CN1582934A - 喜树碱衍生物的纳米微粒、制备方法及其药物用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种喜树碱衍生物的纳米微粒、其制备方法及其在制备治疗肿瘤药物方面的用途。该纳米微粒是由聚乙二醇－聚γ－苄基谷氨酸嵌断共聚物与喜树碱衍生物形成的核－壳型结构，而且呈球形或者椭球形的形态；该核－壳型结构的中心区域为疏水性内核，外层区域为亲水性外壳。它有效地解决了喜树碱衍生物的水溶性问题，又避免了单核噬细胞系统(MPS)的识别与吞噬，使喜树碱衍生物对肿瘤细胞具有了靶向作用。

Description

喜树碱衍生物的纳米微粒、制备方法及其药物用途

技术领域

本发明涉及一种喜树碱衍生物的纳米微粒、制备方法及其药物用途，更具体地讲，本发明涉及一种喜树碱衍生物与聚乙二醇-聚γ-苄基谷氨酸嵌段共聚物形成的纳米微粒、制备方法及其在制备治疗肿瘤药物方面的用途。

背景技术

喜树碱(CPT)是从我国特有的珙桐科植物喜树的树干、树皮和果实中提取的一种具有抗肿瘤作用的生物碱。这种生物碱是一种细胞周期特异性药物，主要作用于DNA拓扑异构酶I(TopoI)，CPT与TopoI、DNA形成复合物后，使断裂的DNA堆积，最终导致细胞死亡。

喜树碱衍生物有10-羟基喜树碱(HCPT)、9-氨基-20(s)-喜树碱(9-AC)、9-二甲氨基甲基-10-羟基喜树碱(Tapotecan)、7-乙基-10-(4-[1-哌啶基]-1-哌啶基)-羟基喜树碱(伊立替康，CPT-11，Irinotecan)等等。它们都几乎不溶水，进入体内后迅速被清除，因此虽然具有良好的抗肿瘤作用，但是在应用上受到很大的限制。

10-羟基喜树碱(HCPT)是由喜树碱基本环A环中10位-H被-OH取代后得到的。它具有比喜树碱更强的抗肿瘤作用和宽的抗瘤谱，是一种常用于治疗肿瘤的喜树碱衍生物。用它做体外和动物实验，结果均显示HCPT对多种肿瘤细胞具有强的杀伤作用。HCPT有两种形式，即开环HCPT(C-HCPT)和闭环HCPT(O-HCPT)。由于HCPT为内酯环，不溶于水，因此通常将其碱化使其开环后溶于水，制成注射剂。但是这种注射剂存在许多缺点：①制剂质量不稳定；②水针剂的开环钠盐不易保存；③酶学研究表明，闭合内酯是抑制TopoI的必需形式，开环化合物需经环合后才能发挥功效，因此临床应用的HCPT钠盐虽增加了水溶性，但活性只有内酯的1/10；④在酸性环境下(PH＜6)HCPT主要以闭环形式，在碱性环境时(PH＞7.6)以开环形式存在，因此在生理PH条件下，药物主要以开环形式存在；⑤药代动力学研究显示HCPT体内半衰期短，与组织的亲和力低，药物不易进入细胞内。

为了解决注射剂的上述问题，有人将喜树碱衍生物与高分子材料结合，制成前导药物，以改善其水溶性。例如，日本专利公开号为JP平10-513187的申请公开了一种用高分子聚合体作为基剂的前药，该前药具有

的结构，其中，D是生物体活性基团，可以是喜树碱类化合物；M是X或Q，X是吸电子基，Q是距离Y′5或6个原子的位置上有自由电子对的基团；Y和Y′是独立的O或S，R是聚亚烷基氧化物。又例如，日本专利公开号为JP2003-527443的专利申请公开了一种聚谷氨酸——喜树碱结合体及其制备方法。这种结合体具有

的结构，其中，PG是聚谷氨酸聚合体；X是单键结合、酰胺-[OC-(CHR’)_p-NH]_n-或羟基酰胺-[OC-(CHR’)_p-O]_n-；R’是自然界存在的氨基酸的侧链，喜树碱是20(s)-喜树碱或者是有生物活性20(s)-喜树碱类似物；m是正整数5-65；n是1和10之间的整数；此外p也是1和10之间的整数。国内还有人不仅采用高分子材料，而且利用纳米载药系统来提高CPT类药物的靶向性，减少该类药物的毒性。例如，我国专利申请CN01133700.1公开了一种10-羟基喜树碱聚乳酸纳米粒的制备方法。又例如，我国专利授权011382552.x公开了一种10-羟基喜树碱葡聚糖纳米粒的制备方法。上述的这些国内外专利申请中公开的高分子材料，虽然在一定程度上能起到增加HCPT溶解度的作用，但是效果都不尽理想。

因此，有必要研究出一种能通过提高喜树碱衍生物溶解度，延长其在体内的循环时间，增加其对组织的亲和力，从而提高喜树碱衍生物抗肿瘤作用的方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种喜树碱衍生物的聚乙二醇-聚γ-苄基谷氨酸共聚物(HCPT/PEG-PBLG)纳米微粒(或称纳米胶束)。

本发明的纳米微粒是由聚乙二醇-聚γ-苄基谷氨酸嵌断共聚物与喜树碱衍生物形成的核-壳型结构，而且呈球形或者椭球形的形态；所述的核-壳型结构的中心区域为疏水性内核，外层区域为亲水性外壳。

这种纳米微粒的大小一般是几十至几百纳米，其疏水性内核直径一般为50-300nm，优选为100-200nm；它的亲水性外壳直径一般为10-80nm，优选为20-50nm。

本发明中的喜树碱衍生物可以是10-羟基喜树碱、9-氨基-20(s)-喜树碱(9-AC)、9-二甲氨基甲基-10-羟基喜树碱(Tapotecan)、7-乙基-10-(4-[1-哌啶基]-1-哌啶基)-羟基喜树碱等有抗肿瘤作用的喜树碱衍生物。优选地，采用抗肿瘤效果显著的10-羟基喜树碱(Hydroxycamptothecin、HCPT)。喜树碱衍生物在纳米微粒中的含量通常为5-20％。

本发明利用聚乙二醇-聚γ-苄基谷氨酸嵌断共聚物作为喜树碱衍生物的包覆材料的依据是：聚γ-苄基谷氨酸(PBLG)具有较强的疏水性和刚性，易成型，降解产物为内源性物质谷氨酸单体，不在体内滞留，因此不易产生体内的蓄积和毒副作用。但是PBLG制备的微粒进入体内后，由于其强疏水性易被单核噬细胞系统(MPS)快速摄取，难以发挥非MPS靶位效应。而聚乙二醇为亲水性的柔顺大分子，具有免疫学惰性和良好的生物相容性。如果将PEG与PBLG聚合形成亲水和疏水性为一体的聚合物，由于该聚合物具有两亲性，因此它对亲水环境和疏水环境都具有不排斥的适应性，并可以发挥其中某一嵌段的功能性作用而减弱不良反应。PBLG刚性强可形成载药库，而PEG可以环绕在PBLG表面，改善PBLG微粒制剂的疏水性，在PBLG内核表面形成柔顺性好的水合性外壳，增强内核的稳定性且掩蔽疏水性内核免受MPS的识别。

根据上述理论，本发明给喜树碱衍生物采用了聚乙二醇-聚γ-苄基谷氨酸嵌断共聚物作为包覆材料。利用这种包覆材料，能够将疏水性的喜树碱衍生物包覆起来形成纳米微粒。

本发明的喜树碱衍生物的聚乙二醇-聚γ-苄基谷氨酸嵌断共聚物纳米微粒，是由聚乙二醇——聚γ-苄基谷氨酸嵌断共聚物包覆喜树碱衍生物所形成的。

本发明的发明人利用透射电子显微镜(TEM)来观察喜树碱衍生物/PEG-PBLG纳米微粒，结果显示：胶束大多呈球形或者椭球形，大小分布均匀，分散性良好，亲水性的背景和PEG被磷钨酸染色，呈灰色的外壳(见图4)。又利用扫描电子显微镜(SEM)观察，结果也显示了类似的结果：喜树碱衍生物/PEG-PBLG纳米微粒呈核-壳型结构，呈球形或者椭球形，中心区域为疏水性不被镀金，呈灰色的内核，直径约为200nm，周围亲水性被镀金的白色外壳，厚度约为30nm(见图5)。此外，我们还在酸、碱性条件下分别考察了纳米微粒的释药速率，发现喜树碱衍生物/PEG-PBLG胶束在碱性条件下释药速率加快，而且碱性越强，释药速率越快。

本发明的目的之二是提供制备喜树碱衍生物的聚乙二醇-聚γ-苄基谷氨酸共聚物(喜树碱衍生物/PEG-PBLG)纳米微粒的方法。

本发明的纳米微粒可以采用许多方法进行制备，包括沉淀/溶剂蒸发法、乳化/溶剂蒸发法、复乳法、透析法等。例如，对于脂溶性药物来说，可以采用溶剂蒸发法，即将药物与PEG-PBLG溶解于有机溶剂中如乙腈，将有机溶剂通氮气加温吹干，形成薄膜，再加入水，激烈搅拌得到纳米微粒。

本发明优选采用透析法，该方法包括如下步骤：

(1)将喜树碱衍生物和聚乙二醇——聚γ-苄基谷氨酸嵌断共聚物在非质子溶剂中进行溶解；

(2)将步骤(1)中所得到的溶液转移至透析袋中进行透析；

(3)将步骤(2)中透析后得到的胶束溶液进行离心分离；

(4)将步骤(3)中离心分离后得到的上清液进行过滤；

(5)将步骤(4)中得到的滤液进行冷冻干燥，制得喜树碱衍生物的聚乙二醇-聚γ-苄基谷氨酸嵌断共聚物纳米微粒。

在步骤(1)中，非质子溶剂可以是二氧六环、苯、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺等，优选为N，N-二甲基甲酰胺。在溶解过程中，最好使溶液保温在50-70℃之间。喜树碱衍生物与PEG-PBLG聚合物的投料比例优选为1∶1。以该比例投料，制得的HCPT/PEG-PBLG纳米微粒载药量约为6-9％，包封率约为55-58％。

在步骤(2)中，透析时优选地，多次更换透析用的蒸馏水，以加快透析的速度。在透析袋的选择上，由于本发明的纳米微粒的分子量大约在8,000-20,000左右，所以优选采用截止分子量在2,000-6,000道尔顿的透析袋。选择这样的透析袋是因为：透析袋的截止分子量的大小是由所截留的物质的分子量大小决定的，通常是所截留的物质的分子量的1/3左右。

在步骤(4)中，优选地，采用微孔滤膜过滤，微孔滤膜的孔径优选为0.45μm。

在步骤(5)中，冷冻干燥后得到的本发明的纳米微粒具有良好的分散性。

上述步骤(1)中的聚乙二醇——聚γ-苄基谷氨酸嵌断共聚物，可以通过以下方法制备：

(1)制备BLG：

其中，上述反应中酯化所生成的水被及时除掉；

(2)

或

(3)

其中，LG表示L-谷氨酸；BLG表示γ-苄基-L-谷氨酸；THF表示四氢呋喃；BLG-NCA表示γ-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐；MeO-PEG-NH₂表示ω-端氨基聚乙二醇。

在上述制备PEG-PBLG嵌断共聚物的步骤(1)中，制备BLG时，苯甲醇与谷氨酸克分子比例优选为1.1∶1；L-谷氨酸苄酯化通常在酸催化的条件下完成，采用酸催化剂可以是氢溴酸、硫酸、对甲苯磺酸等。优选地，采用浓硫酸。制备L-谷氨酸苄酯传统的方法是采用氢溴酸作催化剂，虽然简单可靠，但产率较低，一般只有2.95％，同时还消耗较多的氢溴酸、苯甲醇、吡啶和乙醇。文献报道曾有人采用硫酸作催化剂和吸水剂制备苄酯，产率可提高到51.5％，但是工序比较复杂，反应时间长达18小时，而且成本较高，要消耗大量的乙醚、苯甲醇、吡啶和干冰。还有，该反应是酯化反应。由于酯化反应是可逆反应，为保证酯化反应的进行，需要把酯化生成的水排掉。可以采用抽真空方式排水。整个反应需要在较高的温度下进行。采用该方法合成的BLG为银白色的片晶状，熔点171～173℃。

在上述制备PEG-PBLG嵌断共聚物的步骤(2)中，用光气

和三光气 都可以制得BLG-NCA。由于BLG的活性低而且不易聚合，所以要将它转化为活性高的BLG-NCA。以往合成BLG-NCA的方法有光气法、酰氯法等。光气法是把氨基酸悬浮于二氧六环中，用光气鼓泡若干小时，直至氨基酸溶解，溶液变为透明，再通入大大过量的光气，最后用氮气鼓泡或减压处理的方式来去除过量的光气。后来，有人对这种光气法做了改进，在光气法中采用光气苯液代替光气鼓泡，光气只加至稍过量而不使其大大过量。该方法能够减少副反应，反应结束后也无须吹入氮气或减压处理。但是该方法易引入杂质，从而导致聚合反应易被终止。因此，本发明的发明人对光气法进行了改进，将BLG与三光气反应。三光气在反应中须分解生成光气后才能与BLG反应。本发明的三光气法与改进后的光气法——光气-甲苯法相比，虽然其转透明时间较长，但具有制得的BLG-NCA的聚合度大于光气-甲苯法制得的总的BLG-NCA的聚合度，而且不易将杂质引入反应中，分解产物明确的优点。

在上述制备PEG-PBLG嵌断共聚物的步骤(3)中所用的ω-端氨基聚乙二醇可以通过以下步骤制备：

其中，英文缩写Ts指的是甲苯磺酸基。

本发明的目的之三是提供一种治疗肿瘤的药物组合物及其在治疗肿瘤方面的用途；该药物组合物中含有本发明的喜树碱衍生物的纳米微粒以及药学上可以接受的辅剂。辅剂可以是在制备各种剂型时加入的辅料，也可以是其他对抗肿瘤起辅助治疗作用的，与本发明的纳米微粒配伍后无毒副作用的药物。

本发明的纳米微粒可以制成多种剂型。由于它具有良好的溶解性，并且聚乙二醇-聚γ-苄基谷氨酸共聚物的在人体内不易产生蓄积和毒副作用，因此可以将这种纳米微粒制成注射剂。又由于这种纳米微粒在干燥的条件下具有良好的分散性，因此还可以将其制成粉针。另外，还可以将它制成各种口服制剂，例如：胶囊剂、溶液剂等。此外，可以根据各种剂型的需要，在本发明的纳米微粒的制剂中加入药学中可以接受的辅料。这些剂型可以采用常规的制剂技术，简单易操作，与以往的喜树碱衍生物的制剂相比，喜树碱衍生物的水不溶性问题得到了彻底地解决，从而使喜树碱衍生物的抗肿瘤的效果得到了极大地提高，并有效地降低了它们的毒副作用。

本发明的喜树碱衍生物/PEG-PBLG纳米微粒在抗肿瘤方面具有突出的优点。例如，HCPT/PEG-PBLG的纳米微粒对口腔鳞癌、大肠癌具有比HCPT更强的体内抑瘤效果、更长的肿瘤倍增时间、更安全可靠的疗效；这是因为PEG-PBLG能增加HCPT的水溶性，稳定HCPT的内酯结构，从而延长HCPT在体内循环时间，增加HCPT对肿瘤组织的转运。

本发明的喜树碱衍生物的聚乙二醇-聚γ-苄基谷氨酸嵌断共聚物纳米微粒采用了既亲水又亲脂的两性的表面活性剂PEG-PBLG作为包覆材料，彻底地解决了HCPT的水溶性问题，并能避免单核噬细胞系统(MPS)的识别与吞噬作用。这种纳米微粒的粒子大小达到了纳米级，从而使药物对肿瘤细胞具有靶向作用。

下面，结合实施例来进一步说明本发明。

附图说明

图1显示了用超微透析的方法制备PEG-PBLG载药胶束的简图，图中各附图标记表示：1----PEG         2------PBLG    1+2------PBLG-PEG

      3------透析装置  4------喜树碱衍生物/PBLG-PEG的纳米微粒

图2显示了PBLG的核磁共振图谱。

图3显示了PEG-PBLG的核磁共振图谱。

图4显示了用放大倍数为40000的TEM(透射电子显微镜)观察到的PEG-PBLG胶束的形态。

图5显示了用放大倍数为20000的SEM(扫描电子显微镜)观察到的PEG-PBLG胶束的形态。

图6显示了各组口腔鳞移植瘤的生长曲线

图7显示了用PBS处理后的Tcal8113细胞的组织变化

图8显示了用HCPT/PEG-PBLG纳米微粒处理后的Tcal8113细胞的组织变化

图9显示了各组大肠癌移植瘤的生长曲线

具体实施方式

本发明中所采用的部分试剂如下：

二氯甲烷：分析纯，广州化学试剂厂，CaCl₂干燥3天，蒸馏、收集40-55℃馏分；

吡啶：分析纯，广州化学试剂厂，400℃分子筛干燥3天，收集115-120℃馏分；

对甲苯磺酰氯：化学纯，广州化学试剂厂，在苯与石油醚(沸程60-80℃)(1∶20，v/v)的混合溶剂中重结晶，真空干燥；

单甲氧基端基聚乙二醇(MeO-PEG)：Sigma公司，平均分子量为5000；

氨水：分析纯(25-28％)，广州化学试剂厂；

L-谷氨酸：生化试剂，第二军医大学试剂厂；

苯甲醇：分析纯，广州化学试剂厂；

98％浓硫酸：分析纯，广州化学试剂厂；

无水乙醇：分析纯，广州化学试剂厂；

乙醚：分析纯，广州化学试剂厂；

四氯化碳：分析纯，广州化学试剂厂；

甲苯：分析纯，广州化学试剂厂，金属钠回流6h，收集110-120℃馏分；

四氢呋喃：分析纯，广州化学试剂厂，金属钠回流12h，收集64-67℃馏分；

石油醚：分析纯，广州化学试剂厂，沸程30-60℃；

苯：分析纯，广州化学试剂厂，金属钠回流6h，收集79-81℃馏分；

二氧六环：分析纯，广州化学试剂厂，金属钠回流6h，收集100-103℃馏分；

三乙胺：分析纯，广州花学试剂厂，仅属钠回流，蒸馏

PEG-PBLG共聚物(自制Mn 1.12×104)

透析袋(MWCO3500-5000)(SMI公司)

N，N-二甲基甲酰胺(分析纯，广州化学试剂厂)

HCPT(武汉黄石李时珍药业有限公司)

PH7.4磷酸盐缓冲液，PH9.18硼酸盐缓冲液

色谱甲纯(天津四友公司)

0.01PBS：含8.1mM NaHPO4，1.9mM Na2HPO4，0.85％NaOH，调PH为7.4，高压灭菌

甲醇、乙腈为Fisher公司的色谱纯，三乙胺、氨水、稀醋酸为分析纯试剂，水为注射用水。

0.25％胰酶：NaCl 0.8g，KCl 0.04g，葡萄糖0.1g，NaHCO3 0.035g，EDTA-Na0.02g，

胰蛋白酶0.25g，用三蒸水100ml配制，过滤灭菌。

牛血清白蛋白(BSA)

本发明中所使用的部分仪器设备如下：

CM10透射电镜(荷兰PHILIPS)

扫描电子显微镜(荷兰PHILIPS)

600U型双光束分光光度计(Beckman)

日立HITACHI H-600

高效液相色谱仪(HP1100 Agilent配置自动进样器、紫外检测器、四元梯度泵、在线脱气机)

光学显微镜

            实施例1ω-端氨基聚乙二醇(MeO-PEG-NH₂)的合成

实验过程

取40gMeO-PEG在120℃下抽真空脱水5h，冷置室温，加入200mlCH₂Cl₂溶解，再加入一倍过量的对甲苯磺酰氯/吡啶溶液(5％w/v)，室温避光反应24h。反应液加入431ml 3M HCl，充分混合使其与吡啶中和，将所有液体置分液漏斗中，静置分层，取出下层有机层，用固体NaHCO₃洗涤，过滤，真空旋转蒸发CH₂Cl₂，加入20ml四氢呋喃(THF)溶解，大量乙醚沉淀，过滤，真空干燥得白色粉末状的PEG-对甲苯磺酰盐，收率79％。10g PEG-对甲苯磺酰盐与过量的浓氨水(28％)120℃密闭反应8h，冷至室温，加入等体积CH₂Cl₂，混匀静置、萃取，分出有机层得对甲苯磺酰铵盐，倒入1M NaOH中搅拌2h，发生置换反应得ω-氨基聚乙二醇(MeO-PEG-NH₂)。萃取分离有机层，蒸馏水洗5-6次至近中性，有机层抽真空旋转蒸发除去CH₂Cl₂，的白色粉末状MeO-PEG-NH₂纯品，收率为65.7％。

              实施例2 PEG-PBLG嵌段共聚物的合成

将96g L-谷氨酸与78g苯甲醇搅拌混合，滴加106g 60％浓硫酸，20min后使溶液变清，70℃抽真空反应4h。反应倒入800ml含与浓硫酸等摩尔量NaHCO₃的水溶液中，搅拌产生白色泡末状沉淀，过滤，用2000ml 5％乙醇70℃热水重结晶，4℃静置过夜，过滤、洗涤，得产物L-谷氨酸γ-苄酯(BLG)80g，银白色片晶状，产率83.3％。熔点172～174℃。取40g BLG混悬于装160ml THF密闭容器中，加入三光气26g，60～65℃下搅拌反应10min，反应液澄清透明，再反应20min，将反应液倒入500ml石油醚中沉淀，-20℃放置48h，过滤，洗涤，真空干燥的白色针状结晶BLG-NCA，产率95％，熔点86～90℃。

BLG-NCA单体(A)4g溶解于80ml苯-二氧六环混合溶剂中，以ω-端氨基聚乙二醇(I)为引发剂，按单体与引发剂摩尔比(A/I)分别为50/1，60/1分别加入引发剂，室温搅拌反应72h。反应初期有CO₂气泡产生，反应液粘度逐渐增加，将反应液倒入20倍的无水乙醇中沉淀，过滤，真空干燥，得到PEG-PBLG嵌断共聚物。制得的PEG-PBLG嵌断共聚物为淡黄色半透明状固体，产率为56％。

           实施例3 PEG-PBLG嵌段共聚物的合成

用实施例2的方法合成BLG-NCA单体的方法。然后将合成好的BLG-NCA单体(A)2g溶解于40ml苯-二氧六环混合溶剂中，以三乙胺为引发剂，按单体与引发剂摩尔比(A/I)分别为50/1加入引发剂，室温搅拌反应72h。反应初期有CO₂气泡产生，反应液粘度逐渐增加，将反应液倒入20倍的无水乙醇中沉淀，过滤，真空干燥，得到PEG-PBLG嵌断共聚物。

          实施例4 PEG-PBLG载药纳米纳米胶束的制备

用超微透析技术制备PEG-PBLG载药纳米胶束：称取20mgPEG-PBLG，溶解于10mlN，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，60℃水浴保温5min，将DMF溶液转移至透析袋(截止分子量3500)中，置于2L蒸馏水透析24h。在2h、5h、8h、12h分别替换新鲜蒸馏水。24h后将透析袋中胶束溶液离心，上清液经0.45μm滤器过滤，4℃保存，冷冻干燥得固体样品。该反应的示意图见图1。

      实施例5 HCPT/PEG-PBLG纳米胶束体外药代动力学试验

1.HCPT标准曲线的制备

精密称取HCPT 3mg，用蒸馏水溶解并稀释至10ml的容量瓶中，配制0.1～1mg/ml的一系列浓度，在紫外分光光度计的362nm处测定溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，HCPT浓度为横坐标绘制HCPT的标准曲线。

2.HCPT/PEG-PBLG胶束体外释药试验

一定量的HCPT/PEG-PBLG胶束置透析袋中，在PH6.86和PH9.18的介质中释药，释药的环境维持在37±1℃，94±4beat/min振荡器中，定时更换介质，更换的介质在UV362nm处以空白胶束的释放介质为对照测定吸光度，根据标准曲线求出介质中的释药量，绘制释药曲线。

3.实验结果

HCPT在甲醇中的标准曲线为：y＝10.7x+0.0056(r＝0.9999)。

HCPT/PEG-PBLG胶束在PH6.86和PH9.18的介质中释药曲线表明，释药行为由两相组成，即突释相和缓释相，突释发生在2h，释放的药量约占总量的1/3，随即进入缓释相，96h后仍有3/5药物被包裹。

     实施例6 HCPT/PEG-PBLG纳米胶束体内药代动力学试验

1.HCPT标准曲线制备

精密吸取对照液(10-羟基喜树碱内酯的含量0.1mg/ml)加入到空白血浆中，使之浓度为：2，5，10，25，50，75，100，250，750，1000，1500，2500ng/ml的含HCPT的血样品。取200μl血浆，加入5μl稀醋酸，充分混合后，避光环合4h，再加入200μl的冷甲醇-乙腈(1∶1)去除蛋白，震摇混匀，4℃10000rpm/min离心5min，取上清50μl按上述色谱条件进样。以浓度为横坐标，所测的峰面积为纵坐标，作峰面积-浓度的标准曲线，并计算回归方程。

色谱条件：色谱柱：Hypersil C18(5μm，ID4.6×300mm)；柱温：室温；流动相：0.075M醋酸缓冲液(PH6.4)-乙腈(78∶22)，0.45μm过滤并超声脱气；流速：1.0ml/min；激发波长：269nm，发射波长：550nm。

2.日内、日间稳定性试验及回收率试验

精密吸取适量10-羟基喜树碱内酯对照品溶液，加入到空白血浆中配制成浓度为10ng/ml的血样品，按上述方法测定10-羟基喜树碱内酯在48h内的含量，计算日内、日间变异。

配成低、中、高三个浓度(5ng/ml、100ng/ml、2000ng/ml)的10-羟基喜树碱血浆样本，按上述方法测定样本浓度，计算相对及绝对回收率。

3.HCPT体内药代动力学试验

新西兰大白兔(雄性2-3Kg)3只，于左耳静脉给予12mg/kg的HCPT，在右耳静脉于0、15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h取血1ml置肝素化试管中，2000rpm/min离心10min，离心后取200μl血浆，加入5μl稀醋酸，充分混合后，避光环合4h，再加入200μl的冷甲醇-乙腈(1∶1)去除蛋白，震摇混匀，4℃10000rpm/min离心5min，取上清50μl，经高效液相色谱仪测定，根据标准曲线计算HCPT的血药浓度，描绘HCPT血浆-浓度时间曲线。

4.HCPT/PEG-PBLG纳米微粒(纳米胶束)体内药代动力学试验

新西兰大白兔(雄性2-3Kg)3只，于左耳静脉给予12mg/kg的HCPT/PEG-PBLG，在右耳静脉于0、15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h取血1ml置肝素化试管中，2000rpm/min离心10min，离心后取200μl血浆，加入5μl稀醋酸，充分混合后，避光环合4h，再加入200μl的冷甲醇-乙腈(1∶1)去除蛋白，震摇混匀，4℃10000rpm/min离心5min，取上清50μl，经高效液相色谱仪测定，根据标准曲线计算HCPT的血药浓度，描绘HCPT血浆-浓度时间曲线。

5.药代动力学参数的计算

将血药浓度-时间点代入3p87软件，或用开放一室模型计算药代动力学参数。

6.实验结果

a.HCPT标准曲线

10-羟基喜树碱内酯在上述色谱条件下的保留时间为9.96min，与杂质峰完全分离，且空白血浆经过测试不干扰HCPT内酯的测定。以HCPT色谱峰面积对浓度作图，方程为：y＝2.75x+2.90(r＝0.9999)，线性范围：2～2000ng/ml，最低检测限为2ng/ml。

b.日内、日间变异

HCPT标准品、HCPT标准品+血浆在48h内测定(见表1)，从表可看出，HCPT标准品在48h内可以保持稳定，但在血浆中，只能在6h内保持稳定，日间变异性较差，因此本试验作随行标准曲线。

       表1  用高效液相色谱测得的HCPT的日内、日间精密度

时间     对照品峰高    (对照品+血浆样品)峰高    百分比(％)

0        0.25          0.24                     96.0

6        0.25          0.23                     92.0

24       0.26          0.19                     73.1

48       0.26          0.13                     50.0

c.回收率试验

低、中、高三个浓度的回收率(见表2)，绝对回收率＞70％，相对回收率＞95％。

               表2 HCPT在兔血中的回收率

浓度(ng/ml)    绝对回收率(％)    相对回收率(％)

5              73.5±4.5         100.8±6.4

100            82.6±4.8         102.9±3.2

2000           78.9±3.7         98.6±2.8

d.HCPT/PEG-PBLG体内药代动力学试验

HCPT、HCPT/PEG-PBLG给药后不同时间的血药浓度(见表3)。将HCPT浓度-时间点分别代入3P87软件拟合，曲线呈明显的双相处置特征，表明HCPT在体内符合二房室模型，消除相浓度的对数对时间作图，为一直线，表明消除为一级动力学消除，后呈二房室模型，半衰期(t_1/2β)为4.52h，最高血药浓度C_max为2627.8μg/L，达峰时间T_max为给药后即刻，浓度-时间曲线下面积(AUC)为2459μg/L.min，Vd为7.3L，24h后HCPT基本从体内完全清除。

HCPT/PEG-PBLG纳米微粒注射入体内后呈典型的纳米微粒释药模型即突释-缓释模型，突释发生在1h，浓度为1513.5μg/L，随即进入缓释相，浓度为84.7-7.4μg/L。与HCPT药代动力学参数相比(见表4)，t_1/2β延长至10.1h，C_max减少为1513.5μg/L，T_max延长至1h，V_d增加至20.0L，而AUC基本不变为2175.9μg/L.h。缓释相以1gCt-t作图为近似一直线(r＝0.9535)，因此药物的消除可以近似为一级动力学消除。

             表3 HCPT在兔血中的浓度变化

时间(h)         HCPT(μg/L)        HCPT/PEG-PBLG(μg/L)

0               2627.8             0

0.25            1281               75.3

0.5             893.1              90.4

1               496.9              1513.5

2               323.8              84.7

4               173.8              67.8

8               62.3               43.5

12              12.7               24.3

24              7.5                12.4

36              /                  7.3

              表4 HCPT和HCPT/PEG-PLG纳米微粒的药物动力学参数

              t_1/2β(h)    C_max(μg/L)    Tmax(h)    AUC(μg/L.min)

HCPT           4.52          2627.8          0          2459

HCPT/PEG-PBLG  10.1          1513.5          1          2175.9

p              ＜0.01        ＜0.01          ＜0.01     ＞0.05

以上结果表明：当HCPT制备成HCPT/PEG-PBLG纳米胶束后，T_max、t_1/2β延长(p＜0.01)，C_max减少(p＜0.01)，而AUC基本不变(p＞0.05)，说明HCPT/PEG-PBLG纳米微粒具有缓释作用。

    实施例7 HCPT/PEG-PBLG纳米胶束治疗口腔鳞癌移植瘤的研究

1.口腔鳞癌裸鼠移植瘤模型的建立和治疗方案

BALB/C小鼠，鼠龄6～8周，体重20～30g，SPF级，共48只，接种Tca8113细胞于右侧腋下，5×106个细胞/只，肿瘤形成直径约5mm时开始治疗，随机分组如下：对照组10只、PEG-PBLG空白胶束组10只、HCPT组10只、HCPT/PEG-PBLG纳米微粒组10只。接种第8天开始腹腔注射HCPT或HCPT/PEG-PBLG纳米微粒，剂量3mg/kg，隔天1次，共8次。HCPT/PEG-PBLG纳米微粒治疗口腔鳞癌移植瘤的实验方案(见表5)。

表5 HCPT/PEG-PBLG内米微粒治疗口腔鳞癌移植瘤的方案

                          天

            1   8                       15         21                             34

接种舌癌细胞   ★

腹腔注射药物   ★ ★

肿瘤大小的测量 ★ ★

处死部分动物：                                     ★

光镜、透射电镜                                     ★

处死全部动物                                                                      ★

其中，“★”号表示从实施具体方案的起(止)日。

2.观察并比较移植瘤生长状况

接种第8天开始，测量肿瘤的最大直径(a)和最大横径(b)，每3天测量1次。①计算肿瘤体积v＝1/2(a×b2)，描绘肿瘤的生长曲线，对生长曲线进行拟合y＝a×e^kday，计算群体倍增时间(T＝ln2/k)合生长速率(k)。②计算抑瘤率(抑瘤率＝1-实验组体积变化/对照组体积变化)。③对接种34天各组肿瘤体积大小进行单因素方差分析。

3.组织病理学观察

接种第21天每组处死动物1只，分别进行如下检测：①光镜下观察肿瘤组织的病理改变，肿瘤组织切除后10％福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色。②透射电镜观察细胞超微结构的改变：切除组织后，组织放入前固定液，1％锇酸固定1～2h，常规乙醇脱水，LR White渗透包埋，56℃聚合24～36h，超薄切片，铀铅双染，透射电镜观察。

4.实验结果

a.生长曲线

各处理组移植瘤成瘤率100％。各处理组肿瘤的生长曲线(见图6)，由图6可见对照组、PEG-PBLG组肿瘤的生长迅速，两组间的体积无明显差别，肿瘤的群体倍增时间分别为3.50天和3.57天。HCPT组、HCPT/PEG-PBLG组肿瘤生长明显受到抑制，肿瘤的群体倍增时间分别为4.5天和4.9天，其抑瘤率分别为58.7％和87.0％，而对照组和PEG-PBLG组则无明显的抑瘤作用。对31天各组肿瘤的体积进行单因素分析见表6：二个对照组之间肿瘤体积无明显差异(p＞0.05)，HCPT、HCPT/PEG-PBLG组与对照组比较均存在显著性差异(p＜0.01)，且HCPT/PEG-PBLG组与HCPT组间也存在显著性差异。

       表6  HCPT或HCPT/PEG-PBLG纳米微粒对治疗口腔鳞癌移植瘤的作用

                    对照组      PEG-PBLG组    HCPT组         HCPT/PEG-PBLG组

肿瘤体积            3.95±0.58  3.94±0.20    1.56±0.29^*   0.56±0.062^*

(cm3，x±s)

肿瘤倍增时间(天)    3.50        3.57          4.5            4.9

抑瘤率(％)                                    58.7％         87.0％

^*与对照组比较p＜0.01，与HCPT组比较P＜0.05

b.组织病理学的改变

对照组、PEG-PBLG组肿瘤细胞生长活跃，可见较多的瘤巨细胞、核分裂相多见，未见组织坏死或炎症细胞侵润；HCPT组和HCPT/PEG-PBLG组可见肿瘤内有灶性坏死，坏死灶及其周围可见淋巴细胞侵润。

c.细胞超微结构的改变

对照组肿瘤细胞超微结构无明显改变，HCPT组肿瘤细胞出现凋亡，HCPT/PEG-PBLG组肿瘤细胞可见大量吞噬小体，肿瘤细胞出现凋亡(见图7和图8)。表明PEG-PBLG纳米微粒增加肿瘤细胞对药物的吞噬，从而增加肿瘤细胞内药物浓度，提高抗肿瘤作用。

我们的实验表明：HCPT、HCPT/PEG-PBLG对口腔鳞癌具有的抑瘤作用，单药HCPT对口腔鳞癌的抑瘤率为58.7％，而HCPT被PEG-PBLG纳米微粒化后，抑瘤率提高为87.0％(p＜0.01)，肿瘤的倍增时间也从4.5天延长到4.9天(p＜0.01)，表明HCPT/PEG-PBLG的疗效优与单药HCPT。PEG-PBLG增加HCPT的疗效原因可能是：①PEG-PBLG增加HCPT的表观分布容积，提高HCPT从血液向组织的转运，从而使药物更易进入肿瘤组织。透射电镜结果显示HCPT/PEG-PBLG组、PEG-PBLG组的肿瘤细胞形成许多吞噬小体，而HCPT组、对照组未见，HCPT/PEG-PBLG组出现较广泛的坏死、凋亡。②HCPT/PEG-PBLG纳米微粒避免HCPT在血浆中的迅速水解，稳定其酮式形式。O-HCPT才能与TopoI-DNA形成三联聚合物，抑制TopoI的活性，从而抑制DNA的合成，达到杀死肿瘤细胞的作用。O-HCPT稳定时间越长，其抗癌作用越强，因此PEG-PBLG包裹HCPT有利于提高HCPT的疗效。③HCPT/PEG-PBLG纳米微粒缓慢释放HCPT，增加肿瘤组织与HCPT的暴露时间，从而提高疗效。HCPT被PEG-PBLG纳米微粒包裹后对口腔鳞癌的抑瘤率得到提高，达到87.0％。

              实施例8 HCPT/PEG-PBLG治疗大肠癌的研究

1.大肠癌裸鼠移植瘤模型的建立和治疗方案

BALB/C小鼠，鼠龄6～8周，体重20～30g，SPF级，共48只，接种lovo细胞于右侧腋下，5×10⁶个细胞/只，肿瘤形成直径约5mm时开始治疗，随机分组如下：对照组10只；PEG-PBLG空白胶束组8只；HCPT组8只；HCPT/PEG-PBLG纳米组8只。接种第3-9天给药。腹腔注射药物：HCPT或HCPT/PBLG-PEG(3mg/kg)。(见表7)

       表7 HCPT/PEG-PBLG纳米微粒治疗大肠癌移植瘤的方案

                                 Day

                1      3                   9                   21

接种大肠癌细胞  ★

腹腔注射药物           ★

★

肿瘤大小的测量         ★

★

处死全部动物                                                   ★

2.观察并比较移植瘤生长状况

接种第3天开始，测量肿瘤的最大直径(a)和最大横径(b)，每3天测量1次。①计算肿瘤体积v＝1/2(a×b2)，描绘肿瘤的生长曲线，对生长曲线进行拟合y＝a×e^kday，计算群体倍增时间(T＝ln2/k)合生长速率(k)。②计算抑瘤率(抑瘤率＝1-实验组体积变化/对照组体积变化)。③对接种21天各组肿瘤体积大小进行单因素方差分析。

3.实验结果

各处理组移植瘤成瘤率100％。各处理组肿瘤的生长曲线见图9，由图可见对照组、PEG-PBLG组肿瘤的生长迅速，两组间的体积无明显差别，肿瘤的群体倍增时间分别为2.88天和2.99天。HCPT组、HCPT/PEG-PBLG组肿瘤生长明显受到抑制，肿瘤的群体倍增时间分别为4.28天和4.88天。HCPT、HCPT/PEG-PBLG组的抑瘤率分别为70.04％和83.82％，而对照组和PEG-PBLG组则无明显的抑瘤作用。对27天各组肿瘤的体积进行单因素分析(见表8)，二个对照组之间肿瘤体积无明显差异(p＞0.05)，HCPT、HCPT/PEG-PBLG组与对照组比较均存在显著性差异(p＜0.01)，且HCPT/PEG-PBLG组与HCPT组间也存在显著性差异。

      表8 HCPT/PEG-PBLG纳米微粒对治疗大肠癌移植瘤的作用

                  对照组        PEG-PBLG组    HCPT组         HCPT/PEG-PBLG组

肿瘤体积          4.34±0.48    4.21±0.31    1.30±0.081    0.70±0.067

(cm3，x±s)

肿瘤倍增时间(天)  42.88         2.99          4.28           4.88

抑瘤率(％)                                    70.04％        83.82％

^*与对照组比较p＜0.01，与HCPT组比较P＜0.05

HCPT/PEG-PBLG治疗肠癌移植瘤的动物模型显示，单药HCPT对肠癌的抑瘤率为70.04％，而HCPT被PEG-PBLG纳米微粒包裹后，抑瘤率提高为83.82％(p＜0.01)，肿瘤的倍增时间也从4.28天延长到4.88天(p＜0.01)。表明HCPT/PEG-PBLG的疗效优与单药HCPT。肿瘤组织的电镜照片也显示PEG-PBLG和HCPT/PEG-PBLG组的肿瘤细胞出现大量的吞噬小体，表明HCPT经PEG-PBLG纳米微粒包裹后易进入肿瘤细胞，优于HCPT单药组。

Claims (10)

1、一种喜树碱衍生物的纳米微粒，其特征在于，所述的纳米微粒是由聚乙二醇-聚γ-苄基谷氨酸嵌断共聚物与喜树碱衍生物形成的核-壳型结构，而且呈球形或者椭球形的形态；所述的核-壳型结构的中心区域为疏水性内核，外层区域为亲水性外壳。

2、如权利要求1所述的纳米微粒，其特征在于，所述的疏水性内核直径为50-300nm，优选为100-200nm；所述的亲水性外壳直径为10-80nm，优选为20-50nm。

3、如权利要求1所述的纳米微粒，其特征在于，所述的喜树碱衍生物为10-羟基喜树碱、9-氨基-20(s)-喜树碱、9-二甲氨基甲基-10-羟基喜树碱或7-乙基-10-(4-[1-哌啶基]-1-哌啶基)-羟基喜树碱。

4、如权利要求1所述的纳米微粒，其特征在于，所述的纳米微粒中喜树碱衍生物的含量为5-20％。

5、一种制备如权利要求1-4之一所述纳米微粒的方法，该方法包括如下步骤：

(1)将喜树碱衍生物和聚乙二醇——聚γ-苄基谷氨酸嵌断共聚物在非质子溶剂中进行溶解；

(2)将步骤(1)中所得到的溶液转移至透析袋中进行透析；

(3)将步骤(2)中透析后得到的胶束溶液进行离心分离；

(4)将步骤(3)中离心分离后得到的上清液进行过滤；

(5)将步骤(4)中得到的滤液进行冷冻干燥，制得喜树碱衍生物的聚乙二醇-聚γ-苄基谷氨酸嵌断共聚物纳米微粒。

6、如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所用的非质子溶剂为二氧六环、苯、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺或其混合物。

7、如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(1)的溶解过程中，使溶液保温在50-70℃之间。

8、如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的聚乙二醇-聚γ-苄基谷氨酸嵌断共聚物是通过以下步骤制备的：

(1)制备BLG：

其中，上述反应中酯化所生成的水被及时除掉；

(2)

或

(3)

其中，LG表示L-谷氨酸；BLG表示γ-苄基-L-谷氨酸；THF表示四氢呋喃；BLG-NCA表示γ-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐；MeO-PEG-NH₂表示ω-端氨基聚乙二醇。

9、一种喜树碱衍生物的药物组合物，其特征在于，该组合物中含有如权利要求1-4之一所述的喜树碱衍生物的纳米微粒以及药学上可以接受的辅剂。

10、如权利要求1-4之一所述的喜树碱衍生物的纳米微粒在制备治疗肿瘤药物方面的用途。

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