CN107955153B - 一种聚乙二醇-去氧胆酸及其衍生物的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属制药技术领域，具体涉及一种聚乙二醇‑去氧胆酸及其衍生物的制备方法和应用；聚乙二醇‑去氧胆酸衍生物的母核为聚乙二醇‑去氧胆酸，连接键是氧化还原敏感键、pH敏感键或酶易水解键，配体为疏水性聚氨基酸类化合物、生物相容性聚合物或难溶性抗癌药物；聚乙二醇‑去氧胆酸的制备方法为将去氧胆酸和4‑二甲氨基吡啶溶于无水二氯甲烷中得到去氧胆酸溶液，再取聚乙二醇溶于二氯甲烷中得到聚乙二醇溶液，然后将去氧胆酸溶液和聚乙二醇溶液逐滴滴加到反应瓶中，加入催化剂，反应后得到聚乙二醇‑去氧胆酸。本发明制备得到的聚乙二醇‑去氧胆酸及其衍生物拥有良好的抗多药耐药性，具有很好的应用前景。

Description

一种聚乙二醇-去氧胆酸及其衍生物的制备方法和应用

技术领域

本发明属制药技术领域，具体涉及一种聚乙二醇-去氧胆酸及其衍生物的制备方法和应用。

背景技术

化疗是治疗癌症最常见的手段，但是化疗的效果会因为肿瘤细胞拥有抗耐药性而失败。多药耐药(MDR)，是指肿瘤细胞对不同结构和作用机理的药物产生交叉耐受性，肿瘤细胞对多种化疗药物产生交叉耐药是成为化疗成功的障碍。据不完全统计，90％以上的患者死因与多药耐药有关。MDR的产生的原因有很多，1976年juliano用中国仓鼠卵巢细胞使其对秋水仙碱耐药，首先揭示了MDR与细胞内药物浓度降低有关，并证实细胞内存在一种能量依赖性膜转运蛋白，P-gp作为一种ATP酶活性的跨膜泵或“换位酶”，将摄入细胞内的药物泵出，促使其外流而维持细胞内化疗药物的低浓度水平。因此P-gp的过度表达与肿瘤细胞的固有耐药性有关.

目前临床上使用的抗癌药物，如阿霉素、表阿霉素、丝裂霉素、柔红霉素、紫杉醇、长春新碱、顺铂、喜树碱类等，均为耐药肿瘤细胞所抗。肿瘤细胞获得的抗药性，并不针对一种抗癌药，而是对多种抗癌药，即多药耐药，要增加多药耐药肿瘤细胞对药物的敏感性，办法之一就是促进或抑制P-gp蛋白的功能，增加其蛋白表达量的比例，从而增强肿瘤细胞的凋亡，因此研制促进或抑制这些蛋白功能的药物对肿瘤的化疗有重要意义。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明提供一种聚乙二醇-去氧胆酸及其衍生物的制备方法和应用。本发明制备得到的聚乙二醇-去氧胆酸及其衍生物拥有良好的抗多药耐药性，通过体外肿瘤细胞实验验证其抗多药耐药效应，表明其在抗多药耐药研究中具有良好的应用前景。

为了实现上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：

一种聚乙二醇-去氧胆酸(PEG-DCA)，具有如下分子结构式：

一种聚乙二醇-去氧胆酸衍生物，母核为聚乙二醇-去氧胆酸，连接键是氧化还原敏感键、pH敏感键或酶易水解键，配体为疏水性聚氨基酸类化合物、生物相容性聚合物或难溶性抗癌药物。

优选地，所述氧化还原敏感键为二硫键和单硫键；所述pH敏感键为腙键或亚胺键；所述酶易水解键为酯键、酰胺键或短肽链；所述疏水性聚氨基酸类化合物为聚天冬氨酸苄酯、聚谷氨酸苄酯或聚丙氨酸；所述生物相容性聚合物为聚乳酸或聚己内酯；所述难溶性抗癌药物为紫杉醇、阿霉素、表阿霉素、丝裂霉素、柔红霉素、长春新碱、喜树碱类或多西他赛。

优选地，所述二硫键为3,3’-二硫代二丙羧基。

一种聚乙二醇-去氧胆酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将去氧胆酸和4-二甲氨基吡啶溶于无水二氯甲烷中得到去氧胆酸溶液，再取聚乙二醇溶于二氯甲烷中得到聚乙二醇溶液，然后将去氧胆酸溶液和聚乙二醇溶液逐滴滴加到反应瓶中，加入催化剂，反应后经过抽滤、萃取、真空干燥处理后得到聚乙二醇-去氧胆酸。

一种聚乙二醇-去氧胆酸衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)称取二硫代二丙酸酐0.5～2.5mmol置于装有25mL二氯甲烷的三颈瓶中，氮气保护下搅拌处理，直至二硫代二丙酸酐全部溶解，称取0.1～0.5mmol聚乙二醇-去氧胆酸和0.5mmol DMAP溶于二氯甲烷中得到混合液，将混合液逐滴滴加到三颈瓶中，然后加入三乙胺，反应处理，反应处理后得到中间产物；

(2)称取中间产物0.1～0.5mmol，DMAP 0.2～1.0mmol于100mL的茄型瓶中，加入5～50mL的无水二氯甲烷溶解，N₂保护下搅拌均匀，然后加入0.05～0.5mmol疏水性聚氨基酸类化合物、生物相容性聚合物或难溶性抗癌药物和0.3～1.2mmolDCC，反应24～72h，反应结束后，抽滤，浓缩，乙醚沉淀，抽滤，真空干燥，得到聚乙二醇-去氧胆酸衍生物。

优选地，所述步骤(1)中反应处理温度为25～60℃，反应处理时间为12～48h。

优选地，所述步骤(2)中真空干燥温度为20～55℃。

一种聚乙二醇-去氧胆酸应用于抗肿瘤多药耐药领域。

一种聚乙二醇-去氧胆酸衍生物应用于抗肿瘤多药耐药领域。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的聚乙二醇-去氧胆酸及其衍生物拥有很好的生物相容性，经过溶血实验、覆盖实验、动态凝血时间实验证明该观点。

本发明提供的聚乙二醇-去氧胆酸及其衍生物拥有良好的抗多药耐药性，通过体外肿瘤细胞实验验证其抗多药耐药效应，表明其在抗多药耐药研究中具有良好的应用前景。

附图说明

图1为聚乙二醇-去氧胆酸的核磁图谱。

图2为聚乙二醇-去氧胆酸的红外图谱。

图3为聚乙二醇-去氧胆酸衍生物1的核磁图谱。

图4为聚乙二醇-去氧胆酸衍生物1的红外图谱。

图5为聚乙二醇-去氧胆酸衍生物2的核磁图谱。

图6为聚乙二醇-去氧胆酸衍生物2的红外图谱。

图7为聚乙二醇-去氧胆酸的动态凝血时间曲线图。

图8为MTT法检测聚乙二醇-去氧胆酸与抗癌药联用的细胞死亡率图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件按照说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

称取去氧胆酸1mmol、DMAP1.5mmol于100mL的茄型瓶中，再加入40mL的无水二氯甲烷(CH₂C_l2)常温搅拌30min，转速600r/min，再称取1.1mmol聚乙二醇溶于5mL的二氯甲烷中，然后将其逐滴滴加到反应瓶中，然后加入1.6mmol的DCC(二环己基碳二亚胺)，常温下搅拌24h，反应结束后，抽滤，用0.5mol/L的盐酸萃取一次，再用饱和的食盐水萃取两次，有机层用无水硫酸镁(MgSO₄)干燥，抽滤，旋蒸浓缩溶剂，无水乙醚进行沉淀，放置一夜，抽滤，于37℃真空干燥，得到聚乙二醇-去氧胆酸(PEG-DCA)。

所得聚乙二醇-去氧胆酸的红外与1H核磁图分别见图1和图2，其化学结构如下：

实施例2

1.3,3’-二硫代二丙酸酐的合成

称取3,3’-二硫代二丙酸5g置于真空干燥箱中30℃干燥，另量取50mL乙酰氯于75℃下重新蒸出，蒸馏装置全程密封置于通风橱内，取出真空干燥后的3,3’-二硫代二丙酸，加入上述新蒸乙酰氯，70℃下回流2h，回流结束后减压蒸出多余的乙酰氯，剩余物加过量冰无水乙醚沉淀，置于冰箱下层-20℃冷冻过夜，次日抽滤，取沉淀物于真空干燥箱中45℃干燥10h。得浅黄至灰黄色片状固体，产率约60％。

2.称取上述合成的3,3’-二硫代二丙酸酐1.07g(5.6mmol)，置于100mL的圆底三颈烧瓶中，加入40mL无水DMF，室温下N₂保护搅拌至完全溶解后，加入实施例1合成的PEG-DCA1.5922g(0.7mmol)，完全溶解后再加入DMAP 0.171g(1.4mmol)，另用滴管吸取三乙胺约0.5mL加入其中，室温下继续反应8h，反应完毕后减压旋去溶剂，加入50mL的乙酸乙酯将其溶解完全，用0.5mol/L的稀盐酸洗2遍，饱和氯化钠溶液洗2遍，加无水硫酸镁干燥，密封放置2h使其完全干燥，抽滤除去无水硫酸镁，滤液浓缩后加冰无水乙醚沉淀，置冰箱下层冷冻过夜，抽滤，取沉淀物置真空干燥箱40℃下干燥12h以上，即得深棕色粉末状产物，产率约65％。

3.正丙胺-聚天冬氨酸苄酯(nPBLA)的合成

称取BLA-NCA 2.4923g(10mmol)于100mL三颈圆底烧瓶中，加入60mL新蒸无水二氯甲烷，室温氮气保护下低速搅拌30min以上，用移液器精密移取正丙胺0.5mmol加入到上述反应物中，室温下搅拌72h。反应完毕后将反应得到的溶液滴入过量冰无水乙醚中进行沉淀，置冰箱下层冷冻12h以上使沉淀完全，过滤，取沉淀物35℃下真空干燥24h。得纯白色疏松粉末，产率约85％。

4.聚乙二醇-去氧胆酸衍生物1

称取上述合成的PEG-DCA-DTPA0.2478g(0.1mmol)，DMAP 0.049g(0.4mmol)，加入10mL无水二氯甲烷，N₂保护下搅拌40min，另称取nPBLA 0.2048g(0.05mmol)溶于5mL无水二氯甲烷中，完全溶解后逐滴加入上述反应液当中，滴加完以后加入DCC 0.0845g(0.4mmol)，室温继续反应72h。反应结束后抽滤，滤液浓缩后加冰乙醚沉淀，置冰箱内冷冻使其沉淀完全后抽滤，取滤饼35℃下真空干燥，得到聚乙二醇-去氧胆酸衍生物1(PEG-DCA-SS-nPBLA)。

实验结果：红外与1H核磁图分别见图3和图4，说明聚乙二醇-去氧胆酸衍生物1制备成功。

实施例3

1.PEG-DCA-DTPA的合成

称取二硫代二丙酸酐0.5mmol置于装有25mL二氯甲烷的三颈瓶中，氮气保护下搅拌处理，直至二硫代二丙酸酐全部溶解，称取0.1mmol PEG-DCA，0.5mmolDMAP于8mL的二氯甲烷中，将混合液逐滴滴加到三颈瓶中，然后加入4滴三乙胺，35℃反应24h。反应液用乙醚沉淀，将沉淀用饱和的碳酸氢钠溶解有大量气泡产生，然后用二氯甲烷萃取两次，弃去有机相，再用0.1mol/L的盐酸调pH至2左右，然后用二氯甲烷萃取两次，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，浓缩溶剂，乙醚沉淀，抽滤，37℃真空干燥，得到中间产物(PEG-DCA-DTPA)。

称取PEG-DCA-DTPA 0.1mmol，DMAP 0.2mmol于100mL的茄型瓶中，加入30mL的无水二氯甲烷溶解，27℃下搅拌1h，然后加入0.35mmol PTX和0.8mmol DCC，进行反应48h，反应结束后，抽滤，浓缩除去部分溶剂，乙醚沉淀，抽滤，35℃真空干燥。再用硅胶柱进行层析，洗脱液二氯甲烷：甲醇的比80:1，最终得到聚乙二醇-去氧胆酸衍生物2(PEG-DCA-S-S-PTX)。

实验结果：红外与1H核磁图分别见图5和图6，说明聚乙二醇-去氧胆酸衍生物2制备成功。

实施例4

溶血性实验：取三只大鼠对其进行眼球取血10mL，装入到加抗凝剂的试管中(1mL的血液加入0.1mL的肝素钠溶液)，混匀，得抗凝血，取2mL抗凝血加入2.5mL的生理盐水，得到稀释血液，称取三份10mg的PEG-DCA于试管中，加入5mL的生理盐水，37℃水浴中保持30min，再加稀释血液0.1mL，轻轻混匀，在37℃下继续恒温60min，阳性对照用蒸馏水5mL加稀释血液0.1mL，阴性对照用生理盐水5mL加稀释血0.1mL。以2000r/min离心5min，取上清液在545nm处测其吸光度。

实验结果见附表1：

表1.PEG-DCA的溶血实验结果表

实施例5

动态凝血时间实验：将0.2mL新鲜抗凝血加到事先涂有试样材料的锥形瓶中(称取100mg的PEG-DCA溶于2mL的二氯甲烷中，将溶液滴加到锥形瓶中，室温下挥干溶剂)，然后分别加入25μl的CacL2，与血液混合均匀，开始计时，每组试样按各自情况设多个间隔时间(5、10、20、30、80min)，到预定时间后，分别用100mL蒸馏水缓慢流注与血液表面，收集注流液，在541nm处测其吸光度，用空白锥形瓶和10％甲基硅油硅化锥形瓶作对照，以吸光度值对时间做图，绘制动态凝血时间曲线，所得结果如图7所示。

实施例6

复钙实验：取上述抗凝血4mL于试管中，2000r/min离心5min，得到血小板血浆。取5mg材料于试管中，分别浸入0.1mL血小板血浆，另取一支试管加入0.1mL血小板血浆做空白对照组，将试管置于37℃水浴中1分钟，各加入0.025mol/L氯化钙溶液0.1mL，摇匀，开动秒表计时，不断摇动试管，观察到出现白色纤维蛋白膜时，停止计时。每种均测4次，取平均值。

实验结果见附表2：

表2.PEG-DCA的复钙实验结果表

实施例7

急毒实验：取七至八周龄的昆明小鼠(18-22g)随机分为10组(n＝6)，分别容纳在不锈钢笼中。将PEG-DCA溶于生理盐水中以(60，110，160，210和260mg/kg)的浓度注射入小鼠体内，均通过尾尾静脉以约1mL/min施用，然后立即用约0.2mL盐水冲洗导管。同理阴性对照小鼠给同剂量的生理盐水。注射约1小时后，开始观察动物是否有任何不利的临床体征。并在第2、4和7天持续观察小鼠临床症状。

实验结果见附表3：

表3.PEG-DCA的急毒实验结果表

实施例8

四甲基偶氮唑盐(简称MTT法)检测PEG-DCA与抗癌药联用的抗多药耐药的效应：选择对数生长期细胞，以6000的密度接种于96孔板中，置37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时后加入不同浓度的PEG-DCA与TPGS以及同浓度的抗癌药阿霉素(25ug/ml)，每个浓度设复孔3个，培养48小时，往每孔中加入浓度为5mg/ml的MTT，每孔10μl，放入培养箱中继续培养4小时，取出96孔板，甩出孔中液体，每孔加入100μl的DMSO即可，轻轻震荡孔板，待孔底部的结晶物完全溶解后，将孔板放入酶标仪中测波长在570nm处测定各孔的吸光度值，记录结果，实验重复三次。

实验结果见附图8，图8为MTT法检测PEG-DCA与抗癌药联用的细胞死亡率图，由图8可见，PEG-DCA与抗癌药联用的效果好。

以上所述，仅是本发明较佳的实施例而已，并非对本发明的技术范围作任何限制，故凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何细微修改、等同变化和修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (3)

1.一种聚乙二醇-去氧胆酸衍生物的制备方法，其特征在于制备过程如下：

(1)3,3’-二硫代二丙酸酐的合成

称取3,3’-二硫代二丙酸5g置于真空干燥箱中30℃干燥，另量取50mL乙酰氯于75℃下重新蒸出，蒸馏装置全程密封置于通风橱内，取出真空干燥后的3,3’-二硫代二丙酸，加入上述新蒸乙酰氯，70℃下回流2h，回流结束后减压蒸出多余的乙酰氯，剩余物加过量冰无水乙醚沉淀，置于冰箱下层-20℃冷冻过夜，次日抽滤，取沉淀物于真空干燥箱中45℃干燥10h，得浅黄至灰黄色片状固体，产率60％；反应过程如下：

(2)PEG-DCA-DTPA的合成

称取步骤(1)合成的3,3’-二硫代二丙酸酐1.07g，置于100mL的圆底三颈烧瓶中，加入40mL无水DMF，室温下N₂保护搅拌至完全溶解后，加入PEG-DCA 1.5922g，完全溶解后再加入DMAP 0.171g，另用滴管吸取三乙胺0.5mL加入其中，室温下继续反应8h，反应完毕后减压旋去溶剂，加入50mL的乙酸乙酯将其溶解完全，用0.5mol/L的稀盐酸洗2遍，饱和氯化钠溶液洗2遍，加无水硫酸镁干燥，密封放置2h使其完全干燥，抽滤除去无水硫酸镁，滤液浓缩后加冰无水乙醚沉淀，置冰箱下层冷冻过夜，抽滤，取沉淀物置真空干燥箱40℃下干燥12h以上，即得深棕色粉末状产物，产率65％；反应过程如下：

(3)正丙胺-聚天冬氨酸苄酯nPBLA的合成

称取BLA-NCA 2.4923g于100mL三颈圆底烧瓶中，加入60mL新蒸无水二氯甲烷，室温氮气保护下低速搅拌30min以上，用移液器精密移取正丙胺0.5mmol加入到上述反应物中，室温下搅拌72h，反应完毕后将反应得到的溶液滴入过量冰无水乙醚中进行沉淀，置冰箱下层冷冻12h以上使沉淀完全，过滤，取沉淀物35℃下真空干燥24h，得纯白色疏松粉末，产率85％；反应过程如下：

(4)聚乙二醇-去氧胆酸衍生物

称取步骤(2)合成的PEG-DCA-DTPA 0.2478g，DMAP 0.049g，加入10mL无水二氯甲烷，N₂保护下搅拌40min，另称取步骤(3)中的nPBLA 0.2048g溶于5mL无水二氯甲烷中，完全溶解后逐滴加入上述反应液当中，滴加完以后加入DCC 0.0845g，室温继续反应72h，反应结束后抽滤，滤液浓缩后加冰乙醚沉淀，置冰箱内冷冻使其沉淀完全后抽滤，取滤饼35℃下真空干燥，得到聚乙二醇-去氧胆酸衍生物1，即PEG-DCA-SS-nPBLA；反应过程如下：

2.一种聚乙二醇-去氧胆酸衍生物的制备方法，其特征在于制备过程如下：

称取PEG-DCA-DTPA 0.1mmol，DMAP 0.2mmol于100mL的茄型瓶中，加入30mL的无水二氯甲烷溶解，27℃下搅拌1h，然后加入0.35mmol PTX和0.8mmol DCC，进行反应48h，反应结束后，抽滤，浓缩除去部分溶剂，乙醚沉淀，抽滤，35℃真空干燥，再用硅胶柱进行层析，洗脱液二氯甲烷/甲醇的比为80:1，最终得到聚乙二醇-去氧胆酸衍生物2，即PEG-DCA-S-S-PTX。

3.权利要求1或权利要求2所制备得到的聚乙二醇-去氧胆酸衍生物。

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