JP5548852B2 - 疎水性基結合ヌクレオシド、疎水性基結合ヌクレオシド溶液、及び疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法 - Google Patents
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Description
本発明の疎水性基結合ヌクレオシドは、下記一般式(1)で示される化合物である。
ここで、本発明の疎水性基結合ヌクレオシドにおいて、R1、R2、及びR5で表される炭化水素鎖、並びにR3及びR4が互いに結合して形成される炭化水素鎖は、それぞれ独立に、飽和炭化水素鎖であっても、不飽和炭化水素鎖であってもよく、直鎖炭化水素鎖であっても、分岐鎖炭化水素鎖であってもよい。しかしながら、各炭化水素鎖は、それぞれ独立に、飽和炭化水素鎖であることが好ましく、直鎖飽和炭化水素鎖であることが更に好ましい
本発明の疎水性基結合ヌクレオシドにおいて、Xは水素原子、水酸基、又は保護基により保護された水酸基である。ここで、Xが水素原子の場合、本発明の疎水性基結合ヌクレオシドに含まれる5単糖残基は、デオキシリボース残基となる。このため、Xが水素原子の場合、本発明の疎水性基結合ヌクレオシドは、疎水性基結合デオキシリボヌクレオシドとなり、疎水性基結合オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成に用いることができる。同様に、Xが水酸基又は保護基により保護された水酸基の場合、本発明の疎水性基結合ヌクレオシドに含まれる5単糖残基は、2位の水酸基が保護されていてもよいリボース残基となる。このため、Xが水酸基又は保護基により保護された水酸基の場合、本発明の疎水性基結合ヌクレオシドは、リボース残基の2位の水酸基が保護されていてもよい疎水性基結合リボヌクレオシドとなり、リボース残基の2位の水酸基が保護されていてもよい疎水性基結合オリゴリボヌクレオチドの合成に用いることができる。
本発明の疎水性基結合ヌクレオシド溶液は、本発明の疎水性基結合ヌクレオシドを非極性溶媒に溶解させたものである。ここで、非極性溶媒としては、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ベンゼン、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、及び酢酸エチルからなる群から選ばれる少なくとも一種であることが好ましく、ジクロロメタンであることが更に好ましい。非極性溶媒を上記溶媒とすることにより、疎水性基結合ヌクレオシド溶液中における疎水性基結合ヌクレオシドの溶解度が向上し、且つより疎水性が強い疎水性環境を構築することができる。
本発明の疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法においては、非極性溶媒中において、本発明の疎水性基結合ヌクレオシド又は前記疎水性基結合ヌクレオシドが有する5単糖残基の5位の炭素原子に結合する基にヌクレオシドホスホロアミダイト化合物が結合した化合物と、酸・アゾール複合体化合物により活性化されたヌクレオシドホスホロアミダイト化合物と、を液相合成法により結合させる反応を複数回行う段階(以下、「段階A」ともいう)を含み、前記疎水性基結合ヌクレオシド又はこれに結合したヌクレオシド残基の有する5単糖残基の5位の炭素原子と、その5’末端側に隣接するヌクレオシド残基の有する5単糖残基の3位の炭素原子とが、リン酸基を介して連続的に結合した構造を有する疎水性基結合オリゴヌクレオチドを合成する工程(以下、「工程A」ともいう)と、疎水性基結合オリゴヌクレオチドに結合した保護基を脱保護する工程(以下、「工程B」ともいう)と、溶液温度及び/又は溶液組成を変化させることにより、疎水性基結合オリゴヌクレオチドを分離する工程(以下、「工程C」ともいう)と、を有するものである。
(段階A)
段階Aにおいては、まず、本発明の疎水性基結合ヌクレオシドにおける保護基であるYを、酸性溶液を用いて脱保護させ、その後、還元剤を添加することで脱保護反応を停止させる。ここで、酸性溶液に用いられる酸としては、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、モノクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸等を挙げることができる。これらの中でもジクロロ酢酸が好ましい。また、遊離保護基の捕捉剤としては、メタノール、トリエチルシラン、トリイソプロピルシラン、アニソール、チオアニソール、エタンジチオール等を挙げることができるが、メタノール及びトリエチルシランであることが好ましい。保護基であるYを脱保護した場合、下記一般式(1−1)で示される化合物が得られるが、この化合物については、後述する「分離段階」により晶析させて分離・回収することができる。
工程Aは、任意の化学反応の後に、分離段階を有していてもよい。分離段階としては、溶液温度及び/又は溶液組成を変化させる手法を用いる段階を挙げることができる。特に、本発明の疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法においては、上記一般式(1)で示される疎水性基結合ヌクレオシドを用いるので、溶液温度及び/又は溶液温度を変化させる手法を用いる段階により、疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成反応の中間生成物を容易に分離・回収することができる。
溶液温度を変化させる手法としては、特に制限されるものではないが、例えば、反応溶液を冷却する手段を挙げることができる。例えば、疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法の中間生成物を溶解している溶媒としてジクロロメタン/メタノール混合溶液、あるいはジクロロメタン/アセトニトリル混合溶液を用いた場合には、0℃以下に冷却することにより、当該中間生成物を晶析させることが可能となる。
溶液組成を変化させる手法としては、特に制限されるものではないが、例えば、非極性溶媒中に疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法の中間生成物を溶解した溶液に、上記非極性溶媒への親和性の高い溶媒を、更に添加する手法を挙げることができる。この場合、反応溶液が相分離することなく一相のみで維持される。
工程Bにおいては、疎水性基結合オリゴヌクレオチドに結合した保護基を脱保護する。保護基の脱保護については、疎水性基結合オリゴヌクレオチドに結合した保護基の種類・性質に応じて、当業者に周知の手法を適宜用いることができる。
工程Cにおいては、溶液温度及び/又は溶液組成を変化させることにより、疎水性基結合オリゴヌクレオチドを分離する。ここで、工程Cにおいて、溶液温度及び/又は溶液組成を変化させる手法としては、上記工程Aにおける分離段階と同様の条件で行うことができる。
本発明の疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法に用いられる、疎水性基結合ヌクレオシドは、所定の疎水性基を有するため、非極性溶媒中、水の存在しない疎水性環境下でオリゴヌクレオチドの合成反応を行うことができる。このため、疎水性基結合オリゴヌクレオチドの合成の際に用いられるヌクレオシドホスホロアミダイト化合物の、酸・アゾール複合体化合物による活性化が阻害されない。したがって、疎水性基結合オリゴヌクレオチドの合成反応の収率を向上させることができる。
3,4,5−トリス(オクタデシロキシ)安息香酸927.6mg(1mmol)に、4−ブトキシカルボニルピペラジン558.8mg(3mmol)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)405.4mg(3mmol)、2−(1H−1−ベンゾトリアゾリル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸(HBTU)1.1378g(1mmol)、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を523μl(3mmol)を加え、3,4,5−トリス(オクタデシロキシ)安息香酸−4−ブトキシカルボニルピペラジンを合成した。これに4N塩酸を作用させて、3,4,5−トリス(オクタデシロキシ)安息香酸ピペラジン塩酸塩を合成した。
(反応1)
ナスフラスコ容器中に、上記化学式(3)で示される化合物324.4mg(100μmol)をジクロロメタン10mlに溶解させた溶液と、3%トリクロロ酢酸/ジクロロメタン溶液10mlとを投入して均一に撹拌した。これを室温で5分間放置した後、メタノールを添加し、反応溶液の一部を分取して薄層クロマトグラフィーにて反応の完結を確認した。反応溶液をナスフラスコ容器からエバポレーターに移して濃縮し、キリヤマ漏斗を用いた吸引濾過によって、下記化学式(3−1)で示される化合物を得た。
ナスフラスコ容器中に、上記化学式(3−1)で示される化合物295.6mgをジクロロメタン10mlに溶解させた溶液と、チミニル基の5位水酸基がジメトキシトリチル基により保護されたチミジンデオキシリボヌクレオシドホスホロアミダイト333.5mg(2.0当量)と、0.25M 5−ベンジルメルカプト−1H−テトラゾール溶液2mlとを投入して60分間撹拌し、反応溶液の一部を分取して薄層クロマトグラフィーにて反応の完結を確認した。反応溶液をナスフラスコ容器からエバポレーターに移して濃縮し、吸引濾過によって、下記化学式(3−2)で示される化合物を得た。
ナスフラスコ容器中に、上記化学式(3−2)で示される化合物302.1mgをジクロロメタン10mlに溶解させた溶液と、0.02Mヨウ素/水/ピリジン溶液10mlと投入して室温で10分間撹拌した。反応溶液をナスフラスコ容器からエバポレーターで濃縮し、キリヤマ漏斗を用いた吸引濾過によって、下記化学式(3−3)で示される化合物を得た。
反応3で得られる化合物について、反応1から反応3を繰り返して目的とする疎水性基結合オリゴヌクレオチドの10量体r(UACUUCGA)d(TT)に保護基が結合した化合物を得た。ここで、フタ付チューブ容器中に、最終的に得られた上記疎水性基結合オリゴヌクレオチドの10量体と、アンモニア水:エタノール=3:1の溶液1mlとを加え、85℃で90分間加熱した後、反応溶液をフタ付チューブ容器から遠心エバポレーターに移して乾燥させて、下記化学式(3−4)で示される化合物を得た。なお、塩基の極性基に結合した保護基であるフェノキシアセチル基、4−イソプロピルフェノキシアセチル基、アセチル基、リン酸基に結合しているシアノエチル基、及び疎水性基である有機系単分子ナノキャリアは、この操作にて脱保護又は脱離される。
フタ付チューブ容器中に、上記化学式(3−4)で示される化合物5mgをN−メチルピロリドン:トリエチルアミン:3−ヒドロキシフラボン=130:90:100の溶液320μlに溶解させた溶液を投入し、60℃で90分間加熱した後、室温に戻して下記化学式(3−5)で示される化合物の溶液を得た。なお、5単糖残基の2位の水酸基の保護基であるt−ブチルジメチルシリル基は、この操作によって脱保護される。
化学式(3−6)で示される化合物について、HPLC及びMALDI−TOF/MS質量分析装置を用いて、目的とするオリゴヌクレオチドの10量体が得られていることを確認した。疎水性基結合オリゴヌクレオチドの10量体の合成反応全体の反応収率は97.5%であった。
HPLC(shodex ODP(4.6φ×150mm),AcCN,flow rate=1.0mL/min):tR=17.241min(80.13%)
MALDI−TOF/MS:3077.89[M−H]−
実施例1と同様の方法で反応1から反応3を20回ずつ繰り返して、目的とする疎水性基結合オリゴヌクレオチドの21量体(配列r(UCGAAGUACUCAGCGUAAG)−d(TT))に保護基が結合した化合物を得た。この化合物に、脱保護反応1及び脱保護反応2を行って全ての保護基を脱保護し、HPLC及びMALDI−TOF/MS質量分析装置を用いて、目的とするオリゴヌクレオチドの21量体が得られていることを確認した。21量体の疎水性基結合オリゴヌクレオチドの21量体の合成反応全体の反応収率は97.3%であった。
HPLC(shodex ODP(4.6φ×150mm),AcCN,flow rate=1.0mL/min):tR=19.311min(57.29%)
MALDI−TOF/MS:6689.11[M−H]−
Claims (10)
- 下記一般式(1)で示される疎水性基結合ヌクレオシド。
- 上記一般式(1)において、nが3であり、R6が炭素原子数6から30のアルキル基であって、R5に対して3位、4位、及び5位に炭素原子数6から30のアルコキシ基が結合する請求項1に記載の疎水性基結合ヌクレオシド。
- R2が炭素原子数1以上22以下のアルキレン鎖であり、R3及びR4が互いに結合して炭素原子数1以上22以下のアルキレン鎖を形成する請求項1又は2に記載の疎水性基結合ヌクレオシド。
- R1及びR2がエチレン鎖であり、R3及びR4が互いに結合してエチレン鎖を形成し、R5が単結合である請求項1から3のいずれかに記載の疎水性基結合ヌクレオシド。
- Yで示される酸性条件下で脱保護可能な保護基がジメトキシトリチル基である請求項1から4のいずれかに記載の疎水性基結合ヌクレオシド。
- 請求項1から5のいずれかに記載の疎水性基結合ヌクレオシドを非極性溶媒に溶解させた疎水性基結合ヌクレオシド溶液。
- 前記非極性溶媒が、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ベンゼン、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、及び酢酸エチルからなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項6に記載の疎水性基結合ヌクレオシド溶液。
- 非極性溶媒中において、請求項1から5のいずれかに記載の疎水性基結合ヌクレオシド又は前記疎水性基結合ヌクレオシドが有する5単糖残基の5位の炭素原子に結合する基にヌクレオシドホスホロアミダイト化合物が結合した化合物と、酸・アゾール複合体化合物により活性化されたヌクレオシドホスホロアミダイト化合物と、を液相合成法により結合させる反応を複数回行う段階を含み、前記疎水性基結合ヌクレオシド又はこれに結合したヌクレオシド残基の有する5単糖残基の5位の炭素原子と、その5’末端側に隣接するヌクレオシド残基の有する5単糖残基の3位の炭素原子とが、リン酸基を介して連続的に結合した構造を有する疎水性基結合オリゴヌクレオチドを合成する工程と、
疎水性基結合オリゴヌクレオチドに結合した保護基を脱保護する工程と、
溶液温度及び/又は溶液組成を変化させることにより、疎水性基結合オリゴヌクレオチドを分離する工程と、を有する疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法。 - 10量体以上の疎水性基結合オリゴヌクレオチドを97%以上の収率で合成する請求項8に記載のオリゴヌクレオチド合成方法。
- オリゴヌクレオチド合成プラントにおいて行われる請求項8又は9に記載の疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法。
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