CN115975185A - 一种含多肽的可溶性微针贴及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含多肽的可溶性微针贴及其制备方法，用改性聚谷氨酸制备的凝胶微球吸附多肽，然后与水溶性高分子材料混合制备可溶性微针贴的针体。本发明解决了多肽稳定性差，容易失活的问题，用改性聚谷氨酸制备的凝胶微球可吸附多肽，在多肽周围形成保护屏障，减少失活损耗，以所述凝胶微球制得的可溶性微针贴，制备工艺简单，且高度保留了多肽的生物活性，稳定性好，微针针体容易透过皮肤屏障，在护肤美容方面具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及美容护肤微针贴制备技术领域，具体地，涉及一种含多肽的可溶性微针贴及其制备方法。
背景技术
多肽具有清除自由基、抗氧化功能、促进细胞增殖分化及细胞基质合成与分泌、加快表皮愈合、促进皮肤毛细血管网及小血管形成、美白祛斑抗衰老等多种生物学作用。凭借来源天然、功效显著、特异性、耐受性、高活性和低毒性的优点，近年来，越来越多的多肽类化合物被用于美容护肤领域，涵盖祛皱抗衰、祛痘修复、美白祛斑、舒缓抗敏、祛除眼袋或生发固发等。
目前，市面上现有的美容多肽产品仍存在稳定性差、渗透性差的问题。多肽在生物膜上的转运受到其亲水性的限制以及生物膜屏障结构的影响，在透皮给药的条件下发挥其应有的效果具有一定的难度，肽链越长越难以穿透皮肤屏障。市面上现有的多肽产品会通过减少肽链长度来提高其穿透性，这同时会舍弃不少肽链上发挥功效的部位，造成多肽功效性降低。
针对多肽皮肤渗透不理想的问题，可溶性多肽微针贴集注射给药和传统透皮给药的双重优势，微米级针头刺穿角质层并进入真皮层上层，避免与位于真皮层下层密布的血管和神经纤维接触；针体上含有的多肽功能性成分会随着微针的溶解释放，透过角质层屏障，被皮下组织吸收。快速起效、无痛无痕。
但是，目前的可溶性多肽微针贴，通常是将多肽直接添加到配方中，与基质进行简单的物理混合制备而成。多肽由于自身结构导致的稳定性差、容易降解的问题，没有得到根本性解决。
发明内容
为了解决现有技术中，多肽稳定性差、容易降解、难渗透的问题，本发明提供一种含多肽的可溶性微针贴及其制备方法，基于聚两性离子微球的可溶性微针贴可保持多肽的稳定性，提升多肽生物利用率。
本发明的第一个目的是提供一种聚谷氨酸的改性方法。
本发明的第二个目的是提供上述改性方法制得的改性聚谷氨酸。
本发明的第三个目的是提供上述改性聚谷氨酸在制备微球中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种制备凝胶微球的方法。
本发明的第五个目的是提供上述方法制得的凝胶微球。
本发明的第六个目的是提供上述凝胶微球在制备微针贴中的应用。
本发明的第七个目的是提供一种制备含有多肽的可溶性微针贴的方法。
本发明的第八个目的是提供上述方法制得的含有多肽的可溶性微针贴。
本发明的第九个目的是提供上述含有多肽的可溶性微针贴在制备美容护肤用品中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明通过碳二亚胺偶联剂实现磷酸胆碱两性离子基团对聚谷氨酸的修饰，进而微乳液交联形成聚两性离子凝胶微球用于负载多肽，其含有的两性离子基团具有优异的水合效应，可有效改善多肽稳定性。
一种聚谷氨酸的改性方法，包括以下步骤：
将聚谷氨酸的水溶液与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液充分反应，得到反应物；将反应物与甘油磷酰胆碱充分反应，得到反应液；透析反应液，干燥所得透析产物；
所述聚谷氨酸的羧基、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和甘油磷酰胆碱的摩尔比为1：(2～6)：(4～12)。
优选地，所述聚谷氨酸羧基、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和甘油磷酰胆碱的摩尔比为1：2：4。
优选地，将聚谷氨酸的水溶液加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液。
优选地，所述聚谷氨酸的水溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液反应的时间为6～12h。
更优选地，所述聚谷氨酸的水溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液反应的时间为8～10h。
进一步优选地，所述聚谷氨酸的水溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液反应的时间为8h。
优选地，所述反应物与甘油磷酰胆碱反应的时间为1～9h。
更优选地，所述反应物与甘油磷酰胆碱反应的时间为5h。
优选地，所述透析反应液的时长为1～4天。
更优选地，所述透析反应液的时长为2天。
优选地，所述透析为用去离子水透析。
优选地，所述干燥所得透析产物的方法为-70～-40℃冷冻干燥。
更优选地，所述干燥所得透析产物的方法为-50℃冷冻干燥。
优选地，所述干燥所得透析产物的时长为24～48h。
更优选地，所述干燥所得透析产物的时长为24h。
进一步优选地，所述干燥所得透析产物的方法为-50℃冷冻干燥24h。
上述改性方法制得的改性聚谷氨酸也应在本发明的保护范围之内。
上述改性聚谷氨酸在制备微球中的应用也应在本发明的保护范围之内。
一种制备凝胶微球的方法，包括以下步骤：
将上述改性聚谷氨酸的水溶液与与1,4-丁二醇缩水甘油醚充分混合，得到水相溶液；将十六烷基三甲基溴化铵、正丁醇和正己烷充分混合，得到油相溶液；将所得水相溶液和油相溶液充分混合，得到微乳液；透析微乳液，干燥所得透析产物；
所述上述改性聚谷氨酸的羧基与1,4-丁二醇缩水甘油醚的摩尔比为1：(1～4)；所述正丁醇和正己烷的体积比为1:(5～10)；所述水相溶液、油相溶液和十六烷基三甲基溴化铵的体积质量比为1mL:(4～10)mL:(1～6)g。
优选地，所述上述改性聚谷氨酸的水溶液的浓度为100～300mg/mL。
更优选地，所述上述改性聚谷氨酸的水溶液的浓度为200mg/mL。
优选地，所述上述改性聚谷氨酸的羧基与1,4-丁二醇缩水甘油醚的摩尔比为1：2。
优选地，将1,4-丁二醇缩水甘油醚加入上述改性聚谷氨酸的水溶液。
优选地，所述正丁醇和正己烷的体积比为1:5。
优选地，所述水相溶液、油相溶液和十六烷基三甲基溴化铵的体积质量比为1mL:4mL:2g。
优选地，将水相溶液加入油相溶液。
优选地，所述将水相溶液与油相溶液充分混合的方法为30～50℃搅拌1～3h。
更优选地，所述将水相溶液与油相溶液充分混合的方法为40℃搅拌2h。
优选地，所述透析微乳液的时长为1～4天。
更优选地，所述透析微乳液的时长为3天。
优选地，所述透析为用去离子水透析。
优选地，所述干燥所得透析产物的方法为-70～-40℃冷冻干燥。
更优选地，所述干燥所得透析产物的方法为-50℃冷冻干燥。
优选地，所述干燥所得透析产物的时长为24～48h。
更优选地，所述干燥所得透析产物的时长为24h。
进一步优选地，所述干燥所得透析产物的方法为-50℃冷冻干燥24h。
上述方法制得的凝胶微球应在本发明的保护范围之内。
上述凝胶微球在制备微针贴中的应用也应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述应用为保护多肽在微针贴中的活性。
一种制备含有多肽的可溶性微针贴的方法，包括以下步骤：
将负载多肽的上述凝胶微球的水溶液与水溶性高分子材料的水溶液充分混合，得到针体溶液；将所得针体溶液和微针基底液依次于模具中固化成型；脱模；
所述水溶性高分子材料为聚谷氨酸、透明质酸或羧甲基纤维素中的一种或几种；
所述负载多肽的上述凝胶微球与水溶性高分子材料的质量比为1：(0.5～1.5)；
所述微针基底液为含有聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇的水溶液，所述聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和水的质量体积比为1g：(0.5～1.5)g：(8～12)mL。
优选地，所述多肽与上述凝胶微球的质量比为1：(50～100)。
更优选地，所述多肽与上述凝胶微球的质量比为1：100。
优选地，所述负载多肽的上述凝胶微球的制备方法为：用上述凝胶微球充分吸附多肽。
更优选地，所述负载多肽的上述凝胶微球的制备方法为：将上述凝胶微球于多肽的水溶液中吸附多肽20～30h；所述多肽与上述凝胶微球的质量比为1：(50～100)。
进一步优选地，所述负载多肽的上述凝胶微球的制备方法为：将上述凝胶微球于多肽的水溶液中吸附多肽24h；所述多肽与上述凝胶微球的质量比为1：(50～100)。
进一步优选地，所述负载多肽的上述凝胶微球的制备方法为：将上述凝胶微球于多肽的水溶液中吸附多肽20～30h；所述多肽与上述凝胶微球的质量比为1：100。
更进一步优选地，所述负载多肽的上述凝胶微球的制备方法为：将上述凝胶微球于多肽的水溶液中吸附多肽24h；所述多肽与上述凝胶微球的质量比为1：100。
本发明对多肽没有限定。优选地，所述多肽为寡肽-1、寡肽-2、寡肽-3、寡肽-4、寡肽-5、寡肽-6、寡肽-29、寡肽-32、酵母菌多肽类、大豆肽、抗坏血酸多肽、乙酰基多肽或棕榈酰多肽中的一种或几种；
更优选地，所述多肽为寡肽-4和/或大豆肽。
进一步优选地，所述多肽为寡肽-4。
优选地，所述水溶性高分子材料为聚谷氨酸。
更优选地，所述负载多肽的上述凝胶微球与聚谷氨酸的质量比为1：1。
优选地，所述聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和水的质量体积比为1g：1g：10mL。
更优选地，所述微针基底液的制备方法为将述聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和水按照质量体积比1g：1g：10mL混合，90℃搅拌3h。
优选地，所述聚乙烯吡咯烷酮的分子量为5～10wDa；所述聚乙烯醇的分子量为5～10wDa。
更优选地，所述聚乙烯吡咯烷酮的分子量为8wDa；所述聚乙烯醇的分子量为8wDa。
优选地，所述将所得针体溶液和微针基底液依次于模具中固化成型，包括以下步骤：将针体溶液倒入模具中，5～18℃，3500rpm～6500rpm离心1.5h～2.5h；18～28℃干燥5～10h，得到针体；将微针基底液倒入模具中，20～30℃3500rpm～6500rpm离心0.5h～1.5h；15～35℃干燥8～18h。
更优选地，所述将所得针体溶液和微针基底液依次于模具中固化成型，包括以下步骤：将针体溶液倒入模具中，10℃，4500rpm离心2h，20℃干燥8h，得到针体；将微针基底液倒入模具中，25℃4000rpm离心0.5h，25℃干燥10h。
本发明对模具的规格没有限定，任何可用于制备微针针体和/或微针基底的模具均可实现本发明的目的。
优选地，所述针体模具呈四棱锥形或圆锥形，针体高度为250～450μm，底面边长为50～250μm，针尖的直径为0.5～2.5μm，针尖的间距为550～750μm。
更优选地，所述针体模具呈圆锥形，针体高度为400μm，底面边长为200μm，针尖的直径为1μm，针尖的间距为600μm。
上述方法制得的含有多肽的可溶性微针贴也应在本发明的保护范围之内。
上述含有多肽的可溶性微针贴在美容护肤领域中的应用也应在本发明的保护范围之内。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明解决了多肽稳定性差，容易失活的问题，用改性聚谷氨酸制备的凝胶微球可吸附多肽，在多肽周围形成保护屏障，减少失活损耗，以所述凝胶微球制得的可溶性微针贴，制备工艺简单，且高度保留了多肽的生物活性，稳定性好，微针针体容易透过皮肤屏障，在护肤美容方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为含多肽的可溶性微针贴的结构示意图。
图2为实施例1制得的含寡肽-4的的可溶性微针贴的扫描电镜照片。
图3为实施例4制得的含大豆肽的可溶性微针贴的扫描电镜照片。
图4为实施例1制得的含寡肽-4的可溶性微针贴的自由基清除率；A为没有聚两性离子凝胶微球的含寡肽-4的可溶性微针贴；B为有聚两性离子凝胶微球的含寡肽-4的可溶性微针贴。
图5为实施例2制得的含寡肽-4的可溶性微针贴的自由基清除率；A为没有聚两性离子凝胶微球的含寡肽-4的可溶性微针贴；B为有聚两性离子凝胶微球的含寡肽-4的可溶性微针贴。
图6为实施例3制得的含寡肽-4的可溶性微针贴的自由基清除率；A为没有聚两性离子凝胶微球的含寡肽-4的可溶性微针贴；B为有聚两性离子凝胶微球的含寡肽-4的可溶性微针贴。
图7为实施例4制得的含大豆肽的可溶性微针贴的自由基清除率；A为没有聚两性离子凝胶微球的含大豆肽的可溶性微针贴；B为有聚两性离子凝胶微球的含大豆肽的可溶性微针贴。
图8为实施例1制得的含寡肽-4的可溶性微针贴的疗效对比图；A为使用可溶性微针贴片前的皮肤情况；B为使用可溶性微针贴片24h后的皮肤情况。
图9为实施例4制得的含大豆肽的可溶性微针贴的疗效对比图；A为使用可溶性微针贴片前的皮肤情况；B为使用可溶性微针贴片24h后的皮肤情况。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1一种含寡肽-4的可溶性微针贴的制备
含多肽的可溶性微针贴的结构示意图如图1所示，微针贴包括微针基底和微针针体，微针针体中分散有负载多肽的两性离子改性聚谷氨酸微球。所述两性离子改性聚谷氨酸微球也称为聚两性离子凝胶微球。
具体制备步骤如下：
1、聚谷氨酸的改性
(1)将2g聚谷氨酸溶于10mL去离子水中，得到200mg/mL聚谷氨酸水溶液；将5mL200mg/mL聚谷氨酸水溶液缓慢加入10mL 0.26g/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDAC)溶液中(聚谷氨酸的-COOH与EDAC的摩尔比为1:2)，反应8h。
(2)将上一步所得溶液与10mL 0.7g/mL甘油磷酰胆碱(GPC)混合(聚谷氨酸的-COOH与GPC的摩尔比为1:4)，反应5h，得到反应液。
(3)用去离子水透析反应液2天，所得透析产物在-50℃冷冻干燥24h，即得到磷酰胆碱化聚谷氨酸(PC-PGA)。
2、聚两性离子凝胶微球的制备
(1)用水将上一步所得PC-PGA配制成1mL 200mg/mL PC-PGA水溶液；向PC-PGA水溶液中缓慢滴入1mL 0.6g/mL 1,4-丁二醇缩水甘油醚(BDDE)(聚谷氨酸的-COOH与BDDE的摩尔比为1:2)，形成水相溶液。
(2)将4g十六烷基三甲基溴化铵缓慢加入到1mL正丁醇和7mL正己烷的混合溶液中，搅拌1h，得到油相溶液。
(3)将所得水相溶液缓慢加入到所得油相溶液中，40℃下搅拌2h，得到微乳液。
(4)用去离子水透析微乳液3天后，所得透析产物在-50℃冷冻干燥24h，得到磷酰胆碱化聚谷氨酸凝胶微球(PC-PGA-MG)，即聚两性离子凝胶微球，。
3、寡肽-4-聚两性离子凝胶微球的制备
将1g PC-PGA-MG浸泡在10mL 1mg/mL寡肽-4溶液中，寡肽-4(《化妆品原料目录(2021年版)》INCI号：OLIGOPEPTIDE-4)与PC-PGA-MG的质量比为0.1：10；PC-PGA-MG吸附寡肽-4 24h后，即得到寡肽-4-聚两性离子凝胶微球。
4、含寡肽-4的可溶性微针贴的制备
(1)将2g寡肽-4-聚两性离子凝胶微球溶于10mL去离子水中，得到200mg/mL寡肽-4-聚两性离子凝胶微球水溶液；将1mL 200mg/mL寡肽-4-聚两性离子凝胶微球水溶液与1mL200mg/mL聚谷氨酸水溶液混合均匀，得到针体溶液。
(2)将针体溶液倒入四棱锥形微针模具中，10℃、4500rmp离心2h，在20℃下干燥8h成型，得到针体。
(3)将1g聚乙烯吡咯烷酮(PVP，分子量8wDa)与1g聚乙烯醇(PVA，分子量8wDa)加入10mL水中，90℃搅拌3h，得到PVP-PVA复配基座溶液。
(4)将PVP-PVA复配基座溶液倒入四棱锥微针成型模具中，25℃、4000rmp离心0.5h，25℃干燥10h，脱模，得到含寡肽-4的可溶性微针贴。
实施例2一种含寡肽-4的可溶性微针贴的制备
1、聚谷氨酸的改性
(1)将2g聚谷氨酸溶于10mL去离子水中，得到200mg/mL聚谷氨酸水溶液；将0.5mL200mg/mL聚谷氨酸溶液缓慢加入1mL 0.4g/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚-盐酸盐(EDAC)溶液中(聚谷氨酸的-COOH与EDAC的摩尔比为1:3)，反应10h。
(2)将上一步所得溶液与1mL 0.9g/mL甘油磷酰胆碱(GPC)混合(聚谷氨酸的-COOH与GP的摩尔比为1:5)，反应6h，得到反应液。
(3)用去离子水透析反应液3天，然后在-60℃冷冻干燥12h，得到磷酰胆碱化聚谷氨酸(PC-PGA)。
2、聚两性离子凝胶微球的制备
(1)用水将上一步所得PC-PGA配制成0.5mL 200mg/mL PC-PGA水溶液，向PC-PGA水溶液中缓慢滴加0.5mL 0.8g/mL 1,4-丁二醇缩水甘油醚(BDDE)(聚谷氨酸的-COOH与BDDE的摩尔比为1:3)形成水相溶液。
(2)将6g十六烷基三甲基溴化铵缓慢加入到1mL正丁醇和9mL正己烷的混合溶液中，搅拌1h，得到油相溶液。
(3)将所得水相溶液缓慢加入到所得油相溶液中，40℃下搅拌2h，得到微乳液。
(4)用去离子水透析微乳液2天后，所得透析产物在-45℃冷冻干燥48h，得到磷酰胆碱化聚谷氨酸凝胶微球(PC-PGA-MG)，即聚两性离子凝胶微球。
3、寡肽-4-聚两性离子凝胶微球的制备
将1g PC-PGA-MG浸泡在10mL 2mg/mL寡肽-4溶液中，寡肽-4(《化妆品原料目录(2021年版)》INCI号：OLIGOPEPTIDE-4)与PC-PGA-MG的质量比为1:50；PC-PGA-MG吸附寡肽-4 24h后，即得到寡肽-4-聚两性离子凝胶微球。
4、含寡肽-4的可溶性微针贴的制备
(1)将3g寡肽-4-聚两性离子凝胶微球溶于10mL去离子水中，得到300mg/mL寡肽-4-聚两性离子凝胶微球水溶液；将1mL 300mg/mL寡肽-4-凝胶微球水溶液与1mL 300mg/mL聚谷氨酸水溶液混合均匀，得到针体溶液。
(2)将针体溶液倒入圆锥形微针模具中，15℃、6000rmp离心2.5h，在25℃下干燥7h成型，得到针体。
(3)将1g聚乙烯吡咯烷酮(PVP，分子量8wDa)与1g聚乙烯醇(PVA，分子量8wDa)加入12mL水中，92℃搅拌2h，得到PVP-PVA复配基座溶液。
(4)将PVP-PVA复配基座溶液倒入四棱锥微针成型模具中，25℃、6000rmp离心1h，20℃真空干燥15h，脱模，得到含寡肽-4的可溶性微针贴。
实施例3一种含寡肽-4的可溶性微针贴的制备
1、聚谷氨酸的改性
(1)将2g聚谷氨酸溶于10mL去离子水中，得到200mg/mL聚谷氨酸水溶液；将0.5mL200mg/mL聚谷氨酸溶液缓慢加入1mL 0.7g/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚-盐酸盐(EDAC)溶液中(聚谷氨酸的-COOH与EDAC的摩尔比为1:5)，反应10h。
(2)将上一步所得溶液与1mL 1g/mL甘油磷酰胆碱(GPC)混合(聚谷氨酸的-COOH与GP的摩尔比为1:6)，反应6h，得到反应液。
(3)用去离子水透析反应液3天，然后在-60℃冷冻干燥12h，得到磷酰胆碱化聚谷氨酸(PC-PGA)。
2、聚两性离子凝胶微球的制备
(1)用水将上一步所得PC-PGA配制成0.5mL 200mg/mL PC-PGA水溶液，向PC-PGA水溶液中缓慢滴加0.5mL 0.2g/mL 1,4-丁二醇缩水甘油醚(BDDE)(聚谷氨酸的-COOH与BDDE的摩尔比为1:4)形成水相溶液。
(2)将6g十六烷基三甲基溴化铵缓慢加入到1mL正丁醇和9mL正己烷的混合溶液中，搅拌1h，得到油相溶液。
(3)将所得水相溶液缓慢加入到所得油相溶液中，40℃下搅拌2h，得到微乳液。
(4)用去离子水透析微乳液2天后，所得透析产物在-45℃冷冻干燥48h，得到磷酰胆碱化聚谷氨酸凝胶微球(PC-PGA-MG)，即聚两性离子凝胶微球。
3、寡肽-4-聚两性离子凝胶微球的制备
将1g PC-PGA-MG浸泡在10mL 2mg/mL寡肽-4溶液中，寡肽-4(《化妆品原料目录(2021年版)》INCI号：OLIGOPEPTIDE-4)与PC-PGA-MG的质量比为1:50；PC-PGA-MG吸附寡肽-4 24h后，即得到寡肽-4-聚两性离子凝胶微球。
4、含寡肽-4的可溶性微针贴的制备
(1)将3g寡肽-4-聚两性离子凝胶微球溶于10mL去离子水中，得到300mg/mL寡肽-4-聚两性离子凝胶微球水溶液；将1mL 300mg/mL寡肽-4-凝胶微球水溶液与1mL 300mg/mL聚谷氨酸水溶液混合均匀，得到针体溶液。
(2)将针体溶液倒入圆锥形微针模具中，15℃、6000rmp离心2.5h，在25℃下干燥7h成型，得到针体。
(3)将1g聚乙烯吡咯烷酮(PVP，分子量8wDa)与1g聚乙烯醇(PVA，分子量8wDa)加入12mL水中，92℃搅拌2h，得到PVP-PVA复配基座溶液。
(4)将PVP-PVA复配基座溶液倒入四棱锥微针成型模具中，25℃、6000rmp离心1h，20℃真空干燥15h，脱模，得到含寡肽-4的可溶性微针贴。
实施例4一种含大豆肽的可溶性微针贴的制备
1、聚谷氨酸的改性
(1)将2g聚谷氨酸溶于10mL去离子水中，得到200mg/mL聚谷氨酸水溶液；将5mL200mg/mL聚谷氨酸水溶液缓慢加入10mL 0.26g/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDAC)溶液中(聚谷氨酸的-COOH与EDAC的摩尔比为1:2)，反应8h。
(2)将上一步所得溶液与10mL 0.7g/mL甘油磷酰胆碱(GPC)混合(聚谷氨酸的-COOH与GPC的摩尔比为1:4)，反应5h，得到反应液。
(3)用去离子水透析反应液2天，所得透析产物在-50℃冷冻干燥24h，即得到磷酰胆碱化聚谷氨酸(PC-PGA)。
2、聚两性离子凝胶微球的制备
(1)用水将上一步所得PC-PGA配制成1mL 200mg/mL PC-PGA水溶液；向PC-PGA水溶液中缓慢滴入1mL 0.6g/mL 1,4-丁二醇缩水甘油醚(BDDE)(聚谷氨酸的-COOH与BDDE的摩尔比为1:2)，形成水相溶液。
(2)将4g十六烷基三甲基溴化铵缓慢加入到1mL正丁醇和7mL正己烷的混合溶液中，搅拌1h，得到油相溶液。
(3)将所得水相溶液缓慢加入到所得油相溶液中，40℃下搅拌2h，得到微乳液。
(4)用去离子水透析微乳液3天后，所得透析产物在-50℃冷冻干燥24h，得到磷酰胆碱化聚谷氨酸凝胶微球(PC-PGA-MG)，即聚两性离子凝胶微球。
3、大豆肽-聚两性离子凝胶微球的制备
将1g PC-PGA-MG浸泡在10mL 1mg/mL大豆肽溶液中，大豆肽(《化妆品原料目录(2021年版)》INCI号：GLYCINE MAX(SOYBEAN)POLYPEPTIDE)与PC-PGA-MG的质量比为0.1：10；PC-PGA-MG吸附大豆肽24h后，即得到大豆肽-聚两性离子凝胶微球。
4、含大豆肽的可溶性微针贴的制备
(1)将2g大豆肽-聚两性离子凝胶微球溶于10mL去离子水中，得到200mg/mL大豆肽-聚两性离子凝胶微球水溶液；将1mL 200mg/mL大豆肽-聚两性离子凝胶微球水溶液与1mL 200mg/mL聚谷氨酸水溶液混合均匀，得到针体溶液。
(2)将针体溶液倒入四棱锥形微针模具中，10℃、4500rmp离心2h，在20℃下干燥8h成型，得到针体。
(3)将1g聚乙烯吡咯烷酮(PVP，分子量8w)与1g聚乙烯醇(PVA，分子量8w)加入10mL水中，90℃搅拌3h，得到PVP-PVA复配基座溶液。
(4)将PVP-PVA复配基座溶液倒入四棱锥微针成型模具中，25℃、4000rmp离心0.5h，25℃干燥10h，脱模，得到含大豆肽的可溶性微针贴。
实施例5含多肽的可溶性微针贴的形态观察
1、实验方法
按照实施例1～3的方法制备得到含寡肽-4的可溶性微针贴，按照实施例2的方法制备得到含大豆肽的可溶性微针贴。
用扫描电镜观察两种可溶性微针贴的形态，具体步骤如下：
(1)取出含寡肽-4的可溶性微针贴(实施例1～3)和含大豆肽的可溶性微针贴(实施例2)，剪取合适大小贴在铜台表面。
(2)将铜台表面的贴片进行喷金处理。
(3)在扫描电镜下观察并拍摄。
2、实验结果
如图2所示，实施例1制得的含寡肽-4的可溶性微针贴的针体为圆锥形，针体高度为400μm，针体底面边长为200μm，针尖的直径为1μm，针尖的间距为600μm，头部尖锐，表面光滑。实施例2～3制得的含寡肽-4的可溶性微针贴有相同的形态。
如图3所示，实施例2制得的含大豆肽的可溶性微针贴的针体为四棱锥形状，针体高度300μm，针体底面边长为100μm，针尖的直径为2μm，针尖的间距为700μm，头部尖锐，表面光滑。
实施例6可溶性微针贴中寡肽-4活性的测定
一、实验方法
1、参照实施例1中的步骤4，直接用1mL 300mg/mL寡肽-4溶液与1mL300mg/mL聚谷氨酸水溶液制备得到针体溶液，并采用相同的方法制备得到没有聚两性离子凝胶微球的含寡肽-4的可溶性微针贴A；按照实施例1的方法制备得到有聚两性离子凝胶微球的含寡肽-4的可溶性微针贴B。
采用ABTS(2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)法测定可溶性微针贴A和可溶性微针贴B中寡肽-4对自由基的清除效率，具体步骤如下：
(1)将384mg的2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、662mg过硫酸钾分别溶于10mL去离子水中，得到ABTS溶液和过硫酸钾溶液。
(2)将ABTS溶液和过硫酸钾溶液以1:1的体积比混合均匀，得到混合液；避光放置20h后，按照体积比混合液：PBS缓冲液＝1:1混合均匀，得到反应液。
(3)分别取0.1mg可溶性微针贴A和0.1mg可溶性微针贴B，在湿度40％室温(20℃～25℃)保存30天。
(4)存放结束后，将可溶性微针贴A溶于10mL去离子水中得到检测液A，将可溶性微针贴B溶于10mL去离子水中得到检测液B。
(5)取0.1mg寡肽-4溶于10mL去离子水中，作为对照液。
(6)将检测液A、检测液B和对照液分别与反应液等体积混合，室温反应20min。
(7)在734nm下测定各溶液的吸光度，计算检测液中ABTS+自由基清除率，计算公式为：
其中A0为对照液的吸光度；A1为检测液的吸光度。
2、按照上述方法，检测实施例2～3的方法制得的含寡肽-4的可溶性微针贴对自由基的清除效率。
二、实验结果
如图4所示，室温保存30天后，不含有聚两性离子凝胶微球的可溶性微针贴A中，寡肽-4对自由基的清除率仅为26％，而实施例1制得的含有聚两性离子凝胶微球的可溶性微针贴中寡肽-4的自由基清除率为96％。
如图5所示，室温保存30天后，不含有聚两性离子凝胶微球的可溶性微针贴A中，寡肽-4对自由基的清除率仅为26％，而实施例2制得的含有聚两性离子凝胶微球的可溶性微针贴中寡肽-4的自由基清除率为94％。
如图6所示，室温保存30天后，不含有聚两性离子凝胶微球的可溶性微针贴A中，寡肽-4对自由基的清除率仅为25％，而实施例3制得的含有聚两性离子凝胶微球的可溶性微针贴中寡肽-4的自由基清除率为92％。
以上结果表明，聚两性离子凝胶微球高度保留了可溶性微针贴中寡肽-4的生物活性。
实施例7可溶性微针贴中大豆肽活性的测定
1、实验方法
参照实施例4中的步骤4，直接用1mL 200mg/mL大豆肽溶液与1mL 200mg/mL聚谷氨酸水溶液制备得到针体溶液，并采用相同的方法制备得到没有聚两性离子凝胶微球的含大豆肽的可溶性微针贴A；按照实施例1的方法制备得到有聚两性离子凝胶微球的含大豆肽的可溶性微针贴B。
采用ABTS(2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)法测定可溶性微针贴A和可溶性微针贴B中大豆肽对自由基的清除效率，具体步骤如下：
(1)将384mg的2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、662mg过硫酸钾分别溶于10mL去离子水中，得到ABTS溶液和过硫酸钾溶液。
(2)将ABTS溶液和过硫酸钾溶液以1:1的体积比混合均匀，得到混合液，避光放置20h后，按照体积比混合液：PBS缓冲液＝1:1混合均匀，得到反应液。
(3)分别取0.1mg可溶性微针贴A和0.1mg可溶性微针贴B，在湿度40％室温(20℃～25℃)保存30天。
(4)存放结束后，将可溶性微针贴A溶于10mL去离子水中得到检测液A，将可溶性微针贴B溶于10mL去离子水中得到检测液B。
(5)取0.1mg大豆肽溶于10mL去离子水中，作为对照液。
(6)将检测液A、检测液B和对照液分别与反应液等体积混合，室温反应20min。
(7)在734nm下测定各溶液的吸光度，计算检测液中ABTS+自由基清除率，计算公式为：
其中A0为对照液的吸光度；A1为检测液的吸光度。
2、实验结果
如图7所示，室温保存30天后，不含有聚两性离子凝胶微球的可溶性微针贴A中，大豆肽对自由基的清除率仅为31％，而实施例1制得的含有聚两性离子凝胶微球的可溶性微针贴B中，大豆肽对自由基清除率为93％。
以上结果表明，聚两性离子凝胶微球高度保留了可溶性微针贴中大豆肽的生物活性。
综上所述，本发明提供的制备方法中，聚谷氨酸经两性离子甘油磷酰胆碱(GPC)改性后，经交联剂1,4-丁二醇缩水甘油醚(BDDE)交联而得的聚两性离子凝胶微球，可以吸附多肽、在多肽外层形成保护膜，在后续的制备过程中保护多肽不受外界因素影响，制得的可溶性微针贴含有大量具有活性的多肽，起到良好的抗氧化作用。
实施例8含寡肽-4的可溶性微针贴的使用功效
1、实验方法
(1)受试者信息
人数：30人，男女各50％；
年龄：18～35岁；
皮肤状况：面部都有痤疮。
(2)微针贴
实施例1制备的含寡肽-4的可溶性微针贴。
(3)试用方法
洁面后擦干脸部水分，将微针贴贴于脸部痤疮处，按压刺入皮肤中；2个小时后摘除，每天1次，连续使用3天。
(4)使用效果测定
使用前后，对受试者的脸部痤疮情况进行观察评分，并拍照记录。
评分标准如下：
痤疮红肿有脓液，轻触有痛感，记为1分；痤疮红肿面积缩小，触碰痛感减轻，记为2分；痤疮干瘪，不泛红无脓液无痛感，记为3分；痤疮消退，有明显痘印，记为4分；痤疮消退，基本无痘印，记为5分。
治愈率(％)＝评分为“5分”的人数÷受试者总人数×100％。
2、实验结果
使用前后，受试者脸部痤疮情况统计如表1所示。
表1人体祛痘功效评价
如表1所示，连续使用实施例1制备的含寡肽-4的可溶性微针贴3天后，绝大部分受试者的脸部痤疮得以治愈。
如图8中的A所示，使用前，受试者脸上有明显红肿突起的痤疮；如图8中的B所示，按规定使用实施例1制备的含寡肽-4的可溶性微针贴3天后，受试者脸部的痤疮完全消失，炎症明显得到改善。
以上结果表明，本发明提供的含有寡肽-4的可溶性微针贴的微针针体容易透过皮肤屏障，使寡肽-4释放至皮肤深层，快速发挥抗氧化、抗炎和抗菌的效果，可用于日常祛痘护肤。
实施例9含大豆肽的可溶性微针贴的人体功效评价
1、实验方法
(1)受试者信息
人数：30人，男女各50％；
年龄：35～55岁；
皮肤状况：面部都有皱纹。
(2)微针贴片：实施例4制备的含大豆肽的可溶性微针贴。
(3)试用方法：
洁面后擦干脸部水分，将微针贴贴于脸部皱纹处，按压刺入皮肤中；2个小时后摘除，每天1次，连续使用3天。
(4)使用效果测定
使用前后，对受试者的脸部皱纹情况进行观察，并拍照记录。
如图9中的A所示，使用前，受试者脸上有明显皱纹；如图9中的B所示，按规定使用微针贴3天后，受试者脸部的部分细纹淡化，整体皱纹情况明显得到改善。
以上结果表面，本发明提供的含有大豆肽的可溶性微针贴的微针针体容易透过皮肤屏障，使大豆肽释放至皮肤深层，可达到抗老抗皱效果，可以用于日常抗氧化、抗皱及防衰。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种聚谷氨酸的改性方法，其特征在于，包括以下步骤：
将聚谷氨酸的水溶液与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液充分反应，得到反应物；将反应物与甘油磷酰胆碱充分反应，得到反应液；透析反应液，干燥所得透析产物；
所述聚谷氨酸的羧基、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和甘油磷酰胆碱的摩尔比为1：(2～6)：(4～12)。
2.权利要求1所述改性方法制得的改性聚谷氨酸。
3.权利要求2所述改性聚谷氨酸在制备微球中的应用。
4.一种制备凝胶微球的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求2所述改性聚谷氨酸的水溶液与1,4-丁二醇缩水甘油醚充分混合，得到水相溶液；将十六烷基三甲基溴化铵、正丁醇和正己烷充分混合，得到油相溶液；将所得水相溶液和油相溶液充分混合，得到微乳液；透析微乳液，干燥所得透析产物；
所述权利要求2所述改性聚谷氨酸的羧基与1,4-丁二醇缩水甘油醚的摩尔比为1：(1～4)；所述正丁醇和正己烷的体积比为1:(5～10)；所述水相溶液、油相溶液和十六烷基三甲基溴化铵的体积质量比为1mL:(4～10)mL:(1～6)g。
5.权利要求4所述方法制得的凝胶微球。
6.权利要求5所述凝胶微球在制备微针贴中的应用。
7.一种制备含有多肽的可溶性微针贴的方法，其特征在于，包括以下步骤：将负载多肽的权利要求5所述凝胶微球与水溶性高分子材料的水溶液充分混合，得到针体溶液；将所得针体溶液和微针基底液依次于模具中固化成型；脱模；
所述水溶性高分子材料为聚谷氨酸、透明质酸或羧甲基纤维素中的一种或几种；
所述负载多肽的权利要求5所述凝胶微球与水溶性高分子材料的质量比为1：(0.5～1.5)；
所述微针基底液为含有聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇的水溶液，所述聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和水的质量体积比为1g：(0.5～1.5)g：(8～12)mL。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述多肽与权利要求5所述凝胶微球的质量比为1：(50～100)。
9.权利要求7～8任一所述方法制得的含有多肽的可溶性微针贴。
10.权利要求9所述含有多肽的可溶性微针贴在制备美容护肤用品中的应用。
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