CN1535163A - 核酸传递系统 - Google Patents

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Abstract

αvβ3整联蛋白受体靶向脂质体包含阳离子两性分子(例如阳离子脂质)、中性脂质和靶向脂质。所述靶向脂质包括非肽αvβ3整联蛋白拮抗剂。

Description

核酸传递系统
相关申请的交叉引用
本申请要求2001年10月29日递交的专利序列号60/345,89l的美国临时申请和2001年5月30日递交的专利序列号60/294,309的美国临时申请的优先权。
政府权利
本发明受美利坚合众国政府国立卫生研究院的政府支持，资助号为1 R37 CA50286和1 R01 CA86312；美国政府对本发明拥有一定权利。
发明领域
本发明涉及基因和类似核酸传递至体内靶点。更具体地说，本发明涉及由脂质体介导的基因向血管生成血管(angiogenic blood vessel)的传递。
发明背景
整联蛋白是一类已知结合胞外基质蛋白的细胞受体，因此介导一般称为细胞粘附事件的细胞-细胞和细胞-胞外基质相互作用。尽管文献中描述了许多整联蛋白及结合整联蛋白的配体，但大部分整联蛋白的生物学功能仍令人困惑。整联蛋白受体构成了一个蛋白家族，其共有结构特征是由α和β亚单位形成非共价异二聚体糖蛋白复合物，Cheresh & Mecham编辑，整联蛋白；与胞外基质的分子生物学反应，Academic Press，Inc.，San Diego，CA 92101(1994)，Horton，Int.J.Exp.Pathol.，71：741-759(1990)。这些整联蛋白在组织内的许多细胞相互作用中所起的特异性细胞粘附作用仍在研究之中。
内皮-基质的相互作用在形成新生血管的血管发生过程中起作用。称为αVβ3整联蛋白的细胞粘着受体位于参与血管发生的活性内皮细胞表面。
众所周知，血管发生还是恶性肿瘤生长和转移的必要条件。在没有血管发生的情况下，局部肿瘤扩张受到抑制。此外，已知特异性血管发生标志αVβ3整联蛋白的表达与肿瘤分级有关。
现在已发现携带非肽整联蛋白拮抗剂作为靶向药物的阳离子脂质体可传递核酸(例如基因)至血管生成血管。根据需要适当选择的核酸可抑制或促进血管生长，因此提供一种治疗血管发生依赖性疾病的方法。
发明概述
本发明提供包含非肽整联蛋白受体拮抗剂和核酸的靶向脂质体。这些靶向脂质体当全身或局部导入时，有效地将核酸(例如基因、反义寡核苷酸序列、DNA、RNA等)选择性传递至预定的靶点，例如体内的血管生成血管。选定核酸可以此方式传递至血管生成血管，以介导血管内皮细胞吸收核酸进行表达或反义传递。可以实现对新生血管生长的破坏。此外，如有需要，通过适当选择要传递的核酸，可诱导新生血管生长。
更具体地说，αVβ3整联蛋白受体靶向脂质体是一种大小不超过约100nm的纳米颗粒，其为单层或多层囊泡，包含阳离子两性分子(例如阳离子脂质)、中性脂质、具有αVβ3整联蛋白靶向结构域和疏水结构域的靶向脂质以及核酸(例如基因、反义寡核苷酸序列、DNA序列、RNA序列等)。所述靶向脂质体还可选地包含中性脂质。在所述靶向脂质中，靶向结构域可直接与疏水结构域相连。或者，所述靶向结构域可共价结合至亲水连接结构域(表面连接体)，其再共价结合至疏水结构域。所述核酸可与脂质体中存在的阳离子两性分子复合。所述靶向结构域包含非肽αVβ3整联蛋白拮抗剂。
在所述靶向脂质体中，基于脂质体中脂质的总摩尔数，阳离子两性分子(例如阳离子脂质)的存在量为约1至约50mol％，靶向脂质的靶向结构域的存在量为约1至约20mol％。构成靶向脂质体的脂质在其各自的疏水部分可具有寡聚化和/或多聚化功能基团，存在于脂质体中的所述脂质的至少一部分可通过所述基团互相交联。如有需要，阳离子脂质还可具有可交联基。或者，阳离子脂质可没有可交联基。
本发明的靶向脂质体可用于传递核酸来治疗癌症、炎症、眼病等。所述靶向脂质体还可用于传递基因来鉴别血管中的治疗标靶。
本发明的靶向脂质体为多点结合(multibinding)纳米颗粒，不大于约250nm，优选约40至约100nm，包含阳离子脂质或细胞转染剂连同与之复合的核酸。优选的靶向脂质可表示为L-X-K，其中L为靶向结构域，例如整联蛋白受体拮抗剂(如αVβ3受体拮抗剂)等，X为用作疏水结构域K表面连接体的亲水结构域。或者，所述靶向脂质可表示为L-K，其中靶向结构域L直接结合至疏水结构域K。
适于本发明目的的非肽整联蛋白受体拮抗剂L在生理pH值为具有阳离子基团和阴离子基团的两性离子，可作用于或结合整联蛋白受体。阳离子基团和阴离子基团通过间隔基(例如二价芳基)互相分开。受体拮抗剂分子上阳离子基团和阴离子基团之间的间距为约10至约100埃，可由烷氧基苯甲酸、双环或三环化合物、螺环化合物等产生，条件是由其分开的阳离子基团和阴离子基团可在生理pH值下与整联蛋白受体相互作用。合适的整联蛋白受体拮抗剂可图示如下：
说明性的非肽αVβ3受体拮抗剂以下式表示：
Figure A0281496600101
其中游离氨基(NH2)可用于使所述拮抗剂直接或通过表面连接基共价结合至脂质体的疏水结构域。
美国专利笫5,561,148号、第5,776,973号和第6,204,280号以及专利公开WO00/63178、WO01/10841、WO01/14337、WO01/14338、WO97/45137、WO98/35949和WO00/26212描述了其它在结合至靶向脂质亲水结构域时适用于本发明目的的非肽αVβ3受体拮抗剂。
非肽整联蛋白受体拮抗剂L和可选表面连接基X组合构成了适于结合核酸载体(例如阳离子脂质体等)的αVβ3受体靶向分子或基团。然后所产生的靶向脂质体通过与其复合结合至预先确定的核酸(例如基因)。
附图简述
在附图中，
图1图示说明了本发明的靶向脂质体；
图2图解了本发明的交联靶向脂质体；
图3图解了本发明的另一种交联靶向脂质体；
图4图示说明了靶向脂质体的全身循环；
图5图示说明了靶向脂质体在生血管部位的汇集；
图6和7图示说明了DNA(例如基因)向目标细胞的传递；
图8图示说明适于测试αVβ3拮抗剂的粘附测定；
图9以曲线图显示使用图8所示的粘附测定获得的数据，数据表明本发明的靶向脂质体结合αVβ3受体；
图10以图解显示的数据表明，使用本发明的靶向脂质体有效地将绿色荧光蛋白(GFP)基因靶向传递至体内的αVβ3表达细胞；携带所述基因的靶向脂质体显示以αVβ3依赖方式转染细胞；使用的细胞为人黑素瘤细胞M21和M21L；M21细胞表达αVβ3整联蛋白，而M21L细胞不表达αVβ3整联蛋白(αV-无效)；
图11以图解显示的数据表明，使用本发明的靶向脂质体将萤火虫荧光素酶基因体内选择性靶向表达αVβ3的肿瘤血管细胞；靶向基因载体显示以αVβ3依赖方式转染肿瘤细胞；使用的细胞为移植入小鼠的人黑素瘤细胞M21和M21L；M21细胞表达αVβ3整联蛋白，而M21L细胞不表达αVβ3整联蛋白；
图12以曲线图显示的数据证实：移植肿瘤生长的体内抑制和消退是由于给予了与表达血管发生抑制性突变型Raf蛋白的基因结合的靶向脂质体；
图13以曲线图显示的数据证实：移植肿瘤生长的体内抑制和消退是由于给予了与表达血管发生抑制性突变型Raf蛋白的基因结合的靶向脂质体；
图14展示的显微照片证实：使用本发明的靶向脂质体将GFP编码基因体内传递至小鸡CAM的血管生成血管；
图15展示的显微照片证实：通过玻璃体内注射结合GFP编码基因的本发明靶向脂质体，将该基因体内传递至小鼠眼睛的血管；
图16展示的显微照片证实：通过靶向脂质体介导的突变型Raf编码基因向小鼠视网膜血管生成血管的传递，使体内新生血管凋亡；
图17图解了靶向脂质体合成流程1，详述了关键中间体三价脂质-整联蛋白拮抗剂缀合物12的合成；以及
图18图解了靶向脂质体合成流程2，该流程概述了通过合适脂质的自装配和多聚化由三价脂质-整联蛋白拮抗剂缀合物12形成纳米颗粒靶向脂质体(NP)。
优选实施方案的描述
图1-3和18图示说明了本发明的靶向脂质体，其由结合脂质的整联蛋白受体拮抗剂(如αVβ3受体拮抗剂)和核酸载体(例如阳离子两性分子，如阳离子脂质)构成。所述脂质体还可包含中性或两性填充脂质(filler lipid)。
靶向脂质具有靶向结构域，包括共价结合至疏水结构域的αVβ3整联蛋白受体拮抗剂。靶向结构域可直接结合至疏水结构域，或者靶向结构域可结合至亲水结构域，如连接基(表面连接体)，亲水结构域再结合至疏水结构域。
适用于本发明目的的整联蛋白受体拮抗剂在生理pH值为两性离子，并具有可作用于或结合整联蛋白受体的阳离子基团和阴离子基团。所述阳离子和阴离子基团通过间隔基(例如二价芳基)互相分开。受体拮抗剂分子上阳离子基团和阴离子基团之间的间距为约10至约100埃，可由对-烷氧基苯甲酸、双环或三环化合物、螺环化合物等产生，条件是由其分开的阳离子基团和阴离子基团可在生理pH值下与整联蛋白受体相互作用。
本文和所附权利要求书中使用的术语“芳基”是指含至少一个6-碳芳香环的烃基，其还可包含直链、支链或环状烃取代基。术语“杂芳基”是指含至少一个含碳-杂原子的芳香环的基团，其还可包含直链、支链或环状烃取代基，其中所述杂原子可为选自元素周期表中IUPAC命名为15(氮类)和16(氧类)的任一元素，包括L.A.Paquette，现代杂环化学原理，Benjamin/Cummings Publishing Company，Inc.(1968)所公开化合物的芳族杂环基，该文献的相关公开内容通过引用结合到本文中。当在本文中提及芳基和杂芳基时，其可为未取代的，或者可为取代的。
本文和所附权利要求书中使用的术语“杂环基”是指含至少一个含碳-杂原子的非芳香环的基团，其还可包含直链、支链或环状烃取代基，其中所述杂原子可为选自元素周期表中IUPAC命名为15(氮类)和16(氧类)的任一元素，包括Paquette(同上)所公开化合物的非芳族杂环基，该文献的相关公开内容通过引用结合到本文中。杂环基可为未取代的，或者可由烷基或反应性功能基(例如卤素、氨基、羟基、羧酸基、磺酸基等)取代。
本文和所附权利要求书中使用的术语“烷基”是指烃基部分，其可为直链、支链，或者可含有碳环结构。
本文和所附权利要求书中使用的术语“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的烷基。
本文和所附权利要求书中使用的术语“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的烷基。
本文和所附权利要求书中使用的术语“取代的”是指用烷基、苯基或功能基取代上述基团之一的一个或多个氢原子，所述功能基例如为羟基、烷氧基、氨基、亚硝基、硝基、偶氨基、叠氮基、酰胺基、羧基、氧代、硫醇、次硫酸基、磺酰基、氧膦基、膦酰基、氟、氯、溴、碘以及R.Panieo等编辑，有机化合物IUPAC命名法指引，Blackwell Science Ltd.(1993)描述的类似基团，所述文献的相关公开内容通过引用结合到本文中。
本文和所附权利要求书中使用的术语“脂质体”是指其壁为脂质分子的球状物，脂质分子互相之间可共聚合或可以不共聚合。
本文和所附权利要求书中使用的术语“脂质”是指油、脂肪、脂肪样物质中任一成员，其特征为可溶于相对非极性溶剂，但仅微溶于水性溶剂。脂质由存在于活体组织的四类主要化合物构成，包括脂肪酸、中性脂肪(例如三酰甘油、脂肪酸酯和皂类、长链(脂肪)醇和蜡、鞘氨基醇和其它长链碱基、糖脂、磷脂、鞘脂、胡萝卜素、多萜醇、甾醇等)以及萜烯和类似的类异戊二烯。
本文和所附权利要求书中使用的术语“细胞转染剂”是指适于基因传递和表达的阳离子脂质，由阳离子头基团组成，其通过连接体连接至疏水结构域或部分。
本文和所附权利要求书中使用的术语“中性”当修饰脂质时包括不带电脂质(例如胆固醇等)以及两性脂质(例如二油酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱等)。
本文和所附权利要求书中使用的术语“胆甾醇基”是指衍生自或结构上类似胆甾醇的甾族烃基部分。
本文和所附权利要求书中使用的术语“整联蛋白受体拮抗剂”是指选择性结合并拮抗整联蛋白受体(例如αVβ3受体、αVβ5受体、αVβ6受体等)的非肽化合物。
说明性的所述αVβ3拮抗化合物以下式表示：
其中游离氨基(NH2)可用于使所述拮抗剂通过表面连接基(例如羧基和/或其它合适的活性基团)共价结合至脂质体的疏水结构域。
美国专利第5,561,148号、第5,776,973号和笫6,204,280号以及专利公开WO00/63178、WO01/10841、W001/14337、WO01/14338、WO97/45137、WO98/35949和WO00/26212描述了其它在直接或间接结合靶向脂质的疏水结构域时适用于本发明目的的说明性非肽αVβ3受体拮抗剂，所述文献的相关公开内容通过引用结合到本文中。所述αVβ3受体拮抗剂例举如下：
如WO01/14338所述的
等；如WO01/14337所述的
等；如WO00/63178所述的
等；如WO01/10841所述的
等；前提是所述化合物包括或经修饰后包括：可与表面连接体或疏水结构域反应形成靶向脂质的功能基或桥联基。所述修饰在化学领域众所周知。例如，以上例举化合物的一个芳族部分可用氨基、羟基或硫醇基化学取代，提供一种连接表面连接体的方法。或者，例如可用羧酸取代芳基，而表面连接体可为氨基取代基。
使用在非肽整联蛋白受体拮抗剂与表面连接体或疏水结构域之间产生共价键的常规化学技术，使所述拮抗剂共价连接亲水表面连接体或直接连接疏水结构域。产生所述键的反应化学在本领域众所周知，包括使用表面连接体或疏水结构域与整联蛋白拮抗剂配体上的互补功能基团。优选相对于配体上存在的可键合功能基团或者可导入配体用于键合的功能基团选择表面连接体或疏水结构域上的互补功能基团。再者，所述互补功能基团在本领域众所周知。例如，羧酸与伯胺或仲胺在合适的周知活化剂存在下反应形成可共价连接配体与表面连接体或疏水结构域的酰胺键；胺基与磺酰卤基团反应形成可共价连接配体与表面连接体或疏水结构域的磺酰胺键；而醇或酚基与烷基卤或芳基卤反应形成可共价结合整联蛋白拮抗剂配体与表面连接体或疏水结构域的醚键。
或者，整联蛋白受体拮抗剂可包含疏水结构域，例如C18-C30烷基、C18-C30烯基、C18-C30炔基、胆甾醇基等。
有或没有间隔性表面连接体的疏水结构域与整联蛋白受体拮抗剂的连接位置保留了受体结合位点的相互作用，具体地说，其使得拮抗剂自身适于结合整联蛋白受体结合位点。所述键的位置和合成方案在本领域众所周知。
包含疏水结构域或可共价结合疏水结构域的优选αVβ3整联蛋白受体拮抗剂用下式(I)和(II)表示：
Figure A0281496600171
其中在式(I)中，R1和R2均为氢，或一起形成桥联1，2-亚苯基(C6H4)基团或桥联乙烯基(-CH＝CH-)；X是-C(O)-或共价键；n是1，2或3；Z1是-C(O)-R3、-C(O)OR3或SO2R3；而R3是苯基、取代的苯基、吡啶基、苄基、取代的苄基、C1-C4卤代烷基、C2-C30烷基、C2-C30烯基、C2-C30炔基或胆甾醇基；以及
其中式(II)中，R4和R5均为氢，或一起形成共价键；Y是-C(O)-或-CH2-；Z2是-C(O)-R6、-C(O)OR6或SO2R6；R6是苯基、取代的苯基、吡啶基、苄基、取代的苄基、C1-C4卤代烷基、C2-C30烷基、C2-C30烯基、C2-C30炔基或胆甾醇基；而Het是2-吡啶基或2-咪唑基。
式(I)的整联蛋白受体拮抗剂的非限制性实例包括以下的化合物Ia、Ib、Ic、Id、Ie和If。这些具体化合物的制备描述于PCT公开WO98/35949。
式(II)的整联蛋白受体拮抗剂的非限制性实例包括以下的化合物IIa、IIb、IIc、IId、IIe和IIf。这些具体化合物的制备描述于PCT公开WO00/26212。
Figure A0281496600181
优选的αVβ3整联蛋白受体拮抗剂在不与靶向脂质的疏水结构域共价连接时，其分子量(MW)约200至约800道尔顿，更优选为450至约610道尔顿。
共价连接或包含疏水结构域的αVβ3整联蛋白受体拮抗剂与阳离子脂质组合产生的阳离子脂质体生物可相容且基本无免疫原性。靶向脂质体的生物活性可能易受亲水表面连接体(如果存在并又在靶向脂质体整体构型上的话)的化合价、几何形状、组成、大小、柔性或刚性等以及表面连接体的相对亲水性等的影响。因此，如果存在亲水表面连接体，则最好选择亲水表面连接体使靶向脂质体生物活性最大化。可选择表面连接体以增强靶向分子生物活性。一般来说，可由任何使拮抗剂定位于其结合位点的有机分子结构中选择表面连接体。在这一点上，可将表面连接体看作一个“框架”，在其上排列着一个或多个整联蛋白拮抗剂，以便产生需要的定位结果。定位可包括例如以距离脂质体表面合适的距离提供拮抗剂，以使拮抗剂和整联蛋白受体的活性位点有效地相互作用。
例如，可通过包括在框架基团中含有单环或多环基团(包括芳基和/或杂芳基基团)或含有加入一个或多个碳-碳多键(烯基、亚烯基、炔基或亚炔基)的结构，实现不同取向。其它基团还可以包括为支链或直链形式的寡聚物和多聚物。在优选实施方案中，刚性由存在的环状基团(例如芳基、杂芳基、环烷基、杂环基等)赋予。在另一个优选实施方案中，所述环为6元环或10元环。在另一实施方案中，所述环为芳族环，例如苯基或萘基。
Xiong等，Science 296：151-155(2002)描述了在结合了整联蛋白拮抗剂时αVβ3整联蛋白胞外部分的晶体结构。用于实施本发明的αVβ3整联蛋白受体拮抗剂所具有的结构以类似于Xiong等描述的作用方式和αVβ3整联蛋白受体相互作用。
熟练技术人员可轻易控制表面连接体的不同亲水特性以及脂质体上带电部分的存在与否。例如，可通过用聚(氧化烯)基团(例如聚(乙二醇)、聚(丙二醇)等)取代烯基，将衍生自1，6-己二胺(H2N(CH2)6NH2)或相关多胺的表面连接体的疏水特性修饰得明显更亲水。
可通过将辅助基团加入或插入到表面连接体之上或其中改良表面连接体的特性，例如改变脂质体(在水、脂肪、脂质、生物流体等中)的溶解性、疏水性、亲水性、表面连接体柔性、抗原性、稳定性等。例如，将一个或多个聚(乙二醇)(PEG)基团引入表面连接体之上或其中，可增强纳米颗粒脂质体的亲水性和水溶性，同时增加分子量和分子大小，并且根据表面连接体的特性还可增加体内保留时间。此外，PEG可降低抗原性，并潜在增强表面连接体的整体刚性。
可增强脂质体水溶性/亲水性的辅助基团对实施本发明有效。因此，使用辅助基团增强本发明脂质体的水溶性和/或亲水性属于本发明范畴，所述辅助基团例如少量重复单元的乙二醇、丙二醇、醇、多元醇(例如甘油、丙氧基甘油、糖(包括单糖、寡糖)等)、羧酸(例如少量重复单元的谷氨酸、丙烯酸等)、胺(例如四乙撑五胺)等。在优选实施方案中，用于改善水溶性/亲水性的辅助基团为聚醚。辅助基团可连接至靶向脂质上的表面连接体，或可连接至脂质体中的其它脂质，例如阳离子脂质或中性填充脂质。
将亲脂辅助基团加入到表面连接体结构中来增强本文所述脂质体的脂溶性和/或疏水性也属于本发明范畴。用于本发明表面连接体的亲脂基团包括(仅作为实例)未取代或取代的芳基和杂芳基，但至少由允许其共价连接至表面连接体的基团取代。其它用于本发明表面连接体的亲脂基团包括脂肪酸衍生物，其在水性介质中在达到相对较高的浓度之前不形成双层。
可通过包含大和/或刚性的辅助基团操控表面连接体的柔性。存在大或刚性基团可阻碍表面连接体中的键、表面连接体和辅助基团之间键或者表面连接体和功能基团之间键的自由转动。刚性基团可包括例如基团中存在环和/或多键抑制其构象不稳定性的基团，例如芳基、杂芳基、环烷基、环烯基和杂环基。可赋予刚性的其它基团包括多肽基团，例如寡或聚脯氨酸链。
静电也可以赋予刚性。因此，如果辅助基团带正电或负电，则带同种电荷的辅助基团将迫使表面连接体变成带同种电荷的辅助基团间距离最大的构型。使带同种电荷的基团间更接近的能耗代价将使得表面连接体处于维持带同种电荷的辅助基团分开的构型。另外，携带相反电荷的辅助基团趋向于吸引相反电荷部分，很有可能形成分子间离子键和分子内离子键。这种非共价机制将使得表面连接体成为相反电荷基团可以键合的构像。加入表面连接体后加入带电或去保护后带电荷的辅助基团，包括通过改变pH、氧化、还原或本领域技术人员已知的导致去除保护基的其它机制对羧基、羟基、硫醇基或氨基去保护，都属于本发明范畴。
刚性也可以由内部氢键合或疏水折叠赋予。
大基团可包括例如大原子、离子(例如碘、硫、金属离子等)或含大原子的基团、多环基团(包括芳基、非芳基)和加入一个或多个碳-碳多键(即烯基和炔基)的结构。大基团还可以包括支链或直链形式的寡聚物和多聚物。预计支链形式提供给所述结构的刚性要强于相似分子量的直链形式。
在某些实施方案中，刚性由存在的环状基团(例如芳基、杂芳基、环烷基、杂环基等)赋予。在其它实施方案中，表面连接体含有一个或几个六元环。在另一实施方案中，所述环为芳基，例如苯基或萘基。
适当选择表面连接体以提供合适的取向、限制/非限制性转动、需要程度的疏水性/亲水性等，完全属于本领域技术。消除或降低本文所述纳米颗粒的抗原性也属于本领域技术。在某些案例中，可通过使用聚(乙二醇)基之类的基团消除或降低纳米颗粒抗原性。
核酸载体为阳离子两性分子，例如阳离子脂质、阳离子脂质体或具有阳离子基团的胶束，其通常能够通过与负电荷核酸序列相互作用结合核酸，形成能够进入细胞的复合物。图1、2、3、17和18图解了靶向脂质体。
适于本发明目的的阳离子脂质(细胞转染剂)例如为1，2-二油酰氧-3-(N，N，N-三甲铵)丙烷氯化物(DOTAP)、二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)、二油酰二甲基氯化铵、二油酰-L-α-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、N-胆甾醇基氧西维因(carbaryl)-3，7，12-三氮杂十五烷-1，15-二胺(CTAP)等。优选的阳离子脂质为DOTAP。其它合适的阳离子脂质描述于Miller，Angew.Chem.Int.Ed.37：1768-1785(1998)，后文称为“Miller”以及Copper等，Chem.Eur.J.4(1)：137-151(1998)，这些文献在相关程度上通过引用结合到本文中。
本发明的靶向脂质体可交联、部分交联或未交联。交联脂质体可包含交联以及非交联的组分。
本发明的代表性非交联靶向脂质体为一种脂质混合物，其包含DOTAP(阳离子脂质)、类固醇(中性脂质)、聚乙二醇(亲水辅助组分)，例如PEG-350(具有350个氧乙烯重复单元的聚氧乙烯)，以及共价结合或包含脂质的非肽整联蛋白受体拮抗剂。DOTAP∶类固醇∶聚乙二醇的比率优选分别为约1∶1∶0.12，所包含的含非肽整联蛋白受体拮抗剂脂质(整联蛋白靶向脂质)的量足以提供相对较高的αVβ3整联蛋白亲合性。靶向脂质体优选包含整联蛋白靶向脂质，其量以脂质体中脂质组分的总mol数为基准为约1-约20mol％，更优选为约8-约12mol％。
本发明优选的交联靶向脂质体包含聚合两性或中性脂质、聚合整联蛋白靶向脂质和适于结合核酸的聚合阳离子脂质。
在另一个优选实施方案中，所述交联靶向脂质体包含聚合两性或中性脂质、聚合整联蛋白靶向脂质和非聚合阳离子脂质。
含聚合脂质的脂质体可通过例如加入合适的自由基聚合引发剂、用合适波长的紫外灯辐射或聚合领域已知的其它方法交联。
合适的阳离子脂质或细胞转染剂可商购，也可如Sipkins等，Nature Medicine，1998，4(5)：(1998)，623-626所述或Miller(同上)所述制备。制备。
阳离子脂质体可由单一阳离子两性分子形成，或者可由阳离子两性分子与中性脂质组合而成，例如由3，3-[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇和二油酰L-α-磷脂酰乙醇胺组合而成。
亲水特性缘于存在磷酸根、膦酸根、羧酸根、硫酸根、磺酸根、巯基、氨基、硝基、羟基或本领域众所周知的其它类似基团。疏水性可通过包含以下基团赋予：包括但不限于最高达20个碳原子的长链饱和和不饱和脂肪烃基团，以及由一个或多个芳基、杂芳基、环烷基和/或杂环基取代的所述基团。优选的脂质为磷酸甘油酯和鞘酯。磷酸甘油脂的代表性实例包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇聚糖、磷脂酸、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱和二亚油酰磷脂酰胆碱。没有含磷基团的化合物(如鞘脂和鞘糖脂家族)也属于命名为脂质的类别。另外，上述两亲脂质可与其它脂质(包括三甘油酯和类固醇，例如胆固醇、改良胆固醇等)混合。
整联蛋白受体拮抗剂可包含疏水结构域或连接表面连接体或以任何合适部位直接连接疏水结构域，例如连接在直链末端或其任一中间位置，只要此连接不干扰拮抗剂与整联蛋白受体的结合。如果有需要，整联蛋白受体拮抗剂还可包含或具有可选二价桥联基，以促进与表面连接体的连接。
图1图示说明了为球形颗粒的靶向脂质体，其在颗粒表面具有核酸结合位点和整联蛋白靶向位点。
图2图示了本发明的交联靶向脂质体。图3图示了另一个交联靶向脂质体，其中所述脂质体中存在阳离子脂质，但不与其交联。下文的材料与方法部分详细描述了制备此靶向脂质体的实施方案。所述交联脂质体在其外表面上存在衍生自胆碱部分并能够结合核酸的阳离子基团以及来自结合亲水表面连接体的整联蛋白拮抗剂基团的整联蛋白受体结合位点。
通过使带负电核酸接触存在于脂质体上的阳离子基团，例如通过在生理pH的药学上可接受的水性介质中混合核酸和靶向脂质体，可使核酸结合交联脂质体纳米颗粒。所形成的复合核酸的靶向脂质体在体外和体内都很容易被接触靶向脂质体的存在整联蛋白的细胞吸收。
靶向脂质体正电荷对核酸负电荷的比率优选大于1，更优选至少约1.2。
为选择性靶向或拮抗整联蛋白(例如αVβ3整联蛋白)，本发明的化合物和组合物可以单位剂量形式和药用载体、溶媒和佐剂一起，以治疗有效量胃肠外、口服、吸入或局部给药。本文使用的术语“胃肠外”包括静脉内、皮下、肌内、膜内、眼内(例如玻璃体内)和腹腔给药，以及通过输注技术给药。
可利用任何合适的给药途径。包含本发明结合核酸的纳米颗粒的药用组合物可以预定治疗有效剂量使用。本领域技术人员使用药学领域已知的临床前和临床研究很容易确定治疗特定病症或抑制其发展所需的治疗有效量。
本文使用的术语“治疗有效量”是指临床医生或研究者所寻找的激发组织、系统、动物或人的生物学或药学反应的活性成分用量。
本文使用的术语“抑制”是指病症的舒缓、中断或停止，但不是一定表示病症完全消除。本质上，患者生命延长表明病症受到有益地控制。
本发明的结合核酸的靶向脂质体或含所述靶向脂质的组合物的剂量方案基于若干因素，例如患者的年龄、体重、性别和疾病类型、病症严重性、给药途径以及使用的特定靶向分子或配体的拮抗活性。剂量方案可根据前述因素改变。与约0.01mg至约1000mg/kg体重相似的剂量水平对治疗前述病症有效。优选的剂量水平为约0.01mg至约100mg/kg体重。
对于注射给药，用药用载体(例如水、盐水或葡萄糖水溶液)配制本发明描述的含靶向脂质体的组合物。对于注射，通常的日剂量为约0.01mg至约100mg/kg体重，根据上述因素每日以单剂或多剂注射。
为抑制血管发生，例如，给予需要抑制血管发生的患者治疗有效量的本发明所述靶向脂质体，其携带能够表达血管发生抑制性蛋白或肽的核酸，例如核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。接着给予的核酸进入细胞核，并在血管内皮细胞中表达目标蛋白。
提供以下的非限制性实施例进一步阐述本发明的各个方面。本领域技术人员应认识到，可在不偏离本发明的精神和范围的情况下对本文公开的实施例和说明性实施方案进行修改。
材料和方法
制备纳米颗粒
要构建结合整联蛋白的多价靶向脂质体，首先设计并合成可聚合脂质整联蛋白靶向分子12(图17；流程1)。以其苄氧羰基(CBZ)衍生物保护牛磺酸1的氨基产生2，然后形成磺酰氯3，3偶合叔丁氧羰基二氨基丙酸4，产生化合物5。5皂化产生化合物6，去除叔丁氧羰基(BOC)后得到关键中间体7。7与苯甲酸衍生物8偶合产生化合物9，9氢化以去胺的保护，同时还原嘧啶环，产生整联蛋白受体拮抗剂-连接体缀合物10。Duggan等，J.Med.Chem.，2000，43，3736-3745先前已经描述了化合物8的合成，该文献的相关公开内容通过引用结合到本文中。使用苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)使3当量10与三羧酸螯合剂脂质11偶合，产生关键的三价整联蛋白拮抗剂脂质12。Storrs等，J Magn.Reson.Imaging，1995，5，719-724先前已经描述了化合物11的制备，该文献的相关公开内容通过引用结合到本文中。用甲醇钠的甲醇溶液处理11得到化合物15(即11的三钠盐)。如Storrs等(同上)所述，通过加热15和三氯化铕溶液合成铕-螯合剂脂质复合物14。
图18的流程2概述了由Storrs等(同上)先前描述的通过自组装和聚合合适的脂质形成交联靶向脂质体(NP)。通过合并三价脂质-整联蛋白拮抗剂12、丁二炔两性磷酸脂13和铕-螯合剂脂质复合物14的氯仿溶液，合成代表性的交联靶向脂质体。将化合物14以1％(重量)加入所有配制物中，以便使用荧光显微镜检术目测颗粒。向此脂质的氯仿溶液中加入阴离子螯合剂脂质15或阳离子脂质16(DOTAP)，以便改变表面电荷。通过改变脂质体中化合物12的量控制NP上整联蛋白拮抗剂的表面密度。
为形成囊泡，蒸发合并的脂质溶液至干，高真空干燥去除任何残余溶剂，形成脂质薄膜。使用去离子水将干燥的脂质薄膜水化至已知的脂质密度(30mM)。然后按照Leaver等，Biochim.Biophys.Acta，1983，732，210-218的方法，在保持pH为7.0-7.5的同时，使用探针尖端超声器以高于凝胶-液体晶体相转变(Tm 64℃)的温度超声处理所获得的悬浮液。大约超声处理1小时后溶液变得澄清。然后通过在湿冰床上将所述溶液冷却至0℃，并用手提式UV灯于约254nm辐射所述溶液大约2小时，对囊泡进行聚合。获得的脂质体(NP1至NP6)为橙黄色，并具有两条可见吸附带，集中在490nm和535nm，由缀合的烯-炔(ene-yne)丁二炔聚合物产生。根据动态光散射(DLS)测定，NP的平均直径为40nm-50nm。NP1至NP4的ζ电势为-42至-53mV(即NP1-NP4带负电荷)，NP5和NP6的ζ电势分别为+35和+43mV(即NP5和NP6带正电荷)(Brookhaven Instruments，Holtsville，NY)。所述脂质体在使用150mM氯化钠、50mM组氨酸和5％葡萄糖溶液配制为用于体内的溶液后稳定数月，物理和生物特性没有明显变化。
下表1提供了脂质体NP1至NP6的成分，以组分12(靶向脂质)、13(两性脂质)、14(阴离子螯合剂脂质)和16(阳离子脂质；DOTAP)的mol％表示。
                     表1-脂质体成分NP1-NP6
脂质体       mol％        mol％       mol％         mol％
             靶向脂质     两性脂质    阴离子脂质    阳离子脂质
NP1          10           80          10            0
NP2          1            89          10            0
NP3          0.1          90          10            0
NP4          0            90          10            0
NP5          10           80          0             10
NP6          0            90          0             10
如图18的概述，使用0.1、1和10mol％整联蛋白拮抗剂脂质复合化合物12和化合物13通过聚合囊泡构建脂质体，在聚合之前另外加入材料14、15和16到脂质体中，以改变表面电荷密度，使脂质体可通过荧光目测。为简便起见，图18没有列出可选的仅含1mol％脂质体的化合物13。含有10mol％化合物12的材料(NP1和NP5)对整联蛋白αVβ3键合位点的亲合性最高。在使用时间分辨荧光显微镜检术的竞争性整联蛋白结合测定中，消耗了超过100倍的游离配体10(65μm)才将NP1和αVβ3整联蛋白的结合降低50％，尽管事实上NP1在其表面上仅具有0.5μM当量的整联蛋白拮抗剂10。在使用结合至玻连蛋白包被平板的αVβ3阳性M21黑素瘤细胞的体外细胞粘附抑制测定中，游离配体10的IC50为64μM。形成强烈对比的是，在表面上的阴离子颗粒NP1的IC50为0.27μM当量化合物10。这表示当10在NP上时对细胞表面的亲合力是游离配体的200倍以上。对于阴离子颗粒NP5，IC50为0.35μM当量化合物10，亲合力大约是游离配体的180倍，如下表2所示。因此，不管表面电荷如何，与单体配体相比，NP对整联蛋白的亲合力大约增加180-200倍。该结果证实，NP表面和细胞表面之间发生强烈的相互作用。此相互作用与NP上的表面电荷无关，而是与特定受体配体的相互作用直接相关。通过在NP表面上以多价提供整联蛋白拮抗剂，可使亲合力比游离配体增加大约两个数量级。当NP制备物中化合物12的量分别下降10倍和100倍至1mol％和0.1mol％(如NP2和NP3)时，阻断细胞粘附的能力下降约1至2个数量级，分别如下表2所示。
                                表2脂质体NP1-NP6的物理和生物特性
材料        大小   ζ电势     竞争性抑制      细胞粘附测定          多价效果IC50(游离
            (nm)   (mV)       测定(μM10)     IC50(μM NP上10)     [10]/NP上的[10])
NP1         45.1±      -42       65              0.27                  237
            0.6
NP2         42.8±      -49       24              7                     9
            1.5
NP3         44.4±      -53       1               30.5                  2
            0.8
NP4         46.4±      -49       NA              抑制                  NA
            0.7
NP5         41.7±      35        60              0.35                  183
            2.2
NP6         36.8±      43        NA              抑制                  NA
            0.9
脂质体NP5代表本发明的代表性交联靶向脂质体。
通用合成方法
使用的所有溶剂和试剂都是试剂级。在公用真空(house vacuum)或Welch直流真空泵提供的减压下以≤40℃进行溶剂蒸发。如所述对每个实例用JEOL FX90Q记录其在CDCl3、CD3OD、D2O或混合物中的1H和13C-NMR光谱，质子光谱为90MHz，碳光谱为大约23MHz。(注意：尽管可溶于CDCl3，但向脂质中加入CD3OD抑制反胶束形成，由此产生较尖锐的光谱)。1H实验光谱以残余CHCl3(7.25ppm)作为参比，13C实验光谱以CDCl3中线(77.00ppm)作为参比。用PerSeptive DE仪器(质谱，The Scripps Research Institute，La Jolla，CA)进行MALDI-TOF质谱。在玻璃基板型Merck 60 F254(0.2mm；EMSeparations，Wakefield，RI)上进行TLC，显色板按常规用硫酸铈(1％)和钼酸铵(2.5％)的10％硫酸水溶液喷雾，加热至约150℃。其它显色剂包括碘(一般用途)、0.5％茚三酮的丙酮溶液(用于胺)和紫外灯(用于UV发色团)。
N-苄氧羰基-牛磺酸钠盐(2)。将牛磺酸1(约40g，320mmol)溶解在4N氢氧化钠溶液(80ml)和水(约200ml)中。向该溶液中滴加苄氧基碳酰氯(约48ml，330mmol)，剧烈搅拌约4小时。加入10％碳酸氢钠溶液(约300ml)和4N氢氧化钠溶液(约45ml)将溶液pH维持在碱性。然后用乙醚(约1000ml)洗涤获得的反应混合物，将水层旋转蒸发至干，再在高真空下经五氧化二磷过夜干燥，产生约12.7g(14％)2。1H-NMR(D2O)：δ7.50(5H，s，Ar-H)，5.21(2H，s，Ar-CH2)，3.62(2H，t，CH2)，3.14(2H，t，CH2)。
2-苄氧羰基氨基乙烷磺酰氯(3)。在正压氩气下将N-CBZ-牛磺酸钠盐2(约12.7g，32mmol)悬浮在无水乙醚(约30ml)中，并在约15分钟内以5份五氯化磷(约7g，33.6mmol)处理。于室温下搅拌反应物约4小时。旋转蒸发去除溶剂。加入冰水(约10ml)，以冰浴冷却烧瓶和内容物后研磨获得的残余物。再加入冰水(约50ml)，固化产物。过滤收集固体，用冰水(约20ml)洗涤，经五氧化二磷过夜干燥，产生约6.95g(78％)3。1H-NMR(CDCl3)：δ7.35(5H，s，Ar-H)，5.12(2H，s，Ar-CH2)，3.89(2H，t，CH2)与3.85(2H，t，CH2)重叠。
3-丁氧羰基氨基-2-(S)-苄氧羰基氨基乙基亚磺酰氨基丙酸甲酯 (5)。在正压氩气下用冰浴冷却磺酰氯3(约21.6g，78mmol)和3-N-丁氧羰基氨基-2-氨基丙酸甲酯(4，约9.96g，39.2mmol)的无水四氢呋喃(THF，150ml)溶液的混合物。在正压氩气下于约30分钟内，使用预先干燥的滴液漏斗向该溶液中滴加入N-甲基吗啉(约16ml，145mmol)的无水THF(约275ml)溶液。在冰浴中搅拌约1小时后，通过TLC观察到基本上所有磺酰氯(Rf＝0.65)都已消耗完(洗脱液：乙酸乙酯/己烷1∶1)。但是，仍存在未反应的二氨基丙酸(Rf＝0.1，茚三酮喷雾)。在约3小时内再加入磺酰氯(约5.0g，18mmol)。然后过滤获得的反应产物，旋转蒸发去除溶剂，并溶解在乙酸乙酯(约100ml)中，用冷稀盐酸(约20ml)、饱和碳酸氢钠溶液(约20ml)然后是饱和氯化钠溶液(约20ml)洗涤，接着经无水硫酸钠干燥。通过旋转蒸发去除溶剂，真空下过夜干燥获得的残余物。通过首先溶解在乙酸乙酯中，然后加入等体积己烷，使干燥的残余物重结晶，获得为无色固体的甲酯5约13.4g(约74％)。1H-NMR(CDCl3)：δ7.36(5H，s，Ar-H)，5.83(1H，d，NH)，5.55(1H，t，NH)，5.12(2H，s，Ar-CH2)，5.06(1H，t，NH)，4.26(2H，m，CH)，3.79(3H，s，CH3)，3.70(2H，dd，CH2)，3.26(2H，dd，CH2)，1.43(9H，s，(CH3)3)。
3-丁氧羰基氨基-2-(S)-苄氧羰基氨基乙基亚磺酰氨基丙酸(6)。以冰浴冷却甲酯5(约13.3g，28.9mmol)的四氢呋喃(约160ml)溶液。向该溶液中加入氢氧化锂(约5.42g，128mmol)的冰水(160ml)溶液。去除冰浴使获得的反应混合物缓慢升温至室温，于室温搅拌混合物约1小时。然后旋转蒸发去除有机溶剂。用乙醚(20ml)洗涤残余的水性部分，然后用稀盐酸酸化至约pH4。以冰浴冷却该溶液，然后和乙酸乙酯(约100ml)混合，接着使用冰冷稀盐酸再酸化至约pH1，并立即用乙酸乙酯(约2×200ml)提取。用盐水(约50ml)洗涤乙酸乙酯层，经无水硫酸钠干燥。然后旋转蒸发去除溶剂，获得的残余物在高真空下过夜干燥，获得约13.3g泡沫固体，将其由己烷/乙酸乙酯(1∶1)中重结晶，获得约11.6g(89.7％)的6。1H-NMR(CDCl3)：δ7.33(5H，s，Ar-H)，6.12(1H，d，NH)，5.68(1H，t，NH)，5.26(1H，t，NH)，5.1(2H，s，Ar-CH2)，4.24(2H，m，CH2)，3.67(2H，t，CH2)，3.27(2H，t，CH2)，1.45(9H，s，C(CH3)3)。
3-氨基-2-(S)-苄氧羰基氨基乙基亚磺酰氨基-丙酸(7)。用三氟乙酸(约68ml)的二氯甲烷(约350ml)处理N-BOC-β-氨基酸6(约11.5g，25.8mmol)约1.5小时，然后旋转蒸发至干。将获得的残余物溶解在水(约200ml)中并冻干，获得约10.9g(98.8％)的固体7。1H-NMR(CDCl3)：δ7.30(5H，s，Ar-H)，6.07(1H，d，NH)，5.61(1H，t，NH)，5.20(1H，t，NH)，5.17(2H，s，Ar-CH2)，4.11(2H，m，CH2)，3.53(2H，t，CH2)，3.32(2H，t，CH2)。C13H19N3O6S的DCI-MS为：m/z(离子)346(M+H)(C13H19N3O6S+H的理论值，m/z346)。
4-[2-(嘧啶-2-基氨基)乙氧基]苯甲酰基-2-(S)-苄氧羰基氨基乙基 亚磺酰氨基-β-丙氨酸(9)。在正压氩气下将苯甲酸衍生物8(约6.4g，24.7mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(约3.6g，31mmol)溶解在无水二甲亚砜(约110ml)中，并以冰浴冷却。向该溶液中加入1-(3-(二甲基氨基)丙基)-3-乙基碳二亚胺盐盐酸(约4.9g，25.6mmol)。于冰冷的温度搅拌该溶液1小时，然后使其升至室温。再于室温持续搅拌约24小时。向获得的混合物中加入β-氨基酸7(约12.2g，25.8mmol)的溶液，然后加入N-甲基吗啉。于氩气下搅拌获得的反应混合物约3天。然后将获得的混合物倾倒入水(约1L)中，用稀盐酸酸化至约pH1.5，并用乙酸乙酯(约5×500ml)提取。用饱和氯化钠溶液(约50ml)洗涤合并的有机相，然后经无水硫酸钠干燥。旋转蒸发去除溶剂。获得的残余物用乙酸乙酯研磨，过滤，然后在高真空下干燥，获得约10.5g(72.5％)9。1H-NMR(DMSO-d6)：δ8.30(2H，d，Ar-H)，7.99(2H，d，Ar-H)，7.34(5H，s，Ar-H)，7.00(2H，d，Ar-H)，6.60(1H，dd，Ar-H)，5.01(2H，s，CH2)，4.15(1H，t，CH)，3.67(2H，t，CH2)，3.56(2H，t，CH2)，3.17(2H，t，CH2)。
4-[2-(3，4，5，6-四氢嘧啶-2-基氨基)乙氧基]苯甲酰基-2-(S)-氨基乙 基亚磺酰氨基-β-丙氨酸(10)。将嘧啶衍生物9(约3.7g，6.4mmol)的溶液溶解在乙酸(约190ml)和浓盐酸(约17ml)中。获得的溶液与10％披钯碳(约1.62g)混合，在约45psi的氢气中氢化约5小时。然后通过C盐床过滤获得的混合物，用水洗涤。旋转蒸发去除溶剂，高真空下干燥获得的残余物。将干燥的残余物溶解在水(约100ml)中，用1N氢氧化钠溶液将pH调节至约7，然后旋转蒸发至干。将获得的残余物溶解在甲醇(约20ml)中并过滤。过滤液旋转蒸发，溶解在水(约275ml)中并冻干。然后获得的冻干产物由水中重结晶，获得约2.96g(约78.9％)产物10。1H-NMR(D2O)：δ7.80(2H，d，Ar-H)，7.14(2H，d，Ar-H)，4.49(1H，s，CHaHb)，4.28(2H，t，CH2)，3.94(1H，dd，CHaHb)，3.61(6H，m，CH2)，3.32(4H，t，CH2)，1.90(2H，t，CH2)。C18H28N6O6S的ES-MS：m/z(离子)457(M+H)(C18H28N6O6S+H的理论值，m/z457)。
[(PDA-PEG3)2-DTPA-(CONHPM)3](12)。 用预先火焰干燥并充氩气的3颈RB烧瓶，将(PDA-PEG3)2-DTPA-(COOH)3(约11.69mg，50μmol)溶解在无水CH3CN(约5ml)、无水CH2Cl2(约2ml)和Et3N(约1ml)中。向获得的溶液加入BOP试剂(约134mg，150μmol)，获得的混合物充分搅拌5分钟，以获得脂质溶液。在充氩气的干燥小瓶中制备10(约69mg，150μmol)的无水CH3CN(约5ml)和无水二甲基甲酰胺(DMF)(约2ml)混合物溶液。使用干燥注射器在连续搅拌下将10的溶液加入脂质溶液中。将如此产生的反应混合物于黑暗中搅拌10小时。TLC(溶剂：CHCl3、CH3OH、H2O和CH3COOH)显示起始物质(Rf＝0.53)完全消失。有一个主产物(Rf＝0.2)和5个副产物(Rf＜0.18)。旋转蒸发去除溶剂，获得的残余物在高真空下干燥约24小时，获得粗产物。使用半制备型硅胶柱通过正常相HPLC纯化粗产物，流速约5ml/分钟(梯度系统起始为100％CHCl3，约5分钟；然后为75％CHCl3/25％CH3OH，10分钟；然后为50％CHCl3/50％CH3OH，10分钟；然后为25％CHCl3/75％CH3OH，10分钟；最后为100％CH3OH，约20分钟)。合并含主产物的组分(保留时间＝35-37分钟)，旋转蒸发去除溶剂，获得的残余物在高真空下干燥约24小时，获得约35.5mg(26.5％)目的产物。高分辨率MALDI-FTMS：m/z 2681.4711(C130H209N25O29S3+H的理论值，m/z 2681.4882)。
实施例
实施例1：细胞粘附测定
使用人黑素瘤细胞系M21在包被玻连蛋白的平板上进行细胞粘附测定。将多价脂质体NP1-NP6以及单体配体10分别与M21细胞温育，加至包被玻连蛋白的48孔平板上。温育1小时后，洗涤各孔，用结晶紫溶液对粘附细胞染色，检测约590nm的光密度(OD)。检测的OD与结合至玻连蛋白平板的细胞数成比例，将OD对不同配制物中NP表面上的组分10浓度作图，以计算IC50。
图8图解了细胞粘附测定，其中表达αVβ3的M21人黑素瘤细胞与共价结合整联蛋白拮抗剂(配体)的脂质体或单独配体混合。然后将细胞置于玻连蛋白平板上，洗涤并染色。然后使用平板计数器对结合细胞数计数。
图9以曲线图列出了使用图8所示的粘附测定所获得的数据，数据显示结合整联蛋白拮抗剂的脂质体强烈抑制细胞粘附(IC50＝1μM)，而单独的拮抗剂(配体)抑制细胞粘附的效果(IC50＝0.5mM)相差很远。
实施例2：体外转染测定
将分别有或没有共价连接αVβ3靶向配体的约30nmol阳离子脂质体NP5和NP6各与约2μg编码绿色荧光蛋白(GFP)的质粒DNA的5％葡萄糖溶液复合，然后体外接触黑素瘤细胞约1小时。24小时后通过计数荧光细胞数和总细胞数相比测定转染效率。使用的细胞是人黑素瘤细胞M21和M21L。M21细胞表达αVβ3整联蛋白，而M21L细胞不表达αVβ3整联蛋白(αV无效)。
如图10所示，用与GFP基因复合的靶向脂质体(NPS)处理的αV表达细胞(M21)表现出的转染程度(＞125,000细胞/百万)是用非靶向脂质体(NP6)(无拮抗剂；约25,000细胞/百万)或单独DNA(无脂质体，约12,000细胞/百万)处理的αV表达细胞的5倍或更高。相比之下，αV无效细胞(M21L)显示加入GFP基因没有优势，获得相对较低水平的转染(25,000细胞/百万)，而与接受的处理无关。因此，靶向基因载体显示以αVβ3依赖方式转染细胞。
实施例3：靶向脂质体介导的体内靶向肿瘤的基因传递
将各约450nmol的NP5和NP6与各约30μg的编码萤火虫荧光素酶的质粒DNA的各约200μl 5％葡萄糖溶液静电复合，然后将每种复合DNA的脂质体溶液静脉注射入具有不表达αVβ3(M21L)的约150mm3皮下黑素瘤的动物。约24小时后处死动物，切除所述器官和肿瘤，测定荧光素酶活性。除使用组织研磨机以器官重量标化的Bright-Glo裂解试剂量研磨全部器官以外，按照生产商的指引，使用Bright-Glo荧光素酶检测试剂盒(Promega Corp.，Madison，WI)测定荧光素酶活性。
如图11所示，相比于肺、肝和心脏组织，与荧光素酶基因复合的靶向脂质体(NP5)在肿瘤组织中显示高度选择性表达，表达水平约4pg荧光素酶/mg组织，相比之下估计在其它组织中的表达水平低于pg/mg组织。与荧光素酶复合的非靶向脂质体(NP6)对转染任何组织都无效。加入约过量20倍的可溶性整联蛋白拮抗剂配体通过靶向配体有效抑制细胞转染。
实施例4：靶向脂质体介导性传递突变型Raf基因至肿瘤血管使移植 肿瘤消退
将不表达αVβ3的黑素瘤(M21L)皮下注射入腰窝，使其生长至约70mm3，此时用200μl5％葡萄糖溶液(对照)、与约30μg编码显性失活突变形式的Raf激酶(Raf-ATPμ)的质粒DNA复合的靶向脂质体NP5的200μl5％葡萄糖溶液或与不编码任何DNA的穿梭载体复合的靶向脂质体NP5的200μl5％葡萄糖溶液静脉注射小鼠。约15天后，以相同的处理方式再注射肿瘤。在图12所示的时间点，使用公式：肿瘤体积＝(最小直径)2×最大直径/2检测肿瘤大小。
如图12所示，用复合显性失活突变形式的Raf激酶(Raf-ATPμ)的靶向脂质体NP5处理具有约70mm3初始体积的黑素瘤的小鼠，导致肿瘤体积开始增加至约550mm3，接着在约30天后肿瘤消退，至第35天稳定至约200mm3体积的稳定状态(图12中标记为“颗粒/Raf(-)”)。该稳定状态的肿瘤大小又保持了30天，此时终止实验。在用单独的靶向脂质体NP5(无基因)(标记为“颗粒/穿梭载体”)或单独的突变型Raf基因(无脂质体)处理的小鼠中，肿瘤在35天的整个阶段中持续生长，没有任何消退迹象。因为所述肿瘤不表达αVβ3，但新生血管内皮细胞确实表达αVβ3，所以肿瘤生长的减弱更可能使由于肿瘤血管的血管发生受到抑制。
实施例5：靶向脂质体介导性传递突变型Raf基因至肿瘤血管使移植 黑素瘤消退
如实施例4处理肿瘤，只是在初始治疗前使肿瘤生长至约300mm3，此时向其注射(a)约450nmol靶向脂质体NP5，其静电复合约30μg编码Raf-ATPμ的质粒DNA的约200μl5％葡萄糖溶液，(b)约450nmol非靶向脂质体NP6，其静电复合约30μg编码Raf-ATPμ的质粒DNA的约200μl5％葡萄糖溶液，或(c)约450nmol靶向脂质体NP，其与和约20mol过量整联蛋白αVβ3竞争配体混合的约30μg编码Raf-ATPμ的质粒DNA的约200μl5％葡萄糖溶液静电复合。在图13所示的时间点进行肿瘤检测，其中(a)标记为“Raf(-)”，(b)标记为“非靶向”，(c)标记为“过量”。还包括未处理的对照。
如图13所示，在初始生长阶段后，用复合显性失活突变形式的Raf激酶(Raf-ATPμ)的靶向脂质体NP5处理具有300mm3初始体积黑素瘤的小鼠，也使肿瘤体积比未处理的对照组减小。
实施例6：靶向脂质体介导的传递是血管发生血管选择性的
将约300nmol NP5与约20μg的编码绿色荧光蛋白(GFP)的质粒DNA的约50μl5％葡萄糖溶液复合，然后静脉注射入鸡胚，鸡胚的尿囊绒膜(CAM)预先暴露于用1mg/ml bFGF饱和的滤碟达24小时，以刺激血管发生。复合物注射后1天，收集CAM组织，用PBS洗涤，用4％低聚甲醛固定，并检测荧光的存在情况。结果示于图14。
由图14的显微照片可见，GFP高度定位于CAM的血管系统。
实施例7：由靶向脂质体介导的突变型Raf基因向肿瘤血管的传递诱 导血管凋亡，随后肿瘤细胞死亡
将不表达αVβ3的黑素瘤皮下注射入小鼠腰窝。使产生的肿瘤生长至约200mm3，此时用约450nmol NP5静脉注射小鼠，所述NP5复合约30μg编码Raf-ATPμ的质粒DNA约200μl5％葡萄糖溶液或复合穿梭载体的约200μl5％葡萄糖溶液。约72小时后切除肿瘤，用4％低聚甲醛固定，制成切片，使用检测片段化DNA的TUNEL法(Intergen Corp，Purchase，NY)对Von Willebrand因子(血管标记物)和凋亡染色。
图15所示的显微照片表明，接触纳米颗粒/穿梭载体(对照)的肿瘤显示相对较高的血管密度，几乎没有细胞经历凋亡。相反，接触NP5/Raf-ATPμ的肿瘤的大部分血管经历凋亡，肿瘤的大部分区域在距凋亡血管的固定距离死亡，推测是由于输血不足。
实施例8：靶向脂质体介导的传递是血管发生血管选择性的
在小鼠中，侧支由浅表血管丛视网膜毛细血管出芽，穿过视网膜，在出生后第8天(P8)和第10天(P10)之间形成深部血管丛。在该研究中，在P10对小鼠玻璃体内注射复合约0.15μg编码绿色荧光蛋白的质粒DNA的约1μl5％葡萄糖溶液的靶向脂质体NP5，然后玻璃体内注射。注射复合GFP基因的NP5后约24小时，处死小鼠，用连接抗胶原蛋白IV抗体(一种血管标记物)的罗丹明免疫染色视网膜，通过双光子激光扫描显微镜进行评测，以检测视网膜血管中GFP的相对水平。
图16的显微照片显示GFP高度定位于视网膜血管。
可在不背离本发明新特征的精神和范围的情况下，对上述实施方案和实施例实施众多的变化和修改。本文阐述的具体实施方案没有限制作用，或者应当推断出没有限制作用。所附权利要求书用于覆盖属于权利要求书范围的所有所述修改。

Claims (43)

1.一种αvβ3整联蛋白靶向脂质体，其包含：
阳离子两性分子；
中性脂质；
具有靶向结构域和结合靶向结构域的疏水结构域的靶向脂质；以及
与所述阳离子脂质复合的核酸；
所述阳离子脂质的存在量为约1至约50mol％，所述靶向脂质的存在量为约1至约20mol％，mol％值是基于脂质体中脂质的总摩尔数，而所述靶向结构域包括非肽αvβ3整联蛋白拮抗剂。
2.权利要求1的脂质体，其中所述阳离子两性分子为阳离子脂质。
3.权利要求2的脂质体，其中所述脂质体中存在的至少一部分脂质具有互相交联的功能基团。
4.权利要求2的脂质体，其中所述非肽αvβ3整联蛋白拮抗剂在生理pH值为两性离子，具有通过间隔基互相分开的阳离子基团和阴离子基团，所述间隔基在阳离子基团和阴离子基团之间产生的间距为约10埃至约100埃。
5.权利要求4的脂质体，其中所述间隔基包括二价芳基。
6.权利要求1的脂质体，其中所述核酸为DNA。
7.权利要求1的脂质体，其中所述核酸为基因。
8.权利要求1的脂质体，其中所述核酸为反义寡核苷酸序列。
9.权利要求1的脂质体，其中所述核酸为RNA。
10.权利要求1的脂质体，其中所述脂质体的颗粒大小不超过约250nm。
11.权利要求1的脂质体，其中所述脂质体的颗粒大小为约40nm至约100nm。
12.权利要求1的脂质体，其中所述脂质体的颗粒大小为约75nm至约100nm。
13.权利要求1的脂质体，其中所述脂质体的颗粒大小为约40nm至约65nm。
14.权利要求1的脂质体，其中所述非肽αvβ3整联蛋白拮抗剂的分子量为约455道尔顿至约605道尔顿。
15.权利要求1的脂质体，其中所述非肽αvβ3整联蛋白拮抗剂的分子量为约200道尔顿至约800道尔顿。
16.权利要求2的脂质体，其中所述非肽αvβ3整联蛋白拮抗剂由式(I)表示：
Figure A028149660003C1
其中在式(I)中，R1和R2均为氢，或一起形成桥联1，2-亚苯基(C6H4)基团或桥联乙烯基(-CH＝CH-)；X是-C(O)-或共价键；n是1，2或3；Z1是-C(O)-R3、-C(O)OR3或SO2R3；而R3是苯基、取代的苯基、吡啶基、苄基、取代的苄基、C1-C4卤代烷基、C2-C30烷基、C2-C30烯基、C2-C30炔基或胆甾醇基。
17.权利要求2的脂质体，其中所述非肽αvβ3整联蛋白拮抗剂由式(II)表示：
Figure A028149660003C2
其中在式(II)中，R4和R5均为氢，或一起形成共价键；Y是-C(O)-或-CH2-；Z2是-C(O)-R6、-C(O)OR6或SO2R6；R6是苯基、取代的苯基、吡啶基、苄基、取代的苄基、C1-C4卤代烷基、C2-C30烷基、C2-C30烯基、C2-C30炔基或胆甾醇基；而Het是2-吡啶基或2-咪唑基。
18.权利要求2的脂质体，所述脂质体不含交联脂质，其颗粒大小为约75nm至约100nm。
19.权利要求2的脂质体，其中所述脂质体包含交联脂质，其颗粒大小为约40nm至约65nm。
20.权利要求1的脂质体，其中所述靶向脂质和中性脂质至少部分互相交联，而所述阳离子两性分子基本没有交联。
21.权利要求2的脂质体，其中所述阳离子脂质为1，2-二油酰氧基-3-(N，N，N-三甲铵)丙烷氯化物。
22.权利要求21的脂质体，所述脂质体还包含具有约250至约500个氧乙烯重复单元的聚(乙二醇)。
23.权利要求22的脂质体，其中所述聚(乙二醇)包含约350个氧乙烯重复单元。
24.权利要求2的脂质体，所述脂质体包含1，2-二油酰氧基-3-(N，N，N-三甲铵)丙烷氯化物、胆固醇和聚(乙二醇)，它们的比率分别为约1∶1∶012。
25.权利要求2的脂质体，其中所述核酸能够在已经引入所述脂质体的细胞中表达蛋白或肽。
26.权利要求25的脂质体，其中所述核酸能够表达血管发生抑制性蛋白或肽。
27.权利要求26的脂质体，其中血管发生抑制性蛋白为Raf蛋白。
28.一种将核酸导入存在αvβ3整联蛋白的细胞中的方法，该方法包括使所述细胞接触权利要求1的αvβ3整联蛋白受体靶向脂质体。
29.权利要求28的方法，其中所述非肽αvβ3整联蛋白受体拮抗剂为选择性αvβ3整联蛋白受体拮抗剂。
30.权利要求28的方法，其中所述αvβ3整联蛋白受体拮抗剂在生理pH值具有能够结合整联蛋白受体的阳离子基团和阴离子基团，而其中所述阳离子基团和阴离子基团通过间隔基互相分开，所述间隔基在所述拮抗剂的阳离子基团和阴离子基团之间产生的间距为约10埃至约100埃。
31.一种抑制血管发生的方法，该方法包括给予需要抑制血管发生的患者治疗有效量的权利要求1的αvβ3整联蛋白受体靶向脂质体，所述靶向脂质体能够表达血管发生抑制性蛋白或肽。
32.权利要求31的方法，其中所述非肽αvβ3整联蛋白受体拮抗剂为选择性αvβ3整联蛋白受体拮抗剂。
33.权利要求32的方法，其中所述αvβ3整联蛋白受体拮抗剂在生理pH值具有能够结合整联蛋白受体的阳离子基团和阴离子基团，而其中所述阳离子基团和阴离子基团通过间隔基互相分开，所述间隔基在所述拮抗剂的阳离子基团和阴离子基团之间产生的间距为约10埃至约100埃。
34.权利要求31的方法，其中所述脂质体眼内给药以治疗血管性眼病。
35.权利要求31的方法，其中所述脂质体静脉内给药。
36.权利要求31的方法，其中所述脂质体通过注射入肿瘤给药。
37.一种抑制肿瘤生长的方法，该方法包括给予需要抑制肿瘤生长的患者治疗有效量的权利要求1的αvβ3整联蛋白受体靶向脂质体，所述靶向脂质体能够表达血管发生抑制性蛋白或肽。
38.权利要求37的方法，其中所述非肽αvβ3整联蛋白受体拮抗剂为选择性αvβ3整联蛋白受体拮抗剂。
39.权利要求38的方法，其中所述αvβ3整联蛋白受体拮抗剂在生理pH值具有能够结合整联蛋白受体的阳离子基团和阴离子基团，而其中所述阳离子基团和阴离子基团通过间隔基互相分开，所述间隔基在所述拮抗剂的阳离子基团和阴离子基团之间产生的间距为约10埃至约100埃。
40.权利要求37的方法，其中所述脂质体静脉内给药。
41.权利要求37的方法，其中所述脂质体通过注射入肿瘤给药。
42.一种诱导血管内皮细胞凋亡的方法，该方法包括使血管内皮细胞接触诱导凋亡有效量的权利要求1的αvβ3整联蛋白受体靶向脂质体，所述靶向脂质体能够表达凋亡诱导性蛋白或肽。
43.权利要求42的方法，其中所述凋亡诱导性蛋白为Raf蛋白。
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