CN115916797A - 从碳水化合物衍生物单元在溶液中合成大分子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过连续延伸通过共价键连接到可溶于有机溶剂的锚定分子的第一单元U1来合成由单元U组成的大分子的方法，所述单元U主要是单糖或单糖衍生物。所述延伸通过与具有至少两种功能的单体或低聚物M偶联而发生。所述方法的特征在于，所述锚定分子包括具有至少5个单体单元、优选10至50个单体单元的聚烯烃链或聚烯烃低聚物或聚链烯烃，所述聚烯烃链优选为聚异丁烯链。

Description

从碳水化合物衍生物单元在溶液中合成大分子的方法
技术领域
本发明属于有机大分子合成领域。更具体地，本发明涉及从单糖或寡糖单元或这些单元的衍生物生产感兴趣大分子的方法。该方法在液相(溶液)中进行，并使用可溶于有机介质(特别是非极性溶剂)的锚定分子。这些锚定分子(或液体载体)与感兴趣大分子(或中间体)结合时，它们赋予感兴趣大分子(或中间体)：至少一种化学功能的瞬时保护和在非极性有机溶剂中的优异溶解性，因此，通过简单提取或在二氧化硅上过滤来纯化。靶向的大分子尤其可以是生物学感兴趣的大分子，例如寡核苷酸和寡糖，并且它们可以包含非单糖或寡糖的单元。
背景技术
本发明涉及合成包括单糖和/或寡糖和/或其衍生物的单元的大分子的新方法；这些单元可以是或可以特别包括戊糖或己糖。因此，更具体地，本发明涉及寡核苷酸(或其衍生物)的合成和寡糖(或其衍生物)的合成。
通常，寡核苷酸是在实验室规模下，通过固体载体合成，用自动机制备的。在工业阶段为更大的生产(>1千克)改进该设备作出了许多努力。然而，自上世纪末以来，治疗性寡核苷酸经历了巨大的扩张，引发了对这些分子物种的真正兴趣。迄今为止，超过100种寡核苷酸处于临床试验中，并且8种药物已获得美国食品药品监督管理局(FDA)的批准(参见Y.S.Sanghvi,"A Status Update for Modified Oligonucleotides forChemotherapeutics Applications,"Curr.Protoc.Nucleic Acid Chem.2011,46:4.1.1-4.1.22.)。
首个获批的寡核苷酸是fomivirsen或VitraveneTM(参见M.D.de Smet et al,"Fomovirsen-a phosphorothioate oligonucleotide for the treatment of CMVretinitis",Ocul.Immunol.Inflamm.1999,7,189-198和S.T.Cooke et al,"RNA-TargetedTherapeutics,"Cell Metabolism,2018,27,714-739)，一种由硫代磷酸键连接的21个单元组成的寡核苷酸。它用于巨细胞病毒视网膜炎的治疗。
后来，MacugenTM(培加他尼钠(pegaptanib sodium))和KynamroTM(米泊美生钠(mipomersen sodium))于2004年和2013年相继获批，分别用于新生血管(湿)形式的老年黄斑变性(AMD)和纯合子家族性高胆固醇血症的治疗(参见Sanghvi and Schulte,Curr.Opin.Drug Discovery Dev.2004,6,765)。
到目前为止，固相寡核苷酸合成已常规生产出质量良好的千克级寡核苷酸(参见Sanghvi,Y.S.(2019)"Large-scale automated synthesis of therapeuticoligonucleotides:A status update",published in S.Agrwal&M.J.Gait(Eds.)Advances in nucleic acid therapeutic(pp.453-473))。尽管已经作出了许多优化努力，但寡核苷酸生产方法仍有改进的空间。液相寡核苷酸合成越来越被定位为对寡核苷酸生产的有效响应。
无论反应发生的相(固相(非均相)或液相(溶液))如何，寡核苷酸合成归结为核苷之间按规定顺序形成磷酸酯键(参见H.
Figure BDA0004014198710000021
"Synthesis of oligonucleotides on asoluble support,"Beilstein J.Org.Chem.,2017,13,1368-1387和A.Molina&Y.S.Sanghvi,"Liquid-Phase Oligonucleotide Synthesis:Past,Present,and FuturePredictions,"Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,2019,77(1))。通常，液相寡核苷酸合成(脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA))开始于锚定分子与核苷3'端的连接；从3’到5’发生延伸。在这阶段，第一个合成周期开始于3'位磷酸化的核苷衍生物(亚磷酰胺(phosphoramidite)或H-磷酸酯或磷酸三酯)，它将与锚定在合成载体上的核苷5’位的醇反应。
除反应醇外，所有其他亲核功能都必须预先得到保护。因此，核酸碱基的胺优选通过酰化保护(胞嘧啶和腺嘌呤为苯甲酰基，鸟嘌呤为异丁基)，而脱氧核糖和核糖的醇功能分别被5′位的三苯甲基(二甲氧基三苯甲基或单甲氧基三苯甲基)醚和/或被2′位的甲硅烷基(叔丁基二甲基甲硅烷基或三异丙基甲硅烷基氧基甲基)醚掩蔽。
根据所选择的磷酸化核苷的性质，偶联反应的操作条件不同。在核苷亚磷酰胺(参见S.L.Beaucage&M.H.Caruthers,"Deoxynucleoside Phosphoramidites-A new Class ofKey Intermediates for Deoxypolynucleotide Synthesis",Tetrahedron Letters,1981,22,1859-1862)和核苷H-磷酸酯的情况下，偶联反应后进行氧化反应，生成相应的磷酸三酯。在核苷磷酸盐的情况下，相应的磷酸三酯通过用前面的核苷酯化而获得(参见C.B.Reese&Z.Pei-Zhuo,"Phosphotriester Approach to the Synthesis ofOligonucleotides:A Reappraisal,"J.Chem.Soc,Perkin Trans.1,1993,2291-2301,V.A.Efimov et al,"Application of new catalytic phosphate protecting groupsfor the highly efficient phosphotriester oligonucleotide synthesis",NucleicAcids Res.1986,14,6525-6540,G.van der Marel et al,"A New Approach to theSynthesis of Phosphotriester Intermediates of Nucleosides and Nucleic Acids,"Tetrahedron Lett.1981,22,3887-3890和E.de Vroom et al,"Use of a 1-hydroxybenzotriazole activated phosphorylating reagent towards the synthesisof short RNA fragments in solution,"Nucleic Acids Res.1986,14,5885-5900)。
文献中已经描述了与液相寡核苷酸合成相关的各种锚定分子。历史上，Hayatsu和Khorana的工作为寡核苷酸合成奠定了基础(参见"DeoxyribooligonucleotideSynythesis on a Polymer Support",J.Am.Chem.Soc.1966,88,13,3182-3183)。该方法受到Merriefield所述肽合成方法的启发，使用可溶性聚苯乙烯作为接枝的锚定分子(5′-O-单甲氧基三苯甲基(MMTr))。然而，这种聚苯乙烯在超过3个核苷酸的有机溶剂中变得不溶，因此，产品分离变差。
已经研究了其他聚合物，例如纤维素(Biochemistry 1968,7,8,2809-2813)或聚乙烯醇(H.Schott et al.,"Liquid-Phase-Synthese von Oligothymidylphosphaten",Die Makromolekulare Chemie,1973,173,247-251)。在这两种情况下，在将第一个核苷掺入载体的过程中，为了避免在合成结束时存在截短的寡核苷酸，游离(非官能化)羟基的所谓封端反应是必要的。
20世纪90年代，另一类聚合物：聚乙二醇(或PEG)，作为锚定分子被广泛研究。使用这种类型的可溶性载体，Bonora的团队实现了寡核苷酸的克级合成，同时显著缩短了处理时间(参见"HELP(High Efficiency Liquid Phase)new oligonucleotide synthesis onsoluble polymeric support,"Nucleic Acids Research,1990,18,3155-3159和"Largescale,liquid phase synthesis of oligonucleotides by the phosphoramiditeapproach,"Nucleic Acids Research,1993,21,1213-1217)。
最近，Livingston的团队开发并使用了通过纳滤进行分子分离的膜(参见P.R.J.Gaffney et al,"Liquid-Phase Synthesis of 2'-Methyl-RNA on a HomostarSupport through Organic-Solvent Nanofiltration",Chem.Eur.J.,2015,21,9535-9543和J.F.Kim et al,"Organic Solvent Nanofimltration(OSN):A New TechnologyPlatform for Liquid-Phase Oligonucleotide Synthesis(LPOS)",Org.Proc.Res.Dev.,2016,20,1439-1452)。它们促进并加速生长寡核苷酸的纯化步骤。
一般而言，聚乙二醇(PEG)作为锚定基质的使用具有几个优点，例如：使用乙腈作为溶剂；获得具有良好纯度的寡核苷酸；(在每个步骤)简化纯化；达到合理数量的寡核苷酸的可能性；偶联反应水平上的多功能性(亚磷酰胺、H-磷酸酯(参见K.J.Padiya et al,"Large Scale,Liquid Phase Oligonucleotide Synthesis by Alkyl H-phosphonateApproach",Bioorg.Med.Chem.,2000,8,337-342)和磷酸盐)以及所涉及单体量的减少。
在工业规模上使用PEG的主要障碍是：大量的沉淀步骤；溶剂的过度消耗和纳滤膜的成本。
2017年，金刚烷衍生物被描述为液相寡核苷酸合成的锚定分子(A.Schwenger etal.,"Solution-Phase Synthesis of Branched Oligonucleotides with up to32Nucleotides and the Reversible Formation of Materials",Eur.J.Org.Chem.,2017,5852-5864)。这种载体的一个优点是通过简单提取进行纯化。这种锚定分子的主要缺点是其低E因子(其表示所需的废物与产品质量比)，因为不同的提取纯化步骤需要大量溶剂。同一研究组描述了一种四取代金刚烷衍生物作为液相寡核苷酸合成的锚定分子。同样，纯化所需的大量溶剂和过量的亚磷酰胺单体阻碍了其工业发展。
2006年，描述了第一种离子锚定分子，在这种情况下为咪唑鎓(imidazolium)型(R.A.Donga et al.,"A Novel Approach to Oligonucleotide Synthesis Using anImidazolium Ion Tag as a Soluble Support",J.Org.Chem.,2006,71,7907-7910)。通过沉淀和提取来完成延伸寡核苷酸的纯化。在工业展望中，这种液体载体的重量取决于纯化生长寡核苷酸所需的大体积溶剂。
基于D-吡喃葡萄糖的可溶性β-环糊精型锚定分子已被证明对在液相中合成寡核苷酸有效(A.Gimenez Molina et al.,"Acetylated and Methylatedβ-Cyclodextrins asViable Soluble Supports for the Synthesis of Short 2'-Oligodeoxyribo-nucleotides in Solution",Molecules,2012,17,12102-12120)。与这些可溶性载体相关的优点是它们的成本和偶联步骤所需单体量的减少。
这些基质的弱点在于纯化方法。事实上，对于每个循环，必须通过色谱柱进行纯化。
描述了由官能化季戊四醇衍生物组成的另一类锚定分子。它们用于合成DNA(V.Kungurtsev et al.,"Solution-Phase Synthesis of Short Oligo-2'-deoxyribonucleotides by Using Clustered Nucleosides as a Soluble Support",(Eur.J.Org.Chem.,2013,6687-6693)和RNA(A.Gimenez Molina et al.,"Solution phasesynthesis of short oligoribonucleotides on a precipitative tetrapodalsupport",Beilstein J.Org.Chem.,2014,10,2279-2285and Current OrganicSynthesis,2014,12,202-207)。这种液体载体的优点是：在亚磷酰胺或磷酸三酯化学中进行延伸反应的可能性；基质的稳定性；存在四个锚定点；并通过沉淀进行纯化。
这种液体载体工业化的主要障碍是在RNA合成过程中使用两个疏水保护基团(在2’和5’)，以及使用非商业单体和通过沉淀进行的大量纯化。
作为可溶性载体的没食子酸(Gallic acid)衍生物也用于在溶液中生产寡核苷酸(参见JP 2010-275254和WO 2013/179412以及S.Kim et al,"Liquid-Phase RNASynthesis by Using Alkyl-Chain-Soluble Support",Chem.Eur.J.,2013,19,8615-8620和T.Shoji et al,"Synthesis of Conjugated Oligonucleotide in Solution PhaseUsing Alkyl-chain-soluble Support",Chem.-Lett.2014,43,1251-1253的出版物)。使用后者，结合亚磷酰胺化学，以优异的产率(26％)和良好的纯度(78％)实现(21-mer)RNA的合成。然而，大量的纯化步骤(>50)使这些锚定分子不适合用于工业用途。
同样地，名为AjiphaseTM的锚定分子被描述用于寡核苷酸的生产(参见S.Katayama&K.Hirai,"Liquid-phase synthesis of oligonucleotides",published inS.Obika&M.Sekine(Eds.),"Synthesis of therapeutic oligonucleotides"(pp.83-95),Springer Singapore,2018)。使用AjiphaseTM作为用于寡核苷酸生产的锚定分子具有一些优点：锚定的低聚物可以在乙腈或甲醇中通过简单沉淀来纯化；亚磷酰胺当量的数量低(<2当量)；提高了总产量并降低了溶剂消耗。然而，该方法的主要限制仍然是纯化(每个循环一次沉淀)。
本发明还涉及寡糖，以前称为“碳水化合物”。它们参与多种生物过程，在生物界中发挥着重要作用。事实上，糖参与基本分子(例如核酸(核糖和脱氧核糖))的结构。寡糖和多糖由通过糖苷键连接在一起的单糖组成。从理解糖在生物界中的作用的角度来看，化学家已经取得了概念和实践上的进步，允许获得日益复杂的寡糖(M.Panza et al.,"AutomatedChemical Oligosaccharide Synthesis:Novel Approach to Traditional Challenges",Chem.Rev.2018,118,17,8105-8150和M.Guberman&P.H.Seeberger,"Automated GlycanAssembly:A Perspective",J.Am.Chem.Soc.2019,141,14,5581-5592)。
自20世纪60年代Merrifield在固体载体肽合成方面的工作以来，许多化学家开发了类似的方法，适用于寡糖合成，以从该方法的优点中获益，即：使用过量的试剂和通过简单洗涤固体载体来纯化。然而，这种寡糖合成方法涉及一些问题，例如：固体载体的选择、间隔物的设计、保护基团的选择、反应的监测、供体或受体单体的选择以及目标寡糖从基质中的最终脱钩(参见P.H.Seeberger&S.J.Danishefsky,"Solid-Phase Synthesis ofOligosaccharides and Glycoconjugates by the Glycal Assembly Method:A FiveYear Retrospective",Acc.Chem.Res.1998,31,685-695；P.H.Seeberger&W.-C.Haase,"Solid-Phase Oligosaccharide Synthesis and Combinatorial CarbohydrateLibraries",Chem.Rev.2000,100,4349-4393和P.H.Seeberger,"Automatedoligosaccharide synthesis",Chem.Soc.Rev.2008,37,19-28)。
1973年，描述了三糖的第一次固态合成(参见J.M.Frechet&C.Schuerch,"Solid-Phase Synthesis of Oligosaccharides.I.Prepapration of the Solid Support.Poly[p-(1-propen-3-ol-1-yl)styrene]",J.Am.Chem.Soc.1971,93,492-496；Frechet,J.M.in"Polymer-Supported Reactions in Organic Synthesis",Hodge,P.,Sherrington,D.C.,Eds.；John Wiley&Sons Ltd:Chichester,UK,1980,pp 407-434andCarbohydr.Res.1972,399-412)。
受到这项工作的启发，Seeberger等人设计了一种用于寡糖自动合成的机器(P.H.Seeberger,"Solid Phase Oligosaccharide Synthesis",J.Carbohydr.Chem,2002,21,613-643和M.Weishaupt et al,"Solid Phase Synthesis of Oligosaccharides",published in Methods in Enzymology,2010,478,463-484)。因此，他们描述了几种复杂寡糖的合成，如β-葡聚糖十二聚体衍生物。
已经在固体载体上探索了烯糖用于糖苷偶联的用途(J.T.Randolph et al,"Major Simplifications in Oligosaccharide Synthesis Arising from a Solid-PhaseBased Method:An Application to the Synthesis of the Lewis b Antigen",J.Am.Chem.Soc.1995,117,5712-5719；C.Zheng et al,"Solid Support OligosaccharideSynthesis:Construction ofβ-Linked Oligosaccharides by Coupling of GlycalDerived Thioethyl Glycosyl Donors",J.Org.Chem,1998,63,1126-1130和K.A.Savin etal,"A New Polymer Support Silylene Linking Method for Hindered Hydroxyl-Bearing Systems,"J.Org.Chem.1999,64,4183-4186)。糖苷偶联的概念是基于用亲电试剂(例如二甲基过氧化酮)激活烯糖。
由于刚刚阐述的内容，固相寡糖合成的主要挑战是：使用过量的单体单元，无法控制引入的每种单体的异头性，外推到任何类型的糖苷键，间隔物裂解的低动力学，间隔物的复杂合成，需要特殊设备(能够降至约-20℃)和低生产能力。
简而言之，以低成本和低环境占用空间在工业规模上生产大分子、寡核苷酸和寡糖，用目前的方法是虚无缥缈的。这正是本发明的目的。事实上，本发明人已经开发了一系列保护基团(或锚定分子或增溶分子或锚定基质)，其能够以低成本、低环境影响和低复杂性合成寡核苷酸和寡糖。换句话说，使用这些锚定分子可以结合液相合成和固相合成的优点(反应介质的均匀性，由于载体是可溶的，这提供了线性动力学；减少昂贵试剂和溶剂的量的可能性；实施大规模反应(分批)的可能性；被延长的大分子、过量试剂和副产物的简化纯化。这些纯化特别基于锚定分子的物理化学特性和性质，它们通常通过液-液萃取技术进行，该技术基于溶质在两种几乎不混溶的液体中的选择性分布(或分配系数或分布系数)。
发明内容
本发明提出解决现有技术中发现的困难，特别是在纯化技术方面，一方面通过衍生化可溶于非极性溶剂的保护基团，另一方面，通过使用聚烯烃(polyolefin)或聚烯烃(polyolefin)的低聚物或聚链烯烃(polyalkene)，能够在液相(或溶液)中产生生物大分子(寡核苷酸和寡糖)的过程中引起选择性溶解。事实上，本发明人已经发现，使用聚烯烃(特别是聚异丁烯衍生物(PIB))作为保护基团或锚定分子或液体载体或锚定基质，允许在溶液(卤化和/或非卤化溶剂)中合成这些大分子，同时通过液-液萃取有助于其纯化。
因此，本发明旨在通过连续延伸不同单元来合成大分子，这些单元主要是相同或不同的碳水化合物衍生物。所述大分子尤其可以是寡核苷酸或寡糖。
本发明的第一个目的是用于合成由单元U组成的大分子的方法，所述单元U主要是单糖或单糖衍生物，可以相同的或不同的，所述大分子具有第一末端和第二末端，所述合成方法通过由具有至少两种功能的单体或低聚物M连续延伸所述第二末端来进行，并且所述方法的特征在于：
-在第一所谓的锚定步骤中，对应于单体M1或低聚物M1的末端单元的所述大分子的第一单元U1通过共价键(醚、酯或与本方法兼容的任何其他功能)连接到可溶于有机溶剂的锚定分子上，所述共价键由所述单体M1或所述低聚物M1的第一功能与所述锚定分子的功能的反应产生，所述第二末端可能是所述单体M1或所述低聚物M1的另一功能，在所述反应之前，所述第二末端已被至少第一保护基团GP1保护，并且可能被第二保护基团GP2和第n保护基团GPn保护；
-在第二所谓的脱保护步骤中，除去所述保护基团GP1或GP2或GPn中的一个，在所述单体M1或所述低聚物M1上留下至少一个自由化学功能；
-在第三所谓的偶联步骤中，携带至少一种自由化学功能和至少一种由保护基团GP3保护的化学功能的第二单体M2或低聚物M2以如下方式反应，即其自由化学功能通过与所述第一单体M1或低聚物M1的所述自由功能反应形成共价键，由此产生由所述单体M1或低聚物M1通过其第一末端连接到所述锚定分子和所述单体M2或低聚物M2连接到其另一末端形成的新分子，所述方法的特征在于所述锚定分子包括具有至少5个单体单元并优选10至50个单体单元的聚烯烃链或聚烯烃低聚物或聚链烯烃，所述聚烯烃链是支链，优选聚异丁烯链。
因此，可以通过偶联添加第n单体Mn或低聚物Mn；这种方法允许合成大分子。
该方法包括至少一个步骤，其中通过液-液萃取技术在具有不混溶极性溶剂(或极性溶剂混合物)的非极性有机溶剂中将连接到所述锚定分子的所述大分子与反应介质分离。因此，真正的挑战是在脱保护和偶联反应之后保持锚定单体或低聚物M1相对于所述反应的副产物的选择性溶解度。
正是锚定分子的聚烯烃链的支链特性使其在非极性溶剂中具有优异的溶解度，在极性溶剂的溶解度非常低，这是通过液-液萃取将锚定分子从反应介质中分离所必需的。
该方法可包括将所述大分子完全脱保护的步骤。在偶联最后的单体或低聚物后，大分子的保护基团被去除。
所述单糖单元或单糖衍生物特别是戊糖(特别是核苷)或己糖的衍生物。在戊糖中，可提及例如核苷，如C-核苷、无环核苷、羧基核苷、亚氨基-C-核苷、具有修饰碱基的核苷；所有这些分子都必须以适当的保护形式使用。其他可用的单糖衍生物是糖胺(氨基糖)，如葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、葡甲胺。
两个连续单元之间的连接是苷(osidic)(并且优选为糖苷)或磷酸化(特别是糖-1-磷酸(ose-1-phosphate))或碳水化合物或N-糖杂体或S-糖杂体连接。
在该方法的一个实施例中，一些单元U可以不是单糖或单糖衍生物。特别地，这样的单元U可以选自氨基酸和脂质(异戊二烯衍生物)。
所述锚定分子有利地具有300至20,000，优选500至15,000的质量平均分子量。其聚烯烃链是低聚物或由优选相同的单体构建的聚合物。
在一个有利的实施例中，所述聚烯烃链或聚烯烃或聚链烯烃低聚物是通过单体聚合获得的。这种单体有利地是生物来源的。
在一个特定实施例中，所述聚烯烃或聚链烯烃低聚物链包含不超过5％，优选不超过3％的不饱和碳-碳键。
本发明的第二个目的是使用根据本发明任一实施例的方法用于合成寡核苷酸或寡糖。
在寡核苷酸的情况下，单体单元通常由适当保护的磷酸化核苷(或寡核苷酸链)组成(方案1)。该单元将在核酸碱基上适当保护的核苷(或寡核苷酸链)的5’位置和/或糖的2’位置与醇反应，并在3’位置锚定到液体载体上。
[化学1]
Figure BDA0004014198710000081
在寡糖的情况下，单体单元通常由适当保护或未保护的供体糖基(或寡糖链)组成，其在异头位置携带有Z基团，其可以是但不限于环半缩醛、醋酸盐、硫代糖苷、磷酸盐或酰亚胺酯(imidate)。锚定在液体载体上的适当保护或未保护的受体糖苷(或寡糖链)的醇功能将与所述单体单元反应(方案2)。
[化学2]
Figure BDA0004014198710000091
一般来说，根据本发明的方法可以用相同的或不同的单元进行。例如，可以合成寡糖，其为均聚物，即由相同的单糖单元组成。寡糖也可以由不同的单糖单元合成。也可以使用二糖、三糖或更长寡糖的单元。
类似地，寡核苷酸可以由相同的或不同的磷酸化核苷(或寡核苷酸)单元合成。
例如，为了制备寡核苷酸，可以使用核苷3'(2-氰基乙基-N,N-二烷基磷酰胺)或核苷3'-(H-磷酸酯)或核苷磷酸盐(二酯或三酯)。在寡糖的合成中，可以使用适当保护或未保护的供体糖基。在这两种情况下，应用本领域技术人员已知的偶联反应。
根据本发明的方法还允许合成包含单糖单元和核苷酸单元的混合多糖。
根据本发明的方法还可以在大分子中引入既不包含寡糖也不包含寡核苷酸的单元。
根据本发明的方法的一个基本特征是使用锚定分子或增溶分子或锚定基质。它们必须溶于非极性溶剂。它们由具有至少5个单体单元，优选10至50个单元的聚烯烃链组成；它们是聚烯烃或聚烯烃的低聚物或聚链烯烃。有利地，锚定分子在其至少一个末端官能化，以允许保护或连接初始单体(或低聚物)单元。
所述锚定分子可以在其每个单元中包含相同或不相同的烷基，其优选选自由甲基和乙基组成的组。所述聚烯烃链有利地具有300至20,000，优选500至15,000的质量平均分子量。所述聚烯烃链条可包含不超过5％，优选不超过3％的不饱和碳-碳键。优选地，它是聚异丁烯(缩写为PIB)链。方案3示出了在本发明范围内可用的一些PIB；在这些式子中，X表示具有旨在与大分子的第一单元U1反应以实现锚定到液体载体的功能的间隔物。
[化学3]
Figure BDA0004014198710000101
根据本发明的方法允许获得高纯度大分子。该方法引入了有利的E因子(环境因子)，因为纯化是通过液-液萃取技术进行的，具有合理的溶剂的量，这允许通过色谱柱最小化纯化步骤；从而实现节约资金。因此，可在液-液萃取之前进行衍生化可溶于非极性溶剂的副产物的反应。
在一个特定实施例中，所述锚定分子包括聚烯烃链(或是聚烯烃链)，该聚烯烃链由选自由脂族链(支链或非支链且不饱和或非不饱和)、(杂)环和/或(杂)芳基(经取代或未经取代)组成的组(间隔物)中的至少一个基团终止。
在一个有利的实施例中，锚定分子的质量平均分子量(不包括其末端官能化)在300和20,000之间，优选在500和15,000之间。超过约20,000的质量平均摩尔质量，这些分子可能表现出过高的粘度，这将限制它们在有机溶剂中的溶解度。
在本发明范围内使用的一些PIB衍生物可作为用于均相催化的配体商购获得。例如，可以使用分别由Strem Chemicals公司以参考号06-1037和06-1048分销的2-甲基-3-[聚异丁基(12)]丙醇(质量平均分子量757，包括末端官能化)或4-[聚异丁基(18)]苯酚(质量平均分子量1104，包括末端功能化)。这两种分子是聚异丁烯的衍生物，其链分别被-CH2-C(CH3)(H)-CH2-OH基团(即异丙醇)和-CH2-C(CH3)2-C6H4-OH基团)(即苯酚)终止。
根据本发明的一个特征，锚定分子作为保护基团、醇功能和/或在作为本发明主题的方法的条件下需要是惰性的任何其他功能。
在寡核苷酸合成的情况下，核糖/脱氧核糖和/或核碱基的胺的3’-位的醇功能可以同时或不同时用至少一个增溶保护基团掩蔽。
在寡糖合成的情况下，初始异头功能被增溶保护基团锚定(保护)。
这些衍生化允许单体和低聚物在非极性溶剂(如环己烷、庚烷或己烷)中增溶。
根据本发明的另一个特征，如上所述，使用可溶于有机溶剂且不溶于某些极性溶剂(例如水和/或乙醇和/或乙腈)的锚定分子(更特别是使用聚烯烃)有助于通过简单的液-液萃取或二氧化硅上的简单过滤来纯化锚定单体和低聚物。
根据本发明的另一个特征，使用市售的锚定分子，或使用可以从市售的前体(包括一些聚异丁烯衍生物)以简单和直接的方式合成的锚定化合物。换言之，传统的保护基团可以连接到PIB，例如苄基、甲硅烷基或羧酸衍生物。
下图4列出了能够在寡核苷酸合成中发挥保护基团的作用的一些非详尽的结构。
[化学4]
Figure BDA0004014198710000111
下面的方案5列出了能够在寡糖合成中发挥保护基作用的一些非详尽的结构。
[化学5]
Figure BDA0004014198710000112
根据本发明的另一个特征，在合适的溶剂(例如(卤化或非卤化)溶剂混合物)中并在-50℃至150℃的温度下，初始单体(或低聚物)根据化学功能根据已知的反应连接到锚定分子上。
根据本发明的另一个特征，与该方法不相容的单体(或低聚物)的化学功能可以暂时被合适的保护基团掩蔽，例如叔丁基二甲基甲硅烷基(缩写为TBDMS或TBS)、二甲氧基三苯基(缩写为DMTr)或与本方法相容的任何其他保护基。
根据本发明的另一个特征，在脱保护步骤之后，保护基团可以衍生，优选原位衍生，形成可溶于极性溶剂(或极性溶剂混合物)的化合物。因此，锚定在PIB衍生物上的单体(或低聚物)，其伯醇受到三苯甲基保护，在酸性介质中，在相应的碳正离子(三苯甲基)清除剂的存在下被裂解，使其可溶于水(或极性)相中。三苯甲基碳正离子清除剂包括但不限于巯基乙酸、3-巯基丙酸、3-巯基-1-丙磺酸、半胱氨酸或硫代苹果酸(或巯基琥珀酸)。
根据本发明的另一个特征，所述锚定分子与适当保护的第一单体(或低聚物)反应，导致这两种分子物种之间的共价键，例如酯键或O-糖苷键。
根据本发明的另一个特征，具有与延伸(或迭代)循环的反应条件不相容的化学功能的单体可以被增溶保护基团暂时掩蔽。在这种情况下，根据目标大分子的长度，化学功能可以被一个或多个增溶保护基团和一个或多个传统的保护基团掩蔽，例如：苯甲酰基、乙酰基、叔丁基二甲基甲硅烷基。
根据本发明的另一个特征，使用与锚定分子连接的单体单元(或低聚物)作为起始点来进行大分子合成方法。
在寡核苷酸合成的情况下，如果锚定核苷是三苯甲基衍生物，则第一个延伸周期开始于在酸性介质中且清除剂存在下选择性地脱保护锚定核苷的5’保护基团。
在寡糖合成的情况下，第一个延伸周期开始于适当保护或未保护的供体糖基与锚定并脱保护在将参与反应的醇功能上的糖苷之间的反应。同样，如果保护基团是三苯甲基衍生物，则在酸性介质中在清除剂的存在下将其脱保护。
根据本发明的另一个特征，单体单元的整合(或迭代)需要几个步骤。
在寡核苷酸合成的情况下，核苷磷酸盐需要两个步骤(5’位醇的偶联和脱保护)，而核苷亚磷酰胺或H-磷酸酯需要三个步骤(5’位醇的偶联、氧化和脱保护)。
在寡糖合成的情况下，需要两个步骤(偶联和脱保护)。
根据本发明的另一个特征，所述大分子由n个具有结合到锚定分子的化学功能的单体单元形成。在该方法的过程中，低聚物链通过连续的延伸(或循环)或迭代而生长，并且在这些步骤中的每一个步骤中，在游离醇末端添加单体或低聚物单元。
根据本发明的另一个特征，天然和/或非天然和/或合成单体(或低聚物)可用于所述低聚物链。
根据本发明的另一个特征，一种或多种适当保护的单体(或低聚物)类似物单元(如吗啉代磷单体或N-乙酰基单糖单体)可用于所述低聚物链。
根据本发明的另一个特征，至少一个步骤，其中通过在水不混溶的(或与水/乙醇混合物或水/乙腈混合物不混溶的)非极性有机溶剂中提取或通过在二氧化硅上过滤从反应介质中纯化所述低聚物链。作为非极性有机溶剂，优选仅含碳和氢原子的碳氢化合物，例如直链烷烃、支链烷烃和环烷烃，特别优选环己烷、庚烷和己烷。
根据本发明的另一个特征，该方法使得在锚定分子完全脱保护和脱锚定之后，可以获得高纯度低聚物，用于它们的预期用途，例如作为临床前试验、临床护理或任何其他应用的活性成分。
根据本发明的另一个特征，锚定分子可以在根据本发明方法中重复使用(再循环)。
根据本发明的另一个特征，提取溶剂可以在本发明的方法中重复使用(再循环)。
根据本发明的方法可以自动化和/或在流动化学中进行。
具体实施方式
在本发明中，以下术语具有以下含义，其符合国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)的术语，并且所使用的任何其他术语也应理解为IUPAC所定义的。
术语“碳水化合物”包括单糖、寡糖和多糖，以及通过羰基功能(特别是醛或酮功能)的还原、通过将链末端的至少一个官能团氧化为羧酸、或通过用氢原子、氨基、巯基、或任何类似的原子取代一个或多个羟基而从单糖衍生的化合物。该术语还包括此类化合物的衍生物。
术语“单糖”是指碳水化合物的单体。
术语“糖胺”是指碳水化合物在异头位置与胺基连接的化合物。
术语“核苷”是指一些嘧啶或嘌呤碱基的核糖基或脱氧核糖基衍生物，更准确地说是，由与戊糖残基的异头碳原子相连的核碱基组成的糖胺，通常是核糖(核糖核苷)或脱氧核糖(脱氧核糖核苷)，通过嘧啶的N1原子或嘌呤的N9原子的糖苷键连接。
术语“核苷酸”是指核酸(如DNA或RNA)的构成模块的有机分子；这种分子由一个核酸碱基、一个五碳糖，最后是一到三个磷酸基团组成。
术语“保护基团”是指在化学反应期间用于官能团的可逆保护的分子，以使所述官能团在所述化学反应过程中不反应，这将转化所述未保护官能团。
术语“官能团”是指可以与其他官能团反应的原子或原子组。官能团的示例如下：醛、羧酸、磷酸、膦酸、磺酸、伯胺或仲胺、酮、卤化烷、肼、羟胺、羟基、异氰酸酯、异硫氰酸酯、硫醇。
术语“大分子”是指由一系列低分子质量单元设计的高分子质量分子。这些单元可以单独且连续地连接以形成链；还可以偶联包含几个这些单元的低聚物。一般来说，这些单位可以是相同的或不同的。大分子可以是合成来源或生物来源，或两者的组合。它们可以包括一个或多个官能团。本文中使用的术语“大分子”包括聚合物；在聚合物的情况下，所述单元称为单体。
术语“聚合物”是指包含重复结构单元的大分子，即单体，其通过化学键以线性、圆形、分支、交联、树枝状或其组合的方式连接。应当理解，例如，聚合物还可以包括至少一个官能团。如果聚合物由相同的单体组成，则称其为“均聚物”；如果聚合物由不同的单体组成，则称为“共聚物”。
根据本发明的一个特征(将在下文更详细地描述)，锚定分子或增溶保护基团或锚定基质是聚烯烃，或更准确地说是聚烯烃低聚物(聚烯烃(polyolefin)也称为聚链烯烃(polyalkene))及其衍生物，即它们携带至少一个官能团。
在一个优选实施例中，根据本发明的方法使用聚烯烃，或更准确地说是聚烯烃的低聚物(聚烯烃(polyolefin)也称为聚链烯烃(polyalkene))及其衍生物作为不同单体的几个官能团(至少是单官能团)的锚定分子或保护基团或锚定基质，其通过共价键(酯、酰胺、醚、硫醚或任何其他合适的化学功能)连接，使新的单体衍生物可溶于非极性液相中。聚烯烃分子包括由单键连接的碳原子链。它们可以包括由相同的或不同的(但优选相同的)烷基组成的分支。优选地，聚合物由至少10个、优选15至50个的多个单体单元组成。优选为均聚物，但可以使用共聚物(饱和或不饱和)。在不饱和聚合物或共聚物的情况下，碳原子链中的不饱和键的数量有利地不超过5％，优选不超过3％。
在一个优选实施例中，这些是聚异丁烯(PIB)的衍生物，这是自20世纪30年代以来已知的一类聚合物，但也可以使用聚丙烯的衍生物。
在根据本发明的方法中使用的这些锚定分子优选为官能化衍生物的形式。前述方案4和5示出了适合于实施本发明的许多PIB衍生物及其官能化。
根据本发明的一个特征，这些锚定分子通过共价键(例如酰胺、醚、硫醚、硫酯酯、磺酰基酰肼或酰基酰肼(非详尽列举))连接到单体(或低聚物)单元。这假设所涉及的PIB衍生物被适当地官能化。锚定分子的这种官能化在末端位置是作为一般规则，即优选在碳原子链的一个末端。
根据本发明，多官能单体(或低聚物)可通过共价键以酯、醚、硫醚、硫酯或与本方法相容的任何其他化学功能的形式用PIB衍生物官能化。这充当用于单体(或低聚物)的增溶保护基团。
用作锚定分子的聚烯烃低聚物通常以质量平均分子质量为特征，但也可以使用具有给定链长的相同分子的“纯”低聚物。
锚定分子和单体(或低聚物)之间的反应导致具有低水溶性(＜30mg/mL)的新分子。
根据本发明的另一个特征，在多步骤合成过程中，PIB官能化通过化学反应导致能够充当至少双功能感兴趣分子(或中间体)的增溶保护基团的各种分子结构。这意味着保护基团也至少是单官能的。否则，PIB衍生物和感兴趣的分子(或中间体)之间的连接中不涉及的化学功能必须是惰性的或适当保护的，以避免任何虚假的产物或副反应。
根据本发明的另一个特征，直接或不直接参与与PIB衍生物的共价键的单体(或低聚物)的化学功能必须是被动的或适当保护的，以避免形成不良的产物。
在本发明的另一方面，由PIB衍生物与单体(或低聚物)之间通过直接或不直接形成共价键的反应产生的分子的特征在于其在水中的溶解度低(＜30mg/mL)。换句话说，PIB衍生物充当增溶分子。
根据本发明的另一个特征，由PIB衍生物与单体(或低聚物)之间通过直接或不直接形成共价键的反应产生的分子的特征在于PIB衍生物显著增加了单体(或低聚物)在非极性溶剂(环己烷、庚烷、己烷或芳族溶剂)或任何其他合适溶剂中的溶解度。因此，新的单体(或低聚物的)衍生物在液-液萃取过程中(在水或水/乙醇或水/乙腈混合物的存在下)对非极性溶剂具有选择性溶解度(高分配系数)，使得纯化方法简单、快速且廉价。
PIB衍生物和单体(或低聚物)之间的保护反应，通过共价键的形成，直接或间接(间隔物)，在任何可以溶解反应物的溶剂或惰性液体中，在适当的温度下进行。适用的溶剂(纯溶剂或混合物)包括但不限于卤代烃或非卤代烃。优选的溶剂是二氯甲烷和甲苯(单独或在N-N-二甲基甲酰胺存在下)。
根据单体(或低聚物)和锚定分子的自由化学功能，各种化学反应是可能的。因此，新单体或低聚物衍生物的形成可以根据本领域技术人员已知的所有方法进行。作为非详尽的实例，适用的反应包括酯化反应、酰胺化反应或醚化反应。因此，反应条件(溶剂、温度、浓度、持续时间)必须适合每个保护反应。
根据单体(或低聚物)和锚定分子之间的键的化学性质，脱保护步骤可以使用本领域技术人员已知的反应条件进行。未详尽列举，可以提及皂化、水解和氢解。更准确地说，根据本发明的通过共价键用于溶解适当保护和锚定的单体(或低聚物)的方法的特征在于其溶解在有机溶剂中。换句话说，锚定分子充当单体(或低聚物)化学功能的增溶分子和保护基团。
适当保护并共价结合到(各种)锚定分子的单体(或低聚物)的特征在于其在水中的溶解度低(＜30mg/mL)。换句话说，锚定基质充当增溶实体。这种衍生作用显著增加了新分子的溶解度，使其可溶于非极性有机溶剂。因此，在环己烷或庚烷或己烷和水或水/乙醇或水/乙腈混合物存在下的液-液萃取过程中，锚定在PIB衍生物上的单体(或低聚物)对非极性有机相具有高分配系数(选择性溶解度(或选择性分布))，从而允许简单和快速的纯化。
本发明打开了聚合合成长的低聚物的可能性，这可以通过使用至少两个适当保护的低聚物片段来实现，其中至少一个片段与锚定分子结合。
下面的反应方案6示出了生产寡核苷酸的完整顺序。更准确地说，在第一所谓的锚定步骤中，由保护基团(在此情况下为DMTr)保护的第一单体单元(在此情况中为脱氧核糖衍生物)连接到根据本发明的液体载体分子上；所得产物通过液-液萃取纯化。在第二所谓的脱保护步骤中，在清除剂的存在下，在酸性介质中去除并清除保护基团(DMTr)，并通过液-液萃取纯化获得产物。优选在不分离中间保护的醇的情况下进行锚定和脱保护(具有清除作用)。
[化学6]
Figure BDA0004014198710000171
在脱保护步骤之后，保护基团可以衍生，优选原位衍生，形成可溶于极性溶剂(或其混合物)的化合物。因此，锚定在PIB衍生物上的单体(或低聚物)，其伯醇被三苯甲基保护，在酸性介质中，在相应碳正离子(三苯甲基)的清除剂的存在下被裂解，以使其可溶于水(或极性)相中。三苯甲基碳正离子的清除剂可以有利地选自由以下各项组成的组：巯基乙酸、3-巯基丙酸、3-巯基-1-丙磺酸、半胱氨酸、硫代苹果酸、巯基琥珀酸。这种脱保护的一个示例在下面的方案7中表示。
[化学7]
Figure BDA0004014198710000181
在第三所谓的偶联/氧化(硫化)步骤中，引入由保护基团(在此情况下为DMTr)保护的第二单体单元(在此情况中为磷酸化核糖衍生物)。在亚磷酰胺化学的情况下，偶联反应在四唑或任何其他合适的试剂(苄硫基-1H-四氮唑(BTT)、4,5-二氰基咪唑)的存在下进行，然后进行氧化反应(间氯过苯甲酸(mCPBA)、碘、2-过氧化丁酮)。由此获得二核苷酸；通过萃取分离试剂和副产物。
在称为一般脱保护的第四步中，仍与根据本发明的液体载体分子结合的这种二核苷酸可以被脱保护，然后从该载体上分离。或者，它可以进入一个新的周期，添加第三单元，依此类推。
下面的反应方案8示出了生产寡糖的完整顺序。更准确地说，在第一所谓的锚定步骤中，第一单体单元(在这种情况下是己糖衍生物)由或不由第一更强的保护基团(GP)和第二更不稳定的保护基团或非保护基团(称为临时(GPt))保护，根据本发明在异头位置上连接到液体载体分子上；通过萃取纯化该化合物。在第二所谓的选择性脱保护步骤中，除去所述第二保护基(GPt)，并通过萃取纯化化合物。在第三所谓的糖基化步骤中，添加第二单体单元(在这种情况下是受保护或未受保护的供体糖基衍生物)并与所述第一单元偶联以形成锚定的二糖；通过液-液萃取除去反应物和副产物。在第四所谓的整体脱保护步骤中，该二糖被脱保护，然后从液体载体分离。或者，它可以在官能团的选择性脱保护后进入新的循环，如果需要，启动新的循环等等。
[化学8]
Figure BDA0004014198710000191
在锚定分子中，那些能够由简单单体通过聚合技术制造的分子是优选的。这是聚异丁烯(PIB)的情况，其代表一种特别优选的锚定分子类型。聚异丁烯的单体，即异丁烯，可以从生物源原料工业制造，PIB可以通过简单聚合从生物源异丁烯制备。因此，本发明可以用生物源锚定分子实现，特别是用生物源PIB实现。
生物源含量的概念在ISO 16620-1:2015"Plastics-Biosourced Content-Part1:General Principles”中定义，包括术语“生物源合成聚合物”、“生物源合成聚合物含量”、“生物源碳含量”和“生物源质量含量”的定义，以及在ISO 16620-2:2015"Plastics-Biobased Content-Part 2:Determination of Biobased Carbon Content”和ISO16620-3:2015"Plastics-Biosourced Content-Part 3:Determination of Biobased SyntheticPolymer Content”中关于确定和量化生物源性质的方法。
有利地，本发明中使用的锚定分子的生物源碳含量大于90％、优选大于93％、甚至更优选大于95％。
根据本发明的方法具有许多优点。
第一个优点是，它允许通过在非极性有机溶剂和水或水/乙醇或水/乙腈混合物中通过简单的液-液萃取或通过二氧化硅过滤获得纯度良好的基质结合低聚物，导致去除不与聚烯烃或聚烯烃低聚物衍生物结合的副产物(盐、过量试剂或任何其他分子物种)。闪点<15℃的非极性有机溶剂(如环己烷、庚烷、己烷)适用于在萃取或洗涤过程中溶解聚烯烃或聚烯烃低聚物或聚链烯烃衍生物。因此，根据本发明的方法有助于纯化步骤并产生较少的废物(流出物和固定相)。
第二个特别有趣的优点是自动化根据本发明的方法的可能性。
第三个优点是可以回收提取溶剂以及锚定分子(聚烯烃或聚烯烃的低聚物或聚链烯烃)，特别是在工业规模下。事实上，这些保护基团可以在合成结束时通过通常用于有机合成的反应(例如水解、皂化、氢解或与本方法兼容的任何其他反应)容易地去除并再循环。这证明根据本发明的方法符合绿色或可持续化学，与当前的生产方法相反。
本发明的第四个优点在于，通过调节锚定分子的大小，或通过向聚合合成方向移动，或通过将一个或多个锚定分子引入单体单元，可以获得大的低聚物。
第五个优点是可以在合成过程中通过不同的分析技术(例如质谱、高效液相色谱、质子或碳-13核磁共振)在每个步骤控制低聚物的纯度。
第六个优点是可以在没有昂贵设备的情况下实现工业规模。
由于其高纯度，通过该方法生产的大分子可以用作药物、化妆品、植物检疫产品或农业食品产品，或用于获取任何这些产品。
另一个优点是优选的锚定分子，即聚异丁烯衍生物，可以如上所述由生物来源的异丁烯制备。
示例：
以下示例说明可用于实施根据本发明的方法的一些官能化锚定分子的合成。
除非另有说明，已知的PIB衍生物已经由所述的前体和方法(Tetrahedron,2005,61,12081)和商业试剂制备。
示例1：一般O-芳基化程序
[化学9]
Figure BDA0004014198710000201
向在甲苯/N-N-二甲基甲酰胺(1/1)(0.1M)混合物中的PIB-CH2-CH(CH3)-CH2-OMs衍生物(1当量)和苯酚(3当量)的混合物中加入碳酸钾(5当量)，然后将反应介质在120℃下加热16小时，然后冷却至室温。用环己烷和乙腈/水或乙醇/水(90/10)混合物萃取反应介质三次，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，在减压下浓缩，如果需要，通过二氧化硅过滤纯化残留物，得到相应的O-芳基衍生物。
示例2：
[化学10]
Figure BDA0004014198710000211
将锚定醛(1当量)溶解在(0.1M)四氢呋喃/乙醇(1/1)混合物中，然后冷却至0℃持续5分钟。将硼氢化钠(3当量)加入到反应介质中(少量)，然后在室温下搅拌反应介质30分钟。在减压下浓缩反应介质，然后将1N氢氧化钠溶液和环己烷依次加入残留物中。然后用水、盐水洗涤有机相，在硫酸钠上干燥，过滤并在减压下浓缩，得到相应的苄醇。
示例3：
[化学11]
Figure BDA0004014198710000212
将锚定的甲酯(1当量)溶解在(0.1M)四氢呋喃/DMSO/水(8/1/1)混合物中。向反应介质中加入氢氧化锂(3当量)，然后在室温下搅拌反应介质12小时。用环己烷萃取反应介质三次，并依次用盐酸溶液(1N)、乙醇/水混合物(90/10)、盐水洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤，在减压下浓缩，如果需要，通过二氧化硅过滤纯化残留物，得到相应的羧酸。
示例4：
[化学12]
Figure BDA0004014198710000213
向在(0.1M)甲苯/N-N-二甲基甲酰胺(1/1)混合物中的PIB-苯酚衍生物(1当量)和4-(溴甲基)苯甲酸甲酯(3当量)混合物中加入碳酸钾(5当量)，然后将反应介质在120℃下加热16小时，然后冷却至室温。用环己烷萃取反应介质三次，然后依次用乙腈/水或乙醇/水(90/10)混合物、盐水洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤，在减压下浓缩，如果需要，通过在二氧化硅上过滤纯化残留物，得到相应的O-芳基衍生物。
示例5：
[化学13]
Figure BDA0004014198710000221
在搅拌和室温下，向在甲苯(0.1M)中的PIB-苯酚衍生物(1当量)的溶液中加入琥珀酸酐(2当量)，然后加入三乙胺(3当量)。将反应介质加热至60℃持续16小时，然后冷却至室温。加入(1N)盐酸溶液后，反应介质用环己烷萃取三次，依次用乙醇/水(90/10)混合物、盐水洗涤有机相，在硫酸钠上干燥，过滤，在减压下浓缩，如果需要，在二氧化硅上过滤纯化残留物，得到相应的酯。
示例6：
[化学14]
Figure BDA0004014198710000222
在搅拌和室温下，向在甲苯/DMF(1/1)(0.1M)中的PIB-苯酚衍生物(1当量)的溶液中加入5-氟-2-硝基苯甲醛(3当量)，然后加入碳酸钾(3当量)。将反应介质加热至80℃持续48小时，然后冷却至室温。用环己烷萃取反应介质三次，并用乙醇/水(90/10)混合物、盐水洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤，在减压下浓缩，如果需要，通过二氧化硅过滤纯化残留物，得到相应的芳基醚。
示例7：
[化学15]
Figure BDA0004014198710000231
将锚定醛(1当量)溶解在(0.1M)四氢呋喃/乙醇(1/1)混合物中，然后冷却至0℃持续5分钟。将硼氢化钠(3当量)加入到反应介质中(少量)，然后在室温下搅拌反应介质持续30分钟。在减压下浓缩反应介质，然后将1N氢氧化钠溶液和环己烷依次加入残留物中。然后用水、盐水洗涤有机相，在硫酸钠上干燥，过滤并在减压下浓缩，得到相应的苄醇。
示例8：
[化学16]
Figure BDA0004014198710000232
在搅拌、惰性气氛和室温下，向在二氯甲烷(0.1M)中的PIB-醇衍生物(1当量)的溶液中加入琥珀酸酐(1.1当量)，然后加入三乙胺(1.2当量)。将反应介质加热至40℃持续18小时，然后冷却至室温。
在这一阶段，已将5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷(1.1当量)、乙基-(N,N-二甲基氨基)-丙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(1.1当量)和4-(N,N-二甲基氨基)-吡啶(DMAP)(0.5当量)相继加入反应介质中；然后将反应介质在40℃下加热18小时。蒸发反应介质，然后用环己烷萃取，用乙醇/水(90/10)混合物、盐水洗涤3次，在硫酸钠上干燥，过滤，在减压下浓缩，如果需要，通过二氧化硅过滤纯化残留物，得到相应的锚定胸苷。
示例9：
[化学17]
Figure BDA0004014198710000241
在搅拌、惰性气氛和室温下，向在二氯甲烷中的PIB-羧酸衍生物(1当量)的溶液中加入5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷(1.1当量)、乙基-(N,N-二甲基氨基)-丙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(1.1当量)和4-(N,N-二甲基氨基)-吡啶(DMAP)(0.5当量)，然后将反应介质加热至40℃持续18小时。蒸发反应介质，然后用环己烷萃取，用乙醇/水(90/10)混合物、盐水洗涤3次，在硫酸钠上干燥，过滤，在减压下浓缩，如果需要，通过二氧化硅过滤纯化残留物，得到相应的锚定胸苷。
示例10：
[化学18]
Figure BDA0004014198710000242
在室温下，向在(0.1M)THF/H2O混合物中的锚定的5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷衍生物(1当量)的溶液中加入巯基琥珀酸(5当量)，然后加入二氯乙酸(5％V)，然后搅拌反应介质持续1小时。蒸发反应介质，然后用环己烷萃取，用乙醇/水混合物(90/10)、盐水洗涤3次，在硫酸钠上干燥，过滤，在减压下浓缩，得到相应锚定胸苷的脱保护衍生物。
示例11：
[化学19]
Figure BDA0004014198710000251
在搅拌、惰性气氛和室温下，向在二氯甲烷(0.1M)中的PIB-羧酸衍生物(1当量)的溶液中加入5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷(1.1当量)、乙基-(N,N-二甲基氨基)-丙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(1.1当量)和4-(N,N-二甲基氨基)-吡啶(DMAP)(0.5当量)。然后将反应介质在45℃下加热持续18小时，然后蒸发。
在室温下将残留物溶解于(0.1M)THF/H2O(9/1)混合物中，然后依次加入巯基琥珀酸(5当量)、二氯乙酸(5％V)，然后在室温下搅拌反应介质持续1小时。蒸发反应介质，然后用环己烷萃取，用乙醇/水(90/10)混合物、饱和碳酸氢钠溶液、盐水洗涤3次，在硫酸钠上干燥，过滤，在减压下浓缩，得到相应锚定胸苷的脱保护衍生物。
示例12：
[化学20]
Figure BDA0004014198710000252
锚定胸苷的脱保护衍生物(1当量)和DMT-dT亚磷酰胺(2当量)已与无水甲苯共蒸发3次，然后在真空下干燥。在惰性气氛下向残留物中加入二氯甲烷(0.1M)，然后加入在(0.01M)乙腈中的苄硫基-1H-四氮唑(BTT)溶液(4.5当量)，并在室温下搅拌反应介质持续16小时。将mCPBA(3当量)加入到反应介质中，然后搅拌1小时，然后蒸发。
在此阶段，将残留物在室温下溶解于(0.1M)THF/H2O(9/1)混合物中，然后依次加入巯基琥珀酸(5当量)、二氯乙酸(5％V)，然后在室温下搅拌反应介质持续1小时。蒸发反应介质，然后用环己烷萃取，用乙醇/水(90/10)混合物、碳酸氢钠水溶液(10％)、盐水洗涤3次，在硫酸钠上干燥，过滤，在减压下浓缩，得到相应锚定胸苷的二聚脱保护衍生物。
示例13：
[化学21]
Figure BDA0004014198710000261
在搅拌、在惰性气氛下和室温下，向在二氯甲烷(0.1M)中的PIB-苯甲酸衍生物(1当量)的溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(1.1当量)、乙基-(N,N-二甲基氨基)-丙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(1.1当量)和4-(N,N-二甲基氨基)-吡啶(DMAP)(0.1当量)，然后将反应介质加热至40℃持续30分钟，然后冷却至室温。将水合肼加入到反应介质中，然后加热至40℃持续30分钟。蒸发反应介质，然后用环己烷萃取，用乙醇/水(90/10)混合物、盐水洗涤3次，在硫酸钠上干燥，过滤，在减压下浓缩，得到相应的PIB酰基酰肼衍生物。
示例14：
[化学22]
Figure BDA0004014198710000262
在搅拌下，在惰性气氛和室温下，向在二氯甲烷(0.1M)中的PIB-芳基衍生物(1当量)的溶液中逐滴加入氯磺酸(1.1当量)，然后在室温下搅拌反应介质持续30分钟。将水合肼(3当量)加入到反应介质中，然后搅拌持续30分钟。蒸发反应介质，然后用环己烷萃取，用乙醇/水(90/10)混合物、盐水洗涤3次，在硫酸钠上干燥，过滤，在减压下浓缩，得到相应的PIB-磺酰基肼衍生物。
示例15：
[化学23]
Figure BDA0004014198710000271
向在(0.1M)DMF/THF(9/1)混合物中的PIB-酰基酰肼(1当量)和2,3,4,6-四-O-苄基-D-吡喃葡萄糖(1.5当量)混合物中加入乙酸(0.01当量)，然后将反应混合物加热至90℃持续18小时。蒸发反应介质，然后用环己烷萃取，用乙醇/水混合物(90/10)、盐水洗涤3次，在硫酸钠上干燥，过滤，在减压下浓缩，得到相应的PIB-糖基酰肼衍生物。
示例16：
[化学24]
Figure BDA0004014198710000272
向在(0.1M)DMF/THF(9/1)混合物中的PIB-酰基酰肼(1当量)和2,3,4-三-O-苄基-D-吡喃葡萄糖(1.5当量)混合物中加入乙酸(0.01当量)，然后将反应混合物在90℃下加热持续18小时。蒸发反应介质，然后用环己烷萃取，用乙醇/水(90/10)混合物、盐水洗涤3次，在硫酸钠上干燥，过滤，在减压下浓缩，得到相应的PIB-糖基酰肼衍生物。

Claims (11)

1.一种合成由单元U组成的大分子的方法，所述单元U主要是单糖或单糖衍生物，其可以是相同的或不同的，所述大分子具有第一末端和第二末端，所述合成方法通过具有至少两种功能的单体或低聚物M连续延伸所述第二末端而进行，所述方法的特征在于：
-在第一所谓的锚定步骤中，对应于单体M1或低聚物M1的末端单元的所述大分子的第一单元U1通过共价键连接到可溶于有机溶剂的锚定分子上，所述共价键由所述单体M1或所述低聚物M1的第一个功能与所述锚定分子的功能的反应产生，所述第二末端可能是所述单体M1或所述低聚物M1的另一个功能，其在所述反应之前被至少第一保护基团GP1保护，并且可能被第二保护基团GP2保护；
-在第二所谓的脱保护步骤中，除去所述保护基团GP1或GP2中的一个，在所述单体M1或低聚物M1上留下所谓的自由功能；
-在第三所谓的偶联步骤中，携带至少一种自由功能和至少一种由保护基团GP3保护的功能的第二单体M2或低聚物M2发生反应，使得其自由功能通过与所述第一单体M1或低聚体M1的所述自由功能反应形成共价键，从而产生由所述单体M1和低聚物M1通过其第一末端连接到所述锚定分子并且所述单体M2或低聚物M2连接到其另一末端而形成的新分子，所述方法的特征在于，所述锚分子包括具有至少5个单体单元并优选10至50个单体单元的聚烯烃链或聚烯烃低聚物或聚链烯烃，所述聚烯烃链是支链，优选是聚异丁烯链。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过偶联添加第n单体Mn或低聚物Mn。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其特征在于，在偶联最后的单体或低聚物之后，进行大分子的保护基团的脱保护。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，包括以下至少一个步骤，其中通过在非极性有机溶剂中提取、和/或通过用极性溶剂提取或洗涤、和/或过滤，将附接在所述锚定分子上的所述大分子与反应介质分离。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，包括将所述大分子完全脱保护的步骤。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述单糖单元或单糖衍生物是戊糖(且特别是核苷)或己糖衍生物。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，两个连续单元之间的键是苷型(且优选糖苷型或磷酸化型(特别是糖-1-磷酸型))或碳水化合物型或N-糖杂体型或S-糖杂体型的键。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述锚定分子的质量平均分子量为300至20,000，优选为500至15,000。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚烯烃或聚烯烃低聚物或聚链烯烃链包含不超过5％，优选不超过3％的不饱和碳-碳键。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚烯烃链或聚烯烃低聚物或聚链烯烃通过优选生物来源单体的聚合而获得。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法用于合成寡核苷酸或寡糖的用途。
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