JP2013247890A - トロポニンｔと結合するｄｎａ、これを用いた腫瘍組織における血管新生および／または脈管形成抑制剤ならびにこれを用いた細胞内へ目的物質が取り込まれることを促進する剤 - Google Patents

Abstract

【課題】 所定の塩基配列からなるＤＮＡ、所定の塩基配列を有し、かつトロポニンＴと結合するＤＮＡ、および所定の塩基配列において１または数個のヌクレオチドが欠失、置換または挿入された塩基配列を有し、かつトロポニンＴと結合するＤＮＡからなる群から選択されるＤＮＡ、前記ＤＮＡと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体、ならびに前記ＤＮＡを有効成分とする、腫瘍組織における血管新生および／または脈管形成抑制剤ならびに細胞表面にトロポニンＴを有する細胞内へ目的物質が取り込まれることを促進する剤を提供する。
【解決手段】 所定の塩基配列からなるＤＮＡ、所定の塩基配列を有し、かつトロポニンＴと結合するＤＮＡ、および所定の塩基配列において１または数個のヌクレオチドが欠失、置換または挿入された塩基配列を有し、かつトロポニンＴと結合するＤＮＡからなる群から選択される。
【選択図】 図１０

Description

本発明は、トロポニンＴと結合するＤＮＡ、これを用いた腫瘍組織における血管新生および／または脈管形成抑制剤ならびにこれを用いた細胞内へ目的物質が取り込まれることを促進する剤に関する。

特定の分子と特異的に結合する核酸やペプチドは、アプタマーとも呼ばれ、結合相手に対する特異性が高く、試験管内で化学的に短時間での合成が可能であることから、医療分野や生物工学的分野において利用価値が高い。特に、特定の分子と特異的に結合するＤＮＡについては、免疫原性もほとんどないことから、抗体に代わる特異的結合分子として利用が期待されている。これまでに、特定の分子と結合するＤＮＡとしては、例えば、免疫グロブリンＧに結合するＤＮＡ（特許文献１）、８−ヒドロキシデオキシグアノシンに結合するＤＮＡ（特許文献２）、キチンに結合するＤＮＡ（特許文献３）、ビスフェノールＡに結合するＤＮＡ（特許文献４）、ベロ毒素Ｉ型に結合するＤＮＡ（特許文献５）などが開示されている。

一方、腫瘍組織における血管新生阻害療法は、悪性腫瘍に対する有力な治療方法として期待されている。これは、Ｆｏｌｋｍａｎらによって１９７１年に提唱された治療法であり、腫瘍組織における血管新生を阻害して腫瘍実質細胞への血流を遮断することにより、腫瘍実質細胞への栄養分や酸素の供給を途絶えさせて、その増殖を防ぐ他、死滅させるという戦略に基づくものである。腫瘍組織における血管新生抑制剤として、これまでに、大麦玄麦エチルアルコール抽出画分または大麦玄麦アルカリ抽出画分（特許文献６）や、子のう菌類であるネオサルトルヤ属微生物の培養物から得られる新規化合物（特許文献７）などが開示されている。

また、一般に、薬剤などの目的物質が細胞内で効果を奏する性質のものである場合は、当該目的物質を標的細胞へ到達させるだけでは効果が得られず、細胞内へ取り込ませる特別の仕掛けが必要となる場合がある。そこで、細胞内へ目的物質が取り込まれることを促進する剤が研究開発されており、これまでに、例えば、脂質膜構造体に結合して脂質膜構造体の腫瘍細胞への取り込みを促進するトランスフェリン（特許文献８）や核酸やタンパク質と融合して用いうる細胞内へ内在化されるペプチド（特許文献９）などが開示されている。

国際公開パンフレットＷＯ２００７／００４７４８号 特開２００７−２４４２５４号公報 特開２０００−２５３８８３号公報 特開２００３−１１６５８３号公報 特開２００３−０７９３７０号公報 特開２００７−０８４５０３号公報 特開２００３−０９６０７８号公報 特許第３４１５１３１号公報 特表２０１１−５１１６４１号公報

しかしながら、特許文献１〜５に記載されたＤＮＡは、いずれもトロポニンＴと結合するＤＮＡではない。また、特許文献６および７に記載された腫瘍組織における血管新生抑制剤もまた、いずれも、トロポニンＴと結合するＤＮＡを利用するものではない。さらに、特許文献８および９に記載された細胞内へ目的物質が取り込まれることを促進する剤もまた、いずれも、トロポニンＴと結合するＤＮＡを利用するものではない。

本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号５の塩基配列を有し、かつトロポニンＴと結合するＤＮＡ、および配列番号５の塩基配列において１または数個のヌクレオチドが欠失、置換または挿入された塩基配列を有し、かつトロポニンＴと結合するＤＮＡからなる群から選択されるＤＮＡ、これらのＤＮＡと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体、ならびに配列番号５の塩基配列または配列番号５の塩基配列において１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは挿入された塩基配列を有するＤＮＡを有効成分とする、腫瘍組織における血管新生および／または脈管形成抑制剤ならびに細胞表面にトロポニンＴを有する細胞内へ目的物質が取り込まれることを促進する剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意研究の結果、初代腫瘍血管内皮細胞を用いたｃｅｌｌ ｂａｓｅｄ ｓｅｌｅｘ法により選定した配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡが、トロポニンＴと結合すること、細胞表面のトロポニンＴと結合して細胞内に取り込まれること、腫瘍組織における血管新生や脈管形成を抑制すること、および細胞表面にトロポニンＴを有する細胞内へ脂質膜構造体が取り込まれることを促進することを見出し、下記の各発明を完成した。

（１）下記の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選択されるＤＮＡ；（ａ）配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ、（ｂ）配列番号５の塩基配列を有し、かつトロポニンＴと結合するＤＮＡ、（ｃ）配列番号５の塩基配列において１または数個のヌクレオチドが欠失、置換または挿入された塩基配列を有し、かつトロポニンＴと結合するＤＮＡ。

（２）細胞表面のトロポニンＴと結合して細胞内に取り込まれる、（１）に記載のＤＮＡ。

（３）腫瘍組織における血管新生および／または脈管形成を抑制する、（１）または（２）に記載のＤＮＡ。

（４）（１）から（３）のいずれかに記載のＤＮＡと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体。

（５）配列番号５の塩基配列または配列番号５の塩基配列において１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは挿入された塩基配列を有するＤＮＡを有効成分とする、腫瘍組織における血管新生および／または脈管形成抑制剤。

（６）配列番号５の塩基配列または配列番号５の塩基配列において１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは挿入された塩基配列を有するＤＮＡを有効成分とする、細胞表面にトロポニンＴを有する細胞内へ目的物質が取り込まれることを促進する剤。

（７）目的物質が脂質膜構造体である、（６）に記載の剤。

本発明に係るＤＮＡはトロポニンＴと結合することができ、トロポニンＴは後述する実施例で示すように腫瘍マーカーであることから、本発明に係るＤＮＡによれば、腫瘍の診断や治療をすることができる他、腫瘍の診断法や治療法の研究開発に用いることができる試薬を提供することができる。また、トロポニンＴは心筋障害の発生や進行に伴い血中濃度が上昇する心筋障害マーカーでもあることから、本発明に係るＤＮＡによれば、心筋障害の診断をすることができる。また、本発明に係るＤＮＡと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体によれば、当該脂質膜構造体に結合された物質や内包された物質を、細胞内へ効率的に送達することができる。また、本発明に係るＤＮＡおよび本発明に係る腫瘍組織における血管新生および／または脈管形成抑制剤によれば、上述した血管新生阻害療法を行うことができ、腫瘍の治療や進行を抑制することができる。また、本発明に係るＤＮＡおよび本発明に係る細胞表面にトロポニンＴを有する細胞内へ目的物質が取り込まれることを促進する剤によれば、細胞表面にトロポニンＴを有する細胞の内部へ、目的物質を選択的かつ効率的に送達することができる。

さらに、本発明に係るＤＮＡによれば、生体に存在するトロポニンＴや生体から分離採取したトロポニンＴと有効に結合するＤＮＡを得ることができる。何故なら、本発明に係るＤＮＡが、タンパク質の構造変化や発現構成の変化の虞が大きい単離タンパク質や系代培養細胞を用いて選定されたものではなく、そのような虞が比較的小さい初代腫瘍血管内皮細胞を用いて選定されたものだからである。なお、後述する実施例で示すように、本発明に係るＤＮＡは初代腫瘍血管内皮細胞に対して特異的に結合することが確認されている。

化学合成した８２ｍｅｒのＤＮＡライブラリーをＨＰＬＣに供して得られたクロマトグラムである。 ＰＣＲにより増幅したＤＮＡの分子量を示す図（アガロースゲルにおける電気泳動図）である。図中、１０、１２、１５、２０、２５、３０はＰＣＲ反応のサイクル数を示し、四角で囲んだバンドは不斉一次ＰＣＲの鋳型に用いた増幅ＤＮＡを示す。 ＰＣＲにより増幅したＤＮＡの分子量を示す図（非変性ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動図）である。図中、四角で囲んだバンドは、８２ｍｅｒの１本鎖ＤＮＡに相当するバンドを示す。 結合反応を行っていないマウス腫瘍血管内皮細胞（ｍＴＥＣ）、０サイクルＤＮＡライブラリーと結合反応を行ったｍＴＥＣ、２００ｐｍｏｌのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識した配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡ（以下、「ＦＩＴＣ標識４番ＤＮＡ」という。）と結合反応を行ったｍＴＥＣおよび１０００ｐｍｏｌのＦＩＴＣ標識４番ＤＮＡと結合反応を行ったｍＴＥＣにおける、ＦＩＴＣの蛍光強度と細胞数とを示す図である。 結合反応を行っていないマウス正常血管内皮細胞（ｍＥＣ）、ヒト腎細胞癌培養細胞（ＯＳＲＣ−ＩＩ）およびメラノーマ（ＲＦＰ−ＳＭ）、０サイクルＤＮＡライブラリーと結合反応を行ったｍＥＣ、ＯＳＲＣ−ＩＩおよびＲＦＰ−ＳＭ、２００ｐｍｏｌのＦＩＴＣで標識した配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ（以下、「ＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡ」という。）と結合反応を行ったｍＥＣ、ＯＳＲＣ−ＩＩおよびＲＦＰ−ＳＭ、ならびに１０００ｐｍｏｌのＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡおよび０サイクルＤＮＡライブラリーと結合反応を行ったｍＥＣ、ＯＳＲＣ−ＩＩおよびＲＦＰ−ＳＭにおける、ＦＩＴＣの蛍光強度と細胞数とを示す図である。 結合反応を行っていないヒト腫瘍血管内皮細胞（ｈＴＥＣ）およびヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、０サイクルＤＮＡライブラリーと結合反応を行ったｈＴＥＣおよびＨＵＶＥＣ、２００ｐｍｏｌのＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡと結合反応を行ったｈＴＥＣおよびＨＵＶＥＣ、ならびに１０００ｐｍｏｌのＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡおよび０サイクルＤＮＡライブラリーと結合反応を行ったｈＴＥＣおよびＨＵＶＥＣにおける、ＦＩＴＣの蛍光強度と細胞数とを示す図である。 ＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡと結合反応を行ったｍＴＥＣおよびｍＥＣにおける、ＦＩＴＣの蛍光強度とＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡの濃度との関係、ならびにＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡとｍＴＥＣとの解離定数（Ｋｄ）を示す図である。 結合反応を行っていないｍＴＥＣ（コントロール群）、ビオチンで標識した配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡと結合反応を行ったｍＴＥＣ（Ａ群）、およびビオチンで標識した配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡと結合反応を行った後クロスリンカーを添加したｍＴＥＣ（Ｂ群）について、ビーズ結合分画とビーズ非結合分画とに含まれるタンパク質の分子量を示す図（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける泳動図）である。図中、Ａ群およびＢ群のビーズ結合分画に特異的に検出されたバンドを楕円で囲んで示す。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出された約７０ＫＤａのタンパク質についての、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ Ｍａｓｓのスペクトル、プロテインスコアのヒストグラムおよびプロテインスコアが最大であったタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。 心筋トロポニンＴおよび骨格筋トロポニンＴのアミノ酸配列の相同性を示す図である。 種々の濃度の心筋トロポニンＴと結合反応を行った配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡの、ポリアクリルアミドゲル電気泳動における泳動速度を示す図である。 何も添加していないｍＴＥＣおよびｍＥＣ（抗体無添加群）、ならびにＦＩＴＣで標識した心筋トロポニンＴ抗体を添加したｍＴＥＣおよびｍＥＣ（抗体添加群）における、ＦＩＴＣの蛍光強度と細胞数とを示す図である。 ｍＥＣおよびｍＴＥＣにおける骨格筋トロポニンＴの相対的発現量を示す図である。 ＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡと結合反応を行ったｍＴＥＣにおける、ＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡ（ＦＩＴＣ）、酸性コンパートメント（Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ）および細胞核（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３４３２）の位置を示す図である。図中、右端の融合図は、ＦＩＴＣ、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ ＲｅｄおよびＨｏｅｃｈｓｔ３３４３２を検出した画像を重ね合わせたものである。 ＤＮＡ結合ＰＥＧ脂質の構造を示す模式図である。図中、（Ｓ）はチオール基を示す。 ＤＮＡ結合ＰＥＧ脂質および配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡの分子量を示す図（４〜２０％グラジエントポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動図）である。 リポソームＡ、Ｂ、ＣおよびＤをそれぞれ取り込ませたｍＴＥＣの蛍光強度を示す図である。 結合反応を行っていないｍＴＥＣ（コントロール群）、ならびに、０サイクルＤＮＡライブラリーおよび配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡと結合反応を行ったｍＴＥＣ（０サイクル群および５番ＤＮＡ群）における、細胞が形成した管構造の様子および管構造の長さを示す図である。

以下、本発明に係るＤＮＡ、腫瘍組織における血管新生および／または脈管形成抑制剤ならびに細胞内へ目的物質が取り込まれることを促進する剤について詳細に説明する。

本発明に係るＤＮＡは、
（ａ）配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号５の塩基配列を有し、かつトロポニンＴと結合するＤＮＡ、
（ｃ）配列番号５の塩基配列において１または数個のヌクレオチドが欠失、置換または挿入された塩基配列を有し、かつトロポニンＴと結合するＤＮＡ、
以上（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選択される。

本発明に係る「ＤＮＡ」すなわちデオキシリボ核酸は、１本鎖でもよく相補的結合した２本鎖でもよい。また、その構造としては、環状構造や直鎖状、相補的二本鎖構造の他、これらが入り混じった構造などを挙げることができる。

（ｂ）および（ｃ）のＤＮＡは、トロポニンＴと結合する限り、それぞれ、配列番号５の塩基配列および配列番号５の塩基配列において１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは挿入された塩基配列以外の塩基配列を有していてもよい。すなわち、（ｂ）においては配列番号５の塩基配列に、（ｃ）においては配列番号５の塩基配列において１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは挿入された塩基配列に、それぞれ、１個もしくは複数個のヌクレオチドが付加されていてもよい。これらの場合の付加されるヌクレオチドの個数は、トロポニンＴと結合する限り特に限定されないが、例えば３５個、３４個、３３個、３２個、３１個、３０個、２９個、２８個、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個の任意の個数を挙げることができる。

（ｃ）のＤＮＡにおいて、「１または数個のヌクレオチドが欠失、置換、または挿入された塩基配列」というときの、欠失、置換、または挿入されるヌクレオチドの個数もまた、トロポニンＴと結合する限り、特に限定されないが、例えば３０個、２９個、２８個、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個の任意の個数を挙げることができる。

本発明において、ＤＮＡがトロポニンＴと結合するか否かは、定法に従い確認することができ、例えば、ゲルシフトアッセイにより簡便に確認することができる。ゲルシフトアッセイでは、蛍光標識したＤＮＡをトロポニンＴと混合してインキュベートすることにより反応させた後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、蛍光を検出することでＤＮＡの泳動速度を検出する。トロポニンＴと反応させない場合と比較して、トロポニンＴと反応させた場合にＤＮＡの泳動速度が遅くなれば、そのＤＮＡはトロポニンＴと結合すると判断することができる。

ここで、トロポニンＴは、心筋や骨格筋においてカルシウム濃度を調整するタンパク質として知られるトロポニンのサブユニットの一つである。本発明において、トロポニンＴは、トロポニンの他のサブユニットであるトロポニンＩやトロポニンＣと複合体を形成しているものでもよく、トロポニンＴのみからなる単量体や二量体、三量体などでもよい。また、トロポニンＴの由来する生物種はどのような生物種でもよく、具体的には、例えば、ヒト、ヒトを除く霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、鳥類などを挙げることができるが、これらのうちのいずれでもよい。また、トロポニンＴの由来する組織や器官としては、例えば、心筋、骨格筋、腫瘍組織などを挙げることができるが、これらのうちのいずれでもよい。また、トロポニンＴは、生体あるいは細胞から単離・精製したものでもよく、生体内や細胞内、細胞表面上などに存在するものでもよい。

本発明に係るＤＮＡは、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選択される限り、特に限定されないが、好ましくは、細胞表面のトロポニンＴと結合して細胞内に取り込まれるＤＮＡである。ここで、本発明における「細胞表面のトロポニンＴ」とは、細胞表面に存在するトロポニンＴを意味する。トロポニンＴが細胞表面に存在する態様としては、例えば、細胞膜に埋め込まれた態様や、膜タンパク質や膜の構成脂質の細胞外側に結合した態様、細胞膜上の糖鎖に結合した態様などを挙げることができるが、これらのうちのいずれでもよく、これらのような態様でなくてもよい。また、本発明に係るＤＮＡが細胞内に取り込まれる態様としては、例えば、ファゴサイトーシスやピノサイトーシス、マクロピノサイトーシスなどのエンドサイトーシスにより取り込まれる態様、チャネルタンパク質から取り込まれる態様などを挙げることができるが、これらのうちのいずれでもよく、これらのような態様でなくてもよい。

本発明において、ＤＮＡが細胞表面のトロポニンＴと結合して細胞内に取り込まれるか否かは、定法に従って確認することができ、そのような方法としては、例えば、細胞と反応させたＤＮＡの位置を蛍光観察する方法を挙げることができる。この方法では、まず、細胞表面にトロポニンＴを有する細胞と蛍光標識したＤＮＡとを混合して一定時間インキュベートする。次に、細胞核やリソソームなどの細胞小器官を蛍光染色する。その後、ＤＮＡおよび細胞小器官を蛍光観察し、それらの位置関係からＤＮＡが細胞内に存在するのか細胞外に存在するのかを確認する。当該ＤＮＡが細胞内に存在すれば、細胞表面のトロポニンＴと結合して細胞内に取り込まれたと判断することができる。

なお、本発明における「細胞表面にトロポニンＴを有する細胞」として、具体的には、例えば、腫瘍血管内皮細胞を挙げることができる。ここで、本発明において、その表面にトロポニンＴを有する細胞か否かは定法に従い確認することができ、そのような方法としては、例えば、蛍光標識したトロポニンＴ抗体を反応させた細胞をフローサイトメトリーに供して蛍光強度を測定する方法を挙げることができる。測定した蛍光強度がトロポニンＴ抗体を反応させない場合の蛍光強度と比較して大きい場合は、その細胞は表面にトロポニンＴを有すると判断することができる。これらの方法により、任意の細胞から本発明に係る「細胞表面にトロポニンＴを有する細胞」を得ることができる。

また、本発明に係るＤＮＡは、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選択される限り、特に限定されないが、好ましくは腫瘍組織における血管新生や脈管形成を抑制するＤＮＡである。ここで、本発明における「腫瘍組織」は良性および悪性のいずれでもよく、腫瘍（癌）の種類も問わない。腫瘍（癌）の種類としては、例えば、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、頭頸部癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大症、直腸癌、腎臓癌、精巣癌、子宮癌、甲状腺癌、喉頭癌などを挙げることができる。

血管新生とは、元々存在する血管から新しい血管が生じることをいい、脈管形成とは、管構造を未だ形成していない中胚葉性の細胞が血管構造を形成することをいう。腫瘍組織では腫瘍実質細胞の増殖など、腫瘍の進行に伴って血管新生が起こることが知られている。本発明において、ＤＮＡが腫瘍組織において血管形成や脈管形成を抑制するか否かは、定法に従って確認することができる。そのような方法としては、例えば、腫瘍組織から単離した腫瘍血管内皮細胞にＤＮＡを投与して一定時間培養し、細胞によって形成された管構造の様子を観察あるいは管構造の長さを測定する方法を挙げることができる。その結果、ＤＮＡを投与せずに培養した場合と比較して、管構造が形成された領域が小さい場合や管構造の長さが短い場合は、投与されたＤＮＡが血管形成や脈管形成を抑制すると判断することができる。

本発明に係るＤＮＡは、当業者によって適宜選択可能な方法を用いて合成することができる。そのような方法としては、例えば、ＤＮＡ合成装置を用いて固相合成法などにより化学合成する方法の他、配列番号５の塩基配列、または配列番号５において１または数個のヌクレオチドが欠失、置換または挿入された塩基配列を鋳型とし、ＤＮＡポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により合成する方法、プラスミドベクターやウイルスベクターなどのベクターに配列番号５の塩基配列、または配列番号５において１または数個のヌクレオチドが欠失、置換または挿入された塩基配列を挿入して組み換えベクターを作製し、作製した組み換えベクターを適切な宿主細胞に導入して得られる形質転換体を培養して増殖させ、増殖させた形質転換体から採取する方法などを挙げることができる。なお、いずれの合成法においても、当業者により広く知られている一般的な方法の他、あらゆる方法を利用することができる。

本発明に係るＤＮＡは、本発明の特徴を損なわない範囲において、適宜、必要に応じて、保護基や官能基、標識物質などで修飾をすることができ、そのように修飾されたＤＮＡも本願発明に包含される。本発明に係るＤＮＡの修飾に用いることができる物質としては、例えば、アシル基やジメトキシトリチル基、チオール基、２’−フッ化ピリミジン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖、テネイシン、３２Ｐや３Ｈ、１４Ｃ、１３Ｃ、１５Ｎなどの放射性同位体（ＲＩ）、ＦＩＴＣやジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ビオチンなどの標識物質を挙げることができる。また、ＤＮＡを構成するヌクレオチドにおけるリン酸基の酸素原子が硫黄原子で置換（ホスホロチオエート化）されていてもよい。

また、本発明に係るＤＮＡは、本発明の特徴を損なわない範囲において、種々の物質と混合あるいは結合などして、複合体として用いることができる。本発明に係るＤＮＡと複合体を形成しうる物質として、具体的には、例えば、各種薬剤、核酸、ペプチド、酵素や抗体などのタンパク質、単糖や多糖といった生理活性物質や標識物質、リポソームやミセルなどの脂質膜構造体を挙げることができる。

次に、本発明は、本発明に係るＤＮＡと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体を提供する。本発明に係る脂質膜構造体の好ましい形態としては、脂質二重層からなる脂質膜を有する閉鎖小胞を挙げることができ、そのような脂質膜構造体としては、例えば、リポソームを挙げることができる。

本発明に係る「ＤＮＡと結合した脂質」は、ＤＮＡと脂質とが直接結合したものでもよく、マレイミド基やメトキシ基、チオール基などの官能基や保護基、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの何らかのスペーサーを介してＤＮＡと脂質とが結合したものでもよい。

本発明に係る脂質膜構造体は、単純水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結・融解法などの公知の方法を用いて製造することができる。なお、本発明に係る脂質膜構造体の製造に際し、本発明に係るＤＮＡは、脂質膜構造体を調製した後に、当該脂質膜構造体の構成脂質である脂質に結合させてもよく、あらかじめ本発明に係るＤＮＡと結合した脂質を調製して、当該脂質を用いて脂質膜構造体を製造してもよい。

本発明に係る脂質膜構造体は、正帯電性、非帯電性、両（正負）帯電性および負帯電性のいずれでもよい。また、本発明に係る脂質膜構造体が有する脂質膜の枚数は１枚であってもよく、２以上の複数枚であってもよい。本発明に係る脂質膜構造体を構成する脂質は、正帯電性脂質、両（正負）帯電性脂質や非帯電性脂質を含む中性脂質、負帯電性脂質のいずれでもよく、脂質の種類としては、例えば、リン脂質、糖脂質、ステロール、長鎖脂肪族アルコールあるいはグリセリン脂肪酸エステルなどを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。

リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンなど）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロールなど）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレオイルグリセロフォスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）など）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸（ＰＡ）、カルジオリピン、またはこれらの水素添加物、卵黄、大豆その他の動植物に由来する天然脂質（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチンなど）などを挙げることができ、これらのうちの１種または２種以上を用いることができる。

糖脂質としては、スフィンゴミエリン、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリドなどのグリセロ糖脂質、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシドなどのスフィンゴ糖脂質などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。

ステロールとしては、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロールなどの動物由来のステロール、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロールなどの植物由来のステロール（フィトステロール）、チモステロール、エルゴステロールなどの微生物由来のステロールなどを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。また、これらのステロールは、一般には脂質二重層を物理的または化学的に安定させるために、あるいは膜の流動性を調節するために用いることができる。

長鎖脂肪酸または長鎖脂肪族アルコールとしては、炭素数１０〜２０の脂肪酸またはそのアルコールを使用することができる。そのような長鎖脂肪酸または長鎖脂肪族アルコールとしては、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、アラキジン酸、マルガリン酸、ツベルクロステアリン酸などの飽和脂肪酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、アラキドン酸、バクセン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エレオステアリン酸などの不飽和脂肪酸、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、リノリルアルコールなどを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。

グリセリン脂肪酸エステルとしては、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリドを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。

正帯電性脂質としては、上述した脂質の他、例えば、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロライド（ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＤＯＤＡＣ）、Ｎ−（２，３−オレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（Ｎ−（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ、ＤＯＴＭＡ）、ジドデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｄｏｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ ｐｒｏｐａｎｅ、ＤＯＴＡＰ）、３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモールコレステロール（３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）−ｃａｒｂａｍｏｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ、ＤＭＲＩＥ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ−Ｎ−［２（ｓｐｅｒｍｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｕｍ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、ＤＯＳＰＡ）などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。

また、両（正負）帯電性脂質や非帯電性脂質を含む中性脂質としては、上述した脂質の他、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミドなどを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。また、負帯電性脂質としては、上述した脂質の他、例えば、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−スクシニルＰＥ）、ホスファチジルエチレングリコール、コレステリルヘミスクシネート（ＣＨＥＭＳ）などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。

本発明に係る脂質膜構造体の脂質膜には、上述した脂質の他に、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエンなどの抗酸化剤、ステアリルアミン、オレイルアミンなどの正荷電を付与する荷電物質、ジセチルホスフェートなどの負電荷を付与する荷電物質、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質などの膜タンパク質、抗体、脂質膜構造体に細胞透過能や核移行能を付与するペプチドなどの機能性ペプチド、標的化リガンドその他のドラッグデリバリー用機能性素子を結合または含有させることができ、その結合量や含有量は適宜調節することができる。

本発明に係る脂質膜構造体は、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン緩衝液，酢酸緩衝液などの適当な水性溶媒に分散させて使用することができる。分散液には、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤などの添加剤を適宜添加してもよい。また、本発明に係る脂質膜構造体は、前記の分散液を乾燥させた状態で保存することができる。

なお、本発明において、「結合」は、「付着」、「接着」、「合体」、「接続」、「連結」、「接合」、「密着」、「相互作用」「接触」と交換可能に用いられる場合がある。また、本発明における結合様式としては、例えば、共有結合、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合や機械的結合、ハロゲン結合などの非共有結合、ジスルフィド結合、ペプチド結合、ホスホジエステル結合、グリコシド結合、疎水結合、スタッキング結合などを挙げることができるが、これらのうちのいずれであってもよい。

次に、本発明は、腫瘍組織における血管新生および／または脈管形成抑制剤を提供する。本発明に係る腫瘍組織における血管新生および／または脈管形成抑制剤は、
（ｄ）配列番号５の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｅ）配列番号５の塩基配列において１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは挿入された塩基配列を有するＤＮＡ、
以上（ｄ）または（ｅ）を有効成分とする。なお、腫瘍組織における血管新生および／または脈管形成抑制剤において、上述した本発明に係るＤＮＡまたはＤＮＡと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体の構成と同等または相当する構成については再度の説明を省略する。

（ｄ）および（ｅ）のＤＮＡは、腫瘍組織における血管新生や脈管形成を抑制する限り、それぞれ、配列番号５の塩基配列および配列番号５の塩基配列において１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは挿入された塩基配列以外の塩基配列を有していてもよい。すなわち、（ｄ）においては配列番号５の塩基配列に、（ｅ）においては配列番号５の塩基配列において１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは挿入された塩基配列に、それぞれ、１個もしくは複数個のヌクレオチドが付加されていてもよい。この場合の付加されるヌクレオチドの個数は、腫瘍組織における血管新生や脈管形成を抑制する限り特に限定されないが、例えば３５個、３４個、３３個、３２個、３１個、３０個、２９個、２８個、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個の任意の個数を挙げることができる。

（ｅ）のＤＮＡにおいて、「１または数個のヌクレオチドが欠失、置換、または挿入された塩基配列」というときの、欠失、置換、または挿入されるヌクレオチドの個数もまた、腫瘍組織における血管新生や脈管形成を抑制する限り、特に限定されないが、例えば３０個、２９個、２８個、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個の任意の個数を挙げることができる。

最後に、本発明は、細胞表面にトロポニンＴを有する細胞内へ目的物質が取り込まれることを促進する剤を提供する。本発明に係る細胞表面にトロポニンＴを有する細胞内へ目的物質が取り込まれることを促進する剤は、
（ｆ）配列番号５の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｇ）配列番号５の塩基配列において１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは挿入された塩基配列を有するＤＮＡ、
以上（ｆ）または（ｇ）を有効成分とする。なお、細胞表面にトロポニンＴを有する細胞内へ目的物質が取り込まれることを促進する剤において、上述した本発明に係るＤＮＡ、ＤＮＡと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体、または腫瘍組織における血管新生および／もしくは脈管形成抑制剤と同等または相当する構成については再度の説明を省略する。

（ｆ）および（ｇ）のＤＮＡは、細胞表面にトロポニンＴを有する細胞内へ目的物質が取り込まれることを促進する限り、それぞれ、配列番号５の塩基配列および配列番号５の塩基配列において１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは挿入された塩基配列以外の塩基配列を有していてもよい。すなわち、（ｆ）においては配列番号５の塩基配列に、（ｇ）においては配列番号５の塩基配列において１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは挿入された塩基配列に、それぞれ、１個もしくは複数個のヌクレオチドが付加されていてもよい。この場合の付加されるヌクレオチドの個数は、細胞表面にトロポニンＴを有する細胞内へ目的物質が取り込まれることを促進する限り特に限定されないが、例えば３５個、３４個、３３個、３２個、３１個、３０個、２９個、２８個、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個の任意の個数を挙げることができる。

（ｅ）のＤＮＡにおいて、「１または数個のヌクレオチドが欠失、置換、または挿入された塩基配列」というときの、欠失、置換、または挿入されるヌクレオチドの個数もまた、細胞表面にトロポニンＴを有する細胞内へ目的物質が取り込まれることを促進する限り、特に限定されないが、例えば３０個、２９個、２８個、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個の任意の個数を挙げることができる。

本発明における「目的物質」は、本発明の特徴を損なわない範囲においていかなる物質でもよく、例えば、各種薬剤、核酸、ペプチド、タンパク質、糖またはこれらの複合体などの種々の生理活性物質や標識物質、リポソームやミセルなどの脂質膜構造体を挙げることができ、診断、治療などの目的に応じて適宜選択することができる。このうち、目的物質が脂質膜構造体である場合は、当該脂質膜構造体に各種薬剤や核酸、ペプチド、酵素や抗体などのタンパク質、糖またはこれらの複合体などの種々の生理活性物質を内包あるいは結合させて目的物質とすることができる。

本発明において、目的物質が細胞内へ取り込まれる態様は、上述の本発明に係るＤＮＡが細胞内に取り込まれる態様と同様のものを挙げることができる。また、目的物質が細胞内へ取り込まれるか否かの確認は、上述の本発明に係るＤＮＡが細胞内に取り込まれるか否かを確認する方法と同様の方法により行うことができる。

本発明に係る腫瘍組織における血管新生および／もしくは脈管形成抑制剤ならびに細胞表面にトロポニンＴを有する細胞内へ目的物質が取り込まれることを促進する剤の製剤化には、当業者に公知の方法を用いることができる。投与形態もまた、当業者によって適宜選択することができる投与形態でよく、そのような投与形態としては、例えば、経口投与製剤として調製する場合の、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、コーティング剤、液剤、懸濁剤などの形態を挙げることができ、非経口投与製剤にする場合の、吸入剤、注射剤、点滴剤、座薬、塗布剤、噴霧剤、貼付剤などの形態を挙げることができる。また、その投与量は、医薬組成物の製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される投与対象の年齢、体重、症状によって適宜設定することができる。

以下、本発明に係るＤＮＡ、腫瘍組織における血管新生および／または脈管形成抑制剤ならびに細胞内へ目的物質が取り込まれることを促進する剤について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。

＜試薬・細胞の調製＞
（１）セレクションバッファーの調製
終濃度で５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌ、１００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ_２、２５０ｍｍｏｌ／Ｌのｓｕｃｒｏｓｅ、０．１％（ｗ／ｖ）のｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄ、２μｍｏｌ／Ｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および２μｍｏｌ／Ｌの酵母由来ｔＲＮＡを含む水溶液を調製し、濾過滅菌して、これをセレクションバッファーとした。

（２）細胞の調製
既報（Ａｋｉｎｏ Ｔ．ら、Ａｍ．Ｊ．ｐａｔｈｏｌ．、第１７５巻、第２６５７−２６６７頁、２００９年；Ｈｉｄａ Ｋ.ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．、第９９巻、第４５９−４６６頁、２００８年）に従い、マウスの真皮からマウス正常血管内皮細胞（ｍＥＣ）およびマウス腫瘍血管内皮細胞（ｍＴＥＣ）を、ヒト腎臓癌組織からヒト腫瘍血管内皮細胞（ｈＴＥＣ）をそれぞれ単離した。このようにして得られたｍＥＣ、ｍＴＥＣおよびｈＴＥＣは初代培養細胞である。また、ヒト腎細胞癌培養細胞（ＯＳＲＣ−ＩＩ；独立行政法人理化学研究所）、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ；Ｌｏｎｚａ社）および本願発明者がＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡのＩｓａｉａｈ Ｊ．Ｆｒｉｄｌｅｒ氏より供与されたメラノーマ（ＲＦＰ−ＳＭ）を用意した。

細胞は、フローサイトメトリーに供する場合は、１０ｃｍのＲｅｐ Ｃｅｌｌ ｄｉｓｈ（ＣｅｌｌＳｅｅｄ社）に、それ以外の場合は通常のｄｉｓｈに、それぞれ５×１０^５個の濃度で播種した後、１×１０^６個になるまで培養した。培養条件は３７℃、５％ＣＯ_２、湿度９５％とした。培地は、初代ｍＥＣ、初代ｍＴＥＣおよび初代ｈＴＥＣに対しては５％（ｖ／ｖ）となるよう仔ウシ血清（ＦＢＳ）および成長因子を添加した血管内皮細胞用増殖培地（ＥＧＭ−２ＭＶ培地）を、ＯＳＲＣ−ＩＩに対しては１０％（ｖ／ｖ）となるようＦＢＳを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地を、ＨＵＶＥＣに対しては２％（ｖ／ｖ）となるようＦＢＳを添加したＥＢＭ−２培地を、ＲＦＰ−ＳＭに対してはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）を、それぞれ用いた。細胞を使用する際は、Ｒｅｐ Ｃｅｌｌ ｄｉｓｈには４℃に冷却した培地を加えることにより、通常のｄｉｓｈには０．１％（ｗ／ｖ）となるようトリプシンを添加することにより、ｄｉｓｈから細胞を剥がした。次に、１０００×ｇ、４℃の条件下で５分間遠心分離を行って上清を除去した後、セレクションバッファーで３回洗浄した。続いて、４０μｍの孔径を有するセルストレーナー（ＢＤ−Ｆａｌｃｏｎ社；以下「４０μｍストレーナー」という。）に通した後に、使用した。

＜実施例１＞ＤＮＡの選定
（１）０サイクルＤＮＡライブラリーの調製
ＤＮＡ固相合成機ＡＢＩ３９４（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、ホスホロアミダイト法に基づく化学合成によりＤＮＡを調製し、０サイクルＤＮＡライブラリーとした。０サイクルＤＮＡライブラリーに含まれるＤＮＡの塩基配列は、５’側および３’側にそれぞれ２１ｍｅｒのＰＣＲ用配列を持ち、その間にアデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミジン（Ｔ）の群から任意に選択されてなる４０ｍｅｒのランダム配列（Ｎ４０）を持つ計８２ｍｅｒとした。すなわち、その塩基配列は５’−ＣＧＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＧＧＡＣＧＴＴ−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−ＡＧＣＴＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＣＧＡＴ−３’（配列番号１；ＮはＡ、Ｇ、ＣおよびＴから選択されるいずれかの塩基である）で表される。

具体的には、チミジン３’−水酸基を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓを固相担体とし、塩基部をアシル基で、５’−水酸基をジメトキシトリチル基でそれぞれ保護したＡ、Ｇ、ＣおよびＴの各ホスホロアミダイトを、促進剤ベンズイミダゾリウムトリフレートの存在下で反応させて鎖長を伸張した。Ｎ４０の合成は、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴの各ホスホロアミダイトを１：１：１：１の割合で混合した溶液を導入して行った。続いて、５０℃で１６時間アンモニア処理を行って塩基部を脱保護した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行って精製した。ＨＰＬＣは、装置としてＥｌｉｔｅ ＬａＣｈｒｏｍ Ｌ−２０００ ｓｅｒｉｅｓ（日立社）を、カラムとしてＺｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ ｐｌｕｓ Ｃ１８、４．６×２５０ｍｍ（ａｇｉｌｅｎｔ社）を、展開溶媒Ａ液として１００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸トリエチルアンモニウムを、展開溶媒Ｂ液としてメタノールを、検出器として紫外検出器を、それぞれ用いて、カラム温度は６５℃とし、紫外線の波長は２５４ｎｍとして、定法に従い行った。その後、８０％（ｖ／ｖ）酢酸を用いてジメトキシトリチル基の脱保護を行い、再度、同条件でＨＰＬＣを行って精製した。その結果を図１に示す。図１に示すように、保持時間６分２７秒において、目的とする８２ｍｅｒのＤＮＡに相当する最大ピークが確認されたため、これを分取して、０サイクルＤＮＡライブラリーとした。この結果から、ｃｅｌｌ ｂａｓｅｄ ｓｅｌｅｘ法に用いるのに十分な高純度のＤＮＡライブラリーが得られたことが確認された。

（２）ｃｅｌｌ ｂａｓｅｄ ｓｅｌｅｘ法
［２−１］１サイクルの選定
本実施例１（１）の０サイクルＤＮＡライブラリー２００ｐｍｏｌをセレクションバッファー５００μＬに加えて８０℃で１０分間加熱した後、放冷することにより二次構造を形成させた。続いて、２ｎｍｏｌの酵母由来ｔＲＮＡおよび１０００ｐｍｏｌのＢＳＡを加えて、結合用ＤＮＡ溶液を調製した。１×１０^６個のｍＴＥＣに結合用ＤＮＡ溶液を添加し、５分間隔で天地転倒しながら４℃で４５分間インキュベートすることにより、ＤＮＡとｍＴＥＣとの結合反応を行った。結合反応後、４℃、２００×ｇの条件下で５分間遠心分離を行い、上清を除去して細胞を回収した。回収した細胞をセレクションバッファーに懸濁し、８０℃に加熱することにより細胞に結合したＤＮＡを変成させた。４℃、２００×ｇの条件下で５分間遠心分離を行ってＤＮＡを含む上清を回収した。回収した上清を３回のフェノール／クロロホルム抽出に供して水層を回収した。水層をクロロフルムで３回洗浄した後、５０μＬの３ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム、５μＬの１ｍｇ／ｍＬグリコーゲンおよび１２００μＬのエタノールを加えて、−２０℃で一晩静置することによりＤＮＡを沈殿させた。その後、１５０００×ｇ、４℃の条件下で６０分間遠心分離を行って上清を除去し、ＤＮＡペレットを回収した。得られたＤＮＡペレットに７０％（ｖ／ｖ）エタノールを加え、１５０００×ｇ、４℃の条件下で３０分間遠心分離を行って 上清を除去することにより洗浄した。

得られたＤＮＡを１０μＬのＴＣＥＰ水に溶解し、これを鋳型として、下記条件により一段階目のＰＣＲを行うことによりＤＮＡを増幅し、増幅ＤＮＡを得た。続いて、増幅ＤＮＡを３．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後のゲルをエチジウムブロミドにより染色し、Ｄｏｌｐｈｉｎｅ ｖｉｅｗ２ トランスイルミネーター（倉敷紡績社）により検出した。その結果を図２に示す。図２に示すように、サイクル数１２回において、目的とする８２ｍｅｒのＤＮＡに相当するバンドのみが確認されたため、これを切り出した。切り出したゲルについて、ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ ｍｅｎｂｒａｎｅ ＭＷＣＯ ２０００（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ社）を用いて、５０Ｖで、３０分間電気溶出することにより、ＤＮＡを溶出した。続いて、定法に従いフェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出およびエタノール沈殿に供し、これを精製増幅ＤＮＡとした。

一段階目のＰＣＲの条件
ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（キアゲン社）
フォワードプライマー；５’末端にＦＩＴＣが結合した次の配列からなるプライマー ５’−ＣＧＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＧＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号２）
リバースプライマー：５’末端にＦＩＴＣが結合した次の配列からなるプライマー ５’−ＡＧＣＴＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＣＧＡＴ−３’（配列番号３）
反応液の組成；鋳型ＤＮＡ１ｎｍｏｌ／Ｌ、プライマー各１μｍｏｌ／Ｌ、ｄＮＴＰｓ２００μｍｏｌ／Ｌ、ＤＮＡポリメラーゼ５Ｕ
反応条件；９５℃で５分間の後、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒および７２℃で１分の反応を１サイクルとして、１０、１２、１５、２０、２５または３０サイクル行い、最後に７２℃で４分間インキュベートすることにより、増幅ＤＮＡを得た。

その後、精製増幅ＤＮＡを鋳型として、既報（Ｇｙｌｌｅｎｓｔｔｅｎ Ｕ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第８５巻、第７６５２−７６５６頁、１９８８年）に従い、不斉ＰＣＲ（不斉一次ＰＣＲおよび不斉二次ＰＣＲ）を行うことにより、一本鎖ＤＮＡのみを増幅させた不斉二次ＰＣＲ産物を得た。不斉一次ＰＣＲの条件は、鋳型として精製増幅ＤＮＡの濃度を１μｍｏｌ／Ｌとし、サイクル数を１０サイクルとした以外は一段階目のＰＣＲと同条件とした。不斉二次ＰＣＲの条件は下記のとおりとした。不斉二次ＰＣＲ産物を２０％（ｗ／ｖ）の非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。泳動後のゲルをエチジウムブロミドにより染色し、ＵＶトランスイルミネーターにより検出した。その結果を図３に示す。図３に示すように、８２ｍｅｒの１本鎖ＤＮＡに相当するバンドが確認されたため、これを切り出した。切り出したゲルを細かく砕いた後、３７℃でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に浸すことによりＤＮＡを溶出して溶液とした。得られた溶液を定法に従いフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿に供した後、ＮＡＰ−５カラムを用いて脱塩し、これを１サイクルの選定後のＤＮＡライブラリーとした。

不斉二次ＰＣＲの条件（下記以外は一段階目のＰＣＲと同条件）
ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（キアゲン社）
反応液の組成；鋳型ＤＮＡとして不斉一次ＰＣＲのＰＣＲ産物１／１０量、一段階目のＰＣＲのフォワードプライマーのみ１μｍｏｌ／Ｌ、ｄＮＴＰｓ２００μｍｏｌ／Ｌ、ＤＮＡポリメラーゼ５Ｕ
反応条件；９５℃で５分間の後、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒および７２℃で１分の反応を１サイクルとして、２５サイクル行い、最後に７２℃で４分間インキュベートすることにより、不斉二次ＰＣＲ産物を得た。

［２−２］１２サイクルの選定
本実施例１（１）の０サイクルＤＮＡライブラリーを本実施例１（２）［２−１］の１サイクルの選定後のＤＮＡライブラリーに代えて、本実施例１（２）［２−１］の操作を行い、２サイクルの選定後のＤＮＡライブラリーを得た。以降、同様の操作を繰り返し行い、１２サイクルの選定後のＤＮＡライブラリーを得て、これを選定後ＤＮＡとした。ただし、１１サイクル目および１２サイクル目では、ｍＴＥＣに代えてｍＥＣおよびＯＳＲＣ−ＩＩをそれぞれ用い、結合反応後の遠心分離を行った際に、沈殿物を除去して上清を回収することにより、ネガティブセレクションを行った。

（３）クローニングおよびシークエンス
本実施例１（２）［２−２］の選定後ＤＮＡについて、ＴＯＰＯ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて添付の使用書に従いクローニングを行い、選定後ＤＮＡが挿入されたプラスミドを得た。プラスミドを定法に従ってｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに導入した。ＳＯＣ培地を加えて大腸菌を１時間培養した後、アンピシリンを添加したＬＢ寒天培地に播種し、３７℃で１８時間培養してコロニーを得た。得られたコロニーについて、選定後ＤＮＡが挿入されたプラスミドを持つことを、定法に従いコロニーＰＣＲを行って確認した後、６０個のコロニーを、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地に加えて３７℃で１８時間培養した。その後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて添付の使用書に従いプラスミドを回収し、定法に従ってシークエンシングを行った。その結果、選定後ＤＮＡの塩基配列は、５’−ＣＧＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＧＧＡＣＧＴＴＡＣＧＴＡＣＣＧＡＣＴＴＣＧＴＡＴＧＣＣＡＡＣＡＧＣＣＣＴＴＴＡＴＣＣＡＣＣＴＣＡＧＣＴＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＣＧＡＴ−３’（配列番号４）であることが明らかになった。すなわち、ＰＣＲ用配列の間の４０ｍｅｒのランダム配列（Ｎ４０）は、５’−ＡＣＧＴＡＣＣＧＡＣＴＴＣＧＴＡＴＧＣＣＡＡＣＡＧＣＣＣＴＴＴＡＴＣＣＡＣＣＴＣ（配列番号５）−３’であることが明らかになった。

＜実施例２＞ＤＮＡの結合性および解離定数の検討
（１）配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡの腫瘍血管内皮細胞に対する結合性
ＦＩＴＣで標識した配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡ（以下、「ＦＩＴＣ標識４番ＤＮＡ」という。）を化学合成した。ＦＩＴＣ標識４番ＤＮＡ２００ｐｍｏｌおよび１０００ｐｍｏｌ、ならびに実施例１（１）の０サイクルＤＮＡライブラリー２００ｐｍｏｌについて、ｍＴＥＣに対し、実施例１（２）［２−１］に記載の方法により結合反応を行って細胞を回収した。続いて、回収した細胞をセレクションバッファーに懸濁した後、４０μｍストレーナーで濾過して濾液を回収した。濾液をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ−Ｆａｌｃｏｎ社）を用いてフローサイトメトリーに供し、１００００個の細胞のＦＩＴＣの蛍光強度を測定して、蛍光強度を横軸、細胞数を縦軸に示すヒストグラムを得た。また、結合反応を行っていないｍＴＥＣを同様にフローサイトメトリーに供してヒストグラムを得た。その結果を図４に示す。

図４に示すように、結合反応を行っていないｍＴＥＣおよび０サイクルＤＮＡライブラリーと結合反応を行ったｍＴＥＣでは蛍光強度の大きい細胞は検出されず、蛍光強度の小さい細胞が大多数であった。これに対し、２００ｐｍｏｌおよび１０００ｐｍｏｌのＦＩＴＣ標識４番ＤＮＡと結合反応を行ったｍＴＥＣでは、蛍光強度の大きい細胞が多数検出された。また、１０００ｐｍｏｌのＦＩＴＣ標識４番ＤＮＡと結合反応を行ったｍＴＥＣの方が、２００ｐｍｏｌのＦＩＴＣ標識４番ＤＮＡと結合反応を行ったｍＴＥＣよりも細胞の蛍光強度が大きかった。これらの結果から、配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡは、腫瘍血管内皮細胞に結合することが明らかになった。

（２）配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡの腫瘍血管内皮細胞に対する結合性
ＦＩＴＣで標識した配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ（以下、「ＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡ」という。）を化学合成した。ＦＩＴＣ標識４番ＤＮＡに代えてＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡを用いて、本実施例２（１）と同様の実験を行った。その結果は、ＦＩＴＣ標識４番ＤＮＡを用いた場合と同様であった（結果は図示しない）。これらの結果から、配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡは、腫瘍血管内皮細胞に結合することが明らかになった。そこで、以下の実験では、配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡを用いることとした。

（３）正常血管内皮細胞、腫瘍実質細胞およびメラノーマに対する結合性
ＦＩＴＣ標識４番ＤＮＡに代えてＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡを、ｍＴＥＣに代えてｍＥＣ、ＯＳＲＣ−ＩＩおよびＲＦＰ−ＳＭをそれぞれ用いて、本実施例２（１）と同様の実験を行った。その結果を図５に示す。図５に示すように、ｍＥＣ、ＯＳＲＣ−ＩＩおよびＲＦＰ−ＳＭのいずれにおいても、結合反応を行っていない場合および０サイクルＤＮＡライブラリーと結合反応を行った場合と、２００ｐｍｏｌおよび１０００ｐｍｏｌのＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡと結合反応を行った場合とで、細胞の蛍光強度は同程度であった。すなわち、ＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡは、ｍＥＣ、ＯＳＲＣ−ＩＩおよびＲＦＰ−ＳＭには結合しないことが明らかになった。これらの結果および本実施例２（２）の結果から、配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡは、正常血管内皮細胞、腫瘍実質細胞およびメラノーマには結合せず、腫瘍血管内皮細胞に特異的に結合することが示された。

（４）ヒトの腫瘍血管内皮細胞に対する結合性
ＦＩＴＣ標識４番ＤＮＡに代えてＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡを、ｍＴＥＣに代えてｈＴＥＣおよびＨＵＶＥＣをそれぞれ用いて、本実施例２（１）と同様の実験を行った。その結果を図６に示す。図６に示すように、ｈＴＥＣでは、結合反応を行っていない場合および０サイクルＤＮＡライブラリーと結合反応を行った場合と比較して、２００ｐｍｏｌおよび１０００ｐｍｏｌのＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡと結合反応を行った場合は、蛍光強度の大きい細胞が多数検出された。一方、ＨＵＶＥＣでは、結合反応を行っていない場合および０サイクルＤＮＡライブラリーと結合反応を行った場合と２００ｐｍｏｌおよび１０００ｐｍｏｌのＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡと結合反応を行った場合とで、細胞の蛍光強度は同程度であった。すなわち、ＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡは、ｈＴＥＣに結合し、ＨＵＶＥＣには結合しないことが明らかになった。これらの結果から、配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡは、マウスのみならずヒトにおいても、腫瘍血管内皮細胞に特異的に結合することが示された。

（５）解離定数
ＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡについて、ｍＴＥＣおよびｍＥＣに対し、実施例１（２）［２−１］に記載の方法により結合反応を行って細胞を回収した。ただし、結合反応の際の細胞数は１サンプルあたり５×１０^５個とし、ＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡの濃度は１ｎｍｏｌ／Ｌ〜１５０ｎｍｏｌ／Ｌの範囲で変化させた。続いて、回収した細胞を、本実施例２（１）に記載の方法によりフローサイトメトリーに供して測定を行った。次に、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（ＳＹＳＴＡＴ社）を用いて、蛍光強度と結合反応時のＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡの濃度との関係をプロットしたグラフを作成し、ＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡとｍＴＥＣとの解離定数（Ｋｄ）を算出した。その結果を図７に示す。図７に示すように、Ｋｄの値は４３．８±１３．７ｎｍｏｌ／Ｌであった。既報（ｋｅｅｆｅ，ＡＤ．ら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．、第９巻、第５３７−５５０頁、２０１０年）によると、現在治療などに利用可能性があるアプタマーの解離定数は０．１３〜４２０ｎｍｏｌ／Ｌであるのに対し、得られたＫｄの値はこの範囲内であったことから、配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡは、腫瘍血管内皮細胞に対してアプタマーとして十分使用可能な程度に高い解離定数を有することが明らかになった。

また、図７に示すように、ＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡの濃度がいずれの場合も、ｍＴＥＣの方がｍＥＣと比較して蛍光強度が大きかった。さらに、ｍＥＣではＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡの濃度に関わらず蛍光強度が一定であったのに対して、ｍＴＥＣではＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡの濃度が大きいほど蛍光強度が大きかった。これらの結果は本実施例２（２）および（３）と一致する結果であったことから、配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡは、腫瘍血管内皮細胞に特異的に結合し、正常血管内皮細胞には結合しないことが再度確認された。

＜実施例３＞ＤＮＡの標的物質の同定
（１）標的物質の単離および同定
６×１０^６個のｍＴＥＣを３群用意し、Ａ群、Ｂ群およびコントロール群とした。１％（ｗ／ｖ）となるようｔｒｉｔｏｎを、０．１％（ｗ／ｖ）となるようプロテアーゼインヒビターをそれぞれ加え、３０分間撹拌することにより細胞を溶解した。続いて、１４０００×ｇ、４℃の条件下で５分間遠心分離を行って上清を回収した。次に、Ａ群およびＢ群には、５’末端をビオチンで標識した配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡを加え、コントロール群には何も加えなかった。続いて、Ｂ群にクロスリンカーとして５０ｎｍｏｌのＤＴＳＳＰを加えて２時間反応させた。一方、Ａ群およびコントロール群には何も加えずに１時間撹拌した。その後、２ｍＬのストレプトアビジン結合磁気ビーズを使用書に従って洗浄した後、Ａ群、Ｂ群およびコントロール群に加えて、１０分間混和した。磁石を用いてストレプトアビジン結合磁気ビーズを保持し、上清を分離した。分離した上清は、ストレプトアビジン結合磁気ビーズに結合しなかった細胞成分を含むため、回収してこれをビーズ非結合分画とした。続いて、ストレプトアビジン結合磁気ビーズを３回洗浄した後、加熱して、ＤＮＡを変性させてストレプトアビジン結合磁気ビーズから分離させた。その後、上清を回収してこれをビーズ結合分画とした。ビーズ結合分画およびビーズ非結合分画を、４〜１５％グラジエントゲルを用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、既報（Ｓｈａｎｇｇｕａｎ Ｄ．ら、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．、第７巻、第２１３３−２１３９頁、２００８年）に従って銀染色を行ってタンパク質を検出した。その結果を図８に示す。図８において楕円で囲んで示すように、Ａ群およびＢ群のビーズ結合分画における約７０ＫＤａのバンドが、ビーズ非結合分画では検出されず、ビーズ結合分画にのみ特異的に検出されたものであることが明らかになった。すなわち、この約７０ＫＤａのバンドに含まれるタンパク質が、ビオチンで標識した配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡを介してストレプトアビジン結合磁気ビーズに特異的に結合したタンパク質であると考えられた。

そこで、この約７０ＫＤａのバンドを切り出して精製し、ペプチドマスフィンガープリント分析に供して、タンパク質を同定した。ペプチドマスフィンガープリント分析における質量分析はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより、質量データに基づくタンパク質同定はＭＡＳＣＯＴ Ｓｅｒｖｅｒにより、ｇｅｎｏｍｉｎｅ社に委託してそれぞれ行った。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ Ｍａｓｓのスペクトルおよびプロテインスコアのヒストグラムおよびプロテインスコアが最大であったタンパク質（配列番号６）のアミノ酸配列を図９に示す。図９に示すように、約７０ＫＤａのバンドに含まれるタンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列と最も高い一致が見られ、この配列番号６のタンパク質はマウスの骨格筋トロポニンＴであることが明らかになった。この結果から、配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡの標的物質は、骨格筋トロポニンＴであることが明らかになった。なお、骨格筋トロポニンＴの分子量は３３ＫＤａであることから、約７０ＫＤａのバンドを含まれるタンパク質は骨格筋トロポニンＴの二量体であると考えられた。骨格筋トロポニンＴは二量体を形成することが報告されており（Ｒｉｓｎｉｋ Ｖ．Ｖ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、第２５巻、第５４９−５５２頁、１９８５年）、これらの既報と一致する結果であった。

（２）心筋トロポニンＴとＤＮＡとの結合の確認
トロポニンＴは主に骨格筋に発現しているもの（骨格筋トロポニンＴ；配列番号６）と主に心筋に発現しているもの（心筋トロポニンＴ；配列番号７）とでアミノ酸組成が異なることが知られているため、マウスの骨格筋トロポニンＴとヒトの心筋トロポニンＴとの全長アミノ酸配列の相同性を検討した。その結果を図１０に示す。図１０に示すように、骨格筋トロポニンＴと心筋トロポニンＴとは、アミノ酸配列においておよそ６０％の高い相同性を有することが明らかになった。この結果から、配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡは、骨格筋トロポニンＴのみならず、心筋トロポニンＴとも結合することが示唆された。

そこで、心筋トロポニンＴと配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡとの結合性を、定法に従いゲルシフトアッセイ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ；ＥＭＳＡ）を行うことにより確認した。具体的には、スルホインドシアニンスクシンイミジルエステル（Ｃｙ５）で標識した配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡを、１０ｎｍｏｌ／Ｌとなるようセレクションバッファーに入れ、８０℃で１０分間加熱し、その後放冷して二次構造を形成させた。これを、０〜２０００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度の心筋トロポニンＴに加えて、４℃で３０分間インキュベートすることにより、結合反応を行った。続いて、８％（ｖ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、蛍光イメージアナライザーＬＡＳ４０００（ＧＥヘルスケア社）を用いてＣｙ５の蛍光を検出した。その結果を図１１に示す。図１１に示すように、ＤＮＡのバンドは、心筋トロポニンＴの濃度が０、５．３３、および１６ｎｍｏｌ／Ｌでは下部に見られた。これに対し、８０ｎｍｏｌ／Ｌでは下部から中間部にわたって幅広く見られ、４００ｎｍｏｌ／Ｌでは上部に見られ、２０００ｎｍｏｌ／Ｌではより上部に見られた。すなわち、心筋トロポニンＴの濃度が大きいほど、配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡの泳動速度が遅くなったことが明らかになった。この結果から、配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡは、心筋トロポニンＴと結合することが示された。

以上の本実施例３（１）および（２）の結果から、配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡの標的物質はトロポニンＴであることが明らかになった。

（３）腫瘍血管内皮細胞におけるトロポニンＴ発現の確認
［３−１］フローサイトメトリー
５×１０^５個のｍＴＥＣを２群用意し、抗体添加群および抗体無添加群とした。抗体添加群には、ＦＩＴＣで標識した心筋トロポニンＴ抗体を０．９ｍｇ／ｍＬとなるよう加え、抗体無添加群には何も加えず、それぞれ４℃で５０分間攪拌した。その後、セレクションバッファーを用いて細胞を２回洗浄し、実施例２（１）に記載の方法によりフローサイトメトリーによる測定を行った。また、ｍＴＥＣに代えてｍＥＣを用いて同様の実験を行った。それらの結果を図１２に示す。図１２に示すように、ｍＴＥＣにおける細胞の蛍光強度は、抗体無添加群と比較して抗体添加群の方が大きかったのに対し、ｍＥＣにおける細胞の蛍光強度は、抗体無添加群と抗体添加群とで同等であった。すなわち、心筋トロポニンＴ抗体は、ｍＴＥＣに結合し、ｍＥＣには結合しないことが明らかになった。これらの結果から、心筋トロポニンＴは、腫瘍血管内皮細胞の細胞表面に発現しており、かつ、正常血管内皮細胞の細胞表面には発現していないことが明らかになった。

［３−２］リアルタイムＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、添付の使用書に従いｍＴＥＣおよびｍＥＣからトータルＲＮＡを抽出した。続いて、トータルＲＮＡを鋳型としてＲｅｖｅｒ Ｔｒａ−Ｐｌｕｓ（東洋紡社）を用いて、添付の使用書に従い逆転写を行ってｃＤＮＡを得た。ｃＤＮＡを鋳型とし、下記に示すプライマーおよびＳｓｏＦａｓｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて、添付の使用書に従いリアルタイムＰＣＲを行うことにより、骨格筋トロポニンＴの相対的発現量を測定した。リアルタイムＰＣＲの標準物質はグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）とした。その結果を図１３に示す。図１３に示すように、骨格筋トロポニンＴの相対的発現量は、ｍＥＣと比較してｍＴＥＣの方が大きかった。この結果から、腫瘍血管内皮細胞では、正常血管内皮細胞と比較して、骨格筋トロポニンＴの発現量が増大していることが明らかになった。

マウスＧＡＰＤＨ
フォワード：５’−ＴＣＴＧＡＣＧＴＧＣＣＧＣＣＴＧＧＡＧ−３’（配列番号８）
リバース：５’−ＴＣＧＣＡＧＧＡＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴＣ−３’（配列番号９）
マウス骨格筋由来トロポニンＴ１
フォワード:５’−ＴＴＧＧＡＧＧＣＣＧＣＴＧＧＡＡＧＴＧＡＧＡ−３’（配列番号１０）
リバース：５’−ＡＣＡＧＡＴＧＧＧＡＣＡＣＧＣＴＣＣＡＧＴＧ−３’（配列番号１１）

以上の本実施例３（１）〜（３）［３−２］の結果および実施例２（２）〜（４）の結果から、配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡは、トロポニンＴと結合することが示された。また、トロポニンＴは、正常血管内皮細胞や腫瘍実質細胞、メラノーマの細胞表面には発現せず、腫瘍血管内皮細胞の表面に特異的に発現する腫瘍マーカーであることが明らかになった。

＜実施例４＞ＤＮＡの細胞内への取り込みの検討
（１）取り込みの検討
直径３．５ｃｍのガラスボトムディッシュに １×１０^５個のｍＴＥＣを播種し、２４時間培養した。培養したｍＴＥＣに対し、ＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡを用いて、実施例１（２）［２−１］に記載の方法により結合反応を行った。ただし、結合反応の時間は４５分間に代えて３０分間とした。続いて、細胞核に対する染色色素であるＨｏｅｃｈｓｔ３３４３２および酸性コンパートメントに対する染色色素であるＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄをそれぞれ１ｍｇ／ｍＬおよび０．５μｍｏｌ／Ｌとなるよう加えて、１５分間静置することにより染色した。その後、細胞を洗浄し、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて、蛍光観察を行った。ＦＩＴＣ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３４３２およびＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄの励起および検出はそれぞれ励起波長／検出波長（ｎｍ）＝４９４／５１８、３５０／４６１、５７７／５９０で行った。その結果を図１４に示す。図１４に示すように、ＦＩＴＣ（ＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡ）およびＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ（酸性コンパートメント）は、細胞内の同じ部位で検出された。すなわち、ＦＩＴＣ標識５番ＤＮＡは、エンドサイトーシスなどにより細胞内に取り込まれたために、リソソームなどの酸性コンパートメントに存在していることが明らかになった。この結果から、配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡは、細胞内に取り込まれることが明らかになった。これらの結果と実施例３（１）〜（３）［３−２］の結果とから、配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡは、細胞表面のトロポニンＴと結合して細胞内に取り込まれることが明らかになった。

（２）取り込み促進効果の検討
［２−１］ＤＮＡ結合脂質の調製
マレイミド基が付加された分子量２０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００）が１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＳＰＥ）に結合してなる脂質（ＰＥＧ脂質）と５’をチオール基で修飾した配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡとを、終濃度５ｍｍｏｌ／Ｌのトリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を含むトリスＨＣｌ緩衝液に入れて１２時間反応させることにより、３’−配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ−５’、マレイミド基、ＰＥＧ２０００およびＤＳＰＥがこの順で結合してなるＤＮＡ結合ＰＥＧ脂質を調製した。ＤＮＡ結合ＰＥＧ脂質の模式図を図１５に示す。続いて、定法に従いゲル濾過カラムクロマトグラフィーに供することによりＤＮＡ結合ＰＥＧ脂質を精製した後、配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡとともに４〜２０％グラジエントポリアクリルアミドゲル電気泳動に供して分子量を確認した。その結果を図１６に示す。図１６に示すように、ＤＮＡ結合ＰＥＧ脂質は、配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡと比較して、顕著に大きい分子量を有していた。この結果から、ＤＮＡ結合ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ脂質と配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡとが結合してなるものであることが確認された。

［２−２］リポソームの調製
本実施例４（２）［２−１］のＤＮＡ結合ＰＥＧ脂質を２．５モル％または５モル％の濃度で構成脂質として含むリポソームを、単純水和法により調製した。具体的には、まず、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）とコレステロール（Ｃｈｏｌ）とを、モル比がＥＰＣ：Ｃｈｏｌ＝７：３となるようエタノールに溶解して、ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ溶液を調製した。また、ジオレオイルグリセロフォスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）にローダミンが結合したローダミン標識ＤＯＰＥをエタノールに溶解して、ローダミン標識ＤＯＰＥ溶液を調製した。また、本実施例（２）［２−１］のＰＥＧ脂質およびＤＮＡ結合ＰＥＧ脂質を、それぞれ１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解して、ＰＥＧ脂質溶液およびＤＮＡ結合ＰＥＧ脂質溶液を調製した。続いて、ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ溶液、ローダミン標識ＤＯＰＥ溶液およびＰＥＧ脂質溶液またはＤＮＡ結合ＰＥＧ脂質溶液を、各脂質のモル％比が下記に示す比となるよう混合して、ａ、ｂ、ｃおよびｄの計４つの混合脂質溶液を調製した。

ａ；ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ：ローダミン標識ＤＯＰＥ：ＰＥＧ脂質＝９６．５：１：２．５
ｂ；ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ：ローダミン標識ＤＯＰＥ：ＤＮＡ結合ＰＥＧ脂質＝９６．５：１：２．５
ｃ；ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ：ローダミン標識ＤＯＰＥ：ＰＥＧ脂質＝９４：１：５
ｄ；ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ：ローダミン標識ＤＯＰＥ：ＤＮＡ結合ＰＥＧ脂質＝９４：１：５

続いて、混合脂質溶液をデシケーターに供することにより溶媒を除いて脂質フィルムを調製した。脂質フィルムに１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液を添加し、１０分間静置することにより脂質フィルムを水和させた。その後、１分間超音波処理することによりリポソームを調製した。すなわち、混合脂質溶液ａからはＰＥＧ脂質を２．５モル％の濃度で構成脂質として含む、ローダミンで標識したリポソーム（リポソームＡ）を、混合脂質溶液ｂからはＤＮＡ結合ＰＥＧ脂質を２．５モル％の濃度で構成脂質として含む、ローダミンで標識したリポソーム（リポソームＢ）を、混合脂質溶液ｃからはＰＥＧ脂質を５モル％の濃度で構成脂質として含む、ローダミンで標識したリポソーム（リポソームＣ）を、混合脂質溶液ｄからはＤＮＡ結合ＰＥＧ脂質を５モル％の濃度で構成脂質として含む、ローダミンで標識したリポソーム（リポソームＤ）を、それぞれ調製した。各リポソームについて、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて、平均粒子径、粒度分布指数（Ｐｈａｓｅ Ｄｏｐｐｌｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｅｒ；ＰＤＩ）および表面電位をそれぞれ測定した。その結果を表１に示す。表１に示すように、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤのいずれも、平均粒子径は４３．３３ｎｍ〜１４２．３ｎｍの範囲、ＰＤＩは０．３前後、表面電位は比較的差の小さいマイナス電位であった。この結果から、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、同様の物性を有することが明らかになった。

［２−３］リポソームの取り込みの検討
２４穴プレートに４×１０^４個のｍＴＥＣを播種し、一晩培養した。培地を交換した後、２ｍＬのＰＢＳを用いて細胞を洗浄し、５ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを含むクレブス緩衝液８００μＬを加え、さらに、本実施例４（２）［２−２］のリポソームＡ、Ｂ、ＣおよびＤをそれぞれ含むＨＥＰＥＳ緩衝液２００μＬ（脂質濃度０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）を加えた。続いて、３７℃で３時間静置することにより細胞にリポソームを取り込ませた、ＰＢＳを用いて細胞を洗浄し、Ｌｙｓｉｓ緩衝液を用いて細胞を溶解した。続いて、１００００×ｇ、４℃の条件下で５分間遠心分離を行い、上清を回収して、蛍光光度計を用いてローダミンの蛍光強度を測定した。その結果を図１７に示す。

図１７に示すように、蛍光強度を、リポソームＡおよびＢを取り込ませた場合で比較するとＢを取り込ませた場合の方が顕著に大きく、リポソームＣおよびＤを取り込ませた場合で比較するとＤを取り込ませた場合の方が顕著に大きかった。すなわち、ＤＮＡ結合ＰＥＧ脂質を構成脂質として含むリポソームを取り込ませた場合の方が、ＰＥＧ脂質を構成脂質として含むリポソームを取り込ませた場合と比較して、細胞の蛍光強度が大きいことが明らかになった。また、蛍光強度を、リポソームＢおよびＤを取り込ませた場合で比較するとＤを取り込ませた場合の方が大きかった。すなわち、ＤＮＡ結合ＰＥＧ脂質を、５モル％の濃度で構成脂質として含むリポソームを取り込ませた場合の方が、２．５モル％の濃度で構成脂質として含むリポソームを取り込ませた場合と比較して、細胞の蛍光強度が大きいことが明らかになった。これらの結果から、配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡは、腫瘍血管内皮細胞の細胞内へ、脂質膜構造体が取り込まれることを促進することが示された。

以上の本実施例４（２）［２−２］の結果および実施例３（１）〜（３）［３−２］の結果から、配列番号５の塩基配列を有するＤＮＡは、細胞表面にトロポニンＴを有する細胞内へ目的物質が取り込まれることを促進することが明らかになった。

＜実施例５＞血管新生・脈管形成抑制効果の検討
配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡおよび実施例１（１）の０サイクルＤＮＡライブラリーについて、ｍＴＥＣに対し、実施例１（２）［２−１］に記載の方法により結合反応を行って細胞を回収し、５番ＤＮＡ群および０サイクル群とした。ただし、結合反応の際の細胞数は１サンプルあたり１×１０^５個とし、配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡおよび０サイクルＤＮＡライブラリーの濃度はそれぞれ５μｍｏｌ／Ｌとした。また、結合反応を行っていないｍＴＥＣを同数用意してコントロール群とした。５番ＤＮＡ群、０サイクル群およびコントロール群を、マトリゲルでコートした２４穴プレートに播種し、１６時間培養した後、倒立顕微鏡を用いて、細胞が形成した管構造の様子を観察した。また、観察画像を撮影し、これをＩｍａｇｅＪ（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を用いて解析して、画像内の管構造の長さを測定した。複数の画像で同様の操作を行って、群ごとに平均値を算出し、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ法による一元配置分散分析で有意差検定を行った。その結果を図１８に示す。図１８に示すように、管構造は、コントロール群および０サイクル群では画像内の全領域にわたって形成されているのに対し、５番ＤＮＡ群では、形成されている領域と未形成の領域とがおよそ半々であった。また、管構造の長さは、コントロール群および０サイクル群と比較して、５番ＤＮＡ群で有意に短かった。すなわち、配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡは、腫瘍血管内皮細胞による管構造の形成を抑制することが明らかになった。これらの結果から、配列番号５の塩基配列を有するＤＮＡは、腫瘍組織における血管新生や脈管形成を抑制することが示された。

Claims (7)

1. 下記の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選択されるＤＮＡ；
   （ａ）配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ、
   （ｂ）配列番号５の塩基配列を有し、かつトロポニンＴと結合するＤＮＡ、
   （ｃ）配列番号５の塩基配列において１または数個のヌクレオチドが欠失、置換または挿入された塩基配列を有し、かつトロポニンＴと結合するＤＮＡ。
2. 細胞表面のトロポニンＴと結合して細胞内に取り込まれる、請求項１に記載のＤＮＡ。
3. 腫瘍組織における血管新生および／または脈管形成を抑制する、請求項１または請求項２に記載のＤＮＡ。
4. 請求項１から請求項３のいずれかに記載のＤＮＡと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体。
5. 配列番号５の塩基配列または配列番号５の塩基配列において１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは挿入された塩基配列を有するＤＮＡを有効成分とする、腫瘍組織における血管新生および／または脈管形成抑制剤。
6. 配列番号５の塩基配列または配列番号５の塩基配列において１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは挿入された塩基配列を有するＤＮＡを有効成分とする、細胞表面にトロポニンＴを有する細胞内へ目的物質が取り込まれることを促進する剤。
7. 目的物質が脂質膜構造体である、請求項６に記載の剤。