CN1284523C - 由脂质膜被覆微粒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种安全、简便且高效的由脂质膜被覆微粒的方法。该方法通过减少含有极性有机溶剂的水溶液中的极性有机溶剂的比例而在微粒表面被覆脂质膜，所说的微粒分散于所说的极性有机溶剂中且在所说的极性有机溶剂中溶解有脂质。

Description

由脂质膜被覆微粒的方法
技术领域
本发明涉及由脂质膜被覆微粒的方法。
背景技术
使微粒内包药物以提高药效的技术是公知的，例如，已知有脂质体或脂肪乳剂等。这些物质的临床应用主要是通过注射进行，注射中也特别是通过血管内给药进行。被给药到血管内的微粒与血液成分相互作用，这是已知的，但因为相互作用而使微粒或药物被破坏(分解)，或者微粒接受调理素，被从血中除去(通过网状内皮系统作为异物被除去)。为克服这一缺点，例如研究开发了脂质体的聚乙二醇修饰法[Stealth Liposomes，ed.By D.D.Lasic and F.Martin，CRC Press Inc.，Florida，93-102(1995)]。
另外，为将寡核苷酸、DNA、RNA等核酸送达靶细胞，经常利用由含有阳离子脂质的脂质构成的脂质体(以下称为阳离子脂质脂质体)或聚L-赖氨酸、聚酰胺胺等碱性聚合物与核酸的复合体。但是，已知阳离子脂质脂质体与核酸的复合体经脉给药后迅速从血中向肝脏或肺转移[Biochim.Biophys.Acta，1281，139-149(1996)；J.Controlled Release，41，121-130(1996)]。另一方面，S.Li等人公开了使小鼠血清与阳离子脂质脂质体/DNA复合体接触会引起复合体增大、凝集、脂质体的崩解、DNA释放和分解[Gene Therapy，5，930-937(1998)；Gene Therapy，6，585-594(1999)]。为解决上述问题，研究开发了阳离子脂质脂质体的聚乙二醇修饰法，O.Meyer等人制备了含有聚乙二醇磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的阳离子脂质脂质体和低聚脱氧核苷酸(ODN)的复合体[J.Biol.Chem.，273，15621-15627(1998)]。但是，使其与50％人血浆水溶液接触4小时后有35％的ODN解离。为进行改良，D.Stuart和T.Allen将阳离子脂质脂质体预先溶解在氯仿中，然后加入ODN的水溶液和甲醇，混合后，通过进行离心分离，使阳离子脂质脂质体/ODN的复合体转移到氯仿层中。再取出氯仿层，向其中加入PEG脂质和中性脂质及水，形成W/O型乳夜，之后与F.Szoka等人的反相蒸发法同样进行处理，试着使ODN完全内含在脂质体内部[Biochim.Biophys.Acta，1463，219-229(2000)]。但是，从安全性方面考虑，使用氯仿是不理想的。进而，D.Mc Phail等人将十六烷酰壳聚糖与胆固醇的囊悬浮液(壳聚糖囊)添加到蛋黄磷脂酰胆碱与胆固醇的薄膜上，调制成脂质体中加入了壳聚糖的囊中囊(vesicle invesicle)[Int.J.Pharmaceutics，200，73-86(2000)]。但是没有有关内包效率的记载，由制备方法推测，只有百分之几的内包率，估计在实用方面会有问题。由上述观点可知，利用简便且高效的微粒封闭囊进行的内包化在医疗应用方面非常有用。
另外，医疗上有用的许多肽、蛋白质在生物体内被酶等迅速分解，有时因多次给药而生成抗体，被从体内除去，从而无法发挥效力。因此，为提高这些肽、蛋白质在生物体内的稳定性，而试验了脂质体化。作为脂质体化的方法，例如有Bangham等人的脂质体制备法[J.Mol.Biol.13，238(1965)]、乙醇注入法[J.Cell.Biol.66，621(1975)]、弗氏压碎法[FEBS Lett99，210(1979)]、冻结溶解法[Arch.Biochem.Biophys.212，186(1981)]、反相蒸发法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA75，4194(1978)]、pH梯度法(日本专利第2572554号公报、第2659136号公报等)。另外还制定出了针对低分子化合物的pH梯度法的改良方法。但是，肽、蛋白质未必会实现高效的内包化，通过荧光标记胰岛素测定发现5-40％左右被内包，但胰岛素完全未被内包[Int.J.Pharmaceutics，179，85-95(1999)]。为提高肽、蛋白质的治疗效果，开发将肽、蛋白质高效地内包在封闭小囊内的方法是当前的课题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种被覆方法，该被覆方法为使含有在微粒中的药物等在生物体内保持稳定，而利用脂质膜将所述的微粒安全、简便且有效地被覆。在该被覆方法中，将微粒包含在由脂质双层膜或多层膜构成的封闭小囊内，由此使之免受生物体内特别是血液内或消化道内成分和细网内皮系统等的影响，以及保存过程中微粒之间或用于分散微粒的分散介质的影响。
本发明人等发现，由水溶性药物和阳离子脂质组成的因静电相互作用而形成的复合体不溶于乙醇水溶液，脂质溶于乙醇含量高的乙醇水溶液，在乙醇含量低的乙醇水溶液中形成脂质膜，从而成为脂质体。经过进一步深入的研究，结果发现，预先在水溶性药物和脂质的复合体中加入聚乙二醇化脂质等水溶性高分子衍生物，再使其分散在乙醇含量高的乙醇水溶液中，然后在该溶液中溶解聚乙二醇化脂质和磷脂，之后逐步降低乙醇含量，由此可以使之前的药物与脂质的复合体被聚乙二醇化脂质和磷脂形成的脂质膜所被覆。
即，本发明涉及以下的(1)～(19)。
(1)由脂质膜被覆微粒的方法，特征在于，通过减少含有极性有机溶剂的水溶液中的极性有机溶剂的比例而在微粒表面被覆脂质膜，所说的微粒分散于所说的极性有机溶剂中且在所说的极性有机溶剂中溶解有脂质。
(2)由脂质膜被覆微粒的方法，特征在于，使微粒分散于含有极性有机溶剂的水溶液中(A液)，在与该含有极性有机溶剂的水溶液相同或不同的含有极性有机溶剂的水溶液或极性有机溶剂中溶解脂质(B液)，混合A液和B液(C液)，然后减少C液中的极性有机溶剂的比例(D液)，由此在该微粒上被覆脂质膜。
(3)上述(2)中记载的由脂质膜被覆微粒的方法，其中B液是与脂质一起使水溶性高分子衍生物(I)溶解得到的溶液。
(4)上述(2)或(3)中记载的由脂质膜被覆微粒的方法，其中A液和B液中极性有机溶剂的浓度为30％以上。
(5)上述(2)或(3)中记载的由脂质膜被覆微粒的方法，其中A液和B液中的极性有机溶剂的浓度为60～90％。
(6)上述(5)中记载的由脂质膜被覆微粒的方法，其中D液中的极性有机溶剂的浓度为50％以下。
(7)上述(1)～(6)中任一项记载的由脂质膜被覆微粒的方法，其中微粒是含有与上述(3)中记载的水溶性高分子衍生物(I)相同或不同的水溶性高分子衍生物的微粒。
(8)上述(1)～(7)中任一项记载的由脂质膜被覆微粒的方法，其中微粒是含有从药物、脂质聚集体、脂质体、乳液中的微粒、天然高分子、合成高分子、金属胶体、阳离子脂质、阴离子脂质和微粒制剂中选择的一种以上的微粒。
(9)上述(1)～(7)中任一项记载的由脂质膜被覆微粒的方法，其中微粒是含有药物的微粒。
(10)上述(1)～(7)中任一项记载的由脂质膜被覆微粒的方法，其中微粒是药物与选自下列物质中一种以上物质形成的复合体：脂质聚集体、脂质体、乳液中的微粒、天然高分子、合成高分子、金属胶体、阳离子脂质、阴离子脂质和微粒制剂。
(11)上述(1)～(7)中任一项记载的由脂质膜被覆微粒的方法，其中微粒是药物与阳离子脂质的复合体。
(12)上述(1)～(7)中任一项记载的由脂质膜被覆微粒的方法，其中微粒是药物与阳离子脂质的复合体。
(13)上述(1)～(7)中任一项记载的由脂质膜被覆微粒的方法，其中微粒是药物与含有磷脂的脂质体和葡聚糖硫酸钠的复合体。
(14)上述(8)～(13)中任一项记载的由脂质膜被覆微粒的方法，其中药物是选自肽、蛋白质、核酸、低分子化合物、糖类、高分子化合物中的药物。
(15)上述(1)～(14)中任一项记载的由脂质膜被覆微粒的方法，其中极性有机溶剂是从醇类、二醇类和聚亚烷基二醇类中选择的一种以上。
(16)上述(15)中记载的由脂质膜被覆微粒的方法，其中醇类是乙醇。
(17)上述(15)或(16)中记载的由脂质膜被覆微粒的方法，其中二醇类是丙二醇。
(18)上述(15)～(17)中任一项记载的由脂质膜被覆微粒的方法，其中聚亚烷基二醇类是聚乙二醇。
(19)上述(3)～(18)中任一项记载的由脂质膜被覆微粒的方法，其中水溶性高分子衍生物是选自聚乙二醇化脂质、聚乙二醇烷基醚、聚乙二醇蓖麻油衍生物、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯类、聚乙二醇硬脂酸酯类、乙二醇丙二醇共聚物和甘油酯类中的一种以上。
作为用于本发明的含有极性有机溶剂的水溶液中的极性有机溶剂，例如有甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇等醇类，甘油、乙二醇、丙二醇等二醇类，聚乙二醇等聚亚烷基二醇类等。
对构成用于本发明的微粒的物质无特别限定，例如由药物、脂质聚集体、脂质体、乳液中的微粒、天然高分子、合成高分子、金属胶体、阳离子脂质、阴离子脂质、微粒制剂、水溶性高分子衍生物等。这些物质可单独使用，也可2种以上形成复合体，或与其他化合物组成复合体。
上述的复合体具体可以举出，药物与选自脂质聚集体、脂质体、乳液中的微粒、天然高分子、合成高分子、金属胶体、阳离子脂质、阴离子脂质和微粒制剂中的一种以上的物质形成的复合体等，更具体的有：利用静电相互作用形成的核酸与阳离子脂质的复合体；核酸与聚-L-赖氨酸等正电荷聚合物形成的复合体；等点点高的碱性蛋白质与磷脂酸等阴离子脂质或苯乙烯马来酸等负电荷聚合物的复合体；酸性蛋白质与阳离子脂质或聚-L-赖氨酸等正电荷聚合物形成的复合体等。
药物例如可以举出含氧的蛋白质、肽、含有基因的核酸、低分子化合物、糖类、高分子化合物等具有药理学活性的物质，作为含氧的蛋白质或肽，例如有舒缓激肽、血管紧张素、催产素、抗利尿激素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、降血钙素、胰岛素、胰高血糖素、缩胆囊肽、β-内啡呔、黑素细胞阻碍因子、黑素细胞刺激激素、催胃液激素拮抗剂、神经降压肽、促生长素抑制素、番木鳖碱、环孢菌素、脑啡呔、铁传递蛋白、RGD(Arg Gly Asp)肽、甲状腺激素、生长激素、性腺刺激激素、黄体生成激素(LHRH)、天冬酰胺酶、精氨酸酶、尿酸酶、羧肽酶、谷氨酰胺酶、超氧化物歧化酶(SOD)、组织前纤维蛋白溶酶活化剂(t-PA)、链激酶、白介素、干扰素、胞壁酰二肽、热生成素(thermopoietin)、颗粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、颗粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、胰蛋白酶抑制剂、溶菌酶、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、血小板源生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)、内皮细胞生长因子(ECGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经胶质细胞生长因子(GGF)、热杆菌素、特异抗体(如抗EGF受体抗体等)。作为含基因的核酸例如有反义寡核苷酸、有意寡核苷酸、DNA、RNA等核酸类，低分子化合物例如有ε-氨基己酸、盐酸精氨酸、L-天冬氨酸钾、凝血酸、硫酸争光霉素、硫酸长春新碱、唑啉头孢菌素钠、噻孢霉素钠、胞磷胆碱、阿糖胞苷、硫酸庆大霉素、盐酸万古霉素、硫酸卡那霉素、硫酸丁胺卡那霉素等，作为糖类例如有软骨素硫酸钠、肝素钠、右旋糖苷荧光素等，高分子化合物例如有聚乙烯磺酸钠、DIVEMA(二乙烯基醚马来酸酐共聚物)、SMANCS(苯乙烯马来酸酐共聚物-新制癌菌素结合体)等。
作为脂质聚集体，例如有球状胶束、球状反胶束、香肠状胶束、香肠状反胶束、板状胶束、板状反胶束、hexagonal I、hexagonal II和2分子以上脂质组成的聚集体。
构成脂质体的脂质，例如有磷脂、甘油糖脂质、神经鞘糖脂、
胆固醇、阳离子脂质等，优选使用磷脂。这些脂质例如也可以用以下物质改性：聚山梨酸80、普朗尼克F68、山梨糖醇酐单月桂酸酯(如Span20)等非离子性表面活性剂、烷基二甲基苄基氯化铵等阳离子性表面活性剂、月桂基硫酸钠等阴离子性表面活性剂、葡聚糖等多糖类或其衍生物、聚氧乙烯月桂醇、聚乙二醇(PEG)等聚氧乙烯衍生物等。
磷脂例如有磷脂酰胆碱(大豆磷脂酰胆碱、蛋黄磷脂酰胆碱二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱等)、磷脂酰乙醇胺(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺等)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰胆碱、神经鞘髓磷脂、聚乙二醇化磷脂、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化磷脂等天然或合成磷脂等。
甘油糖脂质例如有次硫酸核糖基甘油酯(Sulphoxy ribosylglyceride)、二糖基二甘油酯、二半乳糖基二甘油酯、半乳糖基二甘油酯、糖基二甘油酯等。
鞘糖脂例如有半乳糖基糖脂、乳糖基糖脂、神经节苷脂等。
阳离子脂质例如有1，2-二油烯基-3-三甲基胺丙烷(DOTAP)、N-(2，3-二油烯氧基丙烷-基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、2，3-二油烯氧基-N-[2-(精胺羧基酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙烷三氟乙酸铵(DOSPA)、1，2-二(十四烷基)氧基丙基-3-二甲基羟基乙基溴化铵(DMRIE)、1，2-二油烯氧基丙基-3-二乙基羟基乙基溴化铵(DORIE)、3β-[N-(N’N’-二甲基氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)等。
脂质体中，这些脂质可单独使用，也可组合使用。组合使用时，例如可以使用下列脂质：由氢化大豆磷脂酰胆碱、聚乙二醇化磷脂和胆固醇中选择的至少二种成分以上组成的脂质，由二硬脂酰基磷脂酰胆碱、聚乙二醇化磷脂和胆固醇中选择的至少二种成分以上组成的脂质，蛋黄磷脂酰胆碱与DOTAP组成的脂质，由蛋黄磷脂酰胆碱、DOTAP和聚乙二醇化磷脂组成的脂质，由蛋黄磷脂酰胆碱、DOTAP、胆固醇和聚乙二醇化磷脂组成的脂质等。
制备脂质体时，可以根据需要与脂质同时添加下列物质：作为膜稳定化剂的胆固醇等甾醇类，作为抗氧化剂的生育酚等，作为荷电物质的硬脂酰胺、二(十六烷基)磷酸酯、神经节苷脂或DOTMA[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413-7417(1987)]、二(十八烷基)酰胺甘氨酰精胺(DOGS)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，6982-6986(1989)]、DMRIE或DORIE[Methods，5，67-75(1993)]、DC-Chol[Biochem.Biophys.Res.Commun.，179，280-285(1991)]等阳离子脂质等。
对乳液中的微粒无特别限定，具体可以举出由脂肪乳剂、非离子表面活性剂和豆油组成的乳液、脂质乳液、含有脂质微球等的所有O/W乳液或W/O/W乳液中的微粒等。对于天然高分子无特别限定，具体有白蛋白、葡聚糖、壳聚糖、脱氧核糖核酸等。
对合成高分子无特别限定，例如有聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚天冬氨酸、苯乙烯马来酸共聚物、异丙基丙烯酰胺-丙烯酸吡咯烷酮共聚物、PEG修饰dendorimer、聚乳酸、聚乳酸聚乙二醇酸、PEG化聚乳酸、葡聚糖硫酸或其盐等。
盐包括金属盐、铵盐、有机胺加成盐、氨基酸加成盐等。金属盐有锂盐、钠盐、钾盐等碱金属盐，镁盐、钙盐等碱土金属盐，铝盐、锌盐等。铵盐有铵、四甲基铵等盐，有机胺加成盐有吗啉、哌啶等盐，氨基酸加成盐有甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸等的加成盐等。
金属胶体例如含有金、银、铂、铜、铑、二氧化硅、钙、铝、铁、铟、镉、钡、铅等的金属胶体。
阳离子脂质与上述相同。
阴离子脂质有磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇等。
微粒制剂例如有微球、微囊、超微晶、脂质超微粒子聚合物胶束等。
优选的微粒是在脂质体内内包药物的微粒。
微粒大小优选为平均粒径数nm～数十μm，特别优选10nm～1000nm。
本发明中使用的水溶性高分子衍生物无特别限定，例如有PEG-PE、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(聚乙二醇2000)(PEG-DSPE)等聚乙二醇化脂质、聚乙二醇烷基醚、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、CREMOPHOR EL等聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(Tween 80)等聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯类、聚乙二醇硬脂酸酯类、乙二醇丙二醇共聚物、甘油酯类、聚乙烯亚胺衍生物、聚乙烯醇衍生物、聚丙烯酸衍生物、聚丙烯酰胺衍生物、葡聚糖衍生物、聚甘油衍生物、壳聚糖衍生物、聚乙烯吡咯烷酮衍生物、聚天冬氨酰胺衍生物、聚-L-赖氨酸衍生物、甘露聚糖衍生物、茁酶多糖衍生物等。
本发明中用于脂质膜的脂质例如有磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂、胆固醇、合成脂质等，特别优选磷脂。磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂可以使用与上述同样的物质，合成脂质例如有氟化磷脂酰胆碱、含氟表面活性剂、溴化二烷基铵等。
作为本发明中使用的分散微粒且溶解有脂质的含极性有机溶剂的水溶液的制备方法，例如有以下方法。在含有极性有机溶剂的水溶液中分散微粒(A液)，在与该含有极性有机溶剂的水溶液相同或不同的含极性有机溶剂的水溶液或极性有机溶剂中溶解脂质(B液)，然后混合A液和B液。
本发明的利用脂质膜被覆微粒的方法，具体例如可以举出以下方法。
步骤1：将微粒分散于含有极性有机溶剂的水溶液优选含有乙醇等醇类的水溶液(悬浮)中。
步骤2：将溶于与所述含极性有机溶剂的水溶液相同或不同的含极性有机溶剂的水溶液(优选相同的含极性有机溶剂的水溶液或极性有机溶剂)中的脂质添加到步骤1得到的悬浮液中，混合。此时，也可添加水溶性高分子衍生物，对于添加的水溶性高分子衍生物的量无特别限定。
步骤3：在步骤2得到的混合液中加入少量水，进行透析或蒸馏除去有机溶剂，减少混合液中极性有机溶剂的比例，溶解的脂质在步骤2中添加水溶性高分子衍生物时脂质和水溶性高分子衍生物聚集在微粒表面，在微粒表面形成脂质膜，得到内包微粒的封闭小囊。
本发明方法中使用的含极性有机溶剂的水溶液中极性有机溶剂的比例，无特别限定，只要能满足微粒不溶解而存在、构成被覆微粒的脂质膜的成分溶解的条件即可，但因所用的溶剂、微粒、脂质的种类而异，优选为30％以上，更优选为60-90％。另外，在上述步骤3中，减少后的混合液中极性有机溶剂的比例也无特别限定，只要能使溶解的脂质在步骤2中添加水溶性高分子衍生物时脂质与水溶性高分子衍生物一起聚集在微粒表面上从而在微粒表面形成脂质膜即可，但水溶液中的极性有机溶剂的浓度优选为50％以下。
本发明方法中使用的微粒相对于含有极性有机溶剂的水溶液或本发明方法得到的制剂的比例，无特别限定，只要该微粒能被脂质膜被覆即可，但优选为1μg/ml～1g/ml，更优选为0.1～500mg/ml。
本发明方法中使用的脂质相对于含有极性有机溶剂的水溶液或本发明方法得到的制剂的比例，无特别限定，只要微粒能被即可，但优选1μg/ml～1g/ml，更优选为0.1～400mg/ml。
与所用微粒种类无关，基本上能按与上述同样的方法用脂质膜被覆微粒。
本发明中使用的极性有机溶剂和脂质，例如可以市售品。
本发明中使用的微粒可以作为市售品得到，也可由公知方法制备。
例如，在制备构成微粒的脂质体时，可以适用的脂质体制备方法。公知的脂质体制备方法有，Bangham等人的脂质体制备法[J.Mol.Biol.，13，238(1965)]、乙醇注入法[J.Cell.Biol.，66，621(1975)]、弗氏压碎法[FEBS Lett.，99，210(1979)]、冻结溶解法[Arch.Biochem.Biophys.，212，186(1981)]、反相蒸发法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，4194(1978)]、pH梯度法(日本专利第2572554号公报、日本专利第2659136号公报等)等。
另外，还可以任意地用非离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂、多糖类或其衍生物、聚氧乙烯衍生物等对脂质体表面进行改性，这些经过表面改性的脂质体也可以作为本发明的微粒使用[Stealth Liposome，ed.By D.D.Lasic and F.Martin，CRCPress Inc.，Florida，93-102(1995)]。
制备构成微粒的脂质体时，作为使脂质体悬浮的溶液，除水之外，还可以利用酸、碱、各种缓冲液、生理盐水、氨基酸输液等。另外，还可在脂质体悬浮液中添加柠檬酸、抗坏血酸、半胱氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)等抗氧剂。另外，作为等张化剂，例如可以添加甘油、葡萄糖、氯化钠等。
将药物和脂质溶于乙醇等有机溶剂中，蒸馏除去溶剂后，添加生理，振荡搅拌，形成脂质体。
脂质体内包药物，或药物和脂质体形成复合体之时或之后，可以添加水溶性高分子衍生物。
对脂质体的平均粒径无特别限定，可以根据需要自由选择。作为调节平均粒径的方法，例如有挤压法、或将大的多层膜脂质体(MLV)以机械粉碎(使用蒙托压碎器、微流化器)的方法[R.H.Muller，S.Bentia，B.Bohm编著，“Emulsion and Nanosuspensions for theFormulation of Poorly Soluble Drugs”，High-Pressure HomogenizationTechniques for the Production of Liposome Dispersions：Potential andLimitations，M.Brandl，267-294(1998)(Scientific Publishers Stuttgart，Germany)]等。
构成微粒的药物、脂质聚集体、脂质体、乳液中的微粒、天然高分子、合成高分子、金属胶体、阳离子脂质、阴离子脂质、微粒制剂和水溶性高分子衍生物中选出的2种以上的组合而成的复合体的形成方法，不只限于在水中混合药物和脂质或高分子等的方法，此时，如有必要还可以增加整粒步骤或无菌化步骤。复合体的形成可以在丙酮、乙醚等各种溶剂中进行。
对于被覆本发明中使用的微粒和/或得到的微粒的脂质膜，可以在其表面用抗体等蛋白质、糖类、糖脂类、氨基酸、核酸、各种低分子化合物、高分子化合物等进行修饰，也可以简单地在微粒和/或脂质膜中添加使用这些物质。
例如，为应用于靶向定位，对于被覆的膜还可以进一步用蛋白质(包括抗体)、肽、脂肪酸类等修饰脂质膜的表面[Stealth liposomes，ed.By D.D.Lasic and F.Martin，CRC Press Inc.，Florida，93-102，(1995)]。
用本发明方法得到的脂质膜被覆的微粒，可以直接使用，但根据使用目的、保存条件等，也可以加入甘露糖醇、乳糖、海藻糖、麦芽糖、甘氨酸等赋形剂进行冷冻干燥。另外，也可加入甘油等冷冻保存剂进行冷冻保存。也可以与适当的赋形剂一起进行造粒、干燥等操作，加工成胶囊剂、片剂、颗粒剂等口服制剂。
用本发明方法得到的脂质膜被覆的微粒，除用水之外，还可以用酸、碱、各种缓冲液、生理盐水、氨基酸输液等悬浮。另外，还可在脂质体悬浮液中加入柠檬酸、抗坏血酸、半胱氨酸、EDTAdeng抗氧剂。另外，作为等张化剂，例如可以添加甘油、葡萄糖、氯化钠等。
用本发明方法得到的制剂，一般作为注射剂使用，但也可加工成口服制剂、滴鼻剂、滴眼剂、栓剂、吸入剂等。
本发明得到的制剂，例如可以用于改善血液成分等生物体成分中如血液中或消化道中的药物稳定性、降低副作用、增加向肿瘤等目标脏器的聚集性、改善口服或经粘膜的吸收等。
以下给出本发明的实施例和比较例。
实施例1
在10mg的阴离子型葡聚糖荧光素(FD)(Molecular Probes制)、60mg的DOTAP(Avanti制)和24mg的PEG-DSPE(Avanti制)中加入3ml蒸馏水，用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.4μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，加入4ml的乙醇。然后在该悬浮液中加入240mg的蛋黄磷脂酰胆碱(EggPC)和50mg的PEG-DSPE溶于1ml乙醇的溶液。在该悬浮液中缓慢加入92ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到5％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加磷酸缓冲食盐水溶液(PBS)，再次悬浮使总脂质浓度达到30mg/ml，得到脂质体悬浮液(制剂1)。
以动态光散射法(DLS)[A model ELS-800，Otsuka Eleetronics Ltd.(ELS-800，大电子)，下同]测定脂质体的平均粒径，为134nm。
实施例2
在10mg FD、60mg的DOTAP和24mg的PEG-DSPE中加入3ml蒸馏水，用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.4μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，加入4ml的乙醇。然后在该悬浮液中加入120mg的EggPC和25mg的PEG-DSPE溶于1ml乙醇的溶液。在该悬浮液中缓慢加入92ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到5％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，再次悬浮使总脂质浓度达到30mg/ml，得到脂质体悬浮液(制剂2)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为179nm。
实施例3
在10mg的FD、60mg的DOTAP和24mg的PEG-DSPE中加入3ml蒸馏水，用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.4μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，加入4ml的乙醇。然后在该悬浮液中加入60mg的EggPC和12.5mg的PEG-DSPE溶于1ml乙醇的溶液。在该悬浮液中缓慢加入92ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到5％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，再次悬浮使总脂质浓度达到30mg/ml，得到脂质体悬浮液(制剂3)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为184nm。
实施例4
在10mg FD、60mg的DOTAP中加入3ml蒸馏水，用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.4μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，加入4ml的乙醇。然后在该悬浮液中加入240mg的EggPC和74mg的PEG-DSPE溶于1ml乙醇的溶液。在该悬浮液中缓慢加入92ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到5％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，再次悬浮使总脂质浓度达到30mg/ml，得到脂质体悬浮液(制剂4)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为131nm。
实施例5
在10mg FD和60mg的DOTAP中加入3ml蒸馏水，用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.4μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，加入4ml的乙醇。然后在该悬浮液中加入240mg的EggPC溶于1ml乙醇的溶液。在该悬浮液中缓慢加入92ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到5％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，再次悬浮使总脂质浓度达到30mg/ml，得到脂质体悬浮液(制剂5)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为458nm。
实施例6
在2.5mg胰岛素-荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记体(F-Ins)(Sigma制)、30mg的DOTAP和12mg的PEG-DSPE中加入1.49ml蒸馏水和0.01ml的1mol/L氢氧化钠水溶液，用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.4μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，加入2ml的乙醇。然后在该悬浮液中加入120mg的EggPC和25mg的PEG-DSPE溶于0.5ml乙醇的溶液。在该悬浮液中缓慢加入46ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到5％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，再次悬浮使总脂质浓度达到30mg/ml，得到脂质体悬浮液(制剂6)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为132nm。
实施例7
按30mg/12mg/ml的比例混合DOTAP/PEG-DSPE/蒸馏水，用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.4μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次。在该悬浮液0.5ml中加入以15mg/ml的浓度溶有荧光素异硫氰酸酯结合硫代磷酸酯(F-PS)(Cymedia制)的蒸馏水溶液0.25ml，加入1ml的乙醇。再在该悬浮液中加入以120mg/25mg/ml溶解的EggPC/PEG-DSPE/乙醇溶液0.25ml。在该悬浮液中缓慢加入23ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到5％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，再次悬浮使总脂质浓度达到30mg/ml，得到脂质体悬浮液。相对于120重量份的EggPC，将50重量份的PEG-DSPE溶于少量的乙醇(脂质体悬浮液4容量％)后，与脂质体悬浮液混合，在70℃下加热2分钟。添加PBS调节总脂质浓度为30mg/ml，得到脂质体悬浮液(制剂7)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为111nm。
实施例8
按30mg/12mg/ml的比例混合DOTAP/PEG-DSPE/蒸馏水，用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.4μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次。在该悬浮液0.4ml中加入以10mg/ml的浓度溶有F-PS的蒸馏水溶液0.2ml，加入0.8ml的乙醇。再在该悬浮液中加入以240mg/50mg/ml溶解的EggPC/PEG-DSPE/乙醇溶液0.2ml。在该悬浮液中缓慢加入18.4ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到5％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，再次悬浮使总脂质浓度达到30mg/ml，得到脂质体悬浮液(制剂8)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为112nm。
实施例9
按30mg/12mg/ml的比例混合DOTAP/PEG-DSPE/蒸馏水，用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.4μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次。在该悬浮液0.4ml中加入以15mg/ml的浓度溶有F-PS的蒸馏水溶液0.2ml，加入0.8ml的乙醇。再在该悬浮液中加入以240mg/50mg/ml溶解的EggPC/PEG-DSPE/乙醇溶液0.2ml。在该悬浮液中缓慢加入18.4ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到5％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，再次悬浮使总脂质浓度达到30mg/ml，得到脂质体悬浮液(制剂9)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为137nm。
实施例10
按30mg/12mg/ml的比例混合DOTAP/PEG-DSPE/蒸馏水，用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.4μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次。在该悬浮液0.4ml中加入以17.5mg/ml的浓度溶有F-PS的蒸馏水溶液0.2ml，加入0.8ml的乙醇。再在该悬浮液中加入以240mg/50mg/ml溶解的EggPC/PEG-DSPE/乙醇溶液0.2ml。在该悬浮液中缓慢加入18.4ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到5％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，再次悬浮使总脂质浓度达到30mg/ml，得到脂质体悬浮液(制剂10)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为132nm。
实施例11
按30mg/12mg/ml的比例混合DOTAP/PEG-DSPE/蒸馏水，用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.4μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次。在该悬浮液0.4ml中加入以20mg/ml的浓度溶有F-PS的蒸馏水溶液0.2ml，加入0.8ml的乙醇。再在该悬浮液中加入以240mg/50mg/ml溶解的EggPC/PEG-DSPE/乙醇溶液0.2ml。在该悬浮液中缓慢加入18.4ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到5％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，再次悬浮使总脂质浓度达到30mg/ml，得到脂质体悬浮液(制剂11)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为164nm。
实施例12
按30mg/12mg/ml的比例混合DOTAP/PEG-DSPE/蒸馏水，用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.4μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次。在该悬浮液0.25ml中加入以15mg/ml的浓度溶有F-PS的蒸馏水溶液0.125ml，加入0.5ml的乙醇。再在该悬浮液中加入以240mg/100mg/ml溶解的EggPC/PEG-DSPE/乙醇溶液0.125ml。在该悬浮液中缓慢加入11.5ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到5％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，再次悬浮使总脂质浓度达到30mg/ml，得到脂质体悬浮液(制剂12)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为122nm。
实施例13
按30mg/12mg/ml的比例混合DOTAP/PEG-DSPE/蒸馏水，用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.4μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次。在该悬浮液0.25ml中加入以15mg/ml的浓度溶有F-PS的蒸馏水溶液0.125ml，加入0.5ml的乙醇。再在该悬浮液中加入以360mg/150mg/ml溶解的EggPC/PEG-DSPE/乙醇溶液0.125ml。在该悬浮液中缓慢加入11.5ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到5％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，再次悬浮使总脂质浓度达到30mg/ml，得到脂质体悬浮液(制剂13)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为165nm。
买施例14
将30mg/ml的DOTAP和12mg/ml的PEG-DSPE悬浮液用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.4μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，得到粒径80nm左右的脂质体悬浮液。用搅拌器搅拌下，在该悬浮液250μl中加入125μl的15mg/ml的F-PS水溶液，加入0.5ml的乙醇。再在该悬浮液中加入120mg的EggPC和25mg的聚氧乙烯硬化蓖麻油60(日本油脂制)溶于1ml乙醇的溶液125μl。在该悬浮液中缓慢加入11.5ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到5％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加40μl的PBS再次悬浮，再用PBS稀释，得到F-PS 3mg/ml的脂质体悬浮液。相对于120重量份的EggPC，用少量乙醇溶解50重量份的PEG-DSPE(约脂质体悬浮液的1/25容量)。将脂质体悬浮液与PEG-DSPE乙醇溶液分别在70℃下加热2分钟。然后在PEG-DSPE乙醇溶液中添加脂质体悬浮液，混合后在70℃下加热2分钟后，水冷。在得到的脂质体悬浮液中加入PBS，稀释至总脂质浓度达到30mg/ml，得到脂质体悬浮液(制剂14)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为116nm。
实施例15
将30mg/ml的DOTAP和12mg/ml的PEG-DSPE悬浮液用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.4μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，得到粒径80nm左右的脂质体悬浮液。用搅拌器搅拌下，在该悬浮液500μl中加入250μl的15mg/ml的F-PS水溶液，加入1ml的乙醇。再在该悬浮液中加入120mg的EggPC和25mg的CREMOPHOREL(Sigma制)溶于1ml乙醇的溶液250μl。在该悬浮液中缓慢加入23ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到5％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加40μl的PBS再次悬浮，再用PBS稀释，得到F-PS 3mg/ml的脂质体悬浮液。相对于120重量份的EggPC，用少量乙醇溶解50重量份的PEG-DSPE(约脂质体悬浮液的1/25容量)。将脂质体悬浮液与PEG-DSPE乙醇溶液分别在70℃下加热2分钟。然后在PEG-DSPE乙醇溶液中添加脂质体悬浮液，混合后在70℃下加热2分钟后，水冷。在得到的脂质体悬浮液中加入PBS，稀释至总脂质浓度达到30mg/ml，得到脂质体悬浮液(制剂15)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为140nm。
实施例16
将30mg/ml的DOTAP和12mg/ml的PEG-DSPE悬浮液用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.4μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，得到粒径80nm左右的脂质体悬浮液。用搅拌器搅拌下，在该悬浮液250μl中加入120μl的15mg/ml的F-PS水溶液，加入0.5ml的乙醇。再在该悬浮液中加入25mg的Tween80溶于120mg/ml EggPC乙醇溶液1ml后得到的溶液125μl。在该悬浮液中缓慢加入11.5ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到5％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加40μl的PBS再次悬浮，再用PBS稀释，得到F-PS 3mg/ml的脂质体悬浮液。相对于120重量份的EggPC，用少量乙醇溶解50重量份的PEG-DSPE(约脂质体悬浮液的1/25容量)。将脂质体悬浮液与PEG-DSPE乙醇溶液分别在70℃下加热2分钟。然后在PEG-DSPE乙醇溶液中添加脂质体悬浮液，混合后在70℃下加热2分钟后，水冷。在得到的脂质体悬浮液中加入PBS，稀释至总脂质浓度达到30mg/ml，得到脂质体悬浮液(制剂16)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为151nm。
实施例17
将30mg/ml的DOTAP和12mg/ml的PEG-DSPE悬浮液用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.4μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，得到粒径80nm左右的脂质体悬浮液。用搅拌器搅拌下，在该悬浮液250μl中加入125μl的15mg/ml的F-PS水溶液，加入0.5ml的乙醇。再在该悬浮液中加入120mg的EggPC、120mg的Span20(关东化学制)、50mg的PEG-DSPE溶于2ml乙醇的溶液125μl。在该悬浮液中缓慢加入11.5ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到5％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加40μl的PBS再次悬浮，再用PBS稀释，得到F-PS 3mg/ml的脂质体悬浮液。相对于120重量份的EggPC，用少量乙醇溶解50重量份的PEG-DSPE(约脂质体悬浮液的1/25容量)。将脂质体悬浮液与PEG-DSPE乙醇溶液分别在70℃下加热2分钟。然后在PEG-DSPE乙醇溶液中添加脂质体悬浮液，混合后在70℃下加热2分钟后，水冷。在得到的脂质体悬浮液中加入PBS，稀释至总脂质浓度达到30mg/ml，得到脂质体悬浮液(制剂17)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为131nm。
实施例18
将30mg/ml的DOTAP和12mg/ml的PEG-DSPE悬浮液用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.4μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，得到粒径80nm左右的脂质体悬浮液。用搅拌器搅拌下，在该悬浮液500μl中加入250μl的15mg/ml的F-PS水溶液，加入1ml的乙醇。再在该悬浮液中加入120mg的EggPC和25mg的CREMOPHOREL(Sigma制)溶于1ml乙醇的溶液250μl。在该悬浮液中缓慢加入23ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到5％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加40μl的PBS再次悬浮，再用PBS稀释，得到F-PS 3mg/ml的脂质体悬浮液。相对于120重量份的EggPC，用少量乙醇溶解50重量份的PEG-DSPE(约脂质体悬浮液的1/25容量)。将脂质体悬浮液与PEG-DSPE乙醇溶液分别在70℃下加热2分钟。然后在PEG-DSPE乙醇溶液中添加脂质体悬浮液，混合后在70℃下加热2分钟后，水冷。在得到的脂质体中加入PBS，稀释至总脂质浓度达到30mg/ml，得到脂质体悬浮液(制剂18)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为133nm。
实施例19
在589mg的蛋黄卵磷脂(KUPPY制)中加入50mmol/L的磷酸二氢钾水溶液11.8ml，用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤30次。将该悬浮液40μl与1mg/ml的G-CSF(协和发酵制，narthoglasstym，基因重组人G-CSF变异型)水溶液1ml和2mg/ml葡聚糖硫酸钠(默克制)水溶液1ml的混合液混合，用1mol/L和0.1mol/L的盐酸水溶液(关东化学制)将混合液调节为pH4。在该混合液500μl中加入753μl的乙醇，加入50mg/ml的蛋黄卵磷脂乙醇溶液80μl。在该悬浮液中缓慢加入7ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到10％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、146,000×g、25℃)，除去上清液。加水使总量达到500μl再次悬浮，得到脂质体悬浮液(制剂19)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为316nm。
实施例20
在588mg的蛋黄卵磷脂和205mg的PEG-DSPE中室温下加入适量乙醇，使之溶解后，蒸馏除去乙醇，减压干燥。向其中加入50mmol/L的磷酸二氢钾水溶液11.8ml，用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤30次。将该悬浮液40μl与1mg/ml的G-CSF水溶液1ml和2mg/ml葡聚糖硫酸钠水溶液1ml的混合液混合，用1mol/L和0.1mol/L的盐酸水溶液将混合液调节为pH4。在该混合液500μl中加入753μl的乙醇，再加入含有50mg/ml的蛋黄卵磷脂、16.7mg/ml PEG-DSPE的乙醇溶液80μl。在该悬浮液中缓慢加入7ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到10％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、146,000×g、25℃)，除去上清液。加水使总量达到500μl再次悬浮，得到脂质体悬浮液(制剂20)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为316nm。
实施例21
在598mg的蛋黄卵磷脂和68.8mg的蔗糖脂肪酸酯(三菱化成制)中在室温下加入适量乙醇溶解后，蒸馏除去乙醇，减压干燥。向其中加入50mmol/L的磷酸二氢钾水溶液12.0ml，用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤30次。将该悬浮液40μl与1mg/ml的G-CSF水溶液1ml和2mg/ml葡聚糖硫酸钠水溶液1ml的混合液混合，用1mol/L和0.1mol/L的盐酸水溶液将混合液调节为pH4。在该混合液500μl中加入753μl的乙醇，加入含有50mg/ml的蛋黄卵磷脂和4.5mg/ml蔗糖脂肪酸酯的乙醇溶液80μl。在该悬浮液中缓慢加入7ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到10％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、146,000×g、25℃)，除去上清液。加水使总量达到500μl，得到脂质体悬浮液(制剂21)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为242nm。
实施例22
在150mg的蛋黄卵磷脂和60mg的PEG-DSPE中加入5ml蒸馏水，用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.08μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次。将该悬浮液571μl与含有1.4mg/ml G-CSF的磷酸二氢钾水溶液119μl和2mg/ml葡聚糖硫酸钠水溶液167μl的混合液混合，用1mol/L和0.1mol/L的盐酸水溶液将混合液调节为pH4。在该混合液0.5ml中加入666μl的乙醇，加入120mg蛋黄磷脂酰胆碱(EggPC、日本油脂制)和25mgPEG-DSPE溶于1ml乙醇的溶液167μl。在该悬浮液中缓慢加入47ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到5％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、146,000×g、4℃)，除去上清液。加水使总量达到500μl，得到脂质体悬浮液(制剂22)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为126nm。
买施例23
在150mg的蛋黄卵磷脂和60mg的PEG-DSPE中加入5ml蒸馏水，用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.08μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.03μm聚碳酸酯膜过滤器过滤7次。将该悬浮液286μl与含有1.4mg/ml G-CSF的磷酸二氢钾水溶液119μl和2mg/ml葡聚糖硫酸钠水溶液119μl的混合液286μl混合，用1mol/L和0.1mol/L的盐酸水溶液将混合液调节为pH4。在该混合液0.25ml中加入333μl的乙醇，再加入120mg蛋黄磷脂酰胆碱和25mgPEG-DSPE溶于1ml乙醇的溶液84μl。在该悬浮液中缓慢加入23.5ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到5％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、146,000×g、4℃)，除去上清液。加入磷酸二氢钾水溶液再悬浮，得到脂质体悬浮液(制剂23)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为146nm。
实施例24
在150mg的蛋黄卵磷脂和60mg的PEG-DSPE中加入5ml蒸馏水，用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.08μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.05μm聚碳酸酯膜过滤器过滤20次。将该悬浮液428μl与含有1.4mg/ml G-CSF的磷酸二氢钾水溶液89μl和2mg/ml葡聚糖硫酸钠水溶液125μl的混合液混合，用1mol/L和0.1mol/L的盐酸水溶液将混合液调节为pH4。在该混合液0.5ml中加入666μl的乙醇，再加入120mg蛋黄磷脂酰胆碱和25mg PEG-DSPE溶于1ml乙醇的溶液167μl。在该悬浮液中缓慢加入47ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到5％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、146,000×g、4℃)，除去上清液。加入磷酸二氢钾水溶液再悬浮，得到脂质体悬浮液(制剂24)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为134nm。
实施例25
在150mg的蛋黄卵磷脂和60mg的PEG-DSPE中加入5ml蒸馏水，用螺旋混合器震荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.08μm的聚碳酸酯膜过滤器过滤20次，再用0.05μm聚碳酸酯膜过滤器过滤20次。将该悬浮液500μl与含有1,000,000units/ml干扰素α-2b(ResearchDiagnostics制)的PBS溶液20μl、2mg/ml葡聚糖硫酸钠水溶液150μl和蒸馏水80μl的混合液混合，用1mol/L和0.1mol/L的盐酸水溶液将混合液调节为pH4。在该混合液0.5ml中加入666μl的乙醇，再加入120mg蛋黄磷脂酰胆碱和25mg PEG-DSPE溶于1ml乙醇的溶液167μl。在该悬浮液中缓慢加入47ml蒸馏水，调节至乙醇浓度达到5％以下。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、146,000×g、4℃)，除去上清液。加入磷酸二氢钾水溶液再悬浮，得到脂质体悬浮液(制剂25)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为164nm。
比较例1
将215mgEggPC、61mg的DOTAP和54mg的胆固醇(chol)溶于氯仿中后，减压下除去溶剂。在得到的薄膜上添加FD水溶液(2mg/ml)5ml。将该悬浮液在室温下用0.4μm的聚碳酸酯膜过滤20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤20次。添加PBS，调节总脂质浓度达到30mg/ml，得到脂质体悬浮液(制剂a)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为134nm。
比较例2
将215mg EggPC、61mg的DOTAP和54mg的胆固醇溶于氯仿中后，减压下除去溶剂。在得到的薄膜上添加FD水溶液(2mg/ml)5ml。将该悬浮液在室温下用0.4μm的聚碳酸酯膜过滤20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤20次。添加浓度为1471mg/ml的PEG-DSPE的乙醇溶液0.05ml后，在70℃下加热5分钟，用PEG被覆脂质体表面。添加PBS，调节总脂质浓度达到30mg/ml，得到脂质体悬浮液(制剂b)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为143nm。
比较例3
将300mg的氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、100mg的胆固醇和100mg的PEG-DSPE溶于氯仿中后，减压下除去溶剂。在得到的薄膜上添加FD水溶液(18.8mg/ml)8ml。将该悬浮液在70℃下用0.4μm的聚碳酸酯膜过滤4次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤10次。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，调节总脂质浓度达到30mg/ml，得到脂质体悬浮液(制剂c)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为149nm。
比较例4
将215mg的EggPC、61mg的DOTAP和54mg的胆固醇溶于氯仿中后，减压下除去溶剂。在得到的薄膜上添加FD水溶液(2mg/ml)8ml。将该悬浮液在室温下用0.4μm的聚碳酸酯膜过滤20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤20次。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS再次悬浮使总脂质浓度达到30mg/ml，得到脂质体悬浮液(制剂d)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为141nm。
比较例5
将215mg的EggPC、61mg的DOTAP和54mg的胆固醇溶于氯仿中后，减压下除去溶剂。在得到的薄膜上添加FD水溶液(2mg/ml)5ml。将该悬浮液在室温下用0.4μm的聚碳酸酯膜过滤20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤20次。添加浓度为1471mg/ml的PEG-DSPE的乙醇溶液0.05ml之后，在70℃下加热5分钟，用PEG被覆脂质体表面。对得到的脂质体悬浮液进行超速离心分离(1小时、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS再次悬浮使总脂质浓度达到30mg/ml，得到脂质体悬浮液(制剂e)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为139nm。
比较例6
使F-PS溶于PBS中，得到F-PS溶液(制剂f)。
比较例7
按30mg/12mg/ml的比例混合DOTAP/PEG-DSPE/蒸馏水，用螺旋混合器振荡搅拌。将该悬浮液在室温下用0.4μm的聚碳酸酯膜过滤20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜过滤20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜过滤20次。在该悬浮液0.5ml中添加15mg/ml的F-PS蒸馏水溶液0.25ml，得到总脂质浓度为28mg/ml的脂质体悬浮液(制剂g)。
以DLS测定脂质体的平均粒径，为108nm。
以下利用试验例说明本发明的效果。
试验例1
对实施例1～5中制备的制剂1～5和比较例1～5中制备的制剂a～e进行超速离心分离(1小时，110,000×g，25℃)。为定量各制剂中的FD和超速离心分离后上清液中的FD，使用荧光微量培养板读出器，以激发波长485nm、荧光波长530nm测定荧光强度。另外，利用磷脂CTESTWACO(和光纯药制)以酶法定量各制剂的脂质体中磷脂酰胆碱(PC)。从PC浓度以加料比换算总脂质浓度。按下式(1)计算出FD的单位脂质封入效率和超速离心分离的内包率。
单位脂质的封入效率(mgFD/mg总脂质)＝(A1-C1)/B1    (1)
A1：各制剂中的FD量(mg/ml)
B1：各制剂中的总脂质量(mg/ml)
C1：上清液中的FD量(mg/ml)
由超速离心分离得到的内包率(％)＝[(A1-C1)÷B1]/(D1÷E1)×100(2)
A1：各制剂中的FD量(mg/ml)
B1：各制剂中的总脂质量(mg/ml)
C1：上清液中的FD量(mg/ml)
D1：实施例1～5或比较例1～5中FD加入量(mg/ml)
E1：实施例1～5或比较例1～5中加入总脂质量(mg/ml)
结果在表1和表2中给出。
表1：单位脂质的封入效率
  封入效率(mgFD/mg总脂质)
  制剂1   0.015
  制剂2   0.031
  制剂3   0.063
  制剂4   0.019
  制剂5   0.027
  制剂a   0.021
  制剂b   0.009
  制剂c   0.036
  制剂d   0.011
  制剂e   0.007
表2：由超速离心分离得到的内包率
  内包率(％)
  制剂1   54
  制剂2   72
  制剂3   97
  制剂4   72
  制剂5   81
  制剂a   70
  制剂b   36
  制剂c   12
  制剂d   38
  制剂e   26
由表1可知，制剂1～5的脂质体中制剂a和c具有同样的高封入效率，但未考虑加入的FD量/总脂质量。制备制剂1～5和a～e时的加入量分别不同，特别是制剂c，相对于脂质而言，使用了大量的FD进行制备，如果考虑到加入量，制剂1～5和a的脂质体相对于总脂质量来说是FD量高的脂质体。
表2中给出的内包率是将表1的结果除以加入时的FD量/总脂质量后得到的值的百分率，反应了加入时的FD量/总脂质量。由表2可知，制剂1～5和a的脂质体中FD内包率较高，而制剂b～e的脂质体中内包率较低。这表明制剂b～e的脂质体中大量存在未被内包的FD(游离)，在制备过程或内包率的分析过程中游离的FD被除去。由该结果可知，在制剂b～e中，加入的FD中被封入脂质体中或牢固结合(静电吸附)在脂质体表面的FD少，被只有很少的FD被有效利用。
试验例2
在实施例1～5中制备的制剂1～5和比较例1～5中制备的制剂a～e的各0.02ml中加入PBS1.98ml，混合，作为试样溶液。混合之后立即将该试样溶液0.5ml进行凝胶过滤(Sepharose CL-4B，φ10mm×20cm，流动相：PBS，试样添加量：2ml，级分采集量：约2ml)。分离脂质体级分和未被内包在脂质体中的成分的级分，与试验例1同样测定溶出液的荧光强度。由凝胶过滤得到的内包率用式(3)算出。
由凝胶过滤得到的内包率(％)＝[F1/(F1+G1)]×100    (3)
F1：脂质体级分中的FD量(mg)
G1：未被内包在脂质体中的成分的级分中FD量(mg)
结果在表3中给出。
表3：由凝胶过滤得到的内包率
  内包率(％)
  制剂1   61
  制剂2   71
  制剂3   75
  制剂4   65
  制剂5   55
  制剂a   13
  制剂b   16
  制剂c   82
  制剂d   26
  制剂e   70
在凝胶过滤中，不只是游离的FD，牢固地结合(静电吸附)在脂质体表面的FD也被除去。另外，制剂的稳定性差的情况下，存在于内水相中的FD部分漏出。由表3可知，制剂1～5、c和e的脂质体内包率高。这表明在脂质体的内水相中存在很多FD。但是，在表3中未考虑到加入时FD量/总脂质量，因为相对于脂质而言在制剂c中使用了大量的FD进行制备，内包率当然高。另一方面，制剂a、b和d的值较低，FD未被牢固地封入脂质体内，可以说是稳定性差的制剂。
表2中给出了制造效率，表3中给出了脂质体的稳定性。由表2和表3可知，制剂a虽然制造效率好，但不是十分稳定，而制剂c和e虽然稳定，但制造效率差，进而，制剂b和d的制造效率和稳定性都差，另一方面，制剂1～5的制造效率、稳定性都好。在制剂1～5中，FD被牢固地包封在脂质体内部。即，FD-阳离子脂质复合体被脂质被覆。
试验例3
将实施例6中制备的制剂6进行超速离心分离(1小时，110,000×g，25℃)。为定量制剂6中的F-Ins和超速离心分离后的上清液中的F-Ins，使用荧光微量培养板读出器，测定激发波长485nm、荧光波长530nm下的荧光强度。另外，对制剂脂质体中的PC利用磷脂C TESTWACO(和光纯药制)以酶法进行定量。由PC浓度按加入比换算总脂质浓度。F-Ins对脂质体的单位脂质封入效率和超离心分离得到的内包率由式(4)式(5)算出。
单位脂质的封入效率(mgF-Ins/mg总脂质)＝(A2-C2)/B2  (4)
A2：制剂6中的F-Ins量(mg/ml)
B2：制剂6中的总脂质量(mg/ml)
C2：上清液中的F-Ins量(mg/ml)
由超速离心分离得到的内包率(％)＝[(A2-C2)÷B2]/(D2÷E2)×100(5)
A2：制剂6中的F-Ins量(mg/ml)
B2：制剂6中的总脂质量(mg/ml)
C2：上清液中的F-Ins量(mg/ml)
D2：实施例6中加入F-Ins量(mg/ml)
E2：实施例6中加入总脂质量(mg/ml)
结果在表4和表5中给出。
表4：单位脂质的封入效率
  封入效率(mg F-Ins/mg总脂质)
 制剂6   0.010
表5：由超速离心分离得到的内包率
  内包率
  制剂6   73
由表4可知，制剂6中尽管单位脂质的F-Ins加入量很少，但F-Ins的单位脂质封入效率还是很高。
由超速离心分离得到的内包率中，牢固地结合在脂质体表面的F-Ins也被作为内包物测定。由表5可知，制剂6的脂质体与制剂1-5的脂质体相同，具有很高的内包率。
试验例4
在实施例6制备的制剂6(0.02ml)中加入1.98ml的PBS，混合，作为试样溶液。混合之后立即将该试样溶液0.5ml进行凝胶过滤(Sepharose CL-4B，φ10mm×20cm，流动相：PBS，试样添加量：2ml，级分采集量：约2ml)。分离脂质体级分和未被内包在脂质体中的成分的级分，与试验例3同样测定溶出液的荧光强度。由凝胶过滤得到的内包率用式(6)算出。
由凝胶过滤得到的内包率(％)＝[F2/(F2+G2)]×100    (6)
F2：脂质体级分中的F-Ins量(mg)
G2：未被内包在脂质体中的成分的级分中F-Ins量(mg)
结果在表6中给出。
表6：由凝胶过滤得到的内包率
  内包率(％)
  制剂6   73
去除牢固结合在脂质体表面上的F-Ins之后测定凝胶过滤得到的内包率。由表6可知，制剂6的脂质体与制剂1-5相同，内包率高，在脂质体的内水相中存在较多的F-Ins。即，制剂6可以说是F-Ins牢固地被封入脂质体内、稳定性高的制剂，F-Ins-脂质复合体可由脂质被覆。
试验例5
将实施例7～13中制备的制剂7～13进行超速离心分离(1小时，110,000×g，25℃)。为定量各制剂中的F-PS和超速离心分离后的上清液中的F-PS，使用荧光微量培养板读出器，测定激发波长485nm、荧光波长530nm下的荧光强度。另外，对各制剂脂质体中的PC利用磷脂C TESTWACO(和光纯药制)以酶法进行定量。由PC浓度按加入比换算总脂质浓度。F-PS在脂质体上的单位脂质封入效率和超离心分离得到的内包率由下式(7)和式(8)算出。
单位脂质的封入效率(mgF-Ins/mg总脂质)＝(A3-C3)/B3  (7)
A3：各制剂中的F-PS量(mg/ml)
B3：各制剂中的总脂质量(mg/ml)
C3：上清液中的F-PS量(mg/ml)
由超速离心分离得到的内包率(％)＝[(A3-C3)÷B3]/(D3÷E3)×100(8)
A3：各制剂中的F-PS量(mg/ml)
B3：各制剂中的总脂质量(mg/ml)
C3：上清液中的F-PS量(mg/ml)
D3：实施例7～13中加入F-PS量(mg/ml)
E3：实施例7～13中加入总脂质量(mg/ml)
结果在表7和表8中给出。
表7：单位脂质的封入效率
  封入效率(mgF-PS/mg总脂质)
  制剂7   0.058
  制剂8   0.034
  制剂9   0.031
  制剂10   0.050
  制剂11   0.059
  制剂12   0.030
  制剂13   0.024
表8：由超速离心分离得到的内包率
  内包率(％)
  制剂7   109
  制剂8   126
  制剂9   76
  制剂10   107
  制剂11   111
  制剂12   86
  制剂13   97
表7表明制剂7-13中F-PS的单位脂质的封入效率很高。
由超速离心分离得到的内包率中，牢固结合在脂质体表面的F-PS也被作为内包物质而被测定。表8表明制剂7-13的脂质体是F-PS的内包率高的脂质体。
试验例6
在实施例7-9、11和12制备的制剂7-9、11和12的各0.02ml中加入1.98ml的PBS，混合，制成试样溶液。混合之后立即对试样溶液0.5ml凝胶过滤(Sepharose CL-4B，φ10mm×20cm，流动相：PBS，试样添加量：2ml，级分采集量：约2ml)。分离脂质体级分和未被内包在脂质体中成分的级分，与试验例5同样测定溶出液的荧光强度。由凝胶过滤得到的内包率用式(9)算出。
由凝胶过滤得到的内包率(％)＝[F3/(F3+G3)]×100   (6)
F3：脂质体级分中的F-PS量(mg)
G3：未被内包在脂质体中的成分的级分中F-PS量(mg)
结果在表9中给出。
表9：由凝胶过滤得到的内包率
  内包率(％)
  制剂7   84
  制剂8   96
  制剂9   94
  制剂11   90
  制剂12   89
去除牢固结合在脂质体表面上的F-PS之后测定凝胶过滤得到的内包率。由表9可知，制剂7-9、11和12的脂质体内包率高，在脂质体的内水相中存在较多的F-PS。即，制剂7-9、11和12可以说是F-PS牢固地被封入脂质体内、稳定性高的制剂，F-PS-脂质复合体可由脂质被覆。
试验例7
进行肿瘤转移性的比较。将人肾脏癌细胞Caki-1株的2mm见方的肿瘤切片移植到BALB/cAJcl-nu系6周龄NUDO小鼠(日本KUREA)的右体侧皮下，将移植20天后肿瘤体积达到102-349mm3的小鼠按每组3只分组，将实施例7中制备的制剂7和比较例6中制备的制剂f以F-PS25mg/kg的容量，用注射筒(26G，1ml，Termo制)在小鼠尾静脉给药。经时性地摘出肿瘤，将肿瘤匀化，与试验例5同样测定匀化物中的荧光强度。算出各时点的肿瘤内F-PS量(μg/g)，评价F-PS的肿瘤转移性。
结果在图1中给出。
图1表明给予制剂7的小鼠比给予制剂f的小鼠的F-PS的转移量增加。
试验例8
用电子显微镜观察实施例1中制备的制剂1的形态。在1％的钼酸铵水溶液(用氨水调pH为7.3)中添加制剂1使总脂质浓度达到0.5mg/ml。将其滴加到装有火棉胶膜的筛网(400目，日新EM)上，约1分钟后用滤纸吸取多余的水分，使其干燥。用透射电子显微镜(H-7000型，日立)以加速电压75kV观察。
结果表明在制剂1中，存在很多内部具有与包围外侧的膜形状不同的团块的粒子。即，该结果表明内部粒子被脂质双层膜被覆。
试验例9
将实施例1中制备的制剂1和比较例1和2中制备的制剂a和b给予到尿烷麻醉下的CD(SD)IGS雄性大鼠(体重200-300g，每组2或3只)的大腿静脉中(给药量与总脂质10mg/kg相当)。用经肝素处理过的注射器经时从颈静脉采血，离心分离(5分钟，10,000×g，4℃)后，与试验例1同样测定血浆中的FD荧光强度，算出血浆中FD浓度。
结果在图2中给出。
图2表明给予制剂1的大鼠与给予制剂a或b的大鼠相比，FD的血浆中浓度推移较高。即，FD-脂质复合体被脂质被覆后改善了血中滞留性。
试验例10
将实施例7-13中制备的制剂7-13和比较例6中制备的制剂f给予到尿烷麻醉下的CD(SD)IGS雄性大鼠(体重200-300g，每组2只)的大腿静脉中(给药量与总脂质10mg/kg相当)。用经肝素处理过的注射器经时从颈静脉采血，离心分离(5分钟，10,000×g，4℃)后，与试验例5同样测定血浆中的FD荧光强度，算出血浆中FD浓度。
结果在图3中给出。
图3表明给予制剂7-13的大鼠与给予制剂f的大鼠相比，FD的血浆中浓度推移都较高。
试验例11
将实施例7中制备的制剂7和比较例6-7中制备的制剂f-g由BALB/cAJcl雄性小鼠(体重20-30g，每组2或3只)的尾静脉给药(给药量与总脂质10mg/kg相当)。在乙醚麻醉下，用经肝素处理过的注射器从大腿静脉采血，离心分离(5分钟，10,000×g，4℃)后，与试验例5同样测定血浆中的F-PS荧光强度，算出血浆中的F-PS浓度。
结果在图4中给出。
图4表明，与给予制剂f-g的小鼠中给予F-PS后迅速从血浆中消失相比，给以制剂7的小鼠中F-PS的血浆中浓度推移较高。
试验例12
将实施例13-18中制备的制剂13-18进行超速离心分离(1小时，110,000×g，25℃)。为定量各制剂中的F-PS和超速离心分离后的上清液中的F-PS，使用荧光微量培养板读出器，测定激发波长485nm、荧光波长530nm下的荧光强度。由下述式(10)算出F-PS在脂质体上由超速离心分离得到的内包率。
由超速离心分离得到的内包率(％)＝[(A4-B4)]/B4×100   (10)
A4：各制剂中的F-PS量(mg/ml)
B4：上清液中的F-PS量(mg/ml)
结果在表10中给出。
表10：由超速离心分离得到的内包率
  内包率(％)
  制剂13   98
  制剂14   95
  制剂15   97
  制剂16   98
  制剂17   95
  制剂18   99
试验例13
在实施例7和14-18中制备的制剂7和14-18的各0.08ml中加入胎牛血清(FBS)7.92ml，混合，作为试样溶液。在混合之后(0小时)和37℃下放置6-168小时后取样，将各试样溶液0.5ml凝胶过滤(Sepharose CL-4B，φ10mm×20cm，流动相：PBS，试样添加量：2ml，级分采集量：约2ml)。分离脂质体级分和未被内包在脂质体中的成分的级分。为定量各级分的F-PS，用荧光微量培养板读出器，测定激发波长485nm、荧光波长530nm下的荧光强度。由下式(11)算出由脂质体漏出的F-PS量。
A5：脂质体级分中的F-PS量(mg)
B5：未被内包在脂质体内的成分的F-PS量(mg)
结果在表11中给出。
表11：由FBS中脂质体的F-PS漏出性(漏出％)
  时间(小时)   0   6   24   48   72   96   168
  制剂7   17   28   41   51   52   -   64
  制剂14   30   47   55   63   62   -   65
  制剂15   35   48   54   57   -   -   72
  制剂16   29   44   56   55   -   -   62
  制剂17   15   21   26   -   -   43   47
  制剂18   27   43   51   55   -   -   57
表11表明，制剂7和14-18中F-PS经时性地由脂质体漏出。即，利用本发明方法由脂质膜被覆微粒，集积到体内的靶部位后，内包在脂质膜内的药物等微粒经时性地漏出，所以可以经时性地表达药效。
试验例14
凝胶过滤实施例19-21中制备的制剂19-21。以脂质体悬浮液0.5ml为试样溶液，添加到凝胶过滤柱(Sepharose CL-4B，φ10mm×20cm，移动相：PBS，试样添加量：0.5ml，试样采集量：约1.5ml)上。分离脂质体级分和游离G-CSF级分，分别用旋转蒸发器浓缩。在浓缩后的脂质体级分中加入蒸馏水，至总量为2ml。在该脂质体悬浮液200μl中加入含有10％月桂基硫酸钠的pH7的50mmol/L的磷酸缓冲液50μl，蒸馏水150μl，搅拌。再加入400μl的2-丙醇，搅拌，完全破坏脂质体后，加入下述的移动相I 800μl，混合。进行离心分离(10000×g，5分钟)，用HPLC分析上清液。在浓缩的游离G-CSF级分中加入含有2％普朗尼克F127(Sigma制)、0.5％三氟乙酸(TFA)的50％乙腈水溶液，至总量为5ml，进行HPLC分析。
柱：YMC pack ODS-AM，φ6.0mm×15cm
移动相：I含有0.5％TFA的50％乙腈
        II含有0.5％TFA的80％乙腈
分析开始后II液的比例如下设定：0-5分钟为0％，5-35分钟内线性增加为0％-100％，35-45分钟为100％。
检测：280nm
分析温度：30℃
流速：1ml/分钟
注入量：200μl
各脂质体中内包的G-CSF的内包率由下式(12)算出。
内包率(％)＝A6/(A6+B6)×100      (12)
A6：脂质体级分中的G-CSF量(μg)
B6：游离G-CSF级分中的G-CSF量(μg)
结果在表12中给出。
表12：内包率
  内包率(％)
  制剂19   100
  制剂20   100
  制剂21   100
表12表明制剂19-21中不含由凝胶过滤分离的游离G-CSF。
附图说明
图1表示F-PS向肿瘤的转移量。横轴为给以制剂后的时间(小时)，纵轴为肿瘤内F-PS量。
图2表示血浆中的FD浓度。横轴为给以制剂后的时间(小时)，纵轴为血浆中的FD浓度。
图3表示血浆中F-PS浓度。横轴为给以制剂后的时间(小时)，纵轴为血浆中的F-PS浓度。
图4表示血浆中的F-PS浓度。横轴为给以制剂后的时间(小时)，纵轴为血浆中的F-PS浓度。
图1-4中符号的含义如下。
图1
●-：制剂7给药组
-○-：制剂f给药组
图2
●：制剂1给药组
-◇-：制剂a给药组
△：制剂b给药组
图3
●-：制剂7给药组
◇-：制剂8给药组
◆：制剂9给药组
△：制剂10给药组
▲：制剂11给药组
□：制剂12给药组
-■-：制剂13给药组
+：制剂f给药组
图4
●：制剂7给药组
+：制剂给药组
◆：制剂g给药组
利用本发明可以简便且高效地利用脂质膜被覆微粒。

Claims (28)

1.由脂质膜被覆的微粒的制备方法，所述脂质膜由脂质在微粒表面聚集而成，所述脂质是从磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂、胆固醇及合成脂质中选择的一种以上，所述微粒含有药物与下述物质形成的复合体，所述物质为从脂质聚集体、脂质体、天然高分子化合物、合成高分子化合物、金属胶体、阳离子脂质、阴离子脂质中选择的一种以上，所述制备方法包括以下步骤：
调制含有极性有机溶剂的水溶液的步骤，在所述含有极性有机溶剂的水溶液中并非溶解而是分散有含有复合体的微粒、且在含有极性有机溶剂的水溶液中溶解有脂质，所述脂质为从磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂、胆固醇及合成脂质中选择的一种以上，所述极性有机溶剂为从醇类、二醇类和聚亚烷基二醇类中选择的一种以上；
通过减少含有极性有机溶剂的水溶液中的极性有机溶剂的比例而在含有复合体的微粒表面被覆该脂质膜的步骤。
2.权利要求1记载的制备方法，其中所述含有复合体的微粒是平均粒径为10nm～1000nm的微粒。
3.权利要求1记载的制备方法，其中所述含有复合体的微粒是含有水溶性高分子衍生物的微粒，所述水溶性高分子衍生物是选自聚乙二醇化脂质、聚乙二醇烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯类、聚乙二醇硬脂酸酯类、乙二醇丙二醇共聚物和甘油酯类中的一种以上。
4.权利要求1记载的制备方法，其中极性有机溶剂是乙醇。
5.权利要求1记载的制备方法，其中极性有机溶剂是丙二醇。
6.权利要求1记载的制备方法，其中极性有机溶剂是聚乙二醇。
7.权利要求1～6任一项记载的制备方法，其中药物是选自肽、蛋白质、核酸、低分子化合物、糖类、高分子化合物中的药物。
8.权利要求1～6任一项记载的制备方法，其中含有复合体的微粒是药物与阳离子脂质的复合体。
9.权利要求1～6任一项记载的制备方法，其中含有复合体的微粒是药物与阴离子脂质的复合体。
10.权利要求1～6任一项记载的制备方法，其中含有复合体的微粒是药物与含有磷脂的脂质体和葡聚糖硫酸钠形成的复合体。
11.由脂质膜被覆的微粒，所述脂质膜由脂质在微粒表面聚集而成，所述脂质是从磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂、胆固醇及合成脂质中选择的一种以上，所述微粒含有药物与下述物质形成的复合体，所述物质为从脂质聚集体、脂质体、天然高分子化合物、合成高分子化合物、金属胶体、阳离子脂质、阴离子脂质中选择的一种以上，该微粒由权利要求2记载的制备方法制成。
12.由脂质膜被覆的微粒的制备方法，脂质膜由脂质在微粒表面聚集而成，所述脂质是从磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂、胆固醇及合成脂质中选择的一种以上，所述微粒含有药物与下述物质形成的复合体，所述物质是从脂质聚集体、脂质体、天然高分子化合物、合成高分子化合物、金属胶体、阳离子脂质、阴离子脂质中选择的一种以上，所述制备方法包括以下步骤：
步骤A：使含有复合体的微粒并非溶解而是分散于含有极性有机溶剂的水溶液中，所述极性有机溶剂为从醇类、二醇类和聚亚烷基二醇类中选择的一种以上；
步骤B：在含有极性有机溶剂的水溶液或极性有机溶剂中溶解脂质，所述脂质是从磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂、胆固醇及合成脂质中选择的一种以上；
步骤C：混合步骤A得到的液体和步骤B得到的液体，得到在含有极性有机溶剂的水溶液中并非溶解而是分散有含有复合体的微粒、且在含有极性有机溶剂的水溶液中溶解有脂质的溶液；以及
步骤D：通过减少步骤C得到的极性有机溶剂的比例使脂质膜被覆在含有复合体的微粒上的步骤D。
13.权利要求12记载的制备方法，其中步骤A得到的液体和步骤B得到的液体中的极性有机溶剂的浓度为30％以上。
14.权利要求12记载的制备方法，其中步骤A得到的液体和步骤B得到的液体中的极性有机溶剂的浓度为60～90％。
15.权利要求14记载的制备方法，其中步骤D得到的液体中的极性有机溶剂的浓度为50％以下。
16.权利要求12记载的制备方法，其中，在步骤B中，使水溶性高分子衍生物与脂质一起溶解在含有极性有机溶剂的水溶液或极性有机溶剂中，所述水溶性高分子衍生物选自聚乙二醇化脂质、聚乙二醇烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯类、聚乙二醇硬脂酸酯类、乙二醇丙二醇共聚物和甘油酯类中的一种以上。
17.权利要求12记载的制备方法，其中含有复合体的微粒是平均粒径为10nm～1000nm的微粒。
18.权利要求12记载的制备方法，其中所述含有复合体的微粒是含有水溶性高分子衍生物的微粒，所述水溶性高分子衍生物是选自聚乙二醇化脂质、聚乙二醇烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯类、聚乙二醇硬脂酸酯类、乙二醇丙二醇共聚物和甘油酯类中的一种以上。
19.权利要求12记载的制备方法，其中极性有机溶剂是乙醇。
20.权利要求12记载的制备方法，其中极性有机溶剂是丙二醇。
21.权利要求12记载的制备方法，其中极性有机溶剂是聚乙二醇。
22.权利要求12～21任一项记载的制备方法，其中药物是选自肽、蛋白质、核酸、低分子化合物、糖类、高分子化合物中的药物。
23.权利要求12～21任一项记载的制备方法，其中含有复合体的微粒是药物与阳离子脂质的复合体。
24.权利要求12～21任一项记载的制备方法，其中含有复合体的微粒是药物与阴离子脂质的复合体。
25.权利要求12～21任一项记载的制备方法，其中含有复合体的微粒是药物与含有磷脂的脂质体和葡聚糖硫酸钠形成的复合体。
26.由脂质膜被覆的微粒，所述脂质膜由脂质在微粒表面聚集而成，所述脂质是从磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂、胆固醇及合成脂质中选择的一种以上，所述微粒含有药物与下述物质形成的复合体，所述物质是从脂质聚集体、脂质体、天然高分子化合物、合成高分子化合物、金属胶体、阳离子脂质、阴离子脂质中选择的一种以上，该微粒由权利要求17记载的制备方法制成。
27.权利要求11记载的由脂质膜被覆的微粒，所述脂质膜由脂质在微粒表面聚集而成，所述脂质是从磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂、胆固醇及合成脂质中选择的一种以上，所述微粒含有药物与下述物质形成的复合体，所述物质为从脂质聚集体、脂质体、天然高分子化合物、合成高分子化合物、金属胶体、阳离子脂质、阴离子脂质中选择的一种以上，其中含有复合体的微粒含有药物与脂质体形成的复合体。
28.权利要求26记载的由脂质膜被覆的微粒，所述脂质膜由脂质在微粒表面聚集而成，所述脂质是从磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂、胆固醇及合成脂质中选择的一种以上，所述微粒含有药物与下述物质形成的复合体，所述物质是从脂质聚集体、脂质体、天然高分子化合物、合成高分子化合物、金属胶体、阳离子脂质、阴离子脂质中选择的一种以上，其中含有复合体的微粒含有药物与脂质体形成的复合体。
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