foi obtida do laboratório da Professora Carol A. Kumamoto no Departamento de Biologia Molecular e Microbiologia do centro médico de Tufts. Amostras de tecido (100 mg) foram trituradas por homogeneizador de microtubo bead bug (Benchmark Scientific). A concentração plasmática e tecidual de AmB foi medida por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) (Agilent 1200) no departamento de química da Tufts University. Camundongos BALB/c fêmeas (idade 6-8 semanas, peso 20-30 g) e ratos fêmeas Sprague Dawley (idade 8-10 semanas, peso 200-250 g) foram encomendados à Charles River. O protocolo animal deste estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Uso e Cuidado de Animais (IACUC) da Tufts University (B2018-73) e todos os experimentos in vivo foram realizados de acordo com as diretrizes de cuidado de animais aprovadas. Preparação de nanopartículas AmB.
[0177] Os encapsulados AmB foram preparados da seguinte forma: Resumidamente, 1mg de cada lipidoide foi misturado com 1mg de AmB que já estava dissolvido em 300μl de dimetilsulfóxido (DMSO). As misturas foram sonicadas durante 30 minutos e depois agitadas no vórtex durante 10 minutos até cada uma estar completamente dissolvida. Em seguida, as nanopartículas AmB foram formuladas com 10 mg/mL DSPE-PEG dissolvido em etanol com a razão molar de 1:6,8 (DSPE-PEG para lipidoides). Como grupo de controle, as nanopartículas AmB não foram formuladas com DSPE-PEG. Cada solução foi adicionada gota a gota a um frasco de vidro contendo 600μl de tampão de acetato de sódio (pH 5,0) com homogeneização contínua a 700 rpm. Em seguida, as soluções foram dialisadas contra água destilada usando o saco de diálise (MWCO: 3500Da) por 4h para remover o DMSO e o tampão de acetato de sódio com uma velocidade de agitação de 600 rpm/min. Os encapsulados AmB foram transferidos para frascos de vidro de 2ml para observar sua transparência visual por 2 semanas. Os dados registrados são a média de três experimentos realizados de forma independente. Estabilidade e tamanho de partícula
[0178] Os tamanhos de partícula e PDI foram analisados por espalhamento dinâmico de luz (DLS), critérios de avaliação de 1 e 2 semanas para avaliar a estabilidade das nanopartículas AmB. O tamanho médio (nm) e PDI foram determinados com base na distribuição de tamanho por número. As nanopartículas AmB foram dispersas em água desionizada com diluição de 10 vezes antes da medição. Três execuções de 60 s por amostra foram realizadas em um ângulo de detecção de 90° nas mesmas condições. Todas as nanopartículas foram preparadas e medidas em triplicado. Conteúdo de carregamento de droga
[0179] A fim de quantificar a quantidade de AmB carregada, a curva de calibração de regressão da concentração de AmB foi calculada estudando a absorbância de diferentes concentrações de AmB (0,001-1,0mg/mL) dissolvidas em DMSO por SpectraMax M2e. O comprimento de onda variando de 300 a 450 nm foi selecionado para o espectro de absorvância UV-Vis. As quantidades de AmB encapsuladas no lipossoma foram determinadas dissolvendo as nanopartículas em DMSO e, em seguida, mediu-se a sua absorvância no comprimento de onda de 392 nm. O conteúdo de carregamento de droga (DLC) de AmB foi calculado de acordo com a curva de calibração de regressão linear e, em seguida, a seguinte equação: Conteúdo de carregamento de droga (%) =Wcarregado × 100 / Wpolímero + Wcarregado, onde Wcarregado é o peso de AmB carregado nos lipossomas após encapsulamento e Wpolímero é o peso dos lipidoides.Os dados registrados são a média de três experimentos realizados de forma independente. Atividade Antifúngica In Vitro
[0180] A concentração inibitória mínima (MIC) e a cepa deC. albicans (SC5314) foram usadas para testar a eficácia antifúngica de AmB encapsuladas in vitro de acordo com o Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts.Resumidamente, a levedura foi cultivada em placas de Agar Sabouraud Dextrose (SDA) e inoculada em água para produzir uma concentração de inóculo final de 1-5 × 106 células de levedura/mL. A suspensão de células deC. albicans foi diluída 1:20 em meio de crescimento RPMI-MOPS e 100μl dispensado em uma bandeja de microlitro contendo uma concentração serial de AmB variando de 0,125 a 32μg/mL e 0,109375μgμg/mL a 14,0μg/ mL. Três poços contendo meio livre de drogas e inóculo foram usados como controles positivo e negativo. As placas inoculadas foram incubadas a 35oC por 48h. O crescimento em cada poço foi estimado visualmente em 24h e 48h. A MIC foi registrada como a menor concentração de AmB que impediu o crescimento visível de C. albicans e expressa em μg/mL.Os dados registrados são a média de três experimentos realizados de forma independente. Teste de hemólise de eritrócitos humanos
[0181] A fim de triar os encapsulados AmB otimizados, altas doses de encapsulados AmB foram necessárias na avaliação de toxicidade. Os encapsulados de AmB foram liofilizados por crioprotetor e, em seguida, foram reconstituídos para o volume adequado com água desionizada filtrada , seguido de agitação para obter uma dispersão lipossomal homogênea. A hemólise foi realizada conforme descrito anteriormente. Sangue venoso obtido de um voluntário saudável armazenado a 6 ± 2 ◦C. O sangue total foi centrifugado (30 min a 1.600 × g) e o sobrenadante foi pipetado e descartado. RBCs foram então lavados três vezes com PBS isotônico de pH 7,4 e foram finamente dispersos em PBS em solução estoque a 2%. Posteriormente, 90μl da suspensão de RBCs foram misturados com 10μl de PBS contendo diferentes encapsulados de AmB, AmB livre e Fungizone® em triplicado. A concentração final de AmB foi de 200, 100, 50 e 25 µg/mL, respectivamente, em todas as nanopartículas. Cada amostra foi então incubada a 37 ◦C. Após 1 h de incubação, a hemólise foi interrompida e os RBCs não lisados foram removidos por centrifugação (5 min a 5000 × g). Os sobrenadantes foram coletados para análise para determinar a extensão da hemólise pela leitura da absorção de hemoglobina em 540 nm por SpectraMax M2e. Hemólise (%) = (Ab s- Abs0) × 100/ (Abs100-Abs0), onde Absé a absorbância de AmB encapsulados, Abs100 é a absorbância da amostra 100% lisada tratada com 1% da amostra Triton X100 e Abs0 é a absorbância de amostra não lisada tratada com PBS. Toxicidade in vitro em células de mamíferos
[0182] Células HEK293 de rim embrionário humano foram usadas para avaliar a viabilidade celular de encapsulados AmB. As células foram transferidas para placas de cultura de tecidos de 96 poços a 5×103 células por poço e incubadas por 24 h a 37°C antes do tratamento com drogas que contém diferentes concentrações de encapsulados AmB, AmB livre e Fungizone® (equivalente a AmB 200, 100, 50 e 25μg/mL). 30μl de solução estoque de MTT (5 mg/mL) foram adicionados a cada poço e as placas foram incubadas por 4 h a 37°C. Depois de descartar o meio de cultura, 200μl de DMSO foram adicionados para dissolver os cristais de formazan azuis convertidos de MTT. A viabilidade celular foi avaliada medindo a absorbância a 570 nm por SpectraMax M2e. A viabilidade celular foi expressa como percentagem calculada com a absorbância obtida do poço de controle sem tratamento com drogas usando a seguinte equação: Viabilidade celular (%) = Abst/Absc × 100%, onde Abst é a absorbância do poço tratado com droga e Absc é o absorbância de controle bem sem tratamento medicamentoso. Estudos de análise farmacocinética
[0183] Para este experimento, seis ratos fêmeas Sprague Dawley jejuaram durante a noite por cerca de 12 h com acesso gratuito à água e foram divididos aleatoriamente em dois grupos. Considerando que a dose máxima tolerada (MTD) de Fungizone® é de 2 mg de AmB/kg, os ratos foram administrados por via intravenosa através da veia de cauda com amB encapsulado ou Fungizone® em uma dose única equivalente a 2 mg/kg de AmB. As amostras de sangue (~ 0,5ml) de cada grupo foram coletadas em tubos heparinizados por punção retro-orbital em cada momento (10, 30 min e 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36 h) após a administração. Cada amostra de sangue foi centrifugada a 10.000 rpm por 10 min e o plasma foi coletado para a determinação da concentração de AmB. Duas partes de metanol foram adicionadas a uma parte do plasma. As misturas foram submetidas a vórtex durante 5 min, seguido de centrifugação (13000 g, 4°C e 30 min). Os sobrenadantes foram coletados para HPLC conforme descrito anteriormente. A análise de HPLC de cada amostra foi realizada com um sistema de cromatografia líquida modular (Agilent ™). A fase móvel consistia em acetonitrila e tampão de acetato de sódio 10 mM, pH 4,0 (40:60, v/v) e a taxa de fluxo mantida em 1 mL/min. Os compostos foram separados em um eclipse de 4,6 × 100 mm, 3,5 μm de tamanho mais uma coluna de fase reverse C18. O tempo de retenção relativo de AmB foi de 4 min. O efluente foi monitorado a 408 nm. As concentrações plasmáticas de AmB foram calculadas a partir de curvas de calibração de regressão linear. A análise farmacocinética não compartimental do software Pks projetado por Zhang foi usada para avaliar as concentrações plasmáticas de AmB em relação aos dados de tempo. Teste de biodistribuição de tecidos
[0184] Vinte e quatro camundongos BALB/c foram divididos aleatoriamente em quatro grupos (n = 6) para o estudo de distribuição nos tecidos. Três grupos foram injetados com encapsulados AmB selecionados via veia de cauda em uma dose única de 10 mg, 5 mg, 2 mg de AmB/kg, respectivamente. Um grupo recebeu injeção intravenosa de Fungizone® em dose única de 2mg AmB/kg. Três camundongos de cada grupo foram sacrificados por inalação de CO2, e os tecidos (fígado, baço, pulmões, rim, coração e cérebro) foram retirados 48 h e 72 h após a administração, respectivamente, e mantidos a -80°C até serem processados posteriormente. Amostras de tecido (100 mg) foram moídas e homogeneizadas com 200 μl de água DI em alta velocidade por homogeneizador de tecido de grânulo bug (2 min, 4000 rpm). Duas partes de metanol foram adicionadas a uma parte do homogenato. As misturas resultantes foram submetidas a vórtex durante 2 min, seguido de centrifugação (13000 g, 4°C e 30 min). Os sobrenadantes foram usados para análise por HPLC da mesma forma que a análise farmacocinética. Testes de hepatotoxicidade e nefrotoxicidade
[0185] Quinze camundongos BALB/c fêmeas foram divididos aleatoriamente em cinco grupos (n = 3). Três grupos foram injetados com encapsulados AmB selecionados via veia de cauda em uma dose única de 10 mg, 5 mg, 2 mg de AmB/kg, respectivamente. Um grupo foi administrado da mesma forma com Fungizone® em uma dose única de 2 mg AmB/kg. O grupo controle foi injetado com PBS. As amostras de sangue (~ 0,2 mL) foram coletadas por punção da veia mandibular 48 h e 72 h após a injeção e foram coaguladas a 4°C e depois centrifugadas por 10 min a 5000 rpm para coletar o soro. Os parâmetros bioquímicos renais e hepáticos foram realizados de acordo com as diretrizes do fabricante para analisar as investigações de nefrotoxicidade e hepatotoxicidade, incluindo creatinina (Cr), nitrogênio ureico no sangue (BUN), alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST). As concentrações foram calculadas com base nas curvas de calibração de regressão de cada kit. Análise estatística
[0186] Todos os dados foram expressos como média ± desvio padrão (SD). A diferença entre os grupos foi avaliada por análise de variância bidirecional (ANOVA) seguida pelo teste de comparação múltipla de Turkey-Kramer para mais de dois grupos e teste tde Student para comparar dois grupos usando o software
Prism (Graph Prism7.0 Software Inc. CA, EUA). As diferenças foram consideradas significativas quando o valor de p<0,05. Considerando que *p <0,05 e ** p <0,001 versus grupo controle descrito nas legendas. EXEMPLO 15: Otimização de encapsulados de lipidoides AmB e avaliação de estabilidade
[0187] AmB é pouco solúvel em solventes aquosos e orgânicos. Sua solubilidade em água em pH fisiológico é inferior a 1 mg/L. A propriedade anfipática representou um desafio para distribuição eficiente e econômica. A característica anfipática se eleva dos lados apolar e polar do anel de lactona, enquanto a propriedade anfipática se deve à presença de grupos carboxil e amina ionizáveis (Fig. 18a). AmB foi inicialmente formulado com diferentes lipidoides 75-O14B, 78- O14B ou 87-O14B, suspensões opacas foram obtidas, mas todas precipitaram em menos de 1 semana, como mostrado na Fig. 2.Os tamanhos das partículas aumentaram dramaticamente e o PDI aumentou para mais de 0,7 no final de 2 semanas.Como todos sabemos, o tamanho da partícula desempenha um papel importante na farmacocinética e na toxicidade. Como o tamanho de partícula maior que 100 nm de diâmetro interage facilmente com as proteínas plasmáticas, pode ser facilmente reconhecido pelo RES e eliminado mais rapidamente do sangue, como o Amphocil®. No entanto, um tamanho de partícula muito pequeno pode aumentar a filtração glomerular e a excreção renal do medicamento, como Fungizone®. O tamanho otimizável da nanopartícula é de 50-100 nm.
[0188] Para aumentar a solubilidade e estabilidade, AmB foi formulado com DSPE-PEG ou encapsulado em QLDs. Como resultado, as nanopartículas demonstraram melhor solubilidade da droga com soluções translúcidas de cor mais claramente amarelada, mas ainda um pouco turvas quando formuladas com DSPE- PEG2000 (Fig. 19). Os tamanhos de partícula aumentaram para 500-900 nm e o PDI aumentou para mais de 0,5 no final de 2 semanas (Fig. 20a e 20b). No entanto, quando o AmB foi carregado por QLDs, soluções homogêneas amarelas transparentes foram obtidas e permaneceram estáveis nas 2 semanas seguintes (Fig. 2). Os tamanhos das partículasdiminuíram para 100-160 nm, mas ainda um pouco maiores do que otamanho otimizável das nanopartículas(Fig. 20a e 20b).Portanto, formulamos DSPE-PEG com QLDs para encapsular AmB. Os tamanhos de partícula de AmB/Q75-O14B-F e AmB/Q78-O14B-F diminuíram para 70-100nm (Fig. 20a). Embora o tamanho de partícula de AmB/Q87-O14B-F fosse um pouco alto (110-120 nm), ele ainda diminuiu em comparação com AmB/Q87- O14B. As vesículas lipossomais quaternizadas formuladas com DSPE-PEG ou não foram todas homogêneas e de natureza semelhante em relação ao tamanho de partícula e PDI após a preparação, mesmo após um período de 2 semanas (Fig. 20b).
[0189] QLDs e DSPE-PEG permitem a formação de encapsulados AmB estáveis e facilitam a produção de estrutura condensada menor, na qual AmB foi intercalado entre a bicamada lipídica (Fig. 18a). A estabilidadedo lipossoma dependia da natureza das moléculas de fosfolipídios contidas em sua estrutura. QLDs com duas cabeças de amina quaternizada caracterizados por sua maior solubilidade, síntese combinatória mais fácil e econômica, bem como maior eficiência de entrega, o que torna os QLDs atraentes. O PEGé biocompatível, mas uma grande quantidade é necessária para o complexo AmB solúvel em água. QLDs aumentaram a propriedade de solubilidade de AmB e diminuíram a quantidade de DSPE-PEG com razão molar de 1:6,8 PEG para lipidoide. Os lipidoides foram quaternizados sendo dissolvidos em THF e reagindo com uma quantidade excessiva de iodeto de metil durante a noite em temperatura ambiente no escuro. As precipitações foram filtradas, lavadas com éter dietílico e depois secas em vácuo (Fig. 18a). Outro aspecto superior dos encapsulados AmB descritos neste documento são os excipientes de menor custo e uma preparação mais fácil em comparação com o Ambisome®. Ambisome® é formulado com colesterol de grau de boas práticas de fabricação injetáveis (GMP) devido aos agentes da encefalopatia espongiforme bovina/encefalopatia espongiforme transmissível e o procedimento de análise relacionado, que tornam o produto final caro. EXEMPLO 16: Conteúdo de carregamento de drogas
[0190] AmB dissolvido em DMSO exibiu três picos espectrofotométricos principais na faixa de UV consistentes como relatado anteriormente. As concentrações de AmB foram medidas pela absorbância da razão devidamente diluída em 392 nm e calculadas pela curva de calibração com coeficiente de correlação equivalente a 0,9985. O DLC de AmB encapsulado foi de 38,9-49,9%
indicando excelente associação de AmB com os lipossomas como mostradonaFig.21a.AmB/Q78-O14B-F mostrou o maior DLC de cerca de 49,9% entre esses encapsulados. A eficiência do DLC em função da polaridade e do coeficiente de partição determinou sua localização na membrana lipossomal. Como o AmB éanfipático, ele reside na cadeia de hidrocarboneto acil, adjacente à interface água-lipídio (Fig. 18a). EXEMPLO 17: Atividade AntifúngicaIn Vitro
[0191] O AmB tem alta afinidade com o ergosterol na membrana da célula fúngica, levando à formação de poros, vazamento de íons intercelulares e morte celular fúngica definitiva. O teste de MIC com incubação de 24 e 48h mostrou o MIC mais baixo para todos os encapsulados de AmB quando comparado com AmB livre e Fungizone® contra cepas de levedura C. albicans(SC5314) (Fig. 21b). O MIC de Fungizone® foi de 0,875μg/mL e AmB livre foi de 1,75μg/ mL após 48h de incubação contra C. albicans (Fig. 21b), consistente com os resultados obtidos por Radwan. Entre todos os encapsulados AmB, AmB/Q78-O14B-F apresentou o MIC mais baixo (0,29±0,13μg/mL), que foi quase 6 vezes menor do que AmB livre, 3 vezes menor que Fungizone®, conforme mostrado na Fig. 21b (p< 0,05). A estrutura característica do grupo amino quaternário pode contribuir para a maior eficácia antifúngica, aumentando as concentrações de AmB nas membranas celulares dos fungos e o efeito antifúngico sinérgico com AmB. EXEMPLO 18: Teste de hemólise de eritrócitos humanos (RBCs)
[0192] Para avaliar a toxicidade dos encapsulados de AmB, a hemólise induzida por diferentes concentrações de AmB foi comparada com AmB livre e Fungizone®. AmB livre exibiu quase 80,69± 2,39%e 102,47±1,04% de hemólise a 100 e 200μg AmB/mL, respectivamente (Fig. 22a). Fungizone® apresentou quase 52,05± 9,83% e 68,84±10,28% de hemólise na mesma concentração de AmB. As propriedades hemolíticas dos encapsulados AmB foram pouco afetadas até 200μg AmB/mL, exceto os encapsulados AmB/Q75-O14B-F que exibem 21,39± 3,58% a 200μg AmB/mL, conforme mostrado na Fig. 22a (p< 0,05). Portanto, os encapsulados de AmB foram menos hematotóxicos que o Fungizone®, porque o AmB liberado da bicamada unilamelar foi menor do que da formulação micelar. As micelas de Fungizone® são uma barreira relativamente fraca em comparação com bicamadas lipídicas e a droga em Fungizone® está mais disponível do que os encapsulados AmB, resultando em um vazamento mais rápido de hemoglobina e potássio. Outra razão para o aumento da hemólise para Fungizone® é que o componente do desoxicolato de sódio que atua como um surfactante pode induzir a hemólise por si só. EXEMPLO 19: Toxicidade em células de mamíferos in vitro
[0193] A Fig. 22b mostrou as viabilidades celulares de encapsulados de AmB, Fungizone® e AmB livre em concentrações que variam de 25 a 200 μg AmB/mL. AmB livre e Fungizone® mostraram citotoxicidade óbvia para HEK293 somente após 24 h de incubação, mesmo em baixa concentração. Após formulado com os QLDs, as viabilidades celulares dos encapsulados AmB/(Q75-O14B, Q78- O14B, Q87-O14B) diminuíram ligeiramente em comparação com os encapsulados AmB/(75-O14B, 78-O14B 87-O14B)-F. Simultaneamente, a viabilidade celular de todas as nanopartículas de AmB aumentou dramaticamente quando comparada com Fungizone® e AmB livre (p< 0,05). Após formulado com DSPE-PEG, as viabilidades celulares dos encapsulados AmB/(Q75-O14B, Q78-O14B, Q87-O14B)- F permaneceram em 70-80% até 200 μg AmB/mL. Isso talvez tenha contribuído para DSPE-PEG biocompatível e relativamente não tóxico, que é capaz de interagir com o grupo amino positivo de AmB para formar um complexo iônico nas bicamadas. Outra razão é que os QLDs encapsularam efetivamente o AmB, resultando em uma liberação lenta e sustentada de AmB e reduzindo a toxicidade.
[0194] Com base nos resultados da avaliação in vitro, o AmB/Q78-O14B-F demonstrando toxicidade mínima, MIC e mais estabilidade foi finalmente rastreado para ser o sistema de entrega mais eficaz para análise posterior in vivo. EXEMPLO 20: Estudos de análise farmacocinética
[0195] A farmacocinética afeta o acúmulo da droga nos tecidos. AmB/Q78- O14B-F e Fungizone® foram injetados por via intravenosa em ratos a uma dose de 2 mg de AmB/kg de peso corporal para comparação de seus perfis farmacocinéticos. Os perfis estimados de concentração plasmática versus tempo foram mostrados na Fig. 23a e os parâmetros farmacocinéticos médios correspondentes foram resumidos na Tabela 1.
[0196] Os resultados demonstraram que os perfis de concentração plasmática de AmB/Q78-O14B-F e Fungizone® mostraram uma fase distributiva inicial rápida. Enquanto isso, AmB/Q78-O14B-F rendeu maior concentração plasmática máxima (Cmax) para AmB do que Fungizone® (25,13±7,05 e 2,66±0,81μg/mL, respectivamente, p< 0,05)( Tabela 1). A concentração de AmB de Fungizone® não foi detectada em todos os ratos às 24h e em um rato às 12h. O AmB ainda foi detectável 24h (0,74 ± 0,12μg/mL) após a administração e permaneceu acima do MIC (0,39 ± 0,13μg/mL). AmB apresentaria atividade fungistática se a concentração fosse inferior a 0,5 a 1 vez do MIC e desempenharia forte atividade fungicida quando sua concentração fosse superior a 0,5 a 1 vez do MIC. Os resultados indicaram que AmB/Q78-O14B-F ainda tem atividade fungicida após 24h de administração benéfica para infecções transmitidas pelo sangue, como candidíase disseminada.
[0197] Além disso, AmB/Q78-O14B-F mostrou maior AUC (46,58 ± 6,28 mg*h/L) mais de 4 vezes contra a de Fungizone® (10,98 ± 5,02 mg*h/L) e o menor volume de distribuição (Vd) (177,08±46,05L/kg) quase a metade em relação ao Fungizone® (296,86±12,02 L/kg) (p <0,05) (Tabela1). O comportamento farmacocinético de AmB/Q78-O14B-F parece ser semelhante ao de Ambisome®, que também exibe Cmax, AUC, CI lento e Vd pequenos elevados. Uma explicação é que o grupo amino de AmB, com sua carga positiva, forma um complexo iônico com QLDs. Esse mecanismo, portanto, promove a retenção de AmB dentro da bicamada lipossomal e o liberta lentamente, resultando em uma circulação mais longa no sangue. Outra razão é que o DSPE-PEG possui propriedades de sua biocompatibilidade e flexibilidade conformacional variada que prolonga o tempo de circulação do sangue ao se fixar na superfície de lipídios aniônicos e, portanto, facilita ainda mais a retenção de AmB na bicamada.
[0198] É muito importante evitar a absorção pelo RES e prolongar o tempo de circulação do plasma para melhorar a distribuição e o efeito quando o alvo infectado é um tecido, exceto fígado e baço. Fungizone® apresentou AUC, Cmax, CI grande e Vd amplo (Tabela 1) consistentes com os resultados relatados anteriormente. A baixa concentração plasmática de AmB de Fungizone® pode ser explicada pela rápida liberação de AmB da formulação micelar de Fungizone® e alta captação de AmB por RES do fígado e baço. Também observamos um fenômeno interessante de que Fungizone® exibiu um segundo pico nos níveis plasmáticos 4h após a administração, o que já foi relatado respectivamente antes por Swenson e Serrano (Fig. 6a). Isso pode estar relacionado à redistribuição de tecidos como o fígado. Tabela.1 Parâmetros farmacocinéticos de AmB após injeção intravenosa de AmB/Q78-O14B-F e Fungizone® em ratos com uma dose de 2 mg de AmB/kg.
Parâmetros Fungizone® AmB/Q78-O14B-F Dose(mg/kg) 2 2 AUC0-24 (mg*h /L) 10,98±5,02 46,58±6,28* MRT(h) 27,92±32,0 21,87±5,48 Cmax (mg/L) 2,66±0,81 25,13±7,05** T1/2 (h) 19,11±22,94 21,14±6,91 CL (L/Kg/h) 19,04±12,02 5,93±0,98* Vd(L/Kg) 296,86±159,06 177,08±46,5* Observação: Todos os dados representam a média±SD(n=3). Abreviaturas: AUC Área sob a curva de concentração de tempo; MRT Tempo de residência médio, Cmax concentração plasmática máxima, T1/2 meia vida, depuração de CL, volume de distribuição V, * p< 0,05 e **p < 0,001 v.s. Fungizone®. EXEMPLO 21: Teste de biodistribuição de tecido
[0199] Depois que as nanopartículas deixam a circulação sanguínea, é muito importante saber para onde vai a droga e quanto tempo permanece em um determinado tecido, porque os tecidos também são o local primário da infecção fúngica sistêmica. Os resultados da distribuição dos tecidos após 48h e 72h da administração intravenosa foram mostrados na Fig. 23b-23e. Todos os camundongos estavam vivos quando administrados com AmB/Q78-O14B-F em uma dose única equivalente a AmB 5mg/kg e 2mg/kg. Cada grupo tem um camundongo falecido quando administrado com a dose equivalente a AmB 10mg/kg de AmB/Q78-O14B-F e 2mg/kg de Fungizone®.
[0200] Os resultados indicaram queAmB/Q78-O14B-F exibiu concentrações mais baixas no fígado (2,07±0,30μg/g) e baço (5,10±0,97μg/g) em comparação com o de Fungizone® (5,80±1,43μg/mL no fígado e 6,25 ± 1,30μg/mL no baço) após injeção de 48h em uma dose única de 2mg AmB/kg (Figs. 23b e 23c). Porque AmB/Q78-O14B-F evitado foi imediatamente reconhecido por RES levando a circulação prolongada no plasma. O reconhecimento da partícula é mediado pela opsonização no sangue, dependendo da distância entre a partícula e as opsoninas. Quando a distância é curta como o Fungizone®, as opsoninas se ligam à superfície da partícula e são reconhecidas pelo RES. Além disso, a concentração de AmB de AmB/Q78-O14B-F diminui para o nível equivalente no fígado (1,46±0,06μg/g) e baço (1,37±0,06μg/g) em comparação com Fungizone® (1,80±0,10 e 1,23±0,14μg/mL, respectivamente) após a injeção de 72h e ainda permanecer acima do MIC (Fig. 23b e 23c).A retenção tecidual de longo prazo sugere que a droga poderia ser administrada de forma intermitente, em vez de diária, sem perda de eficácia e isso reduziria o custo e os possíveis efeitos colaterais tóxicos. Infelizmente, AmB/Q78-O14B-F não exibiu nenhuma distribuição de AmB no tecido cerebral, o que não foi benéfico para a infecção fúngica intracraniana, como meningite criptocócica.
[0201] Notamos que as concentrações de AmB estavam baixas nos rins (48h, 0,79±0,70μg/ g, 72h, 0,45±0,39μg/g) em comparação com Fungizone® (48h, 1,93±0,23μg/g; 72h, 0,83±0,74μg/g)(Fig. 23e), indicando distribuições reduzidas de AmB para os rins. A explicação é que o lipossoma é grande o suficiente para evitar a filtração glomerular e a excreção renal do fármaco e levou à redução da nefrotoxicidade dos encapsulados de AmB.
[0202] Havia outro atributo superior desta nanopartícula que AmB/Q78- O14B-F acumula nos pulmões em concentrações mais elevadas do que Fungizone® (2,96±1,06 v.s. 1,45±0,24μg/g, respectivamente, p < 0,05) (Fig. 23d). Após a injeção de 72h, a concentração no pulmão de AmB encapsulado foi 2,12±0,27μg/g, no entanto,baixas concentrações de AmB foram detectadas nos pulmões de camundongos tratados com Fungizone® (p < 0,05) (Fig. 23d). É benéfico para infecção fúngica pulmonar quando o alvode AmB/Q78-O14B-F é o local do pulmão, como a aspergilose invasiva. Infelizmente, AmB/Q78-O14B-F não exibiu qualquer distribuição em tecidos cerebrais, o que não foi benéfico para a infecção fúngica intracraniana, como meningite criptocócica.
[0203] Um aumento na resposta dependente da dose foi observado nos tecidos AmB/Q78-O14B-F tratados com camundongos (Fig. 23b-23e). Quando a dose de injeção foi aumentada para 5mg AmB/Kg, concentrações mais altas foram detectadas em todos os tecidos de órgãos de camundongos. Todos os camundongos sobreviveram ao experimento, nenhuma toxicidade foi identificada no teste de toxicidade in vivo subsequente. No entanto, um camundongo morreu em 12h quando a dose de AmB/Q78-O14B-F foi aumentada para 10mg de AmB/kg. Isso significa que a toxicidade aumentou quando maior concentração de AmB se acumulou nos tecidos após a administração. Baixas concentrações de AmB foram encontradas nos tecidos do coração após 48h de administração na dose de 10mg de AmB/kg. Um camundongo sucumbiu ao Fungizone® na dose única de 2mg Amb/kg de administração intravenosa. Esses resultados indicaram que AmB/Q78- O14B-F tem janela terapêutica mais ampla e segura em comparação com Fungizone®, o que foi confirmado no seguinte teste de toxicidade in vivo. EXEMPLO 22: Testes de toxicidade In vivo
[0204] Avaliações de toxicidade in vivo os resultados sugeriram que AmB/Q78-O14B-F não afetouas funções do fígado (ALT e AST) e dos rins (Cr e BUN) na dose de 2 mg ou 5 mg de AmB/kg em camundongos tratados em comparação com a dos grupo controle (Fig. 24). Os resultados foram consistentes com a redução da acumulação da concentração de AmB nos rins de 2 mg ou 5 mg de AmB/kg de camundongos tratados com AmB/Q78-O14B-F (Fig. 23e). Assim, a filtração glomerular é reduzida e a nefrotoxicidade é minimizada. No entanto, AmB/Q78-O14B-F aumentou o nível de Cr e BUN ou as enzimas hepáticas AST e ALT quando a dose foi elevada para 10 mg de AmB/kg e todos têm diferenças significativas em comparação com o grupo de controle (p < 0,05) (Fig. 24).
[0205] A hepatotoxicidade e a nefrotoxicidade podem estar relacionadas com a retenção de AmB nos rins e no fígado após o aumento da administração da dose. Em comparação, Fungizone® induziu aumentos significativos em Cr, BUN, ALT e AST após 72h de administração em dose semelhante de 2mg de AmB/kg quando comparado com AmB/Q78-O14B-F (p < 0,05)(Fig. 24). Os resultados demonstraram que AmB/Q78-O14B-F apresenta uma redução substancial na toxicidade e um aumento na janela terapêutica de AmB em comparação com Fungizone®. EXEMPLO 23: Lipídios com cadeias de flúor Síntese
[0206] Uma cauda contendo flúor (2,5 equiv.) foi misturado com uma cabeça de amina (1 equiv.) em um frasco de vidro limpo. A mistura foi mantida a 70 C com agitação contínua durante 48 h. A reação foi então interrompida e o produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia em coluna de sílica gel, usando metanol e diclorometano como fase móvel. Ensaio
[0207] Os resultados da percentagem de células positivas para GFP e positivas para DsRed para os diferentes lipídios acima com cadeia de flúor são resumidos em um gráfico de barras na Figura 25 e Figura 26. EXEMPLO 24: Nova Biblioteca 1 - Amina 200 com diferentes caudas hidrofóbicos
Peso Molecular: 215,35 Peso Molecular: 276,45 Peso Molecular: 304,51 Peso Molecular: 332,56 Peso Molecular: 360,62 Peso Molecular: 312,49 Peso Molecular: 272,45 Peso Molecular: 328,56 Peso Molecular: 384,66 Peso Molecular: 375,46 Peso Molecular: 184,32
[0208] Os resultados da percentagem de células GFP+ para os lipídios acima com caudas hidrofóbicas diferentes (sintetizadas a partir da amina 200) são resumidos em um gráfico de barras na Figura 27. EXEMPLO 25: Nova biblioteca 2 - análogos de amina cíclica
1,4-Bis(3-aminopropil)piperazina 1-(2-Aminoetil)piperidina-3-carboxamida piperazina-2-carboxamida 4-Aminopiperidina 1-Amino-4-(2-hidroxietil)piperazina dicloridrato de 4-(aminometil)piperidinoinformamidina 2-(4-aminopiperidin-1-il)acetamida 1-(2-Aminoetil)piperazina 2-(Aminometil)piperidina 2-Metilpiperazina 2,3-Dimetilpiperazina 1-Metilpiperazina Piperazina 2-(Trifluorometil)piperazina 1-(3-pirrolidinopropil)piperazina 2-Oxopiperazina 1-(3-aminopropil)piperazina 1-metil-4-(2-piperidin-4-il-etil)-piperazina 2-(4-Metil-piperazin-1-il)-etilamina 1-Ciclopentilpiperazina 1-(2-diisopropilaminoetil)-piperazina
[0209] Os resultados da percentagem de células GFP+ para lipídios sintetizados a partir de diferentes análogos de amina cíclica são resumidos em um gráfico de barras na Figura 28. EXEMPLO 26: Nova biblioteca 3 - imidazol contendo análogos de amina
[0210] Os resultados da eficiência da entrega de mRNA às células T CD8+ para os lipídios acima sintetizados a partir de diferentes análogos de amina contendo imidazol são mostrados em um gráfico de barras na Figura 29.
MODALIDADES ADICIONAIS
[0211] Todas as características divulgadas neste relatório descritivo podem ser combinadas em qualquer combinação. Cada característica divulgada neste relatório descritivo pode ser substituída por uma característica alternativa servindo a mesma, equivalente ou semelhante finalidade. Assim, a menos que expressamente indicado em contrário, cada característica divulgada é apenas um exemplo de uma série genérica de características equivalentes ou semelhantes.
[0212] A partir do relatório descritivo acima, um versado na técnica pode facilmente determinar as características essenciais da modalidade descrita, e sem desviar de seu espírito e escopo, pode fazer diversas mudanças e modificações das modalidades para adaptá-las para diversos usos e condições. Assim, outras modalidades também estão dentro das reivindicações. Será evidente para aqueles versados na técnica que várias modificações e variações podem ser feitas nas modalidades divulgadas. Pretende-se que a especificação e os exemplos sejam considerados como exemplos apenas, com um verdadeiro escopo da divulgação sendo indicado pelas seguintes reivindicações e seus equivalentes.

Claims (46)

REIVINDICAÇÕES
1. Composto da fórmula (I): (I), caracterizado pelo fato de que A, uma cabeça hidrofílica, é , ou , em que cada Ra, Ra’, Ra” e Ra”’, independentemente, é H, C1-C20 alquil, C2- C20 alquenil, C2-C20 alquinil, C3-C20 cicloalquil, C1-C20 heteroalquil, C1-C20 heterocicloalquil, aril ou heteroaril; e Z é um radical alifático bivalente C 1-C20, um radical heteroalifático bivalente C1-C20, um radical aril bivalente ou um radical heteroaril bivalente; B é C1-C24 alquil, C2-C24 alquenil, C2-C24 alquinil, C3-C24 cicloalquil, C1-C24 heteroalquil, C1-C24 heterocicloalquil, aril ou heteroaril, ou ; cada um dentre R1 e R2 é um radical alifático bivalente C1-C20; cada um dentre R3 e R4, independentemente, é H ou C1-C10 alquil ou R3 e R4, juntamente com o átomo ao qual estão ligados, formam C3-C10 cicloalquil; R5 é C1-C24 alquil, C2-C24 alquenil, C2-C24 alquinil, C3-C24 cicloalquil, C1-C24 heteroalquil, C1-C24 heterocicloalquil, aril ou heteroaril; W é O, S ou Se; V é uma ligação, O, S ou Se; X, um ligante peptídico, é ou ,
em que cada um dentre L1, L2, L3 e L4, independentemente, é uma ligação, O, S ou NRc; G é O, S ou NRd; Q é ORf, SRg ou NRhRi; e cada um dentre r e t, independentemente, é 1-6, cada um dentre Rc, Rd, Rf, Rg, Rh e Ri, independentemente, sendo H, C1-C10 alquil, C1-C10 heteroalquil, aril ou heteroaril; e m é 0 ou 1, desde que m seja 1 quando V for S.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que A é ou .
3. Composto, de acordo com a reivindicação 1-2, caracterizado pelo fato de que B é .
4. Composto, de acordo com a reivindicação 1-3, caracterizado pelo fato de que X é , , , , ou , cada um dentre Rc e Rd, independentemente, sendo H ou C1-C10 alquil.
5. Composto, de acordo com a reivindicação 1-4, caracterizado pelo fato de que cada um dentre R1 e R2 é um radical alifático bivalente C1-C4; cada um dentre R3 e R4, independentemente, é H ou C1-C4 alquil; e R5 é C1-C20 alquil.
6. Composto, de acordo com a reivindicação 1-5, caracterizado pelo fato de que W é O, S ou Se; e V é uma ligação.
7. Composto, de acordo com a reivindicação 1-5, caracterizado pelo fato de que cada um dentre W e V, independentemente, é O ou Se, e m é 0.
8. Composto, de acordo com a reivindicação 1-5, caracterizado pelo fato de que cada um dentre W e V é O ou S; e m é 1.
9. Composto, de acordo com a reivindicação 1-8, caracterizado pelo fato de que A é uma fração amino formada a partir de uma das seguintes aminas:
.
10. Composto, de acordo com a reivindicação 1-8, caracterizado pelo fato de que A é uma fração amino formada a partir de uma das seguintes aminas:
1,4-Bis(3-aminopropil)piperazina 1-(2-Aminoetil)piperidina-3-carboxamida piperazina-2-carboximida 4-Aminopiperidina
Dicloridrato de 4-(aminometil)piperidinainformamidina 1-Amino-4-(2-hidroxietil)piperazina
2-(4-aminopiperidin-1-il)acetamida
1-(2-Aminoetil)piperazina 2-(Aminometil)piperidina
2-Metilpiperazina 2,3-Dimetilpiperazina 1-Metilpiperazina Piperazina
2-(Trifluorometil)piperazina 2-Oxopiperazina 1-(3-aminopropil)piperazina 1-(3-pirrolidinopropil)piperazina
1-metil-4-(2-piperidin-4-il-etil)-piperazina 2-(4-Metil-piperazin-1-il)-etilamina 1-Ciclopentilpiperazina 1-(2-diisopropilaminoetil)-piperazina .
11. Composto, de acordo com a reivindicação 1-10, caracterizado pelo fato de que Aé ou ; Bé ; cada um dentre R1 e R2 é um radical alifático bivalente C1-C4; cada um dentre R3 e R4, independentemente, é H ou C1-C4 alquil; e R5 é C1-C20 alquil.
12. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, caracterizado pelo fato de que A é uma fração amino formada a partir de uma das seguintes aminas:
.
13. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, caracterizado pelo fato de que A é uma fração amino formada a partir de uma das seguintes aminas:
1,4-Bis(3-aminopropil)piperazina 1-(2-Aminoetil)piperidina-3-carboxamida piperazina-2-carboximida 4-Aminopiperidina Dicloridrato de 4-(aminometil)piperidinainformamidina 1-Amino-4-(2-hidroxietil)piperazina 2-(4-aminopiperidin-1-il)acetamida 1-(2-Aminoetil)piperazina 2-(Aminometil)piperidina 2-Metilpiperazina 2,3-Dimetilpiperazina 1-Metilpiperazina Piperazina 2-(Trifluorometil)piperazina 2-Oxopiperazina 1-(3-aminopropil)piperazina 1-(3-pirrolidinopropil)piperazina 1-metil-4-(2-piperidin-4-il-etil)-piperazina 2-(4-Metil-piperazin-1-il)-etilamina 1-Ciclopentilpiperazina 1-(2-diisopropilaminoetil)-piperazina .
14. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11-13, caracterizado pelo fato de que W é O, S ou Se; e V é uma ligação.
15. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11-13, caracterizado pelo fato de que cada um dentre W e V, independentemente, é O ou Se, e m é 0.
16. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11-13, caracterizado pelo fato de que cada um dentre W e V é O, e m é 1.
17. Composto da fórmula (I):
(I), caracterizado pelo fato de que A, uma cabeça hidrofílica, é
, ou
, em que cada Ra, Ra’, Ra” e Ra”’, independentemente, é H, C1-C20 alquil, C2- C20 alquenil, C2-C20 alquinil, C3-C20 cicloalquil, C1-C20 heteroalquil, C1-C20 heterocicloalquil, aril ou heteroaril; e Z é um radical alifático bivalente C 1-C20, um radical heteroalifático bivalente C1-C20, um radical aril bivalente ou um radical heteroaril bivalente; B é C1-C24 alquil, C2-C24 alquenil, C2-C24 alquinil, C3-C24 cicloalquil, C1-C24 heteroalquil, C1-C24 heterocicloalquil, aril ou heteroaril, ou
; R1 é um radical alifático bivalente C1-C20; R2 é uma ligação ou radical alifático bivalente C1-C20; cada um dentre R3 e R4, independentemente, é H ou C1-C10 alquil ou R3 e R4, juntamente com o átomo ao qual estão ligados, formam C3-C10 cicloalquil; R5 é
, em que R6 é uma ligação ou radical alifático bivalente C1-C20; cada um dentre Rb e Rb’ é F ou, Rb e Rb’, juntamente com o átomo ao qual estão ligados, formam C=O; R7 é F ou uma fração lipídica alifática; cada um dentre L1 e L2, independentemente, é uma ligação, O, S ou NRc, Rc sendo H, C1-C10 alquil, C1-C10 heteroalquil, aril ou heteroaril; e n é 1 a 20;
cada um dentre W e V, independentemente, é uma ligação, O, S ou Se; X, um ligante peptídico, é ou , em que cada um dentre L3, L4, L5 e L6, independentemente, é uma ligação, O, S ou NRc; G é O, S ou NRd; Q é ORf, SRg ou NRhRi; e cada um dentre r e t, independentemente, é 1-6, cada um dentre Rc, Rd, Re, Rf, Rg, Rh, e Ri, independentemente, sendo H, C1-C10 alquil, C1-C10 heteroalquil, aril ou heteroaril; e m é 0 ou 1.
18. Composto, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que Aé ou e Bé .
19. Composto, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que cada um dentre R1 e R2 é um radical alifático bivalente C1-C4; e cada um dentre R3 e R4, independentemente, é H ou C1-C4 alquil.
20. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17-19, caracterizado pelo fato de que cada um dentre L1 e L2 é uma ligação, e cada um dentre Rb, Rb’ e R7 é F.
21. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17-20, caracterizado pelo fato de que cada um dentre R2, W, e V é uma ligação, e m é 0.
22. Composto, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que Aé ou e Bé .
23. Composto, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que R1 é um radical alifático bivalente C1-C4; e X é , , , , , ou , cada um dentre Rc e Rd, independentemente, é H ou C1-C10 alquil.
24. Composto, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que A é uma fração amino formada a partir de uma das seguintes aminas: .
25. Composto, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que A é uma fração amino formada a partir de uma das seguintes aminas:
1,4-Bis(3-aminopropil)piperazina 1-(2-Aminoetil)piperidina-3-carboxamida piperazina-2-carboximida 4-Aminopiperidina
Dicloridrato de 4-(aminometil)piperidinainformamidina 1-Amino-4-(2-hidroxietil)piperazina 2-(4-aminopiperidin-1-il)acetamida 1-(2-Aminoetil)piperazina 2-(Aminometil)piperidina 2-Metilpiperazina 2,3-Dimetilpiperazina 1-Metilpiperazina Piperazina 2-(Trifluorometil)piperazina 2-Oxopiperazina 1-(3-aminopropil)piperazina 1-(3-pirrolidinopropil)piperazina 1-metil-4-(2-piperidin-4-il-etil)-piperazina 2-(4-Metil-piperazin-1-il)-etilamina 1-Ciclopentilpiperazina 1-(2-diisopropilaminoetil)-piperazina .
26. Composto, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que R6 é um radical alifático bivalente C1-C4; cada um dentre L1 e L2, independentemente, é O ou NRc, Rc é H ou C1-C10 alquil; Rb e Rb’, juntamente com o átomo ao qual estão ligados, formam C=O; n é 1 ou 2; e R7 é uma fração lipídica alifática.
27. Composto, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que R7 é uma fração lipídica alifática formada por colesterol.
28. Composto, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que R1 e R2 é um radical alifático bivalente C1-C4; X é , , , , , ou , cada um dentre Rc e Rd, independentemente, é H ou C1-C10 alquil; cada um dentre
W e V, independentemente, é O, S, ou Se; e m é 0.
29. Composto, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que A é uma fração amino formada a partir de uma das seguintes aminas: .
30. Composto, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que A é uma fração amino formada a partir de uma das seguintes aminas:
1,4-Bis(3-aminopropil)piperazina 1-(2-Aminoetil)piperidina-3-carboxamida piperazina-2-carboximida 4-Aminopiperidina
Dicloridrato de 4-(aminometil)piperidinainformamidina 1-Amino-4-(2-hidroxietil)piperazina
2-(4-aminopiperidin-1-il)acetamida
1-(2-Aminoetil)piperazina 2-(Aminometil)piperidina
2-Metilpiperazina 2,3-Dimetilpiperazina 1-Metilpiperazina Piperazina
2-(Trifluorometil)piperazina 2-Oxopiperazina 1-(3-aminopropil)piperazina 1-(3-pirrolidinopropil)piperazina
1-metil-4-(2-piperidin-4-il-etil)-piperazina 2-(4-Metil-piperazin-1-il)-etilamina 1-Ciclopentilpiperazina 1-(2-diisopropilaminoetil)-piperazina .
31. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um nanocomplexo, sendo o nanocomplexo formado por um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, e uma proteína ou um ácido nucleico; em que o nanocomplexo tem um tamanho de partícula de 50 nm a 1000 nm, e o composto se liga à proteína ou ao ácido nucleico através de uma interação não covalente, de uma ligação covalente, ou de ambas.
32. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que a proteína é GFP-Cre ou CRISPR/Cas9.
33. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um nanocomplexo, sendo o nanocomplexo formado por um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 17-30, e uma proteína ou um ácido nucleico; em que o nanocomplexo tem um tamanho de partícula de 50 nm a 1000 nm, e o composto se liga à proteína ou ao ácido nucleico através de uma interação não covalente, de uma ligação covalente, ou de ambas.
34. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a proteína é GFP-Cre ou CRISPR/Cas9.
35. Método de tratamento de uma condição médica, caracterizado pelo fato de que compreende a administração, a um sujeito em necessidade, de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 31 ou 32.
36. Método de tratamento de uma condição médica, caracterizado pelo fato de que compreende a administração, a um sujeito em necessidade, de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 33 ou 34.
37. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um nanocomplexo, sendo o nanocomplexo formado por um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, e uma pequena molécula; em que o nanocomplexo tem um tamanho de partícula de 50 nm a 1000 nm, e o composto se liga às pequenas moléculas através de uma interação não covalente, de uma ligação covalente, ou de ambas.
38. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que a pequena molécula é um agente antifúngico ou um agente quimioterápico.
39. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que a pequena molécula é selecionada do grupo consistindo em bortezomibe, imatinibe, gefitinibe, erlotinibe, afatinibe, osimertinibe, dacomitinibe, cloridrato de daunorrubicina, citarabina, fluorouracila, cloridrato de irinotecano, sulfato de vincristina, metotrexato, paclitaxel, sulfato de vincristina, epirrubicina, docetaxel, ciclofosfamida, carboplatina, lenalidomida, ibrutinibe, acetato de abiraterona, enzalutamida, pemetrexede, palbociclibe, nilotinibe, everolimo, ruxolitinibe, epirrubicina, pirirrubicina, idarrubicina, valrubicina, amrubicina, bleomicina, fleomicina, dactinomicina, mitramicina, estreptozotecina, pentostatina, mitosanos como mitomicina C, enediinas como caliqueamicina, glicosídeos como rebecamicina, macrolídeos como lactonas epotilonas, ixabepilona, pentostatina, salinosporamida A, vinblastina, vincristina, etoposida, teniposida, vinorelbina, docetaxel, camptotecina, Hycamtin, pederina, teopederinas, anamidas, trabectedina, aplidina e ecteinascidina 743 (ET743).
40. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que a pequena molécula é a anfotericina B ou doxorrubicina.
41. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um nanocomplexo, sendo o nanocomplexo formado por um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 17-30, e uma pequena molécula; em que o nanocomplexo tem um tamanho de partícula de 50 nm a 1000 nm, e o composto se liga à pequena molécula através de uma interação não covalente, de uma ligação covalente, ou de ambas.
42. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que a pequena molécula é um agente antifúngico ou um agente quimioterápico.
43. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que a pequena molécula é selecionada do grupo consistindo em bortezomibe, imatinibe, gefitinibe, erlotinibe, afatinibe, osimertinibe, dacomitinibe, cloridrato de daunorrubicina, citarabina, fluorouracila, cloridrato de irinotecano, sulfato de vincristina, metotrexato, paclitaxel, sulfato de vincristina, epirrubicina, docetaxel, ciclofosfamida, carboplatina, lenalidomida, ibrutinibe, acetato de abiraterona, enzalutamida, pemetrexede, palbociclibe, nilotinibe, everolimo, ruxolitinibe, epirrubicina, pirirrubicina, idarrubicina, valrubicina, amrubicina, bleomicina, fleomicina, dactinomicina, mitramicina, estreptozotecina, pentostatina, mitosanos como mitomicina C, enediinas como caliqueamicina, glicosídeos como rebecamicina, macrolídeos como lactonas epotilonas, ixabepilona, pentostatina, salinosporamida A, vinblastina, vincristina, etoposida, teniposida, vinorelbina, docetaxel, camptotecina, Hycamtin, pederina, teopederinas, anamidas, trabectedina, aplidina e ecteinascidina 743 (ET743).
44. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que a pequena molécula é a anfotericina B ou doxorrubicina.
45. Método de tratamento de uma condição médica, caracterizado pelo fato de que compreende a administração, a um sujeito em necessidade, de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 37-40.
46. Método de tratamento de uma condição médica, caracterizado pelo fato de que compreende a administração, a um sujeito em necessidade, de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 41-44.
BR112020015796-1A 2018-02-01 2019-02-01 nanocomplexos semelhantes a lipídios e usos dos mesmos BR112020015796A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862625153P 2018-02-01 2018-02-01
US62/625,153 2018-02-01
PCT/US2019/016362 WO2019152848A1 (en) 2018-02-01 2019-02-01 Lipid-like nanocomplexes and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020015796A2 true BR112020015796A2 (pt) 2021-02-09

Family

ID=67478550

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020015796-1A BR112020015796A2 (pt) 2018-02-01 2019-02-01 nanocomplexos semelhantes a lipídios e usos dos mesmos

Country Status (10)

Country Link
US (2) US20200368254A1 (pt)
EP (1) EP3746129A4 (pt)
KR (1) KR20200115591A (pt)
CN (1) CN111954542A (pt)
AU (1) AU2019215157A1 (pt)
BR (1) BR112020015796A2 (pt)
CA (1) CA3089826A1 (pt)
IL (1) IL276322A (pt)
MX (1) MX2020007944A (pt)
WO (1) WO2019152848A1 (pt)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4289951A3 (en) 2019-12-04 2024-03-13 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions and methods
WO2021189059A2 (en) 2020-03-20 2021-09-23 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions and methods
WO2022155598A2 (en) * 2021-01-15 2022-07-21 Trustees Of Tufts College Lipid nanoparticles for targeted delivery of mrna
CN113402404B (zh) * 2021-04-30 2022-03-11 苏州科锐迈德生物医药科技有限公司 脂质化合物及包含其的脂质载体、核酸脂质纳米粒组合物和药物制剂
BR112023025515A2 (pt) 2021-06-10 2024-02-27 Orna Therapeutics Inc Composições e métodos de rna circular
CN113387825A (zh) * 2021-06-10 2021-09-14 福州大学 长链烷基酯胺类化合物或含氟长链烷基酯胺类化合物及其公斤级制备方法
TW202322851A (zh) 2021-09-30 2023-06-16 美商歐納醫療公司 用於遞送環狀聚核苷酸之脂質奈米粒子組合物
TW202334080A (zh) 2021-11-08 2023-09-01 美商歐納醫療公司 用於遞送環狀聚核苷酸之脂質奈米粒子組合物
CN114191561B (zh) * 2021-12-15 2022-08-02 武汉滨会生物科技股份有限公司 一种可离子化脂质化合物在核酸药物递送系统中的应用
CN114163345B (zh) * 2021-12-15 2022-07-26 武汉滨会生物科技股份有限公司 一种可离子化脂质化合物及核酸体外细胞转染试剂
WO2023114937A2 (en) * 2021-12-16 2023-06-22 Acuitas Therapeutics, Inc. Fluorinated cationic lipids for use in lipid nanoparticles
CN116813493A (zh) * 2022-03-21 2023-09-29 苏州科锐迈德生物医药科技有限公司 一种脂质化合物及基于其的脂质载体、核酸脂质纳米粒组合物和药物制剂
CN114716355B (zh) * 2022-04-02 2023-09-05 华南理工大学 一种脂质化合物、包含其的组合物及应用
US20240052049A1 (en) 2022-06-24 2024-02-15 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna encoding chimeric antigen receptors targeting bcma
WO2024102762A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
WO2024102730A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
CN116063245A (zh) * 2022-12-05 2023-05-05 南开大学 一种中心可降解的mRNA脂质体纳米粒子及其制备方法和应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE682393C (de) * 1933-04-14 1939-10-13 I G Farbenindustrie Akt Ges Verfahren zur Herstellung quaternaerer Stickstoffverbindungen
US9765022B2 (en) * 2013-02-28 2017-09-19 Tufts University Disulfide compounds for delivery of pharmaceutical agents
US20160082126A1 (en) * 2013-05-13 2016-03-24 Tufts University Nanocomplexes for delivery of saporin
US20190336611A1 (en) * 2016-06-09 2019-11-07 Curevac Ag Hybrid carriers for nucleic acid cargo

Also Published As

Publication number Publication date
EP3746129A4 (en) 2022-03-02
AU2019215157A1 (en) 2020-08-13
JP2021512865A (ja) 2021-05-20
WO2019152848A1 (en) 2019-08-08
IL276322A (en) 2020-09-30
US20200368254A1 (en) 2020-11-26
MX2020007944A (es) 2020-11-24
EP3746129A1 (en) 2020-12-09
KR20200115591A (ko) 2020-10-07
CN111954542A (zh) 2020-11-17
US20230405022A1 (en) 2023-12-21
CA3089826A1 (en) 2019-08-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR112020015796A2 (pt) nanocomplexos semelhantes a lipídios e usos dos mesmos
US10845368B2 (en) Nanoparticles for mitochondrial trafficking of agents
Yao et al. The antitumor efficacy of functional paclitaxel nanomicelles in treating resistant breast cancers by oral delivery
Siew et al. Enhanced oral absorption of hydrophobic and hydrophilic drugs using quaternary ammonium palmitoyl glycol chitosan nanoparticles
US8277847B2 (en) Lipidated glycosaminoglycan particles and their use in drug and gene delivery for diagnosis and therapy
Agrawal et al. Bioadhesive micelles of d-α-tocopherol polyethylene glycol succinate 1000: Synergism of chitosan and transferrin in targeted drug delivery
JP4390845B2 (ja) 薬物送達のためのポリマーミセル
Gao et al. Glutathione-responsive nanoparticles based on a sodium alginate derivative for selective release of doxorubicin in tumor cells
ES2369244T3 (es) Sistemas estables de nanocápsulas para la administración de moléculas activas.
JP2008537943A5 (pt)
Rao et al. Size-adjustable micelles co-loaded with a chemotherapeutic agent and an autophagy inhibitor for enhancing cancer treatment via increased tumor retention
US20220280522A1 (en) Telodendrimers with riboflavin moieties and nanocarriers and methods of making and using same
EP3037097A1 (en) Polyrotaxane and medicinal composition
Elkin et al. Non-covalent formulation of active principles with dendrimers: Current state-of-the-art and prospects for further development
Liu et al. pH-sensitive dual drug loaded janus nanoparticles by oral delivery for multimodal analgesia
Barani et al. Preparation, characterization, cytotoxicity and pharmacokinetics of niosomes containing gemcitabine: In vitro, in vivo, and simulation studies
Sun et al. Rational design of mixed nanomicelle eye drops with structural integrity investigation
JP2012515774A (ja) 薬剤化合物の溶解性を増加させるｐｅｇ−脂質抱合体
Marwah et al. Functionally engineered ‘hepato-liposomes’: Combating liver-stage malaria in a single prophylactic dose
Yang et al. Drug-free neutrally charged polypeptide nanoparticles as anticancer agents
Choi et al. Photosensitizer-mediated mitochondria-targeting nanosized drug carriers: subcellular targeting, therapeutic, and imaging potentials
He et al. Dimeric artesunate-choline conjugate micelles coated with hyaluronic acid as a stable, safe and potent alternative anti-malarial injection of artesunate
JP7497045B2 (ja) 脂質様ナノ複合体及びその使用
Nasr et al. p-Coumaric acid in poly (amidoamine) G4 dendrimer: Characterization and toxicity evaluation on zebrafish model
Kathpalia et al. Formulation strategies for effective delivery of Primaquine

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]
B06W Patent application suspended after preliminary examination (for patents with searches from other patent authorities) chapter 6.23 patent gazette]