CN106727892B - 一种复方红豆杉制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复方红豆杉制剂的制备方法，其操作方法为：先红豆杉皮初级粉碎，再超微粉碎，以乙醇为修饰剂和吸收液，采用超临界CO₂流体萃取法，萃取2.5小时，减压回收乙醇，用50%乙醇溶解，过XAD1600型大孔树脂柱，用3倍量50%乙醇洗脱，后弃去50%乙醇洗脱液，再用85%乙醇洗脱，收集85%乙醇洗脱液，减压回收85%乙醇洗脱液的乙醇至无醇味，浓缩，得红豆杉浓缩液；再制备甘草、红参浓缩液；将甘草红参浓缩液与红豆杉浓缩液混合，充分混匀，得成品。本发明要解决的技术问题是提供具备生物利用度更高，有效成分损失减少、含量更高、药效更优，且能更好地保护性地利用了珍稀濒危药材的一种复方红豆杉制剂的制备方法。

Description

一种复方红豆杉制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及中药加工方法领域，具体涉及一种复方红豆杉制剂的制备方法。

背景技术

肺癌是临床最常见的恶性肿瘤，近年来肿瘤发病呈现逐年增长的趋势，随着我国人口老龄化的发展，老年肺癌患者在肺癌中所占比重越来越大，肺癌起病较隐匿，确诊时多为晚期，无法施行手术切除，目前放化疗仍为肺癌治疗的主要手段，其临床总有效率、长久生存也具备很大优势，但不良反应症状也在直线上升，对患者的生存质量造成了不良的影响。提升肺癌患者的生存质量成为了当前肺癌临床治疗的重要标准。

中药复方是在中医药理论指导下，依据中药的药性、功能及主治，按照“君、臣、佐、使”的组方原则，选择适宜的药味及剂量，将中药材有机组合成为一体的方剂。中药复方历史悠久，在《素问：至真要大论》中指出：“治有缓急，方有大小”，分别为大方、小方、急方、缓方、奇方、偶方、复方七类。人们在长期与疾病斗争的过程中认识到临床面临的情况是复杂多变的，单味药的应用往往只能解决问题的一个方面或一个阶段，而将药物联合使用往往会取得放大效应，并减轻其不良反应。复方的这种组成原理正是体现了中医学的整体观，是中医辩证论治理论的具体体现。在整体观的指导下，把多味中药按照一定的原则组合起来，每一味药在其中发挥着不同的作用，最终产生靶向性，起到治疗的目的。

肿瘤是严重危害人类健康的疾病，被称为“人类第一杀手”，且发病率逐渐增高。目前临床上所使用的以红豆杉为君药组方的复方红豆杉验方，经实践证明，具有良好的抗肿瘤效果。红豆杉中药复方制剂具有显著杀伤肿瘤与提高机体免疫力的双重作用。因血药浓度波动小，疗效稳定持久，在放化疗的联合治疗肺癌过程中具有明显的作用。研究表明，放化疗联合红豆复方制剂可有效控制肿瘤患者放化疗的不良反应，改善肺部肿瘤患者的细胞免疫状态，维持其免疫功能的稳定，从而控制肿瘤的再生几率，最终提高患者生存质量。

根据国家药品标准WS-10935(ZD-0935)-2002中所示的制备方法制备而成的复方红豆杉胶囊，具有祛邪散结，用于气虚痰瘀所致的中晚期肺癌化疗的辅助治疗。经多年临床验证，其疗效确切。

但是，现在中药材资源面临土壤肥力下降、农药残留、重金属超标、药效减弱的恶劣趋势，改变原有“粗、黑、大”的利用方式，高效利用中药材资源尤其是高效利用珍稀濒危中药材是实现中药现代化的重要一环。由于现有的制备方法通常为：首先红豆杉皮粉碎，过20目筛，用95%乙醇作溶剂，浸渍48小时后，缓缓渗漉，收集漉液，40℃减压回收乙醇至干，加水和二氯甲烷，充分搅拌混合，静置4小时后分出并收集二氯甲烷液，水液再用二氯甲烷萃取3次，合并各次二氯甲烷液，滤过，减压回收二氯甲烷至干，残余物用醋酸乙酯－甲醇（3∶1）混合溶液溶解，加硅藻土拌匀，减压除去溶剂，装入渗漉桶中，先用正己烷渗漉，继用二氯甲烷渗漉，收集二氯甲烷渗漉液，减压回收二氯甲烷至干，残余物用醋酸乙酯溶解，以硅胶为吸收剂，正已烷－丙酮（75∶25）为洗脱剂，洗脱，收集含有红豆杉紫杉醇的洗脱液，减压回收溶剂至干，得红豆杉浸膏；再将甘草、红参粉碎成粗粉，用70％乙醇作溶剂，浸渍48小时后，缓缓渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，浓缩成稠膏，与上述含红豆杉浸膏混合，充分混匀，即得成品，但是，心有的制备技术工艺落后、采用大量有毒有害化学试剂，致使现有的复方红豆杉口服制剂存在溶散时限长、溶出度低、吸收差和生物利用度低等问题，从而影响药效发挥。因此，目前急需一种采用无毒无害试剂及新的提取方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供具备生物利用度更高，有效成分损失减少、含量更高、药效更优，且能更好地保护性地利用了珍稀濒危药材的一种复方红豆杉制剂的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种复方红豆杉制剂的制备方法，其操作步骤为：

一、红豆杉皮初级粉碎，至少通过20目筛，再超微粉碎，得红豆杉粉；

二、将红豆杉粉以乙醇为修饰剂和吸收液，采用超临界CO2流体萃取法，超临界CO2流体萃取法的压力为30 MPa，温度为40 ℃，萃取2.5小时，减压回收乙醇，得红豆杉浸膏；

三、将红豆杉浸膏用50%乙醇溶解，过XAD1600型大孔树脂柱，再用50%乙醇洗脱，后弃去50%乙醇洗脱液，再用85%乙醇洗脱，收集85%乙醇洗脱液，减压回收85%乙醇洗脱液的乙醇至无醇味，浓缩，得红豆杉浓缩液；

四、将甘草、红参粉碎成粗粉，加70%乙醇回流提取3次，每次1.5小时，过滤，得甘草红参滤液；

五、将甘草红参滤液减压回收溶剂后，再加甘草红参滤液质量的10倍量水溶解，过滤，得甘草红参水溶液；

六、甘草红参水溶液过D101大孔树脂柱，再用水洗脱，弃去水洗液，再用70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，得甘草红参浓缩液；

七、将甘草红参浓缩液与红豆杉浓缩液混合，充分混匀，得成品。

本发明的复方红豆杉制剂的制备方法中运用的技术工艺与原工艺相比，第一、替代了原工艺中的毒性较强的试剂二氯甲烷，并可回收利用，无环境污染，成本得到降低。

第二、采用新工艺，减少了浸膏量，提高了提取物中有效部分中的有效成分的含量，在相同剂量的情况下可有效减少服用量，生物利用度更高，药效得到提高。

进一步，所述的步骤一中，红豆杉皮是选取在采收后的2个月之内的红豆杉皮，初级粉碎之前采用温度低于60℃的低温干燥法干燥。由于紫杉醇及其衍生物对高温敏感，因此，需采用低温干燥法干燥，才可保证紫杉醇的含量不流失；另外，由于采收的红豆杉皮随着储藏时间的延长其紫杉醇及其衍生物含量会降解，因此采用的红豆杉皮应及时处理保藏不宜超过2个月。

进一步，所述的步骤一中，红豆杉皮的超微粉碎的时间为5~30min之间。粉碎作用时间越久所得的粉末粒径越小，对有效成分的溶出越有利。

进一步，所述的步骤一中，所述的红豆杉皮初级粉碎后，通过50~100目筛。初步粉碎越细，超微粉碎时的粉碎时间就会越短。

进一步，所述的步骤一中，所述的红豆杉粉通过100~10000目筛。

进一步，所述的步骤一中，低温干燥法的温度为-4~40℃之间。在粉碎过程中发现，温度越低对有效物质越有利但对粉碎设备要求更高，能耗更大。因此，综合考虑对设备要求，优选粉碎加工温度范围为-4℃—40℃。

进一步，所述的步骤一中，红豆杉皮的超微粉碎的时间为10~20min之间。采用超微粉碎将红豆杉皮粉碎成超微粉，虽然超微粉碎作用时间越久所得的粉末粒径越小，对有效成分的溶出越有利，但随着粉碎时间的延长，将产生大量的热量对活性物质将产生一定的影响，因此，选取粉碎10~20min。

进一步，所述的步骤一中，所述的红豆杉粉通过100-1000目筛。研究表明，各粉碎级别的红豆杉皮多糖溶出、三萜及甾醇溶出与红豆杉皮粉碎粒径相关，粒径越小，溶出时间越快，溶出度越大，在瞬时溶出的实验中显示，红豆杉皮目数在100~1000目、1000~10000目之间的溶出速率均十分迅速，有利于红豆杉皮有效成分的快速溶出，在实际生产过程中，100~1000目溶出已经足够快，因此，1000~10000目在生产中意义不大。

进一步，所述的步骤四中，由以上复方红豆杉制剂的制备方法制备的红豆杉制剂。

具体实施方式

本发明一种复方红豆杉制剂的制备方法，其各实施例的制备方法中参数选取，如表1所示：

表1

现以实施例一举例，具体说明本发明的制备方法。

实施例一：

复方红豆杉制剂的制备方法，其操作方法为：

一、选取在采收后1个月之内的红豆杉皮，采用温度为30℃的低温干燥法干燥，再将红豆杉皮用普通粉碎机初级粉碎，红豆杉皮初级粉碎后，过50目筛网，再超微粉碎，超微粉碎的时间为5min，得红豆杉微粉；

二、将红豆杉粉以乙醇为修饰剂和吸收液，采用超临界CO2流体萃取法，超临界CO₂流体萃取法的压力为30 MPa，温度为40℃，萃取2.5小时，减压回收乙醇，得红豆杉浸膏；

三、将红豆杉浸膏用50%乙醇溶解，过XAD1600型大孔树脂柱，用红豆杉浸膏质量的3倍量50%乙醇洗脱，后弃去50%乙醇洗脱液，再用85%乙醇洗脱，收集85%乙醇洗脱液，减压回收85%乙醇洗脱液的乙醇至无醇味，浓缩，得红豆杉浓缩液；

四、将甘草、红参粉碎成粗粉，粗粉的目数通过20目筛网，加70%乙醇回流提取3次，每次1.5小时，过滤，得甘草红参滤液，

五、将甘草红参滤液减压回收溶剂后，再加甘草红参滤液质量的10倍量水溶解，过滤，得甘草红参水溶液；

六、甘草红参水溶液过D101大孔树脂柱，用甘草红参水溶液质量的8倍量水洗脱，弃去水洗液，再用剩余溶液质量的8倍量70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，得甘草红参浓缩液；

七、将甘草红参浓缩液与红豆杉浓缩液混合，充分混匀，将其制备为胶囊剂，得成品。

实施例一~实施例八其制备方法与实施例一一致。

对比例一：复方红豆杉胶囊（重庆赛诺生物药业股份有限公司），批号1409025。

实验一：复方红豆杉制剂对大鼠Lewis肺癌的影响

1药物：

本发明的实施例一~实施例八；

对比例一：复方红豆杉胶囊（重庆赛诺生物药业股份有限公司，批号1409025）。

二者的剂量一致。

2动物及饲养

清洁级SD大鼠，6-8周龄，157.5-192.6 g/只，雌、雄各半。由重庆市中药研究院实验动物研究所提供，合格证号：SCXK（渝）2012-0006 。

实验动物分组饲养在清洁环境中，饲养设施符合清洁级实验动物的饲养要求。

动物饲养在受控环境中，温度20.3～22.9℃，日温差未超过4℃。动物房每天温度通过台式温度计读取并记录，由实验动物研究所保存。维持12小时明暗交替的光照循环，动物房间的换气次数为8次/小时，各项环境控制遵循实验动物研究所的SOPs。

3瘤株：Lewis肺癌购于中国科学院上海细胞库；

4方法

1）肺部动物模型的构建

在无菌条件下，取传代10d的Lewis肺癌瘤源大鼠，脱颈椎处死，无菌操作从腋部皮下剥取肿瘤组织，研磨后按1：3比例加生理盐水稀释成瘤细胞悬液，并调整细胞浓度为1×10⁷/ml，取SD大鼠每只0.2ml右前肢腋部皮下注射。

2）动物分组及给药

动物造模24小时后，随机分成模型对照组、对比例一组、实施例组，每组20只，雌雄各半。分组完成后模型对照组灌喂等量蒸馏水。所有组别均按照“复方红豆杉胶囊”说明书中规定使用剂量灌喂即10mg/kg/次，每日3次，均取食后灌喂。连续给药21天后休息5天为一个周期，连续给药3个周期。

3）肺癌抑瘤率的测定

三个用药周期结束后处死动物，解剖瘤体称其质量。按下列公式计算肿瘤抑制率：肿瘤抑制率=（对照组平均瘤质量-给药组平均瘤质量）/对照组平均瘤质量*100%。

4）统计学分析

使用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，以P<0.05为有统计学意义。

5结果，如表2所示：

表2各组对大鼠Lewis肺癌的抑制效果

注：与模型组相比，*P<0.05，** P<0.01；与对比例1相比△P<0.05。

从表2中可以看出，各组别对大鼠Lewis肺癌，实施例一~实施例八、对比例一均有显著的抑瘤作用（P <0.05），实施例一~实施例八与模型对照组相比，效果极其显著；实施例一~实施例八与对比例一相比，本发明实施例一~实施例八显著优于对比例一的效果，且实施例五的效果最佳，实施例七次之，实施例三、实施例一随其后。说明按照本发明的新技术工艺经过除杂、精制，疗效更佳，为今后技术工艺的提升及新制剂创制奠定了基础。

实验二：红豆杉皮粉碎粒径与溶出的关系。

以下通过红豆杉皮不同粉碎级别的有效成分溶出实验说明粉碎粒径与溶出的关系。定义粉碎粒径级别为：红豆杉皮粗粉（过20目药典筛）、红豆杉皮一级粉D90 =180-355um（约42~80目）、红豆杉皮二级粉D90=150-180um（约80~100目）、红豆杉皮三级粉D90=15-150um（约100~1000目）、红豆杉皮四级粉D90=1-15um（约1000~10000目）。不同粉碎级别的红豆杉皮粉末中有效成分随时间的溶出见表3。

1.紫杉醇含量的测定

照高效液相色谱法（中国药典2015年版一部附录Ⅵ D）测定。

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇－水－乙腈（24∶42∶36）为流动相；检测波长为227nm。理论板数按紫杉醇峰计算应不低于5000。

对照品溶液的制备：精密称取紫杉醇对照品适量，加乙腈制成每1ml含0.2mg的溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备：取本品装量差异项下的内容物，研细，混匀，精密称取适量（约相当于紫杉醇10mg），置100ml碘量瓶中，用氯仿-甲醇（2∶1）混合溶液，超声处理3次，第一次30ml，超声处理30分钟，后两次每次20ml，超声处理20分钟，滤过，合并滤液，在40℃下减压回收溶剂至干，残渣用乙腈溶解，转移至50ml棕色量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10µl，注入液相色谱仪，测定，即得。

表3 不同粉碎级别的红豆杉皮粉末中紫杉醇随时间的溶出（%）

不同粉碎级别的红豆杉皮粉末中紫杉醇含量测定结果如表3所示，红豆杉皮三级粉和红豆杉皮四级粉在1min时溶出极快，此时红豆杉皮粗粉溶出量极少，只有0.001%；红豆杉皮一级粉为0.002%；红豆杉皮二级粉为0.003%；红豆杉皮三级粉为0.005%；10min时，红豆杉皮三级粉和红豆杉皮四级粉分别为0.018%和0.021%，显著高于其它红豆杉皮粉组别的溶出量。30min后，各组别的溶出量均开始下降，可能与紫杉醇逐渐溶出后含量逐渐减少有关。红豆杉皮四级粉的溶出虽优于红豆杉皮三级粉，但并无显著性，且红豆杉皮三级粉溶出已经足够快，红豆杉皮四级粉在实际生产中意义不大，因此取红豆杉皮三级粉的粒径进行提取生产具有实际意义。

实验三：粉碎方法的研究

1、方法：取鲜品红豆杉皮，去除皮表面的杂质，采用上述普通低温干燥或冷冻低温干燥方法，干燥完成后按不同粉碎方式粉碎5min，按中国药典2015年版紫杉醇项下测定紫杉醇含量，比较不同粉碎方式对有效成分的影响。结果见表4：

试验组1：普通中药粉碎机，粉碎5分钟；

试验组2：组织捣碎机组，粉碎5分钟；

试验组3：胶体磨机组，粉碎5分钟；

试验组4：高速剪切机组，粉碎5分钟；

试验组5：超微粉碎机组，粉碎5分钟；

表4 不同粉碎方法对红豆杉皮中紫杉醇含量的影响

从表4可看出：不同的粉碎方法对红豆杉皮细胞组织的破碎程度不一样，致红豆杉皮粉末中紫杉醇含量差异明显，采用超微粉碎方法所得红豆杉皮多糖活性最强。因此，可确定采用超微粉碎方法进行红豆杉皮的破碎加工。

实验四：超微粉碎工艺参数及粉体性质的研究

在以上工艺中发现采用超微粉碎工艺红豆杉皮粉末中紫杉醇溶出度最高，药材微粉化后质地细腻，有利于有效成分溶出，但粉末粒径过细，易团聚、难分散，吸湿性增强，对设备要求高，不利于分离提取。为满足工业化大生产的需要对超微粉碎工艺中的关键参数粉碎时间及相应粉体性质进行了如下研究：

粉碎时间的考察：

方法：取鲜品红豆杉皮，去除表面杂质，采用上述普通低温干燥方法，干燥完成后切成细段（或细条），分别按以下试验进行粉碎工艺的考察，粉碎完成后按中国药典2015年版紫杉醇项下测定紫杉醇含量，比较不同粉碎时间对紫杉醇含量的影响，结果见表5。

试验组1：取干燥后的红豆杉皮小段500g放入超微粉碎机中，粉碎温度-4°C，粉碎时间5min；

试验组2：取干燥后的红豆杉皮小段500g放入超微粉碎机中，粉碎温度-4°C，粉碎时间10min；

试验组3：取干燥后的红豆杉皮小段500g放入超微粉碎机中，粉碎温度-4°C，粉碎时间15min；

试验组4：取干燥后的红豆杉皮小段500g放入超微粉碎机中，粉碎温度-4°C，粉碎时间20min；

试验组5：取干燥后的红豆杉皮小段500g放入超微粉碎机中，粉碎温度-4°C，粉碎时间25min；

试验组6：取干燥后的红豆杉皮小段500g放入超微粉碎机中，粉碎温度-4°C，粉碎时间30min；

表5 不同粉碎时间对紫杉醇含量的影响

超微粉碎作用时间越久所得的粉末粒径越小，对有效成分的溶出越有利，但随着粉碎时间的延长，将产生大量的热量，对有效物质及设备将产生一定的影响。同时，粉末粒径越小将导致粉体流动性变差，对分离提取不利。从表5可看出当粉碎时间超过10min时，各组紫杉醇含量差异不显著，表明作用时间超过10min即有利于有效成分溶出。从粉末休止角而言，当粉碎时间超过20min 时，休止角超过40 ^o，表明粉末流动性差，不利于产业化分离提取。因此，综合考虑优选粉碎加工时间范围为10min-20min为宜。

对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

Claims (4)

1.一种复方红豆杉制剂的制备方法，其特征在于，其操作步骤为：

取采收后的2个月之内的红豆杉皮，在-4～40℃的条件下将红豆杉皮低温干燥，然后将红豆杉皮初级粉碎，并通过50～100目筛，再超微粉碎5～30min，并通过100～10000目筛，得红豆杉粉；

将红豆杉粉以乙醇为修饰剂和吸收液，采用超临界CO₂流体萃取法，超临界CO₂流体萃取法的压力为30MPa，温度为40℃，萃取2.5小时，减压回收乙醇，得红豆杉浸膏；

将红豆杉浸膏用50％乙醇溶解，过XAD1600型大孔树脂柱，再用50％乙醇洗脱，后弃去50％乙醇洗脱液，再用85％乙醇洗脱，收集85％乙醇洗脱液，减压回收85％乙醇洗脱液的乙醇至无醇味，浓缩，得红豆杉浓缩液；

将甘草、红参粉碎成粗粉，加70％乙醇回流提取3次，每次1.5小时，过滤，得甘草红参滤液；

将甘草红参滤液减压回收溶剂后，再加甘草红参滤液质量的10倍量水溶解，过滤，得甘草红参水溶液；

甘草红参水溶液过D101大孔树脂柱，再用水洗脱，弃去水洗液，再用70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，得甘草红参浓缩液；

将甘草红参浓缩液与红豆杉浓缩液混合，充分混匀，得成品。

2.根据权利要求1所述的复方红豆杉制剂的制备方法，其特征在于：红豆杉皮的超微粉碎的时间为10～20min之间。

3.根据权利要求2所述的复方红豆杉制剂的制备方法，其特征在于：超微粉碎后，红豆杉粉通过100-1000目筛。

4.根据权利要求1～3中任意一项所述的复方红豆杉制剂的制备方法制备的红豆杉制剂。