CN112105628A - 高剪切固相合成 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及有机分子的固相合成，并且尤其涉及使用固相合成来合成聚合物的高效方法，例如肽、核苷酸或糖。
Description
技术领域
本公开总体上涉及固相合成以及使用固相合成法合成肽和其他分子的方法的领域。
背景技术
肽类药物有许多应用。市场上大约有100种已获批准的肽类药物，其中有几种大片药物，如生长抑素类似物奥曲肽。肽类药物最流行和占主导地位的领域包括HIV治疗、糖尿病、癌症治疗，并且在神经系统紊乱(例如阿尔茨海默氏病和帕金森氏病)以及自身免疫性疾病(例如狼疮、类风湿关节炎和葡萄膜炎)领域中的应用也不断产生。
在制药工业中，习惯使用三种主要方法来制备大量肽：重组技术；液相化学合成和固相肽合成(SPPS)。由于原料成本低和规模经济，SPPS是肽的首选制造方法。固相化学方法生产从克到100Kg规模的相对短的肽(通常长达约50个氨基酸长)的速度更快且成本更低，并且更适合于早期临床开发。
SPPS方法是多步骤链方法，其涉及两种主要类型(即阶段或步骤)的反应：(i)除去临时保护基(脱保护)和(ii)氨基酸偶联。这些反应一个接一个地依次发生，并进行中间洗涤以除去未反应的试剂和可溶性副产物。通常，在固相合成中，在不溶性聚合树脂上构建一系列结构单元，所述不溶性聚合树脂具有对所述结构单元具有反应性的连接单元。由于某些结构单元，例如氨基酸包含至少两个彼此反应的官能团(即氨基和羧酸根基团)，因此通常预先保护一个基团(通常是氨基)，以使游离的羧酸根基团与连接单元反应，而不是与另一个存在的氨基酸反应。为了使氨基酸链延续，对氨基进行脱保护，从而产生具有第一氨基酸的树脂，可用于与连续的N-保护的氨基酸反应。重复该过程，直到获得所需数量的结构单元为止。使用不溶性树脂的目的是使简单的洗涤过程成为可能，该过程只需清洗所有过量的可溶试剂以及副产物，同时保持所需的产物附着在不溶性树脂上。因此，最后的合成步骤是除去侧链保护基并切下结构单元链(肽)，并将其与不溶性树脂分离。
因此，聚合物分子的固相合成通常包括以下合成步骤：(a)官能化的树脂聚合物珠粒的溶胀；(b)将第一被保护的单体单元偶联到官能化的树脂上；(c)洗涤过量的第一被保护的单体单元；(d)使用脱保护剂对与步骤(b)中形成的与第一单体连接的树脂进行脱保护，从而形成与第一脱保护单体连接的树脂；和(e)洗涤过量的脱保护剂。然后对随后的被保护的单体循环重复步骤(b)-(e)，从而形成树脂-聚合物分子。因此，步骤(b)-(e)被认为是一个循环，其中总固相合成通常包括多个循环。最后，将所需的产物分子从树脂上切下并与树脂分离，从而获得最终的聚合物产物。
用于固相合成的树脂通常是不溶的聚合物，经化学反应性官能团改性。这些官能团在化学上适合与要掺入目标产物寡聚物/聚合物中的第一单体偶联。所述第一单体以及其他顺序单体通常包括至少两个彼此反应的官能团。然而，在这些官能团之一上放置保护基将所述转化限制为将被保护的单体单元偶联到树脂，从而形成最初与第一单体连接并在许多类似的循环之后与单体的构建体连接的树脂。通常，为了确保反应完成，在一系列的循环中的每个被保护单体被过量(相对于与树脂结合的分子而言)使用。典型地，也过量(相对于与树脂结合的单体分子而言)使用脱保护剂，以确保反应完成。
自1963年布鲁斯·梅里菲尔德(Bruce Merrifield)发明SPPS(Merrifield，R.B.(1963)J.Am.Chem.Soc.85，2149-2154)以来，引入了许多方法来改进该技术。这些方法大多数基于偶联剂的化学修饰(Pattabiraman等，Nature(2011)480，471-479)。其他改进包括热方法，例如微波和加热(Collins等，(2014)Org.Lett.16，940-943)。然而，关于水动力参数对SPPS中产率和副反应影响的研究很少。
多肽的二级和三级结构对剪切力特别敏感。当受到剪切作用时，肽分子的二级和/或三级结构可能会不可逆地改变，从而可能导致生物活性丧失。如果肽分子受到足够的剪切力，则一级结构即氨基酸序列也可能被破坏或打断。考虑到这一点，合成肽的方法通常利用使肽分子暴露于剪切应力的过程最小化的程序。例如，EP0503683公开了一种“涡旋”搅动模式，该模式防止树脂附聚并允许总的流体-树脂相互作用而无需使用叶轮型机械搅动。根据该公开，在机械搅动下，由叶轮引起的剪切和树脂磨损可使树脂珠粒破碎成越来越小的颗粒，这些颗粒最终会堵塞过滤器，从而迫使合成过程中断。使用涡旋式搅动机，对树脂珠粒没有叶轮式剪切或磨损作用。
在他的开创性论文(Merrifield，R.B.(1963)J.Am.Chem.Soc.85，2149-2154)中，Merrifield使用磁力搅拌器来混合聚合树脂珠粒。事实证明，该方法将树脂珠粒破碎成小颗粒，从而阻塞了烧结玻璃过滤器并阻止了过滤。为了避免这个问题，Merrifield发明了一种由反应容器组成的手动装置，其中通过摇动而不是搅拌来混合反应物(Merrifield，R.B.Solid Phase Systhesis(Noble Lecture)，Angewandte ChemieInternationalEdition(1985)24，799-892)。从那时起，肽的生产通常仅限于采用温和的混合方法，例如涡旋、氮气流、在旋转蒸发转子中旋转、摇摆搅动等。在大规模固相合成(SPS)玻璃反应器中，通常采用机械搅拌器在低转速下温和搅动树脂珠粒。这种搅拌器的叶轮是专为剪切速率非常低的搅动而设计的。
固相合成通常用于肽和多肽的合成。然而，该方法决不限于此类化合物的合成，其他寡聚/聚合分子的制备，例如修饰的肽、拟肽、寡核苷酸、肽核酸分子、寡糖和小的有机分子都是通过固相合成来实现的。通常，可以通过固相合成来合成需要选择性保护/去保护、偶联和切断步骤的任何有机聚合物或分子(例如，Boncher等，(2013)Mod.Chem.appl.1：113)。
固相寡核苷酸合成通常使用亚磷酰胺方法进行。在该方法中，亚磷酰胺结构单元衍生自被保护的2'-脱氧核苷核糖核苷或化学修饰的核苷。为了获得所需的寡核苷酸，将结构单元按所需顺序依次偶联至正在生长的寡核苷酸链。该方法涉及的结构单元是核苷的3'-O-(N,N-二异丙基亚磷酰胺)衍生物(核苷亚磷酰胺)。通常，将具有O保护基的树脂脱保护并与O保护的核苷亚磷酰胺偶联以形成P-O键(其中磷来自添加的结构单元，而氧最初是与树脂结合的反应物的一部分)。下一步通常涉及封端未反应的端基是O的树脂，以抑制副产物的形成。接下来，磷原子被氧合并且氧被脱保护，使得产物对进一步的结构单元反应。链组装完成后，产物从固相释放到溶液中、脱保护并收集。通常，合成寡核苷酸是长度约为15-25个碱基的单链DNA或RNA分子。
寡糖的固相合成更加多样化，因为糖单元(即单糖单元)可以通过糖环不同位置的各种C-O键相互连接。但是，寡糖SPS策略与其他SPS方法学享有重复的脱保护-偶联循环的共同特征。Seeberger和Haase(Chem.Rev.，2000，100(12)，第4349-4394页)总结了不同的寡糖SPS工艺。
对于以更高的效率和速度以及更低的副反应来大规模合成肽的改进的方法存在未满足的需求。
发明内容
本发明提供了固相合成寡聚物的改进方法，例如肽、寡糖、寡核苷酸和其他分子。本发明部分基于出乎意料的发现，即使用高剪切力和操纵速度进行固相合成不会损害固相载体或合成分子，但会改善合成效率，例如合成时间、产率和纯度。
结合系统、工具和方法来描述和说明以下实施方式及其方面，它们是示例性和说明性的，而并不限制范围。在各种实施方式中，减少或消除了一个或多个上述问题，而其他实施方式针对其他优点或改进。
根据一个方面，本发明提供了一种用于固相逐步合成有机分子的方法，其包括至少一个混合步骤，该步骤涉及在合成混合物内施加高剪切力，其中在逐步合成的所有合成步骤中，固相树脂与搅拌装置接触。
根据一些实施方式，该方法包括步骤：提供包括反应室和搅拌装置的反应器，该搅拌装置包括具有至少两个可绕轴旋转的叶片的叶轮；将官能化的聚合树脂珠粒和至少一种溶剂放入反应器中以提供反应混合物，其中反应混合物与可旋转的叶片接触；将至少一种反应物放入反应室中；并以至少600转/分的转速旋转叶轮一段时间，同时保持至少3×103s-1的剪切速率，从而进行至少一个固相合成步骤。
根据一些实施方式，搅拌装置是机械搅拌器，并且叶轮的旋转以600至1000转/分的转速进行，保持至少3×103s-1的剪切速率。
根据其他实施方式，搅拌装置是均质机，并且叶轮的旋转以5,000-30,000转/分的转速进行，同时保持至少1×106s-1的剪切速率。
根据本发明的搅拌装置是搅拌器，例如机械搅拌器或均质机，其包括至少两个可旋转的叶片。根据本发明，可以使用能够用于搅拌固相合成反应并产生上述转速和剪切速率的任何搅拌器。
根据一些实施方式，均质机是转子-定子均质机。
根据一些实施方式，搅拌装置和反应室基本同轴。根据一些实施方式，机械搅拌器和反应室基本同轴。根据一些实施方式，均质机和反应室基本同轴。
根据一些实施方式，本文公开的任何搅拌装置，例如机械搅拌器或均质机，均包括沿轴线对齐的大体细长的主体。根据一些实施方式，反应室是三维的，并且包括用于放入搅拌装置的开口边缘。根据一些实施例，开口边缘是二维的，使得搅拌装置通过基本上在开口边缘中心的位置而放入。以这种方式，根据一些实施方式，反应室和均质机基本上是同轴的。
术语“固相合成”(SPS)是指用于制备单一化合物或分子多样性化合物库的一个或一系列化学反应，其中化学反应在通过适当的接头与固相载体材料结合的化合物上进行。因此，根据固相合成合成方法，在一些或所有合成步骤中，将化合物或其前体与固体载体连接。SPS通常在肽、多糖和多核苷酸的生产中实施。
根据一些实施方式，在该方法中形成的有机分子是聚合有机分子。
根据一些实施例，该方法包括步骤：
(a)提供一种反应器，该反应器包括反应室和搅拌装置，该搅拌装置包括具有至少两个可绕轴旋转的叶片的叶轮；
(b)将官能化的聚合树脂珠粒和至少一种溶剂放入反应器中以提供反应混合物，其中反应混合物与可旋转的叶片接触；
(c)将至少一种被保护的单体有机分子放入反应室，并使叶轮和至少一种偶联剂旋转，从而形成被保护的单体有机分子与树脂的偶联产物；
(d)洗涤过量的所述被保护的单体有机分子；和
(e)将至少一种脱保护剂放入反应室中并使叶轮旋转，从而从偶联产物中除去至少一个保护基，形成脱保护的单体有机分子与树脂的偶联产物，从而完成聚合有机分子的固相合成中的一个循环；
其中步骤(c)和(e)的至少一步中的叶轮旋转进行了一段时间，转速为至少600转/分，同时保持至少3×103s-1的剪切速率，可选地，其中步骤(c)至(e)重复多个循环。
根据一些实施方式，提供了一种用于在聚合有机分子的固相合成中实施至少一个循环的方法，该方法包括步骤：
(a)提供一种反应器，该反应器包括反应室和搅拌装置，其中搅拌装置包括具有至少两个可绕轴旋转的叶片的叶轮；
(b)将官能化的聚合树脂珠粒和至少一种溶剂放入反应器中以提供反应混合物，其中反应混合物与可旋转的叶片接触；
(c)将至少一种被保护的单体有机分子和至少一种偶联剂放入反应室并旋转叶轮，从而形成被保护的单体有机分子与树脂的偶联产物；
(d)洗涤过量的所述被保护的单体有机分子；和
(e)将至少一种脱保护剂放入反应室并旋转叶轮，从而从偶联产物中除去至少一个保护基，形成脱保护的单体有机分子与树脂的偶联产物，从而完成聚合有机分子的固相合成中的一个循环；
其中步骤(c)和(e)的至少一步中的叶轮旋转进行了一段时间，转速为至少600转/分，同时保持至少3×103s-1的剪切速率，可选地，其中步骤(c)至(e)重复多个循环。
根据一些实施方式，该方法还包括洗涤过量的所述脱保护剂的步骤，从而分离脱保护的单体有机分子与树脂的偶联产物。
根据一些实施方式，步骤(d)包括洗涤过量的所述被保护的单体有机分子，从而将过量的所述被保护的单体有机分子与被保护的单体有机分子和树脂的偶联产物分离。根据一些实施方式，步骤(d)还包括丢弃分离的过量的所述被保护的单体有机分子。
根据一些实施方式，步骤(d)包括洗涤过量的所述被保护的单体有机分子，从而将过量的所述被保护的单体有机分子与反应室内的被保护的单体有机分子和树脂的偶联产物分离。根据一些实施方式，步骤(d)包括洗涤过量的所述被保护的单体有机分子，从而将过量的所述被保护的单体有机分子与被保护的单体有机分子和树脂的偶联产物分离，使得偶联产物保留在反应室中。
根据一些实施方式，步骤(c)和(e)都以至少600转/分的转速进行一段时间，同时保持至少3×103s-1的剪切速率。
根据一些实施方式，步骤(c)至(e)重复至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少7个循环。
根据一些实施方式，该方法还包括从树脂上切下步骤(e)的偶联产物的步骤，从而形成聚合有机分子而完成其固相合成。
根据一些实施方式，该方法还包括从反应混合物中分离聚合有机分子的步骤。
应该理解的是，术语“单体有机分子”是指与其他有机分子顺序或循环偶联(例如固相合成)会形成相应的聚合有机分子的任何有机分子。通常，SPS中的单体有机分子可包括天然或合成的结构单元，例如氨基酸、核苷酸、核苷和单糖，或其衍生物或类似物。然而，如本文所用，术语“单体有机分子”还包括二聚体、三聚体等，其可以充当SPS中的结构单元。因此，本文提供的方法包括例如固相合成，其中与单体氨基酸结合的树脂首先与二肽偶联，然后与三肽偶联，接着被切下形成六肽。
根据一些实施方式，单体有机分子选自氨基酸、肽、糖、核苷酸和核苷。因此，被保护的单体有机分子选自N-保护的氨基酸、N-保护的肽、O-保护的糖、O-保护的核苷酸和O-保护的核苷。根据一些实施方式，单体有机分子选自氨基酸、单糖和核苷。根据一些实施方式，单体有机分子是氨基酸。
因此，还应理解，术语“聚合有机分子”是指与单体有机分子顺序或循环偶联(例如在固相合成中)可形成的任何有机分子。聚合有机分子的性质取决于单体有机分子的特性。通常，在SPS中制备的聚合有机分子可以包括天然/生物化合物，例如(多肽)肽、多核苷酸和多糖。
如本文所用，术语“循环”是指一系列步骤，其可以重复多次。这些步骤统称为单个循环。因此，“循环的”是指一种方法，其中至少一些步骤以循环的方式重复。
如本文所用，术语“多个”是指等于或大于二的整数。
根据一些实施方式，固相合成的至少一个步骤是将单体偶联至以下中的一种：聚合树脂；与聚合树脂连接的寡聚物链；和与聚合树脂连接的另外的单体；其中所述单体和另外的单体各自独立地选自糖、氨基酸和核苷；和其中寡聚物包含糖、氨基酸、核苷酸和核苷中的至少一种。根据一些实施方式，所述糖是单糖。
根据一些实施方式，固相合成的至少一个步骤是将氨基酸偶联至聚合树脂或偶联至与聚合树脂连接的氨基酸或肽链。
根据一些实施方式，固相合成的至少一个步骤是将核苷偶联至以下之一：聚合树脂；与聚合树脂连接的多核苷酸链；与聚合树脂连接的核苷；和与聚合树脂连接的核苷酸。
根据一些实施方式，固相合成的至少一个步骤是将糖偶联至以下之一：聚合树脂；与聚合树脂连接的多糖链；和与聚合树脂连接的单糖。根据一些实施方式，在步骤中偶联的糖是单糖。
根据一些实施方式，固相合成的至少一个步骤包括除去保护基。
根据一些实施方式，固相合成的至少一个步骤选自氨基酸与树脂的偶联，核苷与树脂的偶联，糖的偶联和保护基的去除。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
根据一些实施方式，固相合成的至少一个步骤选自氨基酸与树脂的偶联和保护基的去除。
根据一些实施方式，该方法包括将单体与树脂偶联的至少两个步骤和除去保护基的至少两个步骤，其中该单体选自糖、氨基酸和核苷。
根据一些实施方式，该方法包括将氨基酸与树脂偶联的至少两个步骤和除去保护基的至少两个步骤。
根据一些实施方式，该方法包括将糖与树脂偶联的至少两个步骤和除去保护基的至少两个步骤。
根据一些实施方式，该方法包括将核苷与树脂偶联的至少两个步骤和除去保护基的至少两个步骤。
根据一些实施方式，固相合成的至少一个步骤是从固相树脂切下合成的分子。
本发明的方法可以用于合成能够在固体载体上合成的任何有机分子。
根据一些实施方式，有机分子合成包括多个步骤。
根据一些实施方式，固相合成方法用于合成选自以下的聚合有机分子：肽、多肽、修饰的肽、拟肽、寡核苷酸、肽核酸分子和寡糖。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
如本文所用，术语“聚合有机分子”是指由连接的单体单元组成的任何分子，只要该分子包括至少两个化学连接的单体单元即可。术语“聚合分子”旨在包括短的寡聚物，例如但不限于二聚物、三聚物和四聚物，以及约最大50个单体的寡聚物和包括最多约一百个单体单元的长聚物。根据一些实施方式，聚合有机分子包含2-50、2-30、3-25或3-25个单体单元。优选地，聚合分子是生物聚合物，特别是多核苷酸、多糖、多肽或其杂合体。根据本发明的杂合分子包括但不限于肽-核酸分子(PNA)、糖蛋白和蛋白聚糖。
如本文所用，术语“多肽”和“寡肽”是本领域众所周知的，并且用于指代一系列连接的氨基酸分子。该术语旨在包括短肽序列(例如但不限于三肽)和更长的蛋白质序列。类似地，术语“多核苷酸”或“寡核苷酸”是指连接的核苷酸的短或长的寡聚物，术语“多糖”是指连接的糖单元的短或长的寡聚物。如本文所用，术语“杂合体”是指具有至少两种类型的单体的寡聚物和聚合物。例如，杂合寡聚物可都包括糖、氨基酸、核苷酸和/或核苷作为结构单元单体。
在其他实施方式中，固相合成方法用于合成肽、多肽、修饰的肽或拟肽。
根据一些实施方式，本发明的方法用于合成组合文库或阵列。根据一些实施方式，使用本发明的方法产生肽的组合文库或阵列。
如本文所用，术语“氨基酸”是指同时包含被保护的或未保护的氨基(NHPG或NH2)和酸性羧基(COOH)的有机酸。通常，氨基酸包括α-氨基酸。这些包括但不限于已被确定为蛋白质成分的25个氨基酸。氨基酸含有在氨基酸分子上的至少一个羧基和一个伯或仲氨基。氨基酸包括诸如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、羟赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、组氨酸、青霉胺等蛋白原性氨基酸。术语“氨基酸”旨在包括未保护的氨基酸和被保护的氨基酸。
根据一些实施方式，氨基酸包含被保护的氨基酸。根据一些实施方式，氨基酸包含N-保护的氨基酸。
如本文所用，术语“N-保护的氨基酸”是指其中氨基(NH2)被氨基保护基保护并且因此被保护不参与偶联反应期间可能发生的化学反应的氨基酸。由于在生物学和医学的各个领域中最丰富的氨基酸是α-氨基酸，因此N-保护的氨基酸通常包含与α-胺共价连接的氨基保护基。然而，本发明还涵盖固相合成，其使用较少使用的结构单元，例如β-氨基酸，其中氨基与羧基被两个碳原子隔开。因此，N-保护的氨基酸还包含β-氨基酸，其中氨基保护基与β-胺共价连接。根据一些实施方式，N-保护的氨基酸选自α-N-保护的氨基酸和β-N-保护的氨基酸。根据一些实施方式，N-保护的氨基酸是α-N-保护的氨基酸。应当理解，“α-N-保护的氨基酸”和“β-N-保护的氨基酸”分别是指包含与其α-氮原子共价连接的氨基保护基的α-氨基酸；和包含与其β-氮原子共价连接的氨基保护基的β-氨基酸。
本文所用的术语“氨基保护基”是指保留氨基或氨基酸的保护基，该氨基或氨基酸否则将通过涉及含氨基化合物(例如氨基酸)的化学反应而被修饰。这样的保护基的非限制性实例包括甲酰基或具有2-4个碳原子的低级烷酰基，例如乙酰基或丙酰基；三苯甲基或取代的三苯甲基，例如单甲氧基三苯甲基和二甲氧基三苯甲基，例如4,4'-二甲氧基三苯甲基；三氯乙酰基；三氟乙酰基；甲硅烷基；邻苯二甲酰基；(9-芴基甲氧基羰基)或“FMOC”基团；烷氧羰基，例如叔丁氧羰基(BOC)；或衍生自卤代碳酸酯的其他保护基，例如C6-Cn芳基低级烷基碳酸酯。以固相合成技术制备多肽时，通常使用FMOC基团。
如本文所用，术语“核苷”是指一种化合物，其由连接至杂环碱基、互变异构体或其衍生物的特定部分(例如嘌呤的9位，嘧啶的1位，或杂环碱衍生物的等效位置)的任何戊糖或修饰的戊糖部分组成。核苷可包括不反应性或反应性的磷取代基，例如亚磷酰胺。实例包括但不限于，包含核糖部分的核糖核苷和包含脱氧核糖部分的脱氧核糖核苷，各自可以被含磷取代基如亚磷酰胺取代。根据一些实施方式，核苷可以是核苷药物类似物。核糖核苷的实例包括但不限于腺苷、鸟苷、5-甲基尿苷、尿苷、5-甲基胞嘧啶、胞嘧啶核苷、肌苷、黄嘌呤核苷和怀丁苷，它们各自可以被含磷取代基取代。脱氧核糖核苷的实例包括但不限于脱氧腺苷、脱氧鸟苷、胸苷、脱氧尿苷、脱氧胞苷、脱氧肌苷和脱氧黄嘌呤核苷，它们各自可以被含磷取代基取代。术语“核苷”旨在包括未保护的核苷和被保护的核苷。
如本文所用，术语“核苷酸”是指具有在5'-位置或核苷衍生物的等效位置上取代的磷酸酯的核苷。在磷酸酯类似物如亚磷酰胺作为取代基存在的情况下，该分子通常被称为核苷而不是核苷酸。然而，在多核苷酸合成中，具有磷基(例如亚磷酰胺)的核苷结构单元可最终转化为相应的磷酸酯，这导致反应中术语从核苷变为核苷酸。因此，当在本文中讨论化学转化和序列时，“核苷酸”和“核苷”均应广义地解释以包括核苷的磷衍生物。
根据一些实施方式，核苷包含被保护的核苷。根据一些实施方式，核苷包含O-保护的核苷。根据一些实施方式，核苷包含5'-O-保护的核苷。
本文所用的术语“O-保护的核苷”是指这样的核苷，其中其至少一个羟基(OH)被氧保护基保护并因此被保护不参与偶联反应过程中可能发生的化学反应。因此，术语“5'-O-保护的核苷”是指其中5'羟基被氧保护基保护的核糖核苷或脱氧核糖核苷。根据一些实施方式，核苷是核糖核苷，其在其5'羟基和2'羟基上包含氧保护基。根据一些实施方式，核苷是脱氧核糖核苷，其在其5'羟基上包含氧保护基。
本文所用的术语“氧保护基”是指保留氧原子或羟基的保护基，否则该氧原子或羟基将通过涉及含氧化合物(例如核苷或糖类)的化学反应而被修饰。这类保护基的非限制性实例包括三苯甲基或取代的三苯甲基，例如单甲氧基三苯甲基和二甲氧基三苯甲基(DMT)基团，例如4,4'-二甲氧基三苯甲基；甲硅烷基醚，例如三甲基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基；酯，例如乙酸酯和卤代乙酸酯；可被卤素原子或氰基取代的低级烷基；可以具有取代基的苄基；可以具有取代基的苯基。以固相合成技术制备多肽时，通常使用三苯甲基衍生物，特别是DMT。
如本文所用，术语“糖(sugar)”和“糖类(saccharide)”是可互换的，并且是指包含一个或多个单糖基团的化合物。如本文所用，术语“单糖”是指碳水化合物的最基本单位。单糖是碳水化合物的基本单位，其无法进一步水解为更简单的化合物。它们是糖的最简单形式，并且通常为无色、水溶性的、和结晶固体。一些单糖具有甜味。单糖的实例包括葡萄糖，果糖和核糖。单糖是二糖(例如蔗糖和乳糖)和多糖(例如纤维素和淀粉)的结构单元。除少数例外情况(例如，脱氧核糖)外，单糖具有化学式：Cx(H2O)y，传统上x≥3。根据它们所含碳原子数x单糖可分为：三糖(3)、四糖(4)、戊糖(5)、己糖(6)、庚糖(7)等。在水溶液中，如果单糖具有四个以上的碳原子，则它们作为环存在。根据一些实施方式，所述糖为单糖。根据一些实施方式，优选的单糖是戊糖和/或己糖。
根据一些实施方式，单糖包含被保护的单糖。根据一些实施方式，单糖包含O-保护的单糖。
如本文所用，术语“O-保护的单糖”是指其中其一个羟基(OH)被氧保护基保护并因此被保护不参与偶联反应过程中可能发生的化学反应的单糖。根据一些实施方式，单糖选自戊糖和己糖。根据一些实施方式，单糖是戊糖。根据一些实施方式，单糖是己糖。根据一些实施方式，单糖包含单个游离羟基，其中其剩余的羟基包含保护基。根据一些实施方式，单糖是包含四个O-保护的羟基和一个游离羟基的己糖。根据一些实施方式，单糖是包含三个O-保护的羟基和一个游离羟基的戊糖。
本文所用的术语“游离”羟基是指未保护的OH化学部分。类似地，本文所用的术语“游离”胺基是指未保护的NH2化学部分。通常，“游离”羟基和/或胺基可在反应如偶联反应中反应，而相应的保护基在相似条件下不会经历相似的化学反应。根据一些实施方式，该方法用于固相合成包含总共2-50、2-20、3-15、3-10或3-6个选自氨基酸残基、核苷酸残基和糖残基的残基的有机分子。根据一些实施方式，肽包含2-50、2-20、3-15、3-10或3-6个氨基酸残基。根据一些实施方式，多糖包含2-50、2-20、3-15、3-10或3-6个单糖残基。根据一些实施方式，多核苷酸包含2-50、2-20、3-15、3-10或3-6个核苷残基。
如本文中使用的术语“偶联”、“偶联过程”或“偶联步骤”，是指在两个或更多个分子例如两个单体单元之间形成键的过程。键可以是共价键，例如肽键、糖苷键或磷酸二酯键。
肽键是当一个偶联分子的羧基与另一个偶联分子的氨基反应从而释放出水(H2O)分子时，两个分子之间形成的化学键。这是脱水合成反应(也称为缩合反应)，且通常发生在氨基酸之间。所得的-C(＝O)NH-键称为肽键，而所得的分子为酰胺。
糖苷键是在糖的半缩醛或半缩酮基与第二化合物例如第二糖的羟基之间形成的化学共价键。基于端基位置(即糖的C1)的相对立体化学(R或S)，可以将糖苷键命名为α-或β-。通常，多糖是通过第一糖的C1与衍生自第二糖的羟基的氧原子之间糖苷键的形成而形成的。
磷酸二酯键是指多核苷酸链中残基之间的共价磷酸酯键。它产生在磷酸中的两个氧原子形成两个酯键时。磷酸二酯键构成核酸链的主链。在DNA和RNA中，磷酸二酯键是一个糖分子的3'碳原子与另一个糖分子(DNA中是脱氧核糖和RNA中是核糖)的5’碳原子之间的键。
本文所用的术语“脱保护”是指除去至少一个保护基。例如，脱保护包括从被保护的氨基酸除去氨基保护基。更具体地，根据一些实施方式，脱保护包括用氢原子取代与被保护氨基酸的氨基连接的FMOC保护基，从而在脱保护的氨基酸中形成碱性NH2基。或者，当在氧原子上施加保护基时，脱保护包括用氢原子取代与被保护核苷的氧连接的保护基，从而在脱保护的核苷中形成游离的OH基。脱保护可以是一个或多个保护基。对于具有n个保护基的化合物，脱保护将产生具有至少少一个保护基的相同化合物，即产物化合物将包括n-1至0个保护基。
术语“脱保护的”是指经历除去至少一个保护基的化合物。该术语包括经历了除去所有保护基的化合物和经历了除去部分保护基的化合物。例如，氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等，可包括两个保护基，第一保护基与α-氮共价连接并且第二保护基与侧链的反应性基团共价连接。在这种情况下，可以将脱保护的氨基酸定义为仅除去一个保护基之后或两个保护基都除去之后的氨基酸。
术语“未保护的”是指化合物，其经历了除去所有保护基，或一开始就不包括保护基。换句话说，未保护的化合物不包括保护基。
根据一些实施方式，该方法包括将至少两种反应物放入反应室中的步骤。
根据一些实施方式，所述至少一种反应物选自：脱保护剂、偶联剂、糖、核苷和氨基酸。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
根据一些实施方式，所述至少一种反应物选自：脱保护剂、偶联剂和氨基酸。
根据一些实施方式，所述N-保护的氨基酸是α-N-保护的氨基酸。根据一些实施方式，所述N-保护的氨基酸包含与其α-氮共价连接的保护基。根据一些实施方式，所述N-保护的氨基酸包含选自Fmoc保护基和tBoc保护基的保护基。根据一些实施方式，所述保护基选自Fmoc保护基和tBoc。
根据一些实施方式，所述N-保护的氨基酸是Fmoc保护的氨基酸。根据一些实施方式，所述保护基是Fmoc保护基。根据一些实施方式，所述N-保护的氨基酸包含与其α-氮共价连接的Fmoc基团。
根据一些实施方式，所述至少一种反应物还包含能够除去Fmoc基团的试剂。
根据一些实施方式，所述能够除去Fmoc基团的试剂包括碱。
根据一些实施方式，所述碱包含胺。
根据一些实施方式，所述胺选自：哌啶、吗啉、哌嗪、二环己胺、N,N-二异丙基乙胺、4-二甲基氨基吡啶、1,8-二氮杂双环十一碳-7-烯、吡咯烷、环己胺、乙醇胺、二乙胺、三甲胺、氨、三丁胺、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷、羟胺、三(2-氨基乙基)胺及其组合。
根据一些实施方式，所述O-保护的核苷包含选自苄基、二苯甲基、三苯甲基及其衍生物的保护基。每种可能性代表本发明的单独实施方式。根据一些实施方式，所述O-保护的核苷是二甲基三苯甲基(DMT)保护的核苷。根据一些实施方式，所述O-保护的核苷是5'二甲基三苯甲基(DMT)保护的核苷。
根据一些实施方式，所述至少一种反应物还包含能够除去DMT基团的试剂。能够除去DMT基团的试剂通常是酸性化合物，例如但不限于二氯乙酸和/或三氯乙酸。
根据一些实施方式，所述O-保护的单糖包含选自甲硅烷基醚、酯、苄基、二苯甲基、三苯甲基和乙缩醛中的至少一个保护基，它们各自可以被一个或多个卤素、氰基和/或硝基取代。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
根据一些实施方式，所述时间段在1-600、10-300、15-210、5-60、10-30、30-180或60-120分钟的范围内。
根据一些实施方式，所述反应物还包含偶联剂。具体地说，碳二亚胺被认为是形成酰胺键(例如肽键)时有用的偶联剂，而各种唑类化合物则是形成P-O键(例如磷酸二酯键)时有用的催化剂；以及各种试剂促进糖苷键的形成，取决于待形成的多糖结构。
根据一些实施方式，所述偶联剂包括碳二亚胺。
根据一些实施方式，所述将至少一种反应物放入反应室包括将至少一种反应物逐渐放入反应室。根据一些实施方式，将碳二亚胺放入反应室包括将碳二亚胺逐渐放入反应室。
根据一些实施方式，所述碳二亚胺选自：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N,N'-二环己基碳二亚胺、N,N'-二异丙基碳二亚胺及其组合。
根据一些实施方式，所述碳二亚胺包括乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。
根据一些实施方式，所述反应物还包括1-羟基苯并三唑(HOBt)。
根据一些实施方式，所述偶联剂包括唑类催化剂。根据一些实施方式，所述唑类催化剂选自：1H-四唑、2-乙基硫代四唑、2-苄基硫代四唑、4，5-二氰基咪唑及其组合。
根据一些实施方式，该方法进一步包括将至少一种溶剂放入反应器中。
如本文所用，术语“溶剂”是指其中发生化学转化的流体介质，特别是液体介质。该术语广泛地用于包括溶解所述转化中涉及的反应物的液体介质以及其中一些所述反应物不溶的介质。因此，应理解，在如本文所述的固相合成中，反应物可溶于溶剂中，而官能化的聚合树脂则不可溶。
根据一些实施方式，至少一种溶剂选自：水、二甲基甲酰胺、二氯甲烷、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺及其组合。
根据一些实施方式，所述溶剂包括N-甲基-2-吡咯烷酮。
根据一些实施方式，所述溶剂包括水。
根据一些实施方式，所述溶剂包括N-甲基-2-吡咯烷酮和水。
根据一些实施方式，该方法包括在溶剂中溶胀所述聚合树脂珠粒的初始步骤。根据一些实施方式，溶胀步骤是在将珠粒和溶剂放入反应器中的步骤之后进行的；并且在将反应物放入反应室的步骤之前。
根据一些实施方式，聚合树脂在溶剂中的浓度为5-25％w/w、5-20％w/w、5-15％w/w或8-12％w/w。
根据一些实施方式，所述溶胀步骤包括将所述聚合树脂珠粒在所述溶剂中混合指定的时间段。根据一些实施例，所述时间段在1-60分钟、2-45分钟或4-30分钟的范围内。
根据一些实施方式，所述转速在600-1400rpm的范围内。根据一些实施方式，所述转速在600-1200rpm的范围内。根据一些实施方式，所述转速在600-1000rpm的范围内。根据一些实施方式，所述转速在600-900rpm的范围内。根据一些实施方式，所述转速在600-800rpm的范围内。根据一些实施方式，所述转速在600-700rpm的范围内。
在其他实施方式中，使用均质机将转速保持在5,000-30,000的范围内。根据一些实施方式，使用均质机将转速保持在10,000-30,000范围内。
根据一些实施方式，所述将所述聚合树脂珠粒在所述溶剂中混合指定的时间段包括保持剪切速率至少为3×103s-1。
在其他实施方式中，将所述聚合树脂珠粒在所述溶剂中混合指定的时间段包括保持剪切速率至少为1×106s-1。
根据一些实施方式，所述将所述聚合树脂珠粒在所述溶剂中混合指定的时间段包括保持剪切应力至少为1.5N/m2。根据一些实施例，所述剪切应力在1.5-5、1.8-3.8、1.8-3.0或1.8-2.4N/m2的范围内。
在其他实施方式中，使用均质机保持500-2000N/m2的剪切应力。根据一些实施方式，使用均质机保持750-1500或900-1200N/m2的剪切应力。
根据本发明的官能化的聚合树脂是包含可以与有机分子偶联的反应性基团的任何聚合树脂。
根据本发明的聚合树脂的反应性基团包括但不限于氨基，羟基羧基，羧基衍生物基团，例如酰基卤，卤素基团和假卤代基团，例如磺酸盐衍生物。
根据一些实施方式，官能化树脂包含选自氨基酸残基、核苷酸残基、核苷残基和糖残基的残基。根据一些实施方式，官能化的树脂包含氨基酸残基。根据一些实施方式，官能化的树脂包含糖残基。根据一些实施方式，官能化的树脂包含核苷酸残基。
根据一些实施方式，所述官能化的聚合树脂珠粒包含聚苯乙烯-二乙烯基苯。
根据一些实施方式，所述包含聚苯乙烯-二乙烯基苯的树脂选自1％DVB-PS氯甲基化的树脂和Rink Amide Tentagel树脂。
根据一些实施方式，所述树脂是1％DVB-PS氯甲基化的树脂。
根据一些实施方式，所述树脂是Rink Amide Tentagel树脂。
根据一些实施方式，所述聚合树脂珠粒的偶联容量为0.2-0.6mmol/g，0.3-0.5mmol/g或0.35-0.45mmol/g。
根据一些实施方式，所述聚合树脂珠粒的粒径在20-200、50-100、60-90、65-85、70-80或73-77μm的范围内。
根据一些实施方式，所述机械搅拌器包括至少三个可绕轴旋转的叶片。根据一些实施方式，所述机械搅拌器包括三个可绕轴旋转的叶片。根据一些实施方式，所述可绕轴旋转的叶片以第一角度向上旋转。根据一些实施方式，所述第一角度在20-40°、25-35°或30-35°的范围内。
根据一些实施方式，所述可绕轴旋转的叶片以第二角度向下旋转。根据一些实施方式，所述第二角度在30-50°、35-45°或40-45°的范围内。
本公开的某些实施方式可以包括一些、全部或不具有以上优点。根据本文所包括的附图、说明书和权利要求书，一种或多种技术优点对于本领域技术人员而言是显而易见的。此外，尽管上面已经列举了具体的优点，但是各种实施方式可以包括全部、一些或不包括所列举的优点。
除了上述示例性方面和实施方式之外，通过参考附图和通过研究以下详细描述，其他方面和实施方式将变得显而易见。
附图说明
下面参考所附附图描述示例性实施方式的实施例。在附图中，一个以上附图中出现的相同结构、元件或部件通常在它们出现的所有附图中用相同的数字标记。或者，一个以上图中出现的元件或部件可以在它们出现的不同图中用不同的数字标记。图中所示的部件和特征的尺寸通常是为了方便和清楚表示而选择，并且不一定按比例显示。这些图在下面列出。
图1A是根据一些实施方式的高剪切SPS(HS-SPS)装置的照片。
图1B是根据一些实施方式的HS-SPS装置的特写照片。
图2是磁力搅拌器装置的照片。
图3是均质机搅拌器装置(装置3)的照片。
图4A是在HS-SPS装置1中TentaGel树脂珠粒在水中旋转之前的照片，该搅拌器由一个带三个3.8cm长的叶片、以32.2°的角度向上旋转的小叶轮组成。
图4B是在HS-SPS装置1中在水中旋转30分钟后的TentaGel树脂珠粒的特写照片。
图4C是在HS-SPS装置1中在水中旋转30分钟后的TentaGel树脂珠粒的照片。
图5A是在HS-SPS装置1中在水中旋转之前的TentaGel树脂珠粒的照片。
图5B是在HS-SPS装置1中在水中旋转42秒后的TentaGel树脂珠粒的照片。
图5C是在HS-SPS装置1中在水中旋转1.1分钟后的TentaGel树脂珠粒的照片。
图5D是在HS-SPS装置1中在水中旋转两分钟后的TentaGel树脂珠粒的照片。
图5E是在HS-SPS装置1中在水中旋转三分钟后的TentaGel树脂珠粒的照片。
图5F是在HS-SPS装置1中在水中旋转四个小时后的TentaGel树脂珠粒的照片。
图6A是在磁力搅拌器中在水中旋转之前的TentaGel树脂珠粒的照片。
图6B是在磁力搅拌器中在水中旋转两个小时后的TentaGel树脂珠粒的照片。
图6C是在磁力搅拌器中在水中旋转18小时后的TentaGel树脂珠粒的照片。
图7A是在HS-SPS装置2中的NMP中旋转之前的TentaGel树脂珠粒的照片。BOLA-mini叶轮搅拌器带三个5厘米长的叶片(h＝35厘米，以41.1°的角度向下旋转)。
图7B是在HS-SPS装置2中的NMP中旋转24小时后的TentaGel树脂珠粒的照片。
图8A是没有溶剂的TentaGel树脂珠粒的照片。
图8B是刚与NMP接触后的TentaGel树脂珠粒的照片。
图8C是在HS-SPS装置2中的NMP中旋转30分钟后的TentaGel树脂珠粒的照片。
图9A是在HS-SPS装置2中的NMP中旋转之前的TentaGel树脂珠粒的照片。
图9B是在HS-SPS装置2中的NMP中旋转30秒后的TentaGel树脂珠粒的照片。
图9C是在HS-SPS装置2中的NMP中旋转一分钟后的TentaGel树脂珠粒的照片。
图9D是在HS-SPS装置2的NMP中旋转1.3分钟后的TentaGel树脂珠粒的照片。
图9E是在HS-SPS装置2中在NMP中旋转两分钟后的TentaGel树脂珠粒的照片。
图9F是在HS-SPS装置2中的NMP中旋转2.3分钟后的TentaGel树脂珠粒的照片。
图9G是在HS-SPS装置2中的NMP中旋转三分钟后的TentaGel树脂珠粒的照片。
图9H是在HS-SPS装置2中的NMP中旋转四分钟后的TentaGel树脂珠粒的照片。
图10是表示采用700rpm、装有5％哌啶的机械搅拌装置(实心圆)；装有5％哌啶的摇床装置(空心三角形)；装有20％哌啶溶液的摇床装置(实心三角形)；采用100rpm、装有5％哌啶的机械搅拌装置(空心圆)；不与5％哌啶混合的固定反应器装置(空心方块)的Fmoc切断进展％的图。误差是进行的三个独立实验之间的标准偏差。
具体实施方式
在以下描述中，将描述本公开的各个方面。为了说明的目的，阐述了特定的配置和细节以便提供对本公开的不同方面的透彻理解。然而，对于本领域的技术人员来说将显而易见的是，可以在不呈现本文中的具体细节的情况下实践本公开。此外，可以省略或简化众所周知的特征，以免混淆本公开。
本发明的方法适合于合成可以在固体载体上合成的任何有机分子。这包括聚合分子，例如肽和多核苷酸。该方法特别适用于使用多个合成步骤生产且需要正交保护反应性基团的分子。
本发明的方法在合成参数上提供了至少一种改进，包括但不限于合成时间、合成产率、副产物形成减少和外消旋化速率减少。
不希望受任何作用机制的束缚，这些改进可能是由于在合成步骤中施加了高剪切力，消除了反应混合物中反应物或中间体的积累以及保持了具有改善的均质性的反应混合物。
根据本发明可以使用的一些混合设备以前没有用于或没有公开用于有机合成。这些包括例如均质机(转子-定子和其他类型的均质机)，它们通常例如在生物学中用于分散组织。
转子-定子均质机在带齿的定子内部采用高速且紧密配合的转子。待均质化的样品被吸入转子的中心，并经过转子和定子之间的狭窄间隙进行混合、加速和挤压。
对流体动能以及施加至反应介质的剪切应力和压缩应力以及力的基本了解对于成功扩大合成工艺的规模至关重要。然而，到目前为止，关于流体动力学参数对SPS中产率和副反应的影响的研究很少。一些重要的流体动力学参数包括“剪切速率”、“剪切应力”和“剪切力”。
以倒数秒(SI单位)为单位度量的术语“剪切速率”是指对材料施加渐进剪切变形的速率。如本文所用，剪切速率是指在混合时将变形施加至反应混合物内的聚合树脂珠粒的速率。通常，在两个平行板(一个板以恒定的速度移动，另一个板静止)之间流动的流体的剪切速率定义为：
其中γ是剪切速率；v是移动板的速度(以s-1为单位)；h是两个平行板之间的距离。对于简单的剪切情况，它只是流动物料中速度的梯度。
在搅拌罐中，得出以下相关性[Perez等，Chem.Eng.J.124，2006，1；以及Metzner和Otto AIChEJournal，1957，3，3]：
其中ki是叶轮常数；N是搅动速度(即叶轮的旋转速度)，以s-1为单位；τ是剪切应力，单位为帕斯卡(牛顿/平方米)；P是功率输入(以瓦特为单位)，取决于叶轮的扭矩及其转速(N)；和V是罐中流体的体积。
以倒数秒为单位度量的术语“剪切应力”是指与材料横截面共面的应力分量。如本文所用，剪切应力是指施加在聚合珠粒上的应力分量，该应力与它们的横截面共面。通常，剪切应力由平行于横截面的力矢量分量产生。
作为应力的量度，剪切应力以单位面积的力来度量(以SI单位：N/m2)
τ＝F/A'
其中τ是剪切应力；F是施加的力；和A是材料的横截面积，其面积平行于所施加的力矢量(即，珠粒的横截面积)。
参照其他流体动力学参数，还可以通过以下公式从剪切速率得出剪切应力：
其中μ是流体的动态粘度。
术语“粘度”是指流体的流体动力学特性，描述了其抵抗剪切应力或拉应力引起的逐渐变形的能力。粘度是由流体中以不同速度运动的相邻粒子之间的碰撞引起的。如本文所用，粘度是指包含溶剂、珠粒和其他添加的试剂的反应混合物的粘度。
术语“剪切力”是指在平行于物体的表面或平面截面的方向上作用的力。如本文所用，剪切力是指在混合时在平行于聚合珠粒的表面或平面截面的方向上作用的力。剪切力Fs可以由剪切应力得出，因为它由物体表面积(A)上的整体剪切应力(τ)组成。
作为异质反应(即被保护的氨基酸在溶液中，而树脂不在溶液中)，在SPS循环中进行的反应是受搅拌或搅动高度影响的扩散控制反应。如上所述，在肽的大规模生产中通常采用温和的混合方法(例如，涡旋、氮气流、旋转蒸发器转子、通过摇摆进行搅动)，使得聚合珠粒上保持低剪切应力，从而避免其损坏。与固相合成中的温和混合方法相反，溶液中小分子生产中使用的混合方法通常以高转速进行。
在SPS中通常采用的温和混合的影响尚未得到充分的记录和表征。在SPS循环的步骤中有两个主要参数可能很关键(即，被保护结构单元的偶联；脱保护和清洗)。首先，施加到树脂珠粒上的压应力和剪应力可能导致它们破裂，结果，由于过滤速度慢和可能的过滤器堵塞，分离过程将很繁琐。其次，偶联和脱保护反应的速率以及洗涤步骤可能受到珠粒破裂的影响。此外，次级参数源于固相(树脂珠粒)和液相之间的相互作用。树脂珠粒的更好分布是由于珠粒在介质中的循环流速引起的，可以增加液体团块到固体表面之间的质量转移，从而加速反应。在特定的反应中，它可以减少杂质的产生并改善最终产品的杂质分布。
尽管上面已经讨论了许多示例性方面和实施方式，但是本领域技术人员将认识到其某些修改、增加和子组合。因此，权利要求书和此后引入的权利要求意欲被解释为包括在其真实精神和范围内的所有这样的修改，增加和子组合。
实施例
实施例1–树脂珠粒稳定性检查
设备和配置
为了表征和优化工业应用方法，估计了设备操作和几何形状(即系统的流体动力学)对方法的影响。该研究评估了混合后聚合树脂珠粒的稳定性，并比较了三种混合方法：
(i)与本发明的一些实施方式一致的包括HS-SPS装置的混合方法(图1A和1B)。
(ii)使用磁力搅拌器的混合方法(图2)。
(iii)使用均质机的混合方法(图3)。
HS-SPS装置由反应器组成，该反应器包括装有机械搅拌器和高剪切应力设备的250mL烧杯(直径为6.8cm，高度为10cm)。该反应器还包括4个挡板，每个挡板的厚度为0.6厘米。检查了两个机械搅拌器：
1.搅拌器，由一个带三个3.8cm长的叶片，以32.2°的角度向上旋转的小叶轮组成。以下将包括该搅拌器的装置称为“HS-SPS装置1”或“装置1”。
2.带三个5cm长的叶片的BOLA-mini叶轮搅拌器，叶轮高度为35cm，以41.1°的角度向下旋转。以下将包括该搅拌器的装置称为“HS-SPS装置2”或“装置2”。
这种设备具有不同的配置，已在所有体积水平上广泛用于精细化工和药物活性成分(API)行业，然而人们认为类似的装置不适用于通常采用固相合成的方法，特别是固相肽合成。
磁力搅拌装置由250毫升圆底烧瓶和椭圆形或八边形的磁力搅拌器组成。磁力搅拌器的几何形状：
长度＝25毫米；
宽度＝10毫米；
周长＝43毫米；
直径＝12毫米；
重量＝6.6189克；
平行带之间的距离＝5毫米。
图3的均质机装置(称为“HS-SPS装置3”或“装置3”)由装有Polytron PT 6100、PT-DA3020/ZEC的250mL烧杯烧瓶(直径为6.8cm和高度为10cm)组成。该均质机包括如下几何形状：
均质机直径＝2厘米；
圆窗直径＝1厘米；
齿数＝14；
窗户数＝14；
窗高(从底部开始)＝0.3厘米；
窗宽＝0.2厘米
Z(窗户)＝0.8cm
使用两种基于PS-DVB(聚苯乙烯-二乙烯基苯)的树脂：(i)传统的PS-1％DVB(由1％二乙烯基苯单体组成的聚苯乙烯)氯甲基化树脂(Merrifield树脂)；(ii)Rink AmideTentagel树脂(一种与环氧乙烷单体接枝的改性PS-1％DVB聚合物，包括Rink Amide接头)。具体而言，该树脂购自RAPP POLYMER的“TentaGel HL RAM，12023’，容量为0.4mmol/g，粒径为75μm。
在两个方向上测试了树脂的机械稳定性。将剪切应力施加到N-甲基吡咯烷酮(NMP)和水溶剂中的两种树脂的混合物上，作用不同的时间段。将珠粒在溶剂中的浓度设置为10％w/w，在125g溶剂中为12.5g珠粒。
在高倍显微镜下检查树脂珠的稳定性，以发现任何损伤。用于观察和测量珠粒的显微镜是Zeiss scope A.1AxioCam iCc3显微镜。
结果
首先，以水为溶剂和TentaGel树脂检查HS-SPS装置1。由于空气进入容器，以1450rpm的转速旋转叶轮会产生浑浊的溶液。仅在约600-700rpm的转速下，溶液没有出现浑浊，也没有产生涡流，因此将最大叶轮转速设置为该速度。
在HS-SPS装置1的机械搅拌器中，室温下将珠粒在水中旋转24小时。在前8小时中，每30分钟取样一次，并在24小时后取最终的样品。如图4可见，珠粒的直径基本上保持不变。因此，为了测试珠粒的溶胀，在显微镜下以很小的时间间隔在没有任何搅拌的情况下测试了动力学。
如图5A-F可见，在HS-SPS装置1中搅拌24小时之前和之后，珠粒保持无瑕的圆形。此外，如预期的那样，珠粒发生溶胀(表1)。
表1：HS-SPS装置1中在水中数小时TentaGel珠粒的溶胀
| 时间(分钟) | 珠粒的平均直径(μm) |
| 0 | 95.45 |
| 42秒 | 102.12 |
| 1.1 | 106.74 |
| 2 | 107.08 |
| 3 | 106.77 |
| 4 | 107.74 |
在实验的下一阶段，将珠粒在水中搅拌24小时后，在均质机装置中测试其在高剪切应力下搅拌的耐久性。在该实验中，将HS-SPS装置1实验中使用的一半初始溶液在均质机装置中以23,000rpm的转速再搅拌5分钟，结果只有很少的珠粒形状受损。
接下来，使用磁力搅拌装置检查通过HS-SPS装置1和均质机装置搅拌的珠粒的耐久性。搅拌24小时后和一周后，取出样品并在显微镜下观察。
使用HS-SPS装置1对水中的TentaGel珠粒进行上述程序，并使用HS-SPS装置2对NMP中的TentaGel珠粒，以及使用HS-SPS装置2对NMP中的聚苯乙烯珠粒重复上述程序(水中的聚苯乙烯是无关紧要的，因为这种聚合物在水性条件下的溶胀性较差)。在所有情况下，均使用测力计(PCE仪器的测力计FH 10)测量剪切应力。表2总结了与采用的搅拌时间、装置和应力相对应的不同珠粒的稳定性。
表2：各种树脂对剪切应力和操作速率的敏感性。
1使用HS-SPS装置1；2使用HS-SPS装置2。
表2和图7A-7B显示出令人惊讶的是，即使在使用HS-SPS装置或均质机装置的高剪切速率操作下，树脂珠粒也不被损坏。损坏树脂珠粒的唯一构造是使用磁力搅拌装置。图6A-C示出了在磁力搅拌装置中搅拌之前和之后树脂的结构差异。显然，珠粒在磁力搅拌装置中搅拌2小时后，其结构明显受损(图6B)，而在相同条件下18小时后，观察到珠粒完全抹开，实际上导致其消失(图6C)。出乎意料的是，这些发现与HS-SPS装置1和HS-SPS装置2在类似条件下的结果完全相反。如表2所示，TentaGel珠粒和Merrifield树脂珠粒在不同溶剂中高剪切速率搅拌下24小时以上均保持稳定。例如，在HS-SPS装置2中将Tentagel珠粒与NMP溶剂一起搅拌，对珠粒的结构没有明显影响，这可以通过比较在HS-SPS装置2中搅拌前(图7A)和搅拌后(图7B)后的显微镜检查而得出。
不希望受到任何理论或机制的束缚，磁力搅拌和机械搅拌之间的意想不到的变化源于每种装置施加的不同水平的压应力。HS-SPS装置主要在不同水平上向介质施加剪切应力。类似地，磁力搅拌装置施加相同种类的剪切应力。但是，由于磁棒搅拌器位于烧瓶的底部，因此也会施加大量的压应力。应力张力的方向可能是磁力搅拌容器中树脂破坏的主要原因。
实施例2–树脂珠粒溶胀检查
在固相肽合成方法的初始阶段进行干燥树脂珠粒的溶胀。NMP、DMF(二甲基甲酰胺)和DCM(二氯甲烷)被认为是聚苯乙烯-二乙烯基苯基树脂的良好溶胀溶剂，通常用于SPSS工艺，尽管已知TentaGel树脂在水中也会溶胀到一定程度。溶胀是溶剂性质与树脂的相互作用和相容性以及设备中的操作条件的直接作用。在常用的摇床反应容器中，溶胀步骤通常在一到两个小时内完成。
将珠粒添加到罐中的溶剂中并在600-700rpm下搅拌两个小时，在搅动的罐中测试聚合珠粒的溶胀动力学。与稳定性评估实验非常相似，使用HS-SPS装置1评估水中的TentaGel珠粒的溶胀动力学，使用HS-SPS装置2评估NMP溶剂中的TentaGel珠粒的溶胀动力学，而使用HS-SPS装置2仅评估NMP中的Merrifield树脂珠粒的溶胀动力学。
每30秒取样一次，并在显微镜下检查。对于每个样品，用显微镜的软件测量珠粒的平均直径。由于珠粒在NMP中短时间膨胀，因此决定在显微镜下以较小的时间间隔在不搅动的情况下测试溶胀，以实时观察溶剂本身的作用。前两分钟每30秒拍摄一张照片，然后其余两分钟每分钟拍摄一张照片。对上面提及的相同样品进行该程序。在两种类型的操作下在不同的时间测量珠粒的直径增长：(1)将树脂添加到溶剂膜中在不搅动的情况下直接在显微镜下；(2)在具有高剪切应力设备的机械搅拌装置中。结果示于表3。
表3：两种树脂的溶胀动力学。
NR-不相关
发现两种树脂与NMP接触后立即膨胀到最大程度的一半。当浸入NMP中时，Tentagel在几秒钟内溶胀到约150μm的直径，而在HS-SPS装置2中搅拌时，它在30分钟内溶胀到300μm的直径。图8显示了与NMP接触之前的起始珠粒(图8A)；与NMP接触后立即时刻的相同珠粒(图8B)；在HS-SPS装置2中的NMP中机械搅拌30分钟后的珠粒(图8C)。从图9A-H可以进一步得出结论，在该研究中未观察到对树脂的损害。珠粒的平均直径随时间的变化按预期增加(表4)。
表4：使用HS-SPS装置NMP中TenraGel树脂的溶胀。
从以上结果可以得出结论，可以对树脂进行短时间溶胀，从而减少了合成的总时间。
实施例3–偶联和外消旋检查
如上所述，肽合成通常通过使用摇床装置在固相中进行。为了证明高剪切固相肽合成(HS-SPPS)方法的可行性，使用三肽合成作为模型，比较了这两种方法。选择的转化是氨基保护的氨基酸与连接至树脂的二肽的偶联反应，从而形成包含三肽的树脂。具体地说，要合成的模型肽是Fmoc-L-His-Phe-Gly-NH2。因此，模型反应包括将包含甘氨酸(Gly)和苯丙氨酸(Phe)单元(H2N-Phe-Gly-树脂)的树脂的游离胺残基与在其杂环氮上被三苯甲基(三苯甲基-Ph3C)保护且在其伯胺上被Fmoc(氟烯基甲氧基羰基)保护的组氨酸单元(Fmoc-His(Trt)OH；Nα-Fmoc-N(im)-三苯甲基-L-组氨酸；CAS NO109425-51-6)的羧基残基偶联。应当指出，使用偶联剂，例如诸如DIPC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)、DCC(N,N'-二环己基碳二亚胺)和EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)，在无添加剂或碱的情况下，将Fmoc-His(Trt)OH与H2 N-Phe-Gly-树脂偶联，已知会引起外消旋作用，并导致三肽的产率降低。换句话说，Fmoc-L-His(Trt)OH的偶联被认为具有挑战性，这主要是由于含有D-组氨酸的非对映体肽副产物的形成增加。
为了监测偶联反应的速率和外消旋程度，使用已知的偶联方法分别制备了两种纯的非对映异构肽(即Fmoc-L-His-Phe-Gly-NH2和Fmoc-D-His-Phe-Gly-NH2)。在HPLC中检查两种纯肽。检查显示了两个独立的峰，这些峰也不与起始原料的HPLC信号重叠，因此可以同时跟踪三肽产物的转化和外消旋化。
在实验中，使用(i)传统的摇床装置，和(ii)HS-SPS装置2在NMP溶剂中(无碱或添加剂的情况下)在EDC存在下测试了Fmoc-His(Trt)OH与H2N-Phe-Gly-树脂的偶联。。此后，取等分试样用于从树脂“小切下”(如Falb等，The Journal of Peptide Research，(1999)53，507–517中所述)产物，并使用HPLC检查样品转化率和外消旋度。结果总结在表5中。
表5：使用摇床和HS-SPPS条件，在无添加剂的情况下，Fmoc-His(Trt)OH与H2N-Phe-Gly-树脂偶联的转化率和外消旋度。
1用微型注射器逐渐加入EDC。2未进行偶联，形成了对称的组氨酸酐。3立即向树脂悬液中加入组氨酸酐。
从表5中可以明显看出，将EDC加入到NMP中的His(Trt)OH和H2N-Phe-Gly-树脂的混合物中的反应2在90分钟内没有提供任何目标三肽。
由于在反应2中没有形成产物，因此单独制备了对称的被保护的组氨酸酐，并将其加入到NMP中的H2N-Phe-Gly-树脂悬液中(反应3)。该方法在反应1.5小时后允许67％的转化率，尽管几乎一半的产物是不期望的D非对映异构体外消旋产物。
令人惊讶地，在将反应物与EDC在NMP中混合的相似反应条件下，在HS-SPS装置中搅拌而不是摇动，提供了70％的转化率，仅提供了8.5％的D-非对映体(反应1)。不希望受任何机制的束缚，这表明由于在本发明的方法中有可能(而在其他方法中是不可能的)逐渐添加EDC，导致偶联反应更有效、更快速并减少外消旋作用和其他副反应。这可能是由于消除了反应混合物中反应物或中间体的积累。在HS-SPS条件下和摇床上转化率均相同(58.4％)且未达到100％的事实反映了已知的事实，即活性酯4与肽-树脂的反应是受扩散控制的，因此不能通过搅拌来加速。
使用HS-SPS装置2(反应4)和使用摇床(反应5)加入HOBt(羟基苯并三唑)作为添加剂，进行了类似的实验。监测反应并在表6中提供结果。
表6：Fmoc-His(Trt)OH与H2N-Phe-Gly-树脂在有添加剂的情况下偶联，在摇床和HS-SPPS条件下的转化率和外消旋度。
1用微型注射器逐渐添加DIC 5分钟。2立即加入DIC，形成具有D-组氨酸的异构体。
从表6可以明显看出，在摇床中将EDC和HOBt添加到NMP中的His(Trt)OH和H2N-Phe-Gly-树脂的混合物中的反应6在90分钟内进行以形成产物，但外消旋率为5.5％。
令人惊讶地，在将反应物与EDC和HOBt在NMP中混合的相似反应条件下，在HS-SPS装置中搅拌而不是摇动，提供了60％的转化率，而没有观察到D型非对映异构体(反应4)。
实施例4–保护基的切断
为了评估混合方法对固体载体上发生的反应速率的影响，监测切断伯胺保护基FMOC的反应。Fmoc除去通常在基于Fmoc的SPPS中的肽延伸过程中发生多次，并使用DMF或NMP中的大量哌啶(20％v/v)进行。哌啶与急性和慢性健康影响相关，包括对眼睛和皮肤的刺激以及对粘膜的损害。因此，在研究和工业设施中都产生了大量有毒的哌啶废物。
因此，通过分光光度法定量释放的二苯并富勒烯的量，在不同条件下监测Fmoc切断的进展。在(i)常规摇床、(ii)100RPM的机械搅拌器，(iii)700RPM的机械搅拌器；和(iv)固定反应器中，使用NMP中5％-20％的哌啶溶液，测定从Fmoc Rink酰胺树脂中除去Fmoc的速率。对二苯并富勒烯的量进行定量，并与Fmoc定量检测测定的树脂的Fmoc含量相比进行归一化。
图10是显示以下装置配置和哌啶量的Fmoc切断(通过二苯并富勒烯形成而测定)进展％随时间变化的图：采用700rpm、装有5％哌啶的机械搅拌装置(实心圆)；装有5％哌啶的摇床装置(空心三角形)；装有20％哌啶溶液的摇床装置(实心三角形)；采用100rpm、装有5％哌啶的机械搅拌装置(空心圆)；装有5％哌啶、无混合固定反应器装置(空心方块)。误差是进行的三个独立实验之间的标准偏差。
如图10可见，形成二苯并富勒烯的UV测定表明，在20％哌啶/NMP的摇床中反应10分钟后，达到95％Fmoc除去率(实心三角形)，但使用带有5％哌啶/NMP的相同装置10分钟后仅获得了60％的切断(空心三角形)。令人惊讶的是，用5％哌啶/NMP以两种分开的机械搅拌装置(700-实心圆；和100rpm-空心圆)在高和低rpm机械搅拌速率下均达到了几乎与摇床中用20％哌啶/NMP所达到的相同的切断曲线。作为对照，在带有5％哌啶/NMP的固定反应器中除去Fmoc。反应20分钟后，除去的Fmoc量仅为20％，这明显低于通过顶置搅拌除去的Fmoc量(空心方块)。不希望受任何理论或作用机理的束缚，假定试剂在固体载体内的渗透取决于溶液的混合性质。实验证明，使用5％溶液的机械搅拌器的反应速率比使用相同溶液的摇床快得多。提示通过机械搅拌实现较高的扩散速率，允许保持高的哌啶局部浓度，同时迅速分散二苯并富勒烯产物。因此，搅拌具有增加向珠粒的扩散和珠粒内部渗透的组合效果。
前述具体实施方式的描述将如此充分地揭示本发明的一般性质，以至于其他人可以通过应用已有知识而容易地修改和/或改编这样的具体实施方式的各种应用，而无需过度的实验并且不背离一般概念，并且因此，这样的改编和修改应当并且旨在被理解为在所公开的实施方式的等同含义和范围内。应当理解，本文采用的措词或术语是出于描述的目的而非限制。在不背离本发明的情况下，用于执行各种公开功能的装置、材料和步骤可以采取多种替代形式。
Claims (50)
1.一种用于进行有机分子的固相合成的至少一个循环的方法，该方法包括步骤：
i.提供包括反应室和搅拌装置的反应器，其中搅拌装置包括具有至少两个可绕轴旋转的叶片的叶轮；
ii.将官能化的聚合树脂珠粒和至少一种溶剂放入反应器中以提供反应混合物，其中所述反应混合物与可旋转的叶片接触；
iii.将至少一种反应物放入反应室中；
iv.以至少600转/分(rpm)的转速旋转叶轮一段时间，同时保持至少3×103s-1的剪切速率；
从而进行有机分子的固相合成的至少一个循环。
2.权利要求1所述的方法，其中所述搅拌装置是机械搅拌器，并且所述叶轮的旋转以600至1400转/分的转速进行，保持至少3×103s-1的剪切速率。
3.权利要求2所述的方法，其中所述转速在600-800rpm的范围内。
4.权利要求2所述的方法，其中所述叶轮的旋转包括在所述反应混合物中保持至少1.5N/m2的剪切应力。
5.权利要求2所述的方法，在所述反应混合物中产生1.5-5、1.8-3.8、1.8-3.0或1.8-2.4N/m2的剪切应力。
6.权利要求2所述的方法，其中所述机械搅拌器包括至少三个可绕轴旋转的叶片。
7.权利要求3所述的方法，其中所述可绕轴旋转的叶片以20-40°、25-35°或30-35°范围内的第一角度向上旋转。
8.权利要求1所述的方法，其中所述搅拌装置是均质机，并且所述叶轮的旋转以5,000-30,000转/分的转速进行，保持至少1×106s-1的剪切速率。
9.权利要求8所述的方法，其中所述转速为10,000-30,000rpm。
10.权利要求8所述的方法，其中所述叶轮的旋转包括保持500-2000N/m2的剪切应力。
11.权利要求8所述的方法，其中在反应混合物中保持750-1500或900-1200N/m2的剪切应力。
12.权利要求8所述的方法，其中所述均质机是转子-定子均质机。
13.权利要求1所述的方法，其中所述官能化的聚合树脂珠粒包括聚苯乙烯-二乙烯基苯。
14.权利要求13所述的方法，其中所述树脂选自1％DVB-PS氯甲基化树脂和Rink AmideTentagel树脂。
15.权利要求1所述的方法，所述官能化的聚合树脂珠粒包括0.2-0.6mmol/g的偶联容量。
16.权利要求1所述的方法，其中所述官能化的聚合树脂珠粒具有20-200μm的颗粒。
17.权利要求1所述的方法，其中所述有机分子是包含选自肽链、核苷酸链和糖的分子的聚合物。
18.权利要求1所述的方法，其中所述有机分子包含肽链。
19.权利要求17所述的方法，用于在聚合有机分子的固相合成中进行循环，其中所述方法包括步骤：
(a)提供包括反应室和搅拌装置的反应器，该搅拌装置包括具有至少两个可绕轴旋转的叶片的叶轮；
(b)将官能化的聚合树脂珠粒和至少一种溶剂放入反应器中以提供反应混合物，其中所述反应混合物与可旋转的叶片接触；
(c)将至少一种被保护的单体有机分子和至少一种偶联剂放入反应室中并旋转叶轮，从而形成被保护的单体有机分子与树脂的偶联产物；
(d)洗涤过量的所述被保护的单体有机分子；和
(e)将至少一种脱保护剂放入反应室中并旋转叶轮，从而从偶联产物中除去至少一个保护基，形成脱保护的单体有机分子与树脂的偶联产物，从而完成在聚合有机分子的固相合成中的一个循环；
其中以至少600转/分的转速进行步骤(c)和(e)的至少一者中的叶轮旋转一段时间，同时保持至少3×103s-1的剪切速率，任选地，其中步骤(c)至(e)重复多个循环。
20.权利要求19所述的方法，其中以至少600转/分的转速进行步骤(c)和(e)两者一段时间，同时保持至少3×103s-1的剪切速率。
21.权利要求17所述的方法，其中所述至少一种反应物选自：脱保护剂、偶联剂和被保护的单体有机分子。
22.权利要求1所述的方法，所述至少一种反应物被逐渐放入反应室中。
23.权利要求17所述的方法，其中所述至少一种反应物包括偶联剂和被保护的单体有机分子，从而进行有机分子的固相合成的至少一个偶联循环。
24.权利要求19和23中任一项所述的方法，其中所述被保护的单体有机分子选自N-保护的氨基酸、O-保护的核苷和O-保护的糖。
25.权利要求24所述的方法，其中所述被保护的单体有机分子是α-N-保护的氨基酸。
26.权利要求25所述的方法，其中所述α-N-保护的氨基酸包含与选自Fmoc和tBoc的保护基共价连接的α-氮原子。
27.权利要求25所述的方法，其中所述α-N-保护的氨基酸包含与Fmoc保护基共价连接的α-氮原子。
28.权利要求17所述的方法，其中所述反应物还包含至少一种脱保护剂。
29.权利要求19和28中任一项所述的方法，其中所述至少一种脱保护剂是能够除去Fmoc基团的试剂。
30.权利要求29所述的方法，其中所述能够除去Fmoc基团的试剂包括碱。
31.权利要求30所述的方法，其中所述碱包括胺。
32.权利要求31所述的方法，其中所述胺选自：哌啶、吗啉、哌嗪、二环己胺、N,N-二异丙基乙胺、4-二甲基氨基吡啶、1,8-二氮杂双环十一碳-7-烯、吡咯烷、环己胺、乙醇胺、二乙胺、三甲胺、氨、三丁胺、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷、羟胺、三(2-氨基乙基)胺及其组合。
33.权利要求19和21中任一项所述的方法，其中所述偶联剂包括碳二亚胺。
34.权利要求33所述的方法，所述碳二亚胺被逐渐放入反应混合物中。
35.权利要求34所述的方法，其中所述碳二亚胺选自：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N,N'-二环己基碳二亚胺、N,N'-二异丙基碳二亚胺及其组合。
36.权利要求21所述的方法，其中所述反应物还包括1-羟基苯并三唑(HOBt)。
37.权利要求19所述的方法，其中步骤(c)包括将至少一种被保护的单体有机分子、至少一种碳二亚胺和HOBt放入反应室中并旋转叶轮，从而形成被保护的单体有机分子与树脂的偶联产物。
38.权利要求1和19中任一项所述的方法，其中所述至少一种溶剂选自：水、二甲基甲酰胺、二氯甲烷、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺及其组合。
39.权利要求38所述的方法，其中所述至少一种溶剂包括N-甲基-2-吡咯烷酮。
40.权利要求1所述的方法，还包括洗涤反应混合物和过滤聚合树脂珠粒的步骤。
41.权利要求1所述的方法，还包括再重复步骤(ii)至(iv)至少一次，从而进行所述有机分子的固相合成的至少又一个循环。
42.权利要求41所述的方法，包括将氨基酸与所述树脂偶联的至少两个步骤和除去保护基的至少两个步骤。
43.权利要求17和19中任一项所述的方法，还包括从所述聚合树脂切下所述聚合有机分子的步骤。
44.权利要求1所述的方法，包括在至少一种溶剂中溶胀所述聚合树脂珠粒的初始步骤。
45.权利要求19所述的方法，其中步骤(b)包括在所述反应混合物中溶胀所述聚合珠粒。
46.权利要求44和45中任一项所述的方法，其中溶胀所述聚合树脂珠粒包括以至少600转/分的转速在所述溶剂中混合所述聚合树脂珠粒指定的时间段。
47.权利要求46所述的方法，其中所述在所述溶剂中混合所述聚合树脂珠粒指定的时间段包括保持至少3×103s-1的剪切速率。
48.权利要求46所述的方法，其中所述在所述溶剂中混合所述聚合树脂珠粒指定的时间段包括保持至少1.8N/m2的剪切应力。
49.权利要求46所述的方法，其中所述指定的时间段是1-60、2-45或4-30分钟。
50.权利要求1和19中任一项所述的方法，其中，所述时间段在1-600、10-300、5-60、10-30、15-210、30-180或60-120分钟的范围内。
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