CN1923223A - 一种纳米参芪扶正注射制剂的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米参芪扶正注射制剂的制备方法及其应用，将党参和黄芪的总提取物与适宜的药用辅料采用本发明工艺方法制成纳米载体，并制备成水针剂、冻干粉针剂和输液剂。采用本发明方法制备的制剂有明显的靶向作用，溶解性好、理化性质稳定、载药量大并且制剂稳定性显著提高；本发明制剂安全性更好、刺激性小，能显著提高扶正固本、益气补虚等功效。本发明制剂能显著提高癌症病人的生活质量，减轻化疗后癌症病人的疾病痛苦。药理研究表明该制剂在活血化瘀、补气养血、提高机体免疫力、辅助癌症晚期的治疗效果等药效作用方面均有显著性提高。
Description
技术领域
本发明属于中药制药技术领域，具体涉及一种纳米参芪扶正注射制剂的制备方法及其应用。
背景技术
纳米中药主要是指运用纳米技术制造的，粒径小于100纳米的中药有效成分、有效部位、原药及复方制剂。纳米中药的制备是研究纳米中药最基础、最重要的问题。将纳米技术引入中药的研究时，必须考虑中药组方的多样性、中药成分的复杂性。中药的有效部位和有效成分又包括无机化合物和有机化合物、水溶性成分和脂溶性成分等。因此，针对不同的药物，在进行纳米化时必须采用不同的技术路线。纳米中药与中药新制剂关系十分密切，如何在中药理论的指导下进行纳米中药新制剂的研究，将中药制成高效、速效、长效、计量小、低毒、服用方便的现代制剂，也是进行中药纳米化时必须考虑的问题。
参芪扶正注射液是采用我国传统扶正补气药物党参、黄芪为主要原料，采用水提取醇沉淀的方法分离出有效成分配制而成的静脉型大输液，具有扶正固本、益气补虚的功效，与化疗合用有助于提高疗效，保护血象，可改善患者免疫功能，改善气虚症状及生存质量。经多年的临床应用表明，参芪扶正注射液有抑制肿瘤细胞生长的作用，对气虚型的晚期肿瘤患者有较好的治疗效果，具有益气健脾、补气养血的扶正作用，可与化疗配合，用于气虚证肺癌、胃癌的辅助治疗，是一种理想的抗肿瘤辅助中成药。
由于肿瘤患者体质虚弱，气血不足的病理特点带有普遍性和根本性，因此扶助正气，补益气血是治疗肿瘤的根本法则。参芪扶正注射液用于气虚证肿瘤病人的治疗，可改善患者的气虚症状，提高生存质量。但是，参芪扶正注射液在临床应用中剂型为液体输液，稳定性较差，贮存一定时间后往往出现pH值的改变，引起外观色泽变深，甚至出现浑浊和沉淀，使澄明度不合格；此外，参芪扶正注射液在临床应用中曾有少数患者出现低热、口腔炎、嗜睡等不良反应。这些症状可能与患者长期患有癌症，身体虚弱，对药物耐受性差等因素有关。
申请号为01100151.8“纳米参芪制剂药物及其制备方法”的专利中只是单纯的将党参和黄芪两味中药粉碎成纳米级颗粒，并没有药理试验证明该制剂的药理作用，只是泛泛的说生物利用度提高，实用性不强。
发明内容
基于上述原因，本发明研究人员经过大量试验研究，运用中药纳米技术，将参芪扶正注射液制备成本发明纳米注射制剂，该方法简便，易于大生产，采用本发明方法制备的制剂有明显的靶向作用，溶解性好、理化性质稳定、载药量大并且制剂稳定性显著提高，本发明制剂安全性更好、刺激性小，能显著提高扶正固本、益气补虚等功效。本发明制剂能显著提高癌症病人的生活质量，减轻化疗后癌症病人的疾病痛苦。药理研究表明该制剂在活血化瘀、补气养血、提高机体免疫力、辅助癌症晚期的治疗效果等药效作用方面均有显著性提高。
本发明旨在提供一种稳定、安全、疗效好、具有靶向作用的纳米参芪扶正注射制剂。
本发明与参芪扶正注射液比较，其特征在于采用本发明工艺将党参、黄芪有效部位制备成达到纳米粒径的制剂，采用本发明方法制备的纳米制剂具有显著的靶向性。
本发明旨在应用纳米技术将中药复方制备成纳米注射制剂，使其疗效显著提高。
本发明还提供了纳米参芪扶正注射制剂的制备方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一、工艺制法
(1)有效部位的制备：
按照中成药部颁标准[ws-459(z-065)和ws-387(z-50)-99]项下的制备方法提取纯化，党参和黄芪最后滤液减压回收乙醇至干，得到有效部位。
(2)制剂处方重量份组成为：有效部位1-5重量份，药用载体6-30重量份；
(3)主药混悬液的制备方法：
取有效部位、乳化剂和脂质，在通氮气条件下加热至70-90℃，在搅拌条件下加入相同温度甘油和poloxamer-188的水溶液，制成粗乳，在70-90℃通氮气条件下用高压乳匀机(或高速剪切乳匀)在35-45MPa压力下乳匀5-7次，充氮气分装后，迅速冷却形成主药混悬液。
(4)制剂的制备：
水针制剂的制备：取上述混悬液，加PVP适量，加注射用水至全量，搅匀，调pH值为6.5-7.5，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，制备成本发明纳米参芪扶正水针制剂；
输液制剂的制备：取上述混悬液，加PVP适量，加注射用水至全量，搅匀，加入氯化钠或葡萄糖调等渗，调pH值为6.5-7.5，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，制备成本发明纳米参芪扶正输液制剂；
冻干粉针制剂的制备：取上述混悬液，加入赋形剂，加注射用水调整浓度，调pH值为6.5-7.5，用0.22μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥，制备成本发明纳米参芪扶正冻干粉针制剂。
上述制备方法中，脂质、乳化剂统称为载体。
本发明所用的脂质可以选用脂肪酸甘油酯类(包括三硬脂酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三窬酸甘油酯、Witepsol W35、Witepsol H35、Witepsol H42、单硬脂酸甘油酯)及脂肪酸类(如硬脂酸、棕榈酸)中的一种或几种。
本发明所用乳化剂可以选用磷脂(包括大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂及磷脂酰胆碱等)、Pluronic F-68、泊洛沙姆、聚山梨醇、胆酸盐、四丁酚醛中的一种或几种。
本发明主药混悬液制备方法中温度优选为75℃-85℃
本发明的一种纳米参芪扶正注射制剂的水针剂、输液剂中加入少量PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，可以提高制剂的稳定性。
本发明的一种纳米参芪扶正注射制剂的冻干粉针制剂的赋形剂为甘露醇、葡萄糖、乳糖、右旋糖酐、葡聚糖中的一种或两种。
将主药应用纳米技术制备成纳米药物，提高了药物血脑屏障的透过率。但是透过率的大小与药物的载体及制备温度有密切关系，脂质、乳化剂的选择及其它们的比例关系，温度的选择都对药物透过血脑屏障有很大的影响，为了确保本发明制剂能最大最有效的透过血脑屏障，本实验室研究人员对脂质、乳化剂、温度等相关条件进行了优选实验，最终得到本发明纳米参芪扶正注射制剂，该制剂在临床治疗方面得到了很好的临床治疗效果。
二、优选试验
本发明优选实验以药物在脑脊液中的浓度为指标。具体实验方法为：取新西兰家兔，体重约2.5kg，雌雄不限。静脉注射纳米参芪扶正注射液(生药)1.2g/kg，于给药后20分钟抽取0.5ml脑脊液进行实验。取脑脊液0.25ml加溶剂混悬15min后，静置15min，以10000r/min离心1min，取上清液20μl进样，以毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷为指标，用高效液相色谱法(HPLC法)测定。
1.不同脂质对主药透过血脑屏障的影响
制备一系列药物，其中主药、乳化剂的种类和用量相同，脂质按下表的设计进行安排，测定脑脊液中的药物浓度。实验结果见表1。
为了比较方便，将测定的兔脑脊液中的最大浓度计为100％。
表1不同脂质对主药透过血脑屏障的影响
| 脂质 | 脑脊液中药物浓度(％) |
| 三硬脂酸甘油酯三棕榈酸甘油酯三肉豆蔻酸甘油酯三月桂酸甘油酯三窬酸甘油酯Witepsol W35Witepsol H35Witepsol H42单硬脂酸甘油酯硬脂酸棕榈酸无 | 100.080.591.699.872379.380.278.693.690.192.743.8 |
由上述实验结果可以看出，不同脂质对主药通过血脑屏障有影响，均可以增加主药对于血脑屏障的通透性，其中三硬脂酸甘油酯和三月桂酸甘油酯的作用效果最好。
2.不同乳化剂对主药透过血脑屏障的影响
制备一系列药物，其中主药、脂质的种类和用量相同，乳化剂按下表的设计进行安排，测定脑脊液中的药物浓度。实验结果见表2。
为了比较方便，将测定的兔脑脊液中的最大浓度计为100％。
表2不同乳化剂对主药透过血脑屏障的影响
| 脂质 | 脑脊液中药物浓度(％) |
| 大豆卵磷脂蛋黄卵磷脂磷脂酰胆碱聚山梨醇Pluronic F-68泊洛沙姆 | 100.099.990.485.682.778.3 |
| 无 | 41.2 |
由上述实验结果可以看出，不同乳化剂对主药通过血脑屏障有影响，均可以增加主药对于血脑屏障的通透性，其中大豆卵磷脂和蛋黄卵磷脂的作用效果最好。
3.脂质和乳化剂用量比例的选择
制备一系列药物，脂质和乳化剂用量按下表的设计进行安排。测定了500个粒径，计算平均粒径。结果见表3。
表3脂质和乳化剂用量比例的选择
| 脂质∶乳化剂 | 平均粒径 |
| 3∶24∶25∶26∶27∶28∶29∶210∶2 | 6054535470758295 |
由上述实验结果可以看出，当脂质和乳化剂、助乳化剂用量为4-6∶2时，粒径较小。
4.温度的选择
制备一系列药物，主药、脂质、乳化剂的种类和用量相同，在不同温度下制备药物，以包封率为指标。结果见表4。
表4温度的选择
| 温度(℃) | 包封率(％) |
| 455565758590100 | 65.874.687.595.996.888.879.6 |
由上述实验结果可以看出，当温度在65-90℃时，包封率较好；当温度为75-85℃时，包封率最好。
三、质量标准
标准依据：《中国药典》2005年版附录XIX E“微囊、微球与脂质体制剂指导原则”中的方法。H-7000型透射电镜仪(日本Hitachi公司)；Zetamaster光子相关光谱仪(英国Malvern公司)；LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津)；TGL-18G型台式高速离心机。
1.形态观察及粒径
将本专利纳米药物在透射电镜下进行形态观察，可见呈圆球体，大小较均匀，表面光滑，无粘连。根据纳米药物的光学显微照片测定了500个，平均粒径为55±10nm，最大粒径为120nm，最小粒径为45nm，且粒径分布符合正态分布规律。
2.包封率和载药量测定
采用反相高效液相色谱法进行含量测定，并用下述公式计算包封率和载药量：
包封率(％)＝(投药量-游离药物量)/投药量×100％；
载药量(％)＝(投药量-游离药物量)/纳米药物的重量×100％。
结果：包封率为90.8％，载药量为8％-20％。
3.稳定性考察
将纳米药物分别置于小瓶内，密封。于冰箱(3-5℃)、室温(20-25℃)和37℃(RH75％)的环境中放置，于0、1、2和3月观测纳米药物的外观、大小、再分散性等。结果均未见明显变化，3种条件下的纳米药物再分散性保持良好，无聚合现象的发生。结果见表5。
表5稳定性实验结果
| 放置条件 | 观测指标 | 时间(月) | |||
| 0 | 1 | 2 | 3 | ||
| 3-5℃ | 粒径(nm) | 55.4 | 55.2 | 55.7 | 55.2 |
| 颜色 | 白色 | 白色 | 白色 | 白色 | |
| 20-25℃ | 粒径(nm) | 55.1 | 55.4 | 55.2 | 55.5 |
| 颜色 | 白色 | 白色 | 白色 | 白色 | |
| 37℃(RH75％) | 粒径(nm) | 55.3 | 55.5 | 55.4 | 55.6 |
| 颜色 | 白色 | 白色 | 白色 | 白色 |
4.加速实验含量测定
参芪扶正注射液(丽珠集团制药厂生产)；本发明纳米参芪扶正注射制剂(按本发明制备工艺制备，由北京联合伟华药业中药实验室提供)；将以上制剂分别置40℃，RH75％条件下放置6个月，分别测定制剂中的成分毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量，考察加速条件下纳米参芪扶正制剂含量的变化(以0月含量为100％计算)。结果见表6。
表6制剂稳定性试验毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量测定结果
| 样品 | 0月 | 1月 | 2月 | 3月 | 6月 |
| 参芪扶正注射液纳米参芪扶正水针剂纳米参芪扶正粉针剂纳米参芪扶正输液剂 | 100％100％100％100％ | 98.4％99.7％99.8％99.7％ | 95.2％98.2％98.3％98.1％ | 92.5％97.1％97.2％97.0％ | 90.2％96.0％96.2％96.0％ |
试验结果表明在加速实验过程中参芪扶正注射液的毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量下降明显，而采用本发明方法制备的纳米参芪扶正注射制剂变化较小，说明本发明纳米参芪扶正制剂的制备方法显著提高了制剂的质量和稳定性，具有重要的实际意义。
结论：通过上述实验表明，本专利纳米药物具有很好的稳定性，充分说明本发明工艺具有实际意义。
四、药理和耙向试验
试药与动物：参芪扶正注射液(丽珠集团利民制药厂生产)；本发明纳米参芪扶正注射制剂(按本发明制备工艺制备，由北京联合伟华药业中药实验室提供)；Wistar大鼠，体重180-220g；健康昆明种小鼠，体重18-22g；瘤株：小鼠S180，小鼠肝癌Heps、人中分化胃癌细胞株MKN-45(中国医学科学院肿瘤所动物中心)。
1.抗肿瘤试验
1.1对小鼠移植性肝癌Heps的影响和靶向作用
无菌抽取接种后第7d的肝癌Heps荷瘤小鼠腹水，加4倍量生理盐水混匀，立即接种于小鼠右前肢腋窝处皮下，每只接种0.2ml，接种后24h随机分组，每组10只，小鼠尾静脉注射给药，给药剂量相当于1.2g生药/kg，给药容积同为0.2ml/只，对照组给予等量生理盐水，每日给药1次，连续给药10d，于末次给药后24h脱颈处死小鼠，剥取肿瘤称重，取肿瘤细胞然后按组织∶生理盐水为1∶1.5(W/V)的比例匀浆，离心10min(2000rpm)，取上清液用HPLC法测定毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量。同时末次给药后1h取血测定血清中的毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的浓度。结果见表7、表8。
表7对移植性肝癌Heps小鼠的影响
| 组别 | 瘤体重量(g) | 抑瘤率(％) |
| 生理盐水组参芪扶正注射液组纳米参芪扶正注射制剂组 | 2.54±0.161.65±0.151.04±0.18 | 35.0**59.1**Δ |
注：与生理盐水组比较**P＜0.01，与参芪扶正注射液组比较ΔP＜0.01
表8对移植性肝癌Heps的靶向作用
| 组别 | 血清中毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷浓度(μg/ml) | 肿瘤细胞中毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量(μg) |
| 参芪扶正注射液组纳米参芪扶正注射制剂组 | 0.0820.097 | 0.465.13 |
结果表明本发明纳米参芪扶正注射制剂能显著抑制小鼠移植性肝癌Heps的生长，具有比参芪扶正注射液更好的药理作用，本发明纳米注射制剂与参芪扶正注射液比较血清中药物浓度相当，而肿瘤细胞中有效成分含量显著增加，表明本发明纳米注射制剂对肿瘤细胞具有较好的靶向性。
1.2对人中分化胃癌细胞株MKN-45的影响和靶向作用
无菌抽取接种后第7d的胃癌细胞株MKN-45荷瘤小鼠腹水，加4倍量生理盐水混匀，立即接种于小鼠右前肢腋窝处皮下，每只接种0.2ml，接种后24h随机分组，每组10只，小鼠尾静脉注射给药，给药剂量相当于1.2g生药/kg，给药容积同为0.2ml/只，对照组给予等量生理盐水，每日给药1次，连续给药10d，于末次给药后24h脱颈处死小鼠，剥取肿瘤称重，取肿瘤细胞然后按组织∶生理盐水为1∶1.5(W/V)的比例匀浆，离心10min(2000rpm)，取上清液用HPLC法测定毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量。同时末次给药后1h取血测定血清中的毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的浓度。结果见表9、表10。
表9对人中分化胃癌细胞株MKN-45小鼠的影响
| 组别 | 瘤体重量(g) | 抑瘤率(％) |
| 生理盐水组参芪扶正注射液组纳米参芪扶正注射制剂组 | 2.46±0.141.58±0.131.02±0.15 | 35.8**58.5**Δ |
注：与生理盐水组比较**P＜0.01，与参芪扶正注射液组比较ΔP＜0.01
表10对人中分化胃癌细胞株MKN-45的靶向作用
| 组别 | 血清中毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷浓度(μg/ml) | 肿瘤细胞中毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量(μg) |
| 参芪扶正注射液组纳米参芪扶正注射制剂组 | 0.0790.086 | 0.534.85 |
结果表明本发明纳米参芪扶正注射制剂能显著抑制人中分化胃癌细胞株MKN-45的生长，具有比参芪扶正注射液更好的药理作用，本发明纳米注射制剂与参芪扶正注射液比较血清中药物浓度相当，而肿瘤细胞中有效成分含量显著增加，表明本发明纳米注射制剂对肿瘤细胞具有较好的靶向性。
1.3对小鼠S180肿瘤的抑制作用和靶向作用
取接种传代小鼠S180，在匀浆器中加入生理盐水，制成小鼠S180瘤匀浆液，再以生理盐水1∶3稀释，然后取0.2ml注入小鼠左腋皮下，24小时称重，分组，每组10只，给药组小鼠每日尾静脉给药一次，给药剂量为1.2g生药/kg，给药容积同为0.2ml/只，对照组给予等量生理盐水，共7天。停药次日处死小鼠，称体重并细心剥离皮下瘤块，于EM50电子天平称取瘤重，并计算抑瘤率，将称重后的瘤块按组织∶生理盐水为1∶1.5(W/V)的比例匀浆，离心10min(2000rpm)，取上清液，用HPLC法测定肿瘤组织和血清中的毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量。同时末次给药后1h取血测定血清中的毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的浓度。结果见表11、表12。
表11对小鼠S180肿瘤生长抑制作用
| 组别 | 瘤体重量(g) | 抑瘤率(％) |
| 生理盐水组参芪扶正注射液组本发明纳米参芪扶正注射制剂组 | 1.67±0.111.08±0.120.52±0.09 | 35.3**68.9**Δ |
注：与生理盐水组比较**P＜0.01，与参芪扶正注射液比较ΔP＜0.01
表12对小鼠S180肿瘤的靶向作用
| 组别 | 血清中毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷浓度(μg/ml) | 肿瘤细胞中毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量(μg) |
| 参芪扶正注射液组纳米参芪扶正注射制剂组 | 0.0720.084 | 0.645.76 |
结果表明本发明纳米参芪扶正注射制剂能显著抑制小鼠肿瘤S180生长，具有比参芪扶正注射液更好的药理作用，本发明纳米注射制剂与参芪扶正注射液比较血清中药物浓度相当，而肿瘤细胞中有效成分显著增加，表明本发明纳米注射制剂具有较好的靶向性。
1.4对荷瘤S180小鼠死亡率和存活时间的影响
取接种传代小鼠S180，在匀浆器中加入生理盐水，制成小鼠S180瘤匀浆液，再以生理盐水1∶3稀释，然后取0.2ml注入小鼠左腋皮下，于接种肿瘤后一周，小鼠尾静脉注射给药，给药剂量相当于1.2g生药/kg，给药容积同为0.2ml/只，对照组给予等量生理盐水，每日给药1次，让其自然死亡，待对照组动物全部死亡后，比较死亡率，并比较90天各组动物的存活时间差异，设给药组与对照组，每组小鼠20只，结果见表13。
表13对小鼠死亡率和存活时间的影响
| 组别 | 死亡数(％) | 死亡率(％) | 平均存活时间(天) | 生命延长率(％) |
| 生理盐水组参芪扶正注射液组本发明纳米参芪扶正注射制剂组 | 20124 | 10060*20*Δ | 31.0±1.853.4±1.578.8±1.2 | 72.3**154.2**Δ |
注：与生理盐水组比较**P＜0.01，与参芪扶正注射液组比较ΔP＜0.05
结果表明本发明纳米参芪扶正注射制剂能显著降低荷瘤小鼠死亡率，延长荷瘤小鼠存活时间，与参芪扶正注射液比较作用更显著。
2.对小鼠白细胞减少症的影响
取体重18-22g的昆明种小鼠50只，随机分5组，每组10只，雌雄各半，即正常对照组、环磷酰胺组、参芪扶正注射液组、本发明纳米参芪扶正注射制剂组。除正常对照组外均给予环磷酰胺100g/kg腹腔注射，每日1次，连续3日，同时各给药组分别静脉给药，给药剂量相当于生药1.2g/kg，每天给药2次，连续8天，分别于第4天和第8天由眼眶静脉取血，镜检白细胞总数，结果见表14。
表14对小鼠白细胞减少症的影响
| 组别 | 白细胞数目(109/L) | |
| 第4天 | 第8天 | |
| 正常对照组环磷酰胺组参芪扶正注射液组纳米参芪扶正注射制剂组 | 8.56±1.342.89±0.45**4.16±0.555.12±0.35 | 9.08±1.263.91±0.58**6.18±0.25Δ8.59±1.28ΔΔ |
注：与正常对照组比较**P＜0.01，与参芪扶正注射液组比较ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01
实验结果表明，对于环磷酰胺所致的白细胞减少症，本发明纳米参芪扶正注射制剂组与参芪扶正注射液比较具有更好的升高白细胞作用。
3.血管刺激性考察
取家兔8只，随机均分2组，每组4只，分别于左耳把家兔置于固定器中，且头用兔头固定仪固定，用酒精将皮肤消毒后，于右侧耳缘静脉注射参芪扶正注射液和本发明纳米参芪扶正注射制剂，给药剂量相当于生药1.2g/kg，于另一侧对应部位注射同一体积的生理盐水作为对照，每日注射1次，连续1周，观察兔耳缘静脉反应，每日观察注射部位血管有无发红、水肿、周围有无渗血，触摸血管有无变硬现象，左右耳比较观察。于末次给药后24h，将动物处死，取下两耳，进行组织切片检查，切片部位为进针部位的向心端，距进针部位1-4cm，分1-2.5cm和2.5-4cm两段取样。
观察指标及评分标准：观察方法包括肉眼观察和显微镜下病理观察。观察给药血管及其周围组织的变化，显微镜下观察耳缘静脉有无血栓形成、内皮损伤及血管周围组织的病理变化情况。对各项指标评分。①血管变化：肉眼观察无明显充血记0分，轻度充血发红、纹路清晰记1分，充血发红、纹路不清记2分，重度充血、呈紫红色记3分；显微镜观察血管内皮及血管壁完整记0分，有内皮损伤记1分，有血栓栓塞记2分，血管破裂记3分。②血管周围组织变化：肉眼观察无明显水肿记0分，轻微水肿记1分，明显水肿记2分，严重水肿记3分；显微镜观察周围组织正常记0分，水肿记1分，出血记2分，有炎症细胞浸润记3分。将每组4只家兔各项观察指标得分累加，计算各组平均得分值，见表15。
表15刺激性试验结果
| 组别 | 刺激性评分 |
| 参芪扶正注射液组纳米参芪扶正注射制剂 | 1.50.5 |
由以上实验结果可知：本发明纳米参芪扶正注射制剂与参芪扶正注射液比较刺激性具有明显改善。
4.溶血毒性考察
2％红细胞混悬液的制备：取兔耳缘静脉取血10-20ml，放入盛有玻璃珠的锥形瓶中，振摇10分钟，除去纤维蛋白原，使成脱纤血。加10倍量的生理盐水溶液，摇匀，离心，除去上清液，沉淀的红细胞再用生理盐水溶液洗涤2-3次，至上清液不呈红色时为止。将所得的红细胞用生理盐水配成浓度为2％的混悬液，即得。
试验方法：取试管6支，按表中的配比量依次加入2％红细胞混悬液和生理盐水溶液，混匀，于37℃恒温箱中放置30分钟，分别加入不同量的药液(以第6管为空白对照)，摇匀后，置37℃恒温箱中，开始每隔15分钟观察1次，1小时后，每隔1小时观察1次，共观察2小时。结果见表16。
表16溶血实验结果
| 试管编号 | 2％红细胞混悬液(ml) | 生理盐水溶液(ml) | 药液(ml) |
| 123456 | 2.52.52.52.52.52.5 | 2.02.12.22.32.42.5 | 0.50.40.30.20.10 |
结果：以第3试管为准，各管均未染有红色，显微镜下观察未见有红细胞破裂，说明本品不溶血，安全性好。
5.急性毒性实验
取Wistar大鼠80只，雌雄各半。禁食24h，随机分4组，每组20只。浓缩成相同的生药浓度，各组分别尾静脉注射药物，给药剂量按生药量折算相当于1.2g生药/kg，每天给药3次，连续7天，观察小鼠死亡情况，结果见表17。
表17急性毒性实验结果
| 组别 | 动物数 | 死亡数 | 死亡率(％) |
| 参芪扶正注射液组纳米参芪扶正水针剂 | 2020 | 72 | 3510 |
| 纳米参芪扶正粉针剂纳米参芪扶正输液剂 | 2020 | 32 | 1510 |
急性毒性实验结果表明本发明纳米参芪扶正注射制剂与参芪扶正注射液比较安全性更好。
6.靶向组织中药物含量的测定
取大鼠40只，体重约180-220g，雌雄不限，分为4组。静脉注射本发明制剂和参芪扶正注射液1.2g/kg，30min后立即断头处死，取血浆和脑组织，取血浆离心10min(2000rpm)，取血清分析测定含量。取出的脑组织用生理盐水轻轻冲洗，用滤纸吸干，脑膜血管剥离干净后取两侧大脑皮层处组织，称重。然后按组织∶生理盐水＝1∶1.5(W/V)的比例匀浆，离心10min(2000rpm)，取上清液分析测定含量，计算结果以血清中用毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的绝对含量为1，计算其他组织中毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的相对含量，结果见表18。
表18各组织中毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量的测定(℃)
| 组别 | 组织 | ||||
| 血清 | 脑 | 肝 | 肾 | 胃 | |
| 参芪扶正注射液纳米参芪扶正水针剂纳米参芪扶正输液组纳米参芪扶正粉针剂组 | 1 | 0.57 | 0.96 | 1.02 | 1.56 |
| 1 | 2.89 | 5.42 | 3.54 | 5.26 | |
| 1 | 2.92 | 5.46 | 3.46 | 5.19 | |
| 1 | 2.90 | 5.52 | 3.76 | 5.23 | |
结果：血清中药物浓度相当，而靶向组织中药物浓度显著提高，说明本发明制剂具有一定靶向性。
小结：以上药理实验结果表明本发明纳米参芪扶正注射制剂药理作用显著好于参芪扶正注射液，且本发明纳米参芪扶正注射制剂具有更好的靶向性和安全性。
五、制备实施例
实施例1
取党参、黄芪药材各400g，粉碎成粗粉，加入去离子水加热提取3此，每次加水量分别为8倍、6倍、6倍。煎煮时间分别为1小时、1小时、0.5小时，合并3次提取液，浓缩至每1ml中含生药量约为1.0-1.5g，搅拌下加入乙醇，使含乙醇量达60％，充分搅拌后静置24小时，过滤，滤液回收乙醇并浓缩至每1ml含生药量1.8-2.2g，搅拌下加入乙醇，使含乙醇量达80％，充分搅拌后冷处(2-10℃)静置24小时，过滤，滤液减压回收乙醇至干，浓缩至每1ml中含生药量为1.8-2.2g，得到本发明参芪扶正有效部位。
实施例2
(1)取有效部位5g、大豆卵磷脂12g和三月桂酸甘油酯18g，在通氮气条件下加热至75℃，在搅拌条件下加入相同温度甘油4g和poloxamer-188 20g的水溶液，制成粗乳，在80℃通氮气条件下用高压乳匀机(或高速剪切乳匀)在41.4MPa压力下乳匀6次，充氮气分装后，迅速冷却形成主药混悬液。
(2)制剂的制备：
水针制剂的制备：取上述混悬液，加PVP适量，加注射用水至全量，搅匀，调pH值为6.5-7.5，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，制备成本发明纳米参芪扶正水针制剂1000支；
输液制剂的制备：取上述混悬液，加PVP适量，加注射用水至全量，搅匀，加入氯化钠调等渗，调pH值为6.5-7.5，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，制备成本发明纳米参芪扶正输液制剂500瓶；
冻干粉针制剂的制备：取上述混悬液，加入甘露醇，加注射用水调整浓度，调pH值为6.5-7.5，用0.22μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥，制备成本发明纳米参芪扶正冻干粉针制剂1000支。
【将上述纳米制剂进行检测，其纳米粒径为45-120纳米】
实施例3
(1)取有效部位10g、蛋黄卵磷脂24g和三硬脂酸甘油酯36g，在通氮气条件下加热至84℃，在搅拌条件下加入相同温度甘油6g和poloxamer-188 35g的水溶液，制成粗乳，在88℃通氮气条件下用高压乳匀机(或高速剪切乳匀)在42MPa压力下乳匀4次，充氮气分装后，迅速冷却形成主药混悬液。
(2)制剂的制备：
水针制剂的制备：取上述混悬液，加PVP适量，加注射用水至全量，搅匀，调pH值为6.5-7.5，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，制备成本发明纳米参芪扶正水针制剂1000支；
输液制剂的制备：取上述混悬液，加PVP适量，加注射用水至全量，搅匀，加入葡萄糖调等渗，调pH值为6.5-7.5，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，制备成本发明纳米参芪扶正输液制剂500瓶；
冻干粉针制剂的制备：取上述混悬液，加入葡萄糖，加注射用水调整浓度，调pH值为6.5-7.5，用0.22μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥，制备成本发明纳米参芪扶正冻干粉针制剂1000支。
【将上述纳米制剂进行检测，其纳米粒径为45-120纳米】
实施例4
(1)取有效部位8g、磷脂酰胆碱15g和三棕榈酸甘油酯25g，在通氮气条件下加热至82℃，在搅拌条件下加入相同温度甘油4g和poloxamer-188 25g的水溶液，制成粗乳，在85℃通氮气条件下用高压乳匀机(或高速剪切乳匀)在41.5MPa压力下乳匀6次，充氮气分装后，迅速冷却形成主药混悬液。
(2)制剂的制备：
水针制剂的制备：取上述混悬液，加PVP适量，加注射用水至全量，搅匀，调pH值为6.5-7.5，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，制备成本发明纳米参芪扶正水针制剂1000支；
输液制剂的制备：取上述混悬液，加PVP适量，加注射用水至全量，搅匀，加入葡萄糖调等渗，调pH值为6.5-7.5，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，制备成本发明纳米参芪扶正输液制剂500瓶；
冻干粉针制剂的制备：取上述混悬液，加乳糖，加注射用水调整浓度，调pH值为6.5-7.5，用0.22μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥，制备成本发明纳米参芪扶正冻干粉针制剂1000支。
【将上述纳米制剂进行检测，其纳米粒径为45-120纳米】
实施例5
(1)取有效部位15g、泊洛沙姆30g和三肉豆蔻酸甘油酯50g，在通氮气条件下加热至80℃，在搅拌条件下加入相同温度甘油10g和poloxamer-188 40g的水溶液，制成粗乳，在85℃通氮气条件下用高压乳匀机(或高速剪切乳匀)在41MPa压力下乳匀5次，充氮气分装后，迅速冷却形成主药混悬液。
(2)制剂的制备：
水针制剂的制备：取上述混悬液，加PVP适量，加注射用水至全量，搅匀，调pH值为6.5-7.5，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，制备成本发明纳米参芪扶正水针制剂1000支；
输液制剂的制备：取上述混悬液，加PVP适量，加注射用水至全量，搅匀，加入葡萄糖调等渗，调pH值为6.5-7.5，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，制备成本发明纳米参芪扶正输液制剂500瓶；
冻干粉针制剂的制备：取上述混悬液，加入右旋糖酐，加注射用水调整浓度，调pH值为6.5-7.5，用0.22μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥，制备成本发明纳米参芪扶正冻干粉针制剂1000支。
【将上述纳米制剂进行检测，其纳米粒径为45-120纳米】
实施例6
(1)取有效部位3g、聚山梨醇6g和三窬酸甘油酯10g，在通氮气条件下加热至85℃，在搅拌条件下加入相同温度甘油2g和poloxamer-188 10g的水溶液，制成粗乳，在90℃通氮气条件下用高压乳匀机(或高速剪切乳匀)在41.8MPa压力下乳匀4次，充氮气分装后，迅速冷却形成主药混悬液。
(2)制剂的制备：
水针制剂的制备：取上述混悬液，加PVP适量，加注射用水至全量，搅匀，调pH值为6.5-7.5，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，制备成本发明纳米参芪扶正水针制剂1000支；
输液制剂的制备：取上述混悬液，加PVP适量，加注射用水至全量，搅匀，加入氯化钠调等渗，调pH值为6.5-7.5，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，制备成本发明纳米参芪扶正输液制剂500瓶；
冻干粉针制剂的制备：取上述混悬液，加入葡聚糖，加注射用水调整浓度，调pH值为6.5-7.5，用0.22μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥，制备成本发明纳米参芪扶正冻干粉针制剂1000支。
【将上述纳米制剂进行检测，其纳米粒径为45-120纳米】
Claims (7)
1.一种纳米参芪扶正注射制剂，其特征在于该药物组成包括：有效部位1-5重量份，药用载体6-30重量份；其特征还在于纳米参芪扶正注射制剂中纳米粒径为45-120纳米；
2.如权利要求1所述的纳米参芪扶正注射制剂的制备方法，其特征包括以下步骤：
(1)制剂处方重量份组成为：有效部位1-5重量份，药用载体6-30重量份；
(2)主药混悬液的制备方法：
取有效部位、乳化剂和脂质，在通氮气条件下加热至70-90℃，在搅拌条件下加入相同温度甘油和poloxamer-188的水溶液，制成粗乳，在70-90℃通氮气条件下用高压乳匀机在35-45MPa压力下乳匀5-7次，充氮气分装后，迅速冷却形成主药混悬液；
(3)制剂的制备：
水针制剂的制备：取上述混悬液，加PVP适量，加注射用水至全量，搅匀，调pH值为6.5-7.5，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，制备成本发明纳米参芪扶正水针制剂；
输液制剂的制备：取上述混悬液，加PVP适量，加注射用水至全量，搅匀，加入氯化钠或葡萄糖调等渗，调pH值为6.5-7.5，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，制备成本发明纳米参芪扶正输液制剂；
冻干粉针制剂的制备：取上述混悬液，加入赋形剂，加注射用水调整浓度，调pH值为6.5-7.5，用0.22μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥，制备成本发明纳米参芪扶正冻干粉针制剂；
3.如权利要求1所述的纳米参芪扶正注射制剂的制备方法，其特征在于所述的脂质为三硬脂酸甘油酯和三月桂酸甘油酯；
4.如权利要求1所述的纳米参芪扶正注射制剂的制备方法，其特征在于所述的乳化剂为大豆卵磷脂和蛋黄卵磷脂；
5.如权利要求1所述的纳米参芪扶正注射制剂的制备方法，其特征在于所述的脂质与乳化剂的用量比是4-6∶2；
6.如权利要求1所述的一种纳米参芪扶正注射制剂的制备方法，其特征在于所述的温度为75℃-85℃；
7.如权利要求1所述的一种纳米参芪扶正注射制剂，其特征在于用作气虚型癌症的辅助治疗；
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