CN1993113A - 包含磷酸钙纳米颗粒核心，生物分子和胆汁酸的颗粒，其生产方法，其治疗用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供以生物活性大分子包封的磷酸钙纳米颗粒。所述颗粒可以被用作生物活性大分子的载体来递送大分子。本发明还提供制备和使用所述颗粒的方法。

Description

包含磷酸钙纳米颗粒核心，生物分子和胆汁酸的颗粒，其生产方法，其治疗用途
对相关申请的交叉参考
本申请涉及递交于2004年2月13日的临时专利申请美国系列号60/544,693，在此将其全部内容并入作为参考。
有关联邦资助研究或发展的声明
不适用。
发明领域
本发明涉及新的磷酸钙颗粒，制备它们的方法，以及将它们用作载体来递送生物活性大分子的载体的方法。
发明背景
大分子药物，包括蛋白质，肽，多糖，核酸，脂质或组合，是日益重要的药物类别用来治疗各种医学病症。给予大分子药物的主要途径是注射，这是令人不愉快的，昂贵并且经常导致很差的患者顺应性。口服递送是施用药物的优选途径。不过，大分子药物很难通过肠道吸收并且能够被胃酸或胃肠道酶容易地破坏。克服口服大分子递送障碍的一种有希望的方法是使用纳米颗粒，它可以提供保护使得大分子药物免受降解并且能够吸收。
据报道载有胰岛素的纳米颗粒可以用来向动物递送生物活性胰岛素。例如，已经显示通过与富马酸酐寡聚物和氧化铁添加剂一起载入聚(丙交酯-共-乙交酯)纳米颗粒中的胰岛素防止血浆葡萄糖升高。Carino等，Controlled Release 65：261，(2000)。口服递送胰岛素与脱乙酰壳多糖纳米颗粒的另一个实例由Pan等，Intl.J.Pharmaceutics，249：139，(2002)提供。此外，还已报道聚烷基氰基丙烯酸酯纳米胶囊是用于在患糖尿病动物中口服递送胰岛素的有效载体。Damge等，Diabetes，37：246，(1988)。记载过通过胃肠道途径吸收颗粒物质并涉及淋巴集合淋巴结。Hussain等，Adv.DrugDelivery Rev.50：107，(2001)。
在影响颗粒吸收的因素中，颗粒大小似乎是主要因素。例如，Jani等(J.Pharm.Pharmacol.42：821，1990)研究了大鼠中各种大小的聚苯乙烯颗粒的肠道吸收。聚苯乙烯颗粒的吸收效率明显依赖于大小。小于100nm的颗粒显示明显的吸收，而大颗粒(500nm或更多)只显示中度到低度的吸收。
Desai等(Pharm.Res.13：1838，1996)在聚(丙交酯-共-乙交酯)或PLGA颗粒中也观察到对于颗粒肠道吸收的大小依赖性。在此研究中，大于500nm的PLGA颗粒事实上不显示通过肠道的吸收，而36％的100nm的PLGA颗粒得以吸收。
已经提议将纳米等级的颗粒用作生物学大分子如蛋白质和核酸和载体颗粒。见美国专利5,178,882；5,219,577；5,306,508；5,334,394；5,460,830；5,460,831；5,462,750；5,464,634，6,355,271。
磷酸钙颗粒是生物粘附性的/生物相容性的并且已经被常规地用作体外将核酸递送入细胞内区室的载体。Chen等，Mol.Cell.Biol.7：2745-52，(1987)；Welzel等，J.Mater.Chem.14：2213-2217(2004)；Jordan等，NucleicAcids Research 24：596-601(1996)；Loyter等，Exp.Cell Res.139：223-234(1982)。此外，还已经测试过磷酸钙作为载体用于基因治疗以体内递送大的核酸。Roy等，Intl.J.Pharmaceutics 250：25，(2003)。
已经描述过治疗性磷酸钙颗粒。美国专利号6,355,271；6,183,803；美国公开号2004/0258763；2002/0054914；2002/0068090；2003/0185892；2001/0048925；WO 02/064112；WO 03/051394；WO 00/46147；WO2004/050065；Cherian等，Drug Development and Industrial Pharmacy26：459-463(2000)。在糖尿病小鼠中测试了载有胰岛素的磷酸钙颗粒的口服制剂的效果并且显示了血液葡萄糖的控制。Morcol等，Intl.J.Pharmaceutics 277：91，(2004)。公开的磷酸钙颗粒具有在300nm到10μm之间的颗粒大小。动物研究使用平均范围2-4μm的颗粒大小。这些颗粒大小显然不是最理想的。
为了制备具有理想大小的磷酸钙颗粒，需要延长的超声处理(Cherian等Drug Dev.Ind.Pharmacy，26：459，2000；Roy等Intl.J.Pharmaceutics250：25，2003)，这可能会损害包封的大分子药物并且不适合于共沉淀操作。
另外，大分子进入磷酸钙颗粒的包封效率通常低下。例如，美国专利号6,355,271公开了大约40％的吸收效率，如果将胰岛素加入到预制的磷酸钙颗粒中的话；如果在颗粒形成期间混合胰岛素，则为大约89％。
这些报道的方法导致具有较不理想大小的颗粒，或者需要苛刻的条件，如延长的超声处理，其不适于大分子制剂。所以，一直对高效并且易于以低成本进行生产的口服大分子递送系统有所需要。
发明简述
本发明提供一种颗粒，其包含：a)磷酸钙纳米颗粒的核心；b)包封在核心颗粒中的生物活性大分子；和c)包封在核心颗粒中的包含胆汁酸的表面改性剂。
在一些实施方案中，所述核心颗粒的直径小于大约1000nm，小于大约300nm，或小于大约200nm。
在一些实施方案中，所述胆汁酸选自由胆酸盐、脱氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、甘胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、乌索脱氧胆酸盐、牛磺乌索脱氧胆酸盐(tauroursodeoxycholate)，和鹅脱氧胆酸盐组成的组。
在一些实施方案中，所述颗粒进一步包含肠溶衣。
在一些实施方案中，所述生物活性大分子选自由蛋白质、多肽、多糖、核酸、多核苷酸、脂质，和糖组成的组。在一些实施方案中，所述蛋白质或多肽选自由胰岛素，促红细胞生成素，干扰素，生长激素，和粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)组成的组。在一些实施方案中，所述生物活性大分子是选自由房尘螨(house dust mice)，动物皮屑，霉菌，花粉，豚草，胶乳，黄蜂毒液和昆虫源的变应原，及其任意组合的组成的组的变应原。
在一些实施方案中，所述颗粒适合以气溶胶的形式存在。在一些实施方案中，所述颗粒适于将生物活性大分子递送到黏膜表面。在一些实施方案中，所述颗粒适于将生物活性大分子递送到需要其的受试者的眼睛表面上用来治疗眼睛疾病。
本发明还提供含有本文所述磷酸钙纳米颗粒和药用载体的药物组合物。
本发明提供制备一种或多种磷酸钙颗粒的方法，所述方法包括：a)将钙盐水溶液与磷酸盐水溶液在存在含有胆汁酸的表面改性剂的情况下相接触；b)混合溶液直到获得理想大小的磷酸钙颗粒；和c)回收所述颗粒。
在一些实施方案中，钙盐的浓度在大约5mM和大约200mM之间。在一些实施方案中，磷酸盐的浓度在大约5mM和大约200mM之间。
在一些实施方案中，所述方法还包括在将钙盐水溶液与磷酸盐水溶液在存在含有胆汁酸的表面改性剂的情况下相接触之前，向磷酸盐水溶液或钙盐水溶液中加入生物活性大分子，由此磷酸钙颗粒与大分子共结晶。
本发明还提供一种治疗需要生物活性大分子的受试者的方法，所述方法包括向受试者给药含有本文所述磷酸钙纳米颗粒的药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物通过口服途径给药。在一些实施方案中，药物组合物给药到黏膜表面上。在一些实施方案中，药物组合物给药到眼睛表面上。
附图简述
图1是显示在用赋形剂(″V″)，G-CSFsc注射(″G″)或肠衣包被的磷酸钙纳米颗粒中的口服G-CSF(″D″)处理的大鼠中白血细胞计数的曲线图。
图2是显示在用干扰素sc注射(″SC1.6M″)或肠衣包被的磷酸钙纳米颗粒中的口服干扰素(″O16M″)处理后的大鼠中血清干扰素浓度的曲线图。
图3显示在扫描电子显微镜下的磷酸钙纳米颗粒的图像。图3A显示500倍放大的空白磷酸钙纳米颗粒的图像。图3B显示5000倍放大的载有胰岛素的磷酸钙纳米颗粒的图像。
图4是显示用口服胰岛素溶液(“对照”)，皮下胰岛素注射(“注射”)和肠衣包被的磷酸钙纳米颗粒中的口服胰岛素(“口服”)处理的糖尿病大鼠中百分比血糖变化的曲线图。
图5A是显示在有(“口服胰岛素”)或无(“No Rx”)肠衣包被的磷酸钙纳米颗粒中的200IU口服胰岛素的情况下摄取68g口服葡萄糖后在健康志愿者一体内血糖变化的曲线图。
图5B是显示在有(“口服胰岛素”)或无(“No Rx”)肠衣包被的磷酸钙纳米颗粒中的200IU口服胰岛素的情况下摄取68g口服葡萄糖后在健康志愿者二体内百分比血糖变化的曲线图。
图6是显示无处理(“空白”)，10IU胰岛素注射(″SC10″)或100IU(″PO100″)或200IU(″PO200″)在肠衣包被的磷酸钙纳米颗粒中的口服胰岛素的患有糖尿病的志愿者体内百分比血糖变化的曲线图。
图7是显示用赋形剂(″V″)，生长激素注射(″SC20″)或在肠衣包被的磷酸钙纳米颗粒中的口服生长激素(″PO50″)处理的在垂体摘除大鼠中净体重增长的曲线图。
发明详述
本发明提供包封了生物活性大分子的新型磷酸钙纳米颗粒，制备所述纳米颗粒的方法，以及利用所述纳米颗粒治疗需要施用所述生物活性大分子的医学病症的方法。用于本文时，“包封”，“包埋”或“结合”意指由一种物质进行复合，包封，结合，关联，包被，分层，或封闭。因而，包封在颗粒中的物质意指所述物质被结合到所述颗粒结构，或包被或附于所述颗粒的表面，或二者都有。
除非另外指定，本文所用的所有技术和科学术语都与本发明所属技术领域的普通技术人员所通常理解的具有相同意义。将本文提到的所有专利、申请、公开的申请和其它出版物的全部内容都并入作为参考。如果本节中所给出的定义与并入本文作为参考的专利、申请、公开的申请和其它出版物中给出的定义相反或不一致，则本节中给出的定义在并入本文作为参考的定义之上得以优选。
如本文所用的，“一个”或“一种”意指“至少一个”或“一个或多个”。
A.具有包封的生物活性大分子的磷酸钙纳米颗粒
本发明提供磷酸钙纳米颗粒，其包含：a)磷酸钙纳米颗粒的核心；b)包封在核心颗粒中的生物活性大分子；和c)包封在核心颗粒中的包含胆汁酸的表面改性剂。
本发明的磷酸钙核心颗粒具有小于大约8000nm，小于大约1000nm，更优选地，小于大约300nm的平均颗粒大小(直径)。所述颗粒可以具有在大约50nm和大约8000nm之间，在大约100nm和大约3000nm之间，或在大约100nm和大约1000nm之间的直径。在一些实施方案中，所述平均颗粒大小小于200nm。在一些实施方案中，平均颗粒大小小于100nm。
本发明的核心颗粒一般具有这样的形态学，即一般并且基本上是球形的并且纳米颗粒的大小基本上是单分散的。单分散指在这些纳米颗粒中观察到的狭窄大小分布，例如，在大约20％，大约30％，大约40％，或大约50％不同的大小范围之内。所述颗粒的表面可以是基本上光滑的。
本文所用的术语″基本上球形的″用来指基本圆形或椭圆形的颗粒，并且包括非平面的(unfaceted)和光滑的颗粒，或具有极少平面的颗粒，以及具有几个或许多平面的多面的颗粒。本文所用的术语“基本光滑的”意指基本上没有表面特征或具有100nm或更大大小的不规则性。所述核心颗粒可以是平面的或有角的并且仍然落入这种定义中，只要所述平面不包含许多上述类型的表面不规则性。
图3A和3B显示按照本文所述方法制备的纳米颗粒的实例的扫描电子显微镜图像。图3A显示没有以大约200nm平均直径涂布或分散的大分子的空白纳米颗粒。图3B显示其中大分子胰岛素分散具有大约70nm平均直径的纳米颗粒中的纳米颗粒。这些纳米颗粒显示球形或狭窄的大小分布。
本发明中的磷酸钙纳米颗粒包含含有具有双重功能的胆汁酸的表面改性剂。如实施例1中所示，当在胆汁酸存在的情况下形成颗粒时，生物活性大分子在磷酸钙纳米颗粒中的包封得以加强。所述胆汁酸还可以加强纳米颗粒的生物粘附性并且影响纳米颗粒的大小。可以使用任何胆汁酸。胆汁酸的实例包括，但不限于，胆酸盐、脱氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、甘胆酸盐、牛磺乌索脱氧胆酸盐、乌索脱氧胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐。
在一些实施方案中，本发明的磷酸钙纳米颗粒进一步包含聚乙二醇(PEG)。所述PEG可以具有大约500道尔顿到大约20,000道尔顿，例如，大约500，大约1000，大约5000，大约10,000，大约15,000，大约20,000道尔顿的分子量。
可以将任何生物活性大分子包封入核心磷酸钙纳米颗粒中。这些生物活性大分子包括，但不限于，蛋白质，多肽，多糖，核酸，脂质，糖，及其组合。在一些实施方案中，生物活性大分子为胰岛素，促红细胞生成素，干扰素，生长激素，或粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)。在一些实施方案中，生物活性大分子是变应原或抗原性物质。变应原的实例为房尘螨，动物皮屑，霉菌，花粉，豚草，胶乳，黄蜂毒液和昆虫源的变应原，及其任意组合。
生物活性大分子包括任何治疗剂，如α-1-抗胰蛋白酶，类固醇，治疗骨质疏松症的药物，血凝固因子，抗癌药物，抗生素，治疗性抗体，脂肪酶，β-阻断药，抗哮喘剂，反义寡核苷酸，用于呼吸性和其它疾病的脱氧核糖核酸酶，抗炎药物，抗病毒药，抗高血压药，心脏病治疗药物如抗心律不齐药物，和基因治疗剂，利尿剂，抗凝结化学品如肝素，及其组合。所述药剂可以是天然分离物或合成性的，化学或生物学药剂。
所述磷酸钙纳米颗粒还可以含有涂层。例如，用肠溶聚合物如醋酞纤维素，丙烯酸树脂和Aquateric进一步涂布用生物活性大分子包被和/或浸渍的纳米颗粒。肠溶衣包被的方法在现有技术中已经得到充分介绍并且特此并入参照文献。Beyger等，J.Pharm.Sci.75：573-578(1986)；Maharaj等，J.Pharm.Sci.73：39-42(1984)。
本发明还提供包含磷酸钙纳米颗粒核心以及包封在所述核心颗粒中的生物活性大分子的磷酸钙纳米颗粒，其中所述核心颗粒的平均颗粒大小(直径)小于大约300nm，条件是生物活性大分子不是核酸，多核苷酸，蛋白质，或多肽。本发明还提供包含磷酸钙纳米颗粒核心以及包封在所述核心颗粒中的生物活性大分子的磷酸钙纳米颗粒，其中所述核心颗粒的平均颗粒大小(直径)小于大约300nm，并且其中所述生物活性大分子是抗体。
本发明还提供包含本文所述磷酸钙纳米颗粒以及药用载体的药物组合物。合适的载体及其制剂是本领域已知的并且在Remington，The Scienceand Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing，2000中得以描述。所述药物组合物可以以溶液、胶囊、片剂、粉末，和气溶胶的形式配制；并且可以以适于口服递送，黏膜递送，或向眼睛表面递送的形式进行配制。所述组合物可以包括其它组分，如缓冲剂，防腐剂，非离子性表面活性剂，加溶剂，稳定剂，缓和剂，软化剂，润滑剂和张力剂。可以配制所述组合物以实现大分子的受控释放。
B.制备磷酸钙纳米微粒的方法
本发明还提供制备一种或多种磷酸钙颗粒的方法，所述方法包括：a)将钙盐水溶液与磷酸盐水溶液在存在含有胆汁酸的表面改性剂的情况下相接触；b)混合溶液直到获得理想大小的磷酸钙颗粒；和c)回收所述微粒。
典型地，通过优选地在存在包含胆汁酸的表面改性剂的情况下使可溶性钙盐与可溶性磷酸盐接触来将本发明的磷酸钙纳米颗粒制备成水性介质中的混悬液。
在一些实施方案中，制备具有大约1mM到大约100mM浓度之间的磷酸氢二钠，以及具有0.01-1％(w/v)浓度的表面改性剂如脱氧胆酸盐的蒸馏水溶液，并在容器中混合。在一些实施方案中，还包括其它的赋形剂如具有1-30％(w/v)浓度的聚乙二醇。
溶液的pH受磷酸盐缓冲系统控制。PH值影响纳米颗粒的大小并且应该适合于与待包封的大分子的稳定性要求。所述pH值可以在大约4.0到大约9.0之间，或更加优选地，在大约5.0到大约8.0之间。
颗粒大小受各种组分，包括钙，磷酸盐，以及大分子的浓度的影响。通常，钙或磷酸盐浓度越高，纳米颗粒就越大。
为了生成纳米颗粒，将具有1mM和大约100mM之间浓度的钙盐水溶液如氯化钙水溶液与上述磷酸盐水溶液混合。混浊立即形成，表明形成了磷酸钙纳米微粒。混合一般持续1分钟到1小时，或者甚至更长(例如，2-48小时)。颗粒大小可以通过提高混合速度或通过超声处理得以减小。
可以进一步回收和/或纯化生成的磷酸钙纳米微粒。在一些实施方案中，通过离心回收形成的具有包封的大分子的磷酸钙纳米微粒。于3000-1000xg将溶液离心5-15min并将收集的纳米颗粒在真空下干燥。在一些实施方案中，通过过滤回收形成的具有包封的大分子的磷酸钙纳米颗粒。将溶液加入到真空下的过滤装置如buchel漏斗中。可以使用滤膜如20nmAnodisc(Whatman)来回收纳米微粒，将其在真空下进一步干燥。
在存在含有胆汁酸的表面改性剂的情况下形成本发明的颗粒以提高生物学活性物质的包载效率。可以用在本发明中的胆汁酸的实例为胆酸盐、脱氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、甘胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、乌索脱氧胆酸盐、牛磺乌索脱氧胆酸盐和鹅脱氧胆酸盐。胆汁酸的浓度一般为0.01％-5％。一般这种操作将导致颗粒的基本上较高的包被或浸渍效率。例如，在存在表面改性剂的情况下胰岛素的加载效率可以达到100％，而在无表面改性剂时相同条件下只达到50-60％。
优选通过在胆汁酸和赋形剂存在的情况下在与磷酸盐溶液组合和混合之前将钙盐水溶液与待结合的生物活性大分子混合，或在胆汁酸和赋形剂存在的情况下在与钙盐溶液组合和混合之前将磷酸盐水溶液与待结合的生物活性大分子混合来实施对纳米颗粒加载生物活性大分子。待包封的生物活性大分子可以具有大约0.1-20mg/ml的浓度。将所述纳米颗粒维持合适的时间，一般在一分钟和一小时之间。通过离心或过滤可以将纳米颗粒从混悬液中分离出来并随后在真空下进行干燥。
可以，例如，用肠溶衣进一步包被本发明的纳米颗粒。肠溶衣包被方法和材料是本领域公知的和熟悉的。众所周知选择不同肠溶聚合物可以导致胃肠道靶向区域和大分子药物动力学行为的变化。
在一些实施方案中，将包封了生物活性大分子的磷酸钙纳米颗粒悬浮在肠溶性聚合物溶液中。最常用的溶剂是丙酮，乙醇或其组合。例如，纳米颗粒可以是10-100mg/ml浓度的混悬液。包被聚合物和核心纳米颗粒的比率可以是3∶1到0.5∶1之间，或优选是2∶1到1∶1。可以通过轻度的超声处理来分散纳米颗粒并且可以向混合物中加入1-5x体积的石蜡油。在通过涡旋或超声处理彻底混合后，可以加入2-10x体积的氯仿以固化包被聚合物。通过滤纸如Whatman Chr 3MM可以回收经包被的颗粒并用氯仿洗涤。可以将回收的产物进一步在真空下进行干燥并研磨为均一大小。
在一些实施方案中，将磷酸钙纳米颗粒悬浮成具有20-100mg/ml之间浓度的肠溶聚合物溶液，并且包被聚合物与纳米颗粒的比例为2∶1到1∶1之间。将混悬液轻轻地进行超声处理，直接加入到不溶解肠溶聚合物的溶剂中，并且可与溶解肠衣聚合物的溶剂混溶。混合物与分散性溶剂的体积比为1∶10到500∶1。通过过滤到滤纸如Whatman Chr 3MM上来回收颗粒。将颗粒在真空下进行干燥并研磨为均一大小。
可以用其它表面改性剂进一步包被或浸渍本发明的颗粒，或二者。这些适用于本发明的表面改性剂包括促进生物活性大分子结合或包载到颗粒上而不会使所述大分子变性的物质。适合的表面改性剂的实例在美国专利5,460,830，5,462,751，5,460,831，和5,219,577中进行了描述。适合的表面改性剂的其它实例可以包括碱性或经修饰的糖，如纤维二糖，或在美国专利号5,219,577中描述的寡糖。适合的表面改性剂还包括糖，糖衍生物，以及其它糖样组分的大分子，其特征是有大量-OH侧基，就像例如在美国专利号5,460,830中所述的。聚乙二醇(PEG)是特别合适的表面改性剂。
可以通过以大约1ml贮存溶液对大约20ml颗粒混悬液的比例向磷酸钙核心颗粒混悬液中加入表面改性剂，如纤维二糖或PEG(例如，292mM左右)的贮存溶液而制备磷酸钙颗粒的包衣。可以搅拌混合物并让其过夜以形成至少部分包被的核心颗粒。一般，此过程将导致颗粒基本上完全的包被，尽管可能存在一些部分包被或未包被的颗粒。
C.使用磷酸钙纳米颗粒的方法
本发明还提供治疗需要生物活性大分子的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用含有本文所述磷酸钙纳米颗粒的药物组合物。
给药本发明的组合物可以通过本领域已知的任何手段，包括：口服，静脉内，皮下，通过吸入，动脉内，肌内，心内，心室内，肠胃外，鞘内和腹膜内。给药可以是全身性的，例如静脉内给药，或局部性的。
可以将本发明的纳米颗粒和药物组合物施用到需要其的受试者中。“受试者”是哺乳动物，更加优选是人。哺乳动物包括，但不限于，畜牧动物(如牛)，娱乐动物，宠物(如猫、狗、马)，灵长类动物，小鼠和大鼠。
在一些实施方案中，所述药物组合物的磷酸钙纳米颗粒包含肠溶衣。肠溶衣包被的颗粒可以通过口服途径适当地给药。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含包封了胰岛素的肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒。所述药物组合物可以以溶液、胶囊、片剂和粉末的形式口服施用给受试者，用于治疗糖尿病或高血糖症。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含包封了干扰素的肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒。所述药物组合物可以以溶液、胶囊、片剂和粉末的形式口服施用给受试者，用于治疗病毒感染，癌症，和自身免疫疾病。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含包封了促红细胞生成素的肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒。所述药物组合物可以以溶液、胶囊、片剂和粉末的形式口服地施用给受试者，用于治疗贫血或提高红血细胞水平。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含包封了G-CSF的肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒。所述药物组合物可以以溶液、胶囊、片剂或粉末的形式口服地施用给受试者，用于治疗由化疗或其它原因引发的中性白细胞减少症。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含包封了人生长激素的肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒。所述药物组合物可以以溶液、胶囊、片剂或粉末的形式口服地施用给受试者，以治疗需要补充生长激素的病症如矮小，成人生长激素缺陷，消瘦，和严重损伤。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含包封了甲状旁腺激素(PTH)的肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒。所述药物组合物可以以溶液、胶囊、片剂和粉末的形式口服施用给受试者。口服的PTH组合物可以用于治疗骨质疏松症或其它需要PGH给药的疾病。
本发明的颗粒可以用来递送变应原或其它抗原性物质。在一些实施方案中，所述药物组合物包含包封了变应原或抗原的磷酸钙纳米颗粒。可以将所述药物组合物给药于受试者用来诱导受试者体内的免疫反应，提供变应原向受试者的控制性释放，或诱导受试者体内的变应性脱敏作用。可以通过皮下，通过吸入，或穿过黏膜表面施用所述颗粒。可以将所述颗粒作为喷雾剂，气溶胶，软膏剂，滴眼剂，凝胶，混悬液，胶囊，栓剂，浸渍的卫生栓，或其组合进行递送。
可以使用本发明的颗粒递送生物活性大分子到黏膜表面上进行黏膜免疫保护，黏膜疫苗递送，或黏膜药物递送。生物活性大分子的非限制性实例包括一种或多种下列物质：抗原性物质，天然免疫增强因子，编码免疫原性多肽的多核苷酸物质，治疗性药物，如胰岛素，或任何其它当施用到黏膜表面上时能够具有治疗作用的组合物。所述颗粒可以复合以任何生理上可接受的赋形剂并通过黏膜表面进行给药，如通过口服，肺内，鼻，直肠，或眼睛进行给药。
可以使用本发明的颗粒递送生物活性大分子到眼睛表面上用来治疗眼睛疾病。例如，可以将治疗性蛋白质或肽或其它能够具有治疗作用的组分包封到颗粒中并施用到眼睛表面上。可以治疗的眼睛疾病或病症包括，但不限于，青光眼、葡萄膜炎、色素性视网膜炎、黄斑变性、视网膜病、视网膜血管性疾病，以及其它血管性异常、眼内炎、传染性疾病、炎性但是非传染性疾病、眼局部缺血综合征、周围视网膜变性、视网膜变性、脉络膜病症和肿瘤、玻璃体病症，和炎性视神经病变。
下列实施例只是用于例证性目的，并不意欲限制本发明的范围。磷酸钙纳米颗粒可以在如本申请所详述的不同实施方案中进行制备。下列非限制性实施例举例说明了不同实施方案的典型结果。
实施例
实施例1
加载了牛血清白蛋白(BSA)的磷酸钙纳米颗粒的制备
用超声处理制备磷酸钙颗粒
将200毫克聚乙二醇(PEG，MW 10000，Fluka)，23.2mg BSA，1ml125mM Na2HPO4，3ml BBS溶液(包含1.4mM Na2HPO4，10mM KCl，12mM葡萄糖，275mM NaCl，和40mM BES，pH6.964)溶解成20ml水溶液。所述溶液具有0.615的OD280。在搅拌下，加入0.3ml的2.5M CaCl2。
立即观察到沉淀并于室温继续搅拌过夜。将混合物超声处理15min并于8000rpm离心15min。将收集的颗粒在真空下干燥并测量回收物。上清液的OD280为0.084。通过下列等式评估包载效率：
效率(％)＝[1-上清液的OD280/起始溶液的OD280]×100
在本情形中包载效率为86％。
评估自磷酸钙颗粒释放的BSA。将加载了20.6mg BSA的磷酸钙颗粒加入到20ml磷酸盐缓冲溶液(PBS)中。混合后，设置22只微量离心管每只0.8ml等份。将所有等分试样于37℃摇动。在下表1中所示的每个时间点，取三只等分试样的试管并于14000rpm离心10min。移去上清液并测量OD280，数据显示于表1中。在PBS中于4-8小时内自磷酸钙颗粒中的BSA释放基本上完成。
                              表1
                    评估自磷酸钙颗粒释放的BSA
时间(小时) 0.5  1  2  3  4  8  24
平均OD280 0.059  0.089  0.154  0.159  0.183  0.193  0.174
不用超声处理制备加载BSA的磷酸钙纳米颗粒
将200毫克聚乙二醇(PEG，MW 10000，Fluka)，10mg BSA，1ml的125mM Na2HPO4，3ml BBS溶液溶解成20ml水溶液。所述溶液具有0.350的OD280。在搅拌下，加入0.3ml的2.5M CaCl2。
立即观察到沉淀并通过于8000rpm离心15min回收颗粒。将收集的颗粒在真空下干燥。上清液的OD280为0.224，而估计的包载效率为36％。
在脱氧胆酸盐存在时制备加载BSA的磷酸钙纳米颗粒
将200毫克聚乙二醇(PEG，MW 10000，Fluka)，10mg BSA，1ml的125mM Na2HPO4，3ml BBS溶液和40mg脱氧胆酸盐溶解成20ml水溶液。OD280为0.296。在搅拌下，加入0.3ml的2.5M CaCl2。
立即观察到沉淀并通过于8000rpm离心15min回收颗粒。将收集的颗粒在真空下干燥。上清液的OD280为0.084而估计的包载效率为72％。
这两个实施例举例说明脱氧胆酸盐在相同的条件下基本上提高了包封效率。
用过滤制备加载BSA的磷酸钙纳米颗粒
将1克聚乙二醇(PEG，MW 10000，Fluka)，40mg BSA，12mM磷酸钠，pH6.6，和160mg脱氧胆酸钠溶解于20ml水中。在添加前将脱氧胆酸盐溶解入1ml乙醇中。OD280为1.349。在搅拌下，加入20ml 72mMCaCl2。2分钟后，将混合物在真空下过滤到20nm Anodisc膜上。在真空下将膜干燥并回收钙纳米颗粒。滤过物的OD280为0.142而包封效率为82％。
实施例2
加载了促红细胞生成素(EPO)的肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒的制备
于4℃相对于1L水过夜透析EPO样品(1ml，在1.2mg/ml)，最终体积为1.3ml。将400mg PEG(MW 10000，Fluka)，1.3ml EPO，6ml BBS，pH6.964，和2ml的125mM Na2HPO4混合成总共40ml溶液。OD280为0.070。在搅拌下，加入600μl的2.5M CaCl2。立即观察到沉淀并于室温继续搅拌1小时。
于8000g将溶液离心以收集颗粒。测量溶液的OD280为0.033并在真空下干燥所有的颗粒。包载效率被评估为53％。
用醋酞纤维素包被加载了EPO的磷酸钙纳米颗粒。将30mg加载了EPO的磷酸钙纳米颗粒悬浮在0.5ml的在丙酮∶乙醇(95∶5)中的10％醋酞纤维素。加入1.5ml石蜡油并通过涡旋进行混合，随后加入6ml氯仿。用Whatman滤纸(Chr 3mm)回收颗粒并用氯仿进行洗涤。将颗粒在真空下进行干燥并研磨为均一大小。
通过取1mg颗粒包被的磷酸钙纳米颗粒并于室温下重悬于0.5mlPBS 4小时来测量EGO加载。于14000rpm离心后，用商业性ELISA试剂盒(R&D System)测量上清液中的EPO浓度。EPO加载为3600IU/mg。
实施例3
在肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒中的口服促红细胞生成素(EPO)的体内活性
在正常BalB/c小鼠中通过测量血细胞比容评估肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒中的口服EPO的活性。
动物.将九只6-8周龄的雌性Balb/C小鼠笼养在通风室中。无限制供应食物和水。每12小时设置光周期。
处理.将小鼠任意分成三组，每组三只小鼠。赋形剂组一天一次用0.5ml赋形剂溶液(10mM醋酸钠，pH4.0)进行强饲(garvaged)，持续5天。皮下(SC)注射组一天一次用赋形剂中的50IU EPO进行注射，持续5天。口服组一天一次用0.5ml赋形剂溶液中的1000IU EPO进行强饲，持续5天。在第二天，将所有小鼠腹膜内注射10mg右旋糖酐铁。
在第10天，由眼球后穿刺取血液样品并使用肝素处理过的毛细管收集血液样品。将毛细管于3000rpm离心20min并通过全血中红血细胞级分的比例计算血细胞比容(HCT)。结果显示于下表2中。用Excel电子制表软件程序中的内在功能进行双尾和不等方差t-检验。
                  表2
              动物中的HCT值
组 动物数  HCT 与赋形剂相比的p值
赋形剂 3  0.51±0.01
SC 3  0.52±0.02 0.41
口服 3  0.55±0.01 ＜0.05
该数据提示在肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒中的口服递送的EPO是有活性的并且显著提高了HCT值。
实施例4
肠溶衣包被的加载了粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)的磷酸钙纳米颗粒的制备
在接下来的两个实施例中例证脱氧胆酸盐对于包封以及生物学活性的双重作用。
缺少脱氧胆酸盐时制备加载了G-CSF的磷酸钙纳米颗粒
于4℃相对于3L水过夜透析20ml 1.9mg/ml的G-CSF样品，最终G-CSF浓度为1.5mg/ml。将200mg PEG(MW 10000，Fluka)，2.5ml G-CSF，3ml BBS，pH6.964，1ml的125mM Na2HPO4混合并在蒸馏水中调节到20ml。OD280为0.145。在搅拌下，加入300μl的2.5M CaCl2并且立即观察到沉淀。继续搅拌10min并用polytron匀浆器将颗粒匀质化10min并通过于8000g离心10min进行回收。上清液的OD280是0.033而包封效率为77％。在真空下将颗粒干燥。
用肠溶聚合物醋酞纤维素包被加载了G-CSF的磷酸钙纳米颗粒。将17mg颗粒悬浮在400μl的于95∶5丙酮∶乙醇中的10％醋酞纤维素。通过涡旋进行混合后，边搅拌边加入20ml石蜡油并在一分钟后加入7.5ml氯仿。通过过滤到Whatman滤纸(Chr 3mm)上回收经包被的颗粒并用氯仿进行洗涤。将经包被的颗粒在真空下干燥并进行研磨。
在存在脱氧胆酸盐时制备加载了G-CSF的磷酸钙纳米颗粒
将200mg PEG(MW 10000，Fluka)，2.5ml GCSF，65.9mg脱氧胆酸盐，3ml BBS溶液，pH6.964，和1ml的125mM Na2HPO4溶解并调整到20ml。在添加前将脱氧胆酸盐溶解入1ml乙醇中。OD280为0.106。在搅拌下加入300μl的2.5M CaCl2并且立即观察到沉淀。继续搅拌10min，并用polytron匀浆器将颗粒匀质化5min并通过于8000g离心10min进行回收。上清液的OD280是0.008。包封效率为92％。在真空下将颗粒干燥。
用肠溶性聚合物醋酞纤维素涂包被加载了G-CSF的磷酸钙纳米颗粒。将58mg颗粒悬浮在1.2ml的在95∶5丙酮∶乙醇中的5％醋酞纤维素。通过涡旋进行混合后，边搅拌边加入20ml石蜡油并在一分钟后加入7.5ml氯仿。通过过滤到Whatman滤纸(Chr 3mm)上回收经包被的颗粒并用氯仿进行洗涤。将经包被的颗粒在真空下干燥并进行研磨。
所述实施例表明如果在存在脱氧胆酸盐的情况下制备颗粒则包载效率可以得到显著提高。
实施例5
在肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒中的口服G-CSF的体内活性
在正常BalB/c小鼠中通过在处理后计数白血细胞数目来确定口服G-CSF的活性。
动物.将十八只6-8周龄的Balb/C小鼠笼养在通风室中。无限制供应食物和水。每12小时设置光周期。
处理.将小鼠任意分成四组。分别地，赋形剂和SCG组有四只小鼠而CAP和CAPD组有5只小鼠。赋形剂组用0.5ml 10mM NaAc，pH4.0进行处理。SCG用0.1ml赋形剂中100μg/kg G-CSF的皮下注射液进行处理。CAP组以2mg/kg G-CSF，用1ml赋形剂中肠溶衣包被的磷酸钙颗粒里的口服G-CSF进行处理。CAPD是在存在脱氧胆酸盐的情况下制备的在肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒里的口服G-CSF。剂量与CAP组的相同。
每天处理小鼠，持续4天，并在第5天取血液样品以测定总的白血细胞计数。裂解红血细胞并利用显微镜测定总的白血细胞计数。利用Excel电子制表软件程序以t-检验的内在功能分析数据。
                   表3
            总的白血细胞计数的测量
组 动物数目 WBCxE6 PvsV pvs SCG
赋形剂 4 3.36±0.82
SCG 4 5.40±0.76 ＜0.05
CAP 5 5.74±1.24 ＜0.05 0.64
CAPD 5 7.42±0.75 ＜0.01 ＜0.05
该数据提示注射的和口服递送的G-CSF实现了显著较高的白血细胞计数。此外，在存在脱氧胆酸盐的情况下制备的磷酸钙纳米颗粒与不用脱氧胆酸盐的磷酸钙纳米颗粒相比，递送更多的G-CSF活性并获得了更高的白血细胞计数。
实施例6
在肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒中的口服G-CSF的生物等价性
动物.将十只8-10周龄的Sprague-Dawley大鼠笼养在通风室中。无限制供应食物和水。每12小时设置光周期。
处理.将大鼠任意分成三组，其中赋形剂组(V)中两只大鼠而注射(G)和口服G-CSF处理(D)组四只大鼠。处理方案在下表4中列出。V是10mM NaAc的赋形剂，pH4.0。G是皮下注射组。D是在存在脱氧胆酸盐的情况下制备的在肠溶衣包被的磷酸钙颗粒中的口服G-CSF。
          表4
        处理方案
组 途径 体积  剂量
V 口服 1ml
G 皮下 100μl  200μg/kg
D 口服 1ml  2mg/kg
处理大鼠并于预定时间点0，4，8，12，和26小时取血液样品。裂解红血细胞并利用显微镜测定总的白血细胞计数。
图1显示每个时间点上的白血细胞计数。评估曲线下注射的和口服递送的G-CSF的区域并评估口服递送的G-CSF的生物等价性为皮下途径的8.5％。
实施例7
加载肠溶衣包被的干扰素α(IFN)的磷酸钙纳米颗粒的制备
将400mg PEG(MW 10000，Fluka)，1.3ml IFN，6ml BBS溶液，pH6.964，和2ml 125mM Na2HPO4混合于共40ml水溶液中。OD280为0.082。在搅拌下，加入600μl的2.5M CaCl2并且立即观察到沉淀。继续搅拌10min并将颗粒超声处理15min并于8000g离心10min。上清液的OD280为0.033。包封效率为60％。在真空下干燥后，回收35.2mg颗粒。
用肠溶性聚合物醋酞纤维素包被加载了IFN的磷酸钙纳米颗粒。将32mg颗粒悬浮在640μl的95∶5丙酮∶乙醇中的5％醋酞纤维素中。通过涡旋进行混合后，边搅拌边加入20ml石蜡油并在一分钟后加入7.5ml氯仿。通过过滤到Whatman滤纸(Chr 3mm)上回收经包被的颗粒并用氯仿进行洗涤。将经包被的颗粒在真空下干燥并进行研磨。
实施例8
在肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒中的口服IFN的生物有效性
动物.将两只8-10周龄的Sprague-Dawley大鼠笼养在通风室中。无限制供应食物和水。每12小时设置光周期。
处理.通过皮下注射100μl的10mM NaAc，pH4.0中的1.6百万IUIFN来处理一只大鼠。用1ml赋形剂溶液中的16百万IU IFN来强饲另一只大鼠。
在预定时间点第-0.5，0.5，1，2，4，6，8，10，12，16，20，24小时取血液样品。保留血清进行ELISA分析。
图2显示每个时间点上的血清IFN水平。评估曲线下注射的和口服递送的IFN的区域并评估口服递送的IFN的生物有效性为皮下途径的10.2％。
实施例9
肠溶衣包被的加载胰岛素的磷酸钙纳米颗粒的制备
在药房中购买人胰岛素(Eli Lilly)。用Sephadex G-25柱(4.6cm×100cm，1.7L床体积)将180ml胰岛素样品(642mg)交换入蒸馏水中。监测OD280并收集第一个峰。回收总共300ml的样品并且OD280为2.022。
将5g PEG(MW 10000，Fluka)，600mg胰岛素，1.6g脱氧胆酸盐，40ml BBS溶液，pH6.964，19.2ml的125mM Na2HPO4混合并用蒸馏水调整到400ml。在添加前将脱氧胆酸盐溶解入10ml乙醇中。OD280为1.868。在搅拌下，混合400ml的36mM CaCl2并立即将形成的颗粒过滤到20nm Anodisc膜上。滤过物的OD280为0.022而包封效率为98.2％。在真空下干燥颗粒并且回收的颗粒的总量为1.8g。
用相同方法制备空白纳米颗粒，除了省略了蛋白质成分。加载胰岛素的磷酸钙纳米颗粒和空白磷酸钙纳米颗粒都由Material Testing Labs进行电子扫描显微镜(SEM)检查。SEM的图像示于图3A和3B中。空白磷酸钙纳米颗粒呈现球形，单分散的和中空的形态学，平均直径200nm(图3A)。相反，加载胰岛素的磷酸钙纳米颗粒显示球形的和单分散的形态学，平均直径大约70nm(图3B)。
为了进行肠溶衣包被，将0.5g加载胰岛素的磷酸钙纳米颗粒悬浮在5ml包含0.5g醋酞纤维素的丙酮∶乙醇(95∶5)中。混合后加入15ml石蜡油并进行混合，随后加入50ml氯仿。通过过滤到Whatman滤纸(Chr 3mm)上收集颗粒并用氯仿进行洗涤。在真空下干燥颗粒并研磨成均一大小。通过持续3小时在室温下取从1ml PBS里1mg颗粒中释放的胰岛素来测量胰岛素含量。使用用胰岛素作为标准的Lowry蛋白质测定来测定释放介质中胰岛素的浓度。
实施例10
肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒中口服胰岛素的生物等价性
动物模型.将35只8-10周龄的Sprague-Dawley大鼠笼养在通风室中。无限制供应食物和水。每12小时设置光周期。
将大鼠腹膜内注射在20mM柠檬酸盐缓冲液，pH4.5中的60mg/kg链佐星。在链佐星之后8小时腹膜内给予1ml 5％的葡萄糖。两周后，测量禁食血糖水平。在随后用于测试的24只大鼠中，禁食血糖＞300mg/Dl。
处理.将十六只大鼠任意分成三组。胰岛素溶液(OI-50，″对照″)和胰岛素注射(SCI-5，″注射″)组分别有4只糖尿病大鼠。治疗组(PO-50，″口服″)具有8只大鼠。将对照组口服给予0.5ml赋形剂溶液中的50IU胰岛素/kg。注射组接受0.5ml赋形剂中的5IU胰岛素/kg的皮下注射。口服组口服给予0.5ml赋形剂溶液中的在肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒里配制的50IU胰岛素/kg。赋形剂溶液是在10mM乙酸中的2％羧甲基纤维素，pH4.0。
                  表5
             胰岛素治疗方案
组 途径 动物数目  体积  剂量
OI-50(对照) 口服 4  0.5ml  50IU/kg
SCI-5(注射) 皮下 4  0.5ml  5IU/kg
PO-50(Oral) 口服 8  0.5ml  50IU/kg
在禁食过夜后，处理大鼠并在0，1，3，6，12，和24小时的时间点上通过尾部取血样。用血糖测计仪(SureStep)测量血糖。
图4显示在糖尿病大鼠中以口服或皮下注射胰岛素处理后在每个时间点上的百分比血糖变化。皮下注射胰岛素迅速降低血糖水平并在12小时内恢复正常。以磷酸钙颗粒递送的口服胰岛素显示更加逐步和延长的血糖降低效应。与皮下注射胰岛素相比，口服胰岛素的生物等价性为12％。
实施例11
口服肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒中的胰岛素降低健康志愿者体内的血糖
为了评估口服胰岛素在肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒中的活性，对两位健康人志愿者进行测试。进行标准的葡糖耐量试验。每位志愿者禁食超过12小时并摄取68g葡萄糖。在关于摄取葡萄糖的-30，0，30，60，90，120，150，和180分钟，用SureStep血糖测计仪测量血糖。对每位志愿者进行两个周期的测量。第一个周期是标准的葡糖耐量试验以确立基线。在第二个测量周期中，每位志愿者于-30min摄取200U在肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒中的口服胰岛素。
第一位志愿者体内的血糖变化显示于图5A中。通过肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒递送的口服胰岛素降低了最高和最低血糖水平。
第二位志愿者体内的百分比血糖变化显示于图5B中。通过肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒递送的口服胰岛素降低了最高血糖水平并在整个测量期中降低血糖曲线。
本研究显示在肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒中的口服胰岛素在人受试者中是具有活性的并且可以降低血糖。在测量过程中没有记录到有害反应。
实施例12
通过在肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒中的口服胰岛素控制糖尿病患者的禁食血糖
在胰岛素患者中进一步评估在肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒中的口服胰岛素的可行性。十九位规律进行胰岛素治疗以控制其血糖水平的II型糖尿病患者志愿进行该研究。对每位患者进行三个周期的评估。
在第一周期，将每位患者者禁食超过12小时。第二天早晨每30min测量血糖水平。用SureStep血糖测计仪测定血糖水平。在这一周期中不进行任何处理以确立基线。
在第二个周期中，将每位患者者禁食超过12小时。第二天早晨每30min测量血糖水平。用SureStep血糖测计仪测定血糖水平。在本周期中在0时间对每位患者给予10IU人胰岛素的皮下注射
在第三个周期中，将每位患者禁食超过12小时。第二天早晨每30min测量血糖水平。用SureStep血糖测计仪测定血糖水平。在本周期中从0时间给予每位患者100IU或200IU的在肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒中的口服胰岛素。
对于每位患者的测量顺序是任意的并且在口服胰岛素测量之后下一周期之前有48小时的洗涤期。在研究后，对于基线测量有17个可用的患者数据，对于胰岛素注射有19个患者数据，对于100IU口服胰岛素处理有6个患者数据，而对于200IU口服胰岛素处理有11个患者数据。
每个测量周期的百分比血糖变化显示于图6中。在观察期间，不进行处理，血糖水平得以提高并保持相对稳定。胰岛素注射产生血糖的剧烈降低。事实上，7位患者发展成血糖过低并且他们的血糖水平下降到低于50mg/dL，不得不用口服葡萄糖进行治疗。相反地，与基线相比，摄取了100IU或200IU口服胰岛素的患者显示逐步的却是统计学上显著的血糖水平降低，并且没有观察到血糖过低。此外，用200IU口服胰岛素处理的患者显示较大的血糖降低。
本研究显示在肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒中的口服胰岛素能够有效地和剂量依赖型地控制糖尿病患者体内的血糖水平。
实施例13
肠溶衣包被的加载了人生长激素(hGH)的磷酸钙纳米颗粒的制备
用Sephadex G25脱盐柱将hGH样品交换到蒸馏水中。以OD280测量计算hGH的量，光学系数为0.68。将200mg PEG(MW 10000，Fluka)，84mg hGH，12mM磷酸盐，和320mg脱氧胆酸盐溶入40ml溶液。OD280测定为1.307。在搅拌下，混合40ml的72mM CaCl2并将沉淀立即过滤到20nm Anodisc膜(Whatman)上。滤过物的OD280为0.039。将颗粒在真空下干燥，在颗粒形成之前和之后基于OD280测量，包载效率为95％。
为了进行肠溶衣包被，将300mg加载了hGH的磷酸钙纳米颗粒悬浮入4ml的在95∶5丙酮∶乙醇中的10％醋酞纤维素。混合后，加入6ml石蜡油并混合，随后加入18ml氯仿。将颗粒过滤到Whatman滤纸(Chr3mm)上并用氯仿进行洗涤。将颗粒在真空下干燥并研磨成均一大小。
通过加入1mg颗粒到1ml PBS中并于室温温育3小时来测量hGH含量。使用用hGH作为标准的Lowry蛋白质测定来测定释放介质中的hGH浓度。
实施例14
在肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒中的口服人生长激素对体重增加的促进
在摘除垂体的大鼠中测试在肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒中的口服hGH的活性，这是生长激素活性的一种标准测定法。
动物模型.将进行过垂体摘除外科手术的二十只6周龄Sprague-Dawley大鼠笼养在通风室中。无限制供应食物和水。每12小时设置光周期。每天监测每只大鼠的体重。
处理.将二十只大鼠任意分成三组。在赋形剂和注射组中分别有四只大鼠。处理组有12只大鼠。用石蜡油处理赋形剂组。每天早上处理大鼠并于每晚测量体重。
                        表5
                    hGH处理方案
    组     途径   动物数目     体积  剂量
    V     口服   4     0.5ml
    SC20     皮下   4     0.5ml  20μg/大鼠/天
    PO50     口服   12     0.5ml  50μg/大鼠/天
图7显示在摘除垂体的大鼠中，用口服或皮下hGH处理后的净体重增长。皮下hGH导致基本上的净体重增长而赋形剂处理产生体重的轻微下降。用肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒递送的口服hGH产生了明显的体重，提示在肠溶衣包被的磷酸钙纳米颗粒中的口服hGH是具有生物学活性的。
实施例15
加载了甲状旁腺激素(PTH)的磷酸钙纳米颗粒的制备
用Sephadex G25脱盐柱将甲状旁腺激素1-34(PTH)交换入蒸馏水中。将400mg PEG(MW 10000，Fluka)，6ml BBS溶液，pH6.964，和2ml125mM的Na2HPO4混合入40ml溶液。OD280测定为0.082。在搅拌下，加入600μl的2.5M CaCl2。立即观察到沉淀并将颗粒于8000g离心10min。上清液的OD280为0.033。在真空下将颗粒干燥。在颗粒形成之前和之后基于OD280测量将包载效率评估为59％。
实施例16
加载了BCG的多糖和核酸提取物的磷酸钙纳米颗粒的制备
卡介苗(BCG-PSN)的多糖和核酸提取物具有免疫调节活性。BCG-PSN包含多糖和核酸并用于证明磷酸钙纳米颗粒在这类化合物中的用途。
BCG-PSN以粉末状形式的获自Chengdu Rongsheng Pharmaceutical Ltd.(成都，中国)。将1mg BCG-PSN，50mg PEG(Fluka，MW 10000)，0.25mlBBS，pH6.964，和0.75ml 125mM Na2HPO4混合于20ml溶液中。OD260为0.22并通过蒽酮法测量多糖含量。
在搅拌下，加入75μl的5M CaCl2并于室温下持续搅拌1小时。将颗粒于8000g离心10min。上清液的OD260为0.0而多糖浓度为22.1μg/ml。对于核酸组分的包封效率为100％而对于多糖组分为大约63％。将颗粒在真空下干燥。
以上实施例仅仅是为了说明性的目的而包括进来，并非意欲限制本发明的范围。对于上述内容的许多变化都是可能的。由于对上述实施例的改进和变化对于本领域技术人员是显而易见的，所以本发明只受后附权利要求的范围限定。
参考文献
美国专利号3,925,545；4016252；4350686；4500512；4552756；5178882；5219577；5306508；5334394；5364838；5460830；5460831；5462750；5462751；5464634；5506203；5549973；5580859；5593875；5595762；5620896；5629021；5641515；5648097；5695617；5747001；5785975；5827822；5866553；5891420；5898028；5902789.FR专利号7212036；7924948.GB专利号1422973.PCT WO 90/11092；WO 93/17706；WO 93/24640；WO 98/35562；WO 00/15194；WO 00/46147.
Academic Press Dictionary of Science and Technology.http://www.harcourt.com/dictionary/def/2/2/3/1/2231200.html，Nov.2000.*
Abstracts of Papers Presented at the 1992 meeting on Modern Approachesto New Vaccines，Including Prevention of AIDS，Cold Spring Harbor)，Vaccine 11：92(1993).
Aldovini and R.A.Young，″Humoral and cell-mediated immuneresponses to live recombinant BCG-HIV vaccines，″Nature 351：479-482(1991).
Ascadi等，″Human dystrophin expression in mdx mice afterintramuscular injection of DNA constructs，″Nature 352：815-818(1991).
Bartus等，″Sustained Delivery of Proteins for新的TherapeuticProducts，″Science，281(5380)：1161-1162(1998).
Bastin，等，″Use of Synthetic Peptides of Influenza Nucleoprotein toDefine Epitopes Recognized by Class I-Restricted Cytotoxic T Lymphocytes，″J.Exp.Med.，165(4)：1508-1523(1987).
Benvenisty，N.，和Reshef，L.PNAS 83，9551-9555，(1986).
Bennink和J.W.Yewdell，″Recombinant Vaccinia Viruses as Vectors forStudying T Lymphocyte Specificity and Function，″Curr.Top.Microbiol.Immunol.，163：153-184(1990).
Carbone和Bevan，″Induction of Ovalbumin-specific cytotoxic T cells byin vivo peptide immunization，″J.Exp.Med.，169(1)：603-612(1989).
Collins等，″Processing of exogenous liposome-encapsulated antigens invivo generates class I MCH-restricted T cell responses，″J.Immunol.，148(11)：3336-3341(1992).
Cooney等，″Safety of and immunological response to a recombinantvaccinia virus vaccine expressing HIV envelope glycoprotein，″Lancet，337：567-572(1991).
Cox等，″Bovine Heepesvirus 1：Immune Responses in Mice and CattleInjected with Plasmid DNA，″1993，J.Virol.，67(9)：5664-5667.
Deres，等，″In vivo priming of virus-specfic cytotoxic T lymphocytes withsynthetic lipoprotein vaccine，″Nature，342：561-564(1989).
Donnelly等，″DNA Vaccines，″Annu.Rev.Immunol.，15：617-648(1997).
Edgington，″Turning On Tumor-Fighting T-Cells，″Biotechnology，11：1117-1119(1993).
Edwards等，Science，276：1868(1997).
Friedman，T.，″Progress toward human gene therapy，″Science，244，1275-1281(1989).
Furth等，″Gene Transfer into Somatic Tissues by Jet Injection，″Analytical Biochemistry，205(2)：365-368，(1992).
Gardner等，″Cell-mediated cytotoxicity against ectromelia virus-infectedtarget cells，″Eur.J.Immunol.，4：68-72(1974).
Goto等，″Local tissue irritating effects and adjuvant activities of calciumphosphate and aluminum hydroxide with different physical properties，″Vaccine，15(12/13)：1364-1371(1997).
Hahn等，″Infectious Sindbis virus transient expression vectors forstudying antigen processing and presentation，″Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)89：2679-2683(1992).
Hansen等，FEBS Lett.290，73(1991).
Jiao等，Hum.Gene Therapy 3，21(1992)*.
Kato等，″Relationship between Hemolytic Activity and AdsorptionCapacity of Aluminum Hydroxide and Calcium Phosphate as ImmunologicalAdjuvants for Biologicals，″Microbiol.Immunol.，38(7)：543-548(1994).
Kitsis等，″Hormonal modulation of a gene injected into rat heart in vivo，″Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)88：4138-4142(1991).
Lin等，″Expression of Recombinant Genes in Myocardium In Vivo afterDirect Injection of DNA，″Circulation 82(6)：2217-2221(1990).
Lin和Askonas，″Biological properties of an influenza A virus-specifickiller T cell clone，″J.Exp.Med.154(1)：225-234(1981).
Maniatis，等，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1.0-19.0(1989).
Mascola等，″Surveillance of Listeriosis in Los Angeles County，1985-1986，″Arch.Intem.Med.，149(7)：1569-1572(1989).
McMichael等，″Cytotoxic T-Cell Immunity to Influenza，″New Engl.J.Med.，309(1)：13-17(1983).
McMichael等，″Recognition of Influenza A virus Nucleoprotein byhuman cytotoxic T lymphocytes，″J.Gen.Virol.，67：719-726(1986).
Miller，″Retroviral Vectors，″Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，3-24(1992).
Montgomery，D.L.等，1993，Cell Biol.，12，pp.777-783.*.
Redfield等，″Disseminated Vaccinia in a Military Recruit with HumanImmunodeficiency Virus(HIV)Disease，″New Engl.J.Med.，316(11)：673-676(1987).
Robinson等，″Protection against a lethal influenza virus challenge byimmunization with a haemagglutinin-expressing plasmid DNA，″Vaccine 11(9)：957-960(1993).
Sato等，″Immunostimulatory DNA Sequences Necessary for EffectiveIntradermal Gene Immunization，″Science 273：352-354(1996).
Schafer等，″Induction of a cellular immune response to a foreign antigenby a recombinant Listeria monocytogenes vaccine，″J.Immunol.，149(1)：53-59(1992).
Service，Science 277：5330(1997).
Stover等，″New use of BCG for recombinant vaccines，″Nature 351：456-460(1991).
Takahashi等，″Induction of CD8 cytotoxic T cells by immunization withpurified HIV-1 envelope protein in ISCOMs，″Nature，344：873-875(1990).
Tang等，″Genetic immunization is a simple method for eliciting animmune response，″Nature，356：152-154(1992).
Taylor和Askonas，″Influenza nueleoprotein-specific cytotoxic T-cellclones are protective in vivo，″Immunol.，58(1)：417-420(1986).
Townsend，″Antigen recognition by class I-restricted T lymphocytes，″Annu.Rev.Immunol.，7：601-624(1989).
Townsend等，″The Epitopes of Infulenza Nucleoprotein Recognized byCytotoxic T Lymphocytes Can Be Defined with Short Synthetic Peptides，″Cell 44：959-968(1986).
Ulmer，J.B.等，″Heterologous Protection Against Influenza by Injectionof DNA Encoding a Viral Protein，″Science，259：1745-1749(1993).
Wang等，″Gene inoculation generates immune responses against humanimmunodeficiency virus type I，″P.N.A.S.USA 90：4156-4160(May，1993).
Wang，等，″Enhanced type I immune response to a hepatitis B DNAvaccine by formulation with calcium-or aluminum phosphate，″Vaccine，18：1227-1235(2000).
Weiner等，″Immunostimulatory oligodeoxynucleotides containing theCpG motif are effective as immune adjuvants in tumor antigen immunization，″PNAS(USA)94(19)：10833-10837(1997).
Wolff等，″Long-term persistence of plasmid DNA and foreign geneexpression in mouse muscle，″Human Mol.Genet.1(6)：363-369(1992).
Wolff等，″Direct Gene Transfer into Mouse Muscle in Vivo，″Science247：1465-1468(1990).
Yap and Ada，″Transfer of specific cytotoxic T lymphocytes protects miceinoculated with influenza virus，″Nature，273：238-239(1978).
Yewdell等，″Influenza A virus nucleoprotein is a major target antigen forcross-reactive anti-influenza A virus cytotoxic T lymphocytes，″Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82：1785-1789(1985).
Zhu等，″Systemic Gene Expression After Intravenous DNA Delivery intoAdult Mice，″Science 261：209-211(1993).

Claims (21)

1.一种颗粒，其包括：
a)磷酸钙纳米颗粒的核心；
b)被包封在所述核心颗粒中的生物活性大分子；和
c)被包封在所述核心颗粒中的包含胆汁酸的表面改性剂。
2.权利要求1的颗粒，其中所述核心颗粒的直径少于约300nm。
3.权利要求1的颗粒，其中所述胆汁酸选自由下列各项组成的组中：胆酸盐、脱氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、甘胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、乌索脱氧胆酸盐、牛磺乌索脱氧胆酸盐(tauroursodeoxycholate)，和鹅脱氧胆酸盐。
4.权利要求1的颗粒，其中所述颗粒还包括肠溶衣。
5.权利要求1的颗粒，其中所述生物活性大分子选自由下列各项组成的组：蛋白质、多肽、多糖、核酸、多核苷酸、脂质和糖。
6.权利要求5的颗粒，其中所述蛋白质或多肽选自由下列各项组成的组：胰岛素、促红细胞生成素、干扰素、生长激素和粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)。
7.权利要求4的颗粒，其中生物活性大分子选自由下列各项组成的组：胰岛素、促红细胞生成素、干扰素、生长激素和G-CSF。
8.权利要求1的颗粒，其中所述生物活性大分子是变应原，所述变应原选自由下列各项组成的组：房尘螨(house dust mice)、动物皮屑，霉菌，花粉，豚草，胶乳，黄蜂毒液和昆虫源的变应原，及其任意组合。
9.权利要求1的颗粒，其中所述颗粒适合以气溶胶的形式存在。
10.权利要求1的颗粒，其中所述颗粒适合于将生物活性大分子递送到黏膜表面。
11.权利要求1的颗粒，其中所述颗粒适合于将生物活性大分子递送到需要其的受试者的眼睛表面以治疗眼睛疾病。
12.一种药物组合物，其包括权利要求1的颗粒和药用载体。
13.一种药物组合物，其包括权利要求4的颗粒和药用载体。
14.一种药物组合物，其包括权利要求7的颗粒和药用载体。
15.一种制备一种或多种磷酸钙颗粒的方法，所述方法包括：
a)在存在包含胆汁酸的表面改性剂的情况下，使钙盐的水溶液与磷酸盐的水溶液接触；
b)混和溶液直到获得理想大小的磷酸钙颗粒；和
c)回收所述颗粒。
16.权利要求15的方法，其中所述钙盐的浓度介于约5mM和约200mM之间。
17.权利要求15的方法，其中所述磷酸盐的浓度介于约5mM和约200mM之间。
18.权利要求15的方法，其中所述颗粒具有少于300nm的直径。
19.权利要求15的方法，其还包括在存在包含胆汁酸的表面改性剂的情况下，使所述钙盐水溶液与所述磷酸盐水溶液接触之前，将生物活性大分子添加到所述磷酸盐的水溶液或所述钙盐的水溶液中，由此使得所述磷酸钙颗粒与所述大分子共结晶。
20.权利要求14的方法，其中所述胆汁酸选自由下列各项组成的组：胆酸盐、脱氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、甘胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、乌索脱氧胆酸盐、牛磺乌索脱氧胆酸盐(tauroursodeoxycholate)，或鹅脱氧胆酸盐。
21.一种治疗需要生物活性大分子的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用权利要求1的药物组合物。
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CA (1) CA2555921A1 (zh)
DE (1) DE602005021756D1 (zh)
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MX (1) MXPA06009222A (zh)
RU (1) RU2006132735A (zh)
WO (1) WO2005084637A2 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106794150A (zh) * 2014-05-30 2017-05-31 艾伯维德国有限责任两合公司 高药物负载的聚(2‑氰基丙烯酸烷基酯)纳米胶囊
CN108351687A (zh) * 2015-09-04 2018-07-31 耶鲁大学 靶向胰腺和结肠的聚合胆汁酸纳米组合物
CN111349158A (zh) * 2020-03-06 2020-06-30 西北农林科技大学 一种奶山羊性控精液制备方法
CN118370728A (zh) * 2024-06-24 2024-07-23 山东则正医药技术有限公司 一种glp-1ra载药纳米颗粒和制剂及其制备方法

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050266067A1 (en) * 2004-03-02 2005-12-01 Shiladitya Sengupta Nanocell drug delivery system
CN104758253A (zh) 2006-01-24 2015-07-08 安迅生物制药公司 大分子微球的制备技术
US20080241256A1 (en) * 2007-03-30 2008-10-02 Liisa Kuhn Targeted active agent delivery system based on calcium phosphate nanoparticles
CN101361968B (zh) 2007-08-06 2011-08-03 健能隆医药技术（上海）有限公司 白介素-22在治疗脂肪肝中的应用
WO2009038591A1 (en) * 2007-09-17 2009-03-26 Yale University Bile salt colloids and methods of making and using thereof
US20100283570A1 (en) * 2007-11-14 2010-11-11 Lavoie Adrien R Nano-encapsulated magnetic particle composite layers for integrated silicon voltage regulators
WO2009135190A2 (en) * 2008-05-01 2009-11-05 Nod Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic calcium phosphate particles and methods of making and using same
MY162982A (en) 2008-09-23 2017-07-31 Laboratory Skin Care Inc Active agent loaded uniform, rigid, spherical, nanoporous calcium phosphate particles and methods of making and using the same
US9901551B2 (en) * 2009-04-20 2018-02-27 Ambra Bioscience Llc Chemosensory receptor ligand-based therapies
US20100285611A1 (en) * 2009-05-06 2010-11-11 Ostafin Agnes E Photobleaching resistant ph sensitive dye nanoreactors with dual wavelength emission
TWI556839B (zh) * 2009-05-06 2016-11-11 研究室護膚股份有限公司 包含活性劑－磷酸鈣粒子複合物之皮膚遞送組成物及其使用方法
WO2013025951A1 (en) * 2011-08-16 2013-02-21 Laboratoy Skin Care, Inc. Fine dry particulate adenosine compositions and topical formulations including the same
GB0909183D0 (en) * 2009-05-28 2009-07-08 Bedi Kathryn J Coating method
US9937128B2 (en) 2009-08-03 2018-04-10 The University Of North Carolina At Chapel Hill Liposomes comprising a calcium phosphate-containing precipitate
US9095510B2 (en) 2009-11-10 2015-08-04 Laboratory Skin Care, Inc. Sunscreen compositions comprising uniform, rigid, spherical, nanoporous calcium phosphate particles and methods of making and using the same
US20110142889A1 (en) * 2009-12-16 2011-06-16 Nod Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for oral drug delivery
AU2010339907A1 (en) 2009-12-16 2012-07-05 Nod Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for oral drug delivery
AU2011317140A1 (en) 2010-10-19 2013-05-30 Elcelyx Therapeutics, Inc. Chemosensory receptor ligand-based therapies
SG192028A1 (en) 2011-01-19 2013-08-30 Lab Skin Care Inc Topical minocycline compositions and methods of using the same
CO6540157A1 (es) 2011-04-15 2012-10-16 Univ Antioquia Proceso continuo para la elaboracion de nanoparticulas y nanoparticulas obtenidas mediante dicho proceso
WO2013038195A2 (en) * 2011-09-13 2013-03-21 Altacor Limited Pharmaceutical nanoparticle compositions
CN102580109B (zh) * 2012-03-02 2013-11-06 河南师范大学 一种抗癌药物载体及其制备方法
US20140099380A1 (en) 2012-06-28 2014-04-10 Ansun Biopharma, Inc. Microparticle Formulations for Delivery to the Lower and Central Respiratory Tract and Methods of Manufacture
WO2014064710A1 (en) 2012-10-22 2014-05-01 Department Of Biotechnology A process for the prepartion of non-viral vector for delivery of nucleic acids by mucosal route
ES2873600T3 (es) 2013-02-05 2021-11-03 1Globe Health Inst Llc Nanopartículas biodegradables y clínicamente compatibles como vehículos de suministro de fármacos.
CN112675157A (zh) 2013-03-15 2021-04-20 实验室护肤股份有限公司 细干颗粒白藜芦醇活性剂组合物和包括其的局部制剂
CN104623637A (zh) 2013-11-07 2015-05-20 健能隆医药技术（上海）有限公司 Il-22二聚体在制备静脉注射药物中的应用
US10350169B2 (en) 2014-10-31 2019-07-16 University Of Utah Research Foundation Compositions and methods for bile acid particles
US10029031B2 (en) * 2015-10-28 2018-07-24 Warsaw Orthopedic, Inc. Bone void filler having sustained therapeutic agent release
WO2017181143A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Generon (Shanghai) Corporation, Ltd. Use of il-22 in treating necrotizing enterocolitis
US11110064B2 (en) * 2018-12-16 2021-09-07 SRM Institute of Science and Technology Gel formulation for treating diabetic foot ulcer infections

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2181426B1 (zh) 1972-04-06 1974-12-20 Pasteur Institut
US4016252A (en) 1972-04-06 1977-04-05 Institut Pasteur Calcium phosphate gel for adsorbing vaccines
FR2466991A1 (fr) 1979-10-08 1981-04-17 Pasteur Institut Perfectionnement a la preparation d'allergene
FR2505657A1 (fr) 1981-05-13 1982-11-19 Pasteur Institut Perfectionnements apportes aux agents de stabilisation de virus vivants pour la preparation de vaccins, et vaccins stabilises contenant lesdits agents de stabilisation
CA1291036C (en) 1986-04-23 1991-10-22 Edwin I. Stoltz Nasal administration of drugs
DE69034078T2 (de) 1989-03-21 2004-04-01 Vical, Inc., San Diego Expression von exogenen Polynukleotidsequenzen in Wirbeltieren
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5460831A (en) 1990-06-22 1995-10-24 The Regents Of The University Of California Targeted transfection nanoparticles
US5464634A (en) 1990-06-22 1995-11-07 The Regents Of The University Of California Red blood cell surrogate
US5306508A (en) 1990-06-22 1994-04-26 The Regents Of The University Of California Red blood cell surrogate
US5334394A (en) 1990-06-22 1994-08-02 The Regents Of The University Of California Human immunodeficiency virus decoy
US5462751A (en) 1990-06-22 1995-10-31 The Regeants Of The University Of California Biological and pharmaceutical agents having a nanomeric biodegradable core
US5178882A (en) 1990-06-22 1993-01-12 The Regents Of The University Of California Viral decoy vaccine
US5219577A (en) 1990-06-22 1993-06-15 The Regents Of The University Of California Biologically active composition having a nanocrystalline core
US5460830A (en) 1990-06-22 1995-10-24 The Regents Of The University Of California Biochemically active agents for chemical catalysis and cell receptor activation
JPH05238950A (ja) * 1991-04-22 1993-09-17 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd 易吸収性ｖｉｐ製剤
PT584348E (pt) 1992-03-11 2005-10-31 Powderject Vaccines Inc Vacina genetica para virus da imunodeficiencia
US5620896A (en) 1992-03-23 1997-04-15 University Of Massachusetts Medical Center DNA vaccines against rotavirus infections
EP0646178A1 (en) 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
US5273965A (en) * 1992-07-02 1993-12-28 Cambridge Biotech Corporation Methods for enhancing drug delivery with modified saponins
FR2698560B1 (fr) 1992-11-30 1995-02-03 Virbac Laboratoires Principes actifs pulvérulents stabilisés, compositions les contenant, leur procédé d'obtention et leurs applications.
US5364838A (en) 1993-01-29 1994-11-15 Miris Medical Corporation Method of administration of insulin
US5456986A (en) 1993-06-30 1995-10-10 Carnegie Mellon University Magnetic metal or metal carbide nanoparticles and a process for forming same
US5506203C1 (en) 1993-06-24 2001-02-06 Astra Ab Systemic administration of a therapeutic preparation
IL113817A (en) 1994-06-30 2001-03-19 Merck & Co Inc Polynucleotide for vaccination against the umbilical cord virus
US5484720A (en) 1994-09-08 1996-01-16 Genentech, Inc. Methods for calcium phosphate transfection
US5629021A (en) 1995-01-31 1997-05-13 Novavax, Inc. Micellar nanoparticles
US5747001A (en) 1995-02-24 1998-05-05 Nanosystems, L.L.C. Aerosols containing beclomethazone nanoparticle dispersions
IE80468B1 (en) 1995-04-04 1998-07-29 Elan Corp Plc Controlled release biodegradable nanoparticles containing insulin
US8333996B2 (en) 1995-05-19 2012-12-18 Etex Corporation Calcium phosphate delivery vehicle and adjuvant
US5785975A (en) 1995-06-26 1998-07-28 Research Triangle Pharmaceuticals Adjuvant compositions and vaccine formulations comprising same
US5827822A (en) 1996-03-25 1998-10-27 Sangstat Medical Corporation Cyclosporin a formulations as nanoparticles
US5648097A (en) 1995-10-04 1997-07-15 Biotek, Inc. Calcium mineral-based microparticles and method for the production thereof
US5695617A (en) 1995-11-22 1997-12-09 Dow Corning Corporation Silicon nanoparticles
ATE284613T1 (de) 1997-02-14 2005-01-15 Merck & Co Inc Polynukleotid-impfstoff-formulierungen
US5898028A (en) 1997-03-20 1999-04-27 Novo Nordisk A/S Method for producing powder formulation comprising an insulin
US5891420A (en) 1997-04-21 1999-04-06 Aeropharm Technology Limited Environmentally safe triancinolone acetonide aerosol formulations for oral inhalation
US6355270B1 (en) * 1999-01-11 2002-03-12 The Regents Of The University Of California Particles for oral delivery of peptides and proteins
NZ506975A (en) * 1999-01-18 2004-01-30 Lg Chemical Ltd Lipophilic microparticles containing a protein drug or antigen and formulation comprising same
US20020054914A1 (en) 1999-02-03 2002-05-09 Tulin Morcol Compositions and methods for therapuetic agents complexed with calcium phosphate and encased by casein
US20020068090A1 (en) 1999-02-03 2002-06-06 Bell Steve J. D. Calcium phosphate particles as mucosal adjuvants
US20040258763A1 (en) 1999-02-03 2004-12-23 Bell Steve J.D. Methods of manufacture and use of calcium phosphate particles containing allergens
CA2361421A1 (en) 1999-02-03 2000-08-10 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic calcium phosphate particles and methods of manufacture and use
US6183803B1 (en) 1999-06-11 2001-02-06 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Method for processing milk
DE10114178A1 (de) * 2001-03-23 2002-10-10 Aventis Pharma Gmbh Zinkfreie und zinkarme Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität
US20030185892A1 (en) 2001-08-17 2003-10-02 Bell Steve J. D. Intraocular delivery compositions and methods

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106794150A (zh) * 2014-05-30 2017-05-31 艾伯维德国有限责任两合公司 高药物负载的聚(2‑氰基丙烯酸烷基酯)纳米胶囊
CN106794150B (zh) * 2014-05-30 2021-12-28 艾伯维德国有限责任两合公司 高药物负载的聚(2-氰基丙烯酸烷基酯)纳米胶囊
CN108351687A (zh) * 2015-09-04 2018-07-31 耶鲁大学 靶向胰腺和结肠的聚合胆汁酸纳米组合物
CN111349158A (zh) * 2020-03-06 2020-06-30 西北农林科技大学 一种奶山羊性控精液制备方法
CN111349158B (zh) * 2020-03-06 2022-11-08 西北农林科技大学 一种奶山羊性控精液制备方法
CN118370728A (zh) * 2024-06-24 2024-07-23 山东则正医药技术有限公司 一种glp-1ra载药纳米颗粒和制剂及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1720520A2 (en) 2006-11-15
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CN1993113B (zh) 2010-12-08
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ATE470433T1 (de) 2010-06-15
KR20070002014A (ko) 2007-01-04
EP1720520B1 (en) 2010-06-09
RU2006132735A (ru) 2008-03-20

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