KR101492168B1

KR101492168B1 - 양친매성 핵산분자, 이를 포함하는 핵산 복합체 및 이의 약물 전달체로서의 용도

Info

Publication number: KR101492168B1
Application number: KR20130047644A
Authority: KR
Inventors: 안형준; 권익찬; 최귀원
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2013-04-29
Filing date: 2013-04-29
Publication date: 2015-02-11
Also published as: KR20140129467A

Abstract

본 발명은 양친매성 핵산분자, 이를 포함하는 핵산 복합체 및 이의 약물 전달체로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 약물 전달체는 약물을 표적 세포 및 표적 조직에 선택적으로 전달할 수 있고 세포독성 문제가 없으며 세포투과 후에는 약물의 효과적인 세포질 방출이 가능하여 암 치료제, 세포기반 약물 스크리닝 방법 등에서 크게 응용될 수 있다.

Description

양친매성 핵산분자, 이를 포함하는 핵산 복합체 및 이의 약물 전달체로서의 용도{AMPHIPHILIC NUCLEIC ACID, NUCLEIC ACID COMPLEXES COMPRISING THE SAME AND THEIR USE IN THE DRUG CARRIER}

본 발명은 양친매성 핵산분자, 이를 포함하는 핵산 복합체 및 이의 약물 전달체로서의 용도에 관한 것이다.

DNA 나노테크놀로지는 DNA의 상호인식 능력 및 DNA 변형용이성을 이용하여 약물 전달체에 필수적인 약물봉입, 리간드 결합 등을 매우 정교한 나노스케일에서 디자인할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 특히 항암화학적 치료제로서 널리 알려진 독소루비신은 DNA에 쉽게 결합된다는 특징을 가지고 있기 때문에 DNA를 소재로 한 약물 전달체는 기존의 폴리머 혹은 리포좀 기반의 약물 전달체보다 우수한 약물 전달체로 기대를 받아 왔으며, 지난 십여년간의 연구결과물에서 DNA origami, DNA cage, DNAsome과 같은 DNA 나노파티클들은 질환의 예방과 치료를 위한 약물전달에 그 가능성을 충분히 보여주었다(Douglas SM et al., Science, 335; 831-4, 2012). 약물의 암 선택적 전달은 항암치료에 있어서 가장 중요한 위치를 차지하며 약물부작용을 줄이고 치료효과를 최대화할 수 있다는 점에서 중요하다. 이러한 암 선택적 약물전달을 위해서는 선택적 친화력을 가지는 리간드를 이용하여 약물 전달체를 개발하려는 노력이 활발하며, 압타머를 이용한 DNA 나노파티클의 세포선택성을 향상시키려는 연구가 알려져 있지만 아직까지 암 선택적 약물전달이 가능하도록 DNA 나노파티클을 디자인하는 것은 초기단계에 머물고 있는 것이 현실이다.

한편, tLyp-1 펩타이드는 세포투과성질과 Neuropilin-1(NRP-1) 막단백질 결합력을 지닌 tumor-homing peptide로 알려져 있으며 NRP-1 막단백질이 MDA-MB231, MDA-MB435 등과 같은 유방암세포에서 특이적으로 과량 발현되어 있으므로 이러한 암세포를 표적하기 위한 리간드로서 널리 사용되고 있다(Roth L et al., Oncogene; 31; 3754-63, 2012)

한편, 독소루비신은 DNA에 결합되는 성질을 지니고 있으므로 세포 내에 투과된 독소루비신은 핵으로 이동하여 DNA에 결합됨으로써 각종 생합성과정을 저해한다고 알려져 있다. 대표적으로는 DNA 전사과정에서 DNA supercoil 구조를 풀어주는 기능을 하는 topoisomerase II 효소의 작용을 방해함으로써 세포의 증식 혹은 사멸을 유도할 수 있다. 그러나 독소루비신은 세포 특이적인 선택성을 가지고 있지 않으면서 세포투과성이 우수하기 때문에 정상세포와 암세포를 구분하지 않고 모든 세포를 사멸하는 부작용이 심각하다. 따라서 정상세포에는 피해를 최소화하면서 암세포에만 약물을 전달할 수 있는 암 선택적인 전달체의 개발이 필요하며, 또한 세포투과 후에는 효과적인 세포질 방출이 가능한 효과적인 전달 시스템이어야 한다.

기존의 독소루비신 전달체로, 폴리머기반의 나노파티클 또는 리포좀기반의 약물 전달체가 주로 사용되었으나 세포독성 및 암세포특이성의 비효율성 등의 문제 때문에 새로운 전달체의 개발 요구가 대두되고 있는 실정이다.

본 발명은 약물을 표적 세포 및 표적 조직에 선택적으로 전달할 수 있고 세포독성 문제가 없으며 세포투과 후에는 약물의 효과적인 세포질 방출이 가능한 약물 전달 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 구현예는 5' 말단에 소수성 물질이 연결된 센스가닥 핵산분자와 5'말단에 표적 펩타이드가 연결된 안티센스가닥 핵산분자가 상보적으로 결합된 양친매성 핵산분자를 제공하고자 한다.

다른 일 구현예는 상기 핵산분자를 포함하는 나노크기의 핵산복합체를 제공하고자 한다.

또 다른 일 구현예는 상기 핵산 복합체의 제조방법을 제공하고자 한다.

또 다른 일 구현예는 상기 핵산 복합체와 약물을 포함하는 약물 전달체를 제공하고자 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 국한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 일 구현예는 5' 말단에 소수성 물질이 연결된 센스가닥 핵산분자와 5' 말단에 표적 펩타이드가 연결된 안티센스가닥 핵산분자가 상보적으로 결합된 양친매성 핵산분자를 제공한다.

다른 일 구현예는 상기 핵산분자를 포함하는 나노크기의 핵산복합체를 제공한다.

또 다른 일 구현예는 상기 핵산 복합체의 제조방법을 제공하며, 보다 구체적으로는 5' 말단에 소수성 물질이 연결된 센스가닥 핵산분자와 5' 말단에 표적 펩타이드가 연결된 안티센스가닥 핵산분자를 상보적 결합을 시켜 양친매성 핵산분자를 형성시키는 단계; 및 상기 양친매성 핵산분자를 자가조립 시키는 단계를 포함하는 핵산 복합체 제조방법을 제공한다.

또 다른 일 구현예는 상기 핵산 복합체와 약물을 포함하는 약물 전달체를 제공한다.

또 다른 일 구현예는 상기 약물 전달체를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

일 구현예는 5' 말단에 소수성 물질이 연결된 센스가닥 핵산분자와 5' 말단에 표적 펩타이드가 연결된 안티센스가닥 핵산분자가 상보적으로 결합된 양친매성 핵산분자를 제공한다.

상기 핵산분자는 퓨린염기 및/또는 피리미딘 염기, 당, 인산으로 이루어진 고분자물질을 말하며, 예컨대 상기 핵산분자는 디옥시리보핵산(DNA)일 수 있다.

상기 센스가닥 핵산분자와 안티센스가닥 핵산분자의 상보적 결합은 센스가닥 핵산분자의 염기의 전부 또는 일부와 안티센스가닥 핵산분자의 염기의 전부 또는 일부가 결합하여 이루어지며, 상기 염기 개수는 핵산복합체 제조 시 자가조립을 위하여 적절히 조절될 수 있다. 예컨대, 상기 센스가닥 핵산분자와 안티센스가닥 핵산분자의 상보적 결합의 염기 개수는 5 내지 30개일 수 있다.

상기 센스가닥 핵산분자의 염기개수는 핵산복합체 제조를 위해 적절히 조절될 수 있으며, 예컨대, 상기 센스가닥 핵산분자는 5 내지 50개의 염기로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 안티센스가닥 핵산분자의 염기개수도 핵산복합체 제조를 위해 적절히 조절될 수 있으며, 예컨대, 상기 센스가닥 핵산분자는 5 내지 50의 염기로 이루어질 수 있다.

표적으로 하는 암세포 또는 암조직에 효율적으로 전달되기 위하여, 상기 표적 펩타이드와 안티센스가닥 사이에 링커가 연결될 수 있다. 상기 링커는 스페이서(spacer) 부분과 관능기(functional group)를 포함할 수 있다. 상기 스페이서 부분이 너무 긴 경우에는 소수성 성질이 높아 사용될 수 없으므로, C1 내지 C6의 직쇄형 또는 분지형 알킬렌기, 바람직하게는 C1 내지 C6의 직쇄형 알킬렌기가 스페이서 부분으로서 적합하다. 예컨대, 상기 링커는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌, 또는 헥실렌일 수 있다. 상기 스페이서 부분과 표적 펩타이드를 연결시켜 주기 위하여 관능기가 도입되며, 상기 관능기는 표적 펩타이드와 연결시켜 주는 기로서 펩타이드와 결합할 수 있는 모든 작용기를 포함한다. 예컨대 상기 관능기는 아민기(-NH₂), 설프히드릴기(-SH, sulfhydryl) 일 수 있으며, 상기 관능기는 표적 펩타이드와 아미드 결합을 할 수 있다.

상기 소수성 물질은 친수성 핵산분자와 상호작용하여 리포좀 파티클을 형성하게 하는 기능을 한다. 보다 구체적으로, 수용액상에서 친수성 물질은 외부로 향하여 물분자와 접촉하는 반면에 소수성 물질은 물분자와 접촉하지 않으려 하므로 양친매성 핵산분자가 수용액상에 용해되어 있는 경우 소수성 물질은 물과 접촉하지 않고 친수성인 핵산분자는 물과 접촉하기 때문에 이중층의 막(double-layered membrane)을 형성하여 자발적으로 리포좀 구조를 형성하게 됨으로써 도 1a에 나타난 구조와 같이 리포좀 내부에 소수성 분자가 위치하여 물과의 접촉을 피하게 된다. 상기 소수성 물질은 콜레스테롤, 지방산(fatty acids), 및 콜렌산(cholenic acid)으로부터 선택된 1종 이상이 선택될 수 있다. 예컨대 상기 지방산으로 탄소개수가 13 내지 17개인 포화지방산 또는 탄소개수가 13 내지 17개인 불포화지방산일 수 있다.

상기 표적 펩타이드는 암세포를 표적하는 펩타이드로 공지된 모든 펩타이드를 포함한다. 예컨대, 상기 표적 펩타이드는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 펩타이드일 수 있다(표 1 참조).

서열번호	결합 수용체	아미노산 서열
3	NRP-1	CGNKRTR
4	integrin	GRGDSP
5	EphA	YSAYPDSVPMMS
6	CXCR4	KGVSLSYR
7	VGFR3	LTVLPW
8	IL-11	CGRRAGGSC
9	integrin	SVSVGMKPSPRP
10	VEGFR-3	CSDSWHYWC

다른 일 구현예는 상기 양친매성 핵산분자를 포함하는 나노크기의 핵산 복합체를 제공한다.

목표로 하는 표적 암세포 또는 암조직으로 약물을 효과적으로 전달하기 위해서는 우선 제거되지 않고 상당 기간 생체 내에 잔존할 수 있어야 한다. 따라서 상기 약물 전달체의 크기와 표면 특성은 중요하다.

상기 약물 전달체의 크기가 너무 작으면 결합되는 약물의 양이 불충분하게 되며, 너무 크게 되면 체내 순환시 장기 즉 간이나 비장에서 세망내피계에 위치하는 대식세포에 잡혀 제거된다.

따라서 생체내의 약물 전달효율을 높이기 위해, 상기 약물 전달체의 크기는 적절히 조절될 수 있다. 예컨대 상기 약물 전달체는 100 내지 500 nm의 입자지름을 가질 수 있다.

혈액 내에서 이온성 혹은 소수성 특성을 가진 나노입자는 피브로넥틴(fibronectin), 보체(complements), IgG 등과 같은 혈장 단백질들과의 정전기적 인력으로 인해 흡착되고(opsonization), 세망내피계의 대식세포에 의하여 인지되어 결과적으로 약물전달체는 포식 제거된다. 따라서 이러한 대식세포의 포식으로부터 벗어나기 위해서는 약물 전달체의 표면을 중성으로 만드는 것이 필수적이다.

따라서 생체내의 약물 전달효율을 높이기 위해, 상기 약물 전달체의 표면전하는 적절히 조절될 수 있다. 예컨대 상기 약물 전달체의 표면전하는 -30 내지 -1 mV 일 수 있다.

상기 약물과 핵산 복합체는 약물 효과를 극대화시키기 위하여 적절히 조절될 수 있다. 예컨대 상기 약물과 핵산 복합체는 1:1 내지 30:1, 또는 1:1 내지 7:1의 몰비(molar ratio)로 함유될 수 있다.

상기 약물 전달체는 pH 6.5 이하에서는 약물이 해리되는 것이 특징이다. 따라서 상기 약물 전달체는 세포투과 후 약물의 세포질 방출을 가능하게 한다.

상기 약물은 핵산분자에 결합되는 성질을 가진 모든 약물을 포함한다. 대표적으로 DNA에 삽입되는 성질을 가지는 안트라사이클린계(anthracycline) 약물이 상기 약물에 해당될 수 있으며, 상기 안트라사이클린계 약물로는 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin) 등이 포함된다. 따라서 일례로, 상기 약물은 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 및 이다루비신로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

또 다른 일 구현예는 5' 말단에 소수성 물질이 연결된 센스가닥 핵산분자와 5' 말단에 표적 펩타이드가 연결된 안티센스가닥 핵산분자를 상보적 결합을 시켜 양친매성 핵산분자를 제조하는 단계; 및 상기 양친매성 핵산분자를 자가조립 시키는 단계를 포함하는 핵산 복합체 제조방법을 제공한다.

상기 소수성 물질, 표적 펩타이드, 센스가닥, 안티센스가닥, 및 핵산분자에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다. 상기 표적 펩타이드와 안티센스가닥 사이에 링커가 연결될 수 있으며, 링커에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

상기 양친매성 핵산분자를 제조하는 단계에 있어서, 상기 센스가닥 핵산분자와 안티센스가닥 핵산분자의 상보적 결합은 센스가닥 핵산분자의 염기의 전부 또는 일부와 안티센스가닥 핵산분자의 염기의 전부 또는 일부가 결합하여 이루어지며, 상기 염기 개수는 핵산복합체 제조 시 자가조립을 위하여 적절히 조절될 수 있다. 예컨대, 상기 센스가닥 핵산분자와 안티센스가닥 핵산분자의 상보적 결합의 염기 개수는 5 내지 30개일 수 있다.

상기 자가조립 시키는 단계에 있어서, 양친매성 핵산분자는 앞서 설명한 바와 같이 소수성 물질과 친수성 물질의 상호작용에 의하여 리포좀을 형성하여 결과적으로 파티클을 형성하게 된다. 따라서, 양친매성 핵산분자는 수용액상 조건에서 핵산분자간의 상보적 서열에 의한 결합력 및 소수성 물질과 친수성 물질의 상호작용에 의하여 핵산 복합체를 형성하게 된다.

또 다른 일 구현예는 상기 약물 전달체를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 예컨대, 상기 약물 전달체는 10 내지 200mg/kg 범위로 포함되는 약학적 조성물일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 사람을 포함하는 포유동물에 비경구 투여를 포함한 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 비경구 투여는 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용할 수 있으며, 가장 바람직한 예로는 암세포가 있는 조직으로 약물이 전달되는 유일한 경로는 혈관이기 때문에 정맥 내 투여법(Intravenous admintration, I.V)을 이용하는 것이며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏당 0.1 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 암은 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 중피종, 식도암, 위암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종, 피부암 등을 포함한다.

본 발명의 약물 전달체는 약물을 표적 세포 및 표적 조직에 선택적으로 전달할 수 있고 세포독성 문제가 없으며 세포투과 후에는 약물의 효과적인 세포질 방출이 가능하여 암 치료제, 세포기반 약물 스크리닝 방법 등에서 크게 응용될 수 있다.

도 1의 A는 실시예 1.1에 따른 양친매성 DNA 및 핵산 복합체의 제조 모식도를 나타낸 것이며, B는 실시예 2.1에 따른 독소루비신의 DNA 결합현상을 나타낸 그림이다.
도 2는 실시예 1.1에 따른 양친매성 DNA를 구성하고 있는 센스가닥 DNA와 안티센스가닥 DNA의 양쪽 5’말단에 콜레스테롤과 tLyp-1 펩타이드가 결합되어 있음을 나타낸 그림이다.
도 3은 실시예 1.2에 따른 MALDI-TOF 질량분석을 통하여 DNA-Chol 및 DNA-pep의 분자량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 1.3에 따른 2% agarose gel 전기영동 결과를 나타낸 것으로 1번 레인은 핵산 복합체를, 2번 레인은 simple DNA duplex를, 3번 레인은 DNA 마커를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 2.2에 따른 나노입자 분석 시험 결과를 나타내 것으로, 실시예 1.1에서 제조된 핵산 복합체, simple DNA duplex, 펩타이드가 생략된 DNA-chol NP, Dox/c-DNA-p(1:1), Dox/c-DNA-p(5:1), Dox/c-DNA-p(7:1)의 수용액상에서의 사이즈, 강도, 표면전하를 나타낸 결과이다.
도 6은 실시예 3에 따른 pyrene emission spectra로부터의 형광강도비의 변화를 이용하여 핵산 복합체의 CMC을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 실시예 4.1에 따른 2% agarose gel 전기영동 결과를 나타낸 것이며, 도 7b는 Dox/c-DNA-p(7:1)를 14000rpm에서 1시간동안 원심분리를 한 전후 사진을 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 4.2에 따른 2% agarosoe gel 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 실시예 5에 따른 DNA thermal denaturation curve를 나타낸 것이다.
도 10a는 실시예 6.1에 따른 유세포 분석 결과를 나타낸 것으로서 MDA-MB231 유방암 세포 및 HFF 세포에서의 형광세기를 분석한 결과이다. 도 10b는 실시예 6.2에 따른 웨스턴 블롯 결과를 나타내 것이다. 도 10c는 실시예 6.3에 따른 Achroplan IR40 x/0.80W lens 및 Axiocam black and white CCD camera(Carl Zeiss)가 부착된 Axioskop2 FS plus imaging microscope (ZEISS)를 사용하여 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 실시예 7에 따른 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 실시예 8에 따른 MTT assay 결과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 양친매성 핵산분자 및 핵산 복합체

1.1 제조

도 1에 나타난 바와 같이 핵산 복합체를 구성하는 양친매성 핵산분자를 제조하였다. 구체적으로 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 센스가닥 DNA (5'- CCATGTGACTGCCGCTGTTGTTTCTGTAGCGAACGC-3') 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 안티센스가닥 DNA(5'-GCCAGCGCGTTCGCTACAGAAACAACA-3')을 결정하였으며, 7개 아미노산을 사용하여 표적 펩타이드로서 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 tLyp-1 펩타이드(CGNKRTR)를 디자인하였다(도 2). ㈜바이오니어에 의뢰하여 서열번호 1로 표시되는 센스가닥 DNA의 5’ 말단에는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 콜레스테롤((3β)-cholest-5-en-3-ol)이 결합되도록 하여 DNA-콜레스테롤 콘쥬게이트(이하, DNA-Chol로 명명)를 제조하였으며, 서열번호 2로 표시되는 안티센스가닥 DNA의 5’ 말단에는 spacer arm (CH₂)₆이 연결되고 그 끝에 amine group이 삽입되도록 합성하였다. 5’ 말단에 amine group이 도입된 안티센스가닥 DNA와 tLyp-1 펩타이드는 EDC coupling 반응에 의하여 amine group과 tLyp-1 펩타이드의 carboxylic acid가 결합되도록 PBS 버퍼(pH 7.4)에서 1 시간동안 반응시켜 DNA-tLyp-1 콘쥬게이트(이하, DNA-pep로 명명)를 제조하였다. DNA-Chol 및 DNA-pep를 결합시켜 양친매성 DNA를 제조하였다.

상기와 같이 제조된 DNA-Chol 및 DNA-pep에서 센스가닥 DNA와 안티센스 가닥 DNA간에 서로 상보적인 DNA 서열 21 쌍에 의하여 DNA-Chol 및 DNA-pep를 양친매성 DNA로 결합시켰는데, 센스가닥 DNA와 안티센스가닥 DNA의 결합을 최적화하기 위하여 0.5 μM 농도의 DNA-Chol 및 0.5 μM 농도의 DNA-pep를 PBS 버퍼에서 섞은 혼합물을 95℃에서 1분간 열처리를 하고 상온에서 2시간에 걸쳐 냉각시켰다. 상기 과정으로 양친매성 DNA는 양 말단에 존재하는 소수성의 콜레스테롤과 친수성의 DNA 및 펩타이드 성질에 의하여 양친매성 성질을 가지게 되며 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na₂HPO₄-7H₂O, 1.4mM KH₂PO₄의 조성을 가지는 PBS 버퍼에서 자가조립을 시켜 나노파티클의 형상을 가지는 핵산 복합체(c-DNA-p)를 형성하였다.

1.2 질량분석

상기 실시예 1.1의 DNA-Chol 및 DNA-pep를 MALDI-TOF 질량분석기로 질량분석 하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3은 DNA-Chol 및 DNA-pep의 질량분석 결과 그래프를 나타낸 것으로 DNA-Chol의 분자량은 12569.00 Da로 측정되었고 DNA-pep의 분자량은 10427.32 Da로 측정되었다. 질량측정값들은 DNA-Chol의 이론적인 분자량 12644.35 Da 및 DNA-pep의 이론적인 분자량 10438.00 Da과 유사한 값을 보여 각각의 콘쥬게이트가 합성되었음을 확인하였다.

1.3 전기영동 분석

양친매성 핵산분자의 제조를 확인하기 위해서, 센스가닥과 안티센스가닥의 5'말단에 콜레스테롤 및 펩타이드가 연결되지 않은 DNA 이중체(이하, simple DNA duplex로 명명)와 실시예 1.1에서 제조된 핵산 복합체를 2% agarose gel에 전기영동시켰고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4는 상기 전기영동시킨 결과로 1번 레인은 핵산 복합체를, 2번 레인은 simple DNA duplex의 결과를 의미하며 3번 레인은 DNA 마커를 나타낸 것이다.

도 4에 나타난 바와 같이, 핵산 복합체가 simple DNA duplex 분자량보다 훨씬 증가된 분자량을 보임에 따라 수용액상에서 핵산 복합체가 성공적으로 제조되었음을 확인하였다.

실시예 2. 약물 전달체

2.1. 약물전달체 제조

핵산 복합체를 형성하는 양친매성 DNA에 독소루비신이 결합되는 성질, 구체적으로 독소루비신에서 평면의 aromatic chromophore 부위가 DNA의 두 base pair 사이에 결합되는 원리를 이용하여(Glen E. Kellog et al., Nucleic acids research 1998, Vol. 26, No. 20, 4721-4732) 독소루비신과 상기 실시예 1.1에서 제조된 핵산 복합체를 몰비(molar ratio) 7:1로 결합시켜 c-DNA-p와 독소루비신을 결합시킨 약물 전달체(이하, Dox/c-DNA-p(7:1)로 명명)를 제조하였다.

또한, 상기 실시예 1.1에서 제조된 핵산 복합체와 독소루비신의 몰비가 각각 1:1 또는 5:1인 것을 제외하고는 상기 몰비 7:1인 Dox/c-DNA-p(7:1)와 동일한 방법으로 독소루비신이 결합된 약물 전달체(이하, Dox/c-DNA-p(1:1)로 명명) 및 (이하, Dox/c-DNA-p(5:1)로 명명)를 제조하였다.

2.2 나노입자 분석 시험

상기 실시예 1.1에서 제조된 핵산 복합체(c-DNA-p), simple DNA duplex, 펩타이드가 생략된 양친매성 DNA로 형성된 핵산 복합체(이하, DNA-chol NP로 명명), 상기 실시예 2.1에서 제조된 Dox/c-DNA-p(1:1), Dox/c-DNA-p(5:1), Dox/c-DNA-p(7:1)를 DLS(Dynamic Light Scattering) 나노입자분석기를 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5는 상기 6개의 측정대상을 DLS 나노입자분석기를 이용하여 지름(nm), 강도(%) 및 표면전하(mV)를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 5에 나타난 바와 같이, DLS 나노입자분석기를 이용하여 측정한 결과 핵산 복합체(c-DNA-p)는 약 242.2 nm 지름을 나타내었으나, 나노 파티클을 형성하지 못하는 simple DNA duplexes의 사이즈는 약 10.8 nm를 나타내었다. 또한, DNA-chol NP은 수용액상에서 약 221.8 nm 지름의 나노파티클을 형성함을 확인하였고, Zeta potential 측정에서 핵산복합체(c-DNA-p)는 약 -24.9 mV의 표면전하를 보였으나 simple DNA duplex의 경우 -70.2 mV임을 확인하였다. 이는 펩타이드가 생략된 양친매성 DNA가 PBS 버퍼의 수용액상에서 나노파티클을 형성한다는 것과 적어도 콜레스테롤이 DNA에 결합되어 있다는 것을 입증하여 준다. 또한 펩타이드가 결합되지 않았다면 표면전하가 -70 mV 근처이지만 펩타이드가 결합할 경우 펩타이드의 pI 값에 의하여 표면전하가 -24.9 mV인 것에 비추어 콜레스테롤 및 펩타이드 모두 결합해 있음을 나타낸다. 강도는 사이즈 측정의 정확도를 나타내는 지표로, 강도가 높을수록 측정값이 정확하므로 상기 결과가 정확하다는 것을 나타낸다.

실시예 3. 핵산 복합체의 CMC 측정

상기 실시예 1.1에서 제조한 핵산 복합체(c-DNA-p)의 CMC(critical micelle concentration) 측정을 위하여 피렌(pyrene)을 프로브로 사용하였다. 1.0 x 10^-2 nM ~ 10μM 사이의 농도범위에서 15개의 서로 다른 농도의 핵산 복합체 샘플에 피렌을 첨가하여 339 nm 파장에서 excitation 시키고 emission 스펙트럼으로부터 형광 강도 비율 (I339/I334)를 핵산 복합체 농도에 대하여 plot하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6은 형광강도 비율 (I339/I334)을 핵산 복합체(c-DNA-p) 농도에 대하여 플롯하였을 때, 농도가 증가할수록 형광 excitation spectra의 red shift가 발견되었고 이것은 pyrene 분자가 물 환경에서 수소성의 micelle 환경으로 전이되었다는 것을 나타낸 것으로, 이때 형광강도 비율 (I339/I334)에서의 급격한 변화점이 CMC 값에 해당되며, CMC 값은 160 nM임을 나타낸 것이다.

도 6에 나타난 바와 같이, 형광강도 비율에서의 급격한 변화지점으로부터 계산된 CMC 값은 160 nM을 나타내었다. 이는 160 nM 이상의 농도에서 리포좀 구조의 나노파티클을 형성한다는 것을 나타낸다.

또한, 실시예 2.2와 동일한 방법으로 Dynamic light scattering를 통해 측정한 결과에서도 160 nM 미만에서는 나노파티클의 형성을 확인할 수 없었다. 이는 CMC 농도 이상에서만 나노파티클이 형성되며, 그 미만의 농도에서는 형성되지 않는 것을 나타낸다.

실시예 4. 핵산 복합체와 독소루비신 결합력 조사

4.1 몰비에 따른 독소루비신 결합력 조사

상기 실시예 1.1에서 제조된 핵산 복합체(c-DNA-p)에 독소루비신을 결합하여 독소루비신과 핵산 복합체의 결합력을 조사하였다. 핵산 복합체에 결합하는 독소루비신의 몰비를 결정하기 위하여, 핵산 복합체 농도를 고정한 상태에서 독소루비신의 농도를 증가시키면서 독소루비신 결합량을 2% agarose gel에서 전기영동으로 분석하였고, 형광을 발광하는 chromophore를 갖는 독소루비신의 형광세기는 12 bit CCD 카메라를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 도 7a에 나타내었다.

도 7a은 12 bit CCD camera (Kodak Image Station)에 의하여 형광이미지로 영상화한 결과를 나타낸 것으로, 대조군으로는 독소루비신만을 전기영동한 lane을 사용하였다.

도 7a에 나타난 바와 같이, 결합에 참여하는 독소루비신과 참여하지 못하는 독소루비신의 밴드 이동력의 차이가 뚜렷이 구분되었으며, 독소루비신과 핵산 복합체의 약 7:1의 몰비에서 대부분의 독소루비신이 핵산 복합체와 결합됨을 확인하였다.

핵산 복합체를 14000rpm에서 1시간동안 원심분리할 경우 핵산 복합체가 바닥에 침전되는 현상을 이용하여, Dox/c-DNA-p(7:1)를 14000rpm에서 1시간동안 원심분리하였고, 그 결과를 도 7b에 나타내었다. 도 7b에서 1은 원심분리 전을 나타내고 2는 원심분리 후를 나타낸 것이다.

도 7b에 나타난 바와 같이, 원심분리할 경우 상층부에서는 독소루비신이 검출되지 않고 바닥의 침전에서만 독소루비신이 검출됨으로써 독소루비신과 핵산 복합체가 7:1의 molar ratio로 결합함을 확인하였다.

4.2 pH 에 따른 독소루비신 결합력 조사

핵산 복합체(c-DNA-p)의 pH에 따른 독소루비신과의 결합력을 조사하기 위하여 약물 전달체를 실시예 2.1과 동일한 방법으로 pH 7.4, 6.5, 6.0, 5.5, 5.0 조건(하기 표 2)하에서 제조한 후 2% agarosoe gel 전기영동을 수행하였고, 결합 또는 해리되는 독소루비신의 형광 밴드 강도는 Kodak Image Station을 이용하여 영상화 및 정량화(mean ± SE (n = 5))하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8은 결합 또는 해리되는 독소루비신의 형광 밴드 강도를 영상화 및 정량화한 결과를 나타낸 것이다.

pH	조성
7.4	PBS buffer (7.4)
6.5	20 mM sodium phosphate buffer (6.5), 100 mM NaCl
6	20 mM sodium phosphate buffer (6.0), 100 mM NaCl
5.5	20 mM sodium acetate buffer (5.5), 100 mM NaCl
5	20 mM sodium acetate buffer (5.0), 100 mM NaCl

도 8에 나타난 바와 같이, 중성인 pH 7.4에서는 핵산 복합체가 독소루비신과 대부분 결합하였으나 pH 6.5에서는 결합되어있는 독소루비신이 핵산 복합체로부터 해리되기 시작함을 나타내었고, 조금 더 산성조건인 pH 5.5에서는 결합된 독소루비신의 약 30%가 해리됨을 나타내었다. 또한 pH 5.0의 조건에서는 대부분의 독소루비신이 해리된 상태임을 나타내었다. 이러한 결과는 엔도좀 또는 리소좀과 같은 산성조건에서 핵산 복합체가 독소루비신과의 결합력이 감소됨을 암시하며 이러한 pH 의존적인 결합력은 세포투과 후 독소루비신의 세포질 방출을 가능하게 해줄 것으로 예상된다.

실시예 5. 온도에 따른 안정성 조사

DNA의 double helix 구조는 특정온도이상에서 각각의 가닥(strand)으로 해리되는 현상이 있으며 이러한 온도를 melting temperature라고 부른다. UV 260 nm 파장에서 DNA의 흡광도를 측정하면 double helix와 한 가닥(single strand)의 흡광도 값이 다르다는 것을 이용하여 온도를 변화시키면서 흡광도를 측정한다면 helix가 가닥으로 구조적 변화를 일으키는 온도를 알 수 있으며, melting temperature가 높은 경우 DNA double helix 구조가 안정하다는 것을 의미한다. 따라서 이를 이용하여 핵산 복합체 형성에 필수적인 양친매성 DNA를 형성하는 과정을 DNA melting temperature 측정을 통해 조사하였다. 구체적으로 simple DNA duplex, 실시예 1.1에서 제조된 핵산 복합체, 실시예 2.1에서 제조된 약물전달체들(Dox/c-DNA-p(1:1)), (Dox/c-DNA-p(5:1)), (Dox/c-DNA-p(7:1))을 UV spectrophotometer(파장 260nm)로 측정하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9는 simple DNA duplex, 실시예 1.1에서 제조된 핵산 복합체, 실시예 2.1에서 제조된 약물전달체들(Dox/c-DNA-p(1:1)), (Dox/c-DNA-p(5:1)), (Dox/c-DNA-p(7:1))의 온도에 따른 파장 260nm에서의 DNA thermal denaturation curve을 나타낸 것이다.

도 9에 나타난 바와 같이, simple DNA duplex는 약 65℃에서 단일가닥으로 해리됨을 나타내었고, 핵산 복합체는 약 60℃에서 단일가닥으로 해리됨을 나타내었다. 하지만 약물전달체는 1:1에서 7:1의 몰비 범위에서 공통적으로 약 68 ℃의 melting temperature를 나타내었고 이것은 핵산 복합체에 독소루비신이 결합되었을 때 조금 더 안정적인 구조가 됨을 나타낸다.

실시예 6. 약물 전달체의 암세포 선택성 조사

약물 전달체가 암세포에 선택적으로 결합하고 정상세포에는 결합하지 않는 것을 ATCC에서 얻은 MDA-MB231 유방암 세포와 HFF (Human Foreskin Fibroblast) 세포를 이용하여 조사하였다

6.1 유세포 분석( flow cytometry )

NRP-1 positive한 성질을 가지는 MDA-MB231 유방암세포 및 NRP-1 negative한 성질을 가지는 HFF 정상세포에 대하여 FACS (fluorescence activated cell analysis) (FC-500 flow cytometer, Beckman Coulter, Miami, FL)을 이용하여 Dox/c-DNA-p의 세포투과 효능을 조사하였다. 구체적으로, 실시예 2.1에서 제조된 약물 전달체 Dox/c-DNA-p (1 uM)을 세포에 37℃에서 1시간동안 처리한 후 세포를 PBS 버퍼로 두 번 세척하고 trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid 처리를 하여 세포를 떼어낸 후 PBS 버퍼에 담았다. 약 만개의 세포를 FACS 실험에 사용하였으며 독소루비신이 637nm에서 excitation되고 675nm에서 emission되는 것을 이용하여 세포투과를 관찰하였다. 데이터는 CXP 소프트웨어를 이용하여 얻었으며, 대조군으로 PBS 버퍼만을 처리한 세포를 비교하였고, 그 결과를 도 10a에 나타내었다.

도 10a는 Dox/c-DNA-p가 MDA-MB231 유방암세포에 선택적으로 결합하고 투과되는 것을 보여주고 있으나 HFF 정상세포에서는 그러한 선택적 결합과 투과현상이 나타나지 않는 것을 나타낸 것으로, 가는 실선은 대조군으로 PBS 버퍼만을 처리한 세포를 의미하며, 두꺼운 실선은 1 μM Dox/c-DNA-p를 처리한 세포를 의미한다.

도 10a에 나타난 바와 같이, MDA-MB231 유방암 세포에서만 독소루비신의 형광세기가 관찰되었으며 이는 약물 전달체가 암세포에만 선택적으로 결합함을 나타낸다.

6.2 웨스턴 블롯

MDA-MB231 유방암 세포와 HFF 세포를 각각 lysis buffer ((1% SDS, 10% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol, 0.001% bromophenol blue, 50 mM Tris/HCl, pH 6.8)를 이용하여 파쇄하였다. 약 10 μg의 샘플을 18% SDS PAGE gel에 전기영동을 한 후 nitrocellulose membrane에 옮기고 anti-NRP-1 항체 (Cell Signaling Technology)를 이용하여 항체반응을 실시하였다. TBST로 15분씩 4회 세척한 후 2차항체용액에 넣어 30분간 shaking하면서 ELC 반응을 시켜 단백질 밴드를 확인하였고, 그 결과를 도 10b에 나타내었다.

도 10b는 MDA-MB231 유방암세포와 HFF 정상세포가 각각 NRP-1 protein에 대하여 positive 및 negative하다는 것을 NRP-1 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 결과로 나타낸 것이다.

도 10b에 나타난 바와 같이, MDA-MB231 유방암 세포에서 과량의 NRP-1 막단백질이 발현되었음을 나타내었는데, 이는 약물 전달체의 표면의 tLyp-1 펩타이드가 NRP-1 막단백질과 결합하여 암세포에 선택적인 결합력을 가짐을 보여주는 것이다.

6.3 형광 현미경을 이용한 세포투과 실험

약물 전달체(Dox/c-DNA-p), Dox/DNA-chol, 독소루비신이 결합된 scramble tLyp-1를 사용한 핵산 복합체(이하, Dox/scramble c-DNA-p로 명명) 1 μM를 각각 MDA-MB231 유방암 세포에 처리하였으며, 또한 화학적으로 합성된 tLyp-1 펩타이드를 100배 고농도로 MDA-MB231 유방암 세포에 선처리한 후 약물 전달체(tLyp-1 preincub. + Dox/c-DNA-p) 1 μM를 MDA-MB231 유방암 세포에 처리하였다. 비교군으로 독소루비신(Dox) 및 약물 전달체(Dox/c-DNA-p) 1 μM를 각각 HFF 세포에 처리하였으며, 상기 세포들을 Achroplan IR40 x/0.80W lens 및 Axiocam black and white CCD camera(Carl Zeiss)가 부착된 Axioskop2 FS plus imaging microscope (ZEISS)를 사용하여 관찰하였고, 그 결과를 도 10c에 나타내었다.

도 10c의 1 내지 4는 Dox/c-DNA-p, Dox/DNA-chol, Dox/scramble c-DNA-p, tLyp-1 preincub. + Dox/c-DNA-p를 1시간 동안 처리한 MDA-MB231 유방암세포의 형광현미경 이미지를 나타낸 것으로, 붉은 신호는 독소루비신, 파란 신호는 DAPI로 염색된 핵을 나타낸다. 도 10c의 5 및 6은 대조군으로 HFF 정상세포에 독소루비신만을 처리한 형광현미경 이미지를 나타낸 것이다. 오른쪽 하단의 그래프는 세포내의 독소루비신의 형광강도를 정량화한 것으로, 각 실험마다 서로 다른 3개의 샘플을 테스트하였으며, 이미지 분석을 위하여 약 100개의 세포가 매 실험마다 임의적으로 선택하였고, 그 결과로서 mean ± SE (n=300)으로 표시하였다.

도 10c에 나타난 바와 같이, 약물 전달체(Dox/c-DNA-p)는 효과적으로 MDA-MB231 유방암 세포에 세포투과됨을 나타내었으나, Dox/DNA-chol 및 Dox/scramble c-DNA-p에서는 세포투과율이 현저히 감소함을 나타내었다. 비교군으로 정상세포인 HFF 세포에서는 독소루비신(Dox) 자체는 이미 알려진 것처럼 매우 우수한 세포투과를 나타내었으나, 약물 전달체(Dox/c-DNA-p)의 경우 HFF 세포에 투과되지 않음을 나타내었다. 이는 HFF 세포에서는 NRP-1 막단백질이 상대적으로 적기 때문에 tLyp-1 펩타이드에 의한 세포투과가 일어나지 않음을 나타낸다. 또한 화학적으로 합성된 tLyp-1 펩타이드를 세포에 100배 고농도로 선처리한 후 약물 전달체를 세포에 처리한 경우에, MDA-MB231 유방암 세포에서는 독소루비신의 세포내 투과가 현저히 감소함을 나타내었다. 이는 tLyp-1 펩타이드 선처리에 의하여 포화된 세포표면의 NRP-1 막단백질이 전달체와 결합되기 어렵기 때문으로 보인다.

상기 실시예 6.1 내지 6.3의 실험결과들은 공통적으로 약물 전달체가 암세포 선택적인 세포결합 및 세포투과 능력이 있으며 이는 전달체 표면에 존재하는 tLyp-1 펩타이드와 암세포 표면에 존재하는 NRP-1 막단백질 사이의 상호작용 때문인 것으로 이해된다.

실시예 7. 약물 전달체의 세포투과 메커니즘 조사

약물 전달체의 세포투과 메커니즘을 규명하기 위하여 MDA-MB231 유방암 세포를 각각 early endosome 마커인 Rab5a 및 late endosome 마커인 lysotracker로 염색한 후 SYBR Green 형광염료로 표지한 약물 전달체(Dox/ c-DNA-p)를 처리하여 실시예 5.3에서 사용한 형광 현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11의 A는 MDA-MB231 유방암세포에 Rab5a (CellLightTM Early Endosomes-GFP)를 처리하고 24시간 후 형광염료 SYBR Green가 표지된 c-DNA-p를 처리한 형광 이미지로 파란색은 DAPI, 붉은색은 Rab5a, 초록색은 SYBR Green-labeled c-DNA-p, 오렌지색은 c-DNA-p와 early endosomal marker의 colocalization을 나타낸다. 도 11의 B는 MDA-MB231 유방암세포에 50 nM Lysotracker dye와 함께 SYBR Green-labeled c-DNA-p를 처리한 형광 이미지로 파란색은 DAPI, 붉은색은 Lysotracker, 초록색은 SYBR Green-labeled c-DNA-p를 나타낸다.

도 11에 나타난 바와 같이, 약물 전달체는 early endosome 마커 및 early endosome 마커와 동일위치에 발견되었고, 이는 약물 전달체가 엔도사이토시스에 의하여 세포투과한 후 초기에는 엔도좀에 갇혀 있으며 시간이 지날수록 리소좀에 도달한다는 것을 나타낸다. 또한 도 8에 나타난 바와 같이, 약물 전달체는 산성조건을 이용하여 독소루비신을 세포질로 방출할 수 있으므로 엔도좀 또는 리소좀의 산성조건은 독소루비신을 세포질로 방출시켜 핵으로 이동 후 세포사멸을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 8. 약물 전달체에 의한 암세포 사멸 조사

약물 전달체를 이용한 독소루비신의 암세포 사멸 효과를 MDA-MB231 유방암 세포와 HFF 정상세포에 대한 MTT assay를 통해 비교하였다.

MDA-MB231세포에 각각 약물 전달체, Dox/scramble c-DNA-p, 독소루비신(Dox)를 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 uM의 다양한 농도로 처리하였고, HFF에 각각 약물 전달체, Dox/scramble c-DNA-p, 독소루비신(Dox)를 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 uM의 다양한 농도로 처리하였고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12는 MDA-MB231 유방암 및 HFF 세포에 다양한 농도로 각각 MDA-MB231세포에 각각 약물 전달체, Dox/scramble c-DNA-p, 독소루비신(Dox)을 처리하였을 때의 세포 생존도(cell viability)를 나타낸 것이다.

도 12에 나타난 바와 같이, MDA-MB231 유방암 세포에서는 약물 전달체의 IC₅₀ 값은 3 μM이었고 비교군으로 사용한 독소루비신(Dox)의 IC₅₀ 값인 4 μM과 비교시에 유사한 세포독성을 나타내었다. 반면 Dox/scramble c-DNA-p는 세포독성을 나타내지 않았다. 정상세포인 HFF 세포에서는 독소루비신(Dox)의 IC₅₀ 값이 7 μM인 반면, 약물 전달체의 세포독성은 나타내지 않았다. Dox/scramble c-DNA-p는 세포독성을 나타내지 않았다. 이러한 세포독성 결과는 약물 전달체가 암세포에만 선택적으로 독소루비신을 전달하여 세포사멸을 유도한다는 것을 나타낸다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> AMPHIPHILIC NUCLEIC ACID, NUCLEIC ACID COMPLEXES COMPRISING THE SAME AND THEIR USE IN THE DRUG CARRIER <130> DPP20130561KR <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand <400> 1 ccatgtgact gccgctgttg tttctgtagc gaacgc 36 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand <400> 2 gccagcgcgt tcgctacaga aacaaca 27 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tLyp-1 peptide <400> 3 Cys Gly Asn Lys Arg Thr Arg 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD peptide <400> 4 Gly Arg Gly Asp Ser Pro 1 5 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YSA peptide <400> 5 Tyr Ser Ala Tyr Pro Asp Ser Val Pro Met Met Ser 1 5 10 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCR4 target peptide <400> 6 Lys Gly Val Ser Leu Ser Tyr Arg 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VGFR3 target peptide <400> 7 Leu Thr Val Leu Pro Trp 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-11 target peptide <400> 8 Cys Gly Arg Arg Ala Gly Gly Ser Cys 1 5 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> integrin target peptide <400> 9 Ser Val Ser Val Gly Met Lys Pro Ser Pro Arg Pro 1 5 10 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFR-3 target peptide <400> 10 Cys Ser Asp Ser Trp His Tyr Trp Cys 1 5

Claims

5' 말단에 콜레스테롤이 연결된 센스가닥 DNA(deoxyribonucleic acid)와
5' 말단에 표적 펩타이드가 연결된 안티센스가닥 DNA가 상보적으로 결합된, 양친매성 핵산분자.
제1항에 있어서, 상기 표적 펩타이드와 안티센스가닥 사이에 링커가 연결된 것인 양친매성 핵산분자.
제2항에 있어서, 상기 링커는 스페이서(spacer)부분 및 관능기를 포함하며,
상기 스페이서 부분은 C1 내지 C6의 직쇄형 알킬렌기이며,
상기 관능기는 아민기(-NH₂) 또는 설프히드릴기(-SH)인, 양친매성 핵산분자.
삭제
제1항에 있어서, 상기 표적 펩타이드는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것인 핵산분자.
삭제
제1항에 있어서, 상기 센스가닥 DNA와 안티센스가닥 DNA는 5 내지 50의 염기로 이루어지는, 핵산분자.
제1항 내지 제3항, 제5항 및 제7항 중 어느 한 항의 핵산분자를 포함하는 나노크기의 핵산 복합체.
제8항의 핵산 복합체와 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 및 이다루비신(idarubicin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 약물을 포함하는 약물 전달체.
제9항에 있어서, 상기 약물 전달체는 100 내지 500 nm의 입자지름을 가지는 것인 약물 전달체.
제9항에 있어서, 상기 약물 전달체의 표면전하는 -30 내지 -1 mV인 약물 전달체.
제9항에 있어서, 상기 약물과 핵산 복합체는 1:1 내지 30:1의 몰비(molar ratio)로 함유되는 것인 약물 전달체.
삭제
제9항에 있어서, 상기 약물과 핵산 복합체의 결합은 pH 6.5 이하에서는 해리되는 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
5' 말단에 콜레스테롤이 연결된 센스가닥 DNA와 5' 말단에 표적 펩타이드가 연결된 안티센스가닥 DNA를 상보적 결합을 시켜 양친매성 핵산분자를 제조하는 단계; 및 상기 양친매성 핵산분자를 수용액상 또는 PBS(Phosphate-Buffered Saline) 버퍼에서 자가조립 시키는 단계를 포함하는 핵산 복합체 제조방법.
제15항에 있어서, 상기 표적 펩타이드와 안티센스가닥 사이에 링커가 연결된 것인, 핵산 복합체 제조방법.