EP2152782A1 - Acides polyglutamiques fonctionnalises par des groupements cationiques et des groupements hydrophobes et leurs applications, notamment therapeutiques - Google Patents

Acides polyglutamiques fonctionnalises par des groupements cationiques et des groupements hydrophobes et leurs applications, notamment therapeutiques

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EP2152782A1
EP2152782A1 EP08750064A EP08750064A EP2152782A1 EP 2152782 A1 EP2152782 A1 EP 2152782A1 EP 08750064 A EP08750064 A EP 08750064A EP 08750064 A EP08750064 A EP 08750064A EP 2152782 A1 EP2152782 A1 EP 2152782A1
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EP
European Patent Office
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group
groups
polyamino acids
cationic
hydrophobic
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08750064A
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German (de)
English (en)
Inventor
You-Ping Chan
Olivier Breyne
Cécile BONNET GONNET
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Flamel Technologies SA
Original Assignee
Flamel Technologies SA
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Publication date
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Publication of EP2152782A1 publication Critical patent/EP2152782A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G69/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain of the macromolecule
    • C08G69/02—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids
    • C08G69/08—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids derived from amino-carboxylic acids
    • C08G69/10—Alpha-amino-carboxylic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
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    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08G69/48—Polymers modified by chemical after-treatment
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    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites

Definitions

  • the present invention relates to novel biodegradable materials based on copolyamino acids, useful in particular for the vectorization of active principle (s) (PA).
  • PA active principle
  • the invention also relates to novel pharmaceutical, cosmetic, dietetic or phytosanitary compositions based on these modified polyamino acids. These compositions may be of the type of those allowing the vectorization of AP and are preferably in the form of emulsions, micelles, nanoparticles, microparticles, gels, implants or films.
  • the PAs considered are, advantageously, biologically active compounds that can be administered to an animal or human organism orally, parenterally, nasally, vaginally, ocularly, subcutaneously, intravenously, intramuscularly, intradermally, intraperitoneally, intracerebrally, orally, etc.
  • PAs more particularly, but not exclusively, concerned by the invention are proteins, glycoproteins, peptides, polysaccharides, lipopolysaccharides, oligo or polynucleotides, and organic molecules. But it can also be cosmetic products or phytosanitary products, such as herbicides, insecticides, fungicides, etc.
  • polymers of the polylactic, polylactic-glycolic, polyoxyethylene-oxypropylene, polyamino acid or polysaccharide type are raw materials for manufacturing, for example, mass implants, microparticles, nanoparticles, vesicles, micelles or gels.
  • these polymers must be suitable for the manufacture of such systems, they must also be biocompatible, non-toxic, non-immunogenic, economical and they must be easily removed from the body. and / or be biodegradable. On this last aspect, it is moreover essential that the biodegradation in the organism generates non-toxic products.
  • US-B-4,652,441 discloses polylactide microcapsules encapsulating the hormone LH-RH. These microcapsules are produced by preparing a water-in-oil-in-water emulsion and comprise an aqueous inner layer containing the hormone, a substance (gelatin) fixing the same, an oily layer of polylactide, and an aqueous outer layer. (polyvinyl alcohol). The release of the AP can be done over a period of more than two weeks after subcutaneous injection.
  • compositions based on amphiphilic poly (oxyethylene) -poly (oxypropylene) micelles for the vectorization of anticancer agents such as doxorubicin.
  • US-B-4,888,398 discloses polymers based on polyglutamate or polyaspartate, and optionally polyleucine, with pendant groups of alkyloxycarbonyl-methyl type, randomly placed on the polyamino acid chain.
  • These polyamino acids, grafted with side groups e.g. methoxycarbonylmethyl, can be used in the form of biodegradable implants containing a sustained release PA.
  • US Pat. No. 5,904,936 describes nanoparticles obtained from a polyleucine-polyglutamate block polymer capable of forming stable colloidal suspensions capable of associating spontaneously with biologically active proteins without denaturing them. These can then be released in vivo in a controlled manner over a long period.
  • the patent application WO-A-99/61512 describes polylysines and polyornithines functionalized with a hydrophobic group (palmitic acid connected to polylysine or ornithine) and a hydrophilic group (polyoxyethylene).
  • These polymers for example polylysine grafted with polyoxyethylene and palmitoyl chains, form, in the presence of cholesterol, vesicles capable of encapsulating doxorubicin or DNA.
  • These polymers based on polylysines are cationic in a physiological medium.
  • EP-A-963 758 describes polyamino acids functionalized with a cationic group. These polymers are capable of forming complexes with a nucleic acid and can be used in gene therapy.
  • the cationic groups are amino derivatives which are not derived from amino acids and the polyamino acids do not contain hydrophobic groups.
  • WO-A-03/104303 discloses anionic polyamino acids functionalized with alpha-tocopherol.
  • the application WO-A-2004/013206 describes anionic polyamino acids having hydrophobic groups and characterized in that these groups are connected to the polymer via a ball joint containing two amide functions, and more specifically via a lysine-type spacer. or ornithine.
  • the application WO-A-2004/060968 describes polyamino acids functionalized with at least one oligoamino acid group based on leucine and / or isoleucine and / or valine and / or phenylalanine.
  • the invention relates to biodegradable polyamino acids that can be converted into nano- or micro-colloidal vector particles capable of reversibly associating with active principles.
  • one of the essential objectives of the present invention is to provide novel amphiphilic copolyglutamates comprising both positive charges at neutral pH or close to neutrality and pendant hydrophobic groups.
  • These polymers represent an improvement over those described in the patents or patent applications cited above in terms of vectorization of an active ingredient such as a peptide or a therapeutic protein, a DNA, an RNA or a small molecule.
  • Another essential objective of the present invention is that these polymers are capable of being used for the AP active ingredient vectorization and make it possible to optimally satisfy all the specifications of the specification, namely in particular: o capacity:
  • polyamino acids or their pharmaceutically acceptable salts, comprising glutamic residues, characterized in that some of the glutamic residues carry a pendant cationic group which, if it is deprotonable, has a pKa greater than or equal to 7, said cationic groups being identical or different from each other, and in that other glutamic residues carry a hydrophobic group (GH) during, said hydrophobic groups ( GH) being identical or different from each other.
  • glutamic residues characterized in that some of the glutamic residues carry a pendant cationic group which, if it is deprotonable, has a pKa greater than or equal to 7, said cationic groups being identical or different from each other, and in that other glutamic residues carry a hydrophobic group (GH) during, said hydrophobic groups ( GH) being identical or different from each other.
  • GH hydrophobic group
  • cationic group will generally refer to cationic groups which are not deprotonable, and cationic groups which are deprotonable and which have a pKa greater than or equal to 7.
  • pharmaceutically acceptable salts of a polyamino acid according to the invention means all of the polyamino acids with the counterions associated with the ionized functions of the polymer.
  • small molecule refers to a molecule of molecular weight less than 1 kDa.
  • the alkyl radicals have 1 to 10 carbon atoms.
  • Each polyglutamate according to the invention is therefore functionalized by a multiplicity of cationic groups and hydrophobic groups (GH), pendant and respectively identical or different from each other.
  • GH hydrophobic groups
  • the term "multiplicity" means that the polyglutamate is functionalized by: at least 1% of cationic groups (mol% relative to the glutamic acid residues) and up to 99%,
  • the polyglide glutamic has, in addition to pendant hydrophobic groups (GH), hydrophobic groups (GH) attached to at least one end of the copolymer chains.
  • carrier means that the group carried is pendant, that is to say that said group is a lateral group with respect to glutamic residues and is a substituent of the ⁇ carbonyl function of the glutamic residue that carries it.
  • Polyglutamate also carries cationic groups. These groups are preferably grafted to glutamic residues through an amide or ester bond.
  • other glutamic residues may carry a non-ionizable group during, other than hydrophobic groups (GH), said nonionizable groups being identical or different from each other.
  • GH hydrophobic groups
  • Such a pendant nonionizable group may be, for example, the hydroxyethylamino group.
  • other glutamic residues may carry, also on their carbonyl in ⁇ , a non-ionized group at neutral pH, different from hydrophobic groups (GH), said nonionized groups at pH neutral being the same or different from each other.
  • a non-ionized group at neutral pH may for example satisfy the following formula:
  • the polyglutamate, carrying both cationic groups and hydrophobic groups, and optionally also nonionic groups (nonionizable or nonionized at neutral pH) may also comprise negative charges (always at neutral pH) resulting from the ionization of pendant groups of polyglutamic acid that have not been functionalized.
  • the polymers of the invention can be:
  • association or “associate” used to describe the relationship between one or more active ingredients and the modified polyglutamates, mean, in particular, that the active ingredient (s) are related to the (x) polyglutamate (s) in particular by a hydrophobic interaction, and / or are encapsulated by the polyglutamate (s).
  • the polyamino acids according to the invention are functionalized homopolymers of L-glutamate or L-glutamic acid; preferably these residues are bonded in the polyamino acid by their carboxyl in the alpha position.
  • the cationic groups that can be used to functionalize the glutamate residues are identical or different from each other and correspond to the following general formula:
  • Z " chloride, sulphate, phosphate or acetate
  • L linear (C 2 -C 6 ) alkylene and optionally substituted by a carboxyl or derivative functional group.
  • the cationic groups are obtained from precursors chosen from the group comprising: lysine, subsectionthine, arginine and their derivatives, choline, ethanolamine (bound by oxygen), putrescine and lysine. agmatine.
  • the derivatives of lysine, ornithine, and arginine may be, for example, ethyl and methyl esters, amides, and methylated amides.
  • cationic groups that can be used in the present invention can be chosen from the following group of radicals:
  • Ra represents a hydroxyl, alkoxy or alkylamino group, preferably a group -OMe, -OEt, -NH 2 , -NHCH 3 or
  • Z " represents a chloride, a sulfate, a phosphate or an acetate, preferably a chloride, or
  • the pendant cationic groups may have the following formulas (where the name of the precursor is indicated under each radical): And ester or ⁇ mld ⁇ Agm ⁇ tine Arghlne ester or ⁇ mlde
  • Ra represents a hydroxyl, alkoxy or alkylamino group, preferably a group -OMe, -OEt, -NH 2 , -NH-CH 3 or N (CH 3 ) 2 .
  • the polyamino acids of the invention comprise on average at least 3 hydrophobic groups (GH) per polymer chain.
  • At least one of the hydrophobic groups GH is included in a hydrophobic graft comprising at least one spacer (or "spacer") balloon (or pattern) for connecting the hydrophobic group GH to a polyglutamate chain (for example a main chain - skeleton-polyglutamate).
  • This patella may comprise, e.g., at least one direct covalent bond and / or at least one amide bond and / or at least one ester bond.
  • the patella may be of the type belonging to the group comprising, in particular: the amino acid residues different from the constituent monomeric unit of the polyglutamate, the aminoalcohol derivatives, the polyamine derivatives (for example the diamines), the derivatives of the polyols (for example diols) and derivatives of hydroxy acids.
  • the grafting of GH on the polyglutamate chain may involve the use of precursors of GH, able to bind to the polyglutamate chain.
  • the precursors of GH are, in practice and without being limited to, selected from the group comprising alcohols and amines, these compounds being easily functionalized by those skilled in the art.
  • the grafting of GH is explained in more detail below in the description of the process for obtaining modified polyamino acids according to the invention.
  • the hydrophobic group GH of the hydrophobic graft comprises from 8 to 30 carbon atoms.
  • These hydrophobic groups GH are advantageously and judiciously selected from the group comprising:
  • Linear or branched C 8 to C 30 alkyls which may optionally comprise at least one unsaturation and / or at least one heteroatom,
  • C 8 -C 30 alkylaryls or arylalkyls which may optionally comprise at least one unsaturation and / or at least one heteroatom,
  • the (poly) cyclic C 8 to C 30 may optionally comprise at least one unsaturation and / or at least one heteroatom.
  • the GH-forming patellae of the hydrophobic grafts may be di-, tri- or tetravalent (or even pentavalent and more).
  • a divalent patella the hydrophobic graft comprises a single GH group, while a trivalent patella gives the hydrophobic graft a bifid character, that is to say that the graft has two "legs" GH.
  • a trivalent patella mention may be made, inter alia, of "amino acid” residues, for example "glutamic acid” or polyol residues, for example glycerol.
  • two advantageous but non-limiting examples of hydrophobic grafts comprising bifid GHs are dialkylglycerols and dialkylglutamates.
  • the hydrophobic groups GH can be, for example, derived from groups selected from the following group: octanol, dodecanol, tetradecanol, hexadecanol, octadecanol, oleyl alcohol, tocopherol or cholesterol.
  • the polyglutamates according to the invention may also carry at least one graft of polyalkylene (preferably ethylene) glycol type bonded to a glutamate residue.
  • the backbone of the polyglutamate according to the present invention comprises alpha-L-glutamate and / or alpha-L-glutamic acid residues.
  • polyglutamates according to the invention have the following formula (I):
  • A represents independently:
  • -R 7 is -OH, -OR 9 or -NHR 10 , and
  • R 8 , R 9 and R 10 independently represent H, linear C 2 -C 10 alkyl, branched C 3 -C 10 alkyl or benzyl;
  • B is a direct bond, a divalent linking group, trivalent or tetravalent, preferably chosen from the following radicals: -O-, -NH-, -N (C ⁇ 5 alkyl) -, an amino acid residue (of natural preference), diol, triol, diamine, triamine, aminoalcohol or hydroxyacid having 1 to 6 carbon atoms;
  • D is H, linear C 2 -C 10 acyl, branched C 3 -C 10 acyl, or pyroglutamate;
  • the hydrophobic groups GH each independently represent a radical chosen from: • linear or branched C 8 to C 3 o alkyls which may optionally comprise at least one unsaturation and / or at least one heteroatom (preferably O and / or N and / or S), or C 8 -C
  • the C 8 to C 30 (poly) cyclic compounds possibly comprising at least one unsaturation and / or at least one heteroatom (preferably
  • this radical is selected from the following group: octyloxy-, dodecyloxy-, tetradecyloxy-, hexadecyloxy-, octadecyloxy-, 9-octadecenyloxy-, tocopheryloxy- or cholesteryloxy-, B being then a direct bond;
  • R 1 represents a radical chosen from the group having the following formulas:
  • X is an oxygen atom or a -NH-
  • R is H, linear C 2 to Ci 0 alkyl, branched C 3 to Ci 0 or benzyl,
  • R 3 represents a hydroxyethylamino-, an alkylene glycol, a polyalkylene glycol or a radical of formula:
  • hydrophobic groups GH and the cationic groups are randomly arranged in pendant groups.
  • the molar grafting rate of the polyglutamates according to the invention in the hydrophobic groups is between 2 and 99%, and preferably between 5 and 50%, provided that each polymer chain has an average of at least 3 hydrophobic grafts.
  • the ratio (q) / (p + q + r + s) of the polyglutamates according to the invention means that they can contain from 1 to about 97 mol% of groups containing a cationic charge.
  • the ratio (s) / (p + q + r + s) of the polyglutamates according to the invention means that they can be anionic, neutral or cationic at neutral pH.
  • the polymers according to the invention have a molar mass which is between 2000 and 200000 g / mol, and preferably between 5000 and 100000 g / mol.
  • the invention also covers mixtures of modified polyamino acids as defined above.
  • the polyglutamates of the invention are likely to be used in several ways depending on the nature of the hydrophobic groups and cationic groups, the charge and the degree of polymerization of the polyglutamate.
  • Methods for shaping a polymer for the encapsulation of an active ingredient in the various forms contemplated by the invention are known to those skilled in the art. For more details, we can refer, for example to these few particularly relevant references:
  • polyglutamates in the form of particles or not
  • active ingredients such as proteins, peptides, DNA, RNA or small molecules.
  • the preferred shaping is that described in US Pat. No. 6,630,171, which consists of dispersing the copolymer in water and incubating the solution in the presence of an active ingredient (PA).
  • PA active ingredient
  • polymer is cationic and soluble at acid pH due to an excess of cationic charge and that this charge is partially or completely neutralized at neutral pH, such a polymer is said to be pH dependent.
  • This type of polymer can therefore be used to form a deposit after administration, for example in the subcutaneous tissue.
  • the carboxylic residual functions of the modified polyglutamate are either neutral (COOH form) or ionized (COO anion), depending on pH and composition.
  • the counter-cation may be a metal cation such as sodium, calcium or magnesium, or an organic cation such as triethanolamine, tris (hydroxymethyl) aminomethane or a polyamine such as polyethyleneimine. If it is divalent, a counter cation can salt two nearby monovalent cationic groups.
  • the counter anion of the cationic groups is preferably chosen from the group comprising a chloride, a sulfate, a phosphate or an acetate. If he is divalent, a counteranion can salify two nearby monovalent cationic groups.
  • pharmaceutically acceptable salts of the polymer according to the invention all of the polymers with the counter-ions associated with the ionized functions of the polymer. It is also conceivable, for certain structures where there is co-existence of positive and negative charges that there is a total or partial neutralization of charges. A polymer having an equivalent number of positive charges and negative charges (isoelectric point) can exist without the presence of counter-anion or counter-cation.
  • the copolymers of the invention are for example obtained by methods known to those skilled in the art.
  • N-carboxy-amino acid anhydrides NCA
  • the polymers are then hydrolyzed under appropriate conditions to obtain the polymer in its acid form.
  • the copolymers of the invention are synthesized according to 2 routes.
  • the cationic group for example pargininamide
  • the group B-GH for example dodecylamine
  • This reaction can be carried out in a solvent such as DMF, DMSO or NMP according to the following scheme.
  • the precursor of the R 1 group such as nitrogen-bound ethanolamine, is introduced during the synthesis together with the cationic group.
  • the cationic group contains two chemically undifferentiated amino functions (e.g. linear diamine), it can be introduced in a form in which one of the two functions is protected. A last step of cleavage of the protecting group is then added to the above scheme.
  • two chemically undifferentiated amino functions e.g. linear diamine
  • the poly (L-glutamic acid) can be synthesized according to the route described in the patent application FR 2801 226.
  • the HB-GH group is linked via an ester function, it is easier to graft first.
  • the B-GH group by a conventional coupling reaction using a carbodiimide before grafting the cationic group.
  • the precursor of the group R 1 such as ethanolamine bonded with nitrogen, is introduced during the synthesis together with the cationic group.
  • the cationic group contains two chemically undifferentiated amino functions (e.g. linear diamine), it can be introduced in a form in which one of the two functions is protected. A last step of cleavage of the protecting group is then added to the above scheme.
  • two chemically undifferentiated amino functions e.g. linear diamine
  • the degree of polymerization is defined by the molar ratio of the initiator to that of the monomer.
  • the coupling of the hydrophobic graft GH with an acidic function of the polymer is easily achieved by reacting the polyamino acid in the presence of a carbodiimide as a coupling agent and optionally a catalyst such as 4-dimethylaminopyridine and in a suitable solvent such as dimethylformamide ( DMF), N-methyl pyrrolidone (NMP) or dimethylsulfoxide (DMSO).
  • a carbodiimide is, for example, dicyclohexylcarbodiimide or diisopropylcarbodiimide.
  • Coupling reagents such as chloro Formates can also be used for the formation of amide bonds (see, for example, Bodanszky: “Principles of Peptide Synthesis” Springer Verlag, 1984).
  • the degree of grafting is controlled by the stoichiometry of the constituents and reactants or the reaction time.
  • Hydrophobic grafts functionalized with an amino acid other than that of the polymer are obtained by conventional peptide coupling or by direct condensation by acid catalysis. These techniques are well known to those skilled in the art.
  • the invention relates to a pharmaceutical, cosmetic, dietetic or phytosanitary composition
  • a pharmaceutical, cosmetic, dietetic or phytosanitary composition comprising at least one polyglutamate as defined above and optionally at least one active ingredient, which may be therapeutic, cosmetic, dietetic or phytosanitary.
  • the active principle is associated with (x) polyamino acid (s) modified with a cationic group by one or more bonds other than (or that) chemical bond (s) (s) ( s) covalent (s).
  • the active principle is chosen from the group comprising: proteins, glycoproteins, proteins linked to one or more polyalkylene glycol chains [preferably polyethylene glycol (PEG): "PEGylated proteins”], peptides, polysaccharides, liposaccharides, oligonucleotides, polynucleotides and mixtures thereof, and more preferably still in the erythropoietin subgroup, such as epoetin alpha, epoetin beta, darbepoetin, hemoglobin, their analogues or their derivatives; oxytocin, vasopressin, adrenocorticotropic hormone, epidermal growth factor, platelet derived growth factor (PDGF), stimulating factors of hematopo
  • active ingredients are polysaccharides (eg, heparin) and oligo- or polynucleotides, DNA, RNA, iRNA, antibiotics, and living cells.
  • Another class of active ingredients includes pharmaceutical substances acting on the central nervous system, for example, risperidone, zuclopenthixol, fluphenazine, perphenazine, flupentixol, haloperidol, fluspirilene, quetiapine, clozapine, amisulprid, sulpiride, ziprasidone, etc.
  • the active ingredient is a small hydrophobic, hydrophilic or amphiphilic organic molecule.
  • a "small" molecule is especially a small nonprotein molecule.
  • PA that may be associated with the polyamino acids according to the invention, whether or not in the form of (nano or micro) particles, mention may be made of: o proteins such as insulin, interferons, hormones growth, interleukins, erythropoietin or cytokines; peptides such as leuprolide or cyclosporine; o small molecules such as those belonging to the family of anthracyclines, taxoids or camptothecins; o and their mixtures.
  • proteins such as insulin, interferons, hormones growth, interleukins, erythropoietin or cytokines
  • peptides such as leuprolide or cyclosporine
  • small molecules such as those belonging to the family of anthracyclines, taxoids or camptothecins
  • o and their mixtures o proteins such as insulin, interferons, hormones growth, interleukins, erythropoietin or cytokines
  • the active principle is chosen from at least one of the following families of active substances: alcohol abuse treatment agents, agents for treating Alzheimer's disease, anesthetics, acromegaly treatment agents, analgesics, anti-asthmatics, allergy-treating agents, anti-cancer agents, anti-inflammatories, anticoagulants and antithrombotics, anticonvulsants, antiepileptics, antidiabetics, antiemetics, anti-glaucoma, antihistamines, antiparasitics, antibiotics, antifungals, antivirals, antiparkinsonians, anticholinergics, antitussives, carbonic anhydrase inhibitors, cardiovascular agents, lipid-lowering agents, anti-arrhythmics, vasodilators, anti-hypertensives, vasoprotective agents, cholinesterase inhibitors, anti-inflammatory agents, disorders of central nervous system, central nervous system stimulants, contraceptives, fertility promoters, uterine labor inducers and inhibitors,
  • the composition of the invention is in the form of a gel, a solution, a suspension, an emulsion, micelles, nanoparticles, microparticles, an implant, a d a powder, a suspension or a film.
  • the composition whether loaded or not with active ingredient (s), is a stable colloidal suspension of nanoparticles and / or microparticles and / or polyamino acid micelles, in an aqueous or oily phase.
  • Microparticles can be obtained by various methods such as coacervation in the presence of an aggregating agent (divalent or trivalent ions or polyelectrolytes), precipitation by change of pH or ionic strength, extraction / evaporation or by atomization.
  • an aggregating agent divalent or trivalent ions or polyelectrolytes
  • precipitation by change of pH or ionic strength
  • extraction / evaporation or by atomization.
  • composition according to the invention may be a colloidal solution of nanoparticles in an aqueous phase at acidic pH and which precipitates at physiological pH.
  • a polyamino acid of the invention having an excess of cationic charge can condense an anionic active principle such as DNA, a DNA fragment, an RNA or an oligo RNA in the form of nano- or microparticles and these particles can be internalized in a cell.
  • the composition of the invention is in the form of a solution in a biocompatible solvent and can be injected subcutaneously, intramuscularly or into a tumor.
  • composition according to the invention since it is pharmaceutical, can be administered orally, pulmonary, parenterally, nasally, vaginally, ocularly, subcutaneously, intravenously, intramuscularly, intradermally, intraperitoneally, intracerebrally or buccally.
  • composition is in the form of a solution in a solvent or a mixture of biocompatible solvents that can be injected subcutaneously, intramuscularly or into a tumor.
  • the composition may contain an excipient for pH adjustment and / or osmolarity and / or to improve stability (antioxidants) and / or as an antimicrobial agent.
  • excipients are well known to those skilled in the art (see Injectable Drug Development, P.G. Gupta et al., Interpharm Press, Denver, 1999).
  • the invention also relates to a preparation process
  • drugs especially for oral, nasal, vaginal, ocular, subcutaneous, intravenous, intramuscular, intradermal, intraperitoneal or intracerebral
  • the active principles of these drugs may be, in particular, proteins, glycoproteins, proteins linked to one or more polyalkylene glycol chains (for example PolyEthyleneGlycol (PEG), it is called “PEGylated” proteins), peptides hydrophobic, hydrophilic or amphiphilic polysaccharides, liposaccharides, oligonucleotides, polynucleotides and small organic molecules;
  • PEG PolyEthyleneGlycol
  • the invention also relates to a method of therapeutic treatment consisting essentially of administering the composition as described herein, orally, pulmonally, parenterally, nasally, vaginally, ocularly, subcutaneously, intravenously, intramuscularly, intradermally, intraperitoneally, intracerebral or oral.
  • this method of therapeutic treatment essentially consists in using the composition as described above in the form of a solution in a biocompatible solvent and then injecting it subcutaneously, intramuscularly or into a tumor, preferably so that it forms a deposit on the injection site.
  • Comparative compound C1 is the precursor (in its anionic form) of the polyglutamate modified with a cationic group, ie DP20 polyglutamate grafted at 5% statistically with racemic alpha-tocopherol. This compound is obtained by the method described in application WO-A-03/104303.
  • aqueous solution containing 10 mg of polymer per milliliter at pH 7.4 and 200 IU insulin (7.4 mg) is prepared.
  • the solutions are incubated for 2 hours at room temperature and the free insulin is separated from the associated insulin by ultrafiltration (threshold at 100 kDa, 15 min at 10,000 ° C. at 18 ° C.).
  • the free insulin recovered in the filtrate is then assayed by HPLC (High Performance Liquid Chromatography) and the amount of insulin associated is deduced.
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • Example 13 Measurement of the viscosity (mPa / s) under shear of an aqueous solution at 29 mg / g with a gradient of speed of 10 s -1
  • a therapeutic RNA of 1433 nucleotides are incubated for 2 h at 37 ° C. and then analyzed by electrophoresis on 1% agarose gel under denaturing conditions (revelation of the RNAs with ethidium bromide).
  • RNA alone serves as a positive control of integrity.
  • RNA incubated with commercial RNAses serves as a control of degraded RNA.
  • RNA In a 2nd time is added to the RNA the amount of polymer (1) or (3) to fully involve (conditions where the RNA is no longer visible to the expected size on gel) and allowed to these mixtures incubate for 2 h at 37 ° C. After 2 h at 37 ° C., increasing amounts of compound C1 are added to these mixtures and a new incubation is carried out for 16 h at 37 ° C. The mixtures obtained are analyzed by electrophoresis. on 1% agarose gel under denaturing conditions (revelation of RNA ethidium bromide). The results show that the expected size is observed increasing amounts of RNA correlated with the amount of Cl polymer added to the RNA / polymer mixture (1) or (3).
  • Example 16 Study of the crossing of the cell membrane of a model oligonucleotide
  • Opti-MEM ® medium without fetal calf serum is mixed with a Cy3-labeled 30-base RNA oligonucleotide at an amount of polymer (3) or (7) close to the minimum amount to associate the entire oligonucleotide. .
  • This mixture is contacted on Huh-7 human hepatocarcinoma cells grown in 24-well plate at 25,000 cells / well. After 4 hours of incubation at 37 ° C., 5% CO 2 , D-MEM medium is added to 20% fetal calf serum (FCS) so that the final concentration of FCS is 10%.
  • FCS fetal calf serum
  • the cells After 24 hours of incubation of the cells in the presence of oligonucleotide / polymer mixtures, the cells are washed, membrane-labeled with biotinylated concanavalin and then fixed for 3 min with 3.7% paraformaldehyde. After 2 washes with PBS, cells were incubated with DAPI (nuclear DNA) for 10 min, washed 3 times with PBS and then incubated with streptavidin labeled with Alexa Fluor ® 488 which reveals the biotinylated concanavalin. The cells are observed by confocal microscopy.
  • DAPI nuclear DNA
  • the localization of the cells is possible by observation of their membrane labeled with Alexa Fluor ® 488 and their marked nucleus at the DAPI.
  • the entry of the Cy3-labeled oligonucleotide into the cell is visualized by observation of Cy3 fluorescence (excitation at 550 nm, emission at 570 nm).

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Abstract

La présente invention concerne des nouveaux matériaux à base de polyaminoacides modifiés, biodégradables, utiles notamment pour la vectorisation de principe(s) actif(s) (PA). L'invention vise aussi de nouvelles compositions pharmaceutiques, cosmétiques, diététiques ou phytosanitaires à base de ces polyaminoacides. Le but de l'invention est de fournir une nouvelle matière première polymère, susceptible d'être utilisée pour la vectorisation de PA et permettant de satisfaire de manière optimale à toutes les spécifications requises en l'espèce : biocompatibilité, biodégradabilité, aptitude à s'associer facilement avec de nombreux principes actifs ou à les solubiliser, et à libérer ces principes actifs in vivo. Ce but est atteint par la présente invention qui concerne des nouveaux polyglutamates modifiés par des groupements cationiques qui, s'ils sont déprotonables, présentent un pKa supérieur ou égal à 7, et par des groupements hydrophobes comportant de 8 à 30 atomes de carbone. Ces polyglutamates modifiés par des groupements cationiques sont aptes à se transformer aisément et économiquement en particules de vectorisation de principes actifs, ces particules étant elles-mêmes propres à former des suspensions colloïdales aqueuses stables. Ces polyglutamates modifiés présentent l'avantage d'être moins visqueux que d'autres polymères analogues, tout en conservant une capacité à associer des protéines telles que l'insuline. Certains sont solubles dans l'eau à pH acide et deviennent insoluble à pH physiologique (7,4) et devraient donc, lors d'une injection sous-cutanée, précipiter sur le site d'injection.

Description

ACIDES POLYGLUTAMIQUES FONCTIONNALISES PAR DES
GROUPEMENTS CATIONIQUES ET DES GROUPEMENTS HYDROPHOBES
ET LEURS APPLICATIONS, NOTAMMENT THERAPEUTIQUES
La présente invention concerne des nouveaux matériaux biodégradables à base de copolyaminoacides, utiles notamment pour la vectorisation de principe(s) actif(s) (PA). L'invention vise aussi de nouvelles compositions pharmaceutiques, cosmétiques, diététiques ou phytosanitaires à base de ces polyaminoacides modifiés. Ces compositions peuvent être du type de celles permettant la vectorisation de PA et se présentant, de préférence, sous forme d'émulsions, de micelles, de nanoparticules, de microparticules, de gels, d'implants ou de films.
Les PA considérés sont, avantageusement, des composés biologiquement actifs et qui peuvent être administrés à un organisme animal ou humain par voie orale, parentérale, nasale, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale, buccale, etc.
Les PA plus particulièrement, mais non limitativement, concernés par l'invention sont des protéines, des glycoprotéines, des peptides, des polysaccharides, des lipopolysaccharides, des oligo ou des polynucléotides, et des molécules organiques. Mais il peut aussi s'agir de produits cosmétiques ou de produits phytosanitaires, tels que des herbicides, des insecticides, des fongicides, etc.
Dans le domaine de la vectorisation des principes actifs notamment médicamenteux, il existe un besoin, dans beaucoup de cas :
• de les protéger contre la dégradation (hydrolyse, digestion enzymatique etc.),
• et/ou de contrôler leur vitesse de libération afin de maintenir un niveau thérapeutique sur une durée définie,
• et/ou de les véhiculer (en les protégeant) au site d'action.
A ces fins, plusieurs types de polymères ont été étudiés et certains sont même disponibles commercialement. On peut citer, par exemple, les polymères du type polylactique, polylactique-glycolique, polyoxyéthylène-oxypropylène, polyaminoacide ou encore polysaccharide. Ces polymères constituent des matières premières permettant de fabriquer, par exemple, des implants massiques, des microparticules, des nanoparticules, des vésicules, des micelles ou des gels. Outre le fait que ces polymères doivent être adaptés à la fabrication de tels systèmes, ils doivent également être biocompatibles, non-toxiques, non-immunogènes, économiques et ils doivent pouvoir être facilement éliminés du corps et/ou être biodégradables. Sur ce dernier aspect, il est de surcroît essentiel que la biodégradation dans l'organisme génère des produits non-toxiques.
À titre d'illustration de l'art antérieur concernant des polymères employés comme matières premières pour la réalisation de systèmes de vectorisation de PA, divers brevets ou demandes de brevet ou articles scientifiques sont cités ci-après.
Le brevet US-B-4,652,441 décrit des microcapsules de polylactide encapsulant l'hormone LH-RH. Ces microcapsules sont produites en préparant une émulsion eau-dans-huile-dans- eau et comprennent une couche interne aqueuse contenant l'hormone, une substance (gélatine) fixant cette dernière, une couche huileuse de polylactide, ainsi qu'une couche externe aqueuse (alcool polyvinylique). La libération du PA peut se faire sur une période de plus de deux semaines après injection sous-cutanée.
Le brevet US-B-6,153,193 décrit des compositions à base de micelles de poly(oxyéthylène)-poly(oxypropylène) amphiphiles, pour la vectorisation d'anticancéreux tels que la doxorubicine.
Akiyoshi et al. (J. Controlled Release, 1998, 54, 313-320) décrivent des pullulanes qui sont rendus hydrophobes par greffage de cholestérol et qui forment des nanoparticules dans l'eau. Ces nanoparticules, aptes à se complexer de manière réversible avec l'insuline, forment des suspensions colloïdales stables.
Le brevet US-B-4,351,337 décrit des copolyaminoacides amphiphiles, à base de leucine et de glutamate, utilisables sous forme d'implants ou de microparticules pour la libération contrôlée de principes actifs. La libération de ces derniers peut se faire sur une durée très longue dépendant de la vitesse de dégradation du polymère.
Le brevet US-B-4,888,398 décrit des polymères à base de polyglutamate ou polyaspartate, et éventuellement polyleucine, avec des groupements pendants de type alkyloxycarbonyl- méthyle, placés de façon aléatoire sur la chaîne polyaminoacide. Ces polyaminoacides, greffés par des groupements latéraux e.g. méthoxycarbonylméthyle, sont utilisables sous forme d'implants biodégradables contenant un PA à libération prolongée.
Le brevet US-B-5,904,936 décrit des nanoparticules obtenues à partir d'un polymère bloc polyleucine-polyglutamate, aptes à former des suspensions colloïdales stables et capables de s'associer spontanément avec des protéines biologiquement actives sans les dénaturer. Ces dernières peuvent ensuite être libérées in vivo de manière contrôlée, sur une longue période.
Le brevet US-B-5,449,513 décrit des copolymères bloc amphiphiles comprenant un bloc polyoxyéthylène et un bloc polyaminoacide, par exemple poly(bêta-benzyl-L-aspartate). Ces polymères polyoxyéthylène-polybenzylaspartate forment des micelles qui sont aptes à encapsuler des molécules actives hydrophobes telles que la doxorubicine ou l'indométhacine.
La demande de brevet WO-A-99/61512 décrit des polylysines et des polyornithines fonctionnalisées par un groupe hydrophobe (acide palmitique relié à la polylysine ou ornithine) et un groupe hydrophile (polyoxyéthylène). Ces polymères, par exemple la polylysine greffée avec des chaînes polyoxyéthylène et palmitoyle, forment, en présence de cholestérol, des vésicules capables d'encapsuler la doxorubicine ou l'ADN. Ces polymères à base de polylysines sont cationiques en milieu physiologique.
La demande de brevet EP-A-963 758 décrit des polyaminoacides fonctionnalisés par un groupement cationique. Ces polymères sont capables de former des complexes avec un acide nucléique et sont utilisables en thérapie génique. Les groupements cationiques sont des dérivés aminés qui ne sont pas dérivés des acides aminés et les polyaminoacides ne comportent pas de groupements hydrophobes.
Yang et al. {Biotechnology Letters, 2005, 27, 977-982) décrivent des polyaspartates fonctionnalisés par des groupements alkyles linéaires et des oligoarginines. Ces polymères forment des nanoparticules de 8 à 40 nm dans l'eau et sont capables d'être internalisés par des cellules. Il est suggéré que ces particules peuvent être utilisées pour la vectorisation de molécules hydrophobes.
Dans le même domaine, la demanderesse a décrit, dans plusieurs demandes de brevets, des polymères à base de polyglutamate (anioniques) avec des concepts apparentés.
La demande WO- A-03/104303 décrit des polyaminoacides anioniques fonctionnalisés par de Palpha-tocophérol.
La demande WO-A-2004/013206 décrit des polyaminoacides anioniques comportant des groupements hydrophobes et caractérisés en ce que ces groupements sont reliés au polymère par l'intermédiaire d'une rotule contenant deux fonctions amides, et plus précisément via un espaceur de type lysine ou ornithine. La demande WO-A-2004/060968 décrit des polyaminoacides fonctionnalisés par au moins un groupement oligoaminoacide à base de leucine et/ou isoleucine et/ou valine et/ou phénylalanine.
L'article de W. C. Shen, "Acid-sensitive dissociation between poly(lysine) and histamine- modified poly(glutamate) as a model for drug-releasing from carriers in endosomes" Biochim Biophys Acta 1034 (1): 122-124, 1990, décrit un polyglutamate fonctionnalisé par 40 % d'histamine. Cependant, aucun squelette polyglutamate hydrophobisé n'est décrit. De plus, le polymère développé précipite entre pH 4 et 5 et est soluble à pH physiologique. Seule l'application visant à former des complexes avec une polylysine sensible au pH est développée. Ces complexes sont basés sur des interactions électrostatiques. En effet, à pH physiologique, le complexe polyglutamatehistamine-polylysine est formé, alors qu'il se décompose à pH 4 - 5, valeur du pH dans l'endosome.
Ainsi, même si de très nombreuses solutions techniques sont développées et proposées dans l'art antérieur pour la vectorisation des principes actifs médicamenteux, la réponse à l'ensemble des exigences est difficile à obtenir et demeure perfectible. Plus spécifiquement, l'invention concerne des polyaminoacides biodégradables, transformables en nano- ou micro-particules colloïdales de vectorisation aptes à s'associer réversiblement à des principes actifs.
Dans ce contexte, l'un des objectifs essentiels de la présente invention est de fournir de nouveaux copolyglutamates amphiphiles comportant à la fois des charges positives à pH neutre ou proche de la neutralité et des groupements hydrophobes pendants. Ces polymères représentent un perfectionnement par rapport à ceux décrits dans les brevets ou demandes de brevets cités plus haut en termes de vectorisation d'un principe actif tel qu'un peptide ou une protéine thérapeutique, un ADN, un ARN ou une petite molécule.
Un autre objectif essentiel de la présente invention est que ces polymères soient aptes à être utilisés pour la vectorisation de principe actif PA et permettent de satisfaire de manière optimale à toutes les spécifications du cahier des charges, à savoir notamment : o capacité :
• à former aisément et économiquement des suspensions colloïdales aqueuses stables,
• à s'associer facilement avec de nombreux principes actifs,
• et à libérer ces principes actifs in vivo, o biocompatibilité, o biodégradabilité, o stabilité à l'hydrolyse.
Cet objectif, parmi d'autres, est atteint par la présente invention, qui concerne des polyaminoacides, ou leurs sels pharmaceutiquement acceptables, comprenant des résidus glutamiques, caractérisés en ce que certains des résidus glutamiques sont porteurs d'un groupement cationique pendant, qui, s'il est déprotonable, présente un pKa supérieur ou égal à 7, lesdits groupements cationiques étant identiques ou différents entre eux, et en ce que d'autres résidus glutamiques sont porteurs d'un groupement hydrophobe (GH) pendant, lesdits groupements hydrophobes (GH) étant identiques ou différents entre eux.
Dans la description qui suit, sauf précision contraire, le terme "groupement cationique" désignera d'une manière générale les groupements cationiques qui ne sont pas déprotonables, et les groupements cationiques qui sont déprotonables et qui présentent un pKa supérieur ou égal à 7.
On entend par "sels pharmaceutiquement acceptables" d'un polyaminoacide selon l'invention l'ensemble des polyaminoacides avec les contre-ions associés aux fonctions ionisées du polymère.
Dans la description qui suit, le terme "petite molécule" désigne une molécule de poids moléculaire inférieur à 1 kDa.
Sauf mention contraire, les radicaux alkyles ont de 1 à 10 atomes de carbone.
Chaque polyglutamate selon l'invention est donc fonctionnalisé par une multiplicité de groupements cationiques et de groupements hydrophobes (GH), pendants et respectivement identiques ou différents entre eux.
Au sens de l'invention, le terme "multiplicité" signifie que le polyglutamate est fonctionnalisé par : * au moins 1 % de groupements cationiques (% molaire par rapport aux résidus acide glutamique) et jusqu'à 99 %,
* en moyenne, au moins deux groupements hydrophobes (GH) pendants par molécule. Il est possible conformément à l'invention que le polyacide glutamique présente, en plus des groupements hydrophobes (GH) pendants, des groupements hydrophobes (GH) fixés sur au moins l'une des extrémités des chaînes de copolymère.
Au sens de l'invention, l'expression « être porteur » signifie que le groupement porté est pendant, c'est-à-dire que ledit groupement est un groupement latéral par rapport aux résidus glutamiques et est un substituant de la fonction carbonyle en γ du résidu glutamique qui le porte.
Le polyglutamate est également porteur de groupements cationiques. Ces groupes sont, de préférence, greffés aux résidus glutamiques par l'intermédiaire d'une liaison amide ou ester.
Selon une variante de l'invention, encore d'autres résidus glutamiques peuvent être porteurs d'un groupement non ionisable pendant, différent des groupements hydrophobes (GH), lesdits groupements non ionisables étant identiques ou différents entre eux. Un tel groupement non ionisable pendant peut être par exemple le radical hydroxyéthylamino- .
Selon une autre variante de l'invention, encore d'autres résidus glutamiques peuvent être porteurs, également sur leur carbonyle en γ, d'un groupement non ionisé à pH neutre, différent des groupements hydrophobes (GH), lesdits groupements non ionisés à pH neutre étant identiques ou différents entre eux. Un tel groupement non ionisé à pH neutre peut par exemple répondre à la formule suivante :
où -R10 est -H, -CO2H, ester d'alkyle (de préférence -COOMe ou -COOEt), -CH2OH, -C(=O)-NH2 , -C(=O)-NH-CH3 ou -C(=O)-N(CH3)2 .
Le polyglutamate, porteur à la fois des groupements cationiques et des groupements hydrophobes, et également éventuellement de groupements non ioniques (non ionisables ou non ionisés à pH neutre) peut également comporter des charges négatives (toujours à pH neutre) résultant de l'ionisation des groupes pendants de l'acide polyglutamique qui n'ont pas été fonctionnalisés.
Il est du mérite de la demanderesse d'avoir mis au point une nouvelle famille de polymères à base de polyglutamate, porteurs de groupements cationiques, et fonctionnalisés par une multiplicité de groupements hydrophobes, lesquels polymères sont aptes à former des systèmes colloïdaux stables. La capacité de moduler la charge du polymère en fonction du taux de fonctionnalisation peut s'avérer très efficace pour :
- abaisser la viscosité du polymère pour une injection plus facile ou une mise en œuvre plus aisée lors de l'étape de formulation. - assurer une bonne association avec des principes actifs neutres, anioniques ou cationiques. Ainsi, les polymères de l'invention peuvent être :
• anioniques, cationiques, neutres et aptes à associer des principes actifs chargés ou des PA non chargés ;
• cationiques à pH modérément acide (pH = 4 - 5) et neutres ou faiblement chargés à pH neutre. Dans ce cas, cette dépendance au pH leur permet, après association avec le principe actif en solution à pH = 4 - 5, de former un dépôt en milieu physiologique.
De plus, ils sont facilement dégradés, en présence d'enzymes, en catabolites/métabolites non toxiques (acides aminés).
Au sens de l'invention et dans tout le présent exposé, les termes "association" ou "associer" employés pour qualifier les relations entre un ou plusieurs principes actifs et les polyglutamates modifiés, signifient, en particulier, que le ou les principes actifs sont liés au(x) polyglutamate(s) notamment par une interaction hydrophobe, et/ou sont encapsulés par le ou les polyglutamates.
Avantageusement, les polyaminoacides selon l'invention sont des homopolymères fonctionnalisés de L-glutamate ou d'acide L-glutamique ; de préférence ces résidus sont liés dans le polyaminoacide par leur carboxyle en position alpha.
Les groupements cationiques utilisables pour fonctionnaliser les résidus glutamates sont identiques ou différents entre eux et correspondent à la formule générale suivante :
X^ W3 +Z
dans laquelle :
X = O, NH, Y = indépendamment un H ou un CH3,
Z" =un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate,
L = un alkylène linéaire (C2 à C6) et éventuellement substitué par un groupe fonctionnel de type carboxyle ou dérivé. Suivant une caractéristique préférée, les groupements cationiques sont obtenus à partir de précurseurs choisis parmi le groupe comprenant : la lysine, Pornithine, l'arginine et leurs dérivés, la choline, l'éthanolamine (liée par l'oxygène), la putrescine et l'agmatine.
Les dérivés de la lysine, de l'ornithine, et de l'arginine peuvent être par exemple des esters éthyliques et méthyliques, des amides, et des amides méthylés.
Ainsi, des groupements cationiques utilisables dans la présente invention peuvent être choisis dans le groupe de radicaux suivants :
H H — N — C-CORa
NH3 +,Z-
où Ra représente un groupement hydroxy, alcoxy ou alkylamino, de préférence un groupement -OMe, -OEt, -NH2, -NHCH3 ou
-N(CH3)2, et Z" représente un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure, ou
-NH-(CH2)4-NH3 +, Z", -NH-(CH2)4-NH-C(=NH)-NH3 +, Z",
-O-(CH2)2-N+(CH3)3, Z-, -O-(CH2)2-NH3 +, Z" où Z" représente un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure. Par exemple, les groupements cationiques pendants peuvent présenter les formules suivantes (où le nom du précurseur est indiqué sous chaque radical) : Et ester ou αmldβ Agmαtine Arghlne ester ou αmlde
dans lesquelles Ra représente un groupement hydroxy, alcoxy ou alkylamino, de préférence un groupement -OMe, -OEt, -NH2, -NH-CH3 ou N(CH3)2.
Suivant une caractéristique préférée, les polyaminoacides de l'invention comportent en moyenne au moins 3 groupements hydrophobes (GH) par chaîne de polymère.
Avantageusement, au moins l'un des groupements hydrophobes GH est inclus dans un greffon hydrophobe comprenant au moins une rotule (ou motif) d'espacement ("spacer") permettant de relier le groupement hydrophobe GH à une chaîne de polyglutamate (par exemple une chaîne principale - squelette-polyglutamate). Cette rotule peut comprendre, e.g. au moins une liaison covalente directe et/ou au moins une liaison amide et/ou au moins une liaison ester. Par exemple, la rotule peut être du type de celles appartenant au groupe comportant notamment : les résidus acide aminé différents de l'unité monomérique constitutive du polyglutamate, les dérivés des aminoalcools, les dérivés des polyamines (par exemple les diamines), les dérivés des polyols (par exemple les diols) et les dérivés des hydroxyacides.
Le greffage des GH sur la chaîne polyglutamate peut passer par la mise en œuvre de précurseurs de GH, aptes à se lier à la chaîne polyglutamate.
Les précurseurs des GH sont, en pratique et sans que cela ne soit limitatif, choisis dans le groupe comprenant les alcools et les aminés, ces composés pouvant être fonctionnalisés facilement par l'homme de l'art. Le greffage des GH est explicité plus en détails ci-après dans la description du procédé d'obtention des polyaminoacides modifiés selon l'invention.
Suivant une caractéristique préférée, le groupement hydrophobe GH du greffon hydrophobe comporte de 8 à 30 atomes de carbone. Ces groupements hydrophobes GH sont avantageusement et judicieusement sélectionnés dans le groupe comprenant :
• les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome,
• les alkylaryles ou arylalkyles en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome,
• et les (poly)cycliques en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome.
Les rotules formant avec les GH des greffons hydrophobes, peuvent être di-, tri- ou tétravalentes (voire pentavalentes et plus). Dans le cas d'une rotule divalente, le greffon hydrophobe comporte un seul groupement GH, tandis qu'une rotule trivalente confère au greffon hydrophobe un caractère bifide, c'est-à-dire que le greffon présente deux "pattes" GH. À titre d'exemple de rotule trivalente, on peut citer, entre autres, des résidus "acide aminé", par exemple "acide glutamique" ou des restes polyols, par exemple glycérol. Ainsi, deux exemples avantageux mais non limitatifs de greffons hydrophobes comprenant des GH bifides sont les dialkyl-glycérols et les dialkyl-glutamates.
Les groupements hydrophobes GH peuvent être, par exemple, dérivés de groupements choisis dans le groupe suivant : octanol, dodécanol, tétradécanol, hexadécanol, octadécanol, oléylalcool, tocophérol ou cholestérol.
Selon une autre variante, les polyglutamates selon l'invention peuvent être également porteurs d'au moins un greffon de type polyalkylène (de préférence éthylène)glycol lié à un résidu glutamate.
De préférence, le squelette du polyglutamate selon la présente invention comprend des résidus d'alpha- L- glutamate et/ou d'alpha-L-glutamique acide.
De manière plus préférée encore, les polyglutamates selon l'invention répondent à la formule (I) suivante :
(I)
dans laquelle :
A représente indépendamment :
RNH- dans lequel R représente un H, un alkyle linéaire en C2 à C1O, un alkyle ramifié en C3 à C1O ou un benzyle, un résidu acide aminé terminal de formule :
H -NH — C- -COR7
dans laquelle
-R7 est -OH, -OR9 ou -NHR10, et
R8, R9 et R10 représentent indépendamment un H, un alkyle linéaire en C2 à Cio, un alkyle ramifié en C3 à Cio ou un benzyle ; B est une liaison directe, un groupement de liaison divalent, trivalent ou tétravalent, de préférence choisi parmi les radicaux suivants : -O-, -NH-, -N(C μ 5 alkyle)-, un résidu d'acide aminé (de préférence naturel), de diol, de triol, de diamine, de triamine, d'aminoalcool ou d'hydroxyacide comportant de 1 à 6 atomes de carbone ; D représente un H, un acyle linéaire en C2 à Cio, acyle ramifié en C3 à Cio, ou un pyroglutamate ; les groupements hydrophobes GH représentent chacun indépendamment les uns des autres un radical choisi parmi : • les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C3o pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), ou • les alkylaryles ou arylalkyles en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), ou
• les (poly)cycliques en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence
O et/ou N et/ou S) ;
" de préférence, ce radical est choisi dans le groupe suivant : octyloxy-, dodécyloxy-, tétradécyloxy-, hexadécyloxy-, octadécyloxy-, 9-octadecenyloxy-, tocophéryloxy- ou cholestéryloxy-, B étant alors une liaison directe;
" R1 représente un radical choisi dans le groupe ayant les formules suivantes :
- -NH-(CH2)W-NH3 +, Z" avec w compris entre 2 et 6, et de préférence w est égal à 4,
- -NH-(CH2)4-NH-C(=NH)-NH3 +, Z", - -O-(CH2)2-NH3 +, Z-,
- -O-(CH2)2-N+(CH3)3, Z-,
- un résidu d'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé de formule :
dans laquelle :
X est un atome d'oxygène ou un -NH-,
R est H, alkyle linéaire en C2 à Ci0, alkyle ramifié en C3 à Ci0 ou benzyle,
-R13 est -(CH2)4-NH3 +, Z", -(CH2)3-NH-C(=NH)-NH3 +, Z", -(CHa)3-NH3 +, Z ; dans lesquelles le contre-anion Z" est un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure ;
• R3 représente un hydroxyéthylamino-, un alkylène glycol, un polyalkylène glycol ou un radical de formule :
où -R10 représente -H, -CO2H, un ester d'alkyle (de préférence -COOMe ou -COOEt), -CH2OH, -C(=O)-NH2, -C(=O)-NH-CH3 ou -C(=O)-N(CH3)2 ;
• p, q, r et s sont des entiers positifs ; " (p)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements hydrophobes GH et varie de 2 à 99 % molaire, et de préférence entre 5 et 50 % sous condition que chaque chaîne de copolymère possède en moyenne au moins 3 greffons hydrophobes ;
• (q)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements cationiques et varie de 1 à 99 % molaire ;
" (p+q+r+s) varie de 10 à 1000, de préférence entre 30 et 500 ;
• (r)/(p+q+r+s) varie de 0 à 98 % molaire ;
• (s)/(p+q+r+s) varie de O à 98 % molaire ; ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables De préférence, les groupements hydrophobes GH et les groupements cationiques sont disposés de façon aléatoire en groupements pendants.
D'une manière générale, la formule générale (I) décrite ci-dessus ne doit pas être interprétée comme représentant uniquement des copolymères séquences (ou blocs), mais également des copolymères aléatoires ou des copolymères multiblocs.
II est par ailleurs préférable que le taux de greffage molaire en groupements hydrophobes des polyglutamates selon l'invention soit compris entre 2 et 99 %, et de préférence entre 5 et 50 %, sous condition que chaque chaîne de polymère possède en moyenne au moins 3 greffons hydrophobes.
Le rapport (q)/(p+q+r+s) des polyglutamates selon l'invention signifie qu'ils peuvent contenir de 1 à environ 97 % molaire de groupements contenant une charge cationique.
Le rapport (s)/(p+q+r+s) des polyglutamates selon l'invention signifie qu'ils peuvent être anioniques, neutres ou cationiques à pH neutre.
Selon une autre caractéristique de l'invention, les polymères selon l'invention ont une masse molaire qui se situe entre 2000 et 200000 g/mol, et de préférence entre 5000 et 100000 g/mol.
Naturellement, l'invention couvre également des mélanges de polyaminoacides modifiés tels que définis ci-dessus. De manière remarquable, les polyglutamates de l'invention sont susceptibles d'être utilisés de plusieurs façons selon la nature des groupements hydrophobes et des groupements cationiques, la charge et le degré de polymérisation du polyglutamate. Les méthodes de mise en forme d'un polymère pour l'encapsulation d'un principe actif sous les diverses formes visées par l'invention sont connues de l'homme de l'art. Pour plus de détails, on peut se référer, par exemple à ces quelques références particulièrement pertinentes :
"Microspheres, Microcapsules and Liposomes ; vol 1. Préparation and chemical applications" Ed. R. Arshady, Citas Books 1999. ISBN : 0-9532187-1-6.
" Sustained-Release Injectable Products" Ed. J. Senior et M. Radomsky, Interpharm Press 2000. ISBN : 1 -57491 - 101 -5.
"Colloïdal Drug Delivery Systems" Ed. J. Kreuter, Marcel Dekker, Inc. 1994. ISBN :
0-8247-9214-9.
"Handbook of Pharmaceutical Controlled Release Technology" Ed. D. L. Wise, Marcel
Dekker, Inc. 2000. ISBN : 0-8247-0369-3.
Ces polyglutamates (sous forme de particules ou non) peuvent encapsuler ou associer aisément des principes actifs tels que des protéines, peptides, ADN, ARN ou petites molécules. La mise en forme préférée est celle décrite dans le brevet US 6,630,171 et qui consiste à disperser le copolymère dans l'eau et à incuber la solution en présence d'un principe actif (PA). Cette solution colloïdale de particules de vectorisation, constituées des polyglutamates selon l'invention, peut ensuite être filtrée sous 0,2 μm puis directement injectée à un patient.
Dans le cas où le polymère est cationique et soluble à pH acide du fait d'un excès de charge cationique et que cette charge se trouve partiellement ou totalement neutralisée à pH neutre, un tel polymère est dit dépendant du pH. Ce type de polymère peut donc être utilisé pour former un dépôt après administration, par exemple dans le tissu sous-cutané.
Il convient de comprendre que les fonctions résiduelles carboxyliques du polyglutamate modifié sont soit neutres (forme COOH), soit ionisées (anion COO ), selon le pH et la composition. On parlera donc indifféremment i) de résidu glutamate ou de résidu acide glutamique, ii) d'acide polyglutamique ou de polyglutamate. En solution aqueuse, le contre-cation peut être un cation métallique tel que le sodium, le calcium ou le magnésium, ou un cation organique tel que la triéthanolamine, le tris(hydroxyméthyl)- aminométhane ou une polyamine tel que la polyéthylèneimine. S'il est divalent, un contre- cation peut salifier deux groupements cationiques monovalents proches. Le contre-anion des groupements cationiques est de préférence choisi parmi le groupe comprenant un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate. S'il est divalent, un contre-anion peut salifier deux groupements cationiques monovalents proches. Par suite, dans la présente description, on entend par "sels pharmaceutiquement acceptables" du polymère selon l'invention l'ensemble des polymères avec les contre-ions associés aux fonctions ionisées du polymère. Il est aussi envisageable, pour certaines structures où il y a co-existence des charges positives et négatives qu'il y ait une neutralisation totale ou partielle des charges. Un polymère ayant un nombre équivalent de charges positives et de charges négatives (point isoélectrique) peut exister sans présence ni de contre-anion ni de contre-cation.
Les copolymères de l'invention sont par exemple obtenus par des méthodes connues de l'homme de l'art. Tout d'abord, rappelons que pour l'obtention de polyaminoacides de type alpha, la technique la plus courante est basée sur la polymérisation d'anhydrides de N- carboxy-aminoacides (NCA), décrite, par exemple, dans Biopolymers, 1976, 15, 1869 et dans H.R. Kricheldorf " alpha- Aminoacid-N-carboxy Anhydride and related Heterocycles" Springer Verlag (1987). Le dérivé de NCA est de préférence NCA-GIu-O-R3 (R3 = méthyle, éthyle ou benzyle). Les polymères sont ensuite hydrolyses dans des conditions appropriées pour obtenir le polymère sous sa forme acide. Ces méthodes sont inspirées de la description donnée dans le brevet FR 2801 226. Un certain nombre de polymères utilisables selon l'invention, par exemple, de type poly(alpha-L-glutamique), poly(alpha-D-glutamique), poly(alpha-D,L-glutamate) et poly(gamma-L-glutamique) de masses variables sont disponibles commercialement. De préférence, on synthétise les copolymères de l'invention selon 2 voies. Dans la première, on greffe tout d'abord simultanément ou en séquence le groupement cationique (par exemple Pargininamide) et le groupement B-GH (par exemple la dodécylamine) sur un poly(acide-L-glutamique). Cette réaction peut se faire dans un solvant tel que le DMF, le DMSO ou la NMP selon le schéma suivant.
Dans le mécanisme ci-dessus, lorsque q n'est pas nul, le précurseur du groupe Ri, tel que Péthanolamine liée par l'azote, est introduit au cours de la synthèse en même temps que le groupement cationique.
Dans le cas où le groupement cationique contient deux fonctions aminés non différenciées chimiquement (e.g. diamine linéaire), il peut être introduit sous une forme dans laquelle une des deux fonctions est protégée. Une dernière étape de clivage du groupement protecteur est alors ajoutée au schéma ci-dessus.
Le poly(acide-L-glutamique) peut être synthétisé selon la voie décrite dans la demande de brevet FR 2801 226. Dans le cas où le groupement HB-GH est lié via une fonction ester, il est plus aisé de greffer d'abord le groupement B-GH par une réaction de couplage classique en utilisant un carbodiimide avant de greffer le groupement cationique.
Dans le mécanisme ci-dessus, lorsque q n'est pas nul, le précurseur du groupe Ri, tel que l'éthanolamine liée par l'azote, est introduit au cours de la synthèse en même temps que le groupement cationique.
Dans le cas où le groupement cationique contient deux fonctions aminés non différenciées chimiquement {e.g. diamine linéaire), il peut être introduit sous une forme dans laquelle une des deux fonctions est protégée. Une dernière étape de clivage du groupement protecteur est alors ajoutée au schéma ci-dessus.
La chimie de polymérisation et les réactions de couplage des groupements sont classiques et bien connues de l'homme de l'art (voir par exemples les brevets ou demandes de brevet de la demanderesse cités précédemment).
Ces méthodes seront mieux comprises à travers la description des exemples.
Il doit être observé que le degré de polymérisation est défini par le rapport molaire de l'initiateur sur celui du monomère.
Le couplage du greffon hydrophobe GH avec une fonction acide du polymère est réalisé aisément par réaction du polyaminoacide en présence d'un carbodiimide comme agent de couplage et optionnellement, un catalyseur tel que la 4-diméthylaminopyridine et dans un solvant approprié tel que le diméthylformamide (DMF), la N-méthyl pyrrolidone (NMP) ou le diméthylsulfoxide (DMSO). Le carbodiimide est par exemple, le dicyclohexylcarbo- diimide ou le diisopropylcarbodiimide. Les réactifs de couplage tels que les chloro- formiates peuvent également être utilisés pour la formation de liaisons amides (voir par exemple Bodanszky : « Principles ofPeptide Synthesis » Springer Verlag, 1984). Le taux de greffage est contrôlé par la stœchiométrie des constituants et réactifs ou le temps de réaction. Les greffons hydrophobes fonctionnalisés par un acide aminé autre que celui du polymère sont obtenus par couplage peptidique classique ou par condensation directe par catalyse acide. Ces techniques sont bien connues de l'homme de l'art.
Selon un autre de ses aspects, l'invention vise une composition pharmaceutique, cosmétique, diététique ou phytosanitaire comprenant au moins un polyglutamate tel que défini ci-dessus et éventuellement au moins un principe actif, qui peut être thérapeutique, cosmétique, diététique ou phytosanitaire.
Suivant une disposition intéressante de l'invention, le principe actif est associé au(x) polyaminoacide(s) modifiés par un groupement cationique par une ou plusieurs liaisons autre(s) qu'une (ou que des) liaison(s) chimique(s) covalente(s).
Les techniques d'association d'un ou de plusieurs PA aux polyaminoacides modifiés selon l'invention sont similaires à celles décrites notamment dans le brevet US 6,630,171. Elles consistent à incorporer au moins un principe actif dans le milieu liquide contenant des Particules de Vectorisation (PV), de manière à obtenir une suspension colloïdale de PV chargées en ou associées avec un ou plusieurs principe(s) actif(s) PA. Cette incorporation, qui conduit à un piégeage de PA par les PV, peut être réalisée de la manière suivante :
• mise en solution aqueuse de PA, puis ajout des PV, soit sous forme de suspension colloïdale, soit sous forme de PV isolées (lyophilisât ou précipité) ;
• ou ajout de PA, soit en solution, soit à l'état pur ou préformulé, à une suspension colloïdale de particules PV, éventuellement préparée extemporanément par la dispersion de PV sèches dans un solvant approprié, tel que l'eau. De préférence, le principe actif est choisi dans le groupe comprenant : les protéines, les glycoprotéines, les protéines liées à une ou plusieurs chaînes polyalkylèneglycol [de préférence polyéthylèneglycol (PEG): "protéines-PEGylées"], les peptides, les polysaccharides, les liposaccharides, les oligonucléotides, les polynucléotides et leurs mélanges, et, plus préférentiellement encore, dans le sous-groupe des érythropoïétines, telles que l'époétine alpha, l'époétine bêta, la darbépoétine, le raffimère d'hémoglobine, leurs analogues ou leurs dérivés ; ocytocine, vasopressine, hormone adrénocorticotropique, facteur de croissance épidermique, facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), les facteurs stimulants de l'hématopoïèse et leurs mélanges, les facteurs sanguins, tels que alteplase, tenecteplase, facteur VΙI(a), facteur VII ; hémoglobine, les cytochromes, les albumines, prolactine, lulibérine, hormone de libération de l'hormone lutéinisante (LHRH) et analogues, tels que leuprolide, goséréline, triptoréline, buseréline, nafaréline ; antagonistes de la LHRH, les agonistes de la LHRH, les hormones de croissance (GH) humaine, porcine ou bovine, le facteur de libération de l'hormone de croissance, l'insuline, la somatostatine, le glucagon, les interleukines ou leurs mélanges (IL-2, IL-I l, IL- 12), les interférons, tels que l'interféron alpha, alpha-2b, bêta, bêta- la, ou D D la gastrine, la tétragastrine, la pentagastrine, l'urogastrone, la sécrétine, la calcitonine, les enképhalines, les endomorphines, les angiotensines, l'hormone de libération de la thyrotropine (TRH), le facteur de nécrose tumorale (TNF), le facteur de croissance des nerfs (NGF), les facteurs de croissance tels que beclapermine, trafermine, ancestime, le facteur de croissance des kératinocytes, le facteur de croissance hématopoïétique des granulocytes (G-CSF), le facteur de croissance hématopoïétique des granulocytes macrophages (GM-CSF), le facteur de croissance hématopoïétique des macrophages (M- CSF), Phéparinase, les protéines morphogéniques de l'os (BMP), le facteur natriurétique auriculaire humain (hANP), le peptide ressemblant au glucagon (GLP-I), le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), l'antigène recombinant de l'hépatite B (rHBsAg), la rénine, les cytokines, la bradykinine, les bacitracines, les polymyxines, les colistines, la tyrocidine, les gramicidines, l'étanercept, l'imiglucérase, la drotrécogine alpha, les cyclosporines et analogues synthétiques, les modifications et fragments actifs pharmaceutiquement d'enzymes, de cytokines, d'anticorps, d'antigènes et de vaccins, les anticorps tels que rituximab, infliximab, trastuzumab, adalimumab, omalizumab, tositumomab, efalizumab, et cetuximab. D'autres principes actifs sont les polysaccharides (par exemple, l'héparine) et les oligo- ou polynucléotides, ADN, ARN, iARN, antibiotiques, et cellules vivantes. Une autre classe de principes actifs comprend les substances pharmaceutiques agissant sur le système nerveux central, par exemple, rispéridone, zuclopenthixol, fluphénazine, perphénazine, flupentixol, halopéridol, fluspirilène, quétiapine, clozapine, amisulprid, sulpiride, ziprasidone, etc.
Selon une variante, le principe actif est une petite molécule organique hydrophobe, hydrophile ou amphiphile. Au sens du présent exposé, une "petite" molécule est notamment une petite molécule non protéinique.
Comme exemples de PA susceptibles d'être associés aux polyaminoacides selon l'invention, qu'ils soient ou non sous forme de (nano ou micro)particules, on peut citer : o les protéines telles que l'insuline, les interférons, les hormones de croissance, les interleukines, l'érythropoïétine ou les cytokines ; o les peptides tels que le leuprolide ou la cyclosporine ; o les petites molécules telles que celles appartenant à la famille des anthracyclines, des taxoïdes ou des camptothécines ; o et leurs mélanges.
D'une manière avantageuse, le principe actif est choisi parmi au moins l'une des familles de substances actives suivantes : les agents de traitement de l'abus d'alcool, les agents de traitement de la maladie d'Alzheimer, les anesthésiques, les agents de traitement de l'acromégalie, les analgésiques, les anti asthmatiques, les agents de traitement des allergies, les agents anticancéreux, les anti-inflammatoires, les anticoagulants et antithrombotiques, les anticonvulsivants, les antiépileptiques, les antidiabétiques, les antiémétiques, les antiglaucomes, les antihistaminiques, les antiparasitaires, les antibiotiques, les antifongiques, les antiviraux, les antiparkinsoniens, les anti- cholinergiques, les antitussifs, les inhibiteurs de Panhydrase carbonique, les agents cardiovasculaires, les hypolipémiants, les anti-arythmiques, les vasodilatateurs, les antiangineux, les anti-hypertenseurs, les vasoprotecteurs, les inhibiteurs de cholinestérase, les agents de traitement des désordres du système nerveux central, les stimulants du système nerveux central, les contraceptifs, les promoteurs de fécondité, les inducteurs et inhibiteurs du travail utérin, les agents de traitement de la mucoviscidose, les agonistes des récepteurs de la dopamine, les agents de traitement de l'endométriose, les agents de traitement des dysfonctionnements érectiles, les agents de traitement de la fertilité, les agents de traitement des troubles gastro-intestinaux, les immunomodulateurs et les immunosuppresseurs, les agents de traitement des troubles de la mémoire, les antimigraineux, les myorelaxants, les analogues de nucléosides, les agents de traitement de l'ostéoporose, les parasympathomimétiques, les prostaglandines, les agents psychothérapeutiques, les sédatifs, les hypnotiques et tranquillisants, les neuroleptiques, les anxiolytiques, les psychostimulants, les antidépresseurs, les agents de traitements dermatologiques, les stéroïdes et les hormones, les amphétamines, les anorexiques, les anti-douleurs non analgésiques, les anti-épileptiques, les barbituriques, les benzodiazépines, les hypnotiques, les laxatifs, les psychotropes et toutes les associations de ces produits.
Selon un mode de réalisation, la composition de l'invention est sous forme d'un gel, d'une solution, d'une suspension, d'une émulsion, de micelles, de nanoparticules, de microparticules, d'un implant, d'une poudre, d'une suspension ou d'un film. Suivant l'une de ses formes particulièrement préférées, la composition, chargée ou non en principe actif(s), est une suspension colloïdale stable de nanoparticules et/ou de microparticules et/ou de micelles polyaminoacides, dans une phase aqueuse ou huileuse.
Des microparticules peuvent être obtenues par diverses méthodes telles que la coacervation en présence d'un agent d'agrégation (ions divalents ou trivalents ou polyélectrolytes), précipitation par changement de pH ou de la force ionique, extraction/évaporation ou par atomisation.
En particulier, la composition selon l'invention peut être une solution colloïdale de nanoparticules dans une phase aqueuse à pH acide et qui précipite à pH physiologique.
Avantageusement, un polyaminoacide de l'invention présentant un excès de charge cationiques peut condenser un principe actif anionique tel que l'ADN, un fragment d'ADN, un ARN ou un oligo ARN sous forme de nano- ou microparticules et ces particules peuvent être internalisées dans une cellule.
Selon un autre mode de réalisation, la composition de l'invention est sous forme de solution dans un solvant biocompatible et peut être injectée par voie sous-cutanée, intramusculaire ou dans une tumeur.
La composition selon l'invention, dès lors qu'elle est pharmaceutique, peut être administrée par voie orale, pulmonaire, parentérale, nasale, vaginale, oculaire, sous- cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou buccale.
Il est également envisageable que la composition soit sous forme de solution dans un solvant ou un mélange de solvants biocompatibles, susceptible d'être injectée en sous- cutané, intramusculaire ou dans une tumeur.
Selon un autre mode de réalisation, la composition peut contenir un excipient pour l'ajustement du pH et/ou de l'osmolarité et/ou pour améliorer la stabilité (antioxydants) et/ou comme agent antimicrobiens. Ces excipients sont bien connus de l'homme de l'art (Cf. Injectable Drug Development, P. K. Gupta et al. Interpharm Press, Denver, 1999).
L'invention vise aussi un procédé de préparation
• de médicaments, en particulier pour administration orale, nasale, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale ou intracérébrale, les principes actifs de ces médicaments pouvant être, notamment, des protéines, des glycoprotéines, des protéines liées à une ou plusieurs chaînes polyalkylèneglycol {par exemple PolyEthylèneGlycol (PEG), on parle alors de protéines "PEGylées"}, des peptides, des polysaccharides, des liposaccharides, des oligonucléotides, des polynucléotides et des petites molécules organiques hydrophobes, hydrophiles ou amphiphiles ;
• et/ou des nutriments ;
• et/ou de produits cosmétiques ou phytosanitaires ; ce procédé étant caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à mettre en œuvre au moins l'un des polyaminoacides tels que définis ci-dessus et/ou la composition décrite ci-dessus.
L'invention concerne également une méthode de traitement thérapeutique consistant essentiellement à administrer la composition telle que décrite dans le présent exposé, par voie orale, pulmonaire, parentérale, nasale, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou buccale.
Suivant une variante particulière de l'invention, cette méthode de traitement thérapeutique consiste essentiellement à mettre en œuvre la composition telle que décrite supra sous forme de solution dans un solvant biocompatible puis à l'injecter en sous-cutané, intramusculaire ou dans une tumeur, de préférence de manière à ce qu'elle forme un dépôt sur le site d'injection.
L'invention sera mieux comprise et ses avantages et variantes de mise en œuvre ressortiront bien des exemples qui suivent et qui décrivent la synthèse des polymères de l'invention, leur transformation en système de vectorisation de PA (suspension colloïdale aqueuse stable) et la démonstration de la capacité d'un tel système de s'associer à une protéine ou à un acide nucléique pour former des compositions pharmaceutiques.
EXEMPLES : Exemple 1 : synthèse du polymère (1)
Indices et groupements : T = D,L-α-tocophérol, p = s = l l , q = 198
Dix grammes d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'α-tocophérol racémique sont solubilisés dans 125 mL de NMP à 80 0C. Cette solution est refroidie à 0 0C, et 8,7 mL de chloroformiate d'ώo-butyle puis 7,35 mL de TV- méthyl-morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 15 min à 0 0C. En parallèle, 24,67 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 308 mL de NMP et 14,7 mL de triéthylamine sont ajoutés. La suspension obtenue est agitée quelques minutes à 20 0C puis refroidie à 0 0C. La suspension laiteuse de polymère activé est alors additionnée à cette suspension, et le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à 0 0C, puis une nuit à 20 0C. Après ajout de 2,1 mL d'une solution d'HCl 35 % puis 100 mL d'eau, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 1,6 L d'eau. La solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 250 mL. Le pourcentage d'argininamide greffé, déterminé par RMN du proton dans D2O, est de 90 %. Exemple 2 : synthèse du polymère (2)
Indices et groupements : T = D,L-α-tocophérol, p = s = 6, q = 108
Trois grammes et demi d'un poly(acide glutamique) de DP 120 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'α-tocophérol racémique sont solubilisés dans 70 mL de NMP à 80 0C. Cette solution est refroidie à 0 0C, et 3,2 g de chloroformiate d'/so-butyle puis 2,37 g de vV-méthyl-morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 10 min à 0 0C. En parallèle, 4,62 g de 7V-te/t-butyloxycarbonyl-l,4-butanediamine (BOC-putrescine) sont solubilisés dans 9 mL de NMP puis refroidis à 0 0C. La suspension laiteuse de polymère activé est alors additionnée à cette solution, et le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à 0 0C, puis une nuit à 20 0C. Après ajout de 0,7 mL d'une solution d'HCl 35 %, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 317 mL d'eau. La solution obtenue est ajustée à pH = 7,4 avec de la soude IN, puis dialysée contre de l'eau salée (0,9 %) puis de l'eau. La suspension obtenue est lyophilisée pour donner 4,1 g d'une poudre blanche. Cette poudre est remise en solution dans le TFA, agitée 2 h à 20 0C, puis versée goutte à goutte dans un pied d'eau en ajustant le pH vers 7 avec une solution de soude 1 N. La solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 50 mL. Le pourcentage de BOC-putrescine greffée, déterminé par RMN du proton dans D2O, est de 90 %. Exemple 3 : synthèse du polymère (3)
Indices et groupements : T = D,L-α-tocophérol, p = 11, q = 88, r = 99, s = 22
Dix grammes d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'α-tocophérol racémique sont solubilisés dans 125 mL de NMP à 80 0C. Cette solution est refroidie à 0 0C, et 9,1 mL de chloroformiate d'ώo-butyle puis 7,71 mL de N- méthyl morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 15 minutes à 0 0C. En parallèle, 8,2 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 103 mL de NMP et 9,31 mL de triéthylamine sont ajoutés. On ajoute encore 1,6 mL d'éthanolamine, et la suspension obtenue est agitée quelques minutes à 20 0C puis refroidie à 0 0C. La suspension laiteuse de polymère activé est alors additionnée à cette suspension, et le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à 0 0C. On ajoute 1,2 mL d'éthanolamine, puis agite une nuit à 20 0C. Après ajout de 2,1 mL d'une solution d'HCl 35 % puis 200 mL d'eau, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 700 mL d'eau tout en ajustant le pH vers 7,4. La solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 250 mL. Les pourcentage d'argininamide et d'éthanolamine greffées, déterminés par RMN du proton dans D2O, sont respectivement de 40 et 45 % Exemple 4 : synthèse du polymère (4)
Indices et groupements : T = D,L-α-tocophérol, p = 6, q = 59, r = 52, s = 3
Cinq grammes d'un poly(acide glutamique) de DP 120 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'α-tocophérol racémique sont solubilisés dans 63 mL de NMP à 80 0C. Cette solution est refroidie à 0 0C, et 4,3 g de chloroformiate d'ώo-butyle puis 3, 7 g de N- méthyl-morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 10 min à O 0C. En parallèle, 3,15 g de N-fert-butyloxycarbonyl-l,4-butanediamine (BOC-putrescine) sont solubilisés dans 39 mL de ΝMP puis refroidis à 0 0C. On ajoute cette solution à la suspension laiteuse de polymère activé, et le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à
0 0C. On ajoute 2 mL d'éthanolamine, puis agite une nuit à température ambiante. Après ajout de 1,04 mL d'une solution d'HCl 35 %, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 407 mL d'eau. La suspension obtenue est ajustée à pH = 7,4 avec de la soude
1 Ν, puis dialysée (seuil de coupure de 1 kD) contre de l'eau salée (0,9 %) puis de l'eau. La suspension obtenue est lyophilisée pour donner une poudre blanche. Cette poudre est remise en solution dans 100 mL de TFA, agitée 1,25 h à 20 0C, puis versée goutte à goutte dans un pied d'eau (500 mL) en ajustant le pH vers 7 avec une solution de soude 1 Ν. Après ajout de 600 mL d'éthanol, la solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 100 mL. Les pourcentages de BOC-putrescine et d'éthanolamine greffées, déterminés par RMΝ du proton dans D2O, sont respectivement de 49 et 43 %. Exemple 5 : synthèse du polymère (5)
Indices et groupements : T = D,L-α-tocophérol, p = 5, q = 83, s = 12
Selon un mode opératoire similaire à celui utilisé pour la synthèse du polymère (1), on obtient environ 30O mL d'une solution concentrée à 48 mg/g à partir de 10 g d'un poly(acide glutamique) de DP 100 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'α-tocophérol racémique, de 9,6 g de chloroformiate d'zsobutyle, de 7,7 mL de jV-méthyl-morpholine, de 24,7 g de dichlorhydrate d'argininamide et de 14,7 mL de triéthylamine. Le pourcentage d'argininamide greffé, déterminé par RMN du proton dans D2O, est de 83 %.
Exemple 6 : synthèse du polymère (6)
Indices et groupements : T = D,L-α-tocophérol, p = 11, q = 62, s = 147
Selon un mode opératoire similaire à celui utilisé pour la synthèse du polymère (1), on obtient environ 25O mL d'une solution concentrée à 43 mg/g à partir de 10 g d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'α-tocophérol racémique, de 2,9 g de chloroformiate d'ώo-butyle, de 2,2 mL de iV-méthyl-morpholine, de 4,93 g de dichlorhydrate d'argininamide et de 3,3 mL de triéthylamine. Le pourcentage d'argininamide greffé, déterminé par RMN du proton dans D2O, est de 28 %.
Exemple 7 : synthèse du polymère (7)
Indices et groupements : T = D,L-α-tocophérol, p = 5, q = 40, r = 48, s = 7
Selon un mode opératoire similaire à celui utilisé pour la synthèse du polymère (3), on obtient environ 20O mL d'une solution concentrée à 41 mg/g à partir de 10 g d'un poly(acide glutamique) de DP 100 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'α-tocophérol racémique, de 9,58 g de chloroformiate d'ώo-butyle, de 7,7 mL de iV-méthyl-morpholine, de 8,22 g de dichlorhydrate d'argininamide, de 2,86 g d'éthanolamine et de 5,1 mL de triéthylamine. Les pourcentages d'argininamide et d'éthanolamine greffés, déterminés par RMN du proton dans D2O, sont respectivement de 40 et 48 %.
Exemple 8 : synthèse du polymère (8)
Indices et groupements : T = D,L-α-tocophérol, p = 11, q = 139, s = 70
Selon un mode opératoire similaire à celui utilisé pour la synthèse du polymère (1), on obtient environ 20O mL d'une solution concentrée à 51 mg/g à partir de 10 g d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'α-tocophérol racémique, de 6,39 g de chloroformiate d'/so-butyle, de 5,1 mL de vV-méthyl-morpholine, de 13,16 g de dichlorhydrate d'argininamide et de 7,5 mL de triéthylamine. Le pourcentage d'argininamide greffé, déterminé par RMN du proton dans D2O, est de 63 %.
Exemple 9 : synthèse du polymère (9)
Indices et groupements : T = D,L-α-tocophérol, p = l l, q = 121, s = 88
Cinq grammes d'un poly( acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'α-tocophérol racémique sont solubilisés dans 63 mL de NMP à 80 0C. Cette solution est refroidie à 0 0C, et 2,38 mL de chloroformiate d'ώo-butyle puis 2,02 mL de N- méthyl-morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 15 min à O 0C. En parallèle, 4,93 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 62 mL de NMP et 2,8 mL de triéthylamine sont ajoutés. La suspension obtenue est agitée quelques minutes à 20 0C puis refroidie à 0 0C. La suspension laiteuse de polymère activé est alors additionnée à cette suspension, et le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à 0 0C, puis 4 h à 20 0C. Après ajout de 1,04 mL d'une solution d'HCl 35 % puis 5O mL d'eau, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 50O mL d'eau acide (pH = 3), en maintenant le pH vers 3 - 4 avec une solution d'HCl 1 N. La solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 250 mL. Le pourcentage d'argininamide greffé, déterminé par RMN du proton dans D2O, est de 55 %. Exemple 10 : synthèse du polymère (10)
Indices et groupements : T = D,L-α-tocophérol, p = 11 , q = 88, r = 48, s = 73
Dix grammes d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'α-tocophérol racémique sont solubilisés dans 125 mL de NMP à 80 0C. Cette solution est refroidie à 0 0C, et 5,6 mL de chloroformiate d'/so-butyle puis 4,8 mL de N- méthyl-morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 15 min à 0 0C. En parallèle, 7,4 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 93 mL de NMP, puis 4,7 mL de triéthylamine et 1,2 mL d'éthanolamine sont ajoutés. La suspension obtenue est agitée quelques minutes à 20 0C puis refroidie à 0 0C. La suspension laiteuse de polymère activé est alors additionnée à cette suspension, et le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à 0 0C, puis une nuit à 20 0C. Après ajout de 2,07 mL d'une solution d'HCl 35 % puis 20O mL d'eau, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 670 mL d'eau acidifiée à pH = 3 avec HCl, en maintenant le pH vers 3 avec une solution d'HCl 1 N. La solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 250 mL. Les pourcentages d'argininamide et d'éthanolamine greffés, déterminés par RMN du proton dans D2O, sont respectivement de 40 et 22 %. Exemple comparatif 11 : le composé Cl non fonctionnalisé par un groupement cationique
Le composé comparatif Cl est le précurseur (sous sa forme anionique) du polyglutamate modifié par un groupement cationique, soit le polyglutamate de DP 220 greffé à 5% de façon statistique avec de la alpha-tocophérol racémique. Ce composé est obtenu par la méthode décrite dans la demande WO-A-03/ 104303.
Exemple 12 : Étude d'association de l'insuline
On prépare une solution aqueuse contenant 10 mg de polymère par millilitre à pH 7,4 et 200 UI d'insuline (7,4 mg). On laisse incuber les solutions pendant 2 h à température ambiante et on sépare l'insuline libre de l'insuline associée par ultrafiltration (seuil à 10O kDa, 15 min sous 10000G à 18 0C). L'insuline libre récupérée dans le filtrat est ensuite dosée par CLHP (Chromatographie Liquide Haute Performance) et l'on déduit la quantité d'insuline associée. Les résultats sont donnés dans le tableau 1 ci-dessous.
TABLEAU 1
Les résultats démontrent que les polymères de l'invention sont capables d'associer fortement l'insuline pour donner des suspensions colloïdales de taille supérieure à 100 kDa et les taux d'association avec l'insuline sont très élevés. En comparaison avec le polymère Cl, on constate que la présence de charges cationiques ne diminue pas le taux d'insuline associé.
Exemple 13 : mesure de la viscosité (mPa/s) sous cisaillement d'une solution aqueuse à 29 mg/g avec un gradient de vitesse de 10 s"1
Les résultats démontrent que les polymères de l'invention sont nettement moins visqueux que la référence Cl qui ne contient pas de groupements cationiques pendants.
Exemple 14 : Étude de solubilité en fonction du pH
Les résultats montrent que certains polymères de l'invention (exemples 9 et 10) présentent des propriétés de solubilité dépendantes du pH qui, contrairement au composé Cl, leur permettent d'être formulés avec un principe actif à pH modérément acide (pH = 4) et de former un dépôt à pH physiologique (pH autour de 7).
Exemple 15 : Étude d'association d'un ARN thérapeutique
On réalise des associations polymère/ ARN en solution aqueuse en ajoutant des quantités croissantes de polymères (1), (3) (deux exemples de polymères de l'invention qui sont globalement cationiques à pH = 7,4) ou Cl à des quantités fixes d'un ARN thérapeutique de 1433 nucléotides. Ces mélanges sont incubés 2 h à 37 0C, puis analysés par électrophorèse sur gel d'agarose 1 % en conditions dénaturantes (révélation des ARN au bromure d'éthidium). De l'ARN seul sert de contrôle positif d'intégrité. De l'ARN incubé avec des RNAses commerciales sert de contrôle d'ARN dégradé. Les résultats montrent que lorsque l'ARN étudié a été incubé avec les polymères (1) ou (3), la quantité d'ARN qui migre à la taille attendue en électrophorèse diminue progressivement avec la quantité de polymère utilisé pour l'association et disparaît au delà d'une certaine valeur sans apparition d'autres bandes. Au contraire, dans le mélange réalisé avec le composé Cl, la quantité d'ARN qui migre est inchangée, même en présence d'un large excès de polymère.
Dans un 2e temps, on ajoute sur l'ARN la quantité de polymère (1) ou (3) permettant de l'associer totalement (conditions où l'ARN n'est plus visible à la taille attendue sur gel) et on laisse ces mélanges incuber 2 h à 37 0C. Après 2 h à 37 0C, on ajoute sur ces mélanges des quantités croissantes de composé Cl et on réalise une nouvelle incubation de 16 h à 37 0C. Les mélanges obtenus sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose 1 % en conditions dénaturantes (révélation des ARN au bromure d'éthidium). Les résultats montrent que l'on observe à la taille attendue des quantités croissantes d'ARN en corrélation avec la quantité de polymère Cl ajouté sur le mélange ARN/polymère (1) ou (3).
Ces résultats montrent que certains polymères de l'invention, globalement cationiques à pH = 7,4, permettent d'associer un ARN modèle de 1433 nucléotides et que cette association est réversible en présence d'un polymère globalement anionique. De plus, l'ARN formulé n'est pas dégradé.
Exemple 16 : Étude du franchissement de la membrane cellulaire d'un oligonucléotide modèle
On mélange dans du milieu Opti-MEM® sans sérum de veau fœtal un oligonucléotide d'ARN de 30 bases marqué au Cy3 à une quantité de polymère (3) ou (7) proche de la quantité minimale pour associer la totalité de l' oligonucléotide. Ce mélange est mis en contact sur des cellules d'hépatocarcinome humain Huh-7 cultivées en plaque 24 puits à raison de 25 000 cellules/puits. Après 4 h d'incubation à 37 0C, 5 % CO2, on ajoute du milieu D-MEM à 20 % de sérum de veau foetal (SVF) de telle sorte que la concentration finale de SVF soit de 10 %. Après 24 h d'incubation des cellules en présence des mélanges oligonucléotide/polymère, les cellules sont lavées, marquées au niveau membranaire à la concanavaline biotinylée puis fixées 3 min avec du paraformaldéhyde à 3,7 %. Après 2 lavages avec du tampon PBS, les cellules sont incubées avec du DAPI (ADN nucléaire) pendant 10 min, lavées 3 fois avec du PBS, puis incubées avec la streptavidine marquée avec l'Alexa Fluor® 488 qui révèle la concanavaline biotinylée. Les cellules sont observées en microscopie confocale. La localisation des cellules est possible par observation de leur membrane marquée à l'Alexa Fluor® 488 et de leur noyau marqué au DAPI. L'entrée de l'oligonucléotide marqué au Cy3 dans la cellule est visualisée par observation de la fluorescence du Cy3 (excitation à 550 nm, émission à 570 nm).
Les résultats montrent que l'on retrouve de l'oligonucléotide marqué au Cy3 dans le cytoplasme des cellules Huh-7 quand l'oligonucléotide a été incubé sur les cellules en présence des polymères (3) ou (7).
En comparaison, quand on incube l'oligonucléotide seul, ou en présence du polymère Cl, sur les cellules Huh-7, on n'observe pas la présence de l'oligonucléotide marqué dans les cellules.

Claims

REVENDICATIONS
1. Polyaminoacides, ou leurs sels pharmaceutiquement acceptables, comprenant des résidus glutamiques, caractérisés en ce que certains des résidus glutamiques sont porteurs d'un groupement cationique pendant, qui, s'il est déprotonable, présente un pKa supérieur ou égal à 7, lesdits groupements cationiques étant identiques ou différents entre eux, et en ce que d'autres résidus glutamiques sont porteurs d'un groupement hydrophobe (GH) pendant, les groupements hydrophobes (GH) étant identiques ou différents entre eux, lesdits groupements cationiques utilisables correspondant à la formule suivante :
X IW3 +Z
dans laquelle : X = O5 NH,
Y = indépendamment un H ou un CH3,
Z" = un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate,
L = un alkylène linéaire (C2 à C6) et éventuellement substitué par un groupe fonctionnel de type carboxyle ou dérivé, lesdits groupements hydrophobes (GH) étant choisis dans le groupe comprenant :
• les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome,
• les alkylaryles ou arylalkyles en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome,
• et les (poly)cycliques en Cg à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome.
2. Polyaminoacides selon la revendication 1, caractérisés en ce que les groupements cationiques pendants sont greffés aux résidus glutamiques par l'intermédiaire d'une liaison amide ou ester.
3. Polyaminoacides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce qu'ils sont constitués d'homopolymères fonctionnalisés de L- glutamate ou d'acide L-glutamique liés dans le polyaminoacide par leur carboxyle en position alpha.
4. Polyaminoacides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce que les groupements cationiques pendants sont choisis dans le groupe de radicaux suivants :
où Ra représente un groupement hydroxy, alcoxy ou alkylamino, de préférence un groupement -OMe, -OEt, -NH2, -NHCH3 ou -N(CH3)2, et T représente un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure, ou -NH-(CH2)4-NH3 +, Z",
-NH-(CH2)4-NH-C(=NH)-NH3 +, Z", -O-(CH2)2-N+(CH3)3, Z", -O-(CH2)2-NH3 +, Z" où Z" représente un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure.
5. Polyaminoacides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce qu'ils comportent en moyenne au moins 3 groupements hydrophobes (GH) par chaîne de polymère.
6. Polyaminoacides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce que encore d'autres résidus glutamiques sont porteurs d'un groupement non ionisable pendant, différent des groupements hydrophobes (GH), lesdits groupements non ionisables étant identiques ou différents entre eux.
7. Polyaminoacides selon la revendication 6, caractérisés en ce que ledit groupement non ionisable pendant est le radical hydroxyéthylamino-.
8. Polyaminoacides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce que encore d'autres résidus glutamiques sont porteurs d'un groupement non ionisé à pH neutre, différent des groupements hydrophobes (GH), lesdits groupements non ionisés à pH neutre étant identiques ou différents entre eux.
9. Polyaminocacides selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit groupement non ionisé à pH neutre répond à la formule suivante :
où -R10 est -H, -CO2H, ester d'alkyle (de préférence -COOMe ou
-COOEt), -CH2OH, -C(=O)-NH2 , -C(=O)-NH-CH3 ou -C(=O)-N(CH3)2 .
10. Polyaminoacides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce qu'ils sont porteurs d'au moins un greffon de type polyalkylène (de préférence éthylène) glycol lié à un résidu glutamate.
11. Polyaminoacides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule (I) suivante :
dans laquelle :
A représente indépendamment :
RNH- dans lequel R représente un H, un alkyle linéaire en C2 à Cio un alkyle ramifié en C3 à C io ou un benzyle, un résidu acide aminé terminal de formule :
H -NH — C- -COR'
dans laquelle
-R7 est -OH, -OR9 ou -NHR10, et
R8, R9 et R10 représentent indépendamment un H, un alkyle linéaire en C2 à Cio, un alkyle ramifié en C3 à Qo ou un benzyle ; B est une liaison directe, un groupement de liaison divalent, trivalent ou tétravalent, de préférence choisi parmi les radicaux suivants : -O-, -NH-, -N(C 1.5 alkyle)-, un résidu d'acide aminé (de préférence naturel), de diol, de triol, de diamine, de triamine, d'aminoalcool ou d'hydroxyacide comportant de 1 à 6 atomes de carbone ; D représente un H, un acyle linéaire en C2 à Cio, acyle ramifié en C3 à Cio, ou un pyroglutamate ; les groupements hydrophobes GH représentent chacun indépendamment les uns des autres un radical choisi parmi : • les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C3o pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), ou • les alkylaryles ou arylalkyles en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), ou
• les (poly)cycliques en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence
O et/ou N et/ou S) ;
" de préférence, ce radical est choisi dans le groupe suivant : octyloxy-, dodécyloxy-, tétradécyloxy-, hexadécyloxy-, octadécyloxy-, 9-octadecenyloxy-, tocophéryloxy- ou cholestéryloxy-, B étant alors une liaison directe ;
" R1 représente un radical choisi dans le groupe ayant les formules suivantes : -NH-(CH2)W-NH3 +, Z" avec w compris entre 2 et 6, et de préférence w est égal à 4,
- -NH-(CH2)4-NH-C(=NH)-NH3 +, Z\ - -O-(CH2)2-NH3 +, Z",
- -O-(CH2)2-N+(CH3)3, Z", un résidu d'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé de formule :
dans laquelle :
X est un atome d'oxygène ou un -NH-,
R est H, alkyle linéaire en C2 à Ci0, alkyle ramifié en C3 à Cio ou benzyle,
-R13 est -(CH2)4-NH3 +, Z", -(CH2)3-NH-C(=NH)-NH3 +, Z", -(CH2)3-NH3 +, Z ; dans lesquelles le contre-anion Z" est un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure ;
• R3 représente un hydroxyéthylamino-, un résidu d'alkylène glycol, un polyoxyalkylène glycol ou un radical de formule :
où -R10 représente -H, -CO2H, un ester d'alkyle (de préférence -COOMe ou -COOEt), -CH2OH, -C(=O)-NH2, -Q=O)-NH-CH3 ou -C(=O)-N(CH3)2 ;
• p, q, r et s sont des entiers positifs ; • (p)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements hydrophobes GH et varie de 2 à 99 % molaire, et de préférence entre 5 et 50 % sous condition que chaque chaîne de copolymère possède en moyenne au moins 3 greffons hydrophobes ;
• (q)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements cationiques et varie de 1 à 99 % molaire ;
' (P+cl+r+s) varie de 10 à 1000, de préférence entre 30 et 500 ;
• (r)/(p+q+r+s) varie de 0 à 98 % molaire ;
• (s)/(p+q+r+s) varie de 0 à 98 % molaire ; ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
12. Composition pharmaceutique, cosmétique, diététique ou phytosanitaire comprenant au moins un polyaminoacide comprenant des résidus glutamiques modifié par un groupement cationique selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
13. Composition selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un principe actif.
14. Composition selon la revendication 13, caractérisée en ce que le principe actif est associé au(x) polyaminoacide(s) comprenant des résidus glutamiques modifié(s) par un groupement cationique par une ou plusieurs liaisons autre(s) qu'une (ou des) liaison(s) chimique(s) covalente(s).
15. Composition selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisée en ce que le principe actif est choisi dans le groupe comprenant l'ADN, un fragment d'ADN, un ARN et un oligo ARN.
16. Composition selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, caractérisée en ce qu'elle est une suspension colloïdale de nanoparticules et/ou de microparticules et/ou de micelles de polyaminoacide comprenant des résidus glutamiques modifié par un groupement cationique, dans une phase aqueuse ou huileuse.
17. Composition selon l'une quelconque des revendications 12 à 16, caractérisée en ce que la suspension est une solution colloïdale de nanoparticules dans une phase aqueuse à pH acide et qui précipite à pH physiologique.
18. Procédé de préparation de médicaments, en particulier pour administration orale, nasale, pulmonaire, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale ou intracérébrale, les principes actifs de ces médicaments pouvant être, notamment, des protéines, des glycoprotéines, des protéines liées à une ou plusieurs chaînes polyalkylèneglycol, des peptides, des polysaccharides, des liposaccharides, des oligonucléotides, des polynucléotides et des petites molécules organiques hydrophobes, hydrophiles ou amphiphiles ; et/ou des nutriments ; et/ou de produits cosmétiques ou phytosanitaires ; caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à mettre en œuvre au moins l'un des polyaminoacides selon l'une quelconque des revendications l à 11 et/ou la composition selon l'une quelconque des revendications 12 à 17.
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