CN105418732A - 多西紫杉醇维瑞肽偶合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新型靶向抗癌化合物多西紫杉醇维瑞肽偶合物，所述的偶合物是由多西紫杉醇通过不同连接序列与小分子靶向多肽维瑞肽相连合成，所述的偶合物是指DTX-1-维瑞肽偶合物、DTX-5-维瑞肽偶合物、(DTX)2-维瑞肽偶合物。本发明还公开了所述偶合物的制备方法。本发明通过可靠的生物学实验方法及数据证明该类偶合物能具有抗肿瘤活性。本发明所述的偶合物克服了传统抗癌化学药物选择性差、毒副作用大、水溶性差的缺点，具有选择性好、抗癌活性高、毒副作用小、水溶性好等优异性能。

Description

多西紫杉醇维瑞肽偶合物及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及多西紫杉醇的多肽偶合物及其制备方法，具体涉及多西紫杉醇维瑞肽偶合物及其制备方法和在治疗肿瘤方面的应用。
背景技术
多西紫杉醇(Docetaxel，DTX)是以欧洲红豆杉的针叶萃取物为基础半合成得到的继紫杉醇后又一新型的抗癌药物。该药物的作用机制是提高微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用，阻滞细胞于G和M期，从而抑制癌细胞的有丝分裂和增值(F.V.Fossellaetal.,PhaseIIstudyofdocetaxelforadvancedormetastaticplatinum-refractorynon-small-celllungcancer.JournalofClinicalOncology,1995,13,645-651)。与紫杉醇相比，在体外抗肿瘤活性实验中，已证实多西紫杉醇的活性是紫杉醇的1.3～12倍(S.Noguchi，Predictivefactorsforresponsetodocetaxelinhumanbreastcancers.CancerScience，2006，97，813-820)，目前已获得FDA批准用于临床上治疗乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌和前列腺癌等。但是多西紫杉醇与普通化药一样，存在选择性低、毒副作用大、水溶性差的缺点，严重影响了药物药效；由于多西紫杉醇在体内分布广泛，尤其是在正常器官和组织中有较多的分布，不仅给患者带来了痛苦，更降低了药物生物利用度。此外，多西紫杉醇在水中的溶解性较差(小于1μg/ml)，极大的影响了药效的发挥，目前上市的剂型多利用非离子型表面活性剂吐温-80增溶，经13％的乙醇稀释后注射使用。但是吐温-80具有溶血性且粘度较大，在临床应用中，以发现该制剂具有外周神经毒性和肌肉骨骼毒性，以及中性粒细胞减少等一系列过敏反应(J.Baker，etal.，Docetaxel-relatedsideeffectsandtheirmanagement.EuropeanJournalofOncologyNursing,2009,13，49-59)。因此，解决多西紫杉醇的选择性低、水溶性差等问题，控制该药物释放速率及提高靶向性，对于提高多西紫杉醇抗癌活性具有重要意义。
当前，因靶向化疗比全身化疗具有高效低毒的特点，而成为当前癌症治疗的研究热点，Schally等将阿霉素连接在生长抑素类似物上，合成了偶联药物AN-238，通过多种动物实验模型发现，AN-238对高表达SSTR的肿瘤组织具有靶向性和毒性，对正常细胞具有低毒性，甚至在表达相对较低密度SSTR的肿瘤模型中比它们相应的细胞毒素基团更有效且毒性更低。Moody等将喜树碱偶联在生长素类似物上，通过小细胞肺癌NCI-H69细胞的体外实验，证实偶联物既保留了与SSTR2(生长抑素受体)高度的亲和力，又保持了其生长抑素类似物的活性。将化疗药物与生长抑素类似物连接，对于表达SSTR的肿瘤具有广阔的治疗前景与极高的医学价值。
维瑞肽是化学合成的生长抑素的八肽类似物，与SSTR2、SSTR3及SSTR5具有更强的结合力，选用维瑞肽与化疗药物偶联可以有效实现靶向治疗肿瘤细胞。此外，维瑞肽作为生长抑素类似物，本身也具有直接和间接的抗肿瘤作用。
随着多西紫杉醇的临床广泛应用，其在临床显现的不良反应如：骨髓抑制、神经毒性等越来越明显，可以解决多西紫杉醇水溶性差、选择性低、毒副作用大的缺点，临床亟需一种新型的靶向抗癌化合物为广大的肿瘤患者减轻了经济与精神负担。
发明内容
本发明的目的在于提供多西紫杉醇维瑞肽偶合物，所述的多西紫杉醇维瑞肽偶合物是新型的靶向抗癌药物，从根本上解决了多西紫杉醇选择性低、毒副作用大、水溶性差等缺点，具有选择性高、水溶性好、毒副作用小、药效高等优异性能。
本发明的另一目的是提供上述多西紫杉醇维瑞肽偶合物的制备方法。
本发明的又一目的是提供上述多西紫杉醇维瑞肽偶合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明公开了多西紫杉醇维瑞肽偶合物，所述的偶合物是由多西紫杉醇在2’位羟基通过链接序列与维瑞肽氨基相连而得。
所述的多西紫杉醇的结构式为：
所述的连接序列为：HOOC-(CH2)n-COOH；
其中，n＝2-12。
所述小分子多肽维瑞肽的结构式为：
所述的多西紫杉醇维瑞肽偶合物为：DTX-1-维瑞肽偶合物、DTX-5-维瑞肽偶合物、(DTX)2-维瑞肽偶合物中的一种。
进一步，所述的DTX-1-维瑞肽偶合物的结构式为：
进一步，所述的DTX-5-维瑞肽偶合物的结构式如下：
进一步，所述的(DTX)2-维瑞肽偶合物的结构式如下：
本发明还公开了上述多西紫杉醇维瑞肽偶合物的制备方法，所述技术方案如下：
(1)中间体DTX-Linker的化学合成，合成路线如下：
具体操作方法如下：
1)将多西紫杉醇溶于无水二氯甲烷，加入4-二甲基氨基吡啶(DMAP)，丁二酸酐，在一定条件下反应一段时间后加入乙酸乙酯，并用盐酸调至pH3-4，反应液依次用水萃取3次、饱和食盐水萃取1次，最后用无水硫酸钠干燥，过滤后减压回收乙酸乙酯；
2)所得残余物用丙酮-乙醚重结晶，即得到目标产物多西紫杉醇-2’-丁二酸酯纯品(中间体DTX-Linker)。
上述操作的有益效果是：选用的无水二氯甲烷溶剂为关键性溶剂，该溶剂可以使多西紫杉醇完全溶解，并促进与丁二酸酐充分的接触，提高反应效率，副产物少。
进一步，所述的操作方法中，所述的步骤1)中无水二氯甲烷溶剂与4-二甲基氨基吡啶(DMAP)的体积比范围为(11:1)-(15:1)，其中无水二氯甲烷与DMAP的最佳体积比是12:1。
进一步，所述的操作方法中，所述的步骤1)中反应条件为：反应温度为：(0-10)℃，转速为：(200-800)r/min，搅拌时间为：(18-36)h，其中反应温度为8℃、转速为450r/min，搅拌时间为24h为最佳，此反应条件的有益效果是，多西紫杉醇与丁二酸酐的反应更加充分，目标产物收率高。
(2)多西紫杉醇维瑞肽偶合物的化学合成
将DTX-Linker与维瑞肽反应合成不同类型的多西紫杉醇-维瑞肽偶合物即：DTX-1-维瑞肽偶合物、DTX-5-维瑞肽偶合物、(DTX)2-维瑞肽偶合物，整体的工艺路线图见说明书附图1。
进一步，所述的DTX-1-维瑞肽偶合物的合成路线如下：
具体实验操作方法为：
1)选用特殊的固相合成树脂，用-Trt基团保护的巯基(-SH)在I2/DIEA条件下可在固相合成树脂上形成分子内二硫键，用侧链保护的维瑞肽树脂在特定的脱除剂作用下，选择性脱除N-端的Fmoc-氨基保护基，得到-Lys5-侧链氨基受保护、N-端侧链氨基酸游离的维瑞肽树脂，并将其置于固相合成反应器中，用无水二氯甲烷浸洗后抽取溶剂并通入干燥氮气；
2)将多西紫杉醇-2’-丁二酸酯(DTX-Linker)溶于无水二氯甲烷，加入特定的高效偶合试剂，低速搅拌10min后，滴入上述通有氮气的固相合成反应器中，在特定条件下反应一段时间；
3)将反应后溶液减压浓缩，将浓缩液依次用二甲基甲酰胺洗涤6次，用二氯甲烷洗涤5次，用乙醚、石油醚、环己烷、正己烷中的一种或任意比例的混合溶剂洗涤3次，再次减压浓缩除去多余溶剂即得到DTX-Linker-NH-维瑞肽-固相合成树脂；
4)目标产物从固相合成树脂上解离步骤如下：将干燥树脂加入一定的溶剂中，搅拌1小时后过滤；
5)目标产物纯化步骤如下：过滤物再用无水二氯甲烷洗涤过滤，合并上述滤液后减压浓缩，浓缩物用溶剂萃取，抽滤收集溶剂不溶的固体，干燥后得到纯净的目标产物DTX-1-维瑞肽偶合物。
进一步，所述操作方法中，所述步骤1)中N-端氨基保护基脱除剂为吡啶的N,N-二甲基甲酰溶液，吡啶的质量分数为15％-35％，其中最佳质量比为20％；采用上述脱除剂的有益效果为：在脱除N-端保护基的同时，其它保护基不受影响，确保了目标产物的高效合成。
进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述的反应步骤1)中的特定脱除剂为吡啶的N,N-二甲基甲酰溶液，其中吡啶的质量分数为15％-35％，以20％为最佳。
进一步，所述操作方法中，所述的步骤2)中溶解DTX-Linker的溶剂二氯甲烷可用无水二氯乙烷替换，其中无水二氯乙烷与无水二氯甲烷的替换摩尔比为：(1:1)-(3:1)；特定的高效偶合试剂为HOCt、DMC、DIC、DIEA按一定比例的混合溶剂，其中VDMC:VHOCt＝(5:1)-(10:1)，VDIC:VDIEA＝(3:1)-(8:1)。
进一步，所述操作方法中，所述的步骤2)中反应条件为：反应温度为：(20-35)℃，搅拌速度为：(200-800)r/min，搅拌时间为：(5-30)min，其中最佳反应条件为：反应温度为25℃，搅拌速度为540r/min，搅拌时间为10min。
进一步，所述操作方法中，所述步骤4)中解离溶剂为2％-10％三氟乙酸的二氯甲烷溶液，其中最佳质量比为5％；所述步骤4)中解离反应条件如下：反应温度为：(20-25)℃，搅拌速度为：(300-800)r/min，搅拌时间为：(0.8-1.5)h，其中最佳条件为：其中最佳反应条件为：反应温度23℃，搅拌速度为：450r/min，搅拌时间为：1.0h，本操作的有益效果是：将目标产物从树脂上切除，同时避免了目标产物结构遭到破坏，确保了目标产物的高效合成。
进一步，所述操作方法中，锁住步骤5)中萃取溶剂为乙醚、石油醚、环己烷、正己烷中的一种或几种任意比例的混合溶剂。
进一步，DTX-5-维瑞肽偶合物的合成路线如下：
进一步，具体操作方法如下：
1)选用NH2-Rink-Linker-Resin特殊的固相合成树脂，用-Trt基团保护的巯基(-SH)在I2/DIEA条件下可在固相合成树脂上形成分子内二硫键，用烯丙甲酯基(AllylO-CO)保护Lys5侧链的氨基，在加入特定的催化剂选择性脱除烯丙甲酯基，得到N-端氨基受保护、Lys5-侧链氨基游离的维瑞肽树脂，并将其置于固相合成反应器中，用无水二氯甲烷浸洗后抽取溶剂并通入干燥氮气；
2)将多西紫杉醇-2’-丁二酸酯(DTX-Linker)溶于无水二氯甲烷，加入ByBop，DIEA，在一定条件下反应一段时间，滴入上述通有氮气的固相合成反应器中；
3)将反应后的溶液减压浓缩，浓缩液依次用二甲基甲酰胺洗涤6次，二氯甲烷洗涤5次，乙醚、石油醚、环己烷、正己烷的一种或任意比例的混合溶剂洗涤3次，减压浓缩后即得到维瑞肽Lys5(DTX-Linker-NH)-固相合成树脂；
4)目标产物从固相合成树脂上解离步骤如下：将干燥的树脂加入一定的溶剂中，搅拌1小时后过滤，将过滤后的物质用无水二氯甲烷洗涤过滤；
5)目标产物纯化步骤如下：合并上述滤液后减压浓缩，浓缩物用溶剂萃取，抽滤收集溶剂不溶的固体，干燥后得到目标产物即DTX-5-维瑞肽偶合物。
进一步，所述操作方法中，所述步骤1)中烯丙甲酯基脱除反应的催化剂为：Pd[P(C6H5)3]4、C6H5SiH3中的一种或两种任意比例混合物，其中摩尔比1:1为最佳，采用上述脱除剂的有益效果为：脱除烯丙甲酯基的同时，其他保护基不受影响，确保了目标产物的高效合成。
进一步，所述操作方法中，所述步骤2)中溶解DTX-Linker的二氯甲烷可用无水二氯乙烷替换，其中无水二氯乙烷与无水二氯甲烷的替换摩尔比为：(1:1)-(3:1)；溶剂ByBop可以用六氟异丙醇替换，其中六氟异丙醇与ByBoy的替换摩尔比为：(1:1)-(3:1)；反应体系溶剂DIEA可用N,N-二甲基甲酰胺替换，其中N,N-二甲基甲酰胺与DIEA的替换摩尔比为：(1:1)-(3:1)。
进一步，所述操作方法中，所述步骤2)中反应条件为：反应温度为：(20-35)℃，搅拌速度为：(200-800)r/min，搅拌时间(5-30)min，其中最佳反应条件为：反应温度为25℃，搅拌速度为540r/min，搅拌时间为10min。
进一步，所述操作方法中，所述步骤4)中解离试剂为质量分数为2％-10％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液，其中最佳质量比为5％；所述步骤4)中解离反应条件为：反应温度为：(20-25)℃，搅拌速度为：(300-800)r/min，搅拌时间为：(0.8-1.5)h，最佳反应条件为：反应温度为：23℃，搅拌速度为：450r/min，搅拌时间为：1.0h。所述的本操作方法的有益效果是将目标产物从树脂上切除，同时避免了目标产物结构遭到破坏，确保了目标产物的高效合成。
进一步，所述操作方法中，所述的步骤5)中萃取溶剂为乙醚、石油醚、环己烷、正己烷中的一种或几种任意比例的混合溶剂。
进一步，(DTX)2-维瑞肽偶合物的合成路线如下：
所述的(DTX)2-维瑞肽偶合物液相合成的技术方案如下：
1)将DTX-5-维瑞肽偶合物粗品加入到特定溶剂中，在室温下滴入高效偶合试剂，低速搅拌，滴加中间体DTX-linker，在特定条件下反应一段时间；
2)将反应后的溶液进行减压蒸馏，除去多余的溶剂，将残余物滴入冰水中，减压浓缩，收集水中析出的固体并用蒸馏水洗涤3次。所得固体用特定的溶剂进行重结晶，得到目标产物(DTX)2-维瑞肽偶合物。
进一步，所述操作方法中，所述步骤1)中特定溶剂是指N,N-二甲基甲酰胺、DIEA、无水二氯甲烷、无水二氯乙烷中一种或两种的混合溶剂，所述步骤1)中高效偶合试剂为HOCt、DMC、DIC、DIEA按一定比例的混合溶剂，其中VDMC:VHOCt＝(5:1)-(10:1)，VDIC:VDIEA＝(3:1)-(8:1)。
进一步，所述操作方法中，所述步骤1)中反应条件为：反应温度为：(20-25)℃，搅拌速度为：(300-800)r/min，搅拌时间为(5-25)min，其中最佳反应条件为：反应温度为23℃、搅拌速度为450r/min、搅拌时间10min。
进一步，所述操作方法中，所述步骤2)中重结晶溶剂为甲醇、乙酸乙酯任意比例混合的溶剂，其中甲醇可用乙醇等同替换，但并不仅限于乙醇一种溶剂。
所述的(DTX)2-维瑞肽偶合物固相合成的具体技术方案如下：
1)按照权利要求6制备出维瑞肽-Lys5(DTX-Linker-NH)-固相合成树脂后，在室温下加入高效偶合试剂，低速搅拌，滴加中间体DTX-Linker进行反应，在特定条件下反应一段时间；
2)将反应后溶液进行减压浓缩，将浓缩物滴入冰水中，抽滤收集水中析出的固体并用蒸馏水洗涤3次，所得固体用乙醚或乙酸乙酯进行重结晶，即得到(DTX)2-维瑞肽-固相合成树脂；
3)目标产物(DTX)2-维瑞肽偶合物从固相合成树脂上解离反应步骤如下：将干燥的树脂加入质量分数为2％-10％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，搅拌1小时后过滤，过滤物再用无水二氯甲烷洗涤过滤；
4)目标产物纯化步骤如下：合并上述滤液后减压浓缩，浓缩物用溶剂萃取，抽滤收集溶剂不溶的固体，干燥后得到纯净的目标产物(DTX)2-维瑞肽偶合物。
进一步，所述操作方法中，所述步骤1)中高效偶合试剂为：HOCt、DMC、DIC、DIEA按一定比例混合的混合溶剂，其中关键溶剂HOCt为公司自制，VDMC:VHOCt＝(5:1)-(10:1)，VDIC:VDIEA＝(3:1)-(8:1)。
进一步，所述操作方法中，所述步骤1)中反应条件如下：反应温度为：(20-25)℃，搅拌速度为：(300-800)r/min，搅拌时间为(5-25)min，其中最佳反应条件是：反应温度为23℃、搅拌速度为450r/min、搅拌时间10min。
进一步，所述操作方法中，所述步骤4)中萃取溶剂为乙醚、石油醚、环己烷、正己烷中的一种或几种任意比例的混合溶剂。
本发明采用的上述技术方案，具有的有益效果在于：
本发明所合成制备的多西紫杉醇-维瑞肽偶合物，从根本上克服了多西紫杉醇细胞选择性低、毒副作用大、水溶性差的缺点，具有选择性高、毒副作用低、水溶性好的优异性能，达到了抗癌细胞毒性与癌细胞表面受体高选择性的优势互补，显著提高了药物抗癌活性，大大降低了毒副作用，且其具有良好的水溶性为剂型制备及给药方式的选择提供了方便，因此，通过分子靶向多肽与多西紫杉醇相连接而制备的DTX-1-维瑞肽偶合物、DTX-5-维瑞肽偶合物、(DTX)2-维瑞肽偶合物，有利于增强肿瘤部位多西紫杉醇的浓度，更有效地提高抗癌效率，本发明制备的多西紫杉醇维瑞肽偶合物在新型高效低毒分子靶向抗癌药物研发领域具有重要应用前景。
说明书附图
附图1多西紫杉醇-维瑞肽偶合物的总体合成工艺路线图。
附图2透射电镜下(DTX)2-维瑞肽偶合物处理后A549细胞的凋亡过程。
附图3实施例2-5产物及DTX浓度及培养时间对A549细胞凋亡率的影响。
具体实施方式
实施例1多西紫杉醇-2’-丁二酸酯的合成
多西紫杉醇(1.212g，1.5mmol)溶于无水二氯甲烷(15ml)，加入4-二甲基氨基吡啶(DMAP，1.5mol)，丁二酸酐(0.190g，1.9mmol)，于0℃搅拌26小时后，加入乙酸乙酯150ml，并用盐酸(1.0mol/L)调至pH3-4，依次用60ml的蒸馏水洗涤3次，40ml的饱和食盐水萃取2次，用无水硫酸钠干燥，过滤后减压回收乙酸乙酯。所得残余物用丙酮-乙醚重结晶，得到多西紫杉醇-2’-丁二酸酯纯品1.115g，收率81.9％。HPLC：9.10min，质谱分析：MS：901.3[M+H]+，Mw:907.95(C47H57NO17)。
实施例2DTX-1-维瑞肽偶合物的合成
将与固相合成树脂NH2-Rink-Linker-Resin相连，用-Trt基团保护的巯基(-SH)在I2/DIEA条件下可在固相合成树脂上形成分子内二硫键，侧链保护Lys5-端氨基受保护、N-端氨基游离的维瑞肽树脂(含有维瑞肽0.15mmol)置于固相合成反应器中，加入吡啶/N,N-二甲基甲酰(质量比为1:5)，再用无水二氯甲烷浸洗后抽取溶剂并通入干燥氮气，将多西紫杉醇-2’-丁二酸酯(0.363g，0.4mmol)溶于无水二氯甲烷(15ml)，加入DMC(0.099g，1.1mmol)，HOCt(0.156g，0.30mmol)，DIC(0.227g，1.8mmol)，DIEA(0.039g，0.30mmol)，低速搅拌10min，滴入上述固相合成反应器中并用干燥氮气进行搅拌，在搅拌速度为450r/min、反应温度为23℃的条件下反应1h，再将反应溶液中的溶剂减压浓缩，抽干溶剂，将过滤后物质依次用5ml的二甲基甲酰胺洗涤6次，10ml二氯甲烷洗涤5次，5ml乙醚洗涤3次后减压浓缩，除去多余溶剂，将干燥的树脂加入到20ml质量分数为2％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，搅拌1小时后过滤，将树脂再用15ml的二氯甲烷洗涤并过滤3次，滤液合并后减压抽干，残余物用15ml的乙醚洗涤3次，抽滤收集乙醚不溶的固体，干燥后即得多西紫杉醇-2’-丁二酰-维瑞肽偶合物纯品即DTX-1-维瑞肽偶合物，收率达到96.1％。HPLC：18.22min，MS：2022.3[M+H]+，Mw：2021.32(C104H125N13O25)。
实施例3DTX-5-维瑞肽偶合物的合成
将与固相合成树脂NH2-Rink-Linker-Resin相连，用-Trt基团保护的巯基(-SH)在I2/DIEA条件下可在固相合成树脂上形成分子内二硫键，在Pd[P(C6H5)3]4/C6H5SiH3条件下选择性脱除烯丙甲酯基，得到侧链N-端氨基受保护、Lys5-端氨基游离的维瑞肽树脂(含有维瑞肽0.2mmol)，将其置于固相合成反应器中，用无水二氯甲烷浸洗后抽取溶剂并通入干燥氮气。将多西紫杉醇-2’-丁二酸酯(0.454g，0.5mmol)溶于无水二氯甲烷(20ml)，加入PyBop(0.312，0.60mmol)，N,N-二甲基甲酰胺(0.059g，0.80mmol)，并搅拌15分钟后，滴入上述固相合成反应器中并用干燥氮气进行搅拌。1.2小时后将溶剂抽干，将树脂依次用10ml的二甲基甲酰胺洗涤6次，20ml二氯甲烷洗涤5次，10ml乙醚洗涤3次后减压浓缩，抽干多余溶剂。将干燥的树脂加入40ml的质量分数为5％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，在温度为23℃，搅拌速度为400r/min的条件下，搅拌反应1小时后过滤，将过滤物用30ml的二氯甲烷洗涤并过滤3次，合并上述滤液后减压抽干，残余物用30ml的乙醚洗涤3次，抽滤收集乙醚不溶的固体，干燥后即得到目标产品：多西紫杉醇-2’-丁二酰-维瑞肽偶合物纯品即DTX-5-维瑞肽偶合物，收率达到96.1％。HPLC：18.25min，MS：2022.5[M+H]+，Mw：2021.32(C104H125N13O25)。
实施例4(DTX)2-维瑞肽偶合物的固相合成
将维瑞肽-Lys5(DTX-Linker-NH)-固相合成树脂(含有维瑞肽0.15mmol)溶于12ml的无水二氯甲烷后加入固相合成反应器中，再加入0.5mlHOCt、4.0mlDMC、4mlDIC、0.5mlDIEA混合溶剂，室温搅拌，不断滴加多西紫杉醇-2’-丁二酸酯(DTX-Linker，0.17g，0.18mol)，在反应温度为23℃、搅拌速度为450r/min的条件下搅拌反应1.0小时，进行减压蒸馏，将残余物滴入150ml冰水中，抽滤收集水中析出的固体并用40ml蒸馏水洗涤3次，所得固体用50ml乙醚重结晶后，加入40ml质量分数为5％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液，搅拌1h后过滤，再用20ml无水二氯甲烷洗涤过滤，滤液合并后减压浓缩，残余物用80ml乙醚洗涤3次，抽滤收集溶剂不容的固体，干燥得到纯净的目标产物0.407g，收率为93.1％。HPLC：23.21min，MS：2912.8[M+H]+，Mw：2911.21(C151H180N14O41)。
实施例5(DTX)2-维瑞肽偶合物的液相合成
DTX-5-维瑞肽偶合物0.202g(0.1mmol)加入无水二甲基甲酰胺6ml。将多西紫杉醇-2’-丁二酸酯(0.11mg，0.12mmol)溶于DIEA(6ml)加入0.5ml的HOCt，5.0ml的DIC搅拌12min后滴入上述溶液。在反应温度为24℃、搅拌速度为400r/min的条件下，反应1.2小时，将反应后的溶液减压浓缩除去DIEA，将残余物滴入80ml的冰水中，抽滤收集水中析出的固体并用20ml的蒸馏水洗涤3次。所得固体用甲醇-乙酸乙酯重结晶，得(DTX)2-维瑞肽偶合物纯品0.269g，收率为92.4％。HPLC：22.96min，MS：2912.5[M+H]+，Mw：2911.21(C151H180N14O41)。
生物活性实施例
实施例6实施例2-4产物的大鼠急性毒性试验
实验动物：Wistar大鼠40只，雌性，体重180-220g，购自山东大学实验动物中心，生产许可号：SCXK(鲁)20130009，饲养于IVC独立送回风系统中，饲料购自北京华阜康生物科技有限公司；
剂量选择及受试物给与方式：尾静脉注射0.5ml/只，最高剂量定为2.5mg/kg。将40只大鼠随机分为10组，剂间距设为1:0.6，最高剂量组(2.5mg/kg)、中剂量组(1.5mg/kg)、低剂量组(0.9mg/kg)、对照组(等体积生理盐水)，动物随机分为10组，每组4只，其中高、中、低剂量组分别分为3组，对照组1组。
实验方法：以0.9％生理盐水将实施例2-4制备的多西紫杉醇-维瑞肽偶合物：DTX-1-维瑞肽偶合物、DTX-5-维瑞肽偶合物、(DTX)2-维瑞肽偶合物分别配制不同浓度的注射液，每种偶合物注射液的浓度分别为：1mg/ml，0.6mg/ml，0.36mg/ml。注射前16小时禁食不禁水，注射完毕2小时后喂食。按分组情况，分别给每组大鼠尾部静脉注射相应偶合物及相应浓度的样本或0.9％生理盐水1次，进针后缓慢推注，用时80s-100s。
实验结果：最高剂量为2.5mg/kg，经给大鼠尾静脉注射一次后，两周内观察动物生命体征、进食、饮水、活动、死亡情况及其他毒性反应，未见动物死亡及肉眼可见的毒副作用。动物活动正常，体重增加，显示出三种多西紫杉醇维瑞肽偶合物：DTX-1-维瑞肽偶合物、DTX-5-维瑞肽偶合物、(DTX)2-维瑞肽偶合物毒性较小。
实施例7实施例4产物的细胞毒性试验
细胞培养：A549细胞用含10％小牛血清的1640培养液置于含5％CO2的37℃培养箱中培养，布满培养瓶时，用0.05％的胰蛋白酶(含0.02％EDTA)消化为单细胞悬液后传代，2-3次/周。
透射电镜检测细胞凋亡形态：将A549细胞(5×105/ml)接种于6孔板中，200μL/孔，过夜后换含有1000nmol/L的(DTX)2-维瑞肽偶合物的1640培养液继续培养；在培养0h、24h、48h、72h时分别收集活体细胞，并分别进行胰蛋白酶消化、离心收集细胞，用戊二醛固定，次日取出固定好的细胞样品，用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)冲洗，再用锇酸再次固定，用缓冲液冲洗。随后用梯度乙醇脱水，用无水丙酮置换，包埋液浸透过夜。之后用618#环氧树脂包埋，聚合，修组织块等一系列过程后用莱卡UC6型超薄切片机切片，用醋酸铀-柠檬酸铅进行双染色，日产Hitachi-500电子透射显微镜观察并拍照。
实验结果：经(DTX)2-维瑞肽偶合物处理的非小细胞肺癌A549细胞，24h后一些细胞贴壁，体积增大，折光性不好，72h后有50％的细胞皱缩、漂浮，并形成凋亡小体。凋亡细胞变化特征有两种：一种为间期凋亡特点，细胞核染色质固缩，聚集于核边，胞浆浓缩，有空泡形成；另一种为分裂期凋亡特征，主要为染色体散乱分布在细胞中，细胞膜出泡，进而染色体聚集成团，形成凋亡小体，到后期凋亡小体及残留的凋亡细胞进行次级坏死。透射电镜下(DTX)2-维瑞肽偶合物处理后A549细胞的凋亡过程见附图2。
实施例8实施例2-5产物及DTX对A549细胞的影响
原料准备：将实施例2-5产物：DTX-1-维瑞肽偶合物、DTX-5-维瑞肽偶合物、(DTX)2-维瑞肽偶合物与多西紫杉醇(DTX)分别溶解于无水乙醇，保持于-20℃待用。
细胞培养：A549细胞用含10％小牛血清的1640培养液置于含5％CO2的37℃培养箱中培养，布满培养瓶时，用0.05％的胰蛋白酶(含0.02％EDTA)消化为单细胞悬液后传代，2-3次/周。
实验操作：将细胞(5×105/ml)接种于6孔板中，200μL/孔，过夜后换含有100、1000nmol/L的DTX及其偶合物的1640培养液继续培养；在培养24h、72h时分别收集细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，固定、染色后200目筛网过滤，流式细胞仪测定细胞凋亡情况，计算凋亡细胞比率(％)。
统计学处理:数据的表达采用表示，采用SPSS13.0软件进行统计分析，数据比较采用t检验，以P<0.05为有显著性差异。
实验结果及分析：三种多西紫杉醇维瑞肽偶合物及DTX对A549细胞凋亡率的影响呈浓度和时间依赖性，实验结果见附图3；由附图3中的实验数据可以看出三种多西紫杉醇维瑞肽偶合物及DTX对A549细胞凋亡的影响呈时间与浓度依懒性；在相同药物浓度条件下，随着药物作用时间延长，A549细胞凋亡率逐渐升高，且具有显著性差异(p<0.05)；相同浓度药物培养A549细胞相同时间时，(DTX)2-维瑞肽偶合物诱导细胞的凋亡率显著高于DTX、DTX-1-维瑞肽偶合物、DTX-5-维瑞肽偶合物，且具有显著性差异(P<0.05)；在相同浓度下作用相同时间，三种多西紫杉醇维瑞肽偶合物的细胞凋亡率显著高于DTX；在相同浓度下作用相同时间，DTX-1-维瑞肽偶合物与DTX-5-维瑞肽偶合物，A549细胞凋亡率相当；由此可见，本发明专利产品多西紫杉醇维瑞肽偶合物与DTX相比更利于促进非小细胞肺癌A549细胞的凋亡。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，所作出了任何修改、等同替换、改进等，都应视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种多西紫杉醇维瑞肽偶合物，其特征在于：所述的多西紫杉醇在2’位羟基通过链接序列与维瑞肽的氨基相连。
2.根据权利要求1所述的多西紫杉醇维瑞肽偶合物，其特征在于：所述连接剂为HOOC-(CH2)nCOOH；
其中，n=2-12。
3.根据权利要求2所述的一种多西紫杉醇-维瑞肽偶合物，其特征在于：所述偶合物的制备方法为：先合成中间体DTX-Linker，再与连接在固相合成树脂上的维瑞肽相连，合成DTX-1-维瑞肽偶合物、DTX-5-维瑞肽偶合物、(DTX)2-维瑞肽偶合物，最后再将合成的目标产物从树脂上解离下来，最终得到纯净的目标产物多西紫杉醇维瑞肽偶合物。
4.根据权利要求3所述的中间体DTX-Linker，其特征在于：其制备方法为：
1）将多西紫杉醇溶于无水二氯甲烷，加入4-二甲基氨基吡啶（DMAP），丁二酸酐，在一定条件下反应一段时间后加入乙酸乙酯，并用盐酸调pH值至3-4，依次用水萃取3次、饱和食盐水萃取1次，最后用无水硫酸钠干燥，过滤后减压回收乙酸乙酯；
2）所得残余物用丙酮-乙醚重结晶，得中间体DTX-Linker；
进一步，所述的无水二氯甲烷溶剂与4-二甲基氨基吡啶（DMAP）的体积比范围为（11:1）-（15:1），其中无水二氯甲烷与DMAP的最佳体积比是12:1。
5.根据权利要求3所述的DTX-1-维瑞肽偶合物，其特征在于：其制备方法为：
1）向侧链氨基受保护的维瑞肽树脂中加入特定的脱除剂，选择性脱除N-端Fmoc氨基保护基，得到Lys5-侧链氨基受保护、N端侧链氨基酸游离的维瑞肽树脂，并将其置于固相合成反应器中，用无水二氯甲烷浸洗后抽取溶剂并通入干燥氮气；
2）将多西紫杉醇-2’-丁二酸酯（DTX-Linker）溶于无水二氯甲烷，并加入特定的高效偶合试剂，低速搅拌一段时间后，滴入上述通有氮气的固相合成反应器中，在一定条件下反应一段时间；
3）将反应物减压浓缩，除去溶剂后，依次用二甲基甲酰胺洗涤6次，用二氯甲烷洗涤5次，用乙醚、石油醚、环己烷、正己烷中的一种或任意比例的混合溶剂洗涤3次，将洗涤后的反应物抽干即得到DTX-Linker-NH-维瑞肽-固相合成树脂；
4）目标产物从固相合成树脂上解离的步骤为：将干燥的树脂加入一定的溶剂中，搅拌1小时后过滤；
5）目标产物分纯化的步骤如下：过滤物用无水二氯甲烷洗涤过滤，滤液合并后减压抽干，残余物用溶剂萃取，抽滤收集溶剂不溶的固体，干燥后得到纯净的目标产物DTX-1-维瑞肽偶合物；
进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述的反应步骤1）中的特定脱除剂为吡啶的N,N-二甲基甲酰溶液，其中吡啶的质量分数为15%-35%，以20%为最佳；
进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述的步骤2）中溶解DTX-Linker的二氯甲烷可用无水二氯乙烷替换，其中无水二氯乙烷与无水二氯甲烷的替换摩尔比为：（1:1）-（3:1）；所述的步骤2）中特定的高效偶合试剂为HOCt（1-羟基-1H-1,2,3-三唑-4-羧酸乙酯）、DMC（碳酸二甲酯）、DIC（N,N-二异丙基碳二亚胺）、DIEA（N,N-二异丙基乙胺）按一定比例混合的混合溶剂，其中VDMC:VHOCt=（5:1）-（10:1），VDIC:VDIEA=（3:1）-（8:1）；
进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述步骤2）中反应条件如下：反应温度为：（20-35）℃，搅拌速度为：（200-800）r/min，搅拌时间为：（5-30）min，其中最佳反应条件为：反应温度为25℃，搅拌速度为540r/min，搅拌时间为10min；
进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述步骤4）中解离溶剂为2%-10%三氟乙酸的二氯甲烷溶液，其中最佳质量比为5%；所述步骤4）中解离反应条件为：反应温度为：（20-25）℃，搅拌速度为：（300-800）r/min，搅拌时间为：（0.8-1.5）h，其中最佳反应条件为：反应温度23℃，搅拌速度为：450r/min，搅拌时间为：1.0h。
6.根据权利要求3所述的DTX-5-维瑞肽偶合物，其特征在于：所述的制备方法为：
1）将烯丙甲酯基（AllylO-CO）保护Lys5侧链氨基的维瑞肽树脂，加入特定的脱除剂选择性脱除烯丙甲酯基，得到N-端氨基受保护、Lys5-侧链氨基游离的维瑞肽树脂，将其置于固相合成反应器中，用无水二氯甲烷浸洗后抽取溶剂并通入干燥氮气；
2）将多西紫杉醇-2’-丁二酸酯（DTX-Linker）溶于无水二氯甲烷，加入ByBop（六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷），DIEA，在一定的转速下搅拌反应，滴入上述通有氮气的固相合成反应器中；
3）1小时后将溶剂抽干，反应物依次用二甲基甲酰胺洗涤6次，二氯甲烷洗涤5次，乙醚、石油醚、环己烷及正己烷中的一种或几种任意比例的混合溶剂洗涤3次后抽干，即得到维瑞肽-Lys5(DTX-Linker-NH)-固相合成树脂；
4）目标产物从固相合成树脂上解离步骤如下：将合成的上述树脂加入质量分数为2%-10%三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，搅拌反应1小时；
5）目标产物分离提纯的步骤如下：过滤反应液，将过滤物用无水二氯甲烷洗涤过滤，合并滤液后减压浓缩，除去多余溶剂，残余物用乙醚、石油醚、环己烷、正己烷中的一种或几种任意比例的混合溶剂进行萃取3次，抽滤收集溶剂不溶的固体，干燥后得到纯净的目标产物即DTX-5-维瑞肽偶合物；
进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述步骤1）中脱除催化剂为：Pd[P(C6H5)3]4、C6H5SiH3中的一种或两种任意比例混合物，其中摩尔比1:1为最佳；
进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述步骤2）中的二氯甲烷可用无水二氯乙烷替换，其中无水二氯乙烷与无水二氯甲烷的替换摩尔比为：（1:1）-（3:1）；ByBop可以用六氟异丙醇替换，其中六氟异丙醇与ByBoy的替换摩尔比为：（1:1）-（3:1）；反应体系溶剂DIEA可用N,N-二甲基甲酰胺替换，其中N,N-二甲基甲酰胺与DIEA的替换摩尔比为：（1:1）-（3:1）；
进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述的步骤2）中反应条件如下：反应温度为：（20-35）℃，搅拌速度为：（200-800）r/min，搅拌时间为：（5-30）min，其中最佳反应条件为：反应温度为：25℃，搅拌速度为：540r/min，搅拌时间为：10min。
7.根据权利要求3所述的(DTX)2-维瑞肽偶合物，其特征在于：其液相合成方法为：
1）将DTX-5-维瑞肽偶合物加入到特定溶剂中，在室温下滴入高效偶合试剂，低速搅拌，滴加中间体DTX-linker进行反应，在特定条件下反应一段时间；
2）将反应后溶液进行减压蒸馏，除去多余的溶剂，将残余物滴入冰水中，抽滤收集水中析出的固体并用蒸馏水洗涤3次，所得固体用甲醇、乙酸乙酯的一种或两种任意比例的混合溶剂进行重结晶，得到目标产物(DTX)2-维瑞肽偶合物；
进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述反应步骤1）中特定溶剂是指N,N-二甲基甲酰胺、DIEA、无水二氯甲烷、无水二氯乙烷中一种或两种的混溶剂，所用的高效偶合试剂为HOCt、DMC、DIC、DIEA按一定比例混合的混合溶剂，其中VDMC:VHOCt=（5:1）-（10:1），VDIC:VDIEA=（3:1）-（8:1）；
进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述反应步骤1）中的反应条件如下：反应温度为：（20-25）℃，搅拌速度为：（300-800）r/min，搅拌时间为（5-25）min，其中反应温度为23℃、搅拌速度为450r/min、搅拌时间为10min为最佳反应条件。
8.根据权利要求3所述的(DTX)2-维瑞肽偶合物，其特征在于：其固相相合成方法为：
1）按照权利要求6制备出维瑞肽-Lys5(DTX-Linker-NH)-固相合成树脂（N-端侧链仍受保护）后，在室温下加入高效偶合试剂，低速搅拌，滴加中间体DTX-Linker进行反应，在特定条件下反应一段时间；
2）将反应液进行减压蒸馏，除去多余的溶剂，将残余物滴入冰水中，抽滤收集水中析出的固体并用蒸馏水洗涤3次，所得固体用乙醚或乙酸乙酯进行重结晶，即得到目标产物(DTX)2-维瑞肽-固相合成树脂；
3）目标产物从固相合成树脂上解离步骤如下：将干燥的树脂加入质量分数2%-10%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，搅拌反应1小时；
4）目标产物纯化的步骤如下：将反应后的溶液过滤，过滤物再用无水二氯甲烷洗涤过滤，合并滤液后减压浓缩，残余物用溶剂萃取，抽滤收集溶剂不溶的固体，干燥后得到纯净的目标产物(DTX)2-维瑞肽偶合物；
进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述步骤1）中的高效偶合试剂为HOCt、DMC、DIC、DIEA按一定比例混合的混合溶剂，其中VDMC:VHOCt=（5:1）-（10:1），VDIC:VDIEA=（3:1）-（8:1）；
进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述步骤1）中反应条件是：反应温度为：（20-25）℃，搅拌速度为：（300-800）r/min，搅拌时间为（5-25）分钟，其中最佳反应条件是：反应温度为23℃、搅拌速度为450r/min、搅拌时间10分钟；
进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述步骤4）中萃取溶剂为乙醚、石油醚、环己烷、正己烷中的一种或几种任意比例的混合溶剂。
9.权利要求1-8任意一项所述的多西紫杉醇维瑞肽偶合物在制备用于治疗肿瘤药物方面的应用。
10.权利要求1-9任意一项所述的多西紫杉醇维瑞肽偶合物。
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C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160323