CN102159189A - 用于药物递送的纳米载体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有内部和外部的纳米载体，所述纳米载体包含至少一种缀合物，其中每一缀合物包含聚乙二醇(PEG)聚合物。每一缀合物还包含至少两个两亲性化合物，其同时具有亲水面和疏水面。另外，每一缀合物包含寡聚物，其中所述两亲性化合物中的至少两个与共价连接至所述PEG的寡聚物共价连接。所述纳米载体使得每一缀合物在水性溶剂中自组装形成纳米载体，使得由于每一两亲性化合物的疏水面彼此相对的取向而在所述纳米载体内部形成疏水口袋，并且其中每一缀合物中的PEG在所述纳米载体的外部自组装。

Description

用于药物递送的纳米载体
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年9月23日提交的美国临时专利申请No.61/099,272的优先权，其全文并入本文用于所有目的。
对在联邦政府资助之研究和开发下进行的发明之权利的声明
本发明在国立癌症研究所和国立卫生研究院所给予的政府支持(资助号No.R01CA115483)下进行。政府对本发明拥有某些权利。
背景技术
紫杉醇(paclitaxel)
Figure BPA00001331520200011
对于许多癌症类型(例如卵巢癌、乳腺癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌)来说是标准且有效的化疗剂。由于紫杉醇非常难溶于水，因此该药物的制备需要Cremophor EL，而后者引起严重的副作用(例如过敏反应)。接受紫杉醇(Paclitaxel，PTX)的患者需要预先给予组胺阻断剂和类固醇。
Figure BPA00001331520200012
是一种较新的紫杉醇制剂，其此类副作用较少，是最先被FDA批准的纳米治疗剂之一。其由载有紫杉醇的人血清白蛋白纳米颗粒(～130nm)组成。但是，由于其尺寸相对大，Abraxane不太可能穿透到肿瘤块的深部。另外，这些相对大的纳米颗粒易于被肝脏和网状内皮组织系统(RES)所捕获。另一种纳米治疗药物
Figure BPA00001331520200013
(或脂质体多柔比星)具有和Abraxane类似的尺寸，但是其包被有聚乙二醇(PEG)。相比于原本的游离多柔比星药物，Doxil具有较低的心脏毒性。类似于Abraxane，对于Doxil能否穿透进入肿瘤块深部是令人怀疑的。
尽管这两种纳米治疗剂都显示出较好的临床毒性谱，但是其抗肿瘤作用仅仅略好于原始的药物制剂。两亲性嵌段共聚物可形成纳米级胶束，并已应用于药物递送系统的开发。两亲性嵌段共聚物可形成纳米级(＜100nm)的疏水性胶束，并已应用于药物递送体系的开发。但是，这些胶束中的大多数都是不可生物降解的，并且易于被RES捕获。另外，这些胶束常由线型疏水聚合物组成，其在水性环境下形成疏松的核心，导致不稳定以及载药能力低。需要开发更小(20-80nm)的壳且生物相容性胶束作为用于抗癌药物体内递送的有效纳米载体。
最近，我们开发出几种用于PTX或其他疏水性药物的新纳米载体。这些包含PEG和寡聚胆酸的新纳米载体可在水性条件下自组装形成核心-壳(胆烷-PEG)结构，其可在疏水内部运载PTX。预计这些两亲性载药纳米颗粒自身就具有治疗性，且具有改善的临床毒性谱。更重要的是，当用靶向癌细胞表面的配体和/或肿瘤血管配体修饰时，这些纳米载体将能够把毒性治疗剂递送到肿瘤部位。可通过使用多种不同的胆烷-PEG制剂或其组合来调整纳米载体的最终尺寸(10至100nm)。所述纳米载体及其组分、PEG和胆酸都是无毒且完全生物相容的。
由于其惰性和生物相容性，PEG已广泛用于多种生物医学应用。有许多FDA批准的PEG修饰的蛋白质药物，例如PEG化天冬酰胺。PEG化不仅改善了药代动力学性质，还降低了蛋白质药物的免疫原性。在PEG化时，小分子或肽药物显示出循环时间增加以及代谢延迟。接枝于纳米颗粒表面的PEG降低了这些颗粒在体内向正常组织和网状内皮系统(RES)的溢出(extravasation)。在体内成像研究中，PEG修饰显示出降低无机纳米颗粒(例如量子点和磁性纳米颗粒)的聚集和毒性。胆汁酸是哺乳动物肝中生物合成的天然表面活性剂，其作为脂肪消化中的乳化剂。胆酸是胆汁酸的主要成分，其具有表面两亲性结构：刚性类固醇骨架，其在骨架的一个表面上带有四个疏水性基团以及在另一个表面上带有疏水性甲基。胆酸盐在水中形成雪茄形胶束，其合成寡聚物在水中形成具有疏水口袋的单分子胶束，其可在热力学上隔离疏水性分子。但是，寡聚胆酸在药物递送中的应用由于其溶解性差和载药能力低而受到限制。我们之前制备了具有接枝于单胆酸核心的四条PEG链的星形胆酸-PEG化合物。此化合物可在水溶液中形成球形胶束，并且可用作药物递送中的载体。但是，由于亲水性PEG组分占优势，此化合物的临界胶束浓度(critical micellationconcentration，cmc)比单胆烷单元要高，在水性条件下制得的胶束相对较大((直径＞200nm)。
出人意料地，本发明通过提供更小得多且更稳定的纳米载体满足了此需要以及其他需求，所述纳米载体具有由PEG上的胆烷制备的核心-壳结构。
发明内容
在一个实施方案中，本发明提供了具有内部和外部的纳米载体，所述纳米载体包含至少一个缀合物，其中每个缀合物包含聚乙二醇(PEG)聚合物。每个缀合物还包含至少两个两亲性化合物，其具有亲水面和疏水面。另外，每个缀合物包含寡聚物，其中所述两亲性化合物中的至少两个与共价连接至所述PEG的寡聚物共价连接。该纳米载体的每个缀合物在水性溶剂中自组装形成纳米载体，使得由于每个两亲性化合物的疏水面彼此相对的取向而在该纳米载体内部形成疏水口袋，其中每个缀合物中的PEG在该纳米载体的外部自组装。
在第二个实施方案中，本发明提供了一种通过向有治疗需要的对象施用治疗有效量的本发明纳米载体来治疗疾病的方法。
在第三个实施方案中，本发明提供了一种成像方法，包括向待成像对象施用治疗有效量的本发明纳米载体，其中该纳米载体还包含成像剂。
附图说明
图1显示(A)CA3(化合物1)和CA3-PEG9(聚合物2)的合成方案，(B)粒径分析显示，聚合物2由水中形成的纳米颗粒的平均直径为4.3nm，和(C)聚合物2的分子量分析的GPC曲线。
图2显示CA4的化学结构和粒径。
图3显示PEG3000-CA4的(A)化学结构、(B)粒径和(C)分子量。
图4显示PEG3000-CA8的(A)化学结构和(B)粒径。
图5显示PEG分子量为5、3.35和2KDa的聚合物6-15的化学结构。
图6显示PEG3000-CA4-PEG8的(A)化学结构、(B)粒径和(C)分子量。
图7显示使用几种方法在不同PTX浓度下在PEG3000-CA8中装载的PTX的量。分别地，对于蒸发法来说，聚合物(PEG3000-CA8)的浓度保持在20mg/mL，对于透析法和溶解法来说，保持在10mg/mL。
图8显示在不同PTX浓度下在不同聚合物中装载的PTX量(A)以及在不同的PTX添加浓度下载药纳米颗粒的粒径。聚合物浓度保持恒定在20mg/mL。
图9显示在不同依托泊苷浓度下在不同聚合物中装载的依托泊苷(VP-16)的量(A)以及不同的依托泊苷添加浓度下载药纳米颗粒的粒径。聚合物浓度保持恒定在20mg/mL。
图10显示PTX从由PBS中PEG5000-CA8形成的胶束中随时间的释放，显示为胶束中所留存药物量的百分比。根据透析袋中剩下的PTX浓度计算释放的PTX的百分比。
图11显示载有PTX的纳米颗粒随时间的稳定性。PTX-胶束7(PEG5000-CA8)相对于Abraxane。
图12显示随着胶束中PTX浓度的增加，载有PTX的胶束7(PEG5000-CA8)的粒径。胶束处于10％(v/v)胎牛血清(FBS)中。
图13显示在不同胎牛血清(FBS)浓度下PTX-胶束5(PEG3000-CA8)(PTX载量：0.54mg/ml)的粒径。
图14A显示多种聚合物对用萤光素酶转染的SKOV-3细胞的细胞毒性。图14B显示未载药的PEG5000-CA8NP(聚合物7)和聚氧乙烯蓖麻油(cremophor)：乙醇载体对HFF1人成纤维细胞的细胞毒性。C1和C2分别是体内施用后预计的PEG5000-CA8(聚合物7)和cremophor：乙醇的血液浓度，假定人的平均血液体积是6L。用ES-2细胞测试载有PTX的PEG5000-CA8NP的抗癌作用。
图15A和15B显示载有PTX的聚合物对ES-2(15A)和SKOV-3细胞(15B)的细胞毒性。
图16显示不同紫杉醇制剂在具有人SKOV3-luc卵巢癌异种移植物的裸鼠中的抗肿瘤效力。在第0、4、8、12、16天静脉内施用PBS(对照)、Taxol、Abraxane或PEG5000-CA8-PTX制剂，其中在第16天时肿瘤体积达到约50mm3。
图17显示使用不同紫杉醇方案或使用盐水(对照)处理后小鼠体重的变化。
图18显示具有SKOV3-luc卵巢癌异种移植物的裸鼠在用不同紫杉醇方案或用盐水(对照)处理后的红细胞计数(左)和白细胞计数(右)。
图19显示皮下具有Molt-4肿瘤的小鼠在注射染料48小时后的体内NIR荧光成像。通过尾静脉以每个小鼠4nmol的剂量给予载有和不载有PTX的NP(PEG3000-CA8)-Cy5.5和LLP2A-NP-Cy5.5。
图20显示以4nM注射NP(PEG3000-CA8，聚合物5)-Cy5.5第48小时时肿瘤和器官的离体成像。
图21显示线型聚合物的结构和功能。
图22显示二分枝聚合物的结构和功能。
图23显示三分枝聚合物的结构和功能。
图24显示末端树枝状聚合物(telodendrimer)的结构和功能。
图25显示在构建块之间含有可切割连接的生物可降解纳米颗粒的设计。
图26显示线型构造的纳米载体的粒径和胆酸基团数。
图27显示分枝系列1构造的纳米载体的粒径和胆酸基团数。
图28显示分枝系列2构造的纳米载体的粒径和胆酸基团数。
图29显示分枝系列3构造的纳米载体的粒径和胆酸基团数。
图30显示分枝系列4构造的纳米载体的粒径和胆酸基团数。
图31显示在PEG接枝之前和之后的纳米载体尺寸。
图32显示用于制备本发明的末端树枝状聚合物的合成方案。
图33显示在CDCl3(A)和D2O(B)中进行的PEG5000-CA8(聚合物7)的1H NMR谱。
图34分别显示在不存在(34A)和存在烟草花叶病毒(TMV)作为校准标准(18nm宽)(34B)时载有PTX(4.4mg/mL)的PEG5000-CA8(聚合物7)的CryoTEM图像。
图35A显示DLS粒度仪所测的三种胶束，即154nmDiD-PTX-PEG3000-CA4、64nm DiD-PTX-PEG5000-CA8和17nmDiD-PTX-PEG2000-CA4。图35B显示与三种胶束制剂中的每一种一起孵育并在共聚焦荧光显微镜下成像的264.7巨噬细胞。用DAPI对细胞核染色，红色DiD信号表明，相比于较小胶束(17nm和64nm)，巨噬细胞优先摄取154nm胶束。图35C显示在尾静脉注射后24小时时具有SKOV-3卵巢癌异种移植物的小鼠中胶束(三种不同尺寸)的离体生物分布。图35D显示静脉注射DiD-PTX-PEG5000CA8后荷瘤小鼠随时间的体内NIR荧光成像；在注射后2小时至24小时观察到S.Q.植入的异种移植物(箭头)中胶束的被动积累。
图36分别显示末端树枝状聚合物和起始材料线型PEG的MALDI-TOF MS分析，证实了末端树枝状聚合物的明确结构，其考虑了CA树枝状四聚体(1961道尔顿)和CA八聚体(4031道尔顿)分子量的接近。
图37显示金表面上HS-PEG5000-CA8胶束(37A)和载有PTX药物之HS-PEG5000-CA8胶束(37C)的轻敲模式(tapping mode)AFM照片。相应的光标处的图分别表示在(37B)和(37D)中，以显示3D信息。
图38显示PEG5000-CA8纳米颗粒的腹内分布。图38A显示腹膜内具有SKOV-3肿瘤的小鼠在腹膜内注射DiD-PTX-NP后不同时间点的体内NIRF成像。图38B显示DiD-PTX-NP在肿瘤上的定位。注射后72小时处死小鼠，使腹腔暴露，用Kodak成像工作站进行扫描。
图39显示在SKOV3-luc卵巢癌皮下小鼠模型中不同PTX制剂莆脉内处理后针对相对肿瘤体积(39A)和小鼠体重变化(39B)的体内抗肿瘤效力。在第0、4、8天以及肿瘤体积达到约100～200mm3时的第38、42、46天(X轴上箭头)向荷瘤小鼠静脉内施用PBS(对照)、
Figure BPA00001331520200061
和PTX-PEG5000-CA8NP。数据以每组六只小鼠的平均值±SEM表示。
图40显示在腹膜散布卵巢癌之小鼠模型中不同PTX制剂腹膜内治疗后的抗肿瘤效力以及非侵入性生物发光成像。图40A显示治疗后不同时间点表达萤光素酶的SKOV3-luc癌细胞发出的生物发光。具有腹膜SKOV3-luc肿瘤的小鼠在第0、4、8、12和16天接受共五次腹膜内注射
Figure BPA00001331520200063
和PTX-PEG5000-CA8NP。对照组仅接受PBS。对每个小鼠整个腹部区域的信号进行定量，通过测量无光发出区域中相同尺寸的ROI来扣除背景。图40B显示不同治疗组中的小鼠存活。空心圆代表麻醉过程中死亡之后的经检查数据点(即非肿瘤相关)。
图41A和41B显示分枝聚合物系列1(P-1)成员的合成(41A)和合成的产物(41B)。
图42显示未载药聚合物23胶束(A1)、未载药聚合物25胶束(低倍)(A2)和未载药聚合物25胶束(高倍)(A3)的TEM图像。
图43显示随着分枝聚合物系列1(P-1)、分枝聚合物系列2(P-2)、分枝聚合物系列3(P-3)和分枝聚合物系列4(P-4)中核心形成单元数目增加的胶束紫杉醇载药能力(43A)，随着药物浓度之增加的聚合物23中的紫杉醇载药量和载有紫杉醇的聚合物23的对应平均直径(43B)，以及随着溶液中药物浓度之增加的聚合物23胶束的载药效力(43C)。对于所有载药测试，最终胶束溶液体积保持为1mL，聚合物的终浓度为20mg/mL。
图44显示37℃下PTX从PBS中的P-1-4(聚合物23)胶束中的释放谱，通过随时间的胶束中保留的PTX百分比来测定。初始紫杉醇浓度为1.2mg/mL。通过HPLC测定不同时间点透析袋中保留的紫杉醇浓度。所报告的值为一式三份样品的平均值±SD。
图45显示如动态光散射所测的37℃下在50％狗血浆(v/v)中和在PBS中的45mg/mL BSA溶液中载有7.3mg/mL紫杉醇的Abraxane(紫杉醇载药量：5.0mg/mL)和P-1-4(聚合物23)胶束随时间的平均直径。所有测量重复三次。所报告的值为一式两份样品的平均值±SD。
图46显示MTT测定，证实了孵育72小时后用不同浓度的未载药(“空白”)P-1-3(聚合物22)胶束、未载药P-1-4(聚合物23)胶束(46A)、以及
Figure BPA00001331520200071
载有PTX的P-1-3(聚合物22)胶束和载有PTX的P-1-4胶束(46B)处理的SKOV-3细胞的活力。细胞活力计算为所处理样品中细胞数与未处理对照中细胞数的比值。所报告的值为一式三份样品的平均值±SD。
图47显示体内和离体NIR光学图像。图47A显示在静脉注射载有PTX和DiD(疏水性染料)的胶束24后不同时间点用Kodak成像系统获得的具有SKOV-3肿瘤之小鼠的体内NIR光学图像。图47B显示在注射后24小时获得的分离器官和肿瘤的离体NIR图像。来自离体图像的肿瘤和器官的定量荧光强度。
图48A和48B显示分枝聚合物系列2(P-2)成员的合成(48A)和合成的产物(48B)。
图49A和49B显示分枝聚合物系列3(P-3)成员的合成(49A)和合成的产物(49B)。
图50A和50B显示分枝聚合物系列4(P-4)成员的合成(50A)和合成的产物(50B)。
图51显示HS-PEG5000-CA8的结构。
图52A和52B显示线型聚合物系列成员的合成(52A)和合成的产物(52B)。
具体实施方式
I.概述
本发明提供了具有疏水性内部和亲水性外部的纳米载体，其允许该纳米载体递送水溶性低的药物。所述纳米载体通过缀合物聚集到胶束中而形成。本发明的缀合物可采取多种结构，包括线型、分枝和末端树枝状聚合物。所述纳米载体的疏水性核心可由胆酸提供，胆酸具有疏水面和亲水面。通常，一些胆酸基团用于在纳米载体中隔开药物。纳米载体的亲水性由聚乙二醇聚合物链提供，其包裹纳米载体并通过缀合物的聚集形成胶束。胆酸和PEG通过可含有多种酸重复单元的寡聚物相连。通常，所述寡聚物包含二氨基羧酸：赖氨酸。本发明的纳米载体也可由光学探针、放射性核素和金属螯合物以及疏水药物进行官能化。
II.定义
本文使用的术语“两亲性化合物”表示具有疏水性部分和亲水性部分的化合物。例如，本发明的两亲性化合物可具有化合物的一个亲水面和化合物的一个疏水面。可用于本发明的两亲性化合物包括但不限于胆酸，以及胆酸类似物如别胆酸、蟒胆酸、禽胆酸(avicholic acid)、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸等(参见Current Science 2004，87(12)，1666，其全文并入本文)。
本文使用的术语“单体单元”表示二氨基羧酸、二羟基羧酸和羟基氨基羧酸。本发明二氨基羧酸基团的实例包括但不限于2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸、2，5-二氨基戊酸(鸟氨酸)、2，6-二氨基己酸(赖氨酸)、(2-氨基乙基)-半胱氨酸、3-氨基-2-氨基甲基丙酸、3-氨基-2-氨基甲基-2-甲基丙酸、4-氨基-2-(2-氨基乙基)丁酸和5-氨基-2-(3-氨基丙基)戊酸。本发明二羟基羧酸基团的实例包括但不限于甘油酸、2，4-二羟基丁酸、甘油酸、2，4-二羟基丁酸、2，2-双(羟甲基)丙酸和2，2-双(羟甲基)丁酸。羟基氨基羧酸的实例包括但不限于丝氨酸和高丝氨酸。本领域技术人员会了解可用于本发明的其他单体单元。
本文使用的术语“间隔基单体单元”表示将单体单元彼此连接在一起的化学基团。间隔基单体单元实例包括但不限于具有1-3个氧-亚乙基基团的乙二醇寡聚物。本领域技术人员会了解可用于本发明的其他间隔基单体单元。
本文使用的术语“疏水性药物”表示排斥水的任何药物。可用于本发明的药物包括但不限于：紫杉醇、多柔比星、依托泊苷、伊立替康、SN-38、环孢菌素A、鬼臼毒素、卡氮芥、两性霉素、伊沙匹隆(Ixabepilone)、帕土匹龙(Patupilone)(埃博霉素(epothelon)类)、雷帕霉素和铂类药物。本发明的疏水性药物还包括上述药物的前药形式。本领域技术人员会了解其他药物也可用于本发明。
本文使用的术语“结合配体”指能够结合靶标大分子(例如正常细胞、癌细胞和内皮细胞的细胞表面受体，以及细胞外基质和骨基质中的非细胞组分，和感染性物质(病毒、真菌、细菌和寄生虫等)的表面受体)的化学或生物物质。可用于本发明的结合配体包括但不限于LLP2A(与α4β1整合素配体结合)、LXY1和LXY3(与α3β1整合素配体结合)、RGD肽(与α5β1和αvβ3整合素配体结合)以及磷酸氢盐(骨搜索分子(bone seekingmolecule))。本领域技术人员会了解，其他结合配体也可用于本发明。
本文使用的术语“成像剂”指允许对身体器官、组织或系统成像的化学物。示例性的成像剂包括顺磁性物质、光学探针和放射性核素。
本文使用的术语“顺磁性物质”指在外加场下具有磁性的成像剂。顺磁性物质的实例包括但不限于铁颗粒(包括纳米颗粒)。
本文使用的术语“光学探针”指可通过如下所述检测的荧光化合物，即在一个发射波长下激发且在另一个不同的发射波长下检测。可用于本发明的光学探针包括但不限于Cy5.5、Alexa 680、Cy5、DiD(1，1′-双十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸酯)和DiR(1，1′-双十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青碘酸酯)。其他光学探针包括量子点。
本文使用的术语“放射性核素”指发生放射性衰变的化学元素。可用于本发明的放射性核素包括但不限于3H、11C、13N、18F、19F、60Co、64Cu、67Cu、68Ga、82Rb、90Sr、90Y、99Tc、99mTc、111In、123I、124I、125I、129I、131I、137Cs、177Lu、186Re、188Re、211At、Rn、Ra、Th、U、Pu和241Am。
本文使用的术语“金属螯合物”指与金属离子螯合的化合物或物质。例如，可用于本发明的金属螯合物包括但不限于1，4，8，11-四氮杂环十二烷-1，4，8，11-四乙酸(TETA)、4，11-双(羧甲基)-1，4，8，11-四氮杂双环[6.6.2]十六烷(CB-TE2A)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和1，4，7，10-四氮杂环癸烷四乙酸(DOTA)。
本文使用的术语“治疗”表示在处理或改善损伤、病变、病症或症状(例如疼痛)方面的任何成功标志，包括任何客观或主观参数，例如症状的消除、消退、消失，或者所述症状、损伤、病变或病症对患者而言更好承受；减少症状或病症的频率或持续时间；或者，在某些情况下，预防症状或病症的发作。症状的处理或改善可以基于任何客观或主观参数，例如体检结果。
本文使用的“施用”表示口服施用，作为栓剂施用，表面接触，胃肠外、静脉内、腹膜内、肌内、病变内、鼻内或皮下施用，鞘内施用，淋巴内，吸入微滴或者向对象植入延缓释放装置，例如微渗透泵。
本文使用的术语“对象”表示动物，例如哺乳动物，包括但不限于灵长类(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在某些实施方案中，所述对象是人。
本文使用的术语“治疗有效量或剂量”或“治疗足够量或剂量”表示产生施用的预期治疗作用的剂量。确切剂量取决于治疗目的，并且可由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见例如Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3，1992)；Lloyd，The Art，Scienceand Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar，DosageCalculations(1999)；和Remington：The Science and Practice ofPharmacy，20th Edition，2003，Gennaro，Ed.，Lippincott，Williams &Wilkins)。在致敏的细胞中，治疗有效剂量经常可低于对未致敏细胞的常规治疗有效剂量。
本文使用的术语“隔离/隔开”表示疏水性药物在纳米载体的疏水性内部并且不接触纳米载体外部的亲水性环境。
III.纳米载体
本发明提供了形成胶束的纳米载体，其中每个单个纳米载体都是具有疏水性内部和亲水性外部的胶束。所述纳米载体的疏水性区域能够隔离疏水性药物。纳米载体由具有疏水性区域(由两亲性化合物形成)和亲水性区域(例如聚乙二醇(PEG)聚合物)的缀合物聚集形成。PEG的尺寸足以包裹缀合物的疏水性区域，使得缀合物可溶于水中，并自组装形成纳米载体胶束，有利于向对象施用疏水性药物或成像剂。
在一些实施方案中，本发明提供了能够隔开疏水性药物的纳米载体。本发明的纳米载体具有内部和外部，所述纳米载体包含至少一种缀合物，其中每一缀合物包含聚乙二醇(PEG)聚合物。每一缀合物还包含至少两种具有亲水面和疏水面的两亲性化合物。另外，每一缀合物包含寡聚物，其中所述两亲性化合物中的至少两个与共价连接至PEG的寡聚物共价连接。该纳米载体使得每一缀合物在水性溶剂中自组装形成纳米载体，使得由于每一两亲性化合物的疏水面彼此相对的取向而在纳米载体内部形成疏水口袋，并且其中每一缀合物的PEG在纳米载体外部自组装。
任何尺寸和结构的聚乙二醇(PEG)聚合物可用于本发明的纳米载体。在一些实施方案中，PEG为1-100kDa。在另一些实施方案中，PEG为1-10kDa。在又一些实施方案中，PEG为约3kDa。在再一些实施方案中，另外的PEG聚合物与所述两亲性化合物相连。例如，当所述两亲性化合物是胆酸时，多达3个PEG聚合物与每个胆酸相连。与两亲性化合物相连的PEG聚合物大小为200-10000Da。在又一些实施方案中，与两亲性化合物相连的PEG聚合物大小为1-5kDa。本领域技术人员会了解，其他PEG聚合物和其他亲水性聚合物也可用于本发明。
本发明的缀合物还包含至少两个相同或不同的两亲性化合物。可用于本发明缀合物的两亲性化合物是同时具有亲水面和疏水面的那些。另外，每个两亲性化合物与单体单元相连，所述单体单元自身与另一个单体单元和/或PEG聚合物相连。在一些实施方案中，所述两亲性化合物可各自独立地为胆酸、别胆酸、蟒胆酸、禽胆酸、脱氧胆酸或鹅脱氧胆酸。本领域技术人员会了解，其他两亲性化合物也可用于本发明。
本发明的缀合物还包括多个单体单元。在一些实施方案中，所述多个单体单元连接在一起形成寡聚物。所述寡聚物与PEG以及与两亲性化合物共价相连。该寡聚物可采取一些结构中的任一些，例如线型结构、分枝结构或末端树枝状结构。
在一些实施方案中，纳米载体包含疏水性药物或成像剂，从而所述疏水性药物或成像剂被隔离在纳米载体的疏水口袋中。所述疏水性药物可以是排斥水的任何药物，如本文所述。所述疏水性药物和成像剂可被隔离在纳米载体的疏水口袋中，或者与缀合物共价连接。成像剂包括顺磁性物质、光学探针和放射性核素。顺磁性物质包括铁颗粒，例如隔离在纳米载体疏水口袋中的铁纳米颗粒。
在一些其他实施方案中，可用于本发明缀合物的单体单元可以是二氨基羧酸、二羟基羧酸或羟基氨基羧酸。在另一些实施方案中，所述二氨基羧酸是氨基酸。本发明二氨基羧酸基团的实例包括但不限于2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸、2，5-二氨基戊酸(鸟氨酸)、2，6-二氨基己酸(赖氨酸)、(2-氨基乙基)-半胱氨酸、3-氨基-2-氨基甲基丙酸、3-氨基-2-氨基甲基-2-甲基丙酸、4-氨基-2-(2-氨基乙基)丁酸和5-氨基-2-(3-氨基丙基)戊酸。本发明二羟基羧酸基团的实例包括但不限于甘油酸、2，4-二羟基丁酸、2，2-双(羟甲基)丙酸、2，2-双(羟甲基)丁酸、丝氨酸和苏氨酸。羟基氨基羧酸的实例包括但不限于丝氨酸和高丝氨酸。
在另一个实施方案中，在本发明缀合物中使用多于一种单体单元类型，以提供酸共聚物。例如，所述酸共聚物可具有与羟基氨基羧酸或二羟基羧酸交替的二氨基羧酸。
在另一些实施方案中，至少一个单体单元任选地与光学探针、放射性核素、金属螯合物或药物相连。所述药物可以是多种亲水性或疏水性药物，并且不限于隔离在本发明纳米载体内部的疏水性药物。
可以隔离在纳米载体内或与本发明缀合物相连的药物包括但不限于：细胞生长抑制剂、细胞毒性剂(例如但不限于DNA相互作用剂(如顺铂或多柔比星))；紫杉烷类(例如泰索帝(taxotere)、紫杉醇(taxol))；拓扑异构酶II抑制剂(例如依托泊苷)；拓扑异构酶I抑制剂(例如伊立替康(或CPT-11)、开普拓(camptostar)或拓扑替康)；微管蛋白相互作用剂(例如紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)或埃博霉素类(epothilones)；激素药物(例如他莫西芬)；胸苷酸合酶抑制剂(例如5-氟尿嘧啶)；抗代谢剂(例如甲氨蝶呤)；烷化剂(例如替莫唑胺(来自Schering-Plough Corporation，Kenilworth，N.J.的TEMODARTM)、环磷酰胺)；芳香化酶组合；ara-C、阿霉素、环磷酰胺(cytoxan)和吉西他滨。可用于本发明纳米载体的其他药物包括但不限于尿嘧啶氮芥、氮芥、异环磷酰胺(Ifosfamide)、美法仑、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三亚乙基亚胺三嗪、三亚乙基硫代磷酰胺、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、链佐星、达卡巴嗪、氮尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、奥沙利铂、亚叶酸(leucovirin)、奥沙利铂(Sanofi-Synthelabo，France的ELOXATINTM)、喷司他丁(Pentostatine)、长春碱、长春新碱、长春地辛、博来霉素、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星(Idarubicin)、米拉霉素、脱氧助间型霉素、丝裂霉素-C、L-天冬酰胺酶、替尼泊苷(Teniposide)、17α-炔雌醇、己烯雌酚、睾酮、强的松、氟羟甲睾酮、丙酸屈他雄酮、睾内酯、醋酸甲地孕酮、甲基强的松龙、甲基睾酮、氢化泼尼松、曲安西龙、氯烯雌醚、羟孕酮、氨鲁米特、雌氮芥、醋酸甲羟孕酮、亮脯利特(Leuprolide)、氟他胺(Flutamide)、托瑞米芬(Toremifene)、戈舍瑞林、顺铂、卡铂、羟基脲、安吖啶、丙卡巴肼、米托坦、米托蒽醌、左旋咪唑、诺维本(Navelbene)、阿那曲唑(Anastrazole)、来曲唑、卡培他滨、Reloxafine、Droloxafine或六甲三聚氰胺。
其他可用于本发明的药物还包括放射性核素，例如67Cu、90Y、123I、125I、131I、177Lu、188Re、186Re和211At。在一些实施方案中，放射性核素可作为药物和成像剂起到治疗性作用。
可用于本发明纳米载体的疏水性药物包括任何具有低水溶性的药物。在一些实施方案中，所述疏水性药物是紫杉醇、多柔比星、依托泊苷、伊立替康、SN-38、喜树碱、环孢菌素A、鬼臼毒素、卡氮芥、两性霉素、伊沙匹隆、帕土匹龙(埃博霉素类)、雷帕霉素和铂类药物。在另一些实施方案中，所述药物可以是紫杉醇、SN38、喜树碱、依托泊苷或多柔比星。前药形式也可用于本发明。
在一些实施方案中，所述缀合物具有式I：
Figure BPA00001331520200131
其中A是1-100kDa的聚乙二醇(PEG)聚合物，其中A任选地与结合配体L相连。X各自为单体单元。X’是任选地连接光学探针、放射性核素、金属螯合物或药物的单体单元。Y各自为间隔基(spacer)单体单元。R1各自为H、光学探针、放射性核素、金属螯合物、疏水性药物，或者任选地连接有光学探针、放射性核素、金属螯合物或药物的1-100kDa的聚乙二醇(PEG)聚合物。R2各自独立地为胆酸或取代有两个胆酸基团的单体单元，其中每个胆酸基团任选地取代有1-3个聚乙二醇(PEG)聚合物，所述聚乙二醇聚合物各自独立地为200-10,000Da的大小。下标m为2-20。
在另一些实施方案中，所述缀合物具有式Ia：
Figure BPA00001331520200132
其中A是3kDa的PEG聚合物。X’的单体单元是赖氨酸。X各自为赖氨酸。Y各自为
Figure BPA00001331520200133
R2各自为与两个胆酸基团相连的赖氨酸。
在另一些实施方案中，所述缀合物具有式II：
Figure BPA00001331520200141
其中A是1-100kDa的聚乙二醇(PEG)聚合物，其中A任选地与结合配体L相连。X各自为单体单元。X’是任选地连接光学探针、放射性核素、金属螯合物或药物的单体单元。Y各自为间隔基单体单元。R1各自独立地为H、光学探针、放射性核素、金属螯合物、疏水性药物，或者任选地连接有光学探针、放射性核素、金属螯合物或疏水性药物的1-100kDa的聚乙二醇(PEG)聚合物。R2各自独立地为胆酸或取代有两个胆酸基团的单体单元，其中每个胆酸基团任选地取代有1-3个聚乙二醇(PEG)聚合物，所述聚乙二醇聚合物各自独立地为200-10,000Da的大小。下标m和m’各自独立地为2-20。下标p为0-10。
在另一些实施方案中，所述缀合物具有式IIa：
Figure BPA00001331520200142
在另一些实施方案中，R2各自为胆酸。在又一些实施方案中，R2各自为连接两个胆酸基团的单体单元。
在另一个实施方案中，所述缀合物具有式IIb：
Figure BPA00001331520200143
其中A是3kDa的PEG聚合物。X’的单体单元是赖氨酸。X各自为赖氨酸。Y各自为
Figure BPA00001331520200144
R2各自为胆酸。下标m和m’各自是4。
在一些实施方案中，所述缀合物具有式IIc：
Figure BPA00001331520200151
其中下标p是1-10。
在另一些实施方案中，所述缀合物具有式III：
Figure BPA00001331520200152
其中A是1-100kDa的聚乙二醇(PEG)聚合物，其中A任选地与结合配体L相连。X各自为单体单元。X’是任选地连接光学探针、放射性核素、金属螯合物或药物的单体单元。R2各自为胆酸，其中每个胆酸基团任选地由1-3个聚乙二醇(PEG)聚合物取代，所述聚乙二醇聚合物各自独立地为200-10,000Da的大小。
在另一些实施方案中，所述缀合物具有式IIIa：
Figure BPA00001331520200153
其中A是5000Da的PEG聚合物。X’的单体单元是赖氨酸。X各自为赖氨酸。R2各自为胆酸。
本发明的缀合物可通过本领域技术人员已知的多种方法制备。
IV.治疗方法
例如通过在纳米载体内部隔离疏水性药物，或者通过将药物与纳米载体的缀合物共价连接，本发明的纳米载体可用于治疗需要施用药物的任何疾病。通过在纳米载体内部隔离成像剂，或者通过将所述成像剂与纳米载体的缀合物相连，所述纳米载体也可用于成像。
在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗疾病的方法，包括向需要此治疗的对象施用治疗有效量的本发明纳米载体，其中所述纳米载体包含药物。所述药物可以与纳米载体中的缀合物共价连接，或者所述药物可以是被隔离在纳米载体内部的疏水性药物。在另一些实施方案中，所述纳米载体还包含成像剂。所述成像剂可与纳米载体中的缀合物共价相连，或者所述成像剂可被隔离在纳米载体的内部。在另一些实施方案中，疏水性药物和成像剂都被隔离在纳米载体的内部。在又一些实施方案中，药物和成像剂都与纳米载体中的缀合物共价相连。在再一些实施方案中，所述纳米载体还可包含放射性核素。
本发明的纳米载体可施用给对象用于治疗，例如治疗包括癌症在内的过度增殖性疾病，例如但不限于癌、神经胶质瘤、间皮瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、神经胶质母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、前列腺癌和Burkitt淋巴瘤、头颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝胆癌、胆囊癌、小肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、尿道癌、睾丸癌、宫颈癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、胰内分泌腺癌、类癌瘤、骨癌、皮肤癌、眼癌、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(其他癌症参见CANCER：PRINCIPLES ANDPRACTICE(DeVita，V.T.et al.eds 2008))。
可通过本发明纳米载体治疗的其他疾病包括：(1)炎性或变应性疾病，例如全身性过敏或超敏应答、药物过敏、昆虫螫刺过敏；炎性肠病，例如克罗恩病、溃疡性结肠炎、回肠炎和肠炎；阴道炎；银屑病和炎性皮肤病例皮炎、湿疹、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、荨麻疹；血管炎；强直性脊椎炎；硬皮病；呼吸系统过敏疾病如哮喘、变应性鼻炎、超敏性肺病等，(2)自身免疫病，例如关节炎(类风湿性关节炎和银屑病性关节炎)、骨关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、糖尿病、肾小球肾炎等，(3)移植排斥(包括同种异体移植排斥和移植物抗宿主病)，和(4)其他疾病(将抑制其中所不希望的炎性应答)(例如动脉粥样硬化、肌炎、神经病症如卒中和封闭式头损伤、神经退行性疾病、阿尔茨海默病、脑炎、脑膜炎、骨质疏松、痛风、肝炎、肾炎、败血症、类肉瘤病(sarcoidosis)、结膜炎、耳炎、慢性阻塞性肺病、鼻窦炎和白塞氏综合征)。
此外，本发明的纳米载体还可用于治疗病原体(例如病毒、细菌、真菌和寄生虫)感染。可使用本发明纳米载体治疗其他疾病。
A.制剂
可根据本领域技术人员已知的多种不同方法来制备本发明的纳米载体。可药用载体部分地根据所施用的具体组合物以及用于施用所述组合物的具体方法来确定。因此，本发明药物组合物有多种合适制剂(参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第20版，2003，见上文)。有效制剂包括口服和鼻用制剂、胃肠外施用制剂以及为延缓释放而配制的组合物。
适于口服施用的制剂可由以下组成：(a)液体溶液，例如悬浮于稀释剂(例如水、盐水或PEG 400)中的有效量的本发明化合物；(b)胶囊、扁囊(sachet)、贮库(depot)或片剂，各自包含预定量的作为液体、固体、颗粒或胶体(gelatin)的活性成分；(c)在合适液体中的混悬液；(d)合适的乳液；和(e)贴剂。上述液体溶液可以是无菌溶液。药物形式可包含以下物质中的一种或多种：乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸以及其他赋形剂，着色剂，填充剂，粘合剂，稀释剂，缓冲剂，润湿剂，防腐剂，调味剂，染料，崩解剂以及药物相容载体。锭剂形式可包含具有味道(例如蔗糖)的活性成分，以及在惰性基质(例如明胶和甘油)中包含活性成分、或者蔗糖和阿拉伯胶乳液、凝胶等的锭剂(pastille)，其除活性成分之外还含有现有技术中已知的载体。
药物制剂优选单位剂型。在此形式中，制剂被再分为含有合适量活性成分的单位剂量。所述单位剂型可以是包装好的制剂，包装中含有离散量制剂，例如包装的片剂、胶囊剂以及在瓶或安瓿中的粉末。另外，所述单位剂型本身还可以是胶囊剂、片剂、扁囊剂(cachet)或锭剂，或者其可以是合适数量的这些包装形式中的任意种。如果需要，所述组合物还可含有其他相容的治疗剂。优选的药物制剂可递送持续释放制剂中的本发明化合物。
可用于本发明的药物制剂还包含延长释放制剂。在一些实施方案中，可用于本发明的延长释放制剂描述于美国专利No.6,699,508中，其可根据美国专利No.7,125,567制备，这两个专利均通过引用并入本文。
药物制剂通常递送给哺乳动物，包括人和非人哺乳动物。使用本方法治疗的非人哺乳动物包括驯养动物(即犬、猫、鼠、啮齿类和兔)以及农业动物(牛、马、绵羊、猪)。
在本发明方法的实施中，药物组合物可以单独使用，或者与其他治疗剂或诊断剂联合使用。
B.施用
本发明的纳米载体可按照所需的频率施用，包括每小时一次、每天一次、每周一次或每月一次。本发明药物方法中使用的化合物以约每天0.0001mg/kg至约1000mg/kg的起始剂量施用。可使用约0.01mg/kg至约500mg/kg，或约0.1mg/kg至约200mg/kg，或约1mg/kg至约100mg/kg或约10mg/kg至约50mg/kg的日剂量。但是，剂量可根据患者的需要、所治疗疾病的严重程度以及所用的化合物而变化。例如，可考虑具体患者中诊断的疾病类型和阶段按照经验确定剂量。在本发明上下文中，施用给患者的剂量应足以随时间有效实现对患者的有益治疗反应。剂量的大小还将通过在特定患者中伴随施用特定化合物的任何不利副作用的存在情况、性质和程度来确定。针对特定情况确定合适的剂量是在执业医师能力范围之内的。一般来说，用较小的剂量开始治疗，其低于化合物的最佳剂量。此后，少量增加剂量直至达到所处环境下的最佳效果。为简便起见，如果需要，可将每日总剂量分开并在一天中分批次施用。根据进行治疗医师的决定，可以每天或隔天给药。可在一段较长时间内(数周、数月或数年)中定期或连续给药，例如通过使用皮下胶囊、药袋或贮库，或者通过贴剂或泵。
可通过多种方式施用所述药物组合物，包括表面、胃肠外、静脉内、真皮内、皮下、肌内、结肠、直肠或腹膜内。优选地，通过胃肠外、表面、静脉内、肌内、皮下、口服或经鼻(例如通过吸入)施用所述药物组合物。
在本发明方法的实施中，所述药物组合物可单独使用，或者与其他治疗剂或诊断剂联用。本发明组合方案中所用的其他药物可分开施用，或者组合方案中的一种或多种药物可一起施用，例如在混合物中。当分开施用一种或多种药物时，每种药物的施用时间和方案可以不同。所述其他治疗剂或诊断剂可在与施用本发明化合物的相同时间分开施用，或者其可在不同时间施用。
V.成像方法
在一些实施方案中，本发明提供了成像方法，包括向待成像对象施用有效量的本发明纳米载体，其中所述纳米载体包含成像剂。
在另一些实施方案中，使用含有药物和成像剂这两者的纳米载体同时实现所述治疗方法和成像方法。
VI.实施例
在下述讨论中，使用下述命名PEG0000-CAn-PEG3n来表示纳米载体的化学结构。第一PEG的上标数字表示所用线型PEG的大小，CA表示胆酸，“n”表示纳米载体每个单元中存在的胆酸(CA)数，第二PEG指与胆酸(CA)连接的PEG。
实施例1：CA 3 -PEG 9 (2)的制备
首先根据图1使用胆酸NHS活性酯和三氨基乙基胺作为起始材料制备胆酸三聚体(CA3或化合物1)。小分子三聚体1显示在水中溶解度有限。在过滤未溶解的颗粒之后，观察到形成大小约1nm的单分子胶束结构。在通过环氧乙烷阴离子聚合进行PEG化之后，CA3-PEG9(聚合物2)的分子量增加到7.7KDa，其多分散性指数(polydispersity index，PDI)为1.04，表示分子量分布非常窄。聚合物2在水中形成的纳米颗粒(纳米载体2)的大小测得为单分散性直径4.3nm。
实施例2：末端树枝状聚合物PEG-CA 4 (4)的制备
CA4的固相合成：在Rink树脂上通过固相合成使用赖氨酸产生分枝而合成胆酸四聚体(聚合物3)。根据标准Fmoc肽合成法进行偶联反应，通过TFA在水和作为清除剂的三异丙基硅烷的存在下将四聚物产物从树脂上切下。但是，CA4在水中溶解度有限，观察到其自组装成直径为77nm的胶束(图2)。
末端树枝状聚合物的溶液相合成：通过溶液相缩合反应在线型聚乙二醇上合成星形胆酸四聚体PEG3000-CA4(聚合物4)(图3)。通过在冷醚上的沉淀实现可溶性PEG化产物的分离。将叠氮基团偶联于Fmoc保护的分子量为3000Da的氨基-PEG-COOH的羧基上。在用20％哌啶的DMF溶液处理除去Fmoc之后，使用DIC和HOBt作为偶联剂将(Fmoc)Lys(Boc)-OH偶联于PEG的N端上。通过Fmoc肽合成重复偶联(Fmoc)Lys(Foc)-OH，来实现分枝结构。通过胆酸NHS酯将胆酸引入分枝赖氨酸的氨基上，以产生PEG3000-CA4，观察到其自组装成为直径15nm的窄尺寸分布的纳米颗粒。PEG3000-CA4的GPC研究还显示平均分子量4.8KDa的窄分子量分布外加9.2KDa处的较小峰，后者可能是由于两亲性聚合物4的聚集体(图3C)。通过第三代树枝状寡聚赖氨酸在线型聚乙二醇上合成星形胆酸八聚体(聚合物5)。观察到其自组装成为直径21nm的较大纳米颗粒。此PEG3000-CA8纳米载体已显示出很有前途的针对疏水抗肿瘤药物(例如PTX)的装载能力，在下文中将更详细地描述。
实施例3：末端树枝状聚合物PEG 3000 -CA 4 -PEG 8 (16)的制备
通过阴离子聚合合成PEG3000-CA4-PEG8：在上述线型聚乙二醇上合成聚合物4。通过环氧乙烷的阴离子聚合从胆烷单元上的十二个羟基开始将该分子进一步与PEG链接枝产生聚合物16(图6)。有趣的是，来源于较大聚合物16的胶束小于较小聚合物4所形成的那些(分别为8nm和15nm)。据推测，每个胆烷单元上额外的PEG限制了大量聚合物单元结合成大的稳定胶束。不出意料地，药物载量研究显示PTX载药能力相对较低(0.64mg/mL)，表明此纳米载体中的疏水口袋相当小。
实施例4：线型聚合物系列(聚合物17-20)的制备
通过与末端树枝状聚合物制备中相同的溶液相缩合反应制备线型胆酸-PEG聚合物线型系列1。可溶性PEG化产物的分离通过在冷醚中沉淀而实现。以聚合物17为例说明合成方法：使用DIC/HOBt作为偶联剂将叠氮基与分子量为3000道尔顿的Fmoc保护的氨基-PEG-COOH的羧基偶联。以冷醚沉淀叠氮基PEG之后，通过用20％哌啶的DMF溶液处理除去Fmoc基团，通过Fmoc肽化学，使用DIC和HOBt作为偶联剂，在PEG的N端上连续进行(Fmoc)Lys(Boc)-OH的两步骤偶联。通过用DCM中的50％TFA处理30分钟以除去Boc保护基，用冷醚再次沉淀聚合物。为了消除空间位阻，将柔性隔离物分子(Fmoc-Ebes)偶联到赖氨酸的侧链上。在通过DMF中20％哌啶处理除去Fmoc基团之后，使用DIC/HOBt作为偶联剂将(Fmoc)Lys(Fmoc)-OH偶联于赖氨酸的侧链上。在除去Fmoc保护基之后，将胆酸NHS活性酯偶联于赖氨酸的侧链上，以引入侧链(pendant)疏水胆烷构建块。Fmoc保护的N端已准备好偶联荧光染料(例如Cy5.5)或放射性核素。已制备了在每个赖氨酸单元上具有两个胆酸的一系列线型聚合物(图26)，当赖氨酸(CA)2的重复单元从2增加到3、4和5时，DLS粒度仪所测得的胶束尺寸从9.5nm增加至12.6nm以及至20nm，其具有窄的多分散性。
实施例5：分枝聚合物系列1-4的制备
分枝聚合物系列1和4。通过与末端树枝状聚合物制备中相同的溶液相缩合反应制备分枝胆酸-PEG聚合物系列1和4。通过在冷醚中沉淀而实现可溶性PEG化产物的分离。以聚合物21为例说明分枝聚合物系列1的合成方法，合成方案在图41中显示：使用N-羟基苯并三唑(HOBt 3当量)/二异丙基碳二亚胺(DIC 3当量)作为偶联剂，在DMF中过夜将3-叠氮丙胺(3当量)与FmocNH-PEG-COOH(3000Da)的羧基偶联。随后使聚合物沉淀，并用冷醚清洗。在通过20％的DMF哌啶溶液除去Fmoc之后，使用DIC和HOBt作为偶联剂将(Fmoc)Lys(Dde)-OH(3当量)偶联到PEG的N端，直到获得阴性Kais试验结果，从而表明偶联反应完成。然后使PEG化化合物沉淀，用冷醚清洗。在用20％的DMF哌啶溶液处理除去PEG N端的Fmoc之后，通过经Fmoc肽合成的(Fmoc)Lys(Fmoc)-OH偶联实现分枝结构。将两个柔性间隔分子(Fmoc-Ebes)偶联到赖氨酸的氨基上。然后，在使用20％哌啶的DMF溶液去除Fmoc基团后，将(Fmoc)Lys(Boc)-OH偶联到间隔分子上。在使用Fmoc肽合成方法重复偶联(Fmoc)Ebes-OH接头和(6当量)和(Fmoc)Lys(Boc)-OH(6当量)之后，分别使用2、3、4和5个重复[Ebes-lys(Boc)]单元合成聚合物21、22、23和24的骨架(scaffold)。在使用20％哌啶的DMF溶液除去Fmoc以及使用50％TFA/DCM除去Boc基团之后，使胆酸NHS酯与所述骨架的游离氨基反应，产生P-1系列的聚合物21-24。使聚合物沉淀，用冷醚清洗，并溶于水中。过滤聚合物溶液，然后在具有3.5KDa的MWCO的透析管中用4L水透析；在24小时内完全更新贮库水四次。最后，冻干聚合物。
分枝聚合物系列2。如图48所示的分枝聚合物系列2(图28)的合成：通过Fmoc肽化学使用类似于分枝聚合物系列1的策略合成系列2聚合物。使用N-羟基苯并三唑(HOBt 3当量)/二异丙基碳二亚胺(DIC 3当量)作为偶联剂在DMF中使3-叠氮丙胺(3当量)与FmocNH-PEG-COOH(3000Da)的羧基过夜偶联。随后，使聚合物沉淀，并用冷醚清洗。在用20％哌啶的DMF溶液处理除去Fmoc之后，使用DIC和HOBt作为偶联剂将(Fmoc)Lys(Dde)-OH(3当量)偶联于PEG的N端上，直至获得阴性Kais测试结果，从而表明偶联反应完成。然后使PEG化化合物沉淀，并用冷醚清洗。在用20％哌啶的DMF溶液处理以除去PEG N端上的Fmoc之后，通过经Fmoc肽合成的(Fmoc)Lys(Fmoc)-OH的偶联得到分枝结构。将两个柔性隔离物分子(Fmoc-Ebes)偶联到赖氨酸的氨基上。然后，在用20％哌啶的DMF溶液除去Fmoc基团后，将(Fmoc)Lys(Boc)-OH偶联到隔离物分子上。在使用Fmoc肽合成方法重复偶联(Fmoc)Ebes-OH接头和(6当量)和(Fmoc)Lys(Boc)-OH(6当量)之后，分别使用2、3和4个重复[Ebes-lys(Boc)]单元合成聚合物25、26和27的骨架。在使用使用50％TFA/DCM除去Boc基团之后，使(Fmoc)Lys(Fmoc)-OH偶联到赖氨酸侧链的氨基上，从而使每个重复单元中的氨基加倍。在用20％哌啶的DMF溶液除去Fmoc基团后，使胆酸NHS酯与所述骨架的游离氨基反应，产生支链聚合物系列2的聚合物25-27。使聚合物沉淀，用冷醚清洗，溶于水中。过滤聚合物溶液，然后在具有3.5KDa的MWCO的透析管中用4L水透析；在24小时内完全更新贮库水四次。最后，冻干聚合物。
分枝聚合物系列3。如图49所示的分枝聚合物系列3(图29)的合成：通过Fmoc肽化学使用类似于分枝聚合物系列1的策略合成系列3聚合物，区别仅在于在重复单元中不使用Ebes接头分子。使用N-羟基苯并三唑(HOBt 3当量)/二异丙基碳二亚胺(DIC 3当量)作为偶联剂在DMF中使3-叠氮丙胺(3当量)与FmocNH-PEG-COOH(5000Da)的羧基过夜偶联。随后，使聚合物沉淀，用冷醚清洗。在用20％哌啶的DMF溶液处理除去Fmoc之后，使用DIC和HOBt作为偶联剂将(Fmoc)Lys(Dde)-OH(3当量)偶联于PEG的N端上，直至获得阴性Kais测试结果，从而表明偶联反应完成。然后，使PEG化合物沉淀，用冷醚清洗。在用20％哌啶的DMF溶液处理除去PEG N端上的Fmoc之后，通过经Fmoc肽合成的(Fmoc)Lys(Fmoc)-OH的偶联得到分枝结构。使两个(Fmoc)Lys(Boc)-OH偶联到赖氨酸的氨基上。在使用Fmoc肽合成方法重复偶联(Fmoc)Lys(Boc)-OH(6当量)之后，分别使用2、3、4和5个重复[lys(Boc)]单元合成聚合物28、29、30和31的骨架。在使用50％TFA/DCM除去Boc基团之后，使胆酸NHS酯与骨架的游离氨基反应，产生支链聚合物系列3的聚合物28-31。使聚合物沉淀，用冷醚清洗，溶于水中。过滤聚合物溶液，然后在具有3.5KDa的MWCO的透析管中用4L水透析；在24小时内完全更新贮库水四次。最后，冻干聚合物。
分枝聚合物系列4。分枝聚合物系列4(图30)的聚合物骨架与系列3中的聚合物相同，使用十七烷酸替代胆酸作为疏水性区段(图50)。使用N-羟基苯并三唑(HOBt 3当量)/二异丙基碳二亚胺(DIC 3当量)作为偶联剂在DMF中使3-叠氮丙胺(3当量)与FmocNH-PEG-COOH(5000Da)的羧基过夜偶联。随后，使聚合物沉淀，用冷醚清洗。在用20％哌啶的DMF溶液处理除去Fmoc之后，使用DIC和HOBt作为偶联剂将(Fmoc)Lys(Dde)-OH(3当量)偶联到PEG的N端，直至获得阴性Kais测试结果，从而表明偶联反应完成。然后，使PEG化合物沉淀，用冷醚清洗。在用20％哌啶的DMF溶液处理除去PEG N端的Fmoc之后，通过经Fmoc肽合成的(Fmoc)Lys(Fmoc)-OH的偶联得到分枝结构。使两个(Fmoc)Lys(Boc)-OH偶联到赖氨酸的氨基上。在使用Fmoc肽合成方法重复偶联(Fmoc)Lys(Boc)-OH(6当量)之后，分别使用2、3、4和5个重复[lys(Boc)]单元合成聚合物35、36、37和38的骨架。在使用50％TFA/DCM除去Boc基团之后，使十七烷酸NHS酯与骨架的游离氨基反应，产生支链聚合物系列3的聚合物35-38。使聚合物沉淀，用冷醚清洗，溶于水中。过滤聚合物溶液，然后在具有3.5KDa的MWCO的透析管中用4L水透析；在24小时内完全更新贮库水四次。最后，冻干聚合物。
实施例6：药物装载
药物装载方法：已经优化了在水溶液中将作为疏水药物的PTX装载到聚合物纳米载体中。我们评价了三种不同的方法：
直接溶解法：将1mg PTX粉末添加到0.1ml聚合物水溶液(10mg/ml)中。在室温下将混合物超声处理2小时，然后以1000rpm离心，以除去不溶解的药物。通过0.2m孔径的滤器过滤上清。通过HPLC确定PTX的装载：抽取出药物-胶束溶液的等分试样，用DMSO稀释10倍，然后注入HPLC中。根据PTX峰下面积计算PTX浓度。我们能够显示，相比于使用线型PEG，PEG-CA聚合物溶液可将PTX在水溶液中的溶解度增加约10倍。该方法避免了使用有机溶剂。使用此方法，我们观察到，聚合物4的载药能力高于聚合物2和6，它可达到1.1mg/ml的载药能力。
透析法：将0.1ml在DMSO中的浓PTX溶液逐滴加到PBS中的聚合物溶液(10mg/ml)中，同时在涡旋混匀器上搅拌。在室温下将混合物超声处理2小时，以促进将药物装载进胶束。使用具有MWCO 3000的膜以PBS透析或者通过离心过滤除去DMSO和游离药物。
蒸发法：首先将PTX和聚合物溶于有机溶剂，例如氯仿、丙酮、乙醇等。在圆底烧瓶中真空旋转蒸发有机溶剂，形成薄膜，将其在高真空下进一步干燥30分钟，以除去有机溶剂。向烧瓶中加入PBS缓冲溶液，然后超声处理2小时以将聚合物-药物缀合物分散到水中。最后，通过0.2μm滤器过滤胶束溶液。
将DiD和PTX共装载入胶束为了使用光学成像系统监测PEG5k-CA8纳米颗粒的实时生物分布，使用上述相同的蒸发法将DiD(疏水性NIRF染料)和PTX共装载进纳米载体中。通过HPLC测定装载进PEG5k-CA8纳米颗粒中的PTX浓度。通过动态光扫描(DLS)评价PTX和DiD装载后纳米颗粒的平均直径和ζ电位。
表1总结了上述多种新纳米载体的物理化学性质。总的说来，具有5kDa PEG链的聚合物7-9似乎能够产生具有最佳治疗尺寸(20-60nm)和药物装载性质的纳米载体。我们将我们的卵巢癌靶向配体与聚合物7中PEG接头的叠氮基缀合，用于卵巢癌治疗靶向研究。
表1.多种新纳米载体的物理-化学性质
a通过MALDI-TOF MS分析获得，α-氰基-羟基-肉桂酸作为基质化合物。b通过1H NMR方法获得。基于通过MALDI-TOF MS得到的起始PEG分子量，根据1H NMR谱中胆酸甲基质子信号与PEG质子信号的比值计算分子量。c使用芘(2×10-6M)作为探针通过荧光光谱测定CMC。d通过动态光散射粒度仪
Figure BPA00001331520200242
测得。e通过0.45μm滤膜后在20mg/mL末端树枝状聚合物存在时通过HPLC测得的PTX装载。N/D表示检测不到。f通过蒸发法使用10mg/mL聚合物将PTX装载于纳米载体中。g在通过0.45μm滤膜后分析PTX的装载。hCF＝甲酸胆固醇酯；LA＝石胆酸；HA＝十七烷酸。
表2.使用胆酸作为构建块的线型和分枝聚合物的物理化学性质
Figure BPA00001331520200251
a通过动态光散射
Figure BPA00001331520200252
测得，在PBS中聚合物浓度保持在20mg/mL；b通过动态光散射
Figure BPA00001331520200253
测得，通过蒸发法使用20mg/mL聚合物将PTX装载于纳米载体中，在其后括号中显示PTX载量；c由相应聚合物制备的纳米载体的PTX载药能力，通过蒸发法使用20mg/mL聚合物将PTX装载于纳米载体中。d用十七烷酸基团代替胆酸基团。
实施例7：药物释放
使用PBS溶液透析法研究PTX在体外从纳米载体中的释放。在本实验中，将PBS中的PTX(3.2mg/ml)装载到10mg/ml的4.6ml聚合物5(PEG3000-CA8)中，注射进3-12ml的具有MWCO 3,500的透析袋(PierceChemical Inc.)中，用4L PBS进行透析。通过HPLC测定不同时间点时透析袋中保留的PTX浓度。累积的药物释放曲线显示于图10。24小时后，约50％的PTX从胶束中释放出来。
实施例8：纳米载体的稳定性
使用Nanotrac DLS粒度仪在4℃保存过程中不同时间点监测来自PEG5000-CA8(聚合物7)的载有Abraxane和PTX的纳米颗粒的粒度。在保存5天后，发现Abraxane具有较大的尺寸(130nm)，并形成较大的聚集体(～3μm)，有可见的白色沉淀(图11)。相反，PTX-纳米载体7的粒度未改变，并且在相同时间段中没有可见的沉淀。
实施例9：载有PTX的纳米载体的大小
在胎牛血清(FBS)存在下研究了载有PTX之胶束的尺寸。图12显示，随着在10％FBS中载入纳米载体7中PTX浓度的增加，发现纳米载体的粒度稳定在约20nm。图13显示，载有PTX的聚合物5的纳米载体在不同浓度的FBS中保持稳定在90nm，与存在于FBS中的6.5nm颗粒共存。上述研究表明，载有药物的胶束在血清中稳定，这对临床应用来说是关键性的。
实施例10：纳米载体的细胞毒性
在96孔板中使用SKOV-3(卵巢癌细胞系)通过MTT测定评价单独PEG-CA聚合物的细胞毒性(图14)。发现聚合物4、7和16在直至1mg/ml的聚合物浓度下仍没有可观察到的细胞毒性。聚合物5仅在1mg/ml浓度时显示轻微的细胞毒性，并发现在低于100μg/mL时是无毒的。(B)未装载的PEG5000-CA8NP和cremophor：乙醇载体对HFF1人成纤维细胞的细胞毒性。假定人平均血容量为6L，C1和C2分别是体内施用后PEG5000-CA8和cremophor：乙醇的估计血液浓度。
测定了载有PTX的纳米载体和两种紫杉醇临床制剂(
Figure BPA00001331520200261
和
Figure BPA00001331520200262
)对两种不同卵巢癌细胞系的细胞毒性。在与药物一起孵育72小时后，清洗细胞，进行MTT测定。发现五种紫杉醇制剂的IC50相当。在ES-2细胞系中，PTX-PEG3000-CA8似乎比其他制剂更有效力(图15)。
实施例11：在异种移植小鼠模型I中PEG 5000 -CA 8 -PTX的体内效力研究
用不同紫杉醇制剂每4天治疗具有用萤光素酶基因转染的人SKOV-3卵巢癌细胞的裸鼠，共5次给药。肿瘤应答的结果显示于图16中。当异种移植物相对较小时(50mm3)施用不同紫杉醇制剂；在这五种方案中的每一种中，直至第一次治疗给药后的第28天都未检测到肿瘤生长。相比之下，用单独PBS处理的对照小鼠在第一次治疗给药后约16天显示出快速的肿瘤生长。
在这五个处理组和一个盐水对照组中，未观察到急性毒性。在研究过程中对这些小鼠称重。结果显示于图17。对于用taxol处理的组而言，在治疗的第一周里小鼠有显著的体重下降，并且在整个实验中相比于五个治疗组而言体重继续降至最低。相比之下，对于盐水对照组、Abraxane组和三个PEG5000-CA8-PTX组来说，小鼠体重相似，表明三种新紫杉醇纳米治疗剂至少与Abraxane具有同样的有效性和耐受性。
还研究了在紫杉醇方案的第一次给药后第28天，五种方案对RBC和WBC计数的作用。结果显示于图18。在五个治疗组和一个对照组中RBC计数的变化未见显著差异。相比之下，在Taxol组中观察到显著的骨髓抑制(WBC计数下降70％)。Abraxane组中WBC计数下降30％。相比之下，在三个PEG5K-CA8-PTX组中WBC计数仅下降10-20％。此数据表明，三种新紫杉醇纳米治疗剂比Taxol和Abraxane的骨髓抑制更低。
实施例12：在异种移植小鼠模型I中纳米载体的生物分布
在图19中，在通过尾静脉以每只小鼠4nmol的剂量注射四种不同纳米载体-染料缀合物(载有和未载有PTX的NP(PEG3000-CA8)-Cy5.5和LLP2A-NP-Cy5.5)后第48小时，记录具有皮下Molt-4肿瘤之小鼠的体内近红外(NIR)荧光图像。在所有四只小鼠中观察到荧光摄入到肿瘤中。还进行了器官和所切除肿瘤的离体成像(图20)。发现NP-染料缀合物在Molt-4和K562肿瘤中都有高摄取。肝摄取非常显著。但是，包括肾在内的其他器官的摄取非常低。在施用NP-Cy5.5和NP-Cy5.5-PTX的小鼠中，Molt-4肿瘤的摄取明显高于肝脏。但是，LLP2A配体的存在与否看来对肿瘤或肝脏摄取纳米颗粒没有影响。
实施例13：异种移植小鼠模型II中纳米载体的生物分布的尺寸效应
为了研究粒径对纳米颗粒体内生物分布的影响，将相同浓度的DiD(一种疏水性近红外(NIR)花青染料，1mg/mL)与PTX(分别为4mg/mL，4mg/mL和3mg/mL)共同装载到20mg/mL的PEG2000-CA4、PEG5000-CA8和PEG3000-CA4的胶束溶液中，以形成具有不同尺寸(分别为17nm、64nm和154nm)的三种荧光标记胶束制剂(图35a)。将这三种尺寸的载有DiD的胶束中的每一种与Raw 264.7巨噬细胞共孵育2小时。然后，用PBS将细胞清洗三遍，用70％乙醇固定，并在共聚焦荧光显微镜下观察。如图35b所示，与两种较小胶束相比，较大胶束(154nm)优先被巨噬细胞所摄取，这与流式细胞术分析数据一致(数据未显示)。使用NIR荧光成像来评价具有不同尺寸的三种胶束在裸鼠中的体内生物分布，所述裸鼠具有SKOV-3卵巢癌异种移植物(皮下和腹膜内植入物)。通过尾静脉向小鼠注射相同体积的上述三种在PBS中的载有PTX-DiD的胶束制剂。在注射后24小时进行所切除器官和肿瘤的离体成像。图35c显示，较大的纳米颗粒(154nm)在肝脏和肺中显示最高的荧光强度，这可能是由于在这些器官中巨噬细胞的非特异性摄取；但肿瘤对荧光的摄取却很低。相对而言，较小胶束(17和64nm)的肿瘤摄取比正常器官高得多。随时间记录用DiD-PTX-PEG5000CA8处理的荷瘤小鼠的体内NIR图像。载有DiD的胶束通过EPR作用在肿瘤部位的累积从注射后2小时开始，在24小时中持续增加。相对而言，在用游离染料处理的荷瘤小鼠中未发现肿瘤靶向(图像未显示)。
实施例14：NMR和CryoTEM研究
NMR研究。如图33A所示，在氘代氯仿(其为PEG和胆酸的良好溶剂)中采集末端树枝状聚合物PEG5000-CA8的质子NMR谱。可检测到亲水性PEG链(3.3-3.6ppm)和两亲性胆酸(0.6-2.2ppm)的信号，可根据3.65ppm的积分峰值PEG与胆酸上甲基之一的强度(0.67ppm)之比计算PEG链的比例和胆酸数。基于NMR研究，该式计算为PEG5000-CA7.3，其非常接近于理论式PEG5000-CA8。但是，当NMR研究在水中进行时，未测得树枝状聚合物胆酸的信号(0.6-2.2ppm)(图33B)；仅检测到PEG的质子(3.2-3.8ppm)。这证明，胆酸的疏水性部分在水中聚集在一起，限制了胆酸结构部分的运动并显著增加了弛豫时间(D2)，导致NMR谱的弱信号。此NMR数据支持了水中末端树枝状聚合物的胶束模型。
CryoTEM研究。CryoTEM允许观测水合胶束在水性条件下的真实形态和尺寸。通过DLS测量，在载入PTX后，胶束的尺寸增加到50至60nm。同时，胶束核心的密度增加。图34显示以4.4mg/ml装载PTX的PEG5000-CA8的cryoEM图像。在作为标准品的宽度为18nm的烟草花叶病毒(TMV)不存在(A)和存在(B)时获取显微照片。观察到尺寸为30至60nm的球形胶束，其与DLS测量所获得的结果(60nm)一致。
实施例15：通过MALDI-ToF MS和AFM图像对胶束的表征
MALDI ToF MS.在树枝状聚合物物理特性以及纳米颗粒体内被动肿瘤靶向作用的研究中，将具有不同PEG链长度(2-10kDa)的单官能化MeO-PEG-NH2用于缀合树枝状嵌段中不同数量的CA(4、8和16)，以制备一系列末端树枝状聚合物(表1)，MALDI-TOF质谱分析显示末端树枝状聚合物的分子量随着胆酸数的增加而成比例增加(图36)。由MALDI-ToF MS法获得的分子量非常接近于理论值(表1)，其强烈表明末端树枝状聚合物的明确结构，这用标准嵌段共聚物方法是非常难以实现的。
AFM图像。将由硫醇官能化的HS-PEG5000-CA8(结构显示于图51)制备的胶束(DLS显示16±4nm)和载有PTX的胶束(DLS显示6.4mgPTX/mL、23±8nm)固定于金表面用于进行AFM扫描。在水溶液中获得轻敲模式AFM拓扑图。空的和载有药物的胶束显示为个别固定的纳米颗粒，平均尺寸分别为15nm和26nm，其接近于通过DLS测量获得的粒径(图37)。
实施例16：在异种移植小鼠模型III中纳米载体的生物分布的尺寸效应
研究了在腹膜内具有SKOV3-luc卵巢瘤之小鼠中在腹膜内注射后PEG5000-CA8(聚合物7)纳米颗粒的生物分布。用游离DiD或载有DiD的PEG5000-CA8纳米颗粒腹膜内注射小鼠。在用游离DiD处理的小鼠中，荧光在注射后在整个身体中快速扩散，并在72小时时下降至无法与背景自发荧光相区分的水平。相对而言，注射DiD标记的PEG5000-CA8纳米颗粒的小鼠产生主要定位于腹部的强荧光，在72小时大部分仍存在(图38A)。在72小时时，暴露腹腔，用Kodak成像工作站扫描，显示定位于腹膜肿瘤节表面上的DiD-标记的PEG5000-CA8纳米颗粒(图38)。此结果证实了PEG5000-CA8药物载体显著延长了紫杉醇在腹腔中的停留时间，减少了药物从腔吸收进入全身循环的速率和程度。
实施例17：在异种移植小鼠模型II中PEG 5000 -CA 8 -PTX的体内效力研究
在具有皮下SKOV3-luc肿瘤的小鼠中评价了静脉注射后PTX-PEG5000-CA8NP的抗肿瘤作用。在第0、4、8天(第一疗程)施用PBS、
Figure BPA00001331520200301
(13.4mg/kg)、
Figure BPA00001331520200302
(30mg PTX/kg)和PTX-PEG5000-CA8NP(13.4和30mg PTX/kg)。在用所有PTX制剂处理的小鼠中肿瘤生长均被抑制，其中30mg PTX/kg的PTX-PEG5000-CA8NP最有效。但是，随后在所有这些处理组中观察到肿瘤发展。在第38天开始第二轮治疗。总的来说，在静脉内施用
Figure BPA00001331520200303
和PTX-PEG5000-CA8NP后，小鼠显示肿瘤生长速率降低(图39A)。但是，相比于
Figure BPA00001331520200304
PTX-PEG5000-CA8显示更好的抗肿瘤活性。到第73天，相对于初始肿瘤尺寸，对于Taxol来说中位相对肿瘤体积(RTV)是14.9，而对于13.4mgPTX/kg PTX-PEG5000-CA8NP、Abraxane和30mg PTX/kgPTX-PEG5000-CA8NP来说，RTV分别是10.7、7.9和5(对所有而言P＜0.05)。另外，在30mg PTX/kg PTX-PEG5000-CA8NP组中注意到有单个完全应答，而在其他任何组中则没有完全应答。
通过分析对动物行为、体重变化、血细胞计数和肝肾功能的作用来评估毒性。注意到接受Taxol处理的小鼠常在注射后10分钟表现出总体活动减少，而施用任一种剂量的PTX-PEG5000-CA8NP后均没有观察到活动的显著改变。在Taxol组中观察到的此行为差异可与使用Cremophor EL和乙醇作为紫杉醇的载体有关。Taxol组显示在两轮治疗中体重均显著减轻(P＜0.05)，而在PTX-PEG5000-CA8NP组中体重没有下降(图39B)。在最后一次注射后第3天，采集血液样品用于血细胞计数和血清化学测定。所有组中白细胞(WBC)、红细胞(RBC)和血小板计数都在正常范围内，排除了潜在的血液学毒性。所有组中血清化学(ALT、AST、总胆红素、BUN和肌酸酐)也在正常范围内，表明没有肝肾毒性。肝脏的组织学检查进一步证实了没有肝毒性。
实施例18：在异种移植小鼠模型III中PEG 5000 -CA 8 -PTX的体内效力研 究
在腹膜转移卵巢癌原位小鼠模型中评价腹膜内治疗后PTX-PEG5000-CA8NP的治疗效力并与
Figure BPA00001331520200311
和
Figure BPA00001331520200312
进行比较。在第0、4、8、12和16天，向具有腹膜内转移SKOV3-luc卵巢癌异种移植物的裸鼠腹膜内注射
Figure BPA00001331520200313
(20mg/kg)、(45mg PTX/kg)和PTX-PEG5000-CA8(20和45mg PTX/kg)，共五剂。治疗后每周进行生物发光成像，通过测定伪彩强度对肿瘤生物发光进行定量(图40A)。相比于对照组，所有治疗组中的小鼠显示出显著减慢的光强度增加速率(P＜0.05)。在治疗组中，在相当的PTX剂量下，PTX-PEG5000-CA8组中的光强度低于和
Figure BPA00001331520200316
组中的。值得注意的是，20mg PTX/kgPTX-PEG5000-CA8NP组中的一只小鼠和45mg PTX/kgPTX-PEG5000-CA8NP组中的两只小鼠在随后的复发之前对治疗出现完全应答。相反，用
Figure BPA00001331520200317
治疗的小鼠均未显示出完全应答。随访所有小鼠，以确定存活长度。PBS对照组中未治疗小鼠的中位存活时间是39天(29-45天范围)，而所有三种PTX制剂治疗都显著延长了中位存活时间(P＜0.001)。然而，PTX-PEG5000-CA8NP治疗在相当的PTX剂量下显示出比
Figure BPA00001331520200318
和
Figure BPA00001331520200319
更大的存活益处。
Figure BPA000013315202003110
组的中位存活时间是65天(范围37-81)，对于20mg PTX/kg PTX-PEG5000-CA8NP组是74天(范围49-92)。
Figure BPA000013315202003111
组的中位存活是81天(范围55-90)，而45mg PTX/kgPTX-PEG5000-CA8NP组是85天(范围66-105+)(图40B)。
实施例19：分枝聚合物系列P-1的制备
胆酸的线型PEG化两臂寡聚物通过逐步的肽化学来合成。例如，我们通过液相反应从线型聚乙二醇开始合成P-1系列聚合物(图41)。使用N-羟基苯并三唑(HOBt 3当量)/二异丙基碳二亚胺(DIC 3当量)作为偶联剂在DMF中将3-叠氮丙胺(3当量)与FmocNH-PEG-COOH(3000Da)的羧基过夜偶联。随后，使聚合物沉淀，用冷醚清洗。在用20％哌啶的DMF溶液处理除去Fmoc之后，使用DIC和HOBt作为偶联剂将(Fmoc)Lys(Dde)-OH(3当量)偶联到PEG的N端，直至获得阴性Kais测试结果，从而表明偶联反应完成。然后，使所述PEG化化合物沉淀，用冷醚清洗。然后，通过相同的Fmoc肽合成步骤，逐步将(Fmoc)Lys(Fmoc)-OH(3当量)、(Fmoc)Ebes-OH(6当量)、(Fmoc)Lys(Boc)-OH(6当量)偶联到上述PEG化产物上。分别通过将(Fmoc)Ebes-OH与(Fmoc)lys(Boc)-OH重复偶联2、3、4和5次来构建聚合物21、聚合物22、聚合物23和聚合物24的骨架。在除去Boc和Fmoc基团之后，使胆酸NHS酯与所述骨架的游离氨基反应，产生P-1系列的四种聚合物。然后，使聚合物沉淀，用冷醚清洗并溶于水。过滤聚合物溶液，在3.5kDa的MWCO的透析管中用4L水透析；在24小时内完全更新贮库水四次。最后，冻干聚合物。用类似策略通过使用Fmoc-lys(Fmoc)-OH与Fmoc-lys(Boc)-OH的不同组合以及不同轮数的偶联和Fmoc去保护来合成P-2、P-3和P-4系列。
实施例20：聚合物P-1和P-2系列的TEM图像
在用磷钨酸(0.1wt％)对风干的胶束染色后在透射电子显微镜(TEM)下观察胶束形态。如图42(A1)所示，较小聚合物23(～10nm)和较大聚合物25(～150nm)胶束保持圆形且大小均匀。在高倍镜下，聚合物25的清晰核心-壳结构很明显(图42A3)。动态光散射(DLS)测量表明聚合物23和聚合物25胶束的平均直径分别为11和157nm，其与TEM下观察到的一致。
实施例21：P-1、P-2和P-3系列聚合物中的PTX装载及其尺寸
可通过溶剂蒸发法将多种水溶性差的抗肿瘤药物有效包囊进这些胶束中。紫杉醇(PTX)是用于治疗多种恶性肿瘤的广谱抗肿瘤药。由于PTX的水溶性极低(1μg/ml)，市售PTX制剂
Figure BPA00001331520200321
配制在无水乙醇和Cremophor EL的混合物中，其可导致严重的副作用。
Figure BPA00001331520200322
是130nm的结合白蛋白的紫杉醇颗粒制剂。在本文中，我们证明了PTX可在水溶液中容易地装载进我们的胶束中(图43A)。观察到，相比于更低或更高CMC值的胶束，CMC值为4.5-7.8μm的胶束倾向于具有更好的PTX载药能力(≥4.5mg/ml)。聚合物23胶束(CMC：5.8μM)具有最高的紫杉醇载药能力，为12.0mg/ml(图43B)，其相当于37.5％(w/w)的胶束总质量。这表明，PTX的聚合物23胶束制剂可使得该药物的水溶解度增加12000倍。因此，在载药能力方面，聚合物23胶束比两种临床PTX制剂(即Taxol(6.0mg/ml)和Abraxane(5.0mg/ml))要优秀得多，其他常规胶束制剂据报道具有低于25％的PTX装载能力。此外，当PTX总计达10mg/ml时，装载效率几乎是100％，最终粒径仍保持在25-30nm的范围内(图43B、43C)。
实施例22：PTX从聚合物23所形成的胶束中的释放
在37℃下PBS中研究了载有PTX之胶束的PTX释放特性。在药物释放研究中，载有PTX的聚合物23胶束显示在24小时内没有明显的“集中释放”(＜30％)，PTX释放持续多达7天(图44)。在试验结束时，80％的所载PTX已从胶束中释放出来。
实施例23：由聚合物23所形成的载有PTX的胶束的稳定性
在4℃下贮存中评价这些胶束制剂的长期稳定性。载有药物的胶束在4℃下贮存8个月，观察到在尺寸和药物含量上都非常稳定。相对而言，
Figure BPA00001331520200331
形成较大的聚集物，在贮存两天后沉淀。此外，进行在动物模型中胶束或载药胶束的药代动力学建模和效力数据的基本评价，在血清或血清白蛋白存在下测试胶束或载药胶束的稳定性。同样地，在生理相关浓度的牛血清白蛋白(BSA)(45mg/ml)存在下以及在50％(v/v)狗血浆中37摄氏度下96小时孵育期中，载有7.3mg/ml PTX的聚合物23胶束保持约30nm的均一尺寸(图45)。反之，在这样的条件下对来说，则观察到了显著的尺寸变化。这些体外稳定性研究表明，这些载有PTX的胶束可在生理条件下具有长循环时间。已有报道称，载药聚合物胶束通常随载药的增加而变得更不稳定。相反，聚合物23形成的胶束在贮存中或在生理条件下，甚至是在非常高的载药量下，都保持非常稳定。
实施例24：由P-1系列聚合物形成的载有PTX之胶束的细胞毒性
为了临床上可用，纳米载体本身应是无毒的。新型聚合物的四个构建嵌段全部都是生物相容分子。通过MTT测定，针对SKOV-3卵巢癌细胞，在高达1mg/ml下纳米载体本身显示出没有可观察到的细胞毒性(图46A)。载有RTX的纳米载体与紫杉醇的两种临床制剂(
Figure BPA00001331520200333
和)相比，具有相当的体外抗肿瘤作用，对于SKOV-3卵巢癌细胞的IC50值为1.21至4.37ng/ml(图46B)。
实施例25：在卵巢癌异种移植小鼠模型中胶束的生物分布
可将疏水性荧光探针以物理方法掺入胶束中，用于体内示踪。因此，将高氯酸1，1′-双十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚-二碳花青(DiD)(一种疏水性近红外(NIR)荧光染料)与PTX一起载入聚合物23胶束中。如DLS所测得的，最终胶束的粒径是30±10nm。进行NIR光学成像研究，以评价纳米载体在具有人SKOV-3卵巢癌异种移植物的小鼠中的生物分布和肿瘤靶向能力。通过尾静脉将100μl DiD和PTX共装载的胶束溶液注射到小鼠中，然后用Kodak成像系统(IS2000MM)在不同时间点扫描小鼠。在注射后3小时，在肿瘤和背景之间观察到荧光信号的差异，在24小时变得更加显著(图47A)。离体成像进一步证实了纳米载体优先在肿瘤而不是正常器官中积累(图47B)。这可能是由于胶束体内循环时间的延长，以及尺寸介导的提高的渗透性和保留(enhanced permeability andretention，EPR)作用。
实施例26：巯基化末端树枝状聚合物HS-PEG 5000 -CA 8 的制备
通过溶液相缩合反应在线型聚乙二醇上合成巯基化末端树枝状聚合物HS-PEG5000-CA8(图51)。通过在冷醚中沉淀实现可溶性PEG化产物的分离。将S-Trtyl保护的2-巯基乙胺偶联到具有5000Da分子量的Fmoc保护的氨基-PEG-COOH的羧基上。在用20％哌啶的DMF溶液处理除去Fmoc之后，使用DIC和HOBt作为偶联剂将(Fmoc)Lys(Fmoc)-OH偶联于PEG的N端上。通过Fmoc肽合成通过重复偶联(Fmoc)lys(Foc)-OH制备第三代树枝状聚赖氨酸。通过胆酸NHS酯将胆酸引入分枝赖氨酸的氨基上。通过用DCM中的50％TFA处理除去trtyl基团，以产生HS-PEG5000-CA8，其可固定于金表面用于胶束的AFM成像。
尽管为便于理解已通过举例说明和实施例详细地描述了上述发明，但是本领域技术人员会了解，在所附权利要求的范围内可进行某些变化和修改。此外，本文中提供的每篇参考文献均通过引用全文并入本文，其程度如同每篇参考文献各自通过引用并入。

Claims (25)

1.具有内部和外部的纳米载体，所述纳米载体包含至少一种缀合物，其中每一缀合物包含：
聚乙二醇(PEG)聚合物；
至少两个两亲性化合物，其同时具有亲水面和疏水面；和
寡聚物，其中所述两亲性化合物中的至少两个与共价连接至所述PEG的所述寡聚物共价连接；
其中每一缀合物在水性溶剂中自组装形成所述纳米载体，使得由于每一两亲性化合物的疏水面彼此相对的取向而在该纳米载体内部形成疏水口袋，其中每一缀合物中的PEG在该纳米载体的外部自组装。
2.权利要求1的纳米载体，其中所述纳米载体还包含疏水性药物或成像剂，使得该疏水性药物或成像剂被隔离在所述纳米载体的疏水口袋中。
3.权利要求1的纳米载体，其中所述寡聚物包含多个单体单元，其各自独立地选自：二氨基羧酸、二羟基羧酸和羟基氨基羧酸。
4.权利要求3的纳米载体，其中所述二氨基羧酸是氨基酸。
5.权利要求3的纳米载体，其中每种二氨基羧酸独立地选自：2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸、2，5-二氨基戊酸(鸟氨酸)、2，6-二氨基己酸(赖氨酸)、(2-氨基乙基)-半胱氨酸、3-氨基-2-氨基甲基丙酸、3-氨基-2-氨基甲基-2-甲基丙酸、4-氨基-2-(2-氨基乙基)丁酸和5-氨基-2-(3-氨基丙基)戊酸。
6.权利要求3的纳米载体，其中每种二羟基羧酸独立地选自：甘油酸、2，4-二羟基丁酸、2，2-双(羟甲基)丙酸、2，2-双(羟甲基)丁酸、丝氨酸和苏氨酸。
7.权利要求3的纳米载体，其中每种羟基氨基羧酸独立地选自丝氨酸和高丝氨酸。
8.权利要求3的纳米载体，其中所述单体单元中的至少一种任选地与选自下列的成员相连：光学探针、放射性核素、顺磁性物质、金属螯合物和药物。
9.权利要求2的纳米载体，其中所述疏水性药物选自：紫杉醇、SN38、喜树碱、依托泊苷和多柔比星。
10.权利要求1的纳米载体，其中，每种两亲性化合物独立地选自：胆酸、别胆酸、蟒胆酸、禽胆酸、脱氧胆酸和鹅脱氧胆酸。
11.权利要求1的纳米载体，其中所述缀合物具有式I：
Figure FPA00001331520100021
其中
A是1-100kDa的聚乙二醇(PEG)聚合物，其中A任选地与结合配体L相连；
X各自为单体单元；
X’是任选地与选自光学探针、放射性核素、顺磁性物质、金属螯合物和药物中的成员相连的单体单元；
Y各自为间隔基单体单元；
R1各自独立地选自H、光学探针、放射性核素、顺磁性物质、金属螯合物、药物以及1-100kDa的聚乙二醇(PEG)聚合物，所述聚乙二醇(PEG)聚合物任选地与选自光学探针、放射性核素、顺磁性物质、金属螯合物和药物中的成员相连；
R2各自独立地选自胆酸和取代有两个胆酸基团的单体单元，其中每个胆酸基团任选地取代有1-3个聚乙二醇(PEG)聚合物，所述聚乙二醇聚合物各自独立地大小为200-10,000Da；并且
下标m为2-20。
12.权利要求11的纳米载体，其中所述缀合物具有式Ia：
Figure FPA00001331520100022
其中
A是3kDa的PEG聚合物；
X’的单体单元是赖氨酸；
X各自为赖氨酸；
Y各自为
Figure FPA00001331520100031
并且
R2各自为与两个胆酸基团相连的赖氨酸。
13.权利要求1的纳米载体，其中所述缀合物具有式II：
Figure FPA00001331520100032
其中
A是1-100kDa的聚乙二醇(PEG)聚合物，其中A任选地与结合配体L相连；
X各自为单体单元；
X’是任选地与选自光学探针、放射性核素、顺磁性物质、金属螯合物和药物中的成员相连的单体单元；
Y各自为间隔基单体单元；
R1各自独立地选自H、光学探针、放射性核素、顺磁性物质、金属螯合物、药物和1-100kDa的聚乙二醇(PEG)聚合物，其中所述聚乙二醇(PEG)聚合物任选地与选自光学探针、放射性核素、顺磁性物质、金属螯合物和药物中的成员相连；
R2各自独立地选自胆酸和取代有两个胆酸基团的单体单元，其中其中每个胆酸基团任选地取代有1-3个聚乙二醇(PEG)聚合物，所述聚乙二醇聚合物各自独立地大小为200-10,000Da；并且
下标m和m’各自独立地为2-20；并且
下标p是0-10。
14.权利要求13的纳米载体，其中所述缀合物具有式IIa：
Figure FPA00001331520100033
15.权利要求14的纳米载体，其中R2各自为胆酸。
16.权利要求14的纳米载体，其中R2各自为与两个胆酸基团相连的单体单元。
17.权利要求13的纳米载体，其中所述缀合物具有式IIb：
Figure FPA00001331520100041
其中
A是3kDa的PEG聚合物；
X’的单体单元是赖氨酸；
X各自为赖氨酸；
Y各自为
Figure FPA00001331520100042
R2各自为胆酸；并且
下标m和m’各自为4。
18.根据权利要求13的纳米载体，其中所述缀合物具有式IIc：
其中下标p是1-10。
19.权利要求1的纳米载体，其中所述缀合物具有式III：
Figure FPA00001331520100044
其中
A是1-100kDa的聚乙二醇(PEG)聚合物，其中A任选地与结合配体L相连；
X各自为单体单元；
X’是任选地与选自光学探针、放射性核素、顺磁性物质、金属螯合物和药物中的成员相连的单体单元；并且
R2各自是胆酸，其中每个胆酸基团任选地取代有1-3个聚乙二醇(PEG)聚合物，所述聚乙二醇聚合物各自独立地大小为200-10,000Da。
20.权利要求19的纳米载体，其中所述缀合物具有式IIIa：
Figure FPA00001331520100051
其中
A是5kDa的PEG聚合物；
X’的单体单元是赖氨酸；
X各自为赖氨酸；并且
R2各自为胆酸。
21.一种治疗疾病的方法，包括向有此治疗需要的对象施用治疗有效量的权利要求2的纳米载体，其中所述纳米载体还包含药物。
22.权利要求21的方法，其中所述药物是被隔离在所述纳米载体内部的疏水性药物。
23.权利要求21的方法，其中所述纳米载体还包含成像剂。
24.权利要求21的方法，其中所述纳米载体还包含放射性核素。
25.一种成像方法，包括向待成像对象施用有效量的权利要求2的纳米载体，其中所述纳米载体还包含成像剂。
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