CN1915219A - 稳定化的脂质体 - Google Patents

Abstract

一种制备可以同时耐受酸性和碱性pH条件的脂质体，可以适合于口服给药。本发明的脂质体是通过采用多羟基类物质稳定脂质体膜而实现的。本发明的脂质体可以耐受常规湿热灭菌，也可以在pH小于1的强酸性环境中维持2～5小时以上的稳定性，同时对于稀释处理也不敏感，较常规脂质体的稳定性有极大的提高。

Description

稳定化的脂质体

技术领域

本发明涉及一种稳定化的脂质体，更具体的，涉及同时对酸性环境和碱性环境稳定的脂质体，进而涉及可以耐受胃液或者更酸性条件、同时也可以在肠道中稳定的可口服给药的脂质体。本发明具体通过多羟基化合物稳定的脂质体，该脂质体具有耐酸性，可以在人工胃液环境中稳定2小时、优选5小时以上，同时在弱碱性环境中稳定24小时以上，适于口服给药，方便脂质体的给药途径。

背景技术

脂质体药物制剂是以磷脂等两性物质为基础的制剂，是将药物活性物质包封于类脂质双分子层形成的薄膜中间或者是包封于类脂质双分子层形成的中空囊泡内得到的。由于药物活性成分被包被于脂质体中，具有长效、靶向等优点，脂质体药物制剂在新品开发方面表现出极大的开发潜力。许多研究机构和制药公司都致力于脂质体药物新制剂新产品的开发。

但常规脂质体在作为药物载体方面有很多缺陷。表现在：1、常规脂质体更多的靶向网状内皮系统(RES)，对其他部位的疾病的治疗能力极为有限；2、药物作用持续的时间仍然不能满足相应的治疗要求；3、药物制剂的性能，尤其是稳定性仍然很差，或者不能以脂质体小球形式到达的预定的靶向部位，就起不到应有的靶向功能。所以，极有必要对脂质体进行稳定化修饰处理，以便获得满足治疗需要的各种脂质体药物制剂。

脂质体作为药物载体的应用，取决于脂质体在体内的稳定性、脂质体与靶细胞的选择性作用以及药物释放到靶细胞的效率和浓度。脂质体在体内到达靶向细胞需要成功完成几个步骤：1、脂质体必须到达靶细胞并且被靶细胞识别或者脂质体药物制剂识别靶细胞或其微环境，脂质体有选择性的与靶细胞作用，同时几乎不与非靶细胞作用。2、载于脂质体的药物在释放位点能达到所需要的药物浓度。3、药物靶向性不应产生不能允许的毒性程度。如果上述的任何步骤不能成功实现，脂质体药物的靶向治疗就不能实现或者是不成功。

脂质体应用的基础保障就在于其稳定性符合要求。结合具体的药物及其使用目的，以提高脂质体制剂的稳定性为目的的各种类型的脂质体修饰技术都在研究之中。脂质体膜的稳定性及作为药物载体的靶向性，是脂质体药物制剂研究的两个重要方面。

目前常见的脂质体修饰技术主要有：结合抗体的免疫脂质体技术、结合唾液糖蛋白、出芽短梗孢糖(CHP)等多糖物质的糖被覆脂质体、热敏感脂质体、pH敏感脂质体、磁性脂质体、长循环脂质体、前体脂质体、聚合膜脂质体等等。按照修饰的情况，将脂质体可以分为：常规脂质体、正电荷脂质体、免疫脂质体、被膜脂质体等几类。但是，目前来说，上述稳定脂质体的方案大部分是针对注射用脂质体的，对于口服脂质体的稳定化方法涉及甚少。

众所周知，相对于注射给药来说，口服药物不仅给药方便，而且病人的服药顺应性好。另一方面，口服药物一般是在肠道吸收后通过门静脉首先到达肝脏，因此，对于专门用于治疗肝脏疾病的药物来说，有助于避免注射给药时的全身效应，实现对肝的靶向化。

但是，由于胃肠道的特殊pH环境(在胃中pH处于强酸性环境，而到肠道以后很快转变为弱碱性环境)，常规脂质体很难实现脂质体对酸性pH的稳定，同时也难以实现同时对酸和碱性环境的耐受性，因此目前口服脂质体制剂的报道很少。

脂质体及其组成成分磷脂对pH变化比较敏感。所以，口服的脂质体药物制剂的治疗效果将很大程度上依赖于其胃排空时间的长短。对于那些胃排空时间长的药物，在制备成脂质体后，如果胃排空时间没有明显缩短，那么这种制剂的稳定性以及靶向功能将是很差的。另一方面，如果脂质体药物对酸性pH作用的耐受能力明显提高，另一方面，考虑再用一些胃排空时间短的药物或者缩短药物的胃排空时间，必然有助于药物使用效果的提高。当然本发明中的稳定化脂质体对体系pH的变化不那么的敏感。这类稳定化脂质体制剂治疗作用的发挥对于药物胃排空时间的依赖程度有所减小。

本发明的目的就是提供一种稳定化的脂质体系统，其具有较以往更为稳定的性质，可以口服给药。考虑到了胃肠道微环境的急剧变化对脂质体药物制剂的破坏，采用了各种修饰技术来保障脂质体药物制剂产品在消化道内以脂质体小球的形式进行吸收转运。也就保障了脂质体--作为药物载体--这种特殊形式的载体功能及其靶向功能得到顺利实现。

发明内容

本发明人等着眼于脂质体在耐受酸性和碱性pH条件下的稳定性，以提供适当的产品性能，满足口服给药系统或其他对酸性pH或者pH变化有特殊需求的脂质体使用途径对产品中脂质体的要求为目的。

本发明提供了一种稳定性良好的可以供胃肠道用药的脂质体系统。

另外，本发明还提供了上述脂质体的制备方法，本方法中脂质体的制备采用了乙醇注入法或者普通的磷脂分散技术，即将磷脂原料直接分散到合适的磷酸盐缓冲体系中，由于磷脂在水溶液中的分散性能制备脂质体。

根据本发明，提供一种同时在酸性和碱性pH下稳定的满足口服给药系统要求的脂质体制剂，其特征在于含有多羟基类物质作为稳定剂。

作为本发明中所采用的多羟基物质，优选使用环糊精、山梨醇、PEG等。

另外，在制备的脂质体中还可以添加保护物质维生素E等。

作为一种口服给药脂质体系统为基础的脂质体，本发明还强调产品的口服特性，注重产品的口味口感等方面的性能。采用了β-环糊精以及其它的水溶性香精等口味调节物质。在改善产品性能及优化产品的修饰等方面都有不同的作用。

作为一种脂质体修饰研究产品，与其他脂质体修饰技术类似，本发明采用了修饰材料PEG，对比选择了PVP、PEG等一系列亲水的高分子化合物。由于这些物质的使用，大大地提高了脂质体药物制剂产品的稳定性，也改观了产品的外观性能。实验数据表明，本发明修饰的脂质体药物制剂产品的稳定性可提高3个等级以上。

由于使用的亲水多羟基类材料作为修饰物质，本发明中的脂质体药物制剂的外观不再是纯粹的天然的黄色，而是乳白色或者很浅的黄色。本发明的脂质体产品的外观得到了改善。

具体实施方式

以下具体描述本发明的技术方案。

根据本发明，提供了一种同时在酸性pH和碱性pH条件下都稳定的特别是适合口服给药的脂质体系统，同时也提供了制备该同时在酸性和碱性pH条件下都稳定的脂质体系统的方法。

本发明的在酸性和碱性pH下都稳定的可以满足口服给药系统要求的脂质体制剂的特征在于含有多羟基类物质作为稳定剂。

我们通过研究发现，在传统的制备脂质体的磷脂中加入多羟基类物质，可以有效地提高该脂质体在酸性条件下的稳定性和对pH变化的稳定性。

因此，本发明为在酸性pH和碱性pH下稳定的满足口服给药系统要求的脂质体制剂，含有磷脂和多羟基类物质作为必要成分。

磷脂是构成脂质体脂质双层的必须物质，是完成本发明目的的必须成分。

作为用来形成脂质体的磷脂类物质，只要可以形成脂质双层，可以使用任何天然或者合成的磷脂类物质，也可以使用一种磷脂类物质或者多种磷脂类物质的混合物，本发明中对此不加限定。作为天然的磷脂类物质，例如卵磷脂、脑磷脂、大豆磷脂、鞘磷脂等。合成磷脂如二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰卵磷脂等。上述合成磷脂中，当分子中存在顺反异构体的时候，可以单独使用顺式或者反式的异构体或者使用顺反异构体的混合物；在分子中存在不对称碳原子的情况下，可以使用其光学异构体、非对映异构体混合物或者外消旋体。

其中，由于生物来源的磷脂类如蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂等，由于原料来源广泛及价格低廉，所以优选。

当然采用合成的或者更多的复杂的磷脂的组合来研制脂质体，理论上也可以形成类似的对pH变化稳定的脂质体。那样不具备本发明所描述的更适合于工业化或者成本更便宜的优点。根据不同产品级别的要求，本发明可以采用纯度较低的天然磷脂，这样可以大大的降低脂质体产品的生产成本。

作为本发明中的多羟基类物质，是指分子中具有2个或3个以上的多个羟基的水溶性物质。具体来说，如单糖、低聚糖、水溶性多糖、二元醇、小分子多元醇、高分子多元醇等。单糖有四碳糖、戊糖、己糖和庚糖等，例如赤藓糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等。低聚糖如二糖、三糖、四糖以及环糊精等，例如有蔗糖、麦芽糖、乳糖、乳果糖、海藻糖、麦芽三糖、α、β、γ-环糊精等。水溶性多糖是指可以溶于水的糊精、纤维素或者淀粉等多糖的衍生物。二元醇、小分子多元醇例如有乙二醇、丙二醇、甘油(丙三醇)、以及木糖醇、山梨醇、甘露醇等糖醇。高分子多元醇例如各种聚合度不同的聚乙二醇(PEG)或其可药用的衍生物、聚乙烯醇等。上述多羟基类物质可以单独使用，也可以使用多种物质的混合物。

作为本发明中所采用的多羟基类物质，优选使用环糊精、山梨醇、PEG等。

虽不拘泥于任何已有理论，但是本发明的多羟基类物质对磷脂双层的稳定作用大致可以归结为：主要是通过多羟基类物质的亲水性能代替了原来脂质体小球外层的磷脂极性端与缓冲体系中水成分的作用，由于这种作用比较原来的磷脂极性端与水的作用要强，也就提高了脂质体小球的对微环境变化的稳定性。

对以上几种物质在本发明中的各自功能分析如下：

山梨醇等多元醇以及上述的单糖和二糖、三糖等在本发明的脂质体中作为一种小分子的磷脂分散载体存在，有助于形成更小的更均匀的脂质体。这类物质中优选多元醇，更优选山梨醇、甘露醇等糖醇，最优选山梨醇。

环糊精作为常用的包合物质，可以改进对药物的有效包封，改善产品的性能。常见的环糊精有α、β、γ-环糊精等，优选β-环糊精。本发明中，当提及环糊精时，不仅包括环糊精，也包括对其结构进行了修饰的产品，如羟丙基-β-环糊精等。

聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇和上述水溶性多糖等可以在脂质体小球外层形成一层保护层，提高脂质体小球的体内外稳定性。其中，优选的是聚乙二醇。聚乙二醇例如有PEG200～PEG10000等，优选PEG400～PEG8000，更优选PEG800～PEG4000。

本发明中，上述多羟基类物质含有至少一种，优选至少2种，更优选至少3种不同类型的多羟基物质，例如同时含有山梨醇、环糊精和PEG等。

本发明中，作为成膜剂磷脂和膜稳定物质多羟基化合物的各自含量及其配比，只要能够满足制成脂质体并使之稳定的目的，可以任意选择，不过优选天然磷脂，其使用量占体系总体的1.0％-9.0％。

多羟基类物质(如：山梨醇、环糊精和/或PEG)，在脂质体体系中与磷脂的重量比为1∶1-3∶1。

在传统意义的脂质体配方中，胆固醇类物质，如胆固醇、胆固醇酯、β-谷甾醇、牛胆酸盐等也用作为脂质体的膜稳定剂。本发明中，因为含有多羟基类物质作为稳定剂，因此不特别要求必须含有胆固醇类物质。

构成磷脂膜的磷脂在常规条件下容易发生氧化，因此优选在制备的脂质体中添加保护物质。作为保护物质，例如有生育酚(α-生育酚即维生素E、β-、γ-、δ-生育酚等)、生育三烯酚(α-、β-、γ-、δ-生育三烯酚等)、丁基羟基甲苯(BHT)等。优选维生素E(α-生育酚)。保护物质可以根据实际情况(例如所使用磷脂的性质、缓冲液的情况以及所含药物的性质等)适量添加，本发明中不拟作出限定。

需要注意的是，由于维生素E等物质是脂溶性的，因此制备时不推荐将其直接分散于水相中，而是采用少量的有机溶剂如无水乙醇溶解后，在分散制备脂质体完成后，加入到脂质体的均匀体系中。根据磷脂原料的组成特点，可以选择性的使用。

在作为口服给药用的脂质体的时候，在组成中还可以加入常规口服制剂所采用的改善产品的口服特性，如口味、口感等方面的性能的物质。例如，可以加入β-环糊精以及水溶性香精等口味调节物质，以及矫臭矫味剂等物质。上述物质可以采用常规的口味调节物质或者矫臭矫味剂等，本发明中对此不加限制。在使用甜味剂如蔗糖、麦芽糖、麦芽糖醇、木糖醇等的时候，显然它们作为多羟基物质也可以发挥磷脂稳定化的作用。

除了使用本发明中特定的稳定剂以外，本发明的脂质体可以按照常规方法包封各种脂溶性或者水溶性药物，以便在胃肠道吸收后随血液循环或者进入淋巴系统到达靶点或者靶器官发挥药效活性。

作为脂质体可以包封的药物，参见陆彬，《药物新剂型与新技术》人民卫生出版社，1998年4月：107-164页，例如有抗肿瘤药物、抗寄生虫药物、抗生素、抗真菌药物、抗病毒药物、抗结核药物、其它化疗药物、甾体抗炎药物、非甾体抗炎药物、激素、酶、抗体、治疗重金属中毒的药物(螯合剂等)、免疫调节剂、遗传物质等、各种内源性物质等、天然产物如多糖、生物碱、萜类、糖苷、皂苷等，本发明中不拟对此作出限制。

其中，作为可以治疗病毒感染的广谱抗病毒药物，三氮唑核苷(利巴韦林，ribavirin)可抑制单磷酸次黄嘌呤核苷(IMB)脱氢酶、从而抑制IMB转变为鸟苷酸，阻碍病毒核酸的合成，而达抗病毒作用。因为可以对各种肝炎病毒发挥治疗作用，因此在利用本发明的脂质体制备治疗肝炎的药物时，特别优选。

在脂质体中，必要成分磷脂和稳定成分多羟基物质等是在水相中形成磷脂双层从而构成脂质体的。本发明中，对构成水相的溶液不加特别限制，例如可以采用等渗或者非等渗的药物成分的水溶液、缓冲液、生理盐水、葡萄糖水溶液等。水溶液中也可以在加入其它生理活性物质如氨基酸、维生素等。因为本发明的稳定化脂质体可以适于口服，因此不特别要求该水溶液是等渗的。

作为上述水溶液成分，优选采用缓冲液，通过使用缓冲液，可以避免pH的过分剧烈的变化，对进一步稳定脂质体体系更为有利。缓冲体系在脂质体溶液体系中的作用可以从下列几个方面来理解：1、脂质体的膜材成分磷脂等易发生水解和氧化，这跟脂质体溶液体系的pH值、离子强度、缓冲容量及缓冲能力、缓冲体系和溶剂系统都有关系。加入合适的缓冲盐溶液可以减缓脂质的氧化。2、脂质体属于胶体分散体系，属于热力学不稳定体系。如果没有合适的pH值，脂质体表面所带的电荷强度不够(ζ电位小于-25mv)，易聚集而导致体系分解。3、脂质体包封率和载药量跟pH有一定的关系，这跟药物的性质有关。比如离子梯度包封法正是利用pH对药物包封率的影响来发挥作用的。在制备脂质体时，可以采用的缓冲液有磷酸盐缓冲液、氨基酸类缓冲溶液、Tris溶液，其中磷酸盐缓冲体系(PBS)由于磷酸具有磷酸氢盐和磷酸二氢盐，pH调节范围宽，缓冲容量大，故而优选。磷酸盐缓冲液可以使用磷酸的钠盐或钾盐。

磷酸盐缓冲液中使用的盐的浓度，可以根据使用的磷脂种类规格的不同，适当进行调整。其中磷酸氢二钠或磷酸氢二钾与磷酸二氢钠或磷酸二氢钾的使用比例为5∶1-30∶1。

作为一种脂质体修饰研究产品，本发明的脂质体通过具有上述的组成大大的提高了脂质体药物制剂产品的稳定性。实验数据表明，与以往的脂质体制剂相比，本发明的修饰的脂质体药物制剂产品的在保持对碱稳定的同时，对酸的稳定性有极大的提高，可望用作可以口服的脂质体制剂。

本发明中制备的脂质体能够在pH值小于1的强酸性体系内稳定5小时以上。在稳定性方面充分满足了酸性pH条件下稳定的口服给药的要求，为这种脂质体口服药物制剂的靶向治疗提供了保障。

作为本发明特别优选的一例技术方案，具体可以举出含有以下成分形成的脂质体：

磷脂                      15-90克

山梨醇                    20克-150克

β-环糊精                 2克-50克

PEG                       2克-50克

维生素E                   2克-20克

磷酸氢二钠(12水)          2克-15克

磷酸二氢钠(2水)           0.2克-2克

药物(利巴韦林)            1-10克

靶向功能物质(如乳糖)      1-50克

水                        余量

乙醇                      适量

样品总体积                1,000mL

(注：磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的水溶液组成PBS，乙醇用于溶解脂溶性成分)

上述脂质体可用于治疗或辅助治疗各种病毒性肝炎或改善肝炎症状。

上述组成中，磷脂、山梨醇、β-环糊精、PEG、维生素E、PBS等各个成分的功能分别如上所述。

为了进一步保障本发明中制备的脂质体的靶向功能，可以根据特定的治疗目的，使用一些具有明确的靶向功能物质。本发明中使用的药物利巴韦林是一种抗病毒药物，我们采用乳糖这种具有明确的肝靶向功能的物质，可以进一步加强其进入血液循环后的肝靶向作用，对发挥预期的疾病治疗的目的更为有利。

作为靶向功能物质，除了乳糖以外，也可以使用大豆甾醇及其葡萄糖苷等。作为口服给药脂质体系统的组成，它的作用有：能够提高药物的吸收，提高肝靶向性，提高抗肿瘤药物的活性。重要的是，它也有类似于胆固醇且强于胆固醇的脂质体膜的稳定功能。

以下说明本发明的脂质体的制备方法。

本发明采用的脂质体制备方法可以采用常规方法制备，例如参见陆彬，《药物新剂型与新技术》人民卫生出版社，1998年4月：107-164页，可以采用注入法或将磷脂直接分散与合适浓度的磷酸盐缓冲体系中制备脂质体。

当采用注入法时，是将脂质和脂溶性物质溶于有机溶剂中形成透明均匀溶液，然后把它均速注射到恒温在有机溶剂沸点以上的水相(含水溶性药物的缓冲溶液)中，搅拌挥尽有机溶剂，再乳匀或超声得到脂质体。注入法常用溶剂有乙醚、乙醇等。根据溶剂不同可分为乙醚注入法和乙醇注入法，一般来说，在相同条件下，乙醚注入法形成的脂质体大于乙醇。注入法的优点是脂质在乙醚中的浓度不影响脂质体大小。缺点是使用有机溶剂和高温，会使大分子物质变性和对热敏感的物质灭活，脂质体粒度不均匀。

磷脂分散法进行制备的方法就是将磷脂直接添加到适量的缓冲溶液中，经过冷冻搅拌或者研磨使磷脂均匀的分散在缓冲体系中，形成脂质体。然后添加一定的保护物质，比如维生素E的少量乙醇溶液。

以下以上述优选组成为例具体说明本发明的脂质体系统的制备方法及制备过程(磷脂分散法)。

本发明的脂质体制备方法应当至少包括以下步骤：

1，按照配方用量称取可药用的试剂磷酸盐如磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，溶解于纯化水或者更高级别的处理水中，配制磷酸盐缓冲液(PBS溶液)；

2，按照配方用量称取磷脂、稳定剂溶于PBS溶液中。室温下(约13℃-约30℃)搅拌，配制脂质体制剂体系；

3，真空蒸馏处理步骤2)的体系，除去体系内部的空气，顺便除去体系中的乙醇；

4，对得到的脂质体进行过滤处理，使产品的直径分布均一化。调整缩小脂质体药物制剂产品直径分布的范围。

具体的，其制备过程可以依次为：

1，称取分析纯或可药用级别的试剂磷酸氢二盐、磷酸二氢盐，溶解于纯化水或者更高级别的处理水中，配制磷酸盐缓冲液；

2，称取药物利巴韦林、磷脂、山梨醇、β-环糊精等，溶于一定量的PBS溶液中。室温下(13℃-30℃)搅拌配制脂质体制剂体系。我们推荐使用的搅拌速度为400rpm～1,500rpm；

3，称取维生素E等保护物质，用少量的无水乙醇溶解，配制成为均匀的溶液。适当加热帮助溶解。待步骤2)操作完成后一段时间(如5分钟左右)内，向2)的体系中，缓慢加入步骤3)的溶液；

4，称取PEG 2,000，靶向功能物质，溶于剩余的PBS溶液中。视情况而定可以适当加热帮助溶解。待步骤3)操作完成后一段时间(如5分钟左右)内，向3)的体系中，加入步骤4)的溶液。继续搅拌一段时间(如15分钟左右)；

5，真空蒸馏处理步骤4)的体系，除去体系内部的空气，顺便除去体系中的乙醇；

6，体系中蒸除略大于乙醇使用量体积的溶剂量，即获得了本发明的脂质体。具体按产品质量要求确定。

7，在获得脂质体后，也可优选的通过进行过滤或者离心处理，调整脂质体药物制剂产品直径。通过本步骤，可以使产品的直径分布均一化。缩小脂质体药物制剂产品直径分布的范围。

本发明脂质体可以根据需要制成各种药物制剂成品。如可口服的各种制剂例如口服液，也可以根据需要在适当条件下加工成其他的制剂。

通常，由于脂质体药物制剂产品的质量很容易受到外界因素的影响。所以产品制成后还需要进行灭菌处理。本发明脂质体可以经受121℃，20分钟的常规湿热灭菌处理。因此无需采用技术和成本上更为复杂的诸如膜过滤等方式灭菌，在生产上也是有利的。

本发明的稳定化脂质体制剂具有出色的稳定性，从后面的稳定性试验可以看出：

1.按照本发明的各脂质体，在各种酸性pH条件下，60分钟没有明显的变化，经过显微观察表明，与刚制备完成的样品没有差别，为均匀的脂质体小球。330分钟后，样品才开始缓慢变化。7小时后脂质体体系彻底分解成为棕色絮状沉淀。

在碱性pH的实验中，没有明显变化，连续放置24小时后，经离心检查仍然不出现分层。

对照的不含有修饰组分的脂质体样品在pH＝3的条件下，同等温度考察稳定性，其维持稳定的时间仅仅2小时。而在pH＝1的条件下，维持稳定的时间仅仅30分钟。

2.稀释处理后样品稳定性的考察

2.1稀释后强酸性条件下的样品稳定性考察：将样品稀释10倍、20倍、50倍后，用浓磷酸调节pH至强酸性，(pH＜1)，36-38℃水浴，每隔30分钟震荡均匀。并观察记录现象。

试验表明，10倍、20倍、50倍稀释处理后的脂质体样品在(pH＜1)强酸性条件下可以维持7小时左右(实验数据省略)。

2.2生理盐水稀释处理后稳定性考察：用氯化钠配制0.9％的生理盐水，用于考察脂质体样品的稳定性。

按照成人体内血液总量近4升的参考值，按照一次服用10毫升的参考方案进行试验：取脂质体样品一支，约10毫升，取一组试管，通过一套放大过程稀释样品400倍，然后将最后的稀释液36-38℃水浴考察稳定性。稳定时间持续达到48小时以上。(在本研究考察的48小时内没有明显变化。实验数据省略。)

2.3生理盐水稀释处理后强酸pH稳定性考察：按照2.2方法稀释样品并用浓磷酸调节至强酸性，(pH＜1)，36-38℃水浴，每隔30分钟震荡均匀。

试验表明，样品可以保持稳定5小时左右。实验数据省略。

3.在上述试验中，我们采用了磷酸来调节pH的变化。其原因如上所述，是因为缓冲体系使用的磷酸盐缓冲体系，使用磷酸来调节pH可以在大范围内调节pH，排除其它因素对脂质体稳定性的影响。

但是作为口服产品，脂质体进入消化道后，遭遇到的pH的变化不是磷酸的环境，而是盐酸的环境。所以我们又模拟胃液的组成，补充了以盐酸为基础来调节体系pH的稳定性实验。

实验表明(参见实施例部分的稳定性考察部分)即使在pH远低于胃液pH(最低约1.5～2.5左右)的小于1的情况下，本发明的脂质体也符合预期发明目的，虽然使用盐酸来调节pH，对缓冲体系造成了一定的破坏，即破坏了脂质体稳定存在的基础，脂质体对环境的敏感性增加，其保持稳定的时间明显降低(降低2-3小时)。但是，显然，作为一个运动的过程，脂质体在消化道内经历相当于稳定时间那么长时间极端pH的条件的可能性很小，因此可断定，该脂质体修饰方法的产品对极端pH的耐受性有了很大程度的提高，对脂质体膜的保护作用得到了增强。可以满足口服途径的用药需求。

根据上述研究考察，本发明的口服给药脂质体系统在类似胃液的强酸性条件下可以维持2～5小时以上的稳定。根据口服药物传递体统(DDS)遭遇pH变化剧烈的特点进行的一系列pH稳定性考察，说明本发明的脂质体系统可以用作口服用，并保障脂质体的稳定性及靶向性(一般情况下，胃排空时间为2小时)。

本发明的脂质体系统，可以经受121℃，20分钟的湿热灭菌处理，同时可以在稀释处理及pH小于1的强酸性条件下维持2～5小时以上的稳定性，因此是迄今所未能获得的具有出色稳定性的脂质体，可以满足口服的需要，极大的改善了脂质体制剂的使用便利性和病人的服用顺应性。

实施例

以下通过实施例进一步说明本发明。

所使用试剂，除特别说明外，均为市售分析纯试剂。

实施例1：脂质体的制备1

称量12水合磷酸氢二钠4.75克、2水合磷酸二氢钠0.52克、山梨醇3.00克、β-环糊精1.50克、PEG-2000 1.04克，溶解于180ml水中。

称量磷脂14.09克，维生素E 1.61克，溶解于30ml无水乙醇中。形成均匀透明的磷脂乙醇溶液。

将水溶液放置于三口瓶中，60℃水浴加热，同时搅拌使内外温度平衡。待温度平衡后，通过恒流泵向水溶液中连续慢速加入磷脂-乙醇溶液。制备脂质体。

旋转蒸发去除体系内的空气及部分乙醇。后用纯水补充调节体系的体积为200mL。

通过G3规格的漏斗过滤后，按照设计规格进行分装，120℃灭菌处理。

实施例2：脂质体的制备2

称量12水合磷酸氢二钠8.91克、2水合磷酸二氢钠1.06克、山梨醇6.04克、β-环糊精3.02克、PVP 2.03克，溶解于400ml水中。

称量磷脂35.12克、维生素E 3.05克，溶解于72ml无水乙醇中。形成均匀透明的磷脂乙醇溶液。

将水溶液放置于三口瓶中，60℃水浴加热，同时搅拌使内外温度平衡。待温度平衡后，通过恒流泵向水溶液中连续慢速加入磷脂-乙醇溶液。制备脂质体。

旋转蒸发去除体系内的空气及部分乙醇，然后用纯水补充调节体系的体积为400mL。

通过G3规格的漏斗过滤后，按照设计规格进行分装，120℃灭菌处理。

实施例3：脂质体制备3

称量12水合磷酸氢二钠4.38克、2水合磷酸二氢钠0.28克、山梨醇1.52克、β-环糊精0.77克、PEG-2000 0.53克，溶解于100ml水中。

称量磷脂6.97克，放进陶瓷研钵中，倒入40ml水溶液。放置在冷冻冰箱(-20℃)中过夜。第二天研磨搅拌，使体系彻底分散均匀。研磨搅拌过程中，不断添加剩余的水溶液。

称量维生素E 0.82克，溶解于5ml无水乙醇中。形成均匀透明的溶液。然后将维生素E的溶液倒入脂质体样品中，研磨搅拌15分钟。

通过G3规格的漏斗过滤后，按照设计规格进行分装，120℃灭菌处理。

实施例4：脂质体的制备4

称量12水合磷酸氢二钠8.05克、2水合磷酸二氢钠0.42克、山梨醇3.12克、β-环糊精1.01克、利巴韦林2.01克，溶解于180ml水中。

称量磷脂9.82克，维生素E 0.49克，溶解于50ml无水乙醇中。形成均匀透明的磷脂乙醇溶液。

将水溶液放置于三口瓶中，60℃水浴加热，同时搅拌使内外温度平衡。待温度平衡后，通过恒流泵向水溶液中连续慢速加入磷脂-乙醇溶液。制备脂质体。

旋转蒸发去除体系内的空气及部分乙醇。后用纯水补充调节体系的体积为200mL。

通过G3规格的漏斗过滤后，按照设计规格进行分装，120℃灭菌处理。

实施例5：脂质体的制备5

称量12水合磷酸氢二钠11.75克、2水合磷酸二氢钠1.42克、山梨醇5.62克、β-环糊精2.28克、乳糖1.04克、利巴韦林4.38克。溶解于180ml水中。

称量磷脂20.18克，维生素E 1.68克，溶解于50ml无水乙醇中。形成均匀透明的磷脂乙醇溶液。

将水溶液放置于三口瓶中，60℃水浴加热，同时搅拌使内外温度平衡。待温度平衡后，通过恒流泵向水溶液中连续慢速加入磷脂-乙醇溶液。制备脂质体。

旋转蒸发去除体系内的空气及部分乙醇。后用纯水补充调节体系的体积为400mL。

通过G3规格的漏斗过滤后，按照设计规格进行分装，120℃灭菌处理。

实施例6：脂质体的制备6

称量12水合磷酸氢二钠8.35克、2水合磷酸二氢钠1.82克、山梨醇4.05克、β-环糊精2.03克、乳糖0.71克、PEG 600 0.61克、利巴韦林3.38克。溶解于300ml水中。

称量磷脂14.74克，维生素E 1.52克，溶解于50ml无水乙醇中。形成均匀透明的磷脂乙醇溶液。

将水溶液放置于三口瓶中，60℃水浴加热，同时搅拌使内外温度平衡。待温度平衡后，通过恒流泵向水溶液中连续慢速加入磷脂-乙醇溶液。制备脂质体。

旋转蒸发去除体系内的空气及部分乙醇。后用纯水补充调节体系的体积为300mL。

通过G3规格的漏斗过滤后，按照设计规格进行分装，120℃灭菌处理。

实施例7：脂质体的制备7

称量12水合磷酸氢二钠8.75克、2水合磷酸二氢钠1.22克、山梨醇5.62克、β-环糊精2.28克、乳糖1.04克、利巴韦林4.38克。溶解于180ml水中。

称量磷脂20.18克，溶解于50ml无水乙醇中。形成均匀透明的磷脂乙醇溶液。

将水溶液放置于三口瓶中，60℃水浴加热，同时搅拌使内外温度平衡。待温度平衡后，通过恒流泵向水溶液中连续慢速加入磷脂-乙醇溶液。制备脂质体。

取维生素E 1.68克，溶解于10mL无水乙醇中，预热后加入到脂质体溶液中，继续搅拌10分钟。

旋转蒸发去除体系内的空气及部分乙醇。后用纯水补充调节体系的体积为200mL。

通过G3规格的漏斗过滤后，按照设计规格进行分装，120℃灭菌处理。

实施例8：样品的稳定性考察

分别取实施例1-7所得的脂质体样品各10支，每个实施例样品均按照下表比例以磷酸和氢氧化钠溶液调节pH。进行pH稳定性实验。pH稳定性实验的温度为36-38℃，每隔25-35分钟振荡1次，并观察实验结果。其中的对照组就是不添加任何改变pH的物质。

脂质体pH稳定性考察的实验方案表

编号	0-CK	1	2	3	4	6
							脂质体氢氧化钠(2M)pH	10ml0ml7.2	10ml6.0ml9.6	10ml0.8ml7.5	10ml0.6ml7.4	10ml0.4ml7.4	10ml0.2ml7.3

编号	0-CK	6	7	8	9	10
							脂质体磷酸pH	10ml0ml7.2	10ml0.2ml6.8	10ml0.4ml6.2	10ml0.8ml5.8	10ml2.0ml1.6	10ml4.0ml0.7

结果如下：

◆60分钟后，所有样品均看不到明显的变化，经过显微观察表明，与刚制备完成的样品没有变化，为均匀的脂质体小球。

◆120分钟后，1-8号样品没有明显变化。与60分钟时相比，9-10样品的颜色略有加深。

◆240分钟后，1-8号样品没有明显变化。9-10样品的颜色有加深的现象。

◆330分钟后，1-8号样品没有明显变化。

◆7小时后，1-5号样品没有明显变化。其它各样品的分层逐渐明显，说明脂质体小球在缓慢解体。显微观察上层深色物质，发现大量的絮状沉淀。

◆在碱性pH的实验中，各组样品均没有明显变化，连续放置24小时后，经离心检查仍然不出现分层。

◆上述实验中，各实施例所得脂质体表现无显著差异。

对照的不含有修饰组分的脂质体样品在pH＝3的条件下，同等温度考察稳定性，其维持稳定的时间仅仅2小时。而在pH＝1的条件下，维持稳定的时间短于30分钟。

通过上述实验的对比观察，我们可以知道，采用本发明的修饰方法制备样品的稳定性得到了较大的提高。

实施例9：盐酸处理条件下，样品的稳定性考察

分别取同一实验条件下制备的脂质体样品1支。放到标记好的干净试管中，分别加入浓盐酸0.5ml、1ml。混匀后在37℃水浴中放置，每30分钟观察振荡一次。其结果为：

时间	30min	60min	90min	120min
					HCl 0.5mlHCl 1ml	无变化无变化	无变化无变化	无变化无变化	无变化絮状物
时间	150min	180min	210min	240min
					HCl 0.5mlHCl 1ml	少量絮状物明显变质	少量絮状物褐色物质	絮状物增多-	不稳定絮状-

上述实验中，各实施例所得脂质体表现无显著差异。

如上实验结果所示可见，即使在pH远低于胃液pH(最低约1.5～2.5左右)的小于1的情况下(10毫升脂质体溶液中分别加入0.5ml、1ml浓盐酸，pH值均小于1)，本发明的脂质体也能达到预期发明目的。虽然使用盐酸来调节pH，对缓冲体系造成了一定的破坏，即破坏了脂质体稳定存在的基础，脂质体对环境的敏感性增加，其保持稳定的时间明显降低(降低2-3小时)(当然，进入消化道同时还会存在着一些消化道酶对脂质体膜的破坏影响)，但是，显然，作为一个运动的过程，脂质体在消化道内经历象稳定时间那么长时间极端pH的条件的可能性较小，因此可以断定，该脂质体修饰方法的产品对极端pH的耐受性有了很大程度的提高，对脂质体膜的保护作用得到了增强。可以满足口服途径的用药需求。

根据上述实验研究及样品的性能考察，本发明的口服给药脂质体系统在类似胃液的强酸性条件下可以维持2～5小时以上的稳定。根据口服药物传递体统(DDS)遭遇pH变化剧烈的特点进行的一系列pH稳定性考察，说明本发明的脂质体系统可以用作口服用，并保障脂质体的稳定性及靶向性(一般情况下，胃排空时间为2小时)。

Claims (10)

1.稳定化的脂质体，其采用多羟基类物质作为脂质体修饰剂，可以同时在酸性条件和碱性条件下保持稳定2～5小时以上。

2.根据权利要求1的脂质体，其中采用磷脂类物质为天然磷脂。

3.根据权利要求1～2任一项的脂质体，其中多羟基类物质选自单糖、低聚糖、水溶性多糖、二元醇、小分子多元醇、高分子多元醇中的一种或者多种。

4.根据权利要求3的脂质体，其中单糖选自赤藓糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖和果糖；低聚糖选自蔗糖、麦芽糖、乳糖、乳果糖、海藻糖、麦芽三糖和环糊精；水溶性多糖选自水溶性糊精、纤维素和淀粉的衍生物；二元醇、小分子多元醇选自乙二醇、丙二醇、甘油、木糖醇、山梨醇和甘露醇；高分子多元醇是聚乙二醇或其可药用的衍生物、或者聚乙烯醇。

5.根据权利要求1的脂质体，其中多羟基类物质是环糊精、山梨醇和聚乙二醇中的一种、两种或三种。

6.根据权利要求1～5任一项的脂质体，其中基本上不含有胆固醇类物质。

7.根据权利要求1～6任一项的脂质体，其中还含有保护物质，保护物质为生育酚、生育三烯酚或丁基羟基甲苯。

8.根据权利要求7的脂质体，其中保护物质为维生素E。

9.根据权利要求1～8任一项的脂质体，其中构成水相的溶液是磷酸盐缓冲液，其成分为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠或者磷酸氢二钾和磷酸二氢钾。

10.根据权利要求1～9任一项的脂质体，能够在pH值小于1的强酸性体系内稳定2～5小时以上。