CN106188273A - 紫杉醇伐普肽偶合物及其制备方法 - Google Patents

紫杉醇伐普肽偶合物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了新型靶向抗癌化合物紫杉醇伐普肽偶合物，所述的偶合物是由紫杉醇与伐普肽不同N端氨基链接而合成的，所述的偶合物是指PTX‑1‑伐普肽偶合物、PTX‑5‑伐普肽偶合物、(PTX)2‑伐普肽偶合物。本发明还公开了所述偶合物的制备方法。本发明通过可靠的生物学实验方法及数据证明该类偶合物具有一定的抗肿瘤细胞毒性。本发明所述的偶合物克服了一线抗癌药物紫杉醇选择性差、毒副作用大、水溶性差的缺点，具有选择性好、抗癌活性高、毒副作用小、水溶性好等优异性能。

Description

紫杉醇伐普肽偶合物及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及紫杉醇的多肽偶合物及其制备方法，具体涉及紫杉醇伐普肽偶合物及其制备方法和在治疗肿瘤方面的应用。
背景技术
紫杉醇(Paclitaxel，PTX)是从红豆杉属植物的树皮中分离提取的二萜类天然产物，为近二十年来所研发上市的最有效的化学抗癌药物之一。通过特异性结合到细胞微管小管的β位，使微管聚合为团块或束状，紫杉醇可有效抑制微管网的正常重组，使细胞的分裂，繁殖及生长受到阻碍并停滞在G2期和M期，从而抑制癌细胞的有丝分裂和增殖。作为国际上广泛认可的高效化学抗癌药物，紫杉醇已被众多国家批准用于临床，以治疗包括乳腺癌，卵巢癌，结肠癌，食道癌，非小细胞肺癌，膀胱癌，前列腺癌，黑素瘤，淋巴瘤，白血球过多症及胃癌等多种癌症[R.M.straubinger,Biopharmaceutics of paclitaxel(taxol):formulation,activity and pharmacokinetics,in:M.Suffness(Sd.),Taxol:Scienceand Applications,CRC Press,New York,pp.237-54(1995)]。但是紫杉醇与普通化药一样，存在选择性低、毒副作用大、水溶性差的缺点，严重影响了药物药效；由于紫杉醇在体内分布广泛，尤其是在正常器官和组织中有较多的分布，不仅给患者带来了痛苦，更降低了药物生物利用度。此外，紫杉醇在水中的溶解性较差(小于1μg/ml)，极大的影响了药效的发挥，目前上市的剂型多利用非离子型表面活性剂吐温-80增溶，经13％的乙醇稀释后注射使用。但是吐温-80具有溶血性且粘度较大，在临床应用中，以发现该制剂具有外周神经毒性和肌肉骨骼毒性，以及中性粒细胞减少等一系列过敏反应。因此，解决紫杉醇的选择性低、水溶性差等问题，控制该药物释放速率及提高靶向性，对于提高紫杉醇抗癌活性具有重要意义。
当前，因靶向化疗比全身化疗具有高效低毒的特点，而成为当前癌症治疗的研究热点。将化疗药物与生长抑素类似物连接，对于表达SSTR的肿瘤具有广阔的治疗前景与极高的医学价值。伐普肽是化学合成的生长抑素的八肽类似物，与SSTR2、SSTR3及SSTR5具有更强的结合力，选用伐普肽与化疗药物偶联可以有效实现靶向治疗肿瘤细胞。此外，伐普肽作为生长抑素类似物，本身也具有直接和间接的抗肿瘤作用。
随着紫杉醇的临床广泛应用，其在临床显现的不良反应如：骨髓抑制、神经毒性等越来越明显，可以解决紫杉醇水溶性差、选择性低、毒副作用大的缺点，临床亟需一款新型的靶向抗癌化合物为广大的肿瘤患者减轻经济与精神负担。
发明内容
本发明的目的在于提供一款紫杉醇伐普肽偶合物，所述的紫杉醇伐普肽偶合物是一款新型的靶向抗癌药物，从根本上解决了紫杉醇选择性低、毒副作用大、水溶性差等缺点，具有选择性高、水溶性好、毒副作用小、药效高等优异性能。
本发明的另一目的是提供上述紫杉醇伐普肽偶合物的制备方法。
本发明的又一目的是提供上述紫杉醇伐普肽偶合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明公开了紫杉醇伐普肽偶合物，所述的偶合物是由紫杉醇在2’位羟基通过链接序列与伐普肽氨基相连而得。
所述的紫杉醇的结构式为：
所述的连接序列为：
其中，n＝1、3、5、7、9。
所述小分子多肽伐普肽的结构式为：
所述的紫杉醇伐普肽偶合物为：PTX-1-伐普肽偶合物、PTX-5-伐普肽偶合物、(PTX)2-伐普肽偶合物中的一种。
进一步，所述的PTX-1-伐普肽偶合物的结构式为：
进一步，所述的PTX-5-伐普肽偶合物的结构式如下：
进一步，所述的(PTX)2-伐普肽偶合的结构式如下：
本发明还公开了上述紫杉醇伐普肽偶合物的制备方法，所述技术方案如下：
(1)中间体PTX-Linker的化学合成，合成路线图如下：
具体操作方法如下：
1)将紫杉醇溶于无水二氯甲烷，加入4-二甲基氨基吡啶(DMAP)，丁二酸酐，在一定条件下反应一段时间后加入乙酸乙酯，并用盐酸调至pH3-4，反应液依次用饱和食盐水萃取1次、水萃取3次，最后用无水硫酸钠干燥，过滤后减压回收乙酸乙酯；
2)所得残余物用丙酮-乙醚重结晶，即得到目标产物紫杉醇-2’-丁二酸酯纯品(中间体PTX-Linker)。
上述操作的有益效果是：选用的无水二氯甲烷溶剂为关键性溶剂，该溶剂可以使紫杉醇完全溶解，并促进与丁二酸酐充分的接触，提高反应效率，副产物少。
进一步，所述的操作方法中，所述的步骤1)中无水二氯甲烷溶剂与4-二甲基氨基吡啶(DMAP)的体积比范围为(15.5:1)-(20:1)，其中无水二氯甲烷与DMAP的最佳体积比是18:1。
进一步，所述的操作方法中，所述的步骤1)中反应条件为：反应温度为：(8-15)℃，转速为：(700-1000)r/min，搅拌时间为：(30-45)h，其中反应温度为10℃、转速为800r/min，搅拌时间为35h为最佳，此反应条件的有益效果是，紫杉醇与丁二酸酐的反应更加充分，目标产物收率高。
(2)紫杉醇伐普肽偶合物的化学合成
将PTX-Linker与伐普肽反应合成不同类型的紫杉醇-伐普肽偶合物即：PTX-1-伐普肽偶合物、PTX-5-伐普肽偶合物、(PTX)2-伐普肽偶合物，整体的工艺路线图见说明书附图1。
进一步，所述的PTX-1-伐普肽偶合物的合成路线如下：
具体实验操作方法为：
1)选用特殊的固相合成树脂，用-Trt基团保护的巯基(-SH)在I2/DIEA条件下可在固相合成树脂上形成分子内二硫键，用侧链保护的伐普肽树脂在特定的脱除剂作用下，选择性脱除N-端的Fmoc-氨基保护基，得到-Lys5-侧链氨基受保护、N-端侧链氨基酸游离的伐普肽树脂，并将其置于固相合成反应器中，用无水二氯甲烷浸洗后抽取溶剂并通入干燥氮气；
2)将紫杉醇-2’-丁二酸酯(PTX-Linker)溶于无水二氯甲烷，加入特定的高效偶合试剂，低速搅拌10min后，滴入上述通有氮气的固相合成反应器中，在特定条件下反应一段时间；
3)将反应后溶液减压浓缩，将浓缩液依次用二甲基甲酰胺洗涤6次，用二氯甲烷洗涤5次，用乙醚、石油醚、环己烷、正己烷中的一种或任意比例的混合溶剂洗涤3次，再次减压浓缩除去多余溶剂即得到PTX-Linker-NH-伐普肽-固相合成树脂；
4)目标产物从固相合成树脂上解离步骤如下：将干燥树脂加入一定的溶剂中，搅拌1小时后过滤；
5)目标产物纯化步骤如下：过滤物再用无水二氯甲烷洗涤过滤，合并上述滤液后减压浓缩，浓缩物用溶剂萃取，抽滤收集溶剂不溶的固体，干燥后得到纯净的目标产物PTX-1-伐普肽偶合物。
进一步，所述操作方法中，所述步骤1)中N-端氨基保护基脱除剂为DMAP的N,N-二甲基甲酰溶液，DMAP的质量分数为20％-40％，其中最佳质量比为30％；采用上述脱除剂的有益效果为：在脱除N-端保护基的同时，其它保护基不受影响，确保了目标产物的高效合成。
进一步，所述操作方法中，所述的步骤2)中溶解PTX-Linker的溶剂二氯甲烷或三氯甲烷的一种或任意比例混合溶剂；特定的高效偶合试剂为HOBt、DMC、DIC、DIEA按一定比例的混合溶剂，其中VDMC:VHOBt＝(5:1)-(10:1)，VDIC:VDIEA＝(3:1)-(8:1)。
进一步，所述操作方法中，所述的步骤2)中反应条件为：反应温度为：(30-40)℃，搅拌速度为：(500-1000)r/min，搅拌时间为：(25-45)min，其中最佳反应条件为：反应温度为35℃，搅拌速度为800r/min，搅拌时间为30min。
进一步，所述操作方法中，所述步骤4)中解离溶剂为2％-10％三氟乙酸的二氯甲烷溶液，其中最佳质量比为5％；所述步骤4)中解离反应条件如下：反应温度为：(18-30)℃，搅拌速度为：(200-900)r/min，搅拌时间为：(1.5-2.5)h，其中最佳条件为：其中最佳反应条件为：反应温度23℃，搅拌速度为：450r/min，搅拌时间为：2.0h，本操作的有益效果是：将目标产物从树脂上切除，同时避免了目标产物结构遭到破坏，确保了目标产物的高效合成。
进一步，所述操作方法中，所述步骤5)中萃取溶剂为乙醚、石油醚、环己烷、正己烷中的一种或几种任意比例的混合溶剂。
进一步，PTX-5-伐普肽偶合物的合成路线如下：
进一步，具体操作方法如下：
1)选用NH2-Rink-Linker-Resin特殊的固相合成树脂，用-Trt基团保护的巯基(-SH)在I2/DIEA条件下可在固相合成树脂上形成分子内二硫键，用烯丙甲酯基(AllylO-CO)保护Lys5侧链的氨基，在加入特定的催化剂选择性脱除烯丙甲酯基，得到N-端氨基受保护、Lys5-侧链氨基游离的伐普肽树脂，并将其置于固相合成反应器中，用无水二氯甲烷浸洗后抽取溶剂并通入干燥氮气；
2)将紫杉醇-2’-丁二酸酯(PTX-Linker)溶于无水二氯甲烷或三氯甲烷中，加入BOP[苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐]，在一定条件下反应一段时间，滴入上述通有氮气的固相合成反应器中；
3)将反应后的溶液减压浓缩，浓缩液依次用二氯甲烷洗涤5次，二甲基甲酰胺洗涤6次，乙醚、石油醚、环己烷、正己烷的一种或任意比例的混合溶剂洗涤3次，减压浓缩后即得到伐普肽Lys5(PTX-Linker-NH)-固相合成树脂；
4)目标产物从固相合成树脂上解离步骤如下：将干燥的树脂加入一定的溶剂中，搅拌1小时后过滤，将过滤后的物质用无水三氯甲烷洗涤过滤；
5)目标产物纯化步骤如下：合并上述滤液后减压浓缩，浓缩物用溶剂萃取，抽滤收集溶剂不溶的固体，干燥后得到目标产物即PTX-5-伐普肽偶合物。
进一步，所述操作方法中，所述步骤1)中烯丙甲酯基脱除反应的催化剂为：Pd(OAc)2、P(t-Bu)3中的一种或两种任意比例混合物，其中摩尔比2:1为最佳，采用上述脱除剂的有益效果为：脱除烯丙甲酯基的同时，其他保护基不受影响，确保了目标产物的高效合成。
进一步，所述操作方法中，所述步骤2)中溶解PTX-Linker的二氯甲烷可用无水二氯乙烷替换，其中无水二氯乙烷与无水二氯甲烷的替换摩尔比为：(1:2)-(4:1)；反应体系溶剂DIEA可用N,N-二甲基甲酰胺替换，其中N,N-二甲基甲酰胺与DIEA的替换摩尔比为：(1:2)-(4:1)。
进一步，所述操作方法中，所述步骤2)中反应条件为：反应温度为：(30-50)℃，搅拌速度为：(500-1000)r/min，搅拌时间(25-45)min，其中最佳反应条件为：反应温度为35℃，搅拌速度为800r/min，搅拌时间为30min。
进一步，所述操作方法中，所述步骤4)中解离试剂为质量分数为5％-15％的三氟乙酸的三氯甲烷或二氯乙烷溶液，其中最佳质量比为8％；所述步骤4)中解离反应条件为：反应温度为：(30-50)℃，搅拌速度为：(500-1000)r/min，搅拌时间为：(1.2-2.0)h，最佳反应条件为：反应温度为：35℃，搅拌速度为：800r/min，搅拌时间为：1.5h。所述的本操作方法的有益效果是将目标产物从树脂上切除，同时避免了目标产物结构遭到破坏，确保了目标产物的高效合成。
进一步，所述操作方法中，所述的步骤5)中萃取溶剂为正丁基锂、四氢呋喃中的一种或任意比例的混合溶剂。
进一步，(PTX)2-伐普肽偶合物的合成路线如下：
述的(PTX)2-伐普肽偶合物液相合成的技术方案如下：
1)将PTX-5-伐普肽偶合物粗品加入到特定溶剂中，在室温下滴入高效偶合试剂，低速搅拌，滴加中间体PTX-linker，在特定条件下反应一段时间；
2)将反应后的溶液进行减压蒸馏，除去多余的溶剂，将残余物滴入冰水中，减压浓缩，收集水中析出的固体并用蒸馏水洗涤3次。所得固体用特定的溶剂进行重结晶，得到目标产物(PTX)2-伐普肽偶合物。
进一步，所述操作方法中，所述步骤1)中特定溶剂是指二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯中一种或两种的混合溶剂，所述步骤1)中高效偶合试剂为HOBt、DCC、MMF按一定比例的混合溶剂，其中VDCC:VHOBt:VMMF＝(3:2:1)-(8:6:1)。
进一步，所述操作方法中，所述步骤1)中反应条件为：反应温度为：(30-45)℃，搅拌速度为：(800-1000)r/min，搅拌时间为(25-45)min，其中最佳反应条件为：反应温度为35℃、搅拌速度为900r/min、搅拌时间30min。
进一步，所述操作方法中，所述步骤2)中重结晶溶剂为乙醇、四氢呋喃任意比例混合的溶剂。
所述的(PTX)2-伐普肽偶合物固相合成的具体技术方案如下：
1)按照权利要求6制备出伐普肽-Lys5(PTX-Linker-NH)-固相合成树脂后，在室温下加入高效偶合试剂，低速搅拌，滴加中间体PTX-Linker进行反应，在特定条件下反应一段时间；
2)将反应后溶液进行减压浓缩，将浓缩物滴入冰水中，抽滤收集水中析出的固体并用蒸馏水洗涤3次，所得固体用四氢呋喃或乙醇进行重结晶，即得到(PTX)2-伐普肽-固相合成树脂；
3)目标产物(PTX)2-伐普肽偶合物从固相合成树脂上解离反应步骤如下：将干燥的树脂加入质量分数为5％-20％的三氟乙酸的三氯甲烷溶液中，搅拌2小时后过滤，过滤物再用三氯甲烷洗涤过滤；
4)目标产物纯化步骤如下：合并上述滤液后减压浓缩，浓缩物用溶剂萃取，抽滤收集溶剂不溶的固体，干燥后得到纯净的目标产物(PTX)2-伐普肽偶合物。
进一步，所述操作方法中，所述步骤1)中高效偶合试剂为：HOBt、DCC、MMF按一定比例的混合溶剂，其中VDCC:VHOBt:VMMF＝(3:2:1)-(8:6:1)。
进一步，所述操作方法中，所述步骤1)中反应条件如下：反应温度为：(25-40)℃，搅拌速度为：(500-1000)r/min，搅拌时间为(25-45)min，其中最佳反应条件是：反应温度为30℃、搅拌速度为800r/min、搅拌时间35min。
进一步，所述操作方法中，所述步骤4)中萃取溶剂为乙酸乙酯、四氢呋喃中的一种或任意比例的混合溶剂。
本发明采用的上述技术方案，具有的有益效果在于：
本发明所述的紫杉醇-伐普肽偶合物的合成方法工艺简便，安全清洁，目标产物合成效率高。本发明产品紫杉醇伐普肽偶合物具有选择性高、毒副作用小、水溶性好的优异性能，从根本上克服了紫杉醇存在的缺点，很好的达到紫杉醇细胞毒性与伐普肽在癌细胞表面受体的高选择性的优势互补，提高了药效，其具有的水溶性为剂型制备及给药方式提供了更多选择。本发明所述的紫杉醇伐普肽偶合物，患者用药后，将浓集于肿瘤部位，更有效地提高抗癌效率。本发明制备的紫杉醇伐普肽偶合物为癌症治疗指明了方向，新型靶向抗癌药物将成为未来与癌症抗争的新型武器。
说明书附图
附图1中间体PTX-Linker的化学合成工艺流程图。
附图2 PTX-1-伐普肽偶合物的化学合成工艺流程图。
附图3 PTX-5-伐普肽偶合物的化学合成工艺流程图。
附图4(PTX)2-伐普肽偶合物的化学合成工艺流程图。
附图5紫杉醇-伐普肽偶合物的总体合成工艺流程图。
附图6实施例2-5产物及PTX浓度及培养时间对A549细胞增值抑制率的影响。
具体实施方式
实施例1紫杉醇-2’-丁二酸酯的合成
紫杉醇(2.562g，3.0mmol)溶于无水二氯甲烷(40ml)，加入4-二甲基氨基吡啶(DMAP，4.0mol)，丁二酸酐(0.600g，6.0mmol)，于0℃搅拌26小时后，加入乙酸乙酯400ml，并用盐酸(1.2mol/L)调至pH3-4，依次用60ml的饱和食盐水萃取3次，80ml的蒸馏水洗涤3次，用无水硫酸钠干燥，过滤后减压回收乙酸乙酯。所得残余物用丙酮-乙醚重结晶，得到紫杉醇-2’-丁二酸酯纯品2.436g，收率85.1％。HPLC：9.50min，质谱分析：MS：954.3[M+H]+，Mw：953.99(C51H55NO17)。
实施例2 PTX-1-伐普肽偶合物的合成
将与固相合成树脂NH2-Rink-Linker-Resin相连，用-Trt基团保护的巯基(-SH)在I2/DIEA条件下可在固相合成树脂上形成分子内二硫键，侧链保护Lys5-端氨基受保护、N-端氨基游离的伐普肽树脂(含有伐普肽0.15mmol)置于固相合成反应器中，加入DMAP/N,N-二甲基甲酰(质量比为2:5)，再用无水二氯甲烷浸洗后抽取溶剂并通入干燥氮气，将紫杉醇-2’-丁二酸酯(0.5445g，0.6mmol)溶于无水二氯甲烷(25ml)，加入DMC(0.162g，1.8mmol)，HOBt(0.234g，0.45mmol)，DIC(0.252g，2.0mmol)，DIEA(0.0585g，0.45mmol)，低速搅拌30min，滴入上述固相合成反应器中并用干燥氮气进行搅拌，在搅拌速度为700r/min、反应温度为35℃的条件下反应0.5h，再将反应溶液中的溶剂减压浓缩，抽干溶剂，将过滤后物质依次用10ml二氯甲烷洗涤5次，5ml乙醚洗涤3次，5ml的二甲基甲酰胺洗涤6次后减压浓缩，除去多余溶剂，将干燥的树脂加入到40ml质量分数为3％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，搅拌2.0小时后过滤，将树脂再用15ml的二氯甲烷洗涤并过滤3次，滤液合并后减压抽干，残余物用15ml的乙醚洗涤3次，抽滤收集乙醚不溶的固体，干燥后即得紫杉醇-2’-丁二酰-伐普肽偶合物纯品即PTX-1-伐普肽偶合物，收率达到95.8％。HPLC：18.47min，MS：2068.4[M+H]+，Mw：2067.36(C108H123N13O25)。
实施例3 PTX-5-伐普肽偶合物的合成
将与固相合成树脂NH2-Rink-Linker-Resin相连，用-Trt基团保护的巯基(-SH)在I2/DIEA条件下可在固相合成树脂上形成分子内二硫键，在Pd[P(C6H5)3]4/C6H5SiH3条件下选择性脱除烯丙甲酯基，得到侧链N-端氨基受保护、Lys5-端氨基游离的伐普肽树脂(含有伐普肽0.2mmol)，将其置于固相合成反应器中，用无水三氯甲烷浸洗后抽取溶剂并通入干燥氮气。将紫杉醇-2’-丁二酸酯(3.632g，4.0mmol)溶于无水二氯甲烷(200ml)，加入BOP(4.80mmol)，N,N-二甲基甲酰胺(0.472g，6.40mmol)，并搅拌20分钟后，滴入上述固相合成反应器中并用干燥氮气进行搅拌。2.0小时后将溶剂抽干，将树脂依次用80ml的二甲基甲酰胺洗涤6次，100ml乙醚洗涤3次，180ml二氯甲烷洗涤5次后减压浓缩，抽干多余溶剂。将干燥的树脂加入350ml的质量分数为5％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，在温度为23℃，搅拌速度为500r/min的条件下，搅拌反应1.5小时后过滤，将过滤物用250ml的二氯甲烷洗涤并过滤3次，合并上述滤液后减压抽干，残余物用250ml的四氢呋喃洗涤3次，抽滤收集四氢呋喃不溶的固体，干燥后即得到目标产品：紫杉醇-2’-丁二酰-伐普肽偶合物纯品即PTX-5-伐普肽偶合物，收率达到95.9％。HPLC：18.59min，MS：2068.4[M+H]+，Mw：2067.36(C108H123N13O25)。
实施例4(PTX)2-伐普肽偶合物的液相合成
PTX-5-伐普肽偶合物0.207g(0.1mmol)加入无水二甲基甲酰胺6ml。将紫杉醇-2’-丁二酸酯(0.114mg，0.12mmol)溶于DIEA(8ml)加入4ml的HOBt，3ml的DCC，1.0mlMMF搅拌12min后滴入上述溶液。在反应温度为24℃、搅拌速度为400r/min的条件下，反应0.5小时，将反应后的溶液减压浓缩除去DIEA，将残余物滴入100ml的冰水中，抽滤收集水中析出的固体并用30ml的蒸馏水洗涤3次。所得固体用四氢呋喃重结晶，得(PTX)2-伐普肽偶合物纯品0.283g，收率为94.2％。HPLC：23.25min，MS：3004.3[M+H]+，Mw：3003.29(C159H176N14O41)。
实施例5(PTX)2-伐普肽偶合物的固相合成
将伐普肽-Lys5(PTX-Linker-NH)-固相合成树脂(含有伐普肽0.20mmol)溶于24ml的无水二氯甲烷后加入固相合成反应器中，再加入4mlHOBt、5mlDCC、1mlMMF的混合溶剂，室温搅拌，不断滴加紫杉醇-2’-丁二酸酯(PTX-Linker，0.34g，0.36mol)，在反应温度为35℃、搅拌速度为900r/min的条件下搅拌反应0.5小时，进行减压蒸馏，将残余物滴入300ml冰水中，抽滤收集水中析出的固体并用80ml蒸馏水洗涤3次，所得固体用100ml乙醇重结晶后，加入80ml质量分数为5％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液，搅拌1.2h后过滤，再用40ml无水二氯甲烷洗涤过滤，滤液合并后减压浓缩，残余物用160ml乙醚洗涤3次，抽滤收集溶剂不溶的固体，干燥得到纯净的目标产物0.826g，收率为94.5％。HPLC：23.35min，MS：3004.16[M+H]+，Mw：3003.29(C159H176N14O41)。
生物活性实施例
实施例6实施例5产物的细胞毒性试验
实验方法：
应用Cell Counting Kit-8试剂(简称CCK-8法)检测实施例4制备(PTX)2-伐普肽偶合物的对人非小细胞肺癌A549细胞的增殖抑制作用。CCK-8试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
实验结果：
本实验测试了实施例5制备的(PTX)2-伐普肽偶合物对人非小细胞肺癌A549细胞的增殖抑制作用。实验结果如下图所示，(PTX)2-伐普肽偶合物对人非小细胞肺癌A549细胞表现出很强的细胞增殖抑制作用，IC50值约为14.75nM。
实验结论：
(PTX)2-伐普肽偶合物能明显抑制人非小细胞肺癌A549细胞细胞的增殖，其IC50为14.75nM，说明(PTX)2-伐普肽偶合物对人非小细胞肺癌A549细胞具有明显的细胞毒性作用。
实施例7实施例4产物的SD大鼠急性毒性试验
实验动物：SD大鼠24只，雌雄各半，体重140-160g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可号：SCXK(京)2012-0001，饲养于IVC独立送回风系统中，试验动物质量合格证号：11400700146158；
剂量选择及受试物给与方式：尾静脉注射；按照成人70kg计算，临床最大用药量为0.0286mg/kg，根据人与大鼠等效据体表面积换算大鼠等效临床剂量约为0.1716mg/kg；先将SD大鼠随机分为5组，测试组每组5只SD大鼠，依次分别设定SD大鼠给药剂量为：2500mg/kg、833mg/kg、4000mg/kg、5000mg/kg；空白对照组为4只SD大鼠，注射等体积生理盐水进行对比试验。其中试验组动物每次静脉注射不同浓度剂量药物后观察SD大鼠状态，并确定下次剂量的选择。
实验方法：先配制指定浓度的溶液，称取一定质量的受试物，在超净工作台内置入10ml无菌离心管中，然后加入一定体积的0.9％氯化钠注射液，振摇后约1min左右，可见受试物充分溶解，溶液呈澄明透亮，得到指定浓度的受试物溶液。对给药SD大鼠进行称重，按照10ml/kg给药体积给指定浓度的上述溶液，给药后连续观察1h未见明显异常症状，连续观察21d，动物一般状态良好。
注射前16小时禁食不禁水，注射完毕2小时后喂食。按分组情况，分别给每组大鼠尾部静脉注射相应偶合物及相应浓度的样本或0.9％生理盐水1次，进针后缓慢推注，用时80s-100s。
实验结论：FPSDM-TP-5偶合物SD大鼠单次静脉注射给药急性毒性研究结果表明：833mg/kg剂量(相等于人临床最大用药量的29130倍和大鼠等效临床剂量的4850倍)动物一般状态良好；2500、4000和5000mg/kg剂量(分别相等于临床最大用药剂量的87410、
139860、174830倍，相等于大鼠等效临床剂量的14570、23310、29140倍)的实施例4的产物可引起SD大鼠呼吸急促、俯卧、呼吸困难、竖毛等异常症状，上述异常症状药后30min左右基本恢复正常；不同剂量给药动物连续观察21d，存活率为100％；证实静脉注射高剂量的或者更高剂量的本品可引起SD大鼠的耐受，该受试物应无严重急性中毒的危险性，说明了该受试物FPSDM-TP-5偶合物的毒性较小。
实施例8实施例2-5产物及PTX对A549细胞增殖的影响
原料准备：将实施例2-5产物：
PTX-1-伐普肽偶合物、PTX-5-伐普肽偶合物、(PTX)2-伐普肽偶合物与紫杉醇(PTX)分别溶解于无水乙醇，保持于-20℃待用。
细胞培养：A549细胞用含10％小牛血清的1640培养液置于含5％CO2的37℃培养箱中培养，布满培养瓶时，用0.05％的胰蛋白酶(含0.02％EDTA)消化为单细胞悬液后传代，2-3次/周。
实验操作：将PTX、PTX-1-伐普肽偶合物、PTX-5-伐普肽偶合物、(PTX)2-伐普肽偶合物溶解于无水乙醇，保持于-20℃待用。
将A549细胞接种于96孔板，每孔4000个细胞，培养24h后加入不同浓度的药物作用不同时间。药物处理组，每种药物设3个浓度：1、100、1000nmol/L，同时设空白调零孔及对照孔，每组7孔。分别加入上述不同浓度的DTX、DTX-VRT及2DTX-VRT分别培养24h、72h后弃上清夜，加入10％小牛血清的1640培养液200μL，并加入相同体积的5.0mg/mLMTT溶液，在37℃条件下继续孵育4h，吸弃孔内培养上清液，每孔加入相同体积的DMSO，震荡30min。用酶标仪测仪在490nm波长处测定吸光度A值。增殖抑制率＝[1-(A实验-A空白)/(A对照-A空白)]。
统计学处理:数据的表达采用表示，采用SPSS 13.0软件进行统计分析，数据比较采用t检验，以P<0.05为有显著性差异。
实验结果及分析：由附图7可知，PTX及其偶合物细胞毒性的浓度依赖性。在相同培养时间条件下，A549细胞的增殖抑制率随着PTX及其偶合物浓度的增加逐渐升高。在药物浓度大于1nmol/L的条件下，采用相同浓度药物培养A549细胞相同时间时，(PTX)2-伐普肽偶合物培养的细胞增殖抑制率高于另外两种物质，具有显著性差异(P<0.05)。
由图7可知，PTX及其偶合物细胞毒性的时间依懒性。1nmol/L的PTX作用72h后，A549细胞增殖抑制率升高，有显著性差异(P<0.05)。1nmol/L的两种偶合物作用72h后，A549细胞增殖抑制率无明显变化。延长100nmol/L、1000nmol/L PTX及其偶合物作用时间从24h至72h，A549细胞增殖抑制率升高，有显著性差异(P<0.05)。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，所作出了任何修改、等同替换、改进等，都应视为属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种紫杉醇伐普肽偶合物，其特征在于：所述的紫杉醇在2’位羟基通过链接序列与伐普肽的氨基相连。
2.根据权利要求1所述的紫杉醇伐普肽偶合物，其特征在于：所述连接剂为；
其中，n=1、3、5、7。
3.根据权利要求2所述的一种紫杉醇-伐普肽偶合物，其特征在于：所述偶合物的制备方法为：先合成中间体PTX-Linker，再与连接在固相合成树脂上的伐普肽相连，合成PTX-1-伐普肽偶合物、PTX-5-伐普肽偶合物、(PTX)2-伐普肽偶合物，最后再将合成的目标产物从树脂上解离下来，最终得到纯净的目标产物紫杉醇伐普肽偶合物。
4.根据权利要求3所述的PTX-1-伐普肽偶合物，其特征在于：其制备方法为：
1）向侧链氨基受保护的伐普肽树脂中加入特定的脱除剂，选择性脱除N-端Fmoc氨基保护基，得到Lys5-侧链氨基受保护、N端侧链氨基酸游离的伐普肽树脂，并将其置于固相合成反应器中，用无水二氯甲烷浸洗后抽取溶剂并通入干燥氮气；
2）将紫杉醇-2’-丁二酸酯（PTX-Linker）溶于无水二氯甲烷，并加入特定的高效偶合试剂，低速搅拌一段时间后，滴入上述通有氮气的固相合成反应器中，在一定条件下反应一段时间；
3）将反应物减压浓缩，除去溶剂后，依次用二甲基甲酰胺洗涤6次，用二氯甲烷洗涤5次，用乙醚、石油醚、环己烷、正己烷中的一种或任意比例的混合溶剂洗涤3次，将洗涤后的反应物抽干即得到PTX-Linker-NH-伐普肽-固相合成树脂；
4）目标产物从固相合成树脂上解离的步骤为：将干燥的树脂加入一定的溶剂中，搅拌1小时后过滤；
5）目标产物分纯化的步骤如下：过滤物用无水二氯甲烷洗涤过滤，滤液合并后减压抽干，残余物用溶剂萃取，抽滤收集溶剂不溶的固体，干燥后得到纯净的目标产物PTX-1-伐普肽偶合物；
进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述的反应步骤1）中的特定脱除剂为DMAP的N,N-二甲基甲酰溶液，其中DMPA的质量分数为20 %-40 %，以30 %为最佳；
进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述的步骤2）中溶解PTX-Linker的二氯甲烷或三氯甲烷的一种或任意比例混合溶剂；所述的步骤2）中特定的高效偶合试剂为HOBt（1-羟基苯并三唑）、DMC（碳酸二甲酯）、DIC（N,N-二异丙基碳二亚胺）、DIEA（N,N-二异丙基乙胺）按一定比例混合的混合溶剂，其中VDMC:VHOBt =（5:1）-（10:1），VDIC:VDIEA=（3:1）-（8:1）；
进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述步骤2）中反应条件如下：反应温度为：（30-40） ℃，搅拌速度为：（500-1000） r/min，搅拌时间为：（25-45） min，其中最佳反应条件为：反应温度为35 ℃，搅拌速度为800 r/min，搅拌时间为30 min；
进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述步骤4）中解离溶剂为2 %-10 %三氟乙酸的二氯甲烷溶液，其中最佳质量比为5 %；所述步骤4）中解离反应条件为：反应温度为：（18-30） ℃，搅拌速度为：（200-900） r/min，搅拌时间为：（1.5-2.5） h，其中最佳反应条件为：反应温度23 ℃，搅拌速度为：450 r/min，搅拌时间为：2.0h。
5.根据权利要求3所述的PTX-5-伐普肽偶合物，其特征在于：所述的制备方法为：
1）将N-端氨基受保护、Lys5-侧链氨基游离的伐普肽树脂置于固相合成反应器中，用无水二氯甲烷浸洗后抽取溶剂并通入干燥氮气；
2）将紫杉醇-2’-丁二酸酯（PTX-Linker）溶于无水二氯甲烷或三氯甲烷，加入BOP[苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐]在一定的转速下搅拌反应，滴入上述通有氮气的固相合成反应器中；
3）1小时后将溶剂抽干，反应物依次用二甲基甲酰胺洗涤6次，二氯甲烷洗涤5次，乙醚、石油醚、环己烷及正己烷中的一种或几种任意比例的混合溶剂洗涤3次后抽干，即得到伐普肽-Lys5(PTX- Linker-NH)-固相合成树脂；
4）目标产物从固相合成树脂上解离步骤如下：将合成的上述树脂加入质量分数为5 %-15 %三氟乙酸的三氯甲烷或二氯乙烷溶液中，搅拌反应（1.2-2.0）小时；
5）目标产物分离提纯的步骤如下：过滤反应液，将过滤物用无水二氯甲烷洗涤过滤，合并滤液后减压浓缩，除去多余溶剂，残余物用正丁基锂、四氢呋喃中的一种或任意比例的混合溶剂进行萃取3次，抽滤收集溶剂不溶的固体，干燥后得到纯净的目标产物即PTX-5-伐普肽偶合物；
进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述步骤1）中脱除催化剂为：Pd(OAc)2、P(t-Bu)3中的一种或两种任意比例混合物，其中摩尔比2:1为最佳；
进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述步骤2）中的二氯甲烷可用无水二氯乙烷替换，其中无水二氯乙烷与无水二氯甲烷的替换摩尔比为：（1:2）-（4:1）；反应体系溶剂DIEA可用N,N-二甲基甲酰胺替换，其中N,N-二甲基甲酰胺与DIEA的替换摩尔比为：（1:2）-（4:1）；
进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述的步骤2）中反应条件如下：反应温度为：（30-50） ℃，搅拌速度为：（500-1000） r/min，搅拌时间为：（25-45） min，其中最佳反应条件为：反应温度为：35 ℃，搅拌速度为：800 r/min，搅拌时间为：30 min；
进一步，所述操作方法中，所述步骤4）中解离试剂为质量分数为5 %-15 %的三氟乙酸的三氯甲烷或二氯乙烷溶液，其中最佳质量比为8%；所述步骤4）中解离反应条件为：反应温度为：（30-50） ℃，搅拌速度为：（500-1000） r/min，搅拌时间为：（1.2-2.0） h，最佳反应条件为：反应温度为：35 ℃，搅拌速度为：800 r/min，搅拌时间为：1.5 h。
6.根据权利要求3所述的(PTX)2-伐普肽偶合物，其特征在于：其液相合成方法为：
1）将PTX-5-伐普肽偶合物加入到特定溶剂中，在室温下滴入高效偶合试剂，低速搅拌，滴加中间体PTX-linker进行反应，在特定条件下反应一段时间；
2）将反应后溶液进行减压蒸馏，除去多余的溶剂，将残余物滴入冰水中，抽滤收集水中析出的固体并用蒸馏水洗涤3次，所得固体用乙醇、四氢呋喃的一种或两种任意比例的混合溶剂进行重结晶，得到目标产物(PTX)2-伐普肽偶合物；
进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述反应步骤1）中特定溶剂是指二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯中一种或两种的混溶剂，所用的高效偶合试剂为HOBt、DCC、MMF按一定比例的混合溶剂，其中VDCC:V HOBt :VMMF=（3:2:1）-（8:6:1）；进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述反应步骤1）中的反应条件如下：反应温度为：（30-45） ℃，搅拌速度为：（800-1000） r/min，搅拌时间为（25-45） min，其中反应温度为35 ℃、搅拌速度为900 r/min、搅拌时间为30 min为最佳反应条件。
7.根据权利要求3所述的(PTX)2-伐普肽偶合物，其特征在于：其固相相合成方法为：
1）将伐普肽-Lys5(PTX- Linker-NH)-固相合成树脂（N-端侧链仍受保护），在室温下加入高效偶合试剂，低速搅拌，滴加中间体PTX-Linker进行反应，在特定条件下反应一段时间；
2）将反应液进行减压蒸馏，除去多余的溶剂，将残余物滴入冰水中，抽滤收集水中析出的固体并用蒸馏水洗涤3次，所得固体用四氢呋喃或乙醇进行重结晶，即得到目标产物(PTX)2-伐普肽-固相合成树脂；
3）目标产物从固相合成树脂上解离步骤如下：将干燥的树脂加入质量分数5 %-20 %的三氟乙酸的三氯甲烷溶液中，搅拌反应2小时；
4）目标产物纯化的步骤如下：将反应后的溶液过滤，过滤物再用无水二氯甲烷洗涤过滤，合并滤液后减压浓缩，残余物用溶剂萃取，抽滤收集溶剂不溶的固体，干燥后得到纯净的目标产物(PTX)2-伐普肽偶合物；
进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述步骤1）中的高效偶合试剂为：HOBt、DCC、MMF按一定比例的混合溶剂，其中VDCC:V HOBt :VMMF=（3:2:1）-（8:6:1）；
进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述步骤1）中反应条件是：反应温度为：（25-40） ℃，搅拌速度为：（500-1000） r/min，搅拌时间为（25-45）分钟，其中最佳反应条件是：反应温度为30 ℃、搅拌速度为800 r/min、搅拌时间35分钟；
进一步，所述操作方法中，其特征在于：所述步骤4）中萃取溶剂为乙酸乙酯、四氢呋喃中的一种或几种任意比例的混合溶剂。
8.权利要求1-8 任意一项所述制备方法制备的紫杉醇伐普肽偶合物。
9.权利要求1-8任意一项所述的紫杉醇伐普肽偶合物在制备用于治疗肿瘤药物方面的应用。
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