CN1919339A - 含有蛋白的葫芦素纳米制剂及制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
一种含有蛋白的葫芦素纳米制剂。该种制剂可以为液体制剂，也可以为固体制剂。蛋白纳米粒可以在室温贮藏，减少贮藏的费用，方便临床用药；不需要热压灭菌，提高药物的质量和疗效。在液体制剂中，按照重量百分比计算，蛋白占0.05～10％(W/V)，葫芦素含量0.001～1％(W/V)；固体制剂中，蛋白占50～99.9％(W/W)，葫芦素含量0.001～50％(W/W)。按照重量比计算，葫芦素与蛋白的比例范围为1∶1～1∶10000。葫芦素蛋白纳米制剂可以单独给药或者联合给药，用于制备治疗癌症、肿瘤的治疗药物，如肝癌、肺癌、乳腺癌、脑瘤、淋巴瘤、胰腺癌、肾癌、结直肠癌；也可用于制备肿瘤患者因为化疗、放疗造成的白细胞低下症，或者其它不明原因的白细胞低下患者的药物；尚可以用于制备肝炎的治疗药物。
Description
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，确切地说它是一种含有蛋白的葫芦素纳米制剂及制备方法和用途。
背景技术：
葫芦素(Cucurbitacins)属于19-甲基出现在C-9位上的一类四环三萜化合物，主要分布于葫芦科植物中，在十字花科、玄参科、秋海棠科、杜英科、四数木科等高等植物及一些大型真菌中也有发现。中国科学院昆明植物所研究员邱明华带领科技人员在发现的一系列新型葫芦素的基础上，研究了229个几乎所有的葫芦素类化合物，提出了新的结构分类模式，由此前的5类结构类型重新分为12类，得到了国际学术界的认可。目前，我国批准生产的葫芦素又叫葫芦素BE，为中药甜瓜蒂(别名：苦丁香)提取物，主要含葫芦素B、E等成分，现有的提取物中葫芦素B含量为60％以上，纯化后葫芦素B含量可达90％以上。葫芦素片用于治疗慢性肝炎(葫芦素片药学通报1986，21(6)：357)，经上海、北京、重庆等地十三家医院临床，其有效率为75.2％，显效率为44.6％。临床上观察到葫芦素片能较全面地改善慢性肝炎常见症状和主要体征，并有明显的降酶(S-GPT)、降浊(TTT、ZnTT)和降胆红质作用，停药后不引起S-GPT反跳，对蛋白倒置和高球蛋白血症也有明显的纠正作用，还能提高慢性肝炎患者的非特异性细胞免疫能力，无明显毒副作用。除此而外，葫芦素片还能用于治疗原发性肝癌，经上海、北京、广西等地六家医院临床观察，统计169例，有效率69％，显效率39％。临床观察表明，该药与5-氟脲嘧啶比较，其改善症状、消除肝痛、缩小瘤体、延长生存期、恢复体力等，均优于对照组，且无一般化疗药物的毒副作用(治疗肝炎、肝癌新药葫芦素片中草药1987，18(10)：21，葫芦素治疗原发性肝癌50例临床观察新药与临床1984，3(2)：21-22，葫芦素的药理与临床应用中草药1992，23(11)：605～608)。最近有作者将葫芦素片与化疗药联合，治疗中晚期肝癌，中位生存期由单一化疗药的6.1±7.12月，提高到12.5±7.54月(葫芦素片加化疗药治疗中晚期原发性肝癌的临床疗效观察癌症1989，8(6)：434～436)；另有文发现葫芦素B，E(II)20μg/ml对癌细胞的杀伤率为82.6％，浓度提高至80μg/ml时，其杀伤率达94.1％，而对正常人淋巴细胞转化率的影响则分别为90.6％及89.5％，表明(II)对鼻咽癌细胞具有较强的杀伤作用，它同时能促进正常淋巴细胞的转化功能；在进行葫芦素片与现有药物-灭澳灵治疗慢性乙肝疗效比较时发现，治疗组服用葫芦素片，饭后口服，1日3次，每次2片，以3～6个月为一疗程。对照组服用灭澳灵片。结果治疗组总有效率为67.4％，而对照组总有效率为35.9％，P＜0.01(葫芦素片治疗慢性乙型肝炎89例疗效观察浙江中医学院学报1994，18(4)：18～19)；有文献指出，长疗程用药(6周)能明显抑制肝纤维组织增生，防止肝脂肪变性以及肝硬变的形成和发展。
最近，美国的研究人员报道，葫芦素抗癌的作用机理为抑制STAT3活性，Bolleddula Jayaprakasam等比较了葫芦素B、D、E、I与阿霉素对人直肠癌(HCT-116)、乳腺癌(MCF-7)、肺癌(NCI-H460)和中枢神经系统癌(SF-268)细胞的抗癌活性，结果表明，在所选择的四种瘤细胞中，葫芦素B在0.4μM时，对人直肠癌的抑制率为81.5％、人乳腺癌87％；在0.1μM时对人肺癌的抑制率为96％；0.05μM对人CNS癌的抑制率为92％，均高于阿霉素的抑制率(分别为64％、47％、45％、71％，3μM)，即葫芦素B对相应的瘤细胞毒性至少是阿霉素的7.5、30、60倍(BolleddulaJayaprakasam et al.Anticancer and antiinflammatoru activity of cucurbitacinsfrom Cucurbita andreana Cancer Letters 2003，189：11～16)。在同一篇文献中，作者还发现，葫芦素B对COX-2有选择性抑制作用。另外，JuditBartalis等报道葫芦素B抗肝癌细胞(HepG2)的IC50为27.7μM，葫芦素E为15.3μM(Judit Bartalis et al Relationship between cucurbitacinsreversed-phase high-performance liquid chromatography hydrophobicity indexand basal cytotoxicity on HepG2 cells Journal of Chromatography B，818(2005)159～166)。
葫芦素现有剂型为片剂，对于口服固体制剂而言，由于葫芦素的水溶性差，片剂的体外溶出波动较大，且溶出慢，如此不利于临床治疗。针对此类问题，有人申请了纳米葫芦素制剂药物及其制备方法的专利，申请号：01103658.3，在该专利申请中，公开了一种采用微波萃取、减压浓缩、超音速射流技术喷雾干燥等步骤制成的纳米葫芦素制剂药物，其颗粒细度达1200-1500目，粒径为0.1-200nm，其中绝大部分粒径小于100nm。该药物生物利用度高，治疗效果显著。除此之外，尚有如下一些专利：葫芦素环糊精包合物及其制剂专利申请号：02153647.3；葫芦素脂质体组方及其制剂 专利申请号：02144633.4；葫芦素滴丸及其制备方法 专利申请号：200310100943.3。亦有文献将葫芦素制备成乳剂，并考察了制备工艺(中南药学2004，2(2)：73-76)。在该文献中，作者采用大豆油制备脂肪乳剂，其油相的浓度为20％，磷脂浓度为1.2％，甘油浓度为2.1％，药物用量为0.01％(0.1mg/ml)，所得乳剂于115℃灭菌30分钟，粒度为390nm。作者还考察了pH值对药物的稳定性影响，发现灭菌前将pH值调节为8.50、9.50，灭菌后的pH值为6.96、7.30，而药物的含量大大下降，特别是后者，含量下降约10％。为了解决这一问题，有专利申请了可过滤除菌的乳剂。但尚未见有关葫芦素蛋白纳米粒的研究报道。
发明内容：
本发明的目的是提供一种含有蛋白的葫芦素纳米制剂及制备方法和用途。白蛋白是向细胞输注营养的蛋白质，研究显示它在快速生长的肿瘤中积蓄。因而，白蛋白结合的葫芦素可靶向至肿瘤组织，提高药物的疗效。我们经过大量的试验发现，采用适当浓度的葫芦素、适当比例的处方组成和适当的工艺，可以制备出葫芦素蛋白纳米粒。含有蛋白的葫芦素纳米制剂，可以为液体制剂，也可以为固体制剂；按照重量体积百分比计算，葫芦素蛋白纳米液体制剂中，蛋白占0.05～10％(W/V)，葫芦素含量0.001～1％(W/V)；固体制剂中，蛋白占5～99.99％(W/W)，葫芦素含量0.001～50％(W/W)；按照重量比计算，葫芦素与蛋白的比例范围为1∶1～1∶10000，平均粒度范围为5nm～200nm，pH值3～8。
蛋白包括人血浆白蛋白、人血清白蛋白、人工合成白蛋白，除此而外，尚可加入HS15、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯、泊洛沙姆中的一种或几种混合物。
所述的葫芦素，包括葫芦素有效部位提取物，葫芦素BE，葫芦素单体，葫芦素B、葫芦素C、葫芦素D、葫芦素E、葫芦素F、葫芦素I、葫芦素Q。
含有蛋白的葫芦素纳米制剂中可以含有pH调节剂及其它辅料，包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、右旋糖苷、海藻糖、木糖醇其中的一种或者一种以上。
含有蛋白的葫芦素纳米制剂的制备过程如下：
1)含药相的制备：在配制罐中，加入有机溶剂或油相，加入葫芦素，搅拌混匀、溶解；
2)水相的制备：在配制罐中，溶解或者稀释蛋白，根据情况可以加入其它成分，如pH调节剂，调节pH值到3～9，在0～60℃下搅拌混匀；
3)在0～40℃时，将含药相加入水相或水相加入含药相，搅拌混匀，形成初乳；
4)过均质仪，第一步调节匀化压力至2000-8000psi，第二步再调节至10000-40000psi，将溶液反复匀化，得到均匀的纳米制剂，用0.3μm或小于0.3μm的微孔滤膜或G6垂熔玻璃漏斗进行过滤除菌，分装即得；也可以进行冷冻干燥，即得本品。
所述的有机溶剂，包括二氯甲烷、氯仿、甲苯、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、甲醇、特丁醇、聚乙二醇、丙二醇、戊烷、己烷等烷烃类中的一种或者一种以上，或者至少一种；油相包括MCT、生育酚、醋酸生育酚、油酸、油酸乙酯、大豆油、红花油、橄榄油、辛酸、葵酸、月桂酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻油酸、二十二碳六烯酸、深海鱼油中的一种或者一种以上，或者至少一种。
含有蛋白的葫芦素纳米制剂可用于制备治疗癌症、肝炎、白细胞低下的药物。可单独给药或者联合给药，用于癌症、肿瘤的治疗，如肝癌、肺癌、乳腺癌、脑瘤、淋巴瘤、胰腺癌、肾癌、结直肠癌；也可用于肿瘤患者因为化疗、放疗造成的白细胞低下症，或者其它不明原因的白细胞低下患者；尚可以用于肝炎的治疗。
本发明的优点是：相对于常规的乳剂、脂质体等制剂而言，本品尚具有一个很重要的优点是，蛋白纳米粒可以在室温(20℃～25℃)贮藏，减少运输、贮藏的费用，方便临床用药；同时不需要热压灭菌，提高药物的质量，提高药物疗效；利用蛋白载体靶向特点，提高药物抗肿瘤效果；利用蛋白的优良乳化能力，减少粒度，实现药物纳米化。
具体实施方式：
本发明的详细组分由下列实施例给出，但本发明的保护范围，不仅局限于此。
粒度测定仪：本实验中应用PSS.NICOMPTM380(美国)作为测定粒径的仪器。微射流仪(Microfluidic公司，美国)，均质机等。
HPLC条件：ODS柱；流动相，乙腈-水(55∶45)；检测波长228nm，流速1ml/min。
实施例1：葫芦素BE(葫芦素有效提取部位，葫芦素B含量大于60％)
处方组成：葫芦素0.1g，人血白蛋白5g，二氯甲烷适量，其余为注射用水，共100ml。
制备工艺：
称取处方量的葫芦素，用二氯甲烷溶解制成溶液，备用。取市售的人血白蛋白(20％)用注射用水稀释成5％的溶液，并用酸或碱调节pH值为7.5，备用。于0℃下将葫芦素二氯甲烷溶液与人血白蛋白溶液混合，乳化，制备初乳。随后将初乳通过均质机(或微射流)进行分散，第一步调节匀化压力至5000psi，第二步再调节至35000psi，在线检测平均粒度在5nm～200nm，得葫芦素纳米液体。减压除去二氯甲烷，过0.22μm微孔滤膜除菌，分装，冷冻干燥，得无菌粉末。固体中人血白蛋白占98％。以生理盐水(或者5％、10％葡萄糖、灭菌注射用水)再水化后的平均粒度为86nm。
可以采用其它的蛋白获得同样结果。
实施例2、市售葫芦素BE(葫芦素有效提取部位，葫芦素B含量大于60％)。
处方组成：葫芦素0.01g，人血白蛋白1g，泊洛沙姆F68 1g，三氯甲烷适量，蔗糖10g，其余为注射用水，共100ml。
制备工艺：
称取处方量的葫芦素，用三氯甲烷溶解制成溶液，备用。取蔗糖10g，用注射用水溶解，加入人血白蛋白及泊洛沙姆F68各1g，制成溶液后，以柠檬酸调节pH值为3，备用。于10℃下将葫芦素三氯甲烷溶液与人血白蛋白溶液混合，乳化，制备初乳。随后将初乳通过均质机(或微射流)进行分散，第一步调节匀化压力至2000psi，第二步再调节至35000psi，在线检测平均粒度在5nm～200nm，得葫芦素纳米液体。减压除去三氯甲烷，调节溶液体积至100ml，过0.22μm微孔滤膜除菌，分装，冷冻干燥，充氮气，封口即得本品。固体中人血白蛋白占8.3％。以灭菌注射用水再水化后的平均粒度为53nm。
实施例3、精制葫芦素BE(葫芦素B含量大于80％)
组方：精制葫芦素BE 0.05g，人血白蛋白0.05g，泊洛沙姆1g，乙酸乙酯适量，甘露醇5g、海藻糖10g，其余为注射用水，共100ml。
制备工艺：称取处方量的精制葫芦素，用乙酸乙酯溶解制成溶液，备用。称取人血白蛋白0.05g、泊洛沙姆1g，用注射用水溶解制成溶液，加入处方量的甘露醇和海藻糖，溶解后用0.01M氢氧化钠调节pH值为9，备用。于0℃下将葫芦素乙酸乙酯溶液与人血白蛋白溶液混合，乳化，制备初乳。随后将初乳通过均质机(或微射流)进行分散，第一步调节匀化压力至5000psi，第二步再调节至15000psi，在线检测平均粒度在5nm～200nm，得葫芦素纳米液体。减压除去乙酸乙酯，调节溶液体积至100ml，过0.22μm微孔滤膜除菌，分装，冷冻干燥，得无菌粉末。再水化(生理盐水、5％、10％葡萄糖或灭菌注射用水)后的平均粒度为：136nm。
实施例4葫芦素B(含量大于90％)
组方：葫芦素B 0.01g，人血白蛋白5g，乙酸乙酯适量，乙醇适量，其余为注射用水，共100ml。
制备工艺：称取处方量的葫芦素B，用乙酸乙酯和乙醇溶解制成溶液，备用。称取人血白蛋白5g，用注射用水溶解制成溶液，柠檬酸调节pH值为6，备用。于4℃下将葫芦素B溶液与人血白蛋白溶液混合，乳化，制备初乳。随后将初乳通过均质机(或微射流)进行分散，第一步调节匀化压力至3000psi，第二步再调节至18000psi，在线检测平均粒度在5nm～200nm，得葫芦素纳米液体。减压除去乙酸乙酯，调节溶液体积至100ml，过0.22μm微孔滤膜除菌，分装，即得。如果采用冷冻干燥工艺，则得无菌粉末。再水化(生理盐水、5％、10％葡萄糖或灭菌注射用水)后的平均粒度为：73nm。
可以用其它不同的酸，如磷酸、酒石酸、醋酸代替柠檬酸，得到类似结果。
实施例5葫芦素B(含量大于90％)
组方：葫芦素B 0.01g，人血白蛋白5g，HS15 1g，MCT(中链油)0.1g，无水乙醇适量，其余为注射用水，共100ml。
制备工艺：称取处方量的葫芦素B，用MCT(中链油)和无水乙醇溶解制成溶液，备用。称取人血白蛋白和HS15，用注射用水溶解制成溶液，柠檬酸调节pH值为5.5，备用。于10℃下将葫芦素B溶液与人血白蛋白溶液混合，乳化，制备初乳。随后将初乳通过均质机(或微射流)进行分散，第一步调节匀化压力至4000psi，第二步再调节至30000psi，在线检测平均粒度在5nm～200nm，得葫芦素纳米液体。调节溶液体积至100ml，过0.22μm微孔滤膜除菌，分装，即得液体型葫芦素蛋白纳米粒制剂。如果采用冷冻干燥工艺，则得无菌粉末。再水化(生理盐水、5％、10％葡萄糖或灭菌注射用水)后的平均粒度为：36nm。
实施例6葫芦素B(含量大于80％)
组方：葫芦素B 0.001g，人血白蛋白10g，乙酸乙酯适量，其余为注射用水，共100ml。
制备工艺：称取处方量的葫芦素，用乙酸乙酯溶解制成溶液，备用。称取人血白蛋白10g，用注射用水溶解制成15％溶液，并用柠檬酸调节pH值为6.5，备用。余下操作同“实施例5”。减压除去乙酸乙酯，过0.22μm微孔滤膜除菌，分装，冷冻干燥，得无菌粉末(蛋白含量占99.99％)。再水化(生理盐水、5％、10％葡萄糖或灭菌注射用水)后的平均粒度为：17nm。
实施例7葫芦素B(纯度大于95％)
组方：葫芦素B0.01g，人血白蛋白1g，1g F68，特丁醇适量，其余为注射用水，共100ml。
制备工艺：称取处方量的葫芦素，用特丁醇溶解制成溶液，备用。称取人血白蛋白1g，用注射用水溶解制成2％溶液，并用柠檬酸调节pH值为6.5，备用。余下操作同“实施例5”。过0.22μm微孔滤膜除菌，分装，冷冻干燥，得无菌粉末。再水化(生理盐水、5％、10％葡萄糖或灭菌注射用水)后的平均粒度为：106nm。
实施例8葫芦素B(纯度大于98％)
组方：葫芦素B0.005g，生育酚0.5g，油酸0.1g，人血白蛋白5g，二氯甲烷适量，其余为注射用水，共100ml。
制备工艺：称取处方量的葫芦素B、生育酚、油酸，用二氯甲烷溶解制成溶液，备用。称取人血白蛋白，用注射用水溶解制成6％溶液，备用。余下操作同“实施例5”。过0.22μm微孔滤膜除菌，分装，冷冻干燥，得无菌粉末。再水化(生理盐水、5％、10％葡萄糖或灭菌注射用水)后的平均粒度为：167nm。
实施例9葫芦素B(纯度大于98％)
组方：葫芦素B 0.1g，人血白蛋白10g，乙酸乙酯适量，其余为注射用水，共100ml。
制备工艺：称取处方量的葫芦素，用乙酸乙酯溶解制成溶液，备用。称取人血白蛋白10g，用注射用水溶解制成15％溶液，并用柠檬酸调节pH值为6，备用。余下操作同“实施例5”。减压除去乙酸乙酯，过0.22μm微孔滤膜除菌，分装，冷冻干燥，得无菌粉末(药物含量为0.1、0.5、1或者2mg/支，蛋白含量占99％)。再水化(生理盐水、5％、10％葡萄糖或灭菌注射用水)后的平均粒度为：127nm。
实施例10葫芦素E(纯度大于95％)
组方：葫芦素E 0.01g，人血白蛋白4.5g，三氯甲烷适量，其余为注射用水，共100ml。
制备工艺：称取处方量的葫芦素，用三氯甲烷溶解制成溶液，备用。称取人血白蛋白4.5g，用注射用水溶解制成5％溶液，并用柠檬酸调节pH值为6，备用。余下操作同“实施例5”。减压除去三氯甲烷，过0.22μm微孔滤膜除菌，分装，冷冻干燥，得无菌粉末(蛋白含量占99.78％)。再水化(生理盐水、5％、10％葡萄糖或灭菌注射用水)后的平均粒度为：103nm。
实施例11葫芦素I(纯度大于95％)
组方：葫芦素I 0.01g，人血白蛋白3g，二氯甲烷适量，其余为注射用水，共100ml。制造方法：
制备工艺：称取处方量的葫芦素，用二氯甲烷溶解制成溶液，备用。称取人血白蛋白3g，用注射用水溶解制成5％溶液，并用柠檬酸调节pH值为6.5，备用。余下操作同“实施例5”。减压除去二氯甲烷，过0.22μm微孔滤膜除菌，分装，冷冻干燥，得无菌粉末(蛋白含量占99.68％)。再水化(生理盐水、5％、10％葡萄糖或灭菌注射用水)后的平均粒度为：119nm。
实施例12葫芦素Q(纯度大于95％)
组方：葫芦素Q 0.01g，人血白蛋白5g，二氯甲烷适量，乙酸乙酯适量，其余为注射用水，共100ml。制造方法：
制备工艺：称取处方量的葫芦素，用二氯甲烷、乙酸乙酯溶解制成溶液，备用。称取人血白蛋白5g，用注射用水溶解制成6％溶液，并用柠檬酸调节pH值为6.5，备用。余下操作同“实施例5”。减压除去有机溶剂，过0.22μm微孔滤膜除菌，分装，冷冻干燥，得无菌粉末。再水化(生理盐水、5％、10％葡萄糖或灭菌注射用水)后的平均粒度为：138nm。
实例13制剂稳定性研究
按照新药研究指导原则进行长期稳定性实验研究，结果见表1。
表1 制剂稳定性试验结果
| 批号 | 时间(月) | 性状 | pH值 | 乳粒 | 含量(μg) |
| 实施例1 | 036912 | 类白色块状物类白色块状物类白色块状物类白色块状物类白色块状物 | 7.387.367.327.417.33 | 86nm92nm91nm96nm95nm | 87.688.786.887.288.3 |
| 实施例9 | 036912 | 类白色块状物类白色块状物类白色块状物类白色块状物类白色块状物 | 6.026.096.056.116.08 | 127nm119nm116nm125nm123nm | 81.282.082.782.381.6 |
| 实施例5 | 036 | 半透明液体半透明液体半透明液体 | 5.565.585.59 | 36nm41nm43nm | 78.577.877.4 |
| 912 | 半透明液体半透明液体 | 5.615.60 | 45nm37nm | 78.177.5 |
实施例14抗肿瘤和升白作用
按照抗肿瘤药物实验方法进行，建立体内肝癌H22移植模型。随机分组，每组10只，分别为“空白对照组”、“环磷酰胺阳性对照组(CTX20mg·kg-1)”、“给药治疗组(高、中、低剂量组，0.20mg·kg-1、0.10mg·kg-1、0.05mg·kg-1)”、“溶液组”。模型对照组给予生理盐水注射液。造模后第四天待肿瘤有一定体积时开始给药。给药时间：第5、7、9、11、13天给药。第14天时，颈椎脱臼法处死动物，称体重，解剖剥离瘤块，电子天平称瘤重。根据下面公式计算抑瘤率：
抑瘤率＝(1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％
所有数据均采用均值用标准差表示(
x±SD)
小鼠尾静脉采血，进行常规血白细胞计数。
结果见表2
表2 葫芦素蛋白纳米制剂抑制小鼠H22肝癌作用实验结果
| 组别 | 剂量 | 动物数(开始/最后) | 平均体重(g) | 瘤重(g)( x±SD) | 抑瘤率(％) | |
| 开始 | 结束 | |||||
| 空白对照CTX高中低溶液组 | -20mg/kg0.2mg/kg0.1mg/kg0.05mg/kg0.1mg/kg | 10/810/910/1010/1010/1010/8 | 19.3619.7720.0619.6219.8819.62 | 25.8621.0824.1625.3825.6624.71 | 2.82±0.711.26±0.63**1.18±0.58**1.43±0.67**1.77±0.55*1.91±0.83** | -55.358.249.337.232.3 |
注：与模型对照组比较**P＜0.01 *P＜0.05
由此可知，在同等剂量下，溶液组有两只小鼠死亡，而蛋白纳米粒制剂组无小鼠死亡，毒性也小于溶液组；蛋白纳米粒制剂的抑瘤率大于溶液组；同时还发现，“空白对照组”、“环磷酰胺阳性对照组(CTX20mg·kg-1)”、“给药治疗组(高、中、低剂量组，0.20mg·kg-1、0.10mg·kg-1、0.05mg·kg-1)”、“溶液组”的白细胞数分别为：6.89、3.11、8.63、8.11、8.21、8.26(×109·L-1)，环磷酰胺阳性对照组的白细胞数大大下降，葫芦素各组的白细胞数均高于环磷酰胺阳性对照组，高于空白对照组。
Claims (7)
1、一种含有蛋白的葫芦素纳米制剂，其特征在于：所说的制剂可以为液体制剂，也可以为固体制剂；按照重量体积百分比计算，葫芦素蛋白纳米液体制剂中，蛋白占0.05～10％(W/V)，葫芦素含量0.001～1％(W/V)；固体制剂中，蛋白占5～99.99％(W/W)，葫芦素含量0.001～50％(W/W)；按照重量比计算，葫芦素与蛋白的比例范围为1∶1～1∶10000，平均粒度范围为5nm～200nm，pH值3～8。
2、根据权利要求1所述的一种含有蛋白的葫芦素纳米制剂，其特征在于：蛋白包括人血浆白蛋白、人血清白蛋白、人工合成白蛋白，除此而外，尚可加入HS15、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯、泊洛沙姆中的一种或几种混合物。
3、根据权利要求1所述的一种含有蛋白的葫芦素纳米制剂，其特征在于：所述的葫芦素，包括葫芦素有效部位提取物，葫芦素BE，葫芦素单体，葫芦素B、葫芦素C、葫芦素D、葫芦素E、葫芦素F、葫芦素I、葫芦素Q。
4、根据权利要求1所述的一种含有蛋白的葫芦素纳米制剂，其特征在于：含有蛋白的葫芦素纳米制剂中可以含有pH调节剂及其它辅料，包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、右旋糖苷、海藻糖、木糖醇其中的一种或者一种以上。
5、一种含有蛋白的葫芦素纳米制剂的制备方法，其特征在于制备过程如下：
1)含药相的制备：在配制罐中，加入有机溶剂或油相，加入葫芦素，搅拌混匀、溶解；
2)水相的制备：在配制罐中，溶解或者稀释蛋白，根据情况可以加入pH调节剂，调节pH值到3～9，在0～60℃下搅拌混匀；
3)在0～40℃时，将含药相加入水相或水相加入含药相，搅拌混匀，形成初乳；
4)过均质仪，第一步调节匀化压力至2000-8000psi，第二步再调节至10000-40000psi，将溶液反复匀化，得到均匀的纳米制剂，用0.3μm或小于0.3μm的微孔滤膜或G6垂熔玻璃漏斗进行过滤除菌，分装即得；也可以进行冷冻干燥，即得本品。
6、根据权利要求5所述的含有蛋白的葫芦素纳米制剂的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂，包括二氯甲烷、氯仿、甲苯、乙醚、异丙醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、甲醇、特丁醇、聚乙二醇、丙二醇、戊烷、己烷等烷烃类中的一种或者一种以上，或者至少一种；油相包括MCT、生育酚、醋酸生育酚、油酸、油酸乙酯、大豆油、红花油、橄榄油、辛酸、葵酸、月桂酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻油酸、二十二碳六烯酸、深海鱼油中的一种或者一种以上，或者至少一种。
7、一种含有蛋白的葫芦素纳米制剂的应用，其特征在于：可用于制备治疗癌症、肝炎、白细胞低下的药物。
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