CN1212122C - 三七总皂苷脂质体及其制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三七总皂苷脂质体及其制剂。按重量百分比，该脂质体含有如下组份：三七总皂苷5%～30%，膜材50%～80%，附加剂1%～10%以及余量的其它辅料。该脂质体的剂型可为透皮制剂、气雾剂、口服液、眼用制剂、片剂或胶囊。用于治疗中风偏瘫、动脉粥样硬化性血栓性脑梗塞、脑栓塞、视网膜中央静脉阻塞等具有良好的药用前景。

Description

三七总皂苷脂质体及其制剂

                          技术领域

本发明涉及脂质体药物制剂，更具体说，本发明涉及三七总皂苷脂质体和含有三七总皂苷脂质体的药物制剂。

                          背景技术

三七(panax notoginseng)为五加科人参属植物，药用其根。迄今为止，从三七中已分离得到了20余种单体皂苷，平均总苷含量7.87％，以及黄酮0.38％，三七素0.90％，活性多糖0.28％等主要药用有效成分。此外，三七中尚有17种以上氨基酸，平均含量为7.73％，73种挥发油成分0.40％，包括活性硒在内的17种微量元素以及高达8.8％的粗蛋白等化学物质。三七中的活性成分三七总皂苷含量约为12％～18％。

三七总皂苷是由三七的根茎中分离出来的主要成分，它能增加动脉血流量，扩张血管、降低动脉血压及心肌耗氧量，提高机体免疫功能及对缺氧的耐受力，并有抑制血小板聚集、降低血粘度等作用。用于治疗中风偏瘫、动脉粥样硬化性血栓性脑梗塞、脑栓塞、视网膜中央静脉阻塞。

现有治疗心脑血管疾病的三七总皂苷药物大多缺乏组织特异性，在体内极易降解，半衰期短或难以进入细胞内，常规剂量的药物在病变部位难以达到有效浓度，影响治疗效果。如果能将三七总皂苷制成脂质体则能较好地解决上述问题。但是，由于三七总皂苷脂质体属于胶体分散系统，属于热力学不稳定体系，其膜材成分磷脂容易发生水解和氧化反应，外界环境的温度、pH值易引发脂质体结构的变化，从而引起脂质体中药物的渗漏，影响三七总皂苷脂质体贮藏过程中的稳定性。这是长期以来一直未能得到很好解决的技术难题。

                          发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足之处，提供一种三七总皂苷脂质体及其制剂。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

本发明提供了一种三七总皂苷脂质体，按重量百分比，该脂质体含有如下组份：三七总皂苷5％～30％，膜材50％～80％，附加剂1％～10％以及余量的其它辅料。

其中，所述的膜材选自卵磷脂、豆磷脂、脑磷脂、磷脂酰乙醇胺、胆固醇乙酰脂、β-谷甾醇、牛胆酸钠、神经鞘磷脂、二鲸蜡磷酸酯或其它合成磷脂中一种，或它们的混合物。

其中，所述的附加剂选自胆固醇、十八胺或磷脂酸中的一种。主要用于调节双分子层的流动性和通透性。

其中，所述的其它辅料选自甘露醇、葡萄糖、吐温-8 0、维生素E或聚乙二醇中的一种。

本发明制备过程中所需的有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、氯仿中的一种，或它们的混合物。

本发明提供的三七总皂苷脂质体，按重量百分比该脂质体最佳组成成分为：三七总皂苷5％～30％，大豆磷脂50％～80％；胆固醇1％～10％。

三七总皂苷脂质体采用下述方法制备：

1.将NaH₂PO₄和Na₂H₂PO₄用蒸馏水配成pH＝7的缓冲溶液，并置于容器中，将三七总皂苷溶于磷酸缓冲液中；

2.定量称取膜材，加入有机溶剂，待溶解后，在氮气流下加入到三七总皂苷的磷酸缓冲溶液中，混合均匀，减压蒸发除去有机溶剂，使磷脂在容器壁形成均匀的薄膜；

3.然后在容器中加入生理盐水100升，水合0.5～2小时，得到三七总皂苷脂质体粗液，超声波震荡15～25分钟，即得三七总皂苷脂质体溶液。

本发明的三七总皂苷脂质体除上述的薄膜法外还可采用逆相蒸发法、注入法、冷冻干燥法、熔融法等方法进行制备。

制备过程中将膜材和附加剂加入到有机溶剂中形成有机相，由于三七总皂苷易溶于水，因此将其加入到磷酸缓冲液中形成水相，两相混合后，可利用减压旋转蒸发或恒温搅拌等方法除去有机溶剂，此时制成的脂质体粒径大，可利用超声波振荡或用高压乳匀机匀化或微孔滤膜挤压过滤等方法进一步分散成粒径更小的脂质体。为防止在制备脂质体制剂的过程中所用的物质发生降解，使用了惰性气体如氮气或氩气吹洗所有溶液，并在惰性气体下进行所有步骤。通过实验发现，根据不同的剂型需要采用以下方法对脂质体溶液进行处理后，稳定性有很大的提高，药物的渗透率显著降低。(1)将脂质体溶液进行喷雾干燥。(2)加入甘露醇等保护剂后进行冷冻干燥。(3)在脂质体中加入表面活性剂吐温-80或胆酸盐进行处理。其中方法(2)的操作和产品的贮存较为方便。

采用冷冻干燥法将三七总皂苷脂质体溶液进一步加工成冻干粉，长期4℃～6℃放置，稳定性研究结果见表1。

            表1.三七总皂苷脂质体冻干粉稳定性研究结果

放置时间(月)	外观	含量(％)(g/ml)	包封率(％)(g/g)	最大粒径(um)	粒径＜5um(％)
						2	淡黄色颗粒粉末	1.0	80.0％	7.5	99.81
6	1.0	80.0％	7.5	99.80
					8	1.0		80.0％	7.4	99.80
10	1.0	80.0％	7.5	99.81
					12	0.99		80.0％	7.5	99.80
24	出现少量块团	0.99	79.8％	7.4							99.79
					32	0.98	79.6％	7.3	99.78

三七总皂苷脂质体冻干粉在4℃～6℃下放置长期保存2年多，包封率和含量均变化不大。

所述的三七总皂苷脂质体可加工成注射剂、透皮制剂、气雾剂、口服液、眼用制剂、片剂或胶囊多种剂型。

所述的三七总皂苷脂质体用于治疗中风偏瘫、动脉粥样硬化性血栓性脑梗塞、脑栓塞、视网膜中央静脉阻塞。

本发明对三七总皂苷脂质体的药理作用进行了下述深入研究。

A.三七总皂苷脂质体小鼠肌肉注射急性毒性实验

1.材料

1.1受试物：三七总皂苷脂质体

1.2实验动物：昆明种小鼠

2.方法

2.1动物分组：健康昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重18～22g，每组又随机分成6小组，每组10只。

2.2给药剂量及方法：

六个剂量组分别为1000mg/kg、800mg/kg、600mg/kg、500mg/kg、400mg/kg、300mg/kg，按0.081-0.20ml/10g体重一次肌肉注射给药。

给药后观察记录动物中毒表现及死亡情况。死亡动物立即作解剖，肉眼观察各主要脏器的中毒性病变，存活动物继续饲养观察一周，观察记录动物中毒情况和每日动物死亡数。

3.实验结果

小鼠肌肉注射后，出现动物活动减少，嗜睡症状。给药后约72小时动物相继出现死亡。尸体解剖后发现死亡动物肠系膜血管有少量瘀血。心、肝、脾、肺、肾等主要脏器未见明显中毒病变。给药后72小时不死亡的动物即可继续存活。一周饲养观察中，存活动物活动自如，食欲正常，一般情况良好，结果见表2。

            表2.三七总皂苷脂质体小鼠肌肉注射急性毒性试验结果

组别

剂量(mg/kg)

动物数(只)

死亡数(只)

存活动物数(只)

续表

1	300	10	0	10
					2	400	10	0	10
3	500	10	0	10
					4	600	10	1	9
5	800	10	3	7
					6	1000	10	10	0

结果计算LD₅₀为508.23mg/kg，其95％可信区间为684.12-452.96mg/kg体重。

4.讨论

三七总皂苷脂质体的急性毒性反应比血塞通注射液(主要含三七总皂苷)小，这是由于三七总皂苷被脂质体包裹后，靶向到达病变部位后才释放药物，对其他组织器官的损伤较少，有效的降低了药物的毒副作用。

B.三七总皂苷脂质体对家兔亚急性毒性实验

1.材料

1.1受试物：三七总皂苷脂质体

1.2实验动物：家兔

2.方法

2.1动物分组：家兔39只，体重720～1500g，，雌雄各半，随机分成3小组，每组13只。

2.2给药剂量及方法：

第一组(对照组)：0.9％氯化钠注射液4ml/kg，第二组：三七总皂苷脂质体150mg/kg(相当于含三七总皂苷100mg/kg，配成2.5％，4ml/kg)，第三组三七总皂苷脂质体250mg/kg(相当于含三七总皂苷200mg/kg，配成2.5％，4ml/kg)，每天静脉注射一次，共30天。用药后观察记录动物生长率、血红蛋白含量、红细胞计数及分类、肝功能、肾功能、肝肾及肾上腺组织切片检查的情况。

3.实验结果

3.1动物生长率：给药后1～4周，对照组动物的生长率与给药组动物的生长率无明显差异。结果见表3。

                         表3.各组动物不同时期生长率(％)比较

	第一组(对照组)	第二组	第三组	P值
					一周	111.1±7.3	114.9±6.9	112.3±7.4	P＞0.05
二周	117.6±8.2	118.8±7.5	117.9±6.8	P＞0.05
					三周	131.9±8.7	138.2±8.1	134.7±7.6	P＞0.05
四周	145.1±11.3	143.9±10.9	140.9±11.8	P＞0.05

3.2血红蛋白含量、红细胞计数及分类：

三组动物血红蛋白含量、红细胞计数及分类的差异无显著性意义。

3.3肝功能：

对照组、给药一组和二组动物的血清谷一丙转氨酶活性分别为64±9.0、59±9.8和57±11.0Iu/L，组间差异无显著性意义(P＞0.05)，谷一草转氨酶活性分别为59±12、70±16.7和65±10.2Iu/L，各组之间无显著性意义(P＞0.05)。

3.4肾功能：

对照组、给药一组和二组动物的血清肌肝含量分别为1.0±0.13、1.1±0.16和1.1±0.12mg％，各组之间差异无显著性意义(P＞0.05)。

3.5肝肾及肾上腺组织切片：

对照组13只动物中有6只动物的组织切片发现有病变。第一组三七总皂苷脂质体150mg/kg组有3只动物的组织切片发生异常，第二组三七总皂苷脂质体250mg/kg组也有3只动物的组织切片发生异常，情况见表4。

                  表4.各组动物组织切片检查病变情况比较

	病变	肝			肾		肾上腺
								动物数	间质性肝炎	细胞浊肿		细胞浊肿	间质性肾炎	皮质增生
	轻	中
			对照组	6	3	2	1			1	0				2

续表

第一组	3	1	1			1	1
								第二组	3	0	1	0			3

4.讨论

对照组、给药一组和二组动物的血红蛋白含量、红细胞计数及分类的差异无显著性意义，说明长期静脉注射三七总皂苷脂质体对家兔的造血功能无明显影响。三七总皂苷脂质体不改变家兔的血清谷一丙转氨酶和谷一草转氨酶的活性，不增高血清肌肝的含量，说明它不影响家兔的肝肾功能。动物的组织切片表现出病理改变，但各组之间无明显差异，说明三七总皂苷脂质体对家兔肝、肾及肾上腺组织不引起明显病理变化。

C.三七总皂苷脂质体大鼠肌肉长期毒性试验

1.材料

1.1受试物：三七总皂苷脂质体

1.2实验动物：健康大鼠

2.方法

2.1动物分组：健康大鼠96只，雌雄各半，体重200～220g，每组24只动物。

2.2给药剂量：

三七总皂苷脂质体肌肉注射LD₅₀为六个剂量组分别为684.12～452.96mg/kg，设三个剂量组为120mg/kg、70mg/kg、40mg/kg和一个生理盐水对照组，分别为0.05-0.12ml/kg体重肌肉注射给药，对照组按0.12ml/kg体重肌肉注射给药，连续肌肉注射给药30天。

2.3方法：

给药观察记录动物中毒表现及死亡情况。死亡动物立即作解剖，肉眼观察各主要脏器的中毒性病变，存活动物继续饲养观察一周。

3.实验结果

3.1在30天的实验期内，每天观察动物一般情况，记录进食量，每周称量体重一次，调整进食量和给药量。结果显示：动物进食量和体重随剂量的增加动物的进食量和体重增长则下降，具有高度显著性差异。试验结果见表5。

               表5三七总皂苷脂质体大鼠肌肉长期毒性试验结果

	实验前体重	实验后体重	增重
				对照组	192.14±18.6	241.47±20.50	60.80±20.40
低剂量组	193.64±19.1	247.63±21.34	55.43±19.14
				中剂量组	198.84±20.3	244.99±21.06	49.67±19.52
高剂量组	181.8±20.0	229.01±26.74	2 7.59±11.0*

*与对照组、低剂量组、中剂量组三组比较有显著性差异(p＜0.01)。

3.2血液学检测与结果

红细胞和血红蛋白随给药剂量的增高而降低，而白细胞数随着剂量增高而增高，血液学检测观察的三项指标的变化均在正常范围内波动。

3.3血液生化检测与结果

血清谷草转氨酶氨基转移酶随着给药剂量的增高而酶活性增强，而血清白蛋白的量则随着给药剂量增高而降低。

3.4系统尸体解剖和病理组织学检查

3.4.1对实验动物进行尸体解剖，肉眼观察四组均未发现特殊异常改变。对脑、心、肝、脾、肺、肾、子宫、睾丸、前列腺、垂体、胸腺、肾上腺准确称量计算脏器系数(脏/体比值)。结果见表6。

             表6.三七总皂苷脂质体肌肉注射对大鼠脏器系数的影响

器官	对照组	低剂量组	中剂量组	高剂量组
					脑	0.639±0.109	0.685±0.107	0.681±0.106	0.710±0.15
心	0.379±0.055	0.392±0.051	0.384±0.049	0.407±0.049
					肝	4.18±0.701	4.31±0.690	5.55±0.805	5.64±0.993
脾	0.437±0.10	0.461±0.07	0.48±0.14	0.5±0.14

续表

肺	0.741±0.056	0.762±0.049	0.846±0.041	0.855±0.053*
					肾	0.625±0.1	0.685±0.11	0.695±0.08*	0.771±0.09*
子宫	0.26±0.03	0.27±0.041	0.28±0.039	0.28±0.04
					睾丸	1.21±0.1	1.26±0.14	1.28±0.14	1.3±0.22
前列腺	0.09±0.02	0.09±0.018	0.10±0.021	0.10±0.02
					垂体	0.0041±0.0017	0.0049±0.0018	0.0042±0.0013	0.0052±0.0021
肾上腺	0.180±0.047	0.168±0.049	0.173±0.05	0.188±0.053
					胸腺	0.031±0.01	0.035±0.011	0.033±0.012	0.034±0.009

*与对照组、低剂量组两组比较有显著性差异(p＜0.05)。

3.4.2每组随机抽取1/3动物进行脑、心、肝、脾、肺、肾、子卵巢、睾丸、前列腺、胸腺、胸骨、肾上腺、淋巴结、胃肠、脑垂体等脏器进行病理组织学检查，发现高剂量组动物肝脏出现轻微的肝细胞浊肿，动物肾脏出现变性，坏死病理组织学改变，其余各组未见异常。

4.讨论

三七总皂苷脂质体对大鼠肌肉注射30天长期毒性试验结果显示高剂量组有一定毒副作用。主要表现为动物食欲和体重下降，血清谷草转氨酶氨基转移酶活性增强和血清白蛋白的含量降低。病理组织学发现肝脏细胞有轻微的浊肿、胞浆疏松现象。肾脏亦出现变性现象。中、低剂量组毒副反应不明显。

文献报道的血塞通注射液大鼠肌肉注射长期毒性实验显示三七总皂苷中、高剂量时肝脏细胞有浊肿、胞浆疏松、气球样等变性，肾脏出现坏死，低剂量毒副作用不明显。由此可见三七总皂苷经脂质体包裹后毒性降低，对肝、肾的毒副作用降低。

D.三七总皂苷脂质体透过小鼠血脑屏障的动态研究

三七总皂苷治疗心脑血管疾病效果较好，由于用于治疗中风偏瘫、动脉粥样硬化性血栓性脑梗塞、脑栓塞、视网膜中央静脉阻塞脑部，本发明深入研究三七总皂苷脂质体透过血脑屏障的过程，对了解脂质体的靶向治疗的特点有重要意义。

1.材料

三七总皂苷、三七总皂苷脂质体

2.实验动物

昆明种小鼠300只，体重18～22g

3.实验方法

将小鼠分成15组，每组5只。三七总皂苷脂质体用生理盐水溶解成浓度为0.1mg·mL^-1，以0.01ml·g^-1(体重)单剂量尾静脉注射给药，使药物剂量达到1mg/kg。在给药后5、10、15、30、45、60、90、12 0、180、240、300、420、600、1200、1800s断头取血，迅速收集血液于肝素化的离心管中，3000r·min^-15，取0.25ml血浆保存。剥离脑组织后含脑组织0.1g·ml^-1的比例加入生理盐水制成10％脑匀浆。鼠血浆及脑匀浆均保存于-20℃冰箱，待测。对照组用三七总皂苷以同样的方法制成脑匀浆，待用。脑匀浆中的三七总皂苷用HPLC测定含量。

应用Intergration plot法定量解析药物透过血脑屏障的过程。小鼠药动学参数AUC用计算机处理求得，以脑内浓度对血浆中浓度比(K_p，c_b/c_p)为纵轴，血浆中浓度曲线下面积对血浆中浓度比(AUC/c_p)为横轴，反映K_p，与AUC/c_p的关系。该曲线符合二室模型，通过计算机处理，以非线性最小二乘法求出流入系数(K₁)及排出系数(K₂)的关系，以定量反映药物移行入脑的过程。

4.实验结果

三七总皂苷脂质体静脉注射后K_p与AUC/c_p比值见表1。血浆药时曲线计算机处理得AUC＝298.36[s(μgL^-1)]。药物从脑内排出速率K₂(0.00229±0.0031)s^-1，约为进入速度K1(0.00123±0.0001)s^-1的2倍(K₁/K₂＝0.50)AUC/c_P值在2000s左右时，K_p值达到稳定状态。

对照组静脉注射后K_p与AUC/c_p比值见表2。血浆药时曲线计算机处理得AUC＝298.36[s(μgL^-1)]。

               表7.小鼠静脉注射三七总皂苷脂质体的Kp和AUC/Cp比值

时间	三七总皂苷脂质体组		对照组
					Kp	AUC/Cp/s	Kp	AUC/Cp/s
	5	0.193±0.031	319.34±120.13	0.175±0.021					314.1±120.3
10					0.274±0.030	329.15±65.33	0.21±0.036	319.9±50.33
	15	0.361±0.017	333.6±100.26	0.29±0.011					326.01±115.31
30					0.46±0.029	500.2±110.2	0.379±0.045	494.7±100.2
	45	0.483±0.063	684.3±189.6	0.421±0.023					679.2±169.6
60					0.521±0.009	741.3±105.2	0.479±0.036	763.45±100.6
	90	0.603±0.041	931.7±136.2	0.501±0.052					930.06±123.6
120					0.685±0.015	1020.3±165.2	0.511±0.012	1010.31±111.6
	150	0.703±0.081	1037.14±200.32	0.52±0.032					1019.7±145.9
180					0.711±0.049	1083.21165.6±	0.522±0.041	1080.7±165.3
	240	0.725±0.037	1280.31±130.6	0.529±0.013					1273.4±132.1
300					0.73±0.017	1291.3100.2±	0.53±0.023	1272.01±103.2
	420	0.765±0.006	1563.2±312.6	0.532±0.015					1551.8±300.6
600					0.78 7±0.046	2541.3±400.1	0.523±0.036	2520.3±400.21
	1200	0.791±0.035	3990.5±436.3	0.533±0.031					3981.5421.31±
1800					0.803±0.003	4503.2±412.8	0.531±0.006	4490.31±452.0

5.讨论

脂质体具有类生物结构，包裹三七总皂苷后，药物脂溶性增加后容易透过血脑屏障，Kp值随着时间的延长而上升，此时药物进入脑内的过程占优势，使药物在脑内快速的分布，当AUC/c_P值在2000s左右时，Kp值达到稳定状态。药物从脑内排出速率K₂约为进入速度K₁的2倍，说明脂质体运载着药物在一定时间内使进入脑内的药量与排出脑内的药量达到动态的平衡，随着时间的延长最终使脑内的药量减少。

由于三七总皂苷脂质体的脂溶性比三七总皂苷强，因此透过血脑屏障的速率及血药浓度值均比三七总皂苷大。由此可见三七总皂苷脂质体比三七总皂苷更易通过血脑屏障。

E.三七总皂苷脂质体在小鼠体内的组织分布

本文研究了三七总皂苷脂质体在小鼠灌胃给药后全血及心、肝、脾、肺、肾、皮肤各组织的分布特征，并与三七总皂苷相比较。

1.实验材料

三七总皂苷(对照组)，三七总皂苷脂质体，昆明种小鼠，体重18～22g，雌雄不限。

2.实验方法

小鼠摘眼球取血0.5ml于肝素化离心管中。断颈处死后将各器官(心、肝、脾肺、肾、皮肤)取出，用蒸馏水冲洗后再用滤纸吸干水分，称重，然后置于匀浆器中，加入2ml重蒸馏水，匀浆。匀浆液转移至离心管中，加入5.0ml复合溶剂(乙醚、正己烷各2.5ml)，涡旋混和5.0min，821g离心5min，取上层有机溶剂3.0ml，吹干。然后加入1ml乙醚，涡旋混和1.0min，自然挥干，最后加入100μL正己烷，涡旋混和1.0min，821g离心5.0min，取下层液20μL进样。

取小鼠120只，随机分成20组，每组6只，给药前1d晚间禁食。前10组小鼠按24mgkg^-1的剂量灌胃给以三七总皂苷，后10组小鼠给以等剂量三七总皂苷脂质体。给药后各组分布在0.25，0.5，1，1.5，2，4，6，8，12，24h取血及各器官，样品经预处理后进行HPLC分析。

3.实验结果

小鼠灌胃给予三七总皂苷脂质体后的AUC_0-24(药-时曲线下面积)低于灌胃给予的三七总皂苷的AUC_0-24，MRT(平均滞留时间)则大于三七总皂苷的。对两种药物的AUC_0-24和MRT进行了统计学分析，结果见表1，2种药物在肾中的AUC_0-24无显著性差异。而在全血、心、肝、脾、肺、皮肤中的AUC_0-24的均有显著差异。在全血及各组织中的MRT有显著差异。且由表可见小鼠灌胃给予三七总皂苷脂质体后全血、心、肝、脾、肾中药物浓度的达峰时间(Tm)均早于灌胃给以三七总皂苷后的Tm。小鼠灌胃给予三七总皂苷脂质体后肝、肾组织中的AUC_0-24较大，AUC_0-24由大到小的顺序为脾、肺、心、皮肤；而灌胃给予三七总皂苷后，肝组织的AUC_0-24明显大于其它其它组织，AUC_0-24由大到小的顺序为肾、脾、肺、心、皮肤。试验结果见表8。

                  表8.三七总皂苷脂质体在小鼠体内的组织分布

组织	三七总皂苷脂质体组			对照组
							AUC0-24	MRT/h	Tm	AUC0-24	MRT/h	Tm
	全血	21±3b	7.0±0.1c	0.74±0.2	31±9	6.0±0.2							1.5±0.5
心							52±9	7.0±0.12c	1.4±0.3	88±12	5.51±0.3	1.7±0.6
	肝	100±20c	7.6±0.4c	0.64±0.2	180±30	4.90±0.06							1.6±0.1
脾							84±15b	8.3±0.3c	1.0±0.2	115±14	6.10±0.03	2.1±0.9
	肺	65±11c	6.9±0.1c	1.6±0.1	107±10	5.30±0.05							1.2±0.3
肾							102±25a	7.7±0.3c	1.0±0.6	116±12	4.39±0.12	1.3±0.6
	皮肤	1.60±0.01b	12.0±0.3c	3.3±0.8	2.0±0.2	7.61±0.022							4.0±0.4

*2组药物间比较：^aP＞0.05，^bP＜0.05，^cP＜0.01。

4.讨论

将三七总皂苷包封于脂质体中有利于药物渗透透过胃肠道粘液层，由于粒径小，可促进摄取及正常的胃肠道内吞作用。磷脂作为细胞膜组成成分，可以增加内化，提高淋巴循环的吸收。

由于脂质体到达胃肠道后受到胆盐和胰脂酶的消化作用，遭到部分破坏，只有部分完整的脂质体包裹药物进入血液，分布入组织，因此血液和各组织中的药物浓度较快达到峰值，尤其是肝、脾、肾等血流量较为丰富的组织中的药物浓度，与血药浓度几乎同时达到了峰值。但与三七总皂苷比较，除肾组织外，药物在其他组织及血液中的浓度均较低。但同时说明只有部分完整吸收的脂质体吸收进入血液和组织，部分完整吸收的脂质体在血液和组织中可能形成贮库，从而缓慢释放药物，延长了MRT，尤其对皮肤有明显的滞留现象。MRT延长的另一个因素可能是泄漏的药物在胃肠道缓慢的吸收。

F.三七总皂苷脂质体对小鼠巨噬细胞的作用

三七总皂苷能增加动脉血流量，扩张血管、降低动脉血压及心肌耗氧量，提高机体功能及对缺氧的耐受力，并有抑制血小板聚集、降低血粘度等作用。当三七总皂苷剂量为160mg/kg时，可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数，且当连续给药2天以上，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能显著提高，并随给药次数增加而有增强趋势。本文观察了三七总皂苷脂质体(样品组)，单纯三七总皂苷(对照组)，单纯脂质体(空白组)对小鼠免疫功能的影响。

1.材料和动物

三七总皂苷脂质体和昆明小白鼠，体重20g左右。分成四组，每组30只：I组三七总皂苷脂质体，II组单纯三七总皂苷，III组单纯脂质体，IV组生理盐水。

2.剂量：注射三七总皂苷脂质体160mg/kg，每日1次，连续腹腔注射10次。

3.方法

3.1酸性磷酸酶测定法

巨噬细胞溶酶体中富有此酶。细胞一经激活，溶酶体数量增加，酸性磷酸酶随之亦显著上升，是巨噬细胞激活的可靠指标之一。

3.2碳粒廓清试验

将印度墨汁用2倍生理盐水稀释后，按160mg/kg经小鼠尾部静脉注入体内，分别于1、5、10分钟各取眼眶血50μl，并用5ml 0.1％碳酸钠稀释，测读650nm的光密度。

3.3小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能测定

实验时将2.5％鸡红细胞悬液1ml注入小鼠腹腔，30min后脱颈椎处死动物，再用2ml Hank液冲洗腹腔，冲洗液滴片，37℃温箱保温30min，瑞氏染液染色，油镜或高倍镜下检查200个有吞噬能力的巨噬细胞，然后计算出每百个细胞内平均被吞噬消化的鸡红细胞数，即为该鼠腹腔巨噬细胞吞噬消化指数。

3.4 EA花环试验

取小鼠腹腔液滴于载玻片上，在37℃下放置2小时，洗去非粘附细胞，滴加EA悬液，在4℃下放置2小时，然后轻轻洗涤玻片除去游离的EA，经0.025％戊二醛固定，Geimsa染液染色，随机镜检200只单核细胞，以周围粘附有5个或5个以上EA的巨噬细胞作为一个花环，计算花环形成率。

4.结果

4.1腹腔巨噬细胞酸性磷酸酶测定

每组8只小鼠，注射后第4天，用营养液洗出小鼠腹腔细胞。调整到4×10⁶/ml。将同组内4只小鼠的腹腔细胞作等量混和，移放2ml到组织培养瓶内，37℃30分钟，使细胞帖壁，洗去吸附细胞后，反复冻融6次，取细胞裂解物测定酶活力。结果见表9。

         表9.四组小鼠巨噬细胞酸性磷酸酶的测定(金氏单位)

	酸性磷酸酶( X±SE)	P值
			I	2.03±0.17
II	1.16±0.19	P＜0.01
			III	0.59±0.1	P＜0.01
IV	0.57±0.09	P＜0.05

4.2对碳粒廓清率的影响

注射后1周，在注入墨汁后1～10分钟内，比较四组小鼠廓清碳粒的能力，试验结果见表10。

                           表10.四组小鼠廓清碳粒能力(OD值)的比较

	动物数	OD值(650nm)
					1分钟	5分钟	10分钟
		I	8	0.119±0.021				0.028±0.011	0.017±0.016
II	8				0.215±0.022	0.115±0.017	0.059±0.010
		III	8	0.236±0.03				0.1 29±0.017	0.058±0.009
IV	8				0.276±0.035	0.149±0.015	0.071±0.011

表10显示，对廓清碳粒能力I＞II、III、IV组(P＜0.001)，即小鼠经三七总皂苷脂质体注射后1周，MPS(单核吞噬细胞系统)对廓清碳粒能力显著提高。

4.3腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

注射后1、5天，测定四组小鼠腹腔巨噬细胞功能，见表11。

              表11.四组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞功能比较

	动物数	吞噬消化鸡红细胞平均指数		P值
					第1天	第5天
		I	11				1.85	2.06
II	11			0.67	0.71	P＜0.01
		III	11				0.47	0.46	P＜0.01 P＞0.05
IV	11			0.24	0.25	P＞0.05

表11显示，小鼠经三七总皂苷脂质体注射后1～5天，腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力均较其余三组显著增强。

4.4对小鼠腹腔巨噬细胞Fc受体的影响

注射后2周，镜检时发现经三七总皂苷脂质体激活的巨噬细胞伸展能力增强。

5、讨论

单核巨噬细胞是参与免疫反应的一类十分活跃的细胞，它在非特异性免疫、体液免疫、细胞免疫以及肿瘤免疫等方面都起到重要作用。在正常条件下，巨噬细胞处于休止状态，活性较低，但可为免疫增强剂所激活。休止状态的巨噬细胞一经激活，在形态、代谢和功能上均可出现明显的变化。本文观察和比较了三七总皂苷脂质体、单纯三七总皂苷、单纯脂质体对小鼠单核巨噬细胞系统的不同影响。实验结果表明三七总皂苷脂质体对MPS具有较强的激活作用，并具有以下特点：

①通过脂质体的介导。由于脂质体的主要成分是类脂，与细胞膜的脂质成份相似，因此极易为巨噬细胞膜所接受。巨噬细胞可通过吞饮和融合两种方式将脂质体摄入细胞内，被摄入的脂质体可改变巨噬细胞的代谢过程，有氧代谢过程中产生的O₂和H₂O₂是细胞杀死所吞入的细菌和异体的有力武器；当脂质体经溶酶体酶裂解，释出的三七总皂苷则在局部达到高浓度，增强了其激活巨噬细胞的效应，使吞噬功能亢进。

②激活维持时间长，其原因多是三七总皂苷脂质体在体内停留时间较单纯的三七总皂苷长。

③三七总皂苷剂量为160mg/kg时，可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数，而实验结果证明三七总皂苷脂质体160mg/kg时对巨噬细胞的吞噬作用与三七总皂苷相比有显著性的提高。

G.三七总皂苷脂质体对脑血循环的作用

1.材料

1.1药物  三七总皂苷脂质体、三七总皂苷注射液(50mg/ml)、对照品用盐酸罂粟碱(30mg/ml)、酒石酸去甲肾上腺素(NA)(5mg/ml)、生理盐水。

1.2动物  狗14只，体重10.0～18.0kg

1.3其他  玻璃气泡流量计

2.方法

静脉注射戊巴比妥钠麻醉动物，颈正中线切开皮肤，分离二侧颈总动脉及枕动脉，静注肝素，后补充抗凝。流量计进、出口分别与一侧颈总动脉近、远心端连接。在颈动脉窦处结扎除颈内动脉外的动脉分支，并结扎对侧颈总动脉。从颈内动脉注入溴酚蓝观察，认为颈内动脉血流量基本能代表脑血流量，实验结束后，取脑称重，计算100g脑组织血流量的毫升数，将血压除以血流量，即得血管阻力值。

3.结果

3.1三七总皂苷脂质体对正常脑血循环的作用见表12。

3.2去甲肾上腺素引起脑血管功能改变时三七总皂苷脂质体对脑血循环的作用。六只狗麻醉后静脉滴注去甲肾上腺素，血压维持在较恒定得高水平滴注后CBF减少，CVR增加，这时脑血管处于紧张状态。颈内动脉注射三七总皂苷脂质体，六只狗平均CBF明显增加(P＜0.05)，CVR明显改善。试验结果见表13。

         表13.脑血管功能状态改变时注射三七总皂苷对脑血流动力得作用

	脑血流量(ml/100克·分)	脑血管阻力(毫升汞柱/ml/克·分)	血压(毫升汞柱)
				对照	67.9±21.0	2.2±0.9	149±16
滴注NA	52.7±26.0	4.2±1.6	181±23
				滴注NA+三七总皂苷	63.4±13.0	2.5±0.7*	173±21
滴注NA+三七总皂苷脂质体	65.1±14.1	2.3±0.5*	168±23

与滴注NA比较，*P＜0.05。

滴注后观察15分钟，三七总皂苷脂质体和三七总皂苷的峰值都出现在1分钟内，说明两种药都可使处于收缩状态的脑血管扩张，使紧张的脑血管功能回复正常。

4、讨论

通过实验可以看出三七总皂苷脂质体和三七总皂苷都对正常的脑血管无明显影响，都可使收缩状态的脑血管扩张，使紧张的脑血管功能回复正常。

H.三七总皂苷脂质体对心脏血流动力学的作用

                                     表12.三七总皂苷脂质体对正常脑血循环的作用

药物	剂量(毫克/公斤)	注药	脑血流量			脑血管阻力			血压(毫米汞柱)
										高峰值		3分钟平均增减值	高峰值		3分钟平均增减值
			(毫升/100克·分)	增减(％)	(毫升/汞柱/毫升/100克·分)	增减(％)
							三七总皂苷脂质体	4.0		前后	58.1±16.164.6±17.0		9.0±7.3	-2.1±9.9		2.5±0.32.4±0.1	-7.3±5.1	-2.0±10.0	136±22132±23
8.0	前△后	63.4±20.066.0±20.1	4.3±3.9	-0.88±2.8	2.5±0.62.2±0.6	-11.5±4.8			3.7± 8.0			140±17118±20
								16.0		前△后	48.0±11.947.5±13.0		-3.1±8.0	-12.2±7.0	2.6±0.32.5±0.1	-8.9±7.3	-3.1±5.1	132±30108±26
三七总皂苷	16.0	前后	49.3±11.948.2±13.8	-3.5±8.0	-12.1±6.3	2.6±0.62.5±0.9			-8.3±9.6			-2.9±5.8							137±28112±26
							生理盐水	0.5		前后	66.3±22.068.1±22.1		2.3±6.0	-4.8±5.8	2.6±0.72.4±0.9	-4.5±5.0	1.7±6.0	158±27166±26
罂粟碱	0.1	前后	50.7±18.684.9±21.0	86.1±66.3	53.1±44.0	2.8±0.61.7±0.3			-48.2±18.6			-29.1±13.8							135±46134±37

与生理盐水组相比*P＜0.05，**P＜0.01

1.三七总皂苷脂质体对血流动力学的作用

1.1三七总皂苷脂质体对猫心脏收缩性、作功耗氧和前、后负荷的影响

猫6只，体重2.0±0.1kg，开胸后分离升主动脉以电磁流量计记录流量作为心输出量(CO)。用塑料管从心尖部插入左心室腔内，接压力换能器记录左心室内压(LVP)，再输入EQ-600G压力处理器求出心室内变化速率。经外颈静脉插管记录中心静脉压(CPV)。记录颈总动脉血压(BP)、心电图(ECG)并计算心率(HR)。根据记录计算心脏指数(CI)、心博指数(SI)、左室作功指数(LVWI)和外周血管总阻力(TPVR)。

结论：iv三七总皂苷脂质体15mg/kg使dp/dt_max显著下降，t-dp/dt_max显著延长，说明对心脏收缩性有抑制作用，三七皂苷脂质体的CO、CI和SI不下降或增加，TPVR和LVP显著下降，LVEDP和CVP无显著变化，BP显著下降，HR变化不明显，LVWI和TTI/min显著降低，这些情况都和三七总皂苷的情况相同。

1.2三七总皂苷脂质体对猫下肢血管阻力的影响

猫5只，体重2.0±0.4kg，从颈总动脉引血液用蠕动泵恒速灌流股动脉，以股动脉血压为血管阻力指标。结果见表14。

表14.

	颈总动脉血压(BP)下降程度	下肢血管阻力
			三七总皂苷	32±9％	30±11％
三七总皂苷脂质体	35±3％	29±7％

两组实验的后者发生时间与血液从颈总动脉引出后灌流至股动脉所需时间一致，说明两种药物都随血液循环到下肢后才起降低血管阻力作用。

2.三七总皂苷脂质体降压实验

2.1对猫、兔的降压效果

猫6只，1.8±0.3kg，兔5只，2.6±0.2kg，二者的实验结果均显示对猫和兔均有降压作用，猫的降压效果强于兔的，三七总皂苷脂质体的潜伏期7-15秒，降压时间0.3-2.5秒，HR变化不显著。三七总皂苷的潜伏期10-20秒，降压时间0.5-3秒，HR变化不显著。

2.2对脊髓猫的降压作用

iv三七总皂苷脂质体为10mg/kg，iv三七总皂苷脂质体为10mg/kg，分别用脊髓猫和整体猫实验，猫5只，1.8±0.1kg，乙醚麻醉后常规制备脊髓猫。整体猫，6只，体重1.6±0.3kg，实验结果见表2，三七总皂苷脂质体的降压程度和持续时间均无显著差异，三七总皂苷的降压程度和持续时间均无显著差异。

表15.

	颈总动脉血压(BP)(单位：mmHg)
								前	后	下降程度	持续时间
	三七总皂苷	脊髓猫	74.1±12	54.3±9	26±5％	41±15s							P＞0.05
整体猫							143±18	103±10	28±5％	51±16s
		三七总皂苷脂质体	脊髓猫	74±11	50±6	31±6％					47±10s	P＞0.05
整体猫	143±17						100±14	32±7	58±17s

2.3阿托品对三七总皂苷脂质体降压作用的影响

猫6只，体重2.0±0.1kg，iv阿托品1mg/kg，iv三七总皂苷脂质体10mg/kg，iv三七总皂苷10mg/kg，三七总皂苷脂质体的降压程度持续时间均无显著差异。三七总皂苷的降压程度持续时间均无显著差异。结果见表16。

表16.

	颈总动脉血压(BP)(单位：mmHg)
						前	后	降压程度	持续时间
	三七总皂苷	133±10	98±11	26±9％	45±13						P＞0.05
114±14						85±12	26±7％	41±10
		三七总皂苷脂质体	132±11	92±13	30±6％				50±10	P＞0.05
133±9	81±6					31±4％	51±8

2.4总皂苷脂质体对肾上腺素升压作用的影响

猫6只，体重2.3±0.2kg，切断双侧迷走神经，8只未切断迷走神经的猫(体重2.0±0.3kg)，iv三七总皂苷脂质体10mg/kg，降压程度和持续时间均无显著差异。iv三七总皂苷10mg/kg，降压程度和持续时间二者均无显著差异。结果见表17。

表17.

	颈总动脉血压(BP)(单位：mmHg)
								前	后	下降程度	持续时间
	三七总皂苷	切断	124±10	85±14	31±9％	42±7s							P＞0.05
未切断							143±17	103±18	28±8％	52±6s
		三七总皂苷脂质体	切断	123±11	80±10	38±4％					48±4s	P＞0.05
未切断	144±16						98±20	32±2％	56±7s

iv三七总皂苷脂质体10mg/kg前后iv肾上腺素1ug/kg使分别从127±11mmHg升至83±12mmHg和从147±14mmHg升至82±11mmHg。前后对比无显著差异(P＞0.05)。

3.讨论

三七总皂苷脂质体使dp/dt_max显著下降，t-dp/dt_max显著延长，说明对心脏收缩性有抑制作用，TTI反映心肌耗能耗氧情况，三七总皂苷脂质体在整体猫不减少CO和SI情况下使TTI和LVWI显著下降。这是由于后负荷降低，在抑制心肌收缩性情况下SI仍增加，而心肌耗能耗氧却降低，三七总皂苷脂质体使压力功下降，有节能意义。这与三七总皂苷的降压机制是一致的。

脊髓猫实验结果说明降压作用主要为非中枢性。阿托品切断双侧迷走神经影响三七总皂苷脂质体的降压作用，三七总皂苷脂质体对肾上腺素升压作用无影响，说明降压与植物神经系统及组织胺释放无关。主要是直接扩张血管，也可能与抑制心脏收缩有关。

三七总皂苷脂质体同三七总皂苷一样能够降低血压和心脏耗氧量，不减少整体动物的心输出量。而且同剂量时三七总皂苷脂质体的降压效果和持续时间明显大于三七总皂苷的。

综上所述，与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.三七总皂苷包封于脂质体后，可靶向到达病变部位，发挥疗效，从而减少了给药剂量，并能够降低药物毒性，增强药理作用。脂质体本身对人体毒性小，并且脂质体对人体无免疫抑制作用。

2.脂质体制剂可延缓或控制药物的释放，降低药物的消除速率，延长药物的作用时间，增加药物的体内外稳定性。

3.三七总皂苷是水溶性物质，容易包封在脂质体中，制备工艺简单。制成脂质体后可进一步加工成注射剂、透皮制剂、气雾剂、口服液、眼用制剂、片剂、胶囊、颗粒剂等多种剂型。

4.药物包裹在脂质体中是非共价键结合，而有些药物载体是以共价键与药物结合后进入体内，这种由共价键结合的药物不易与载体脱离，影响药效，而脂质体中的三七总皂苷进入人体后可在指定部位完全释放出来；①肌内注射和皮下注射脂质体首先进入淋巴管，最后进入血液循环并具有长效作用；②脂质体口服给药可保护被包封的三七总皂苷不被胃肠道的酶破坏，并一定程度上促进药物被胃肠道吸收；③脂质体还可在肺内、心脏或关节腔等部位注射，增加隔室靶向性；④脂质体眼部给药时，因脂质体对外眼组织、结膜和巩膜具有更强的亲和力，滴眼后可迅速分散，增强药物对角膜的穿透性；⑤皮肤给药时，可使药物与治疗量透入皮肤并可维持恒定的释放，并具有促进药物吸收等作用特点。

                          附图说明

图1为三七总皂苷脂质体的小鼠脑内Integration plot结果

1.为三七总皂苷脂质体；2.为三七总皂苷。

                          具体实施方式

通过下面给出的具体实施例及应用实施例，可以进一步清楚地了解本发明。但它们不是对本发明的限定。

实施例1

将三七总皂苷30g溶于pH7.2磷酸缓冲液中，在氮气流下加入由大豆磷脂120g，胆固醇50g、磷酸二鲸蜡脂10g溶于200ml氯仿制成的溶液中，减压蒸发除去氯仿，残液经超声分散，分散出脂质体，加适量缓冲液稀释即得三七总皂苷脂质体溶液。

实施例2

将卵磷脂40g和胆固醇50g溶于乙醚中，加入用4mmol/L磷酸盐缓冲溶液配成的含8g的三七总皂苷溶液，超声波处理2分钟，立即在水浴上减压旋转蒸发至呈现凝胶状，旋涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚，超速离心30分钟，分离除去未包入的三七总皂苷，沉淀用水洗2次，离心，得到沉淀，用10mmol/L的磷酸盐缓冲溶液稀释即得三七总皂苷脂质体溶液。

实施例3

取蛋黄卵磷脂80g、胆固醇20g、十八胺10g共溶于无水乙醇中等共溶于乙醇中，减压除去乙醇，形成膜，加入含10g三七总皂苷磷酸缓冲液中，振摇使膜脱下，超声波处理20分钟，离心除去未包封的药物，得到脂质体混悬液。

实施例4

取脑磷脂120g、胆固醇60g等共溶于乙醚中，然后滴注于60℃的含三七总皂苷80g的缓冲盐溶液中，继续搅拌至乙醚挥尽，加适量缓冲盐溶液即得三七总皂苷脂质体溶液。

实施例5

取卵磷脂100g分散于等渗的磷酸盐缓冲液(取NaH₂PO₄和Na₂H₂PO₄用纯化水配成的pH7的缓冲溶液)中，超声波处理，加适量甘露醇混匀，在真空下冷冻干燥，随即用含110g三七总皂苷的上述缓冲液振摇进行分散，进一步超声处理，即得均匀的三七总皂苷脂质体混悬液。

实施例6

取三七总皂苷2.0g、大豆磷脂3.0g、胆固醇0.5g溶于60ml乙醚中，加入磷酸缓冲液100ml(含磷酸二氢钠-2H₂O0.2g，磷酸二氢钠3.5g)摇匀，超声波振荡30分钟，转入薄膜旋转仪，蒸发乙醚至尽，即得三七总皂苷脂质体，滤过，灌封于安瓿中，注射用水加至100ml，经100℃水浴30分钟灭菌，即得三七总皂苷脂质体注射液。

实施例7

取卵磷脂94g、胆固醇47g溶于2.6ml乙醚中，磁力搅拌，缓慢滴入已加热的10ml三七总皂苷滴眼液中，保持50℃，继续搅拌30分钟，除去乙醚，灭菌即得三七总皂苷脂质体滴眼液。

实施例8

取注射用的三七总皂苷8g、磷脂70g、胆固醇10g置圆底烧瓶内，加适量乙醇溶解至澄清，恒温水浴减压干燥成膜，加含2g赖氨酸的甘露醇(含15g甘露醇)溶液解膜，超声波振荡，再用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于安瓿内，进行冷冻干燥，通惰性气体封口即得三七总皂苷脂质体冻干粉制剂。

实施例9

将卵磷脂70g、胆固醇10g、油酸7g溶于有机溶剂中，抽气形成磷脂类薄膜，溶于乙醚中，加入含10g三七总皂苷的水溶液，超声波乳化，采用逆向蒸发法制备得到三七总皂苷脂质体溶液，加入矫味剂适量，灌封于口服液瓶中，灭菌，即得三七总皂苷脂质体口服液。

实施例10

称取胆固醇10g、磷脂酰胆碱和VitE适量共溶于乙醚中，另取三七总皂苷10g、稳定剂和吐温-80适量于磷酸盐缓冲液-甲醇(重量比为2∶1)中溶解，再与上述乙醚液混合，超声波处理，减压蒸发除去有机溶剂至得到半固体胶状物，真空干燥，再以适量磷酸盐缓冲液水合，于冰水浴中超声，以0.15μm的微孔滤膜过滤，得到三七总皂苷脂质体。另取少量卡波姆，加甘油润湿研匀，加入上述脂质体中，加入适量水并搅拌，溶胀后加入少量三乙醇胺，调节PH值至7.0-7.5，补足纯化水，搅匀，即得三七总皂苷脂质体凝胶剂。

实施例11

将120g卵磷脂的乙醇液与5.0g二氯二氟甲烷混合成有机相，含有15g三七总皂苷的5％乙醇液为水相，进行灌装，每次开阀门放出50μl有机相及100μl水相，即制成三七总皂苷脂质体气雾剂。

Claims (5)

1.一种三七总皂苷脂质体，按重量百分比，该脂质体含有如下组份：三七总皂苷5％～30％，膜材50％～80％，胆固醇、十八胺或磷脂酸1％～10％，以及余量的其它辅料。

2.根据权利要求1所述的三七总皂苷脂质体，其中所述的膜材选自卵磷脂、豆磷脂、脑磷脂、磷脂酰乙醇胺、胆固醇乙酰脂、β-谷甾醇、牛胆酸钠、神经鞘磷脂、二鲸蜡磷酸酯或其它合成磷脂中一种，或它们的混合物。

3.根据权利要求1所述的三七总皂苷脂质体，其中所述的其它辅料选自甘露醇、葡萄糖、吐温-80、维生素E或聚乙二醇中的一种。

4.根据权利要求1所述的三七总皂苷脂质体，其特征在于按重量百分比该脂质体含有如下组份：三七总皂苷5％～30％，大豆磷脂50％～80％；胆固醇1％～10％。

5.根据权利要求1所述的三七总皂苷脂质体，其特征在于其剂型为注射剂、透皮制剂、气雾剂、口服液、眼用制剂、片剂或胶囊。

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