CN1840198A

CN1840198A - 一种药物增溶载体及其制备方法和应用

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Publication number: CN1840198A
Application number: CN 200610037810
Authority: CN
Inventors: 周建平; 霍美蓉; 魏彦; 张勇; 许向阳; 李玲; 张祖菲
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2006-01-16
Filing date: 2006-01-16
Publication date: 2006-10-04
Anticipated expiration: 2026-01-16
Also published as: CN100450549C

Abstract

本发明公开了一种药物增溶载体及其制备方法和应用。该载体是在壳聚糖骨架6位和2位分别引入亲水性的羧甲基或羟乙基和疏水性的烷基或烷酰基，使其能在水中自组合成纳米胶束的具有两亲性的壳聚糖衍生物。该载体临界聚集浓度低，载药量高、毒性小、药物包封率高，纳米胶束稳定，可作为难溶或微溶性药物的载体，本发明制备方法简单，工艺成熟，适于大规模连续生产。

Description

一种药物增溶载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及一种以壳聚糖为原料的药物增溶载体，本发明还涉及该载体的制备方法及其应用。

背景技术

纳米技术和可生物降解材料均是当前发展药物传输系统的热点研究领域。聚合物纳米胶束研究融合两者的优势，即可生物降解，又可形成药物纳米载体。聚合物纳米胶束具有以下特征：

1、亲水性和柔韧性：聚合物在水中可自发形成胶束，其疏水部分互相缠绕形成“内核”，而亲水性部分则环绕在外，形成柔韧的亲水性“外壳”，疏水性的内核作为药物的载体或储库为疏水性药物提供了一个稳定的微环境，亲水性的外壳使纳米胶束能够稳定地存在于水溶液中和体液中。

2、稳定性：聚合物具有较低的临界聚集浓度(Critical micelle concentrations，CMC)和较高的玻璃态转化温度(T_g)，使聚合物具有高度的热力学稳定性和动力学稳定性，从而聚合物胶束在CMC以下不易被破坏，即具有很高的耐稀释能力，这也预示着血液的稀释作用不会对聚合物胶束的稳定性造成影响，聚合物胶束能以完整的胶束结构在血液中循环，达到长循环和靶向的目的。

3、生物相容性聚合物：在体内可以通过水解或酶解途径被降解为具有生物相容性的单体而排出体外，在体内不会产生积蓄作用。

4、缓释药物特性：药物一般以被动扩散方式释放，由于共聚物纳米胶束疏水性内核的刚性结构及疏水性物质间强大的内聚力，使其释药速率释放缓慢。

5.靶向性：聚合物纳米胶束具有被动靶向，这主要是因为(1)嵌段共聚物胶束的分子量一般大于10⁶，所以不会被肾排泄；(2)10～100nm的粒径范围及亲水性且柔韧性的外壳，使其被网状内皮吞噬系统(RES)识别和摄取的机会也大大下降；(3)由于正常组织的细胞是紧密连接的，因此大分子量的嵌段共聚物胶束无法入内；(4)利用肿瘤特有的高通透性和高截留性(enhanced permeability and retention effect，EPR effect)，纳米级的嵌段共聚物胶束能穿透肿瘤部位的毛细血管壁进入肿瘤组织，又由于肿瘤组织的淋巴系统发育不完善，不能通过淋巴导管将胶束排出，造成胶束在肿瘤部位积蓄并释药，从而达到治疗肿瘤的目的。Yoo(Yoo，H.S.，J Control Release，2001，70(1-2)，63-70)等证实了肿瘤细胞对嵌段共聚物胶束制剂的摄取量比其原料药要高10倍以上。

目前对生物降解聚合物纳米胶束的研究主要集中在合成高分子材料，主要是两亲性A-B嵌段、A-B-A嵌段共聚物或接枝共聚物。A为亲水性组分，B为疏水性组分。由于可供共聚A、B组分及可生物降解的组分较少，在选择时存在较大困难，故疏水性组分通常局限在聚内酯，如聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-乙交酯)(PLGA)或聚氨基酸如聚天冬氨酸、聚谷氨酸等；亲水性组分则多为聚乙二醇(PEG)。然而，聚氨基酸作为疏水段可能导致免疫反应，且肽键很容易被体内的酶断裂，对控制释药速率不是理想的选择。接枝共聚物主要是在亲水性的链如PEG、聚丙烯酸侧引入一些疏水基团。胶束可通过化学偶联连接药物，而化学偶联法在制备特定官能团聚合物时困难较大，安全性较差。另外，无论嵌段共聚物或接枝共聚物的制备及表征均比较烦琐，生产条件苛刻。另外，人工合成的高分子共聚物对疏水性药物的增溶还不是十分理想，例如Zhang，Z.(Zhang，Z.，Feng，S.S，Biomaterials，2006，27(2)，262-70)等合成的poly(lactide)/VitaminE TPGS copolymer，其紫杉醇最高载药量仅为5％(w/w)。D.Le Garrec(Le Garrec，D.，Gori，S.，J Control Res，99(1)，83-101)制备了poly(N-vinylpyrrolidone)-block-poly(D，L-lactide)，其紫杉醇最高载药量也仅为5％(w/w)。

壳聚糖(Chitosan)是甲壳质(Chitin)脱乙酰基的产物，是天然界唯一带有正电荷的多糖，具有来源广泛、价格低廉、性质稳定、无毒、良好的生物相容性和生物可降解性等优点。壳聚糖分子链上带有大量活性氨基和羟基，易于化学修饰而改善其物化性质，如酰化、硫酸酯化和氧化、接枝与交联、羟乙基化、羟甲基化等。壳聚糖的化学改性是当前国内外非常活跃的一个领域，其衍生物已被广泛应用于食品、医药、日用化工、环保、农业等各个方面，但在药物传递系统中的应用研究还较少。在壳聚糖骨架上分别引入亲水基和疏水基，形成两亲性聚合物，在水中可自发形成胶束，可作为药物载体。目前国外已报道了O-羟乙基-N-胆烷酸壳聚糖(Park，Jae Hyung，Kwon，Seunglee，J ControlRelease，95(3)，579-588)，O-羟乙基N-去氧胆酸壳聚糖(Kuen Yong Lee，Won Ho Jo，Macromolecules，1998，31，378-383)，O-羟乙基-N-季铵棕榈酰壳聚糖(Uchegbu，I.F.Sadiq，L.Arastoo，M.，Int J Pharm，2001，224(1-2)，185-99)，N-烷基-O-十二烷基-葡萄糖-壳聚糖(Ngimhuang，Jerasak，Furukawa，Polymer，45(3)，837-841)，但都没有作为难溶性药物或微溶性药物载体得到应用。代昭等(代昭，中草药，2003，34(2)，120-122)报道了十六烷基水溶性低分子量壳聚糖，紫杉醇载药量最高仅为14.6％(w/w)。CN 1439655公开一种新型壳聚糖衍生物N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖，反应条件较为苛刻，所用氯磺酸是个及其活泼的强酸，遇水会爆炸，生产上不安全，磺化过程需在10℃ N₂下进行，且胶束终浓度＞0.18mg/ml时即发生溶血，临界胶束浓度较高，为450mg/L，紫杉醇载药量为25％(w/w)，但是稀释不稳定，稀释至0.67mg/ml时只能稳定1.5h，稀释至0.6mg/ml则立即混浊(Zhang，Can，Qineng，Ping，et al.Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2004，39(1-2)，69-75)。CN 1698899公开一种直接以疏水碳链修饰壳聚糖，在合适的分子量和合适的取代度下在水介质中可形成胶束，但是对药物载药量较低，如紫杉醇仅6.7％(w/w)。AkioMiwa等(Miwa，Akio Ishibe，Atsuo，Pharm Res，1998，15(12)，1844-1850)以甲壳素为原料，先取代140％的羧甲基，脱乙酰化，再取代90％的十二烷基，过高的取代度给工艺带来了一定难度，反应条件较为激烈，如脱乙酰反应需在110℃反应2h，且在脱乙酰的同时分子链大量断裂，该胶束在5mg/ml溶血高达50％。

发明内容

本发明的目的针对上述技术问题提供一种以可生物降解的天然来源的壳聚糖作为原料，通过化学结构修饰得到的安全性好、载药量高的药物增溶载体。

本发明的另一个目的是提供上述载体的制备方法。

本发明还有一个目的是提供上述载体在制药中的应用。

本发明在现有的技术基础之上，改善合成工艺，在较为温和的条件下引入羧甲基或羟乙基作为亲水基，引入烷酰基或烷基作为疏水基(≥5C)，选择合适的壳聚糖分子量(5000～100万)、控制取代位置(亲水基主要取代在6位羟基，疏水基主要取代在2位氨基)和取代度(亲水基50～120％且疏水基20～60％)，选择合适的载药工艺制备反应条件温和、低毒、高载药量、高稳定性的壳聚糖聚合物胶束。

本发明的目的可以通过下列技术措施来实现：

一种药物增溶载体，该载体是在壳聚糖骨架6位和2位分别引入亲水性的羧甲基或羟乙基和疏水性的烷基或烷酰基，使其能在水中自组合成纳米胶束的具有两亲性的壳聚糖衍生物。

所述的药物增溶载体，其中亲水性的羧甲基或羟乙基取代壳聚糖6位羟基和2位氨基，以6位羟基为主，总取代度50～120％，并且疏水性的烷基或烷酰基取代壳聚糖6位羟基和2位氨基，以2位氨基为主，总取代度20～60％。

所述的药物增溶载体，其中疏水烷基或酰基的碳原子数不低于5。

所述的药物增溶载体，其中选用的壳聚糖分子量5×10³～1×10⁶，脱乙酰度为＞70％。

所述的药物增溶载体的制备方法，包括下列步骤：

将壳聚糖分散于异丙醇或甲醇中，采用提供亲水基团的物质与壳聚糖骨架上的6位羟基和2位氨基进行取代反应，在碱性条件下30～50℃搅拌反应3～10h，使其主要在6位羟基取代；再采用提供疏水基团的物质与壳聚糖骨架上的2位氨基和6位羟基进行取代反应，碱性条件下40～70℃反应4～12h，使其主要取代在2位氨基；亲水基和疏水基的取代反应顺序可前后颠倒；控制壳聚糖脱乙酰度为＞70％，亲水基总取代度为50～120％，疏水基总取代度为20～60％即可。

所述的制备方法，其中提供亲水基团的物质是氯乙酸、环氧乙烷；提供疏水基团的物质是碳原子数均不小于5的卤代烃、烷基醛、脂肪酸酐、脂肪酰卤。

所述的药物增溶载体在制备难溶或微溶于水的药物的增溶制剂中的应用；其中难溶或微溶于水的药物是紫杉烷类、环孢素类、喜树碱类、黄酮类、二氢吡啶类、小蘗碱类、长春碱类、蒽醌类、鬼臼毒素类抗肿瘤药或者难溶或微溶于水的非甾体抗炎药中的任一物质或其衍生物；难溶于水的药物优选紫杉烷类抗肿瘤药。

该药物增溶载体的使用方法是将所述两亲性壳聚糖衍生物与水按重量比为3～50∶1000的比例(优选5～20∶1000)溶解，得到两亲性壳聚糖衍生物纳米胶束；将治疗有效量的难溶或微溶于水的有机药物用药学上可接受溶剂溶解后，与所述两亲性壳聚糖衍生物纳米胶束混合后，经超声处理，溶液用截留分子量为12000～14000的透析袋透析，冻干制得粒径为10～1000nm的聚合物胶束即可。

具体方案如下：

在壳聚糖6位羟基和2位氨基引入羧甲基或羟乙基为亲水基，其中亲水基取代以6位羟基为主；在2位氨基和6位羟基引入烷酰基或烷基为疏水基(碳原子数不低于5)，其中疏水基取代以2位氨基为主。壳聚糖引入亲水基和疏水基，使其成为具有两亲性的聚合物分子，在水介质中可组装成胶束，相对疏水的烷酰基或烷基聚集成内核，亲水基修饰的壳聚糖形成亲水性的外壳，具有稳定胶束、有效躲避生物体网状内皮系统的捕捉和蛋白质吸附的作用。因此这类高分子材料是一类优良的药物载体，尤其对于难溶性抗肿瘤药物及其它难溶于水的非抗肿瘤药物。该药物载体可用于血管内或肌肉注射、口服、腔道和外用。该聚合物作为药物载体，粒径在10～1000nm可控，表面光滑，均匀度好，颗粒规则无粘连，再分散性好，载药量和包封率高。

本发明以壳聚糖为原料，在壳聚糖分别引入羧甲基/疏水烷基、羧甲基/疏水烷酰基、羟乙基/疏水烷基，羟乙基/疏水烷酰基，制得两亲性壳聚糖衍生物。羧甲基、羟乙基分别为氯乙酸、环氧乙烷与6位羟基和2位氨基反应，主要在6位羟基取代；疏水烷基或疏水烷酰基为壳聚糖2位氨基和6位羟基与卤代烃、烷基醛、脂肪酸酐、脂肪酰卤(C数皆≥5)反应，主要取代在2位氨基。亲水基和疏水基的取代反应顺序可前后颠倒。元素分析、电位滴定及¹H-NMR测得其脱乙酰度为＞70％；羧甲基或羟乙基总取代度为50～120％；烷基或烷酰基总取代度为20～60％。

壳聚糖衍生物的合成及胶束制备方法详细说明如下：

一、6-O-羧甲基-2-N-烷基壳聚糖的制备

1、先接亲水基再接疏水链

1.1 6-O-羧甲基壳聚糖的制备

壳聚糖混悬于异丙醇中，加入NaOH，30～50℃搅拌1～12h，加入氯乙酸，30～50℃反应3～10h，倾去上清液，加入适量水，用NaOH调pH6～8，加甲醇或丙酮沉淀，过滤，滤饼用浓度为80～90％的甲醇或乙醇洗涤，样品真空干燥，即制得6-O-羧甲基壳聚糖，为淡黄色或白色粉末。

合成路线图解如下：

1.2 6-O-羧甲基-2-N-烷基壳聚糖的制备

1.2.1卤代烃

6-O-羧甲基壳聚糖均匀分散在异丙醇中，加入NaOH，30～40℃碱化，搅拌下加入卤代烃，40～70℃反应4～12h，调pH6～8，加甲醇或丙酮沉淀，过滤，滤饼乙醚洗涤，样品真空干燥。

合成路线图解如下：

1.2.2烷基醛

取6-O-羧甲基壳聚糖1g，混悬于甲醇或乙醇中，加入烷基醛，反应1h后，加入NaBH₄水溶液，继续搅拌12h，NaOH液调pH7，甲醇或丙酮沉淀，过滤，滤饼用浓度为80～90％的甲醇、丙酮和正己烷依次洗涤，真空干燥，即得6-O-羧甲基-2-N-烷基壳聚糖。

合成路线图解如下：

2、先接疏水链再接亲水基

2.1 2-N-烷基壳聚糖的制备

方法同“项一”下的1.2，以壳聚糖替换6-O-羧甲基壳聚糖即可。

2.2 6-O-羧甲基-2-N-烷基壳聚糖的制备

方法同“项一”下的1.1，以2-N-烷基壳聚糖替换壳聚糖即可。

二、6-O-羧甲基-2-N-烷酰基壳聚糖的制备方法

1、先接亲水基再接疏水链

1.1 6-O-羧甲基壳聚糖的制备方法：

方法同“项一”下的1.1。

1.2 6-O-羧甲基-2-N-烷酰基的制备：

1.2.1与脂肪酸酐反应

脂肪酸通过分子间脱水而得到酸酐。将6-O-羧甲基壳聚糖分散在甲醇中，搅拌下滴加脂肪酸酐丙酮溶液(含少量吡啶)，25～70℃保温反应5～15h，加入丙酮沉淀，过滤，滤饼用浓度为80～90％的甲醇洗涤，真空干燥，即得6-O-羧甲基2-N-烷酰基壳聚糖。

合成路线图解如下：

1.2.2与脂肪酰卤反应：

脂肪酸与二氯亚砜、三氯化磷、五氯化磷、三溴化磷、五溴化磷中的一种反应，制得脂肪酰卤。将6-O-羧甲基壳聚糖分散于二甲亚砜中(含有少量吡啶)，搅拌下滴加脂肪酰卤，40～70℃反应5～12h，加入丙酮沉淀，过滤，滤饼用丙酮洗涤，真空干燥，即得6-O-羧甲基2-N-烷酰基壳聚糖。

合成路线图解如下：

2、先接疏水链再接亲水基

2.1 2-N-烷酰基壳聚糖的制备：

方法同“项二”下的1.2，以壳聚糖代替6-O-羧甲基壳聚糖即可。

2.2 6-O-羧甲基2-N-烷酰基壳聚糖的制备：

方法同“项一”下的1.1，以2-N-烷酰基壳聚糖代替壳聚糖即可。

三 6-O-羟乙基-2-N-烷基壳聚糖的制备

1、先接亲水基再接疏水链

1.1 6-O-羟乙基壳聚糖的制备：

壳聚糖混悬于异丙醇中，加入NaOH，30～50℃搅拌1～12h，冰浴下加入环氧乙烷，冰浴搅拌2～6h，升温至30～50℃继续反应3～10h，倾去上清液，加入一定量水，用NaOH调pH6～8，用透析袋(MWCO 12000～14000)在蒸馏水中室温透析72h，透析液冻干即制得高取代的6-O-羟乙基壳聚糖。

合成路线图解如下：

1.2 6-O-羟乙基-2-N-烷基壳聚糖的制备：

方法同“项一”中1.2，以6-O-羟乙基壳聚糖代替6-O-羧甲基壳聚糖即可。

2、先接疏水链再接亲水基

2.1 2-N-烷基壳聚糖的制备：

2.2 6-O-羟乙基-2-N-烷基壳聚糖的制备：

方法同“项三”下的1.1，以2-N-烷基壳聚糖代替壳聚糖即可。

四 6-O-羟乙基-2-N-烷酰基壳聚糖的制备

1、先接亲水基再接疏水链

1.1 6-O-羟乙基壳聚糖的制备：

方法同“项三”下的1.1。

1.2 6-O-羟乙基-2-N-烷酰基壳聚糖的制备：

方法同“项二”下的1.2，以6-O-羟乙基壳聚糖代替6-O-羧甲基壳聚糖即可。

2、先接疏水链再接亲水基

2.1 2-N-烷酰基壳聚糖的制备：

2.2 6-O-羟乙基-2-N-烷酰基壳聚糖的制备：

方法同“项三”下的1.1，以2-N-烷酰基壳聚糖代替壳聚糖即可。

五、两亲性壳聚糖衍生物胶束制备方法

按每1ml水中溶解3～20mg的两亲性壳聚糖衍生物的比例，将制得的两亲性壳聚糖衍生物溶于水中，经超声处理(超声处理的频率及处理时间均是本领域普通技术人员所公知的，下同)，制备成粒径为10～1000nm的壳聚糖胶束。

六、以两亲性壳聚糖衍生物作为载体，制备含难溶药物的药物组合物

两亲性壳聚糖衍生物溶于水后，将难溶性药物如紫杉醇用适当溶剂溶解，与两亲性壳聚糖衍生物水溶液混合，经超声处理，制得粒径为10～1000nm的聚合物胶束。所谓适当溶剂，指药学上使用的能溶解该药物的溶剂。

七、采用两亲性壳聚糖衍生物作为载体制备药物组合物，可对难溶性药物有增溶作用。

可使用该两亲性壳聚糖衍生物作为载体的难溶药物有：紫杉醇、环孢素、替尼泊甙、羟基喜树碱、喜树碱、长春酰胺、依托泊甙、尼莫地平、阿霉素、多西紫杉醇，灯盏花素、银杏内酯、水飞蓟素、柔红霉素、丝裂霉素、氨甲喋呤、吲哚美辛、布洛芬、萘普生，尤其是对紫杉醇、替尼泊甙、羟基喜树碱、喜树碱、长春酰胺、依托泊甙、尼莫地平、阿霉素、多西紫杉醇有增溶效果，但并不局限于这些所列药物。

本发明的有益效果：

一、该两亲性壳聚糖衍生物胶束对以上药物具有较好增溶作用，尤其对紫杉醇有明显的增溶效果，当6-O-羧甲基-2-N-辛基壳聚糖衍生物水溶液浓度为0.57％(w/v)时，载体与药物投药比为1.7∶1时，载药量为34.40％(w/w)，包封率为89.90％，进一步增加载体与药物投药比至1.7∶1.2，载药量进一步增加，为37.65％(w/w)，包封率为80.52％。6-O-羟乙基-2-N-辛基壳聚糖衍生物水溶液浓度为0.57％(w/v)时，载体与药物投药比为1.7∶0.8时，载药量为26.99％(w/w)，包封率为76.23％。以烷酰基代替烷基，载药相似。

二、本发明辅料亦可用于血管内或肌肉注射和口服有机药物、水不溶性或难溶性药物和两亲性药物的载体。作为静脉给药系统，其溶血反应符合静脉注射药用辅料标准。以6-O-羧甲基-2-N-辛基壳聚糖载体材料为例考查其溶血性。

1实验方法：取人血4ml，生理盐水离心(2500rpm，10min)洗涤至上清液无色。移取2ml的血细胞混悬液到100ml的容量瓶，生理盐水定容至100ml，得2％血细胞混悬液。分别配制10mg/ml的吐温80(tween80)、6-O-羧甲基2-N-辛基壳聚糖空白胶束(micelles)、聚氧乙烯蓖麻油(Cremophore EL)，按表1配制得到终浓度分别0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2、4mg/ml的样品溶液，摇匀后，置37℃恒温水浴中。9号管和10号管分别为0％溶血和100％溶血。37℃孵育3h后，3000rpm离心10min，取上清液，于416nm紫外分光光度计测定其吸收值，以空白样品为对照。按下列公式计算溶血百分数。

表1溶血实验设计

管号

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

样品(ml)生理盐水(ml)2％细胞混悬液

0.12.42.5

0.22.32.5

0.32.22.5

0.42.12.5

0.52.02.5

0.751.752.5

1.01.52.5

2.00.52.5

02.52.5

02.5(水)2.5

2.实验结果

以样品在试管中的终浓度为横坐标，以溶血百分数为纵坐标，得到溶血曲线，见图1。

两亲性聚合物具有低分子表面活性剂相似的结构，而低分子表面活性剂对血细胞膜有着伤害作用，因此我们考察了壳聚糖两亲性衍生物对血细胞膜的伤害情况。Tween80和Cremophore EL是最常用的两种可静脉注射的低分子表面活性剂，我们将壳聚糖两亲性衍生物与之进行比较。从图1我们可以看出6-O-羧甲基2-N-辛基壳聚糖空白胶束的溶血性远远低于tween80，在2mg/mL(管7)时，6-O-羧甲基2-N-辛基壳聚糖空白胶束仅溶血2.3％，而tween80溶血47.4％，在浓度为4mg/mL(管8)时，tween80溶血达68.5％，而6-O-羧甲基2-N-辛基壳聚糖空白胶束溶血仅5.1％。可见壳聚糖衍生物的溶血性远远优于tween80。Cremophore EL略优于壳聚糖衍生物，并无显著差异。但据文献报导，Cremophore EL具有较高的致敏性，其每天静脉注射的最大耐受剂量仅为75mg，而tween80为500mg。目前还未有壳聚糖致敏性及其它副作用的报导。本发明中其它壳聚糖衍生物溶血情况与6-O-羧甲基-2-N-辛基壳聚糖衍生物相似。因此，相对于tween80和Cremophor EL而言，壳聚糖衍生物是良好的可静脉注射的药用辅料。

三、壳聚糖两亲性衍生物的临界胶束浓度(Critical micelle concentrations，CMC)测定。

采用最为灵敏的荧光探针法。以芘为荧光探针，芘是一种疏水性芳香化合物，对环境极性极敏感。当两亲性分子的浓度低于CMC时，溶液中不会形成胶束，芘溶解在极性的水中；随着两亲性分子的浓度高于CMC，胶束形成。芘相向胶束内核的疏水部分分配，从而进入非极性环境，继而在其荧光广谱中可以观察到一系列变化，如荧光强度将增加，放射光谱中振动精细结构(the vibrational fine structure of the emission spectra)发生变化，激光光谱中(0，0)波段红移。因此，通过以芘的发射光谱中的I₁/I₃比(在固定的激发波长下扫描，I₁、I₃分别代表发射光谱中第一和第三强峰的荧光强度比)或激发光谱中I₃₃₈/I₃₃₃比(激发光谱中波长分别为338nm和333nm的荧光强度比)对两亲分子的浓度作图即可获得两亲分子的表观CMC。实施例1～16中壳聚糖衍生物的CMC皆在3～20mg/L范围内，预示它有极好的稀释稳定性。

四、载药壳聚糖聚合物胶束稳定性考察

一般而言，载药越高，稳定性越差。本发明以载药量为34.40％(w/w)的6-O-羧甲基2-N-辛基壳聚糖胶束为例，以市售制剂紫杉醇注射液(Taxol®)为对照，考察稀释及温度对载药壳聚糖胶束的影响，结果见表2。

表2紫杉醇壳聚糖胶束的稀释稳定性

紫杉醇浓度(mg/ml)	溶液稳定性
	溶液稳定性						壳聚糖聚合物胶束(34.4％w/w)			紫杉醇注射液(Taxol®)
	40℃	25℃	4℃	40℃	25℃	4℃	壳聚糖聚合物胶束(34.4％w/w)			紫杉醇注射液(Taxol®)
	40℃	25℃	4℃	40℃	25℃	4℃	1.2	3d	5d	＞10d	1d	4d	7d
0.8	4d	6d	＞10d	1d	3d	6d	1.2	3d	5d	＞10d	1d	4d	7d
0.8	4d	6d	＞10d	1d	3d	6d	0.5	7d	10d	＞10d	3d	4d	6d
0.3	3d	5d	＞10d	6h	1d	5d	0.5	7d	10d	＞10d	3d	4d	6d

可见，壳聚糖聚合物胶束不仅具有极高的载药量，还具有非常优越的稳定性。

综上所述，本发明用可生物降解的天然来源的壳聚糖作为原料，进行化学结构修饰，引入羧甲基/疏水烷基、羧甲基/疏水酰基、羟乙基/疏水烷基，羟乙基/疏水酰基，在水介质中自发形成纳米级胶束，在体内具有良好的生物相容性、生物可降解性和稀释稳定性，对难溶性药物有较好的增溶作用，可作为毒性小、不会产生溶血反应的可静脉注射给药的药物载体。

本发明研究的两亲性的壳聚糖衍生物，可以在水中自发形成纳米级胶束，不但可用于难溶药物的增溶和包裹，控制药物释放，而且由于其亲水的壳和疏水的核组成的纳米胶束结构，可以延长体内循环、减少网状内皮细胞的吞噬，增加肿瘤靶向，达到减少毒副作用，增加疗效的目的。

本发明提供的两亲性壳聚糖衍生物的临界聚集浓度低，载药量高、药物包封率高，纳米胶束稳定。本辅料毒性小、可作为难溶性有机药物的载体，以纳米级分散体系用于注射、口服、腔道和外用。本发明制备方法简单，工艺成熟，适于大规模连续生产。

附图说明

图1：吐温80、6-O-羧甲基2-N-辛基壳聚糖空白胶束、聚氧乙烯蓖麻油溶血曲线。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明加以进一步的说明，但下述实施例并不限制本专利的权利范围。

实施例1：

6-O-羧甲基-2-N-辛基壳聚糖的制备(先接亲水基再接疏水基)

1、6-O-羧甲基壳聚糖的制备

1g壳聚糖混悬于异丙醇中，加入5g NaOH、30℃搅拌碱化12h，加入6g氯乙酸的异丙醇溶液，35℃反应5h，倾去上清液，加入一定量水，用NaOH水溶液调pH7，甲醇沉淀，过滤，90％乙醇洗涤真空干燥，即制得高取代的6-O-羧甲基壳聚糖，为淡黄色或白色粉末。

2、6-O-羧甲基-2-N-辛基壳聚糖的制备

A与卤代烷反应

1g 6-O-羧甲基壳聚糖均匀分散在异丙醇中，加入2g NaOH，35℃碱化，搅拌下加入正辛氯，30℃反应8h，调pH7，加丙酮沉淀，过滤，滤饼乙醚洗涤，样品真空干燥即得6-O-羧甲基-2-N-辛基壳聚糖。

元素分析测得脱乙酰化度为91.5％，羧甲基取代度为90％，辛基取代度为45％。

B与烷基醛反应

取6-O-羧甲基壳聚糖1g，混悬于甲醇或乙醇中，加入1.02g正辛醛，反应1h后，加入NaBH₄水溶液，继续搅拌12h，NaOH液调pH7，甲醇沉淀，过滤，滤饼用浓度为80～90％的甲醇、丙酮和正己烷依次洗涤，真空干燥，即得6-O-羧甲基-2-N-辛基壳聚糖。

元素分析测得脱乙酰化度为91.5％，羧甲基取代度为90％，辛基取代度为48％。

实施例2：

6-O-羧甲基-2-N-辛基壳聚糖的制备(先接疏水基再接亲水基)

1、2-N-辛基壳聚糖的制备

方法同实施例1中2，以壳聚糖代替6-O-羧甲基壳聚糖。

2、6-O-羧甲基-2-N-辛基壳聚糖的制备

方法同实施例1中1，以2-N-辛基壳聚糖代替壳聚糖

元素分析测得脱乙酰化度为91.5％，羧甲基取代度为95％，辛基取代度为48％。

实施例3

6-O-羧甲基-2-N-癸基壳聚糖的制备

用正癸氯、正癸醛代替实施例1、2中的正辛氯、正辛醛，制备方法同实施例1、2。

元素分析测得脱乙酰化度为91.5％，羧甲基取代度为98％，癸基取代度为40％。

实施例4

6-O-羧甲基-2-N-十二烷基壳聚糖的制备

用十二烷基氯、十二烷基醛代替实施例1、2中的正辛氯、正辛醛，制备方法同实施例1、2。

元素分析测得脱乙酰化度为91.5％，琥珀酰基取代度为96％，十二烷基取代度为39％。

实施例5：

6-O-羧甲基-2-N-辛酰基壳聚糖的制备(先接亲水基再接疏水基)

1、6-O-羧甲基壳聚糖的制备

制备方法同实施例1中的1。

2、6-O-羧甲基-2-N-辛酰基壳聚糖的制备

A与酸酐反应

3.6g正辛酸(0.05mol)，滴入4ml醋酸酐，120℃蒸出醋酸，得到正辛酸酐。将6-O-羧甲基壳聚糖1g分散在甲醇中，搅拌下滴加正辛酸酐，40℃反应8h，加入丙酮沉淀，过滤，滤饼用80％甲醇洗涤，真空干燥，即得6-O-羧甲基-2-N-辛酰基壳聚糖。

B与酰卤反应

2.88g正辛酸(0.02mol)，二氯亚砜6ml，50℃回流反应3h，减压蒸馏除去过量的二甲亚砜，加入少量无水乙醚待用。将1g羧6-O-甲基壳聚糖分散在二甲亚砜(含少量吡啶)中，搅拌下滴加辛酰氯，60℃反应10h，加入丙酮沉淀，过滤，滤饼用丙酮洗涤，真空干燥，即得6-O-羧甲基-2-N-辛酰基壳聚糖。

实施例6

6-O-羧甲基-2-N-辛酰基壳聚糖的制备(先接疏水基再接亲水基)

1、2-N-辛酰基壳聚糖的制备

方法同实施例5中的2，以壳聚糖代替6-O-羧甲基壳聚糖。

2、6-O-羧甲基-2-N-辛酰基壳聚糖的制备

方法同实施例1中的1，以2-N-辛酰基壳聚糖代替壳聚糖。

元素分析测得脱乙酰化度为91.5％，羧甲基取代度为100％，辛酰基取代度为47％。

实施例7

6-O-羧甲基-2-N-癸酰基壳聚糖的制备

方法同实施例5，6，用正癸酰氯、正癸酸酐分别代替实施例5、6中的正辛酰氯、正辛酸酐。

元素分析测得脱乙酰化度为91.5％，羧甲基取代度为95％，癸酰基取代度为42％。

实施例8

6-O-羧甲基-2-N-十二烷酰基壳聚糖的制备

制备方法同实施例5、6，用月桂酰氯、月桂酸酐分别代替实施例5、6中的正辛酰氯、正辛酸酐。

元素分析测得脱乙酰化度为91.5％，羧甲基取代度为96％，N-十二烷酰基取代度为40％。

实施例9

6-O-羟乙基-2-N-辛基壳聚糖的制备——先接亲水基团，后接疏水基团

1、6-O-羟乙基壳聚糖的制备

1g壳聚糖混悬于异丙醇中，加入5gNaOH、30℃搅拌碱化12h，冰浴下加入7ml环氧乙烷，室温反应2h，40℃反应5h，加入一定量水，用NaOH水溶液调pH7，用透析袋(MWCO 12000～14000)在蒸馏水中室温透析72h，过滤，滤液冻干即制得高取代的6-O-羟乙基壳聚糖。

2、6-O-羟乙基-2-N-辛基壳聚糖的制备

方法同实施例1中的2，以6-O-羟乙基壳聚糖代替6-O-羧甲基壳聚糖。

元素分析测得脱乙酰化度为91.5％，羟乙基取代度为91％，辛基取代度为的取代度为39％。

实施例10

6-O-羟乙基-2-N-辛基壳聚糖的制备——先接疏水基团，再接亲水基团

1、2-N-辛基壳聚糖的制备

方法同实施例2中1。

2、6-O-羟乙基-2-N-辛基壳聚糖的制备

方法同实施例9中1，以2-N-辛基壳聚糖代替壳聚糖。

元素分析测得脱乙酰化度为91.5％，羟乙基取代度为87％，辛基取代度为35％。

实施例11

6-O-羟乙基-2-N-癸基壳聚糖的制备

用正癸氯、正癸醛代替实施例9、10中的正辛氯、正辛醛，制备方法同实施例9、10。

元素分析测得脱乙酰化度为91.5％，羟乙基取代度为90％，N-癸基取代度为30％。

实施例12

6-O-羟乙基-2-N-十二烷基壳聚糖的制备

用月桂氯、十二烷基醛代替实施例9、10中的正辛氯、正辛醛，制备方法同实施例9、10。

元素分析测得脱乙酰化度为91.5％，羟乙基取代度为92％，十二烷基取代度为32％。

实施例13

6-O-羟乙基-2-N-辛酰基壳聚糖的制备——方法一

1、6-O-羟乙基壳聚糖的制备

方法同实施例9的1。

2、6-O-羟乙基-2-N-辛酰基壳聚糖的制备

方法同实施例5的2，以6-O-羟乙基壳聚糖代替6-O-羧甲基壳聚糖。

元素分析测得脱乙酰化度为91.5％，羟乙基取代度为95％，辛酰基取代度为35％。

实施例14

6-O-羟乙基-2-N-辛酰基壳聚糖的制备——方法二

1、2-N-辛酰基壳聚糖的制备

方法同实施例5的2，以壳聚糖代替6-O-羧甲基壳聚糖。

2、6-O-羟乙基-2-N-辛酰基壳聚糖的制备

方法同实施例9的1，以辛酰基壳聚糖代替壳聚糖。

元素分析测得脱乙酰化度为91.5％，羟乙基取代度为92％，辛酰基取代度为40％。

实施例15

6-O-羟乙基-2-N-癸酰基壳聚糖的制备

方法同实施例13、14，用癸酰氯、癸酸酐分别代替实施例13、14中的辛酰氯、辛酸酐。

元素分析测得脱乙酰化度为91.5％，羟乙基取代度为92％，癸酰基取代度为32％。

实施例16

6-O-羟乙基-2-N-十二烷酰基壳聚糖的制备

方法同实施例13、14，用月桂酰氯、月桂酸酐、分别代替实施例13、14中的正辛酰氯、正辛酸酐。

元素分析测得脱乙酰化度为91.5％，羟乙基取代度为89％，十二烷酰基取代度为38％。

实施例17

两亲性壳聚糖衍生物胶束的制备及胶束粒径测定

将两亲性壳聚糖衍生物40mg溶解在7ml水中于50℃搅拌2h，然后冰浴下超声30min后，用Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvern，UK)在633nm，25℃，He-Ne激光测定，实施例1～16衍生物粒径在150～300nm，如6-O-羧甲基-2-N-辛基壳聚糖胶束粒径为175nm，6-O-羧甲基-2-N-辛酰基壳聚糖胶束粒径为167nm，6-O-羟乙基-2-N-辛基壳聚糖胶束粒径为188nm，6-O-羟乙基-2-N-辛酰基壳聚糖胶束粒径206nm。

实施例18

1、包含紫杉醇两亲性壳聚糖衍生物胶束的制备

(1).透析法：

两亲性壳聚糖衍生物51mg溶解在9ml水中于50℃搅拌2h。紫杉醇30mg溶解在1ml乙醇(甲醇、乙腈)中。然后二者溶液混合，冰浴超声30min后，用透析袋(MWCO12000～14000)在蒸馏水中室温透析12h，离心3000rpm 5min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。用Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvern，UK)在633nm，25℃，He-Ne激光测定6-O-羧甲基-2-N-辛基壳聚糖胶束粒径为238nm，Zeta电位为-25mV，HPLC测得溶液浓度为2.968mg/mL，载药量为34.40％(w/w)，包封率为89.90％。6-O-羟乙基-2-N-辛基壳聚糖胶束粒径为203nm，Zeta电位为+18mV，HPLC测得溶液浓度为2.060mg/mL，载药量为26.67％(w/w)，包封率为76.23％。

(2).溶剂挥发法：

两亲性壳聚糖衍生物51mg溶解在9ml水中于50℃搅拌2h，紫杉醇30mg溶解在1mL氯仿中。然后在室温搅拌下将二者溶液混合，继续搅拌过夜，使氯仿挥发，离心(3000rpm)5min，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。HPLC测得6-O-羧甲基-2-N-辛基壳聚糖胶束溶液浓度为0.8310mg/ml，载药量为12.78％(w/w)，包封率为24.93％；6-O-羟乙基-2-N-辛基壳聚糖胶束，溶液浓度为0.67mg/ml，载药量为10.57％(w/w)，包封率为20.10％。

2、两亲性壳聚糖衍生物胶束中紫杉醇含量的测定

用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行含量测定。流动相为甲醇∶水＝75∶25(v/v)，色谱柱为Lichrospher C₁₈(150×4.6mm)，柱子粒径为5μm。流速为1.0mL/min，检测波长为227nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱温为30℃，注射样品体积为20μl。

Claims

1、一种药物增溶载体，其特征在于该载体是在壳聚糖骨架6位和2位分别引入亲水性的羧甲基或羟乙基和疏水性的烷基或烷酰基，使其能在水中自组合成纳米胶束的具有两亲性的壳聚糖衍生物。

2、根据权利要求1所述的药物增溶载体，其特征在于亲水性的羧甲基或羟乙基取代壳聚糖6位羟基和2位氨基，以6位羟基为主，总取代度50～120％，并且疏水性的烷基或烷酰基取代壳聚糖6位羟基和2位氨基，以2位氨基为主，总取代度20～60％。

3、根据权利要求1或2所述的药物增溶载体，其特征在于疏水烷基或酰基的碳原子数不低于5。

4、根据权利要求1所述的药物增溶载体，其特征在于所选用的壳聚糖分子量5×10³～1×10⁶，脱乙酰度为＞70％。

5、权利要求1所述的药物增溶载体的制备方法，其特征在于包括下列步骤：

6、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于提供亲水基团的物质是氯乙酸、环氧乙烷；提供疏水基团的物质是碳原子数均不小于5的卤代烃、烷基醛、脂肪酸酐、脂肪酰卤。

7、权利要求1所述的药物增溶载体在制备难溶或微溶于水的药物的增溶制剂中的应用。

8、根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的难溶或微溶于水的药物是紫杉烷类、环孢素类、喜树碱类、黄酮类、二氢吡啶类、小蘖碱类、长春碱类、蒽醌类、鬼臼毒素类抗肿瘤药或者难溶或微溶于水的非甾体抗炎药中的任一物质或其衍生物。

9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的难溶于水的药物是紫杉烷类抗肿瘤药。

10、根据权利要求7所述的应用，其特征在于该药物增溶载体的使用方法是将所述两亲性壳聚糖衍生物与水按重量比为3～50∶1000的比例溶解，得到两亲性壳聚糖衍生物纳米胶束；将治疗有效量的难溶或微溶于水的有机药物用药学上可接受溶剂溶解后，与所述两亲性壳聚糖衍生物纳米胶束混合后，经超声处理，溶液用截留分子量为12000～14000的透析袋透析，冻干制得粒径为10～1000nm的聚合物胶束即可。