CA2683741A1 - Acides polyglutamiques fonctionnalises par des groupements cationiques et des groupements hydrophobes et leurs applications, notamment therapeutiques - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne des nouveaux matériaux à base de polyamino acides modifiés, biodégradables, utiles notamment pour la vectorisation de p rincipe(s) actif(s) (PA). L'invention vise aussi de nouvelles compositions p harmaceutiques, cosmétiques, diététiques ou phytosanitaires à base de ces po lyaminoacides. Le but de l'invention est de fournir une nouvelle matière pre mière polymère, susceptible d'être utilisée pour la vectorisation de PA et p ermettant de satisfaire de manière optimale à toutes les spécifications requ ises en l'espèce : biocompatibilité, biodégradabilité, aptitude à s'associer facilement avec de nombreux principes actifs ou à les solubiliser, et à lib érer ces principes actifs in vivo. Ce but est atteint par la présente invent ion qui concerne des nouveaux polyglutamates modifiés par des groupements ca tioniques qui, s'ils sont déprotonables, présentent un pKa supérieur ou égal à 7, et par des groupements hydrophobes comportant de 8 à 30 atomes de carb one. Ces polyglutamates modifiés par des groupements cationiques sont aptes à se transformer aisément et économiquement en particules de vectorisation d e principes actifs, ces particules étant elles-mêmes propres à former des su spensions colloïdales aqueuses stables. Ces polyglutamates modifiés présente nt l'avantage d'être moins visqueux que d'autres polymères analogues, tout e n conservant une capacité à associer des protéines telles que l'insuline. Ce rtains sont solubles dans l'eau à pH acide et deviennent insoluble à pH phys iologique (7,4) et devraient donc, lors d'une injection sous-cutanée, précip iter sur le site d'injection.
Description
ACIDES POLYGLUTAMIQUES FONCTIONNALISES PAR DES
GROUPEMENTS CATIONIQUES ET DES GROUPEMENTS HYDROPHOBES
ET LEURS APPLICATIONS, NOTAMMENT THERAPEUTIQUES
La présente invention concerne des nouveaux matériaux biodégradables à base de copolyaminoacides, utiles notamment pour la vectorisation de principe(s) actif(s) (PA).
L'invention vise aussi de nouvelles compositions pharmaceutiques, cosmétiques, diététiques ou phytosanitaires à base de ces polyaminoacides modifiés. Ces compositions peuvent être du type de celles permettant la vectorisation de PA et se présentant, de préférence, sous forme d'émulsions, de micelles, de nanoparticules, de microparticules, de gels, d'implants ou de films.
Les PA considérés sont, avantageusement, des composés biologiquement actifs et qui peuvent être administrés à un organisme animal ou humain par voie orale, parentérale, nasale, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale, buccale, etc.
Les PA plus particulièrement, mais non limitativement, concernés par l'invention sont des protéines, des glycoprotéines, des peptides, des polysaccharides, des lipopolysaccharides, des oligo ou des polynucléotides, et des molécules organiques. Mais il peut aussi s'agir de produits cosmétiques ou de produits phytosanitaires, tels que des herbicides, des insecticides, des fongicides, etc.
Dans le domaine de la vectorisation des principes actifs notamment médicamenteux, il existe un besoin, dans beaucoup de cas :
= de les protéger contre la dégradation (hydrolyse, digestion enzymatique etc.), = et/ou de contrôler leur vitesse de libération afin de maintenir un niveau thérapeutique sur une durée définie, = et/ou de les véhiculer (en les protégeant) au site d'action.
A ces fins, plusieurs types de polymères ont été étudiés et certains sont même disponibles commercialement. On peut citer, par exemple, les polymères du type polylactique, polylactique-glycolique, polyoxyéthylène-oxypropylène, polyaminoacide ou encore polysaccharide. Ces polymères constituent des matières premières permettant de fabriquer, par exemple, des implants massiques, des microparticules, des nanoparticules, des vésicules, des micelles ou des gels. Outre le fait que ces polymères doivent être adaptés à
la fabrication de tels systèmes, ils doivent également être biocompatibles, non-toxiques, non-immunogènes, économiques et ils doivent pouvoir être facilement éliminés du corps
GROUPEMENTS CATIONIQUES ET DES GROUPEMENTS HYDROPHOBES
ET LEURS APPLICATIONS, NOTAMMENT THERAPEUTIQUES
La présente invention concerne des nouveaux matériaux biodégradables à base de copolyaminoacides, utiles notamment pour la vectorisation de principe(s) actif(s) (PA).
L'invention vise aussi de nouvelles compositions pharmaceutiques, cosmétiques, diététiques ou phytosanitaires à base de ces polyaminoacides modifiés. Ces compositions peuvent être du type de celles permettant la vectorisation de PA et se présentant, de préférence, sous forme d'émulsions, de micelles, de nanoparticules, de microparticules, de gels, d'implants ou de films.
Les PA considérés sont, avantageusement, des composés biologiquement actifs et qui peuvent être administrés à un organisme animal ou humain par voie orale, parentérale, nasale, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale, buccale, etc.
Les PA plus particulièrement, mais non limitativement, concernés par l'invention sont des protéines, des glycoprotéines, des peptides, des polysaccharides, des lipopolysaccharides, des oligo ou des polynucléotides, et des molécules organiques. Mais il peut aussi s'agir de produits cosmétiques ou de produits phytosanitaires, tels que des herbicides, des insecticides, des fongicides, etc.
Dans le domaine de la vectorisation des principes actifs notamment médicamenteux, il existe un besoin, dans beaucoup de cas :
= de les protéger contre la dégradation (hydrolyse, digestion enzymatique etc.), = et/ou de contrôler leur vitesse de libération afin de maintenir un niveau thérapeutique sur une durée définie, = et/ou de les véhiculer (en les protégeant) au site d'action.
A ces fins, plusieurs types de polymères ont été étudiés et certains sont même disponibles commercialement. On peut citer, par exemple, les polymères du type polylactique, polylactique-glycolique, polyoxyéthylène-oxypropylène, polyaminoacide ou encore polysaccharide. Ces polymères constituent des matières premières permettant de fabriquer, par exemple, des implants massiques, des microparticules, des nanoparticules, des vésicules, des micelles ou des gels. Outre le fait que ces polymères doivent être adaptés à
la fabrication de tels systèmes, ils doivent également être biocompatibles, non-toxiques, non-immunogènes, économiques et ils doivent pouvoir être facilement éliminés du corps
2 et/ou être biodégradables. Sur ce dernier aspect, il est de surcroît essentiel que la biodégradation dans l'organisme génère des produits non-toxiques.
A titre d'illustration de l'art antérieur concernant des polymères employés comme matières premières pour la réalisation de systèmes de vectorisation de PA, divers brevets ou demandes de brevet ou articles scientifiques sont cités ci-après.
Le brevet US-B-4,652,441 décrit des microcapsules de polylactide encapsulant l'hormone LH-RH. Ces microcapsules sont produites en préparant une émulsion eau-dans-huile-dans-eau et comprennent une couche interne aqueuse contenant l'hormone, une substance (gélatine) fixant cette dernière, une couche huileuse de polylactide, ainsi qu'une couche externe aqueuse (alcool polyvinylique). La libération du PA peut se faire sur une période de plus de deux semaines après injection sous-cutanée.
Le brevet US-B-6,153,193 décrit des compositions à base de micelles de poly(oxyéthylène)-poly(oxypropylène) amphiphiles, pour la vectorisation d'anticancéreux tels que la doxorubicine.
Akiyoshi et al. (J. Controlled Release, 1998, 54, 313-320) décrivent des pullulanes qui sont rendus hydrophobes par greffage de cholestérol et qui forment des nanoparticules dans l'eau. Ces nanoparticules, aptes à se complexer de manière réversible avec l'insuline, forment des suspensions colloïdales stables.
Le brevet US-B-4,351,337 décrit des copolyaminoacides amphiphiles, à base de leucine et de glutamate, utilisables sous forme d'implants ou de microparticules pour la libération contrôlée de principes actifs. La libération de ces derniers peut se faire sur une durée très longue dépendant de la vitesse de dégradation du polymère.
Le brevet US-B-4,888,398 décrit des polymères à base de polyglutamate ou polyaspartate, et éventuellement polyleucine, avec des groupements pendants de type alkyloxycarbonyl-méthyle, placés de façon aléatoire sur la chaîne polyaminoacide. Ces polyaminoacides, greffés par des groupements latéraux e.g. méthoxycarbonylméthyle, sont utilisables sous forme d'implants biodégradables contenant un PA à libération prolongée.
Le brevet US-B-5,904,936 décrit des nanoparticules obtenues à partir d'un polymère bloc polyleucine-polyglutamate, aptes à former des suspensions colloïdales stables et capables de s'associer spontanément avec des protéines biologiquement actives sans les dénaturer.
A titre d'illustration de l'art antérieur concernant des polymères employés comme matières premières pour la réalisation de systèmes de vectorisation de PA, divers brevets ou demandes de brevet ou articles scientifiques sont cités ci-après.
Le brevet US-B-4,652,441 décrit des microcapsules de polylactide encapsulant l'hormone LH-RH. Ces microcapsules sont produites en préparant une émulsion eau-dans-huile-dans-eau et comprennent une couche interne aqueuse contenant l'hormone, une substance (gélatine) fixant cette dernière, une couche huileuse de polylactide, ainsi qu'une couche externe aqueuse (alcool polyvinylique). La libération du PA peut se faire sur une période de plus de deux semaines après injection sous-cutanée.
Le brevet US-B-6,153,193 décrit des compositions à base de micelles de poly(oxyéthylène)-poly(oxypropylène) amphiphiles, pour la vectorisation d'anticancéreux tels que la doxorubicine.
Akiyoshi et al. (J. Controlled Release, 1998, 54, 313-320) décrivent des pullulanes qui sont rendus hydrophobes par greffage de cholestérol et qui forment des nanoparticules dans l'eau. Ces nanoparticules, aptes à se complexer de manière réversible avec l'insuline, forment des suspensions colloïdales stables.
Le brevet US-B-4,351,337 décrit des copolyaminoacides amphiphiles, à base de leucine et de glutamate, utilisables sous forme d'implants ou de microparticules pour la libération contrôlée de principes actifs. La libération de ces derniers peut se faire sur une durée très longue dépendant de la vitesse de dégradation du polymère.
Le brevet US-B-4,888,398 décrit des polymères à base de polyglutamate ou polyaspartate, et éventuellement polyleucine, avec des groupements pendants de type alkyloxycarbonyl-méthyle, placés de façon aléatoire sur la chaîne polyaminoacide. Ces polyaminoacides, greffés par des groupements latéraux e.g. méthoxycarbonylméthyle, sont utilisables sous forme d'implants biodégradables contenant un PA à libération prolongée.
Le brevet US-B-5,904,936 décrit des nanoparticules obtenues à partir d'un polymère bloc polyleucine-polyglutamate, aptes à former des suspensions colloïdales stables et capables de s'associer spontanément avec des protéines biologiquement actives sans les dénaturer.
3 PCT/EP2008/055507 Ces dernières peuvent ensuite être libérées in vivo de manière contrôlée, sur une longue période.
Le brevet US-B-5,449,513 décrit des copolymères bloc amphiphiles comprenant un bloc polyoxyéthylène et un bloc polyaminoacide, par exemple poly(bêta-benzyl-L-aspartate).
Ces polymères polyoxyéthylène-polybenzylaspartate forment des micelles qui sont aptes à
encapsuler des molécules actives hydrophobes telles que la doxorubicine ou l'indométhacine.
La demande de brevet WO-A-99/61512 décrit des polylysines et des polyornithines fonctionnalisées par un groupe hydrophobe (acide palmitique relié à la polylysine ou ornithine) et un groupe hydrophile (polyoxyéthylène). Ces polymères, par exemple la polylysine greffée avec des chaînes polyoxyéthylène et palmitoyle, forment, en présence de cholestérol, des vésicules capables d'encapsuler la doxorubicine ou l'ADN.
Ces polymères à base de polylysines sont cationiques en milieu physiologique.
La demande de brevet EP-A-963 758 décrit des polyaminoacides fonctionnalisés par un groupement cationique. Ces polymères sont capables de former des complexes avec un acide nucléique et sont utilisables en thérapie génique. Les groupements cationiques sont des dérivés amines qui ne sont pas dérivés des acides aminés et les polyaminoacides ne comportent pas de groupements hydrophobes.
Yang et al. (Biotechnology Letters, 2005, 27, 977-982) décrivent des polyaspartates fonctionnalisés par des groupements alkyles linéaires et des oligoarginines.
Ces polymères forment des nanoparticules de 8 à 40 nm dans l'eau et sont capables d'être internalisés par des cellules. Il est suggéré que ces particules peuvent être utilisées pour la vectorisation de molécules hydrophobes.
Dans le même domaine, la demanderesse a décrit, dans plusieurs demandes de brevets, des polymères à base de polyglutamate (anioniques) avec des concepts apparentés.
La demande WO-A-03/104303 décrit des polyaminoacides anioniques fonctionnalisés par de l'alpha-tocophérol.
La demande WO-A-2004/013206 décrit des polyaminoacides anioniques comportant des groupements hydrophobes et caractérisés en ce que ces groupements sont reliés au polymère par l'intermédiaire d'une rotule contenant deux fonctions amides, et plus précisément via un espaceur de type lysine ou ornithine.
Le brevet US-B-5,449,513 décrit des copolymères bloc amphiphiles comprenant un bloc polyoxyéthylène et un bloc polyaminoacide, par exemple poly(bêta-benzyl-L-aspartate).
Ces polymères polyoxyéthylène-polybenzylaspartate forment des micelles qui sont aptes à
encapsuler des molécules actives hydrophobes telles que la doxorubicine ou l'indométhacine.
La demande de brevet WO-A-99/61512 décrit des polylysines et des polyornithines fonctionnalisées par un groupe hydrophobe (acide palmitique relié à la polylysine ou ornithine) et un groupe hydrophile (polyoxyéthylène). Ces polymères, par exemple la polylysine greffée avec des chaînes polyoxyéthylène et palmitoyle, forment, en présence de cholestérol, des vésicules capables d'encapsuler la doxorubicine ou l'ADN.
Ces polymères à base de polylysines sont cationiques en milieu physiologique.
La demande de brevet EP-A-963 758 décrit des polyaminoacides fonctionnalisés par un groupement cationique. Ces polymères sont capables de former des complexes avec un acide nucléique et sont utilisables en thérapie génique. Les groupements cationiques sont des dérivés amines qui ne sont pas dérivés des acides aminés et les polyaminoacides ne comportent pas de groupements hydrophobes.
Yang et al. (Biotechnology Letters, 2005, 27, 977-982) décrivent des polyaspartates fonctionnalisés par des groupements alkyles linéaires et des oligoarginines.
Ces polymères forment des nanoparticules de 8 à 40 nm dans l'eau et sont capables d'être internalisés par des cellules. Il est suggéré que ces particules peuvent être utilisées pour la vectorisation de molécules hydrophobes.
Dans le même domaine, la demanderesse a décrit, dans plusieurs demandes de brevets, des polymères à base de polyglutamate (anioniques) avec des concepts apparentés.
La demande WO-A-03/104303 décrit des polyaminoacides anioniques fonctionnalisés par de l'alpha-tocophérol.
La demande WO-A-2004/013206 décrit des polyaminoacides anioniques comportant des groupements hydrophobes et caractérisés en ce que ces groupements sont reliés au polymère par l'intermédiaire d'une rotule contenant deux fonctions amides, et plus précisément via un espaceur de type lysine ou ornithine.
4 La demande WO-A-2004/060968 décrit des polyaminoacides fonctionnalisés par au moins un groupement oligoaminoacide à base de leucine et/ou isoleucine et/ou valine et/ou phénylalanine.
L'article de W. C. Shen, "Acid-sensitive dissociation between poly(lysine) and histamine-modified poly(glutamate) as a model for drug-releasing from carriers in endosomes"
Biochim Biophys Acta 1034 (1):122-124, 1990, décrit un polyglutamate fonctionnalisé par 40 % d'histamine. Cependant, aucun squelette polyglutamate hydrophobisé n'est décrit.
De plus, le polymère développé précipite entre pH 4 et 5 et est soluble à pH
physiologique. Seule l'application visant à former des complexes avec une polylysine sensible au pH est développée. Ces complexes sont basés sur des interactions électro-statiques. En effet, à pH physiologique, le complexe polyglutamatehistamine-polylysine est formé, alors qu'il se décompose à pH 4 - 5, valeur du pH dans l'endosome.
Ainsi, même si de très nombreuses solutions techniques sont développées et proposées dans l'art antérieur pour la vectorisation des principes actifs médicamenteux, la réponse à
l'ensemble des exigences est difficile à obtenir et demeure perfectible. Plus spécifiquement, l'invention concerne des polyaminoacides biodégradables, transformables en nano- ou micro-particules colloïdales de vectorisation aptes à s'associer réversiblement à des principes actifs.
Dans ce contexte, l'un des objectifs essentiels de la présente invention est de fournir de nouveaux copolyglutamates amphiphiles comportant à la fois des charges positives à pH
neutre ou proche de la neutralité et des groupements hydrophobes pendants.
Ces polymères représentent un perfectionnement par rapport à ceux décrits dans les brevets ou demandes de brevets cités plus haut en termes de vectorisation d'un principe actif tel qu'un peptide ou une protéine thérapeutique, un ADN, un ARN ou une petite molécule.
Un autre objectif essentiel de la présente invention est que ces polymères soient aptes à
être utilisés pour la vectorisation de principe actif PA et permettent de satisfaire de manière optimale à toutes les spécifications du cahier des charges, à savoir notamment :
o capacité :
^ à former aisément et économiquement des suspensions colloïdales aqueuses stables, ^ à s'associer facilement avec de nombreux principes actifs, = et à libérer ces principes actifs in vivo, o biocompatibilité, o biodégradabilité, o stabilité à l'hydrolyse.
Cet objectif, parmi d'autres, est atteint par la présente invention, qui concerne des
L'article de W. C. Shen, "Acid-sensitive dissociation between poly(lysine) and histamine-modified poly(glutamate) as a model for drug-releasing from carriers in endosomes"
Biochim Biophys Acta 1034 (1):122-124, 1990, décrit un polyglutamate fonctionnalisé par 40 % d'histamine. Cependant, aucun squelette polyglutamate hydrophobisé n'est décrit.
De plus, le polymère développé précipite entre pH 4 et 5 et est soluble à pH
physiologique. Seule l'application visant à former des complexes avec une polylysine sensible au pH est développée. Ces complexes sont basés sur des interactions électro-statiques. En effet, à pH physiologique, le complexe polyglutamatehistamine-polylysine est formé, alors qu'il se décompose à pH 4 - 5, valeur du pH dans l'endosome.
Ainsi, même si de très nombreuses solutions techniques sont développées et proposées dans l'art antérieur pour la vectorisation des principes actifs médicamenteux, la réponse à
l'ensemble des exigences est difficile à obtenir et demeure perfectible. Plus spécifiquement, l'invention concerne des polyaminoacides biodégradables, transformables en nano- ou micro-particules colloïdales de vectorisation aptes à s'associer réversiblement à des principes actifs.
Dans ce contexte, l'un des objectifs essentiels de la présente invention est de fournir de nouveaux copolyglutamates amphiphiles comportant à la fois des charges positives à pH
neutre ou proche de la neutralité et des groupements hydrophobes pendants.
Ces polymères représentent un perfectionnement par rapport à ceux décrits dans les brevets ou demandes de brevets cités plus haut en termes de vectorisation d'un principe actif tel qu'un peptide ou une protéine thérapeutique, un ADN, un ARN ou une petite molécule.
Un autre objectif essentiel de la présente invention est que ces polymères soient aptes à
être utilisés pour la vectorisation de principe actif PA et permettent de satisfaire de manière optimale à toutes les spécifications du cahier des charges, à savoir notamment :
o capacité :
^ à former aisément et économiquement des suspensions colloïdales aqueuses stables, ^ à s'associer facilement avec de nombreux principes actifs, = et à libérer ces principes actifs in vivo, o biocompatibilité, o biodégradabilité, o stabilité à l'hydrolyse.
Cet objectif, parmi d'autres, est atteint par la présente invention, qui concerne des
5 polyaminoacides, ou leurs sels pharmaceutiquement acceptables, comprenant des résidus glutamiques, caractérisés en ce que certains des résidus glutamiques sont porteurs d'un groupement cationique pendant, qui, s'il est déprotonable, présente un pKa supérieur ou égal à 7, lesdits groupements cationiques étant identiques ou différents entre eux, et en ce que d'autres résidus glutamiques sont porteurs d'un groupement hydrophobe (GH) pendant, lesdits groupements hydrophobes (GH) étant identiques ou différents entre eux.
Dans la description qui suit, sauf précision contraire, le terme "groupement cationique"
désignera d'une manière générale les groupements cationiques qui ne sont pas déprotonables, et les groupements cationiques qui sont déprotonables et qui présentent un pKa supérieur ou égal à 7.
On entend par "sels pharmaceutiquement acceptables" d'un polyaminoacide selon l'invention l'ensemble des polyaminoacides avec les contre-ions associés aux fonctions ionisées du polymère.
Dans la description qui suit, le terme "petite molécule" désigne une molécule de poids moléculaire inférieur à 1 kDa.
Sauf mention contraire, les radicaux alkyles ont de 1 à 10 atomes de carbone.
Chaque polyglutamate selon l'invention est donc fonctionnalisé par une multiplicité de groupements cationiques et de groupements hydrophobes (GH), pendants et respectivement identiques ou différents entre eux.
Au sens de l'invention, le terme "multiplicité" signifie que le polyglutamate est fonctionnalisé par :
* au moins 1 % de groupements cationiques (% molaire par rapport aux résidus acide glutamique) et jusqu'à 99 %, * en moyenne, au moins deux groupements hydrophobes (GH) pendants par molécule. Il est possible conformément à l'invention que le polyacide glutamique présente, en plus des groupements hydrophobes (GH) pendants, des groupements hydrophobes (GH) fixés sur au moins l'une des extrémités des chaînes de copolymère.
Au sens de l'invention, l'expression être porteur signifie que le groupement porté est pendant, c'est-à-dire que ledit groupement est un groupement latéral par rapport aux
Dans la description qui suit, sauf précision contraire, le terme "groupement cationique"
désignera d'une manière générale les groupements cationiques qui ne sont pas déprotonables, et les groupements cationiques qui sont déprotonables et qui présentent un pKa supérieur ou égal à 7.
On entend par "sels pharmaceutiquement acceptables" d'un polyaminoacide selon l'invention l'ensemble des polyaminoacides avec les contre-ions associés aux fonctions ionisées du polymère.
Dans la description qui suit, le terme "petite molécule" désigne une molécule de poids moléculaire inférieur à 1 kDa.
Sauf mention contraire, les radicaux alkyles ont de 1 à 10 atomes de carbone.
Chaque polyglutamate selon l'invention est donc fonctionnalisé par une multiplicité de groupements cationiques et de groupements hydrophobes (GH), pendants et respectivement identiques ou différents entre eux.
Au sens de l'invention, le terme "multiplicité" signifie que le polyglutamate est fonctionnalisé par :
* au moins 1 % de groupements cationiques (% molaire par rapport aux résidus acide glutamique) et jusqu'à 99 %, * en moyenne, au moins deux groupements hydrophobes (GH) pendants par molécule. Il est possible conformément à l'invention que le polyacide glutamique présente, en plus des groupements hydrophobes (GH) pendants, des groupements hydrophobes (GH) fixés sur au moins l'une des extrémités des chaînes de copolymère.
Au sens de l'invention, l'expression être porteur signifie que le groupement porté est pendant, c'est-à-dire que ledit groupement est un groupement latéral par rapport aux
6 résidus glutamiques et est un substituant de la fonction carbonyle en y du résidu glutamique qui le porte.
Le polyglutamate est également porteur de groupements cationiques. Ces groupes sont, de préférence, greffés aux résidus glutamiques par l'intermédiaire d'une liaison amide ou ester.
Selon une variante de l'invention, encore d'autres résidus glutamiques peuvent être porteurs d'un groupement non ionisable pendant, différent des groupements hydrophobes (GH), lesdits groupements non ionisables étant identiques ou différents entre eux.
Un tel groupement non ionisable pendant peut être par exemple le radical hydroxyéthylamino- .
Selon une autre variante de l'invention, encore d'autres résidus glutamiques peuvent être porteurs, également sur leur carbonyle en y, d'un groupement non ionisé à pH
neutre, différent des groupements hydrophobes (GH), lesdits groupements non ionisés à
pH
neutre étant identiques ou différents entre eux. Un tel groupement non ionisé
à pH neutre peut par exemple répondre à la formule suivante :
N
NH
-N-C
Rlo où -R10 est -H, -CO2H, ester d'alkyle (de préférence -COOMe ou -COOEt), -CHzOH, -C(=O)-NH2, -C(=O)-NH-CH3 ou -C(=O)-N(CH3)2.
Le polyglutamate, porteur à la fois des groupements cationiques et des groupements hydrophobes, et également éventuellement de groupements non ioniques (non ionisables ou non ionisés à pH neutre) peut également comporter des charges négatives (toujours à
pH neutre) résultant de l'ionisation des groupes pendants de l'acide polyglutamique qui n'ont pas été fonctionnalisés.
Il est du mérite de la demanderesse d'avoir mis au point une nouvelle famille de polymères à base de polyglutamate, porteurs de groupements cationiques, et fonctionnalisés par une multiplicité de groupements hydrophobes, lesquels polymères sont aptes à
former des systèmes colloïdaux stables. La capacité de moduler la charge du polymère en fonction du taux de fonctionnalisation peut s'avérer très efficace pour :
- abaisser la viscosité du polymère pour une injection plus facile ou une mise en oeuvre plus aisée lors de l'étape de formulation.
Le polyglutamate est également porteur de groupements cationiques. Ces groupes sont, de préférence, greffés aux résidus glutamiques par l'intermédiaire d'une liaison amide ou ester.
Selon une variante de l'invention, encore d'autres résidus glutamiques peuvent être porteurs d'un groupement non ionisable pendant, différent des groupements hydrophobes (GH), lesdits groupements non ionisables étant identiques ou différents entre eux.
Un tel groupement non ionisable pendant peut être par exemple le radical hydroxyéthylamino- .
Selon une autre variante de l'invention, encore d'autres résidus glutamiques peuvent être porteurs, également sur leur carbonyle en y, d'un groupement non ionisé à pH
neutre, différent des groupements hydrophobes (GH), lesdits groupements non ionisés à
pH
neutre étant identiques ou différents entre eux. Un tel groupement non ionisé
à pH neutre peut par exemple répondre à la formule suivante :
N
NH
-N-C
Rlo où -R10 est -H, -CO2H, ester d'alkyle (de préférence -COOMe ou -COOEt), -CHzOH, -C(=O)-NH2, -C(=O)-NH-CH3 ou -C(=O)-N(CH3)2.
Le polyglutamate, porteur à la fois des groupements cationiques et des groupements hydrophobes, et également éventuellement de groupements non ioniques (non ionisables ou non ionisés à pH neutre) peut également comporter des charges négatives (toujours à
pH neutre) résultant de l'ionisation des groupes pendants de l'acide polyglutamique qui n'ont pas été fonctionnalisés.
Il est du mérite de la demanderesse d'avoir mis au point une nouvelle famille de polymères à base de polyglutamate, porteurs de groupements cationiques, et fonctionnalisés par une multiplicité de groupements hydrophobes, lesquels polymères sont aptes à
former des systèmes colloïdaux stables. La capacité de moduler la charge du polymère en fonction du taux de fonctionnalisation peut s'avérer très efficace pour :
- abaisser la viscosité du polymère pour une injection plus facile ou une mise en oeuvre plus aisée lors de l'étape de formulation.
7 - assurer une bonne association avec des principes actifs neutres, anioniques ou cationiques.
Ainsi, les polymères de l'invention peuvent être :
= anioniques, cationiques, neutres et aptes à associer des principes actifs chargés ou des PA non chargés ;
= cationiques à pH modérément acide (pH = 4 - 5) et neutres ou faiblement chargés à
pH neutre. Dans ce cas, cette dépendance au pH leur permet, après association avec le principe actif en solution à pH = 4 - 5, de former un dépôt en milieu physiologique.
De plus, ils sont facilement dégradés, en présence d'enzymes, en catabolites/métabolites non toxiques (acides aminés).
Au sens de l'invention et dans tout le présent exposé, les termes "association" ou "associer" employés pour qualifier les relations entre un ou plusieurs principes actifs et les polyglutamates modifiés, signifient, en particulier, que le ou les principes actifs sont liés au(x) polyglutamate(s) notamment par une interaction hydrophobe, et/ou sont encapsulés par le ou les polyglutamates.
Avantageusement, les polyaminoacides selon l'invention sont des homopolymères fonctionnalisés de L-glutamate ou d'acide L-glutamique ; de préférence ces résidus sont liés dans le polyaminoacide par leur carboxyle en position alpha.
Les groupements cationiques utilisables pour fonctionnaliser les résidus glutamates sont identiques ou différents entre eux et correspondent à la formule générale suivante :
L
x~ ~ Mr3+z dans laquelle :
X = O, NH, Y = indépendamment un H ou un CH3, Z- =un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, L = un alkylène linéaire (C2 à C6) et éventuellement substitué par un groupe fonctionnel de type carboxyle ou dérivé.
Ainsi, les polymères de l'invention peuvent être :
= anioniques, cationiques, neutres et aptes à associer des principes actifs chargés ou des PA non chargés ;
= cationiques à pH modérément acide (pH = 4 - 5) et neutres ou faiblement chargés à
pH neutre. Dans ce cas, cette dépendance au pH leur permet, après association avec le principe actif en solution à pH = 4 - 5, de former un dépôt en milieu physiologique.
De plus, ils sont facilement dégradés, en présence d'enzymes, en catabolites/métabolites non toxiques (acides aminés).
Au sens de l'invention et dans tout le présent exposé, les termes "association" ou "associer" employés pour qualifier les relations entre un ou plusieurs principes actifs et les polyglutamates modifiés, signifient, en particulier, que le ou les principes actifs sont liés au(x) polyglutamate(s) notamment par une interaction hydrophobe, et/ou sont encapsulés par le ou les polyglutamates.
Avantageusement, les polyaminoacides selon l'invention sont des homopolymères fonctionnalisés de L-glutamate ou d'acide L-glutamique ; de préférence ces résidus sont liés dans le polyaminoacide par leur carboxyle en position alpha.
Les groupements cationiques utilisables pour fonctionnaliser les résidus glutamates sont identiques ou différents entre eux et correspondent à la formule générale suivante :
L
x~ ~ Mr3+z dans laquelle :
X = O, NH, Y = indépendamment un H ou un CH3, Z- =un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, L = un alkylène linéaire (C2 à C6) et éventuellement substitué par un groupe fonctionnel de type carboxyle ou dérivé.
8 Suivant une caractéristique préférée, les groupements cationiques sont obtenus à partir de précurseurs choisis parmi le groupe comprenant : la lysine, l'ornithine, l'arginine et leurs dérivés, la choline, l'éthanolamine (liée par l'oxygène), la putrescine et l'agmatine.
Les dérivés de la lysine, de l'ornithine, et de l'arginine peuvent être par exemple des esters éthyliques et méthyliques, des amides, et des amides méthylés.
Ainsi, des groupements cationiques utilisables dans la présente invention peuvent être choisis dans le groupe de radicaux suivants :
H H
-N-C-CORa ~ CH2)4 NH3+ Z
H H
-N-C-CORa (CH2)3 NH
~ +
HN NH3 ,Z
H H
-N-C-CORa ( CH2)3 ( NH3+,Z
où Ra représente un groupement hydroxy, alcoxy ou alkylamino, de préférence un groupement -OMe, -OEt, -NH2, -NHCH3 ou -N(CH3)2, et Z- représente un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure, ou -NH-(CH2)4-NH3+, Z , -NH-(CH2)4-NH-C(=NH)-NH3+, Z-, -O-(CH2)2-N+(CH3)3, Z , -O-(CH2)2-NH3+, Z-où Z- représente un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure.
Par exemple, les groupements cationiques pendants peuvent présenter les formules suivantes (où le nom du précurseur est indiqué sous chaque radical) :
Les dérivés de la lysine, de l'ornithine, et de l'arginine peuvent être par exemple des esters éthyliques et méthyliques, des amides, et des amides méthylés.
Ainsi, des groupements cationiques utilisables dans la présente invention peuvent être choisis dans le groupe de radicaux suivants :
H H
-N-C-CORa ~ CH2)4 NH3+ Z
H H
-N-C-CORa (CH2)3 NH
~ +
HN NH3 ,Z
H H
-N-C-CORa ( CH2)3 ( NH3+,Z
où Ra représente un groupement hydroxy, alcoxy ou alkylamino, de préférence un groupement -OMe, -OEt, -NH2, -NHCH3 ou -N(CH3)2, et Z- représente un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure, ou -NH-(CH2)4-NH3+, Z , -NH-(CH2)4-NH-C(=NH)-NH3+, Z-, -O-(CH2)2-N+(CH3)3, Z , -O-(CH2)2-NH3+, Z-où Z- représente un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure.
Par exemple, les groupements cationiques pendants peuvent présenter les formules suivantes (où le nom du précurseur est indiqué sous chaque radical) :
9 I ~ H~ HI HI HI HI
O O
CORa CORa CORa NH3`,CP NWie3',q' Efhanolamine Choline NH3',q' Ni NH3,q' NH
~ ~ Omithine -Putrcsclne ~ C~~~ estaYOU amlde HN~
NHs ,CI Lysine NH3' q esiex ou amide Agmadne Arghlne ester ou amlde dans lesquelles Ra représente un groupement hydroxy, alcoxy ou alkylamino, de préférence un groupement -OMe, -OEt, -NH2, -NH-CH3 ou -N(CH3)2.
Suivant une caractéristique préférée, les polyaminoacides de l'invention comportent en moyenne au moins 3 groupements hydrophobes (GH) par chaîne de polymère.
Avantageusement, au moins l'un des groupements hydrophobes GH est inclus dans un greffon hydrophobe comprenant au moins une rotule (ou motif) d'espacement ("spacer") permettant de relier le groupement hydrophobe GH à une chaîne de polyglutamate (par exemple une chaîne principale - squelette-polyglutamate). Cette rotule peut comprendre, e.g. au moins une liaison covalente directe et/ou au moins une liaison amide et/ou au moins une liaison ester. Par exemple, la rotule peut être du type de celles appartenant au groupe comportant notamment : les résidus acide aminé différents de l'unité
monomérique constitutive du polyglutamate, les dérivés des aminoalcools, les dérivés des polyamines (par exemple les diamines), les dérivés des polyols (par exemple les diols) et les dérivés des hydroxyacides.
Le greffage des GH sur la chaîne polyglutamate peut passer par la mise en oeuvre de précurseurs de GH, aptes à se lier à la chaîne polyglutamate.
Les précurseurs des GH sont, en pratique et sans que cela ne soit limitatif, choisis dans le groupe comprenant les alcools et les amines, ces composés pouvant être fonctionnalisés facilement par l'homme de l'art. Le greffage des GH est explicité plus en détails ci-après dans la description du procédé d'obtention des polyaminoacides modifiés selon l'invention.
Suivant une caractéristique préférée, le groupement hydrophobe GH du greffon hydrophobe comporte de 8 à 30 atomes de carbone.
Ces groupements hydrophobes GH sont avantageusement et judicieusement sélectionnés dans le groupe comprenant :
= les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au 5 moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome, = les alkylaryles ou arylalkyles en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome, = et les (poly)cycliques en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome.
Les rotules formant avec les GH des greffons hydrophobes, peuvent être di-, tri- ou tétravalentes (voire pentavalentes et plus). Dans le cas d'une rotule divalente, le greffon hydrophobe comporte un seul groupement GH, tandis qu'une rotule trivalente confère au greffon hydrophobe un caractère bifide, c'est-à-dire que le greffon présente deux "pattes"
GH. A titre d'exemple de rotule trivalente, on peut citer, entre autres, des résidus "acide aminé", par exemple "acide glutamique" ou des restes polyols, par exemple glycérol.
Ainsi, deux exemples avantageux mais non limitatifs de greffons hydrophobes comprenant des GH bifides sont les dialkyl-glycérols et les dialkyl-glutamates.
Les groupements hydrophobes GH peuvent être, par exemple, dérivés de groupements choisis dans le groupe suivant : octanol, dodécanol, tétradécanol, hexadécanol, octadécanol, oléylalcool, tocophérol ou cholestérol.
Selon une autre variante, les polyglutamates selon l'invention peuvent être également porteurs d'au moins un greffon de type polyalkylène (de préférence éthylène)glycol lié à
un résidu glutamate.
De préférence, le squelette du polyglutamate selon la présente invention comprend des résidus d'alpha-L-glutamate et/ou d'alpha-L-glutamique acide.
De manière plus préférée encore, les polyglutamates selon l'invention répondent à la formule (I) suivante :
O Ri O ZOH
O
N N D
H H
L O r O
q s p I
GH
(I) dans laquelle :
^ A représente indépendamment :
- RNH- dans lequel R représente un H, un alkyle linéaire en C2 à C10, un alkyle ramifié en C3 à C10 ou un benzyle, - un résidu acide aminé terminal de formule :
H
dans laquelle -R7 est -OH, -OR9 ou -NHR10, et R8, R9 et R10 représentent indépendamment un H, un alkyle linéaire en C2 à C10, un alkyle ramifié en C3 à Ct0 ou un benzyle ;
^ B est une liaison directe, un groupement de liaison divalent, trivalent ou tétravalent, de préférence choisi parmi les radicaux suivants :
-0-, -NH-, N(C t_5 alkyle)-, un résidu d'acide aminé (de préférence naturel), de diol, de triol, de diamine, de triamine, d'aminoalcool ou d'hydroxyacide comportant de 1 à 6 atomes de carbone ;
^ D représente un H, un acyle linéaire en C2 à C10, acyle ramifié en C3 à C10, ou un pyroglutamate ;
^ les groupements hydrophobes GH représentent chacun indépendamment les uns des autres un radical choisi parmi :
= les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence 0 et/ou N et/ou S), ou = les alkylaryles ou arylalkyles en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), ou = les (poly)cycliques en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S) ;
^ de préférence, ce radical est choisi dans le groupe suivant :
octyloxy-, dodécyloxy-, tétradécyloxy-, hexadécyloxy-, octadécyloxy-, 9-octadecenyloxy-, tocophéryloxy- ou cholestéryloxy-, B étant alors une liaison directe;
^ R' représente un radical choisi dans le groupe ayant les formules suivantes :
--NH-(CH2)w NH3+, Z- avec w compris entre 2 et 6, et de préférence w est égal à 4, - -NH-(CH2)4-NH-C(=NH)-NH3+, Z-, - -O-(CH2)2-NH3+, Z-, - -O-(CH2)2-N+(CH3)3, Z , - un résidu d'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé de formule :
H
dans laquelle :
X est un atome d'oxygène ou un -NH-, Rl2 est H, alkyle linéaire en C2 à Cto, alkyle ramifié en C3 à C10 ou benzyle, -R13 est -(CH2)4-NH3+, Z-, -(CH2)3-NH-C(=NH)-NH3+, Z , -(CH2)3-NH3+, Z ;
dans lesquelles le contre-anion Z- est un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure ;
^ R3 représente un hydroxyéthylamino-, un alkylène glycol, un polyalkylène glycol ou un radical de formule :
NNH
H H
-N-C
R'o où -R10 représente -H, -CO2H, un ester d'alkyle (de préférence -COOMe ou -COOEt), -CHzOH, -C(=O)-NH2, -C(=O)-NH-CH3 ou -C(=O)-N(CH3)2 ;
^ p, q, r et s sont des entiers positifs ^(p)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements hydrophobes GH et varie de 2 à 99 % molaire, et de préférence entre 5 et 50 % sous condition que chaque chaîne de copolymère possède en moyenne au moins 3 greffons hydrophobes ;
^(q)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements cationiques et varie de 1 à 99 % molaire ;
^(p+q+r+s) varie de 10 à 1000, de préférence entre 30 et 500 ;
^(r)/(p+q+r+s) varie de 0 à 98 % molaire ;
^(s)/(p+q+r+s) varie de 0 à 98 % molaire ;
ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables De préférence, les groupements hydrophobes GH et les groupements cationiques sont disposés de façon aléatoire en groupements pendants.
D'une manière générale, la formule générale (I) décrite ci-dessus ne doit pas être interprétée comme représentant uniquement des copolymères séquencés (ou blocs), mais également des copolymères aléatoires ou des copolymères multiblocs.
Il est par ailleurs préférable que le taux de greffage molaire en groupements hydrophobes des polyglutamates selon l'invention soit compris entre 2 et 99 %, et de préférence entre 5 et 50 %, sous condition que chaque chaîne de polymère possède en moyenne au moins 3 greffons hydrophobes.
Le rapport (q)/(p+q+r+s) des polyglutamates selon l'invention signifie qu'ils peuvent contenir de 1 à environ 97 % molaire de groupements contenant une charge cationique.
Le rapport (s)/(p+q+r+s) des polyglutamates selon l'invention signifie qu'ils peuvent être anioniques, neutres ou cationiques à pH neutre.
Selon une autre caractéristique de l'invention, les polymères selon l'invention ont une masse molaire qui se situe entre 2 000 et 200 000 g/mol, et de préférence entre 5 000 et 100 000 g/mol.
Naturellement, l'invention couvre également des mélanges de polyaminoacides modifiés tels que définis ci-dessus.
De manière remarquable, les polyglutamates de l'invention sont susceptibles d'être utilisés de plusieurs façons selon la nature des groupements hydrophobes et des groupements cationiques, la charge et le degré de polymérisation du polyglutamate. Les méthodes de mise en forme d'un polymère pour l'encapsulation d'un principe actif sous les diverses formes visées par l'invention sont connues de l'homme de l'art. Pour plus de détails, on peut se référer, par exemple à ces quelques références particulièrement pertinentes :
"Microspheres, Microcapsules and Liposomes ; vol 1. Preparation and chemical applications" Ed. R. Arshady, Citus Books 1999. ISBN : 0-9532187-1-6.
"Sustained-Release Injectable Products" Ed. J. Senior et M. Radomsky, Interpharm Press 2000. ISBN : 1-57491-101-5.
"Colloidal Drug Delivery Systems" Ed. J. Kreuter, Marcel Dekker, Inc. 1994.
ISBN :
0-8247-9214-9.
"Handbook of Pharmaceutical Controlled Release Technology" Ed. D.L. Wise, Marcel Dekker, Inc. 2000. ISBN : 0-8247-0369-3.
Ces polyglutamates (sous forme de particules ou non) peuvent encapsuler ou associer aisément des principes actifs tels que des protéines, peptides, ADN, ARN ou petites molécules. La mise en forme préférée est celle décrite dans le brevet US
6,630,171 et qui consiste à disperser le copolymère dans l'eau et à incuber la solution en présence d'un principe actif (PA). Cette solution colloïdale de particules de vectorisation, constituées des polyglutamates selon l'invention, peut ensuite être filtrée sous 0,2 m puis directement injectée à un patient.
Dans le cas où le polymère est cationique et soluble à pH acide du fait d'un excès de charge cationique et que cette charge se trouve partiellement ou totalement neutralisée à
pH neutre, un tel polymère est dit dépendant du pH. Ce type de polymère peut donc être utilisé pour former un dépôt après administration, par exemple dans le tissu sous-cutané.
Il convient de comprendre que les fonctions résiduelles carboxyliques du polyglutamate modifié sont soit neutres (forme COOH), soit ionisées (anion COO ), selon le pH et la composition. On parlera donc indifféremment i) de résidu glutamate ou de résidu acide glutamique, ii) d'acide polyglutamique ou de polyglutamate. En solution aqueuse, le contre-cation peut être un cation métallique tel que le sodium, le calcium ou le magnésium, ou un cation organique tel que la triéthanolamine, le tris(hydroxyméthyl)-aminométhane ou une polyamine tel que la polyéthylèneimine. S'il est divalent, un contre-cation peut salifier deux groupements cationiques monovalents proches.
Le contre-anion des groupements cationiques est de préférence choisi parmi le groupe comprenant un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate. S'il est divalent, un contre-anion peut salifier deux groupements cationiques monovalents proches.
Par suite, dans la présente description, on entend par "sels pharmaceutiquement acceptables" du polymère selon l'invention l'ensemble des polymères avec les contre-ions associés aux fonctions ionisées du polymère. Il est aussi envisageable, pour certaines structures où il y a 5 co-existence des charges positives et négatives qu'il y ait une neutralisation totale ou partielle des charges. Un polymère ayant un nombre équivalent de charges positives et de charges négatives (point isoélectrique) peut exister sans présence ni de contre-anion ni de contre-cation.
O O
CORa CORa CORa NH3`,CP NWie3',q' Efhanolamine Choline NH3',q' Ni NH3,q' NH
~ ~ Omithine -Putrcsclne ~ C~~~ estaYOU amlde HN~
NHs ,CI Lysine NH3' q esiex ou amide Agmadne Arghlne ester ou amlde dans lesquelles Ra représente un groupement hydroxy, alcoxy ou alkylamino, de préférence un groupement -OMe, -OEt, -NH2, -NH-CH3 ou -N(CH3)2.
Suivant une caractéristique préférée, les polyaminoacides de l'invention comportent en moyenne au moins 3 groupements hydrophobes (GH) par chaîne de polymère.
Avantageusement, au moins l'un des groupements hydrophobes GH est inclus dans un greffon hydrophobe comprenant au moins une rotule (ou motif) d'espacement ("spacer") permettant de relier le groupement hydrophobe GH à une chaîne de polyglutamate (par exemple une chaîne principale - squelette-polyglutamate). Cette rotule peut comprendre, e.g. au moins une liaison covalente directe et/ou au moins une liaison amide et/ou au moins une liaison ester. Par exemple, la rotule peut être du type de celles appartenant au groupe comportant notamment : les résidus acide aminé différents de l'unité
monomérique constitutive du polyglutamate, les dérivés des aminoalcools, les dérivés des polyamines (par exemple les diamines), les dérivés des polyols (par exemple les diols) et les dérivés des hydroxyacides.
Le greffage des GH sur la chaîne polyglutamate peut passer par la mise en oeuvre de précurseurs de GH, aptes à se lier à la chaîne polyglutamate.
Les précurseurs des GH sont, en pratique et sans que cela ne soit limitatif, choisis dans le groupe comprenant les alcools et les amines, ces composés pouvant être fonctionnalisés facilement par l'homme de l'art. Le greffage des GH est explicité plus en détails ci-après dans la description du procédé d'obtention des polyaminoacides modifiés selon l'invention.
Suivant une caractéristique préférée, le groupement hydrophobe GH du greffon hydrophobe comporte de 8 à 30 atomes de carbone.
Ces groupements hydrophobes GH sont avantageusement et judicieusement sélectionnés dans le groupe comprenant :
= les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au 5 moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome, = les alkylaryles ou arylalkyles en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome, = et les (poly)cycliques en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome.
Les rotules formant avec les GH des greffons hydrophobes, peuvent être di-, tri- ou tétravalentes (voire pentavalentes et plus). Dans le cas d'une rotule divalente, le greffon hydrophobe comporte un seul groupement GH, tandis qu'une rotule trivalente confère au greffon hydrophobe un caractère bifide, c'est-à-dire que le greffon présente deux "pattes"
GH. A titre d'exemple de rotule trivalente, on peut citer, entre autres, des résidus "acide aminé", par exemple "acide glutamique" ou des restes polyols, par exemple glycérol.
Ainsi, deux exemples avantageux mais non limitatifs de greffons hydrophobes comprenant des GH bifides sont les dialkyl-glycérols et les dialkyl-glutamates.
Les groupements hydrophobes GH peuvent être, par exemple, dérivés de groupements choisis dans le groupe suivant : octanol, dodécanol, tétradécanol, hexadécanol, octadécanol, oléylalcool, tocophérol ou cholestérol.
Selon une autre variante, les polyglutamates selon l'invention peuvent être également porteurs d'au moins un greffon de type polyalkylène (de préférence éthylène)glycol lié à
un résidu glutamate.
De préférence, le squelette du polyglutamate selon la présente invention comprend des résidus d'alpha-L-glutamate et/ou d'alpha-L-glutamique acide.
De manière plus préférée encore, les polyglutamates selon l'invention répondent à la formule (I) suivante :
O Ri O ZOH
O
N N D
H H
L O r O
q s p I
GH
(I) dans laquelle :
^ A représente indépendamment :
- RNH- dans lequel R représente un H, un alkyle linéaire en C2 à C10, un alkyle ramifié en C3 à C10 ou un benzyle, - un résidu acide aminé terminal de formule :
H
dans laquelle -R7 est -OH, -OR9 ou -NHR10, et R8, R9 et R10 représentent indépendamment un H, un alkyle linéaire en C2 à C10, un alkyle ramifié en C3 à Ct0 ou un benzyle ;
^ B est une liaison directe, un groupement de liaison divalent, trivalent ou tétravalent, de préférence choisi parmi les radicaux suivants :
-0-, -NH-, N(C t_5 alkyle)-, un résidu d'acide aminé (de préférence naturel), de diol, de triol, de diamine, de triamine, d'aminoalcool ou d'hydroxyacide comportant de 1 à 6 atomes de carbone ;
^ D représente un H, un acyle linéaire en C2 à C10, acyle ramifié en C3 à C10, ou un pyroglutamate ;
^ les groupements hydrophobes GH représentent chacun indépendamment les uns des autres un radical choisi parmi :
= les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence 0 et/ou N et/ou S), ou = les alkylaryles ou arylalkyles en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), ou = les (poly)cycliques en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S) ;
^ de préférence, ce radical est choisi dans le groupe suivant :
octyloxy-, dodécyloxy-, tétradécyloxy-, hexadécyloxy-, octadécyloxy-, 9-octadecenyloxy-, tocophéryloxy- ou cholestéryloxy-, B étant alors une liaison directe;
^ R' représente un radical choisi dans le groupe ayant les formules suivantes :
--NH-(CH2)w NH3+, Z- avec w compris entre 2 et 6, et de préférence w est égal à 4, - -NH-(CH2)4-NH-C(=NH)-NH3+, Z-, - -O-(CH2)2-NH3+, Z-, - -O-(CH2)2-N+(CH3)3, Z , - un résidu d'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé de formule :
H
dans laquelle :
X est un atome d'oxygène ou un -NH-, Rl2 est H, alkyle linéaire en C2 à Cto, alkyle ramifié en C3 à C10 ou benzyle, -R13 est -(CH2)4-NH3+, Z-, -(CH2)3-NH-C(=NH)-NH3+, Z , -(CH2)3-NH3+, Z ;
dans lesquelles le contre-anion Z- est un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure ;
^ R3 représente un hydroxyéthylamino-, un alkylène glycol, un polyalkylène glycol ou un radical de formule :
NNH
H H
-N-C
R'o où -R10 représente -H, -CO2H, un ester d'alkyle (de préférence -COOMe ou -COOEt), -CHzOH, -C(=O)-NH2, -C(=O)-NH-CH3 ou -C(=O)-N(CH3)2 ;
^ p, q, r et s sont des entiers positifs ^(p)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements hydrophobes GH et varie de 2 à 99 % molaire, et de préférence entre 5 et 50 % sous condition que chaque chaîne de copolymère possède en moyenne au moins 3 greffons hydrophobes ;
^(q)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements cationiques et varie de 1 à 99 % molaire ;
^(p+q+r+s) varie de 10 à 1000, de préférence entre 30 et 500 ;
^(r)/(p+q+r+s) varie de 0 à 98 % molaire ;
^(s)/(p+q+r+s) varie de 0 à 98 % molaire ;
ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables De préférence, les groupements hydrophobes GH et les groupements cationiques sont disposés de façon aléatoire en groupements pendants.
D'une manière générale, la formule générale (I) décrite ci-dessus ne doit pas être interprétée comme représentant uniquement des copolymères séquencés (ou blocs), mais également des copolymères aléatoires ou des copolymères multiblocs.
Il est par ailleurs préférable que le taux de greffage molaire en groupements hydrophobes des polyglutamates selon l'invention soit compris entre 2 et 99 %, et de préférence entre 5 et 50 %, sous condition que chaque chaîne de polymère possède en moyenne au moins 3 greffons hydrophobes.
Le rapport (q)/(p+q+r+s) des polyglutamates selon l'invention signifie qu'ils peuvent contenir de 1 à environ 97 % molaire de groupements contenant une charge cationique.
Le rapport (s)/(p+q+r+s) des polyglutamates selon l'invention signifie qu'ils peuvent être anioniques, neutres ou cationiques à pH neutre.
Selon une autre caractéristique de l'invention, les polymères selon l'invention ont une masse molaire qui se situe entre 2 000 et 200 000 g/mol, et de préférence entre 5 000 et 100 000 g/mol.
Naturellement, l'invention couvre également des mélanges de polyaminoacides modifiés tels que définis ci-dessus.
De manière remarquable, les polyglutamates de l'invention sont susceptibles d'être utilisés de plusieurs façons selon la nature des groupements hydrophobes et des groupements cationiques, la charge et le degré de polymérisation du polyglutamate. Les méthodes de mise en forme d'un polymère pour l'encapsulation d'un principe actif sous les diverses formes visées par l'invention sont connues de l'homme de l'art. Pour plus de détails, on peut se référer, par exemple à ces quelques références particulièrement pertinentes :
"Microspheres, Microcapsules and Liposomes ; vol 1. Preparation and chemical applications" Ed. R. Arshady, Citus Books 1999. ISBN : 0-9532187-1-6.
"Sustained-Release Injectable Products" Ed. J. Senior et M. Radomsky, Interpharm Press 2000. ISBN : 1-57491-101-5.
"Colloidal Drug Delivery Systems" Ed. J. Kreuter, Marcel Dekker, Inc. 1994.
ISBN :
0-8247-9214-9.
"Handbook of Pharmaceutical Controlled Release Technology" Ed. D.L. Wise, Marcel Dekker, Inc. 2000. ISBN : 0-8247-0369-3.
Ces polyglutamates (sous forme de particules ou non) peuvent encapsuler ou associer aisément des principes actifs tels que des protéines, peptides, ADN, ARN ou petites molécules. La mise en forme préférée est celle décrite dans le brevet US
6,630,171 et qui consiste à disperser le copolymère dans l'eau et à incuber la solution en présence d'un principe actif (PA). Cette solution colloïdale de particules de vectorisation, constituées des polyglutamates selon l'invention, peut ensuite être filtrée sous 0,2 m puis directement injectée à un patient.
Dans le cas où le polymère est cationique et soluble à pH acide du fait d'un excès de charge cationique et que cette charge se trouve partiellement ou totalement neutralisée à
pH neutre, un tel polymère est dit dépendant du pH. Ce type de polymère peut donc être utilisé pour former un dépôt après administration, par exemple dans le tissu sous-cutané.
Il convient de comprendre que les fonctions résiduelles carboxyliques du polyglutamate modifié sont soit neutres (forme COOH), soit ionisées (anion COO ), selon le pH et la composition. On parlera donc indifféremment i) de résidu glutamate ou de résidu acide glutamique, ii) d'acide polyglutamique ou de polyglutamate. En solution aqueuse, le contre-cation peut être un cation métallique tel que le sodium, le calcium ou le magnésium, ou un cation organique tel que la triéthanolamine, le tris(hydroxyméthyl)-aminométhane ou une polyamine tel que la polyéthylèneimine. S'il est divalent, un contre-cation peut salifier deux groupements cationiques monovalents proches.
Le contre-anion des groupements cationiques est de préférence choisi parmi le groupe comprenant un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate. S'il est divalent, un contre-anion peut salifier deux groupements cationiques monovalents proches.
Par suite, dans la présente description, on entend par "sels pharmaceutiquement acceptables" du polymère selon l'invention l'ensemble des polymères avec les contre-ions associés aux fonctions ionisées du polymère. Il est aussi envisageable, pour certaines structures où il y a 5 co-existence des charges positives et négatives qu'il y ait une neutralisation totale ou partielle des charges. Un polymère ayant un nombre équivalent de charges positives et de charges négatives (point isoélectrique) peut exister sans présence ni de contre-anion ni de contre-cation.
10 Les copolymères de l'invention sont par exemple obtenus par des méthodes connues de l'homme de l'art. Tout d'abord, rappelons que pour l'obtention de polyaminoacides de type alpha, la technique la plus courante est basée sur la polymérisation d'anhydrides de N-carboxy-aminoacides (NCA), décrite, par exemple, dans Biopolymers, 1976, 15, 1869 et dans H.R. Kricheldorf "alpha-Aminoacid-N-carboxy Anhydride and related Heterocycles"
15 Springer Verlag (1987). Le dérivé de NCA est de préférence NCA-Glu-O-R3 (R3 =
méthyle, éthyle ou benzyle). Les polymères sont ensuite hydrolysés dans des conditions appropriées pour obtenir le polymère sous sa forme acide. Ces méthodes sont inspirées de la description donnée dans le brevet FR 2 801226.
Un certain nombre de polymères utilisables selon l'invention, par exemple, de type poly(alpha-L-glutamique), poly(alpha-D-glutamique), poly(alpha-D,L-glutamate) et poly(gamma-L-glutamique) de masses variables sont disponibles commercialement.
De préférence, on synthétise les copolymères de l'invention selon 2 voies.
Dans la première, on greffe tout d'abord simultanément ou en séquence le groupement cationique (par exemple l'argininamide) et le groupement B-GH (par exemple la dodécylamine) sur un poly(acide-L-glutamique). Cette réaction peut se faire dans un solvant tel que le DMF, le DMSO ou la NMP selon le schéma suivant.
H
q ND
p O OH
O
CI~O~
NH
N-) H2NOC
~_O H NH3+,CI-O H HB-GH H O
A p D H2N m O H p q D
N N N
O ~ O O R, ~H
O O~ NH
HN~
NH3+,CP
Dans le mécanisme ci-dessus, lorsque q n'est pas nul, le précurseur du groupe Ri, tel que l'éthanolamine liée par l'azote, est introduit au cours de la synthèse en même temps que le groupement cationique.
Dans le cas où le groupement cationique contient deux fonctions amines non différenciées chimiquement (e.g. diamine linéaire), il peut être introduit sous une forme dans laquelle une des deux fonctions est protégée. Une dernière étape de clivage du groupement protecteur est alors ajoutée au schéma ci-dessus.
Le poly(acide-L-glutamique) peut être synthétisé selon la voie décrite dans la demande de brevet FR 2 801226. Dans le cas où le groupement HB-GH est lié via une fonction ester, il est plus aisé de greffer d'abord le groupement B-GH par une réaction de couplage classique en utilisant un carbodiimide avant de greffer le groupement cationique.
H
A N~
p D
O OH
HB-GH NH
Carbodiimide H2NOC\
O Y v H NH3`,CI' O N~ O O
H ~O H H
N LD N N
%+ m H1~ H A m H p 9 D
GH GH
NH
HN=~
NH3',CI-Dans le mécanisme ci-dessus, lorsque q n'est pas nul, le précurseur du groupe Rl, tel que l'éthanolamine liée par l'azote, est introduit au cours de la synthèse en même temps que le groupement cationique.
Dans le cas où le groupement cationique contient deux fonctions amines non différenciées chimiquement (e.g. diamine linéaire), il peut être introduit sous une forme dans laquelle une des deux fonctions est protégée. Une dernière étape de clivage du groupement protecteur est alors ajoutée au schéma ci-dessus.
La chimie de polymérisation et les réactions de couplage des groupements sont classiques et bien connues de l'homme de l'art (voir par exemples les brevets ou demandes de brevet de la demanderesse cités précédemment).
Ces méthodes seront mieux comprises à travers la description des exemples.
Il doit être observé que le degré de polymérisation est défini par le rapport molaire de l'initiateur sur celui du monomère.
Le couplage du greffon hydrophobe GH avec une fonction acide du polymère est réalisé
aisément par réaction du polyaminoacide en présence d'un carbodiimide comme agent de couplage et optionnellement, un catalyseur tel que la 4-diméthylaminopyridine et dans un solvant approprié tel que le diméthylformamide (DMF), la N-méthyl pyrrolidone (NMP) ou le diméthylsulfoxide (DMSO). Le carbodiimide est par exemple, le dicyclohexylcarbo-diimide ou le diisopropylcarbodiimide. Les réactifs de couplage tels que les chloro-formiates peuvent également être utilisés pour la formation de liaisons amides (voir par exemple Bodanszky : Principles of Peptide Synthesis Springer Verlag, 1984).
Le taux de greffage est contrôlé par la stoechiométrie des constituants et réactifs ou le temps de réaction. Les greffons hydrophobes fonctionnalisés par un acide aminé autre que celui du polymère sont obtenus par couplage peptidique classique ou par condensation directe par catalyse acide. Ces techniques sont bien connues de l'homme de l'art.
Selon un autre de ses aspects, l'invention vise une composition pharmaceutique, cosmétique, diététique ou phytosanitaire comprenant au moins un polyglutamate tel que défini ci-dessus et éventuellement au moins un principe actif, qui peut être thérapeutique, cosmétique, diététique ou phytosanitaire.
Suivant une disposition intéressante de l'invention, le principe actif est associé au(x) polyaminoacide(s) modifiés par un groupement cationique par une ou plusieurs liaisons autre(s) qu'une (ou que des) liaison(s) chimique(s) covalente(s).
Les techniques d'association d'un ou de plusieurs PA aux polyaminoacides modifiés selon l'invention sont similaires à celles décrites notamment dans le brevet US
6,630,171. Elles consistent à incorporer au moins un principe actif dans le milieu liquide contenant des Particules de Vectorisation (PV), de manière à obtenir une suspension colloïdale de PV
chargées en ou associées avec un ou plusieurs principe(s) actif(s) PA. Cette incorporation, qui conduit à un piégeage de PA par les PV, peut être réalisée de la manière suivante :
= mise en solution aqueuse de PA, puis ajout des PV, soit sous forme de suspension colloïdale, soit sous forme de PV isolées (lyophilisat ou précipité) ;
= ou ajout de PA, soit en solution, soit à l'état pur ou préformulé, à une suspension colloïdale de particules PV, éventuellement préparée extemporanément par la dispersion de PV sèches dans un solvant approprié, tel que l'eau.
De préférence, le principe actif est choisi dans le groupe comprenant : les protéines, les glycoprotéines, les protéines liées à une ou plusieurs chaînes polyalkylèneglycol [de préférence polyéthylèneglycol (PEG): "protéines-PEGylées"], les peptides, les polysaccharides, les liposaccharides, les oligonucléotides, les polynucléotides et leurs mélanges, et, plus préférentiellement encore, dans le sous-groupe des érythropoïétines, telles que l'époétine alpha, l'époétine bêta, la darbépoétine, le raffimère d'hémoglobine, leurs analogues ou leurs dérivés ; ocytocine, vasopressine, hormone adrénocorticotropique, facteur de croissance épidermique, facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), les facteurs stimulants de l'hématopoïèse et leurs mélanges, les facteurs sanguins, tels que alteplase, tenecteplase, facteur VII(a), facteur VII ; hémoglobine, les cytochromes, les albumines, prolactine, lulibérine, hormone de libération de l'hormone lutéinisante (LHRH) et analogues, tels que leuprolide, goséréline, triptoréline, buseréline, nafaréline ;
antagonistes de la LHRH, les agonistes de la LHRH, les hormones de croissance (GH) humaine, porcine ou bovine, le facteur de libération de l'hormone de croissance, l'insuline, la somatostatine, le glucagon, les interleukines ou leurs mélanges (IL-2, IL-11, IL-12), les interférons, tels que l'interféron alpha, alpha-2b, bêta, bêta-la, ou ^^ la gastrine, la tétragastrine, la pentagastrine, 1'urogastrone, la sécrétine, la calcitonine, les enképhalines, les endomorphines, les angiotensines, l'hormone de libération de la thyrotropine (TRH), le facteur de nécrose tumorale (TNF), le facteur de croissance des nerfs (NGF), les facteurs de croissance tels que beclapermine, trafermine, ancestime, le facteur de croissance des kératinocytes, le facteur de croissance hématopoïétique des granulocytes (G-CSF), le facteur de croissance hématopoïétique des granulocytes macrophages (GM-CSF), le facteur de croissance hématopoïétique des macrophages (M-CSF), l'héparinase, les protéines morphogéniques de l'os (BMP), le facteur natriurétique auriculaire humain (hANP), le peptide ressemblant au glucagon (GLP-1), le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), l'antigène recombinant de l'hépatite B
(rHBsAg), la rénine, les cytokines, la bradykinine, les bacitracines, les polymyxines, les colistines, la tyrocidine, les gramicidines, l'étanercept, l'imiglucérase, la drotrécogine alpha, les cyclosporines et analogues synthétiques, les modifications et fragments actifs pharmaceutiquement d' enzymes, de cytokines, d'anticorps, d'antigènes et de vaccins, les anticorps tels que rituximab, infliximab, trastuzumab, adalimumab, omalizumab, tositumomab, efalizumab, et cetuximab.
D'autres principes actifs sont les polysaccharides (par exemple, l'héparine) et les oligo- ou polynucléotides, ADN, ARN, iARN, antibiotiques, et cellules vivantes. Une autre classe de principes actifs comprend les substances pharmaceutiques agissant sur le système nerveux central, par exemple, rispéridone, zuclopenthixol, fluphénazine, perphénazine, flupentixol, halopéridol, fluspirilène, quétiapine, clozapine, amisulprid, sulpiride, ziprasidone, etc.
Selon une variante, le principe actif est une petite molécule organique hydrophobe, hydrophile ou amphiphile. Au sens du présent exposé, une "petite" molécule est notamment une petite molécule non protéinique.
Comme exemples de PA susceptibles d'être associés aux polyaminoacides selon l'invention, qu'ils soient ou non sous forme de (nano ou micro)particules, on peut citer :
o les protéines telles que l'insuline, les interférons, les hormones de croissance, les interleukines, l'érythropoïétine ou les cytokines ;
o les peptides tels que le leuprolide ou la cyclosporine ;
o les petites molécules telles que celles appartenant à la famille des anthracyclines, des taxoïdes ou des camptothécines ;
o et leurs mélanges.
D'une manière avantageuse, le principe actif est choisi panni au moins l'une des familles de substances actives suivantes : les agents de traitement de l'abus d'alcool, les agents de traitement de la maladie d'Alzheimer, les anesthésiques, les agents de traitement de l'acromégalie, les analgésiques, les antiasthmatiques, les agents de traitement des 10 allergies, les agents anticancéreux, les anti-inflammatoires, les anticoagulants et antithrombotiques, les anticonvulsivants, les antiépileptiques, les antidiabétiques, les antiémétiques, les antiglaucomes, les antihistaminiques, les antiparasitaires, les antibiotiques, les antifongiques, les antiviraux, les antiparkinsoniens, les anti-cholinergiques, les antitussifs, les inhibiteurs de l'anhydrase carbonique, les agents 15 cardiovasculaires, les hypolipémiants, les anti-arythmiques, les vasodilatateurs, les antiangineux, les anti-hypertenseurs, les vasoprotecteurs, les inhibiteurs de cholinestérase, les agents de traitement des désordres du système nerveux central, les stimulants du système nerveux central, les contraceptifs, les promoteurs de fécondité, les inducteurs et inhibiteurs du travail utérin, les agents de traitement de la mucoviscidose, les agonistes des 20 récepteurs de la dopamine, les agents de traitement de l'endométriose, les agents de traitement des dysfonctionnements érectiles, les agents de traitement de la fertilité, les agents de traitement des troubles gastro-intestinaux, les immunomodulateurs et les immunosuppresseurs, les agents de traitement des troubles de la mémoire, les antimigraineux, les myorelaxants, les analogues de nucléosides, les agents de traitement de l'ostéoporose, les parasympathomimétiques, les prostaglandines, les agents psychothérapeutiques, les sédatifs, les hypnotiques et tranquillisants, les neuroleptiques, les anxiolytiques, les psychostimulants, les antidépresseurs, les agents de traitements dermatologiques, les stéroïdes et les hormones, les amphétamines, les anorexiques, les anti-douleurs non analgésiques, les anti-épileptiques, les barbituriques, les benzodiazépines, les hypnotiques, les laxatifs, les psychotropes et toutes les associations de ces produits.
Selon un mode de réalisation, la composition de l'invention est sous forme d'un gel, d'une solution, d'une suspension, d'une émulsion, de micelles, de nanoparticules, de microparticules, d'un implant, d'une poudre, d'une suspension ou d'un film.
Suivant l'une de ses formes particulièrement préférées, la composition, chargée ou non en principe actif(s), est une suspension colloïdale stable de nanoparticules et/ou de microparticules et/ou de micelles polyaminoacides, dans une phase aqueuse ou huileuse.
Des microparticules peuvent être obtenues par diverses méthodes telles que la coacervation en présence d'un agent d'agrégation (ions divalents ou trivalents ou polyélectrolytes), précipitation par changement de pH ou de la force ionique, extraction/évaporation ou par atomisation.
En particulier, la composition selon l'invention peut être une solution colloïdale de nanoparticules dans une phase aqueuse à pH acide et qui précipite à pH
physiologique.
Avantageusement, un polyaminoacide de l'invention présentant un excès de charge cationiques peut condenser un principe actif anionique tel que l'ADN, un fragment d'ADN, un ARN ou un oligo ARN sous forme de nano- ou microparticules et ces particules peuvent être internalisées dans une cellule.
Selon un autre mode de réalisation, la composition de l'invention est sous forme de solution dans un solvant biocompatible et peut être injectée par voie sous-cutanée, intramusculaire ou dans une tumeur.
La composition selon l'invention, dès lors qu'elle est pharmaceutique, peut être administrée par voie orale, pulmonaire, parentérale, nasale, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou buccale.
Il est également envisageable que la composition soit sous forme de solution dans un solvant ou un mélange de solvants biocompatibles, susceptible d'être injectée en sous-cutané, intramusculaire ou dans une tumeur.
Selon un autre mode de réalisation, la composition peut contenir un excipient pour l'ajustement du pH et/ou de l'osmolarité et/ou pour améliorer la stabilité
(antioxydants) et/ou comme agent antimicrobiens. Ces excipients sont bien connus de l'homme de l'art (C Injectable Drug Development, P.K. Gupta et al. Interpharm Press, Denver, 1999).
L'invention vise aussi un procédé de préparation = de médicaments, en particulier pour administration orale, nasale, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale ou intracérébrale, les principes actifs de ces médicaments pouvant être, notamment, des protéines, des glycoprotéines, des protéines liées à une ou plusieurs chaînes polyalkylèneglycol {par exemple PolyEthylèneGlycol (PEG), on parle alors de protéines "PEGylées"}, des peptides, des polysaccharides, des liposaccharides, des oligonucléotides, des polynucléotides et des petites molécules organiques hydrophobes, hydrophiles ou amphiphiles ;
= etlou des nutriments ;
= et/ou de produits cosmétiques ou phytosanitaires ;
ce procédé étant caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à mettre en oeuvre au moins l'un des polyaminoacides tels que définis ci-dessus et/ou la composition décrite ci-dessus.
L'invention concerne également une méthode de traitement thérapeutique consistant essentiellement à administrer la composition telle que décrite dans le présent exposé, par voie orale, pulmonaire, parentérale, nasale, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou buccale.
Suivant une variante particulière de l'invention, cette méthode de traitement thérapeutique consiste essentiellement à mettre en oeuvre la composition telle que décrite supra sous forme de solution dans un solvant biocompatible puis à l'injecter en sous-cutané, intramusculaire ou dans une tumeur, de préférence de manière à ce qu'elle forme un dépôt sur le site d'injection.
L'invention sera mieux comprise et ses avantages et variantes de mise en oeuvre ressortiront bien des exemples qui suivent et qui décrivent la synthèse des polymères de l'invention, leur transformation en système de vectorisation de PA (suspension colloïdale aqueuse stable) et la démonstration de la capacité d'un tel système de s'associer à une protéine ou à un acide nucléique pour former des compositions pharmaceutiques.
EXEMPLES :
Exemple 1 synthèse du polymère (1) NH
HNNH3+,CI' O NH
H H
N N
P O 4 s O T O ONa Indices et groupements : T = D,L-a-tocophérol, p = s 11 , q 198 Dix grammes d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'a-tocophérol racémique sont solubilisés dans 125 mL de NMP à 80 C.
Cette solution est refroidie à 0 C, et 8,7 mL de chloroformiate d'iso-butyle puis 7,35 mL de N-méthyl-morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 15 min à 0 C.
En parallèle, 24,67 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 308 mL
de NMP
et 14,7 mL de triéthylamine sont ajoutés. La suspension obtenue est agitée quelques minutes à 20 C puis refroidie à 0 C. La suspension laiteuse de polymère activé est alors additionnée à cette suspension, et le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à 0 C, puis une nuit à 20 C. Après ajout de 2,1 mL d'une solution d'HCl 35 % puis 100 mL
d'eau, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 1,6 L d'eau. La solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 250 mL. Le pourcentage d'argininamide greffé, déterminé
par RMN du proton dans D20, est de 90 %.
Exemple 2 synthèse du polymère (2) NH3+,C1' O NH
H H
N N
H2N r7N H
P O q s O T O ONa Indices et groupements : T = D,L-a-tocophérol, p= s 6, q = 108 Trois grammes et demi d'un poly(acide glutamique) de DP 120 greffé à 5 de façon statistique avec de l'a-tocophérol racémique sont solubilisés dans 70 mL de NMP à 80 C.
Cette solution est refroidie à 0 C, et 3,2 g de chloroformiate d'iso-butyle puis 2,37 g de N-méthyl-morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 10 min à 0 C. En parallèle, 4,62 g de N-tert-butyloxycarbonyl-1,4-butanediamine (BOC-putrescine) sont solubilisés dans 9 mL de NMP puis refroidis à 0 C. La suspension laiteuse de polymère activé est alors additionnée à cette solution, et le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à 0 C, puis une nuit à 20 C. Après ajout de 0,7 mL d'une solution d'HCl 35 %, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 317 mL d'eau. La solution obtenue est ajustée à pH = 7,4 avec de la soude 1N, puis dialysée contre de l'eau salée (0,9 %) puis de l'eau. La suspension obtenue est lyophilisée pour donner 4,1 g d'une poudre blanche.
Cette poudre est remise en solution dans le TFA, agitée 2 h à 20 C, puis versée goutte à
goutte dans un pied d'eau en ajustant le pH vers 7 avec une solution de soude 1 N. La solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 50 mL. Le pourcentage de BOC-putrescine greffée, déterminé par RMN du proton dans D20, est de 90 %.
Exemple 3 : synthèse du polymère (3) NH
HNNH3+,CI"
O NH
O ONa O
H O N
--_ I - 7 P O q r H s O
O T O N ,,/OH
H
Indices et groupements : T = D,L-a-tocophérol, p = 11, q = 88, r = 99, s 22 5 Dix grammes d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'a-tocophérol racémique sont solubilisés dans 125 mL de NMP à 80 C.
Cette solution est refroidie à 0 C, et 9,1 mL de chloroformiate d'iso-butyle puis 7,71 mL de N-méthyl morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 15 minutes à
0 C. En parallèle, 8,2 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 103 mL
de NMP et 10 9,31 mL de triéthylamine sont ajoutés. On ajoute encore 1,6 mL
d'éthanolamine, et la suspension obtenue est agitée quelques minutes à 20 C puis refroidie à 0 C.
La suspension laiteuse de polymère activé est alors additionnée à cette suspension, et le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à 0 C. On ajoute 1,2 mL
d'éthanolamine, puis agite une nuit à 20 C. Après ajout de 2,1 mL d'une solution d'HCl 35 % puis 200 mL
15 d'eau, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 700 mL d'eau tout en ajustant le pH vers 7,4. La solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 250 mL. Les pourcentage d'argininamide et d'éthanolamine greffées, déterminés par RIV1N du proton dans D20, sont respectivement de 40 et 45 %
Exemple 4 : synthèse du polymère (4) NH3+,CI' O NH
O ONa O O
H N
N Jr7 H
H2N H H s P O p O
O T O N_~,,OH
H
Indices et groupements : T = D,L-a-tocophérol, p = 6, q = 59, r = 52, s 3 Cinq grammes d'un poly(acide glutamique) de DP 120 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'a-tocophérol racémique sont solubilisés dans 63 mL de NMP à 80 C.
Cette solution est refroidie à 0 C, et 4,3 g de chloroformiate d'iso-butyle puis 3, 7 g de N-méthyl-morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 10 min à 0 C.
En parallèle, 3,15 g de N-tert-butyloxycarbonyl-1,4-butanediamine (BOC-putrescine) sont solubilisés dans 39 mL de NMP puis refroidis à 0 C. On ajoute cette solution à
la suspension laiteuse de polymère activé, et le mélange réactionnel est agité
pendant 2 h à
0 C. On ajoute 2 mL d'éthanolamine, puis agite une nuit à température ambiante. Après ajout de 1,04 mL d'une solution d'HCI 35 %, le mélange réactionnel est versé
goutte à
goutte dans 407 mL d'eau. La suspension obtenue est ajustée à pH = 7,4 avec de la soude 1 N, puis dialysée (seuil de coupure de 1 kD) contre de l'eau salée (0,9 %) puis de l'eau.
La suspension obtenue est lyophilisée pour donner une poudre blanche. Cette poudre est remise en solution dans 100 mL de TFA, agitée 1,25 h à 20 C, puis versée goutte à goutte dans un pied d'eau (500 mL) en ajustant le pH vers 7 avec une solution de soude 1 N.
Après ajout de 600 mL d'éthanol, la solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 100 mL.
Les pourcentages de BOC-putrescine et d'éthanolamine greffées, déterminés par RMN du proton dans D2O, sont respectivement de 49 et 43 %.
Exemple 5 synthèse du polymère (5) NH
HNNH3+,CI"
O NH
H H
N N
P O q s O T O ONa Indices et groupements : T D,L-a-tocophérol, p = 5, q = 83, s 12 Selon un mode opératoire similaire à celui utilisé pour la synthèse du polymère (1), on obtient environ 300 mL d'une solution concentrée à 48 mg/g à partir de 10 g d'un poly(acide glutamique) de DP 100 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'a-tocophérol racémique, de 9,6 g de chloroformiate d'iso-butyle, de 7,7 mL de N-méthyl-morpholine, de 24,7 g de dichlorhydrate d'argininamide et de 14,7 mL de triéthylamine. Le pourcent-age d'argininamide greffé, déterminé par RMN du proton dans D20, est de 83 %.
Exemple 6: synthèse du polymère (6) NH
HNNH3+,CI' O NH
N N
H H
-- -r 4 P O q S
O T O ONa Indices et groupements : T= D,L-a-tocophérol, p = 11, q = 62, s 147 Selon un mode opératoire similaire à celui utilisé pour la synthèse du polymère (1), on obtient environ 250 mL d'une solution concentrée à 43 mg/g à partir de 10 g d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'a-tocophérol racémique, de 2,9 g de chloroformiate d'iso-butyle, de 2,2 mL de N-méthyl-morpholine, de 4,93 g de dichlorhydrate d'argininamide et de 3,3 mL de triéthylamine. Le pourcentage d'argininamide greffé, déterminé par RMN du proton dans D20, est de 28 %.
Exemple 7 : synthèse du polymère (7) NH
HNNH3+,G-O NH
O ONa O p H N
N H
H2N r7N--P O q r O H s O T O N ,-/OH
H
Indices et groupements : T= D,L-a-tocophérol, p = 5, q 40, r = 48, s 7 Selon un mode opératoire similaire à celui utilisé pour la synthèse du polymère (3), on obtient environ 200 mL d'une solution concentrée à 41 mg/g à partir de 10 g d'un poly(acide glutamique) de DP 100 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'a-tocophérol racémique, de 9,58 g de chloroformiate d'iso-butyle, de 7,7 mL de N-méthyl-morpholine, de 8,22 g de dichlorhydrate d'argininamide, de 2,86 g d'éthanolamine et de 5,1 mL de triéthylamine. Les pourcentages d'argininamide et d'éthanolamine greffés, déterminés par RMN du proton dans D20, sont respectivement de 40 et 48 %.
Exemple 8 synthèse du polymère (8) NH
HNNH3+,CI' O NH
H H
N N
H2 N r7N H
P O q s O T O ONa Indices et groupements : T = D,L-a-tocophérol, p = 11, q= 139, s 70 Selon un mode opératoire similaire à celui utilisé pour la synthèse du polymère (1), on obtient environ 200 mL d'une solution concentrée à 51 mg/g à partir de 10 g d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'a-tocophérol racémique, de 6,39 g de chloroformiate d'iso-butyle, de 5,1 mL de N-méthyl-morpholine, 10 de 13,16 g de dichlorhydrate d'argininamide et de 7,5 mL de triéthylamine.
Le pourcent-age d'argininamide greffé, déterminé par RMN du proton dans D20, est de 63 %.
Exemple 9 synthèse du polymère (9) NH
HNNH3+,CI"
O NH
H H
N N
P O q s O T O ONa Indices et groupements : T= D,L-a-tocophérol, p = 11, q 121, s 88 Cinq grammes d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 de façon statistique avec de l'a-tocophérol racémique sont solubilisés dans 63 mL de NMP à 80 C.
Cette solution est refroidie à 0 C, et 2,38 mL de chloroformiate d'iso-butyle puis 2,02 mL de N-méthyl-morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 15 min à 0 C.
En parallèle, 4,93 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 62 mL
de NMP et 2,8 mL de triéthylamine sont ajoutés. La suspension obtenue est agitée quelques minutes à
C puis refroidie à 0 C. La suspension laiteuse de polymère activé est alors additionnée à cette suspension, et le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à 0 C, puis 4 h à 20 C. Après ajout de 1,04 mL d'une solution d'HCl 35 % puis 50 mL
d'eau, le 15 mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 500 mL d'eau acide (pH =
3), en maintenant le pH vers 3 - 4 avec une solution d'HCl 1 N. La solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 250 mL. Le pourcentage d'argininamide greffé, déterminé par RMN du proton dans D20, est de 55 %.
Exemple 10 : synthèse du polymère (10) NH
HN"k NH3+,Cl' O NH
O ONa O
H p N H
H2N N jN H s lq r O
~/OH
O T O N
H
Indices et groupements : T = D,L-a-tocophérol, p 11, q = 88, r = 48, s 73 Dix grammes d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'a-tocophérol racémique sont solubilisés dans 125 mL de NMP à 80 C.
Cette solution est refroidie à 0 C, et 5,6 mL de chloroformiate d'iso-butyle puis 4,8 mL de N-méthyl-morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 15 min à 0 C.
En parallèle, 7,4 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 93 mL de NMP, puis 4,7 mL de triéthylamine et 1,2 mL d'éthanolamine sont ajoutés. La suspension obtenue est agitée quelques minutes à 20 C puis refroidie à 0 C. La suspension laiteuse de polymére activé est alors additionnée à cette suspension, et le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à 0 C, puis une nuit à 20 C. Après ajout de 2,07 mL d'une solution d'HCl 35 % puis 200 mL d'eau, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 670 mL d'eau acidifiée à pH = 3 avec HCI, en maintenant le pH vers 3 avec une solution d'HCl 1 N. La solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 250 mL. Les pourcentages d'argininamide et d'éthanolamine greffés, déterminés par RMN du proton dans D20, sont respectivement de 40 et 22 %.
Exemple comparatif 11 : le composé Cl non fonctionnalisé par un groupement cationique Le composé comparatif C1 est le précurseur (sous sa forme anionique) du polyglutamate modifié par un groupement cationique, soit le polyglutamate de DP 220 greffé à
5% de façon statistique avec de la alpha-tocophérol racémique. Ce composé est obtenu par la méthode décrite dans la demande WO-A-03/104303.
Exemple 12 : Étude d'association de l'insuline On prépare une solution aqueuse contenant 10 mg de polymére par millilitre à
pH 7,4 et 200 UI d'insuline (7,4 mg). On laisse incuber les solutions pendant 2 h à
température ambiante et on sépare l'insuline libre de l'insuline associée par ultrafiltration (seuil à
100 kDa, 15 min sous 10000G à 18 C). L'insuline libre récupérée dans le filtrat est ensuite dosée par CLHP (Chromatographie Liquide Haute Performance) et l'on déduit la quantité d'insuline associée. Les résultats sont donnés dans le tableau 1 ci-dessous.
Polymère % association 3 100%
6 96%
8 100%
C1 99%
Les résultats démontrent que les polymères de l'invention sont capables d'associer fortement l'insuline pour donner des suspensions colloïdales de taille supérieure à
100 kDa et les taux d'association avec l'insuline sont très élevés. En comparaison avec le polymère C1, on constate que la présence de charges cationiques ne diminue pas le taux d'insuline associé.
Exemple 13 : mesure de la viscosité (mPa/s) sous cisaillement d'une solution aqueuse à 29 mg/g avec un gradient de vitesse de 10 s I
Exemple C 1 3 6 8 10 Viscosité 4720 6,6 4,5 5,8 4,7 Les résultats démontrent que les polymères de l'invention sont nettement moins visqueux que la référence C1 qui ne contient pas de groupements cationiques pendants.
Exemple 14 : Étude de solubilité en fonction du pH
Les résultats montrent que certains polymères de l'invention (exemples 9 et 10) présentent des propriétés de solubilité dépendantes du pH qui, contrairement au composé
Cl, leur permettent d'être formulés avec un principe actif à pH modérément acide (pH =
4) et de former un dépôt à pH physiologique (pH autour de 7).
Polymère pH = 4 pH physiologique 1 soluble soluble 2 soluble soluble 3 soluble soluble 4 soluble soluble 5 soluble soluble 6 insoluble soluble 7 soluble soluble 8 soluble soluble 9 soluble insoluble soluble insoluble C1 insoluble soluble Exemple 15 : Étude d'association d'un ARN thérapeutique On réalise des associations polymère/ARN en solution aqueuse en ajoutant des quantités croissantes de polymères (1), (3) (deux exemples de polymères de l'invention qui sont globalement cationiques à pH = 7,4) ou C1 à des quantités fixes d'un ARN
thérapeutique de 1433 nucléotides. Ces mélanges sont incubés 2 h à 37 C, puis analysés par électrophorèse sur gel d'agarose 1 % en conditions dénaturantes (révélation des ARN au bromure d'éthidium). De l'ARN seul sert de contrôle positif d'intégrité. De l'ARN incubé
avec des RNAses commerciales sert de contrôle d'ARN dégradé.
Les résultats montrent que lorsque l'ARN étudié a été incubé avec les polymères (1) ou (3), la quantité d'ARN qui migre à la taille attendue en électrophorèse diminue progressivement avec la quantité de polymère utilisé pour l'association et disparaît au delà
d'une certaine valeur sans apparition d'autres bandes. Au contraire, dans le mélange 5 réalisé avec le composé C1, la quantité d'ARN qui migre est inchangée, même en présence d'un large excès de polymère.
Dans un 2e temps, on ajoute sur l'ARN la quantité de polymère (1) ou (3) permettant de l'associer totalement (conditions où l'ARN n'est plus visible à la taille attendue sur gel) et on laisse ces mélanges incuber 2 h à 37 C. Après 2 h à 37 C, on ajoute sur ces mélanges 10 des quantités croissantes de composé C1 et on réalise une nouvelle incubation de 16 h à
37 C. Les mélanges obtenus sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose 1 % en conditions dénaturantes (révélation des ARN au bromure d'éthidium).
Les résultats montrent que l'on observe à la taille attendue des quantités croissantes d'ARN
en corrélation avec la quantité de polymère C 1 ajouté sur le mélange ARN/polymère (1) ou 15 (3).
Ces résultats montrent que certains polymères de l'invention, globalement cationiques à
pH = 7,4, permettent d'associer un ARN modèle de 1433 nucléotides et que cette association est réversible en présence d'un polymère globalement anionique. De plus, l'ARN formulé n'est pas dégradé.
Exemple 16: Étude du franchissement de la membrane cellulaire d'un oligonucléotide modèle On mélange dans du milieu Opti-MEM sans sérum de veau foetal un oligonucléotide d'ARN de 30 bases marqué au Cy3 à une quantité de polymère (3) ou (7) proche de la quantité minimale pour associer la totalité de l'oligonucléotide. Ce mélange est mis en contact sur des cellules d'hépatocarcinome humain Huh-7 cultivées en plaque 24 puits à
raison de 25 000 cellules/puits. Après 4 h d'incubation à 37 C, 5 % C02, on ajoute du milieu D-MEM à 20 % de sérum de veau foetal (SVF) de telle sorte que la concentration finale de SVF soit de 10 %. Après 24 h d'incubation des cellules en présence des mélanges oligonucléotide/polymère, les cellules sont lavées, marquées au niveau membranaire à la concanavaline biotinylée puis fixées 3 min avec du paraformaldéhyde à
3,7 %. Après 2 lavages avec du tampon PBS, les cellules sont incubées avec du DAPI
(ADN nucléaire) pendant 10 min, lavées 3 fois avec du PBS, puis incubées avec la streptavidine marquée avec l'Alexa Fluor 488 qui révèle la concanavaline biotinylée. Les cellules sont observées en microscopie confocale. La localisation des cellules est possible par observation de leur membrane marquée à l'Alexa Fluor 488 et de leur noyau marqué
au DAPI. L'entrée de l'oligonucléotide marqué au Cy3 dans la cellule est visualisée par observation de la fluorescence du Cy3 (excitation à 550 nm, émission à 570 nm).
Les résultats montrent que l'on retrouve de l'oligonucléotide marqué au Cy3 dans le cytoplasme des cellules Huh-7 quand l'oligonucléotide a été incubé sur les cellules en présence des polymères (3) ou (7).
En comparaison, quand on incube l'oligonucléotide seul, ou en présence du polymère C1, sur les cellules Huh-7, on n'observe pas la présence de l'oligonucléotide marqué dans les cellules.
15 Springer Verlag (1987). Le dérivé de NCA est de préférence NCA-Glu-O-R3 (R3 =
méthyle, éthyle ou benzyle). Les polymères sont ensuite hydrolysés dans des conditions appropriées pour obtenir le polymère sous sa forme acide. Ces méthodes sont inspirées de la description donnée dans le brevet FR 2 801226.
Un certain nombre de polymères utilisables selon l'invention, par exemple, de type poly(alpha-L-glutamique), poly(alpha-D-glutamique), poly(alpha-D,L-glutamate) et poly(gamma-L-glutamique) de masses variables sont disponibles commercialement.
De préférence, on synthétise les copolymères de l'invention selon 2 voies.
Dans la première, on greffe tout d'abord simultanément ou en séquence le groupement cationique (par exemple l'argininamide) et le groupement B-GH (par exemple la dodécylamine) sur un poly(acide-L-glutamique). Cette réaction peut se faire dans un solvant tel que le DMF, le DMSO ou la NMP selon le schéma suivant.
H
q ND
p O OH
O
CI~O~
NH
N-) H2NOC
~_O H NH3+,CI-O H HB-GH H O
A p D H2N m O H p q D
N N N
O ~ O O R, ~H
O O~ NH
HN~
NH3+,CP
Dans le mécanisme ci-dessus, lorsque q n'est pas nul, le précurseur du groupe Ri, tel que l'éthanolamine liée par l'azote, est introduit au cours de la synthèse en même temps que le groupement cationique.
Dans le cas où le groupement cationique contient deux fonctions amines non différenciées chimiquement (e.g. diamine linéaire), il peut être introduit sous une forme dans laquelle une des deux fonctions est protégée. Une dernière étape de clivage du groupement protecteur est alors ajoutée au schéma ci-dessus.
Le poly(acide-L-glutamique) peut être synthétisé selon la voie décrite dans la demande de brevet FR 2 801226. Dans le cas où le groupement HB-GH est lié via une fonction ester, il est plus aisé de greffer d'abord le groupement B-GH par une réaction de couplage classique en utilisant un carbodiimide avant de greffer le groupement cationique.
H
A N~
p D
O OH
HB-GH NH
Carbodiimide H2NOC\
O Y v H NH3`,CI' O N~ O O
H ~O H H
N LD N N
%+ m H1~ H A m H p 9 D
GH GH
NH
HN=~
NH3',CI-Dans le mécanisme ci-dessus, lorsque q n'est pas nul, le précurseur du groupe Rl, tel que l'éthanolamine liée par l'azote, est introduit au cours de la synthèse en même temps que le groupement cationique.
Dans le cas où le groupement cationique contient deux fonctions amines non différenciées chimiquement (e.g. diamine linéaire), il peut être introduit sous une forme dans laquelle une des deux fonctions est protégée. Une dernière étape de clivage du groupement protecteur est alors ajoutée au schéma ci-dessus.
La chimie de polymérisation et les réactions de couplage des groupements sont classiques et bien connues de l'homme de l'art (voir par exemples les brevets ou demandes de brevet de la demanderesse cités précédemment).
Ces méthodes seront mieux comprises à travers la description des exemples.
Il doit être observé que le degré de polymérisation est défini par le rapport molaire de l'initiateur sur celui du monomère.
Le couplage du greffon hydrophobe GH avec une fonction acide du polymère est réalisé
aisément par réaction du polyaminoacide en présence d'un carbodiimide comme agent de couplage et optionnellement, un catalyseur tel que la 4-diméthylaminopyridine et dans un solvant approprié tel que le diméthylformamide (DMF), la N-méthyl pyrrolidone (NMP) ou le diméthylsulfoxide (DMSO). Le carbodiimide est par exemple, le dicyclohexylcarbo-diimide ou le diisopropylcarbodiimide. Les réactifs de couplage tels que les chloro-formiates peuvent également être utilisés pour la formation de liaisons amides (voir par exemple Bodanszky : Principles of Peptide Synthesis Springer Verlag, 1984).
Le taux de greffage est contrôlé par la stoechiométrie des constituants et réactifs ou le temps de réaction. Les greffons hydrophobes fonctionnalisés par un acide aminé autre que celui du polymère sont obtenus par couplage peptidique classique ou par condensation directe par catalyse acide. Ces techniques sont bien connues de l'homme de l'art.
Selon un autre de ses aspects, l'invention vise une composition pharmaceutique, cosmétique, diététique ou phytosanitaire comprenant au moins un polyglutamate tel que défini ci-dessus et éventuellement au moins un principe actif, qui peut être thérapeutique, cosmétique, diététique ou phytosanitaire.
Suivant une disposition intéressante de l'invention, le principe actif est associé au(x) polyaminoacide(s) modifiés par un groupement cationique par une ou plusieurs liaisons autre(s) qu'une (ou que des) liaison(s) chimique(s) covalente(s).
Les techniques d'association d'un ou de plusieurs PA aux polyaminoacides modifiés selon l'invention sont similaires à celles décrites notamment dans le brevet US
6,630,171. Elles consistent à incorporer au moins un principe actif dans le milieu liquide contenant des Particules de Vectorisation (PV), de manière à obtenir une suspension colloïdale de PV
chargées en ou associées avec un ou plusieurs principe(s) actif(s) PA. Cette incorporation, qui conduit à un piégeage de PA par les PV, peut être réalisée de la manière suivante :
= mise en solution aqueuse de PA, puis ajout des PV, soit sous forme de suspension colloïdale, soit sous forme de PV isolées (lyophilisat ou précipité) ;
= ou ajout de PA, soit en solution, soit à l'état pur ou préformulé, à une suspension colloïdale de particules PV, éventuellement préparée extemporanément par la dispersion de PV sèches dans un solvant approprié, tel que l'eau.
De préférence, le principe actif est choisi dans le groupe comprenant : les protéines, les glycoprotéines, les protéines liées à une ou plusieurs chaînes polyalkylèneglycol [de préférence polyéthylèneglycol (PEG): "protéines-PEGylées"], les peptides, les polysaccharides, les liposaccharides, les oligonucléotides, les polynucléotides et leurs mélanges, et, plus préférentiellement encore, dans le sous-groupe des érythropoïétines, telles que l'époétine alpha, l'époétine bêta, la darbépoétine, le raffimère d'hémoglobine, leurs analogues ou leurs dérivés ; ocytocine, vasopressine, hormone adrénocorticotropique, facteur de croissance épidermique, facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), les facteurs stimulants de l'hématopoïèse et leurs mélanges, les facteurs sanguins, tels que alteplase, tenecteplase, facteur VII(a), facteur VII ; hémoglobine, les cytochromes, les albumines, prolactine, lulibérine, hormone de libération de l'hormone lutéinisante (LHRH) et analogues, tels que leuprolide, goséréline, triptoréline, buseréline, nafaréline ;
antagonistes de la LHRH, les agonistes de la LHRH, les hormones de croissance (GH) humaine, porcine ou bovine, le facteur de libération de l'hormone de croissance, l'insuline, la somatostatine, le glucagon, les interleukines ou leurs mélanges (IL-2, IL-11, IL-12), les interférons, tels que l'interféron alpha, alpha-2b, bêta, bêta-la, ou ^^ la gastrine, la tétragastrine, la pentagastrine, 1'urogastrone, la sécrétine, la calcitonine, les enképhalines, les endomorphines, les angiotensines, l'hormone de libération de la thyrotropine (TRH), le facteur de nécrose tumorale (TNF), le facteur de croissance des nerfs (NGF), les facteurs de croissance tels que beclapermine, trafermine, ancestime, le facteur de croissance des kératinocytes, le facteur de croissance hématopoïétique des granulocytes (G-CSF), le facteur de croissance hématopoïétique des granulocytes macrophages (GM-CSF), le facteur de croissance hématopoïétique des macrophages (M-CSF), l'héparinase, les protéines morphogéniques de l'os (BMP), le facteur natriurétique auriculaire humain (hANP), le peptide ressemblant au glucagon (GLP-1), le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), l'antigène recombinant de l'hépatite B
(rHBsAg), la rénine, les cytokines, la bradykinine, les bacitracines, les polymyxines, les colistines, la tyrocidine, les gramicidines, l'étanercept, l'imiglucérase, la drotrécogine alpha, les cyclosporines et analogues synthétiques, les modifications et fragments actifs pharmaceutiquement d' enzymes, de cytokines, d'anticorps, d'antigènes et de vaccins, les anticorps tels que rituximab, infliximab, trastuzumab, adalimumab, omalizumab, tositumomab, efalizumab, et cetuximab.
D'autres principes actifs sont les polysaccharides (par exemple, l'héparine) et les oligo- ou polynucléotides, ADN, ARN, iARN, antibiotiques, et cellules vivantes. Une autre classe de principes actifs comprend les substances pharmaceutiques agissant sur le système nerveux central, par exemple, rispéridone, zuclopenthixol, fluphénazine, perphénazine, flupentixol, halopéridol, fluspirilène, quétiapine, clozapine, amisulprid, sulpiride, ziprasidone, etc.
Selon une variante, le principe actif est une petite molécule organique hydrophobe, hydrophile ou amphiphile. Au sens du présent exposé, une "petite" molécule est notamment une petite molécule non protéinique.
Comme exemples de PA susceptibles d'être associés aux polyaminoacides selon l'invention, qu'ils soient ou non sous forme de (nano ou micro)particules, on peut citer :
o les protéines telles que l'insuline, les interférons, les hormones de croissance, les interleukines, l'érythropoïétine ou les cytokines ;
o les peptides tels que le leuprolide ou la cyclosporine ;
o les petites molécules telles que celles appartenant à la famille des anthracyclines, des taxoïdes ou des camptothécines ;
o et leurs mélanges.
D'une manière avantageuse, le principe actif est choisi panni au moins l'une des familles de substances actives suivantes : les agents de traitement de l'abus d'alcool, les agents de traitement de la maladie d'Alzheimer, les anesthésiques, les agents de traitement de l'acromégalie, les analgésiques, les antiasthmatiques, les agents de traitement des 10 allergies, les agents anticancéreux, les anti-inflammatoires, les anticoagulants et antithrombotiques, les anticonvulsivants, les antiépileptiques, les antidiabétiques, les antiémétiques, les antiglaucomes, les antihistaminiques, les antiparasitaires, les antibiotiques, les antifongiques, les antiviraux, les antiparkinsoniens, les anti-cholinergiques, les antitussifs, les inhibiteurs de l'anhydrase carbonique, les agents 15 cardiovasculaires, les hypolipémiants, les anti-arythmiques, les vasodilatateurs, les antiangineux, les anti-hypertenseurs, les vasoprotecteurs, les inhibiteurs de cholinestérase, les agents de traitement des désordres du système nerveux central, les stimulants du système nerveux central, les contraceptifs, les promoteurs de fécondité, les inducteurs et inhibiteurs du travail utérin, les agents de traitement de la mucoviscidose, les agonistes des 20 récepteurs de la dopamine, les agents de traitement de l'endométriose, les agents de traitement des dysfonctionnements érectiles, les agents de traitement de la fertilité, les agents de traitement des troubles gastro-intestinaux, les immunomodulateurs et les immunosuppresseurs, les agents de traitement des troubles de la mémoire, les antimigraineux, les myorelaxants, les analogues de nucléosides, les agents de traitement de l'ostéoporose, les parasympathomimétiques, les prostaglandines, les agents psychothérapeutiques, les sédatifs, les hypnotiques et tranquillisants, les neuroleptiques, les anxiolytiques, les psychostimulants, les antidépresseurs, les agents de traitements dermatologiques, les stéroïdes et les hormones, les amphétamines, les anorexiques, les anti-douleurs non analgésiques, les anti-épileptiques, les barbituriques, les benzodiazépines, les hypnotiques, les laxatifs, les psychotropes et toutes les associations de ces produits.
Selon un mode de réalisation, la composition de l'invention est sous forme d'un gel, d'une solution, d'une suspension, d'une émulsion, de micelles, de nanoparticules, de microparticules, d'un implant, d'une poudre, d'une suspension ou d'un film.
Suivant l'une de ses formes particulièrement préférées, la composition, chargée ou non en principe actif(s), est une suspension colloïdale stable de nanoparticules et/ou de microparticules et/ou de micelles polyaminoacides, dans une phase aqueuse ou huileuse.
Des microparticules peuvent être obtenues par diverses méthodes telles que la coacervation en présence d'un agent d'agrégation (ions divalents ou trivalents ou polyélectrolytes), précipitation par changement de pH ou de la force ionique, extraction/évaporation ou par atomisation.
En particulier, la composition selon l'invention peut être une solution colloïdale de nanoparticules dans une phase aqueuse à pH acide et qui précipite à pH
physiologique.
Avantageusement, un polyaminoacide de l'invention présentant un excès de charge cationiques peut condenser un principe actif anionique tel que l'ADN, un fragment d'ADN, un ARN ou un oligo ARN sous forme de nano- ou microparticules et ces particules peuvent être internalisées dans une cellule.
Selon un autre mode de réalisation, la composition de l'invention est sous forme de solution dans un solvant biocompatible et peut être injectée par voie sous-cutanée, intramusculaire ou dans une tumeur.
La composition selon l'invention, dès lors qu'elle est pharmaceutique, peut être administrée par voie orale, pulmonaire, parentérale, nasale, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou buccale.
Il est également envisageable que la composition soit sous forme de solution dans un solvant ou un mélange de solvants biocompatibles, susceptible d'être injectée en sous-cutané, intramusculaire ou dans une tumeur.
Selon un autre mode de réalisation, la composition peut contenir un excipient pour l'ajustement du pH et/ou de l'osmolarité et/ou pour améliorer la stabilité
(antioxydants) et/ou comme agent antimicrobiens. Ces excipients sont bien connus de l'homme de l'art (C Injectable Drug Development, P.K. Gupta et al. Interpharm Press, Denver, 1999).
L'invention vise aussi un procédé de préparation = de médicaments, en particulier pour administration orale, nasale, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale ou intracérébrale, les principes actifs de ces médicaments pouvant être, notamment, des protéines, des glycoprotéines, des protéines liées à une ou plusieurs chaînes polyalkylèneglycol {par exemple PolyEthylèneGlycol (PEG), on parle alors de protéines "PEGylées"}, des peptides, des polysaccharides, des liposaccharides, des oligonucléotides, des polynucléotides et des petites molécules organiques hydrophobes, hydrophiles ou amphiphiles ;
= etlou des nutriments ;
= et/ou de produits cosmétiques ou phytosanitaires ;
ce procédé étant caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à mettre en oeuvre au moins l'un des polyaminoacides tels que définis ci-dessus et/ou la composition décrite ci-dessus.
L'invention concerne également une méthode de traitement thérapeutique consistant essentiellement à administrer la composition telle que décrite dans le présent exposé, par voie orale, pulmonaire, parentérale, nasale, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou buccale.
Suivant une variante particulière de l'invention, cette méthode de traitement thérapeutique consiste essentiellement à mettre en oeuvre la composition telle que décrite supra sous forme de solution dans un solvant biocompatible puis à l'injecter en sous-cutané, intramusculaire ou dans une tumeur, de préférence de manière à ce qu'elle forme un dépôt sur le site d'injection.
L'invention sera mieux comprise et ses avantages et variantes de mise en oeuvre ressortiront bien des exemples qui suivent et qui décrivent la synthèse des polymères de l'invention, leur transformation en système de vectorisation de PA (suspension colloïdale aqueuse stable) et la démonstration de la capacité d'un tel système de s'associer à une protéine ou à un acide nucléique pour former des compositions pharmaceutiques.
EXEMPLES :
Exemple 1 synthèse du polymère (1) NH
HNNH3+,CI' O NH
H H
N N
P O 4 s O T O ONa Indices et groupements : T = D,L-a-tocophérol, p = s 11 , q 198 Dix grammes d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'a-tocophérol racémique sont solubilisés dans 125 mL de NMP à 80 C.
Cette solution est refroidie à 0 C, et 8,7 mL de chloroformiate d'iso-butyle puis 7,35 mL de N-méthyl-morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 15 min à 0 C.
En parallèle, 24,67 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 308 mL
de NMP
et 14,7 mL de triéthylamine sont ajoutés. La suspension obtenue est agitée quelques minutes à 20 C puis refroidie à 0 C. La suspension laiteuse de polymère activé est alors additionnée à cette suspension, et le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à 0 C, puis une nuit à 20 C. Après ajout de 2,1 mL d'une solution d'HCl 35 % puis 100 mL
d'eau, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 1,6 L d'eau. La solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 250 mL. Le pourcentage d'argininamide greffé, déterminé
par RMN du proton dans D20, est de 90 %.
Exemple 2 synthèse du polymère (2) NH3+,C1' O NH
H H
N N
H2N r7N H
P O q s O T O ONa Indices et groupements : T = D,L-a-tocophérol, p= s 6, q = 108 Trois grammes et demi d'un poly(acide glutamique) de DP 120 greffé à 5 de façon statistique avec de l'a-tocophérol racémique sont solubilisés dans 70 mL de NMP à 80 C.
Cette solution est refroidie à 0 C, et 3,2 g de chloroformiate d'iso-butyle puis 2,37 g de N-méthyl-morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 10 min à 0 C. En parallèle, 4,62 g de N-tert-butyloxycarbonyl-1,4-butanediamine (BOC-putrescine) sont solubilisés dans 9 mL de NMP puis refroidis à 0 C. La suspension laiteuse de polymère activé est alors additionnée à cette solution, et le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à 0 C, puis une nuit à 20 C. Après ajout de 0,7 mL d'une solution d'HCl 35 %, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 317 mL d'eau. La solution obtenue est ajustée à pH = 7,4 avec de la soude 1N, puis dialysée contre de l'eau salée (0,9 %) puis de l'eau. La suspension obtenue est lyophilisée pour donner 4,1 g d'une poudre blanche.
Cette poudre est remise en solution dans le TFA, agitée 2 h à 20 C, puis versée goutte à
goutte dans un pied d'eau en ajustant le pH vers 7 avec une solution de soude 1 N. La solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 50 mL. Le pourcentage de BOC-putrescine greffée, déterminé par RMN du proton dans D20, est de 90 %.
Exemple 3 : synthèse du polymère (3) NH
HNNH3+,CI"
O NH
O ONa O
H O N
--_ I - 7 P O q r H s O
O T O N ,,/OH
H
Indices et groupements : T = D,L-a-tocophérol, p = 11, q = 88, r = 99, s 22 5 Dix grammes d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'a-tocophérol racémique sont solubilisés dans 125 mL de NMP à 80 C.
Cette solution est refroidie à 0 C, et 9,1 mL de chloroformiate d'iso-butyle puis 7,71 mL de N-méthyl morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 15 minutes à
0 C. En parallèle, 8,2 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 103 mL
de NMP et 10 9,31 mL de triéthylamine sont ajoutés. On ajoute encore 1,6 mL
d'éthanolamine, et la suspension obtenue est agitée quelques minutes à 20 C puis refroidie à 0 C.
La suspension laiteuse de polymère activé est alors additionnée à cette suspension, et le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à 0 C. On ajoute 1,2 mL
d'éthanolamine, puis agite une nuit à 20 C. Après ajout de 2,1 mL d'une solution d'HCl 35 % puis 200 mL
15 d'eau, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 700 mL d'eau tout en ajustant le pH vers 7,4. La solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 250 mL. Les pourcentage d'argininamide et d'éthanolamine greffées, déterminés par RIV1N du proton dans D20, sont respectivement de 40 et 45 %
Exemple 4 : synthèse du polymère (4) NH3+,CI' O NH
O ONa O O
H N
N Jr7 H
H2N H H s P O p O
O T O N_~,,OH
H
Indices et groupements : T = D,L-a-tocophérol, p = 6, q = 59, r = 52, s 3 Cinq grammes d'un poly(acide glutamique) de DP 120 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'a-tocophérol racémique sont solubilisés dans 63 mL de NMP à 80 C.
Cette solution est refroidie à 0 C, et 4,3 g de chloroformiate d'iso-butyle puis 3, 7 g de N-méthyl-morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 10 min à 0 C.
En parallèle, 3,15 g de N-tert-butyloxycarbonyl-1,4-butanediamine (BOC-putrescine) sont solubilisés dans 39 mL de NMP puis refroidis à 0 C. On ajoute cette solution à
la suspension laiteuse de polymère activé, et le mélange réactionnel est agité
pendant 2 h à
0 C. On ajoute 2 mL d'éthanolamine, puis agite une nuit à température ambiante. Après ajout de 1,04 mL d'une solution d'HCI 35 %, le mélange réactionnel est versé
goutte à
goutte dans 407 mL d'eau. La suspension obtenue est ajustée à pH = 7,4 avec de la soude 1 N, puis dialysée (seuil de coupure de 1 kD) contre de l'eau salée (0,9 %) puis de l'eau.
La suspension obtenue est lyophilisée pour donner une poudre blanche. Cette poudre est remise en solution dans 100 mL de TFA, agitée 1,25 h à 20 C, puis versée goutte à goutte dans un pied d'eau (500 mL) en ajustant le pH vers 7 avec une solution de soude 1 N.
Après ajout de 600 mL d'éthanol, la solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 100 mL.
Les pourcentages de BOC-putrescine et d'éthanolamine greffées, déterminés par RMN du proton dans D2O, sont respectivement de 49 et 43 %.
Exemple 5 synthèse du polymère (5) NH
HNNH3+,CI"
O NH
H H
N N
P O q s O T O ONa Indices et groupements : T D,L-a-tocophérol, p = 5, q = 83, s 12 Selon un mode opératoire similaire à celui utilisé pour la synthèse du polymère (1), on obtient environ 300 mL d'une solution concentrée à 48 mg/g à partir de 10 g d'un poly(acide glutamique) de DP 100 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'a-tocophérol racémique, de 9,6 g de chloroformiate d'iso-butyle, de 7,7 mL de N-méthyl-morpholine, de 24,7 g de dichlorhydrate d'argininamide et de 14,7 mL de triéthylamine. Le pourcent-age d'argininamide greffé, déterminé par RMN du proton dans D20, est de 83 %.
Exemple 6: synthèse du polymère (6) NH
HNNH3+,CI' O NH
N N
H H
-- -r 4 P O q S
O T O ONa Indices et groupements : T= D,L-a-tocophérol, p = 11, q = 62, s 147 Selon un mode opératoire similaire à celui utilisé pour la synthèse du polymère (1), on obtient environ 250 mL d'une solution concentrée à 43 mg/g à partir de 10 g d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'a-tocophérol racémique, de 2,9 g de chloroformiate d'iso-butyle, de 2,2 mL de N-méthyl-morpholine, de 4,93 g de dichlorhydrate d'argininamide et de 3,3 mL de triéthylamine. Le pourcentage d'argininamide greffé, déterminé par RMN du proton dans D20, est de 28 %.
Exemple 7 : synthèse du polymère (7) NH
HNNH3+,G-O NH
O ONa O p H N
N H
H2N r7N--P O q r O H s O T O N ,-/OH
H
Indices et groupements : T= D,L-a-tocophérol, p = 5, q 40, r = 48, s 7 Selon un mode opératoire similaire à celui utilisé pour la synthèse du polymère (3), on obtient environ 200 mL d'une solution concentrée à 41 mg/g à partir de 10 g d'un poly(acide glutamique) de DP 100 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'a-tocophérol racémique, de 9,58 g de chloroformiate d'iso-butyle, de 7,7 mL de N-méthyl-morpholine, de 8,22 g de dichlorhydrate d'argininamide, de 2,86 g d'éthanolamine et de 5,1 mL de triéthylamine. Les pourcentages d'argininamide et d'éthanolamine greffés, déterminés par RMN du proton dans D20, sont respectivement de 40 et 48 %.
Exemple 8 synthèse du polymère (8) NH
HNNH3+,CI' O NH
H H
N N
H2 N r7N H
P O q s O T O ONa Indices et groupements : T = D,L-a-tocophérol, p = 11, q= 139, s 70 Selon un mode opératoire similaire à celui utilisé pour la synthèse du polymère (1), on obtient environ 200 mL d'une solution concentrée à 51 mg/g à partir de 10 g d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'a-tocophérol racémique, de 6,39 g de chloroformiate d'iso-butyle, de 5,1 mL de N-méthyl-morpholine, 10 de 13,16 g de dichlorhydrate d'argininamide et de 7,5 mL de triéthylamine.
Le pourcent-age d'argininamide greffé, déterminé par RMN du proton dans D20, est de 63 %.
Exemple 9 synthèse du polymère (9) NH
HNNH3+,CI"
O NH
H H
N N
P O q s O T O ONa Indices et groupements : T= D,L-a-tocophérol, p = 11, q 121, s 88 Cinq grammes d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 de façon statistique avec de l'a-tocophérol racémique sont solubilisés dans 63 mL de NMP à 80 C.
Cette solution est refroidie à 0 C, et 2,38 mL de chloroformiate d'iso-butyle puis 2,02 mL de N-méthyl-morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 15 min à 0 C.
En parallèle, 4,93 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 62 mL
de NMP et 2,8 mL de triéthylamine sont ajoutés. La suspension obtenue est agitée quelques minutes à
C puis refroidie à 0 C. La suspension laiteuse de polymère activé est alors additionnée à cette suspension, et le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à 0 C, puis 4 h à 20 C. Après ajout de 1,04 mL d'une solution d'HCl 35 % puis 50 mL
d'eau, le 15 mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 500 mL d'eau acide (pH =
3), en maintenant le pH vers 3 - 4 avec une solution d'HCl 1 N. La solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 250 mL. Le pourcentage d'argininamide greffé, déterminé par RMN du proton dans D20, est de 55 %.
Exemple 10 : synthèse du polymère (10) NH
HN"k NH3+,Cl' O NH
O ONa O
H p N H
H2N N jN H s lq r O
~/OH
O T O N
H
Indices et groupements : T = D,L-a-tocophérol, p 11, q = 88, r = 48, s 73 Dix grammes d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'a-tocophérol racémique sont solubilisés dans 125 mL de NMP à 80 C.
Cette solution est refroidie à 0 C, et 5,6 mL de chloroformiate d'iso-butyle puis 4,8 mL de N-méthyl-morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 15 min à 0 C.
En parallèle, 7,4 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 93 mL de NMP, puis 4,7 mL de triéthylamine et 1,2 mL d'éthanolamine sont ajoutés. La suspension obtenue est agitée quelques minutes à 20 C puis refroidie à 0 C. La suspension laiteuse de polymére activé est alors additionnée à cette suspension, et le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à 0 C, puis une nuit à 20 C. Après ajout de 2,07 mL d'une solution d'HCl 35 % puis 200 mL d'eau, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 670 mL d'eau acidifiée à pH = 3 avec HCI, en maintenant le pH vers 3 avec une solution d'HCl 1 N. La solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 250 mL. Les pourcentages d'argininamide et d'éthanolamine greffés, déterminés par RMN du proton dans D20, sont respectivement de 40 et 22 %.
Exemple comparatif 11 : le composé Cl non fonctionnalisé par un groupement cationique Le composé comparatif C1 est le précurseur (sous sa forme anionique) du polyglutamate modifié par un groupement cationique, soit le polyglutamate de DP 220 greffé à
5% de façon statistique avec de la alpha-tocophérol racémique. Ce composé est obtenu par la méthode décrite dans la demande WO-A-03/104303.
Exemple 12 : Étude d'association de l'insuline On prépare une solution aqueuse contenant 10 mg de polymére par millilitre à
pH 7,4 et 200 UI d'insuline (7,4 mg). On laisse incuber les solutions pendant 2 h à
température ambiante et on sépare l'insuline libre de l'insuline associée par ultrafiltration (seuil à
100 kDa, 15 min sous 10000G à 18 C). L'insuline libre récupérée dans le filtrat est ensuite dosée par CLHP (Chromatographie Liquide Haute Performance) et l'on déduit la quantité d'insuline associée. Les résultats sont donnés dans le tableau 1 ci-dessous.
Polymère % association 3 100%
6 96%
8 100%
C1 99%
Les résultats démontrent que les polymères de l'invention sont capables d'associer fortement l'insuline pour donner des suspensions colloïdales de taille supérieure à
100 kDa et les taux d'association avec l'insuline sont très élevés. En comparaison avec le polymère C1, on constate que la présence de charges cationiques ne diminue pas le taux d'insuline associé.
Exemple 13 : mesure de la viscosité (mPa/s) sous cisaillement d'une solution aqueuse à 29 mg/g avec un gradient de vitesse de 10 s I
Exemple C 1 3 6 8 10 Viscosité 4720 6,6 4,5 5,8 4,7 Les résultats démontrent que les polymères de l'invention sont nettement moins visqueux que la référence C1 qui ne contient pas de groupements cationiques pendants.
Exemple 14 : Étude de solubilité en fonction du pH
Les résultats montrent que certains polymères de l'invention (exemples 9 et 10) présentent des propriétés de solubilité dépendantes du pH qui, contrairement au composé
Cl, leur permettent d'être formulés avec un principe actif à pH modérément acide (pH =
4) et de former un dépôt à pH physiologique (pH autour de 7).
Polymère pH = 4 pH physiologique 1 soluble soluble 2 soluble soluble 3 soluble soluble 4 soluble soluble 5 soluble soluble 6 insoluble soluble 7 soluble soluble 8 soluble soluble 9 soluble insoluble soluble insoluble C1 insoluble soluble Exemple 15 : Étude d'association d'un ARN thérapeutique On réalise des associations polymère/ARN en solution aqueuse en ajoutant des quantités croissantes de polymères (1), (3) (deux exemples de polymères de l'invention qui sont globalement cationiques à pH = 7,4) ou C1 à des quantités fixes d'un ARN
thérapeutique de 1433 nucléotides. Ces mélanges sont incubés 2 h à 37 C, puis analysés par électrophorèse sur gel d'agarose 1 % en conditions dénaturantes (révélation des ARN au bromure d'éthidium). De l'ARN seul sert de contrôle positif d'intégrité. De l'ARN incubé
avec des RNAses commerciales sert de contrôle d'ARN dégradé.
Les résultats montrent que lorsque l'ARN étudié a été incubé avec les polymères (1) ou (3), la quantité d'ARN qui migre à la taille attendue en électrophorèse diminue progressivement avec la quantité de polymère utilisé pour l'association et disparaît au delà
d'une certaine valeur sans apparition d'autres bandes. Au contraire, dans le mélange 5 réalisé avec le composé C1, la quantité d'ARN qui migre est inchangée, même en présence d'un large excès de polymère.
Dans un 2e temps, on ajoute sur l'ARN la quantité de polymère (1) ou (3) permettant de l'associer totalement (conditions où l'ARN n'est plus visible à la taille attendue sur gel) et on laisse ces mélanges incuber 2 h à 37 C. Après 2 h à 37 C, on ajoute sur ces mélanges 10 des quantités croissantes de composé C1 et on réalise une nouvelle incubation de 16 h à
37 C. Les mélanges obtenus sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose 1 % en conditions dénaturantes (révélation des ARN au bromure d'éthidium).
Les résultats montrent que l'on observe à la taille attendue des quantités croissantes d'ARN
en corrélation avec la quantité de polymère C 1 ajouté sur le mélange ARN/polymère (1) ou 15 (3).
Ces résultats montrent que certains polymères de l'invention, globalement cationiques à
pH = 7,4, permettent d'associer un ARN modèle de 1433 nucléotides et que cette association est réversible en présence d'un polymère globalement anionique. De plus, l'ARN formulé n'est pas dégradé.
Exemple 16: Étude du franchissement de la membrane cellulaire d'un oligonucléotide modèle On mélange dans du milieu Opti-MEM sans sérum de veau foetal un oligonucléotide d'ARN de 30 bases marqué au Cy3 à une quantité de polymère (3) ou (7) proche de la quantité minimale pour associer la totalité de l'oligonucléotide. Ce mélange est mis en contact sur des cellules d'hépatocarcinome humain Huh-7 cultivées en plaque 24 puits à
raison de 25 000 cellules/puits. Après 4 h d'incubation à 37 C, 5 % C02, on ajoute du milieu D-MEM à 20 % de sérum de veau foetal (SVF) de telle sorte que la concentration finale de SVF soit de 10 %. Après 24 h d'incubation des cellules en présence des mélanges oligonucléotide/polymère, les cellules sont lavées, marquées au niveau membranaire à la concanavaline biotinylée puis fixées 3 min avec du paraformaldéhyde à
3,7 %. Après 2 lavages avec du tampon PBS, les cellules sont incubées avec du DAPI
(ADN nucléaire) pendant 10 min, lavées 3 fois avec du PBS, puis incubées avec la streptavidine marquée avec l'Alexa Fluor 488 qui révèle la concanavaline biotinylée. Les cellules sont observées en microscopie confocale. La localisation des cellules est possible par observation de leur membrane marquée à l'Alexa Fluor 488 et de leur noyau marqué
au DAPI. L'entrée de l'oligonucléotide marqué au Cy3 dans la cellule est visualisée par observation de la fluorescence du Cy3 (excitation à 550 nm, émission à 570 nm).
Les résultats montrent que l'on retrouve de l'oligonucléotide marqué au Cy3 dans le cytoplasme des cellules Huh-7 quand l'oligonucléotide a été incubé sur les cellules en présence des polymères (3) ou (7).
En comparaison, quand on incube l'oligonucléotide seul, ou en présence du polymère C1, sur les cellules Huh-7, on n'observe pas la présence de l'oligonucléotide marqué dans les cellules.
Claims (18)
1. Polyaminoacides, ou leurs sels pharmaceutiquement acceptables, comprenant des résidus glutamiques, caractérisés en ce que certains des résidus glutamiques sont porteurs d'un groupement cationique pendant, qui, s'il est déprotonable, présente un pKa supérieur ou égal à 7, lesdits groupements cationiques étant identiques ou différents entre eux, et en ce que d'autres résidus glutamiques sont porteurs d'un groupement hydrophobe (GH) pendant, les groupements hydrophobes (GH) étant identiques ou différents entre eux, lesdits groupements cationiques utilisables correspondant à la formule suivante :
dans laquelle :
X = O, NH, Y = indépendamment un H ou un CH3, Z- = un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, L= un alkylène linéaire (C2 à C6) et éventuellement substitué par un groupe fonctionnel de type carboxyle ou dérivé, lesdits groupements hydrophobes (GH) étant choisis dans le groupe comprenant :
.cndot. les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome, .cndot. les alkylaryles ou arylalkyles en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome, .cndot. et les (poly)cycliques en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome.
dans laquelle :
X = O, NH, Y = indépendamment un H ou un CH3, Z- = un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, L= un alkylène linéaire (C2 à C6) et éventuellement substitué par un groupe fonctionnel de type carboxyle ou dérivé, lesdits groupements hydrophobes (GH) étant choisis dans le groupe comprenant :
.cndot. les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome, .cndot. les alkylaryles ou arylalkyles en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome, .cndot. et les (poly)cycliques en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome.
2. Polyaminoacides selon la revendication 1, caractérisés en ce que les groupements cationiques pendants sont greffés aux résidus glutamiques par l'intermédiaire d'une liaison amide ou ester.
3. Polyaminoacides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce qu'ils sont constitués d'homopolymères fonctionnalisés de L-glutamate ou d'acide L-glutamique liés dans le polyaminoacide par leur carboxyle en position alpha.
4. Polyaminoacides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce que les groupements cationiques pendants sont choisis dans le groupe de radicaux suivants :
où Ra représente un groupement hydroxy, alcoxy ou alkylamino, de préférence un groupement -OMe, -OEt, -NH2, -NHCH3 ou -N(CH3)2, et Z- représente un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure, ou -NH-(CH2)4-NH3+, Z-, -NH-(CH2)4-NH-C(=NH)-NH3+, Z-, -O-(CH2)2-N+(CH3)3, Z-, -O-(CH2)2-NH3+, Z-où Z- représente un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure.
où Ra représente un groupement hydroxy, alcoxy ou alkylamino, de préférence un groupement -OMe, -OEt, -NH2, -NHCH3 ou -N(CH3)2, et Z- représente un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure, ou -NH-(CH2)4-NH3+, Z-, -NH-(CH2)4-NH-C(=NH)-NH3+, Z-, -O-(CH2)2-N+(CH3)3, Z-, -O-(CH2)2-NH3+, Z-où Z- représente un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure.
5. Polyaminoacides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce qu'ils comportent en moyenne au moins 3 groupements hydrophobes (GH) par chaîne de polymère.
6. Polyaminoacides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce que encore d'autres résidus glutamiques sont porteurs d'un groupement non ionisable pendant, différent des groupements hydrophobes (GH), lesdits groupements non ionisables étant identiques ou différents entre eux.
7. Polyaminoacides selon la revendication 6, caractérisés en ce que ledit groupement non ionisable pendant est le radical hydroxyéthylamino-.
8. Polyaminoacides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce que encore d'autres résidus glutamiques sont porteurs d'un groupement non ionisé à pH neutre, différent des groupements hydrophobes (GH), lesdits groupements non ionisés à pH neutre étant identiques ou différents entre eux.
9. Polyaminocacides selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit groupement non ionisé à pH neutre répond à la formule suivante :
où -R10 est -H, -CO2H, ester d'alkyle (de préférence -COOMe ou -COOEt), -CH2OH, -C(=O)-NH2, -C(=O)-NH-CH3 ou -C(=O)-N(CH3)2.
où -R10 est -H, -CO2H, ester d'alkyle (de préférence -COOMe ou -COOEt), -CH2OH, -C(=O)-NH2, -C(=O)-NH-CH3 ou -C(=O)-N(CH3)2.
10. Polyaminoacides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce qu'ils sont porteurs d'au moins un greffon de type polyalkylène (de préférence éthylène) glycol lié à un résidu glutamate.
11. Polyaminoacides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule (I) suivante :
dans laquelle :
~ A représente indépendamment :
- RNH- dans lequel R représente un H, un alkyle linéaire en C2 à C10 , un alkyle ramifié en C3 à C10 ou un benzyle, - un résidu acide aminé terminal de formule :
dans laquelle -R7 est -OH, -OR9 ou -NHR10, et R8, R9 et R10 représentent indépendamment un H, un alkyle linéaire en C2 à C10, un alkyle ramifié en C3 à C10 ou un benzyle ;
~ B est une liaison directe, un groupement de liaison divalent, trivalent ou tétravalent, de préférence choisi parmi les radicaux suivants :
-O-, -NH-, -N(C1-5 alkyle)-, un résidu d'acide aminé (de préférence naturel), de diol, de triol, de diamine, de triamine, d'aminoalcool ou d'hydroxyacide comportant de 1 à 6 atomes de carbone ;
~ D représente un H, un acyle linéaire en C2 à C10, acyle ramifié en C3 à C10, ou un pyroglutamate ;
~ les groupements hydrophobes GH représentent chacun indépendamment les uns des autres un radical choisi parmi :
.cndot. les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), ou .cndot. les alkylaryles ou arylalkyles en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), ou .cndot. les (poly)cycliques en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S);
~ de préférence, ce radical est choisi dans le groupe suivant :
octyloxy-, dodécyloxy-, tétradécyloxy-, hexadécyloxy-, octadécyloxy-, 9-octadecenyloxy-, tocophéryloxy- ou cholestéryloxy-, B étant alors une liaison directe ;
~ R1 représente un radical choisi dans le groupe ayant les formules suivantes :
- -NH-(CH2)w-NH3+, Z- avec w compris entre 2 et 6, et de préférence w est égal à 4, - -NH-(CH2)4-NH-C(=NH)-NH3+, Z-, - -O-(CH2)2-NH3+, Z-, - -O-(CH2)2-N+(CH3)3, Z-, - un résidu d'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé de formule :
dans laquelle :
X est un atome d'oxygène ou un -NH-, R12 est H, alkyle linéaire en C2 à C10, alkyle ramifié en C3 à C10 ou benzyle, -R13 est -(CH2)4-NH3+, Z-, -(CH2)3-NH-C(=NH)-NH3+, Z-, -(CH2)3-NH3+, Z-;
dans lesquelles le contre-anion Z- est un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure ;
~ R3 représente un hydroxyéthylamino-, un résidu d'alkylène glycol, un polyoxyalkylène glycol ou un radical de formule :
où -R10 représente -H, -CO2H, un ester d'alkyle (de préférence -COOMe ou -COOEt), -CH2OH, -C(=O)-NH2, -C(=O)-NH-CH3 ou -C(=O)-N(CH3)2;
~ p, q, r et s sont des entiers positifs ;
~ (p)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements hydrophobes GH et varie de 2 à 99 % molaire, et de préférence entre 5 et 50 % sous condition que chaque chaîne de copolymère possède en moyenne au moins 3 greffons hydrophobes ;
~ (q)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements cationiques et varie de 1 à 99 % molaire ;
~ (p+q+r+s) varie de 10 à 1000, de préférence entre 30 et 500 ;
~ (r)/(p+q+r+s) varie de 0 à 98 % molaire ;
~ (s)/(p+q+r+s) varie de 0 à 98 % molaire ;
ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
dans laquelle :
~ A représente indépendamment :
- RNH- dans lequel R représente un H, un alkyle linéaire en C2 à C10 , un alkyle ramifié en C3 à C10 ou un benzyle, - un résidu acide aminé terminal de formule :
dans laquelle -R7 est -OH, -OR9 ou -NHR10, et R8, R9 et R10 représentent indépendamment un H, un alkyle linéaire en C2 à C10, un alkyle ramifié en C3 à C10 ou un benzyle ;
~ B est une liaison directe, un groupement de liaison divalent, trivalent ou tétravalent, de préférence choisi parmi les radicaux suivants :
-O-, -NH-, -N(C1-5 alkyle)-, un résidu d'acide aminé (de préférence naturel), de diol, de triol, de diamine, de triamine, d'aminoalcool ou d'hydroxyacide comportant de 1 à 6 atomes de carbone ;
~ D représente un H, un acyle linéaire en C2 à C10, acyle ramifié en C3 à C10, ou un pyroglutamate ;
~ les groupements hydrophobes GH représentent chacun indépendamment les uns des autres un radical choisi parmi :
.cndot. les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), ou .cndot. les alkylaryles ou arylalkyles en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), ou .cndot. les (poly)cycliques en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S);
~ de préférence, ce radical est choisi dans le groupe suivant :
octyloxy-, dodécyloxy-, tétradécyloxy-, hexadécyloxy-, octadécyloxy-, 9-octadecenyloxy-, tocophéryloxy- ou cholestéryloxy-, B étant alors une liaison directe ;
~ R1 représente un radical choisi dans le groupe ayant les formules suivantes :
- -NH-(CH2)w-NH3+, Z- avec w compris entre 2 et 6, et de préférence w est égal à 4, - -NH-(CH2)4-NH-C(=NH)-NH3+, Z-, - -O-(CH2)2-NH3+, Z-, - -O-(CH2)2-N+(CH3)3, Z-, - un résidu d'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé de formule :
dans laquelle :
X est un atome d'oxygène ou un -NH-, R12 est H, alkyle linéaire en C2 à C10, alkyle ramifié en C3 à C10 ou benzyle, -R13 est -(CH2)4-NH3+, Z-, -(CH2)3-NH-C(=NH)-NH3+, Z-, -(CH2)3-NH3+, Z-;
dans lesquelles le contre-anion Z- est un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure ;
~ R3 représente un hydroxyéthylamino-, un résidu d'alkylène glycol, un polyoxyalkylène glycol ou un radical de formule :
où -R10 représente -H, -CO2H, un ester d'alkyle (de préférence -COOMe ou -COOEt), -CH2OH, -C(=O)-NH2, -C(=O)-NH-CH3 ou -C(=O)-N(CH3)2;
~ p, q, r et s sont des entiers positifs ;
~ (p)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements hydrophobes GH et varie de 2 à 99 % molaire, et de préférence entre 5 et 50 % sous condition que chaque chaîne de copolymère possède en moyenne au moins 3 greffons hydrophobes ;
~ (q)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements cationiques et varie de 1 à 99 % molaire ;
~ (p+q+r+s) varie de 10 à 1000, de préférence entre 30 et 500 ;
~ (r)/(p+q+r+s) varie de 0 à 98 % molaire ;
~ (s)/(p+q+r+s) varie de 0 à 98 % molaire ;
ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
12. Composition pharmaceutique, cosmétique, diététique ou phytosanitaire comprenant au moins un polyaminoacide comprenant des résidus glutamiques modifié par un groupement cationique selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
13. Composition selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un principe actif.
14. Composition selon la revendication 13, caractérisée en ce que le principe actif est associé au(x) polyaminoacide(s) comprenant des résidus glutamiques modifié(s) par un groupement cationique par une ou plusieurs liaisons autre(s) qu'une (ou des) liaison(s) chimique(s) covalente(s).
15. Composition selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisée en ce que le principe actif est choisi dans le groupe comprenant l'ADN, un fragment d'ADN, un ARN et un oligo ARN.
16. Composition selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, caractérisée en ce qu'elle est une suspension colloïdale de nanoparticules et/ou de microparticules et/ou de micelles de polyaminoacide comprenant des résidus glutamiques modifié par un groupement cationique, dans une phase aqueuse ou huileuse.
17. Composition selon l'une quelconque des revendications 12 à 16, caractérisée en ce que la suspension est une solution colloïdale de nanoparticules dans une phase aqueuse à pH acide et qui précipite à pH physiologique.
18. Procédé de préparation de médicaments, en particulier pour administration orale, nasale, pulmonaire, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale ou intracérébrale, les principes actifs de ces médicaments pouvant être, notamment, des protéines, des glycoprotéines, des protéines liées à une ou plusieurs chaînes polyalkylèneglycol, des peptides, des polysaccharides, des liposaccharides, des oligonucléotides, des polynucléotides et des petites molécules organiques hydrophobes, hydrophiles ou amphiphiles ; et/ou des nutriments ; et/ou de produits cosmétiques ou phytosanitaires ; caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à mettre en oeuvre au moins l'un des polyaminoacides selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 et/ou la composition selon l'une quelconque des revendications 12 à 17.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EEER | Examination request | ||
| FZDE | Discontinued |
Effective date: 20151029 |