JP2006507334A - 2’−o−トリ置換シリルオキシメチル−リボヌクレオシド誘導体およびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、新規な保護基を有するリボヌクレオシド誘導体、および当該リボヌクレオシド誘導体の製造方法を提供する。前記リボヌクレオシド誘導体は一般式(I):
【化1】
[式中、R1は、プリンまたはピリミジンに属する塩基、あるいはかかる塩基の誘導体、もしくは核酸塩基代替物としての役割を果たす他の残基であり、R2は、プロトンまたはホスホン酸の置換誘導体であり、R3は、プロトンまたは5’位にある酸素原子の保護基であり、R4、R5およびR6は、独立してアルキルまたはアリールであるか、またはアルキルおよびアリールまたはヘテロ原子の組合せであり、R4、R5またはR6は、互いに連結して環状であってもよく;そして、ここで、R4、R5またはR6置換基のうち少なくとも1つは、Si原子と隣接する三級炭素原子またはヘテロ原子を含む]
で示される。
【化1】
[式中、R1は、プリンまたはピリミジンに属する塩基、あるいはかかる塩基の誘導体、もしくは核酸塩基代替物としての役割を果たす他の残基であり、R2は、プロトンまたはホスホン酸の置換誘導体であり、R3は、プロトンまたは5’位にある酸素原子の保護基であり、R4、R5およびR6は、独立してアルキルまたはアリールであるか、またはアルキルおよびアリールまたはヘテロ原子の組合せであり、R4、R5またはR6は、互いに連結して環状であってもよく;そして、ここで、R4、R5またはR6置換基のうち少なくとも1つは、Si原子と隣接する三級炭素原子またはヘテロ原子を含む]
で示される。
Description
技術分野
本発明は核酸化学の分野に属し、新規の保護基を有するリボヌクレオシド誘導体の製造方法および使用方法に関する。本発明の化合物は、特にオリゴリボヌクレオチドの自動化された製造方法に適している。
本発明は核酸化学の分野に属し、新規の保護基を有するリボヌクレオシド誘導体の製造方法および使用方法に関する。本発明の化合物は、特にオリゴリボヌクレオチドの自動化された製造方法に適している。
背景技術
合成核酸に関する出願は多くあり、それらは生物学的プロセスの理解の手掛かりとなっている。これらの出願の中で、mRNAに対する合成オリゴヌクレオチドの細胞内での特異的ハイブリダイゼーションによるタンパク質の特異的下方制御を目的とした合成オリゴヌクレオチド使用は、アンチセンス・メカニズムとして知られており、かつ既報(1)により周知である。ごく最近、siRNAとして知られているdsRNAを用いた技術であるRNA干渉が、哺乳動物mRNAのそのタンパク質への翻訳を阻害するために成功裏に用いられた(2)。合成オリゴリボヌクレオチドの効率的かつコスト効率の良い製造方法の開発の必要性から、有望なRNA技術が考案された。
合成核酸に関する出願は多くあり、それらは生物学的プロセスの理解の手掛かりとなっている。これらの出願の中で、mRNAに対する合成オリゴヌクレオチドの細胞内での特異的ハイブリダイゼーションによるタンパク質の特異的下方制御を目的とした合成オリゴヌクレオチド使用は、アンチセンス・メカニズムとして知られており、かつ既報(1)により周知である。ごく最近、siRNAとして知られているdsRNAを用いた技術であるRNA干渉が、哺乳動物mRNAのそのタンパク質への翻訳を阻害するために成功裏に用いられた(2)。合成オリゴリボヌクレオチドの効率的かつコスト効率の良い製造方法の開発の必要性から、有望なRNA技術が考案された。
オリゴリボヌクレオチド合成は、オリゴデオキシヌクレオチド合成よりも難しい。その主な原因は、デオキシリボ核酸には存在しないがリボ核酸に存在する2’−OH基である。オリゴリボヌクレオチドの化学合成は通常、固相上に固定した保護されたリボヌクレオシド誘導体に基づいており、そこに所望の長さの鎖が達成されるまで1つの合成サイクルの連続した工程にて、保護されたリボヌクレオチド誘導体がさらに結合される。効率的な合成を確実にし、そして製造過程中のRNA分解を避けるために、2’−OH基の保護基戦略では、他の保護基と完全に直交(orthogonal)していなければならず、かつ前記保護基はその過程内で可能な限り最後に取り除かれなければならない。これまでに、主に以下タイプの保護基が、2’−OH基の保護に用いられている:
2’−O−TBDMS化学は、RNA合成に関して通常用いられる保護基である(3)。それは、他の保護基と直交している。しかしながら、オリゴリボヌクレオチド合成中における2’−3’リン酸基移行が既報(4)により報告されている。さらに、反応性ホスホアミダイトに近いt−ブチルジメチルシリル基の立体障害が、カップリング効率を著しく低下させる。後者の制限は減少させうるが、その代償として例えば(5)に記載のように、より長いカップリング時間が必要であり、より高いモル過剰の試薬および5−(ベンジルメルカプト)−1H−テトラゾールのような特定のホスホアミダイト活性化剤の使用が必要である。
2’−O−ACE化学は、Caruthersらの既報(6)にTBDMS化学の代替物として記載されている。そこでは、2’−OHは、酸不安定型オルトエステルにより保護されている。TBDMSと比較して、その保護基のより低い障害がより高いカップリング率を可能とする。2’オルトエステルの酸不安定型は、5’−OHの酸不安定型でない一時的な保護を必要とする。これは、フッ素含有溶液によってそれぞれのカップリング・サイクルの最後に除去される三置換シリル基により達成される。その結果、2’−O−ACE構成単位の製造のための試薬は、特別にスケールアップされなければならない。かかる5’脱保護は、いくつかの場合に問題となり得る:例えばフッ素イオンに耐性のある専用の合成装置を必要とし、一般に用いられるシリカベースの支持体(多孔性ガラスビーズ(Controlled Pore Glass)など)の使用は不可能である。
2’−O−TOM化学は、Pitschらの既報(6)により報告されている。2’−OTBDMS保護基戦略に関して、2’−O−TOM保護基は、フッ素イオンで処理して除去される。もともとは、2’−O−TBDMSで観察された2’−3’リン酸基移行なしに長鎖RNAの合成を可能とするために開発された。この場合、ヌクレオシドと保護基間の結合のアセタール特性のために、リボヌクレオシド誘導体の異なる位置、特に3’−O−位置の近隣への保護基の移行は起こりえない。かかる異性化は、2’−O−シリル−置換RNA−ユニットの常套的合成方法における問題として周知である。
2’−O−TOMと2’−O−ACEは共に、オリゴデオキシヌクレオチド合成にて観察されるのに近いカップリング収率を与える。十分なカップリング収率はまた、2’−O−TBDMS化学でも得られるが、その代償として独特の活性化剤の使用が必要であるか、または構成単位のより高モル濃度過剰の使用を必要とする。すべての場合において、記載した構成単位は、オリゴリボヌクレオチドの製造コストに大きく関与している。第二に、オリゴリボヌクレオチドの合成後プロセシングは、オリゴデオキシリボヌクレオチドのプロセシングと比較してより困難である。後者の局面は、要求される高生産性が満たされなければならない場合に特に重要であり得る。
手頃な値段で、かつ容易に合成後プロセシングを達成し得る、改善されたRNA構成単位が必要とされている。
置換シリルオキシメチル基は、既報(7,8)にてヒドロキシル基の保護基として用いられている。Si原子における置換基の立体障害は、保護基の安定性および除去条件を変化させる。例えば、Si原子と隣接する三級炭素を有するシリルオキシメチルが、既報(7)にて報告されており、これらの場合において、保護基の除去率は、一般にTBDMS保護で観察されるものと比較して最適状態には及ばず、そして明らかに固相オリゴリボヌクレオチド合成には適していない。
置換シリルオキシメチル基は、既報(7,8)にてヒドロキシル基の保護基として用いられている。Si原子における置換基の立体障害は、保護基の安定性および除去条件を変化させる。例えば、Si原子と隣接する三級炭素を有するシリルオキシメチルが、既報(7)にて報告されており、これらの場合において、保護基の除去率は、一般にTBDMS保護で観察されるものと比較して最適状態には及ばず、そして明らかに固相オリゴリボヌクレオチド合成には適していない。
本発明はここに、リボヌクレオシド誘導体の2’−OH位を保護する新規かつ改善された基を提供し、それは、特に自動化されたオリゴリボヌクレオチド固相合成に適している。これらの構成単位を製造する新しい方法を提供する。最後に、RNA固相合成におけるこれらの構成単位の使用を開示する。
発明の概要
1つの局面にて、本発明は、式
[式中、
R1は、プリンまたはピリミジンに属する塩基、あるいはかかる塩基の誘導体、もしくは核酸塩基代替物としての役割を果たす他の残基であり、
R2は、プロトンまたはホスホン酸の置換誘導体であり、
R3は、プロトンまたは5’位にある酸素原子の保護基であり、
R4、R5およびR6は、独立してアルキルまたはアリールであるか、またはアルキルおよびアリールまたはヘテロ原子の組合せであり、R4、R5またはR6は、互いに連結して環状であってもよく;
そして
ここで、R4、R5またはR6置換基のうち少なくとも1つは、Si原子と隣接する三級炭素原子またはヘテロ原子を含む。]
で示されるリボヌクレオシド誘導体を提供する。
1つの局面にて、本発明は、式
R1は、プリンまたはピリミジンに属する塩基、あるいはかかる塩基の誘導体、もしくは核酸塩基代替物としての役割を果たす他の残基であり、
R2は、プロトンまたはホスホン酸の置換誘導体であり、
R3は、プロトンまたは5’位にある酸素原子の保護基であり、
R4、R5およびR6は、独立してアルキルまたはアリールであるか、またはアルキルおよびアリールまたはヘテロ原子の組合せであり、R4、R5またはR6は、互いに連結して環状であってもよく;
そして
ここで、R4、R5またはR6置換基のうち少なくとも1つは、Si原子と隣接する三級炭素原子またはヘテロ原子を含む。]
で示されるリボヌクレオシド誘導体を提供する。
好適な局面にて、Si原子と隣接する三級炭素原子を包含する置換基は、炭素原子数4〜24、より好ましくは炭素原子数5〜24、さらにより好ましくは炭素原子数6〜24を含む。より好適な局面にて、Si原子と隣接する三級炭素原子を包含する置換基は、tert−ブチル、tert−ペンチル、tert−ヘキシル、tert−ヘプチル、tert−オクチル、tert−ノニル、tert−デシル、tert−ウンデシル、tert−ドデシルからなる群から選択されるアルキル置換基である。他の好適な局面にて、Si原子と隣接する三級炭素原子を包含する置換基は、1,1−ジメチルエチル、1,1−ジメチル−プロピル、1,1−ジメチル−ブチル、1,1−ジメチル−ペンチル、1,1−ジメチル−ヘキシル、テキシル(1,1,2−トリメチル−プロピル)、1,1,2−トリメチル−ブチル、1,1,2−トリメチル−ペンチル、1,1,2−トリメチル−ヘキシル、1,1,2,2テトラメチル−プロピル、1,1,2,2−テトラメチル−ブチルからなる群から選択される。さらに好適な実施態様にて、上述の基の置換基は少なくとも5つの炭素原子、より好ましくは少なくとも6つの炭素原子を含む。
関連する局面にて、本発明は、Si原子と隣接する置換基が置換ヘテロ原子を含むリボヌクレオシド誘導体を提供する。好適な局面にて、Si原子と隣接する置換基は、置換二価ヘテロ原子を含み、より好適な局面にて、この置換基は酸素である。
他の局面にて、本発明は、リボヌクレオシド誘導体の製造方法であって、
式
[式中、R1およびR3は、上記に定義のとおりである]
で示されるヌクレオシドを、
式
[式中、Yは適した脱離基であり、R4、R5およびR6は、独立してアルキルまたはアリールであるか、あるいはアルキルおよびアリールまたはヘテロ原子の組合せであり、R4、R5またはR6は互いに連結して環状であってもよい]
で示されるシリルオキシメチル誘導体と反応させることを含む方法を提供する。好適な実施態様にて、Yはハロゲンである。他の好適な実施態様にて、R4、R5およびR6は共に、炭素原子数6〜30を含む。さらに好適な実施態様にて、R4、R5およびR6は、少なくとも1つのSi原子と隣接する置換ヘテロ原子を含み、その置換ヘテロ原子は、好ましくは二価原子であり、より好ましくは酸素である。前記リボヌクレオシド誘導体は、ホスホン酸の誘導体を含む群で3’位の酸素をさらに置換されていてよい。
式
で示されるヌクレオシドを、
式
で示されるシリルオキシメチル誘導体と反応させることを含む方法を提供する。好適な実施態様にて、Yはハロゲンである。他の好適な実施態様にて、R4、R5およびR6は共に、炭素原子数6〜30を含む。さらに好適な実施態様にて、R4、R5およびR6は、少なくとも1つのSi原子と隣接する置換ヘテロ原子を含み、その置換ヘテロ原子は、好ましくは二価原子であり、より好ましくは酸素である。前記リボヌクレオシド誘導体は、ホスホン酸の誘導体を含む群で3’位の酸素をさらに置換されていてよい。
本発明のもう1つの局面では、リボヌクレオシド誘導体の製造方法であって、
式
で示されるリボヌクレオシド誘導体を、求電子的活性化させてから、式:
で示される化合物と反応させることを含む方法を提供する
[式中、R1は上記に定義のとおりであり、R7はアルキル基またはアリール基、あるいはアルキル−アリール基であり、
R2は保護基であり、
R3は保護基であり、
R4、R5およびR6は、上記に定義のとおりである]。
式
[式中、R1は上記に定義のとおりであり、R7はアルキル基またはアリール基、あるいはアルキル−アリール基であり、
R2は保護基であり、
R3は保護基であり、
R4、R5およびR6は、上記に定義のとおりである]。
好適な実施態様にて、前記リボヌクレオシド誘導体は、ホスホン酸の誘導体を含む群で3’位の酸素をさらに置換されている。
発明の詳しい説明
略語:
TBDMS t−ブチルジメチルシリル
ACE ビス[2−(アセチルオキシ)エトキシ]メチル
TOM (トリイソプロピルシリル)オキシメチル
THEX [((1,1,2−トリメチル−プロピル)−ジメチルシリル)]−オキシメチル
DCA ジクロロ酢酸
dsRNA 二本鎖RNA
siRNA 小さい干渉RNA(Small interfering RNA)
略語:
TBDMS t−ブチルジメチルシリル
ACE ビス[2−(アセチルオキシ)エトキシ]メチル
TOM (トリイソプロピルシリル)オキシメチル
THEX [((1,1,2−トリメチル−プロピル)−ジメチルシリル)]−オキシメチル
DCA ジクロロ酢酸
dsRNA 二本鎖RNA
siRNA 小さい干渉RNA(Small interfering RNA)
本発明は、以下の一般的な構造式:
[式中、
R1は、プリンまたはピリミジンに属する塩基、あるいはかかる塩基の誘導体、もしくは核酸塩基代替物としての役割を果たす他の残基であり、R2は、プロトンまたはホスホン酸の置換誘導体であり、R3は、プロトンまたは5’位の酸素原子の保護基であり、そして、R4、R5およびR6は、独立してアルキル基またはアリール基であるか、あるいはアルキル−アリール基であり、R4、R5またはR6は、互いに連結して環状であってもよい]
を有するD−またはL−リボース単位を含む、リボ核酸の化学合成に用いるための2’−O−シリルオキシメチル・リボヌクレオチド誘導体に関する。
R1は、プリンまたはピリミジンに属する塩基、あるいはかかる塩基の誘導体、もしくは核酸塩基代替物としての役割を果たす他の残基であり、R2は、プロトンまたはホスホン酸の置換誘導体であり、R3は、プロトンまたは5’位の酸素原子の保護基であり、そして、R4、R5およびR6は、独立してアルキル基またはアリール基であるか、あるいはアルキル−アリール基であり、R4、R5またはR6は、互いに連結して環状であってもよい]
を有するD−またはL−リボース単位を含む、リボ核酸の化学合成に用いるための2’−O−シリルオキシメチル・リボヌクレオチド誘導体に関する。
前記5’−O−位置の保護基R3は、例えば、モノメトキシトリチル基またはジメトキシトリチル基であるか、あるいは異なる、適した基(それは、鎖に付加される次の単位をカップリングするための結合部位を遊離させるために、鎖構築の間に伸長している配列から取り除かれる)である。
リボヌクレオシド誘導体の塩基成分R1は、好ましくはプリンまたはピリミジンに属する塩基、例えば5つの核酸塩基、アデニン、シトシン、チミン、ウラシル、グアニンのうちの1つであるか、またはそれらの誘導体、あるいは核酸塩基の代替物としての役割を果たす他の任意の残基である。それは、鎖構築後に除去され得るアシル−置換基により保護され得る。
3’−O−位置にて、R2は、ホスホン酸の誘導体、例えばN,N−置換ホスホアミダイト基およびO−置換ホスホアミダイト基であり、ここでN−置換基は、さらに置換され得る、および/または互いに連結して環状であり得る、アルキル基またはアリール基である。二置換アミノ基の窒素の活性化により、リン酸化中心は、伸長中の鎖に前記単位をカップリングするために活性化される。
本発明はここに、新しく利点のある2’−O−シリルオキシメチル保護基を提供し、ここで、R4、R5またはR6は、独立してアルキル−置換基またはアリール−置換基であるか、あるいはアルキル−アリール−置換基またはアリール−アルキル−置換基もしくは置換ヘテロ原子置換基であり、そして
R4、R5またはR6置換基のうち少なくとも1つは、式
[式中、R’、R’’およびR’’’は、アルキルまたはアリールであるか、あるいはアルキル−アリール−置換基またはアリール−アルキルもしくは置換ヘテロ原子であり、ここで、R’、R’’およびR’’’はHではなく、R’、R’’およびR’’’は、同一であるかまたは異なっていて良く、炭素原子数1〜12、好ましくは炭素原子数1〜6、より好ましくは炭素原子数1〜4を含む置換基が好適であり、R’、R’’およびR’’’はまた、互いに連結して環状であっても良く、例えばR’は、R’’またはR’’’と連結して環状であってよく、またはR’’は、R’’’と連結して環状であってよい]
で示され得るヘテロ原子または三級炭素原子を含む。好適な実施態様にて、2つの置換基は同一であり、そして炭素原子数1〜6、好ましくは炭素原子数1〜4を含む。3番目の置換基は、好ましくは炭素原子数が少なくとも3、好適には炭素原子数3〜12、より好適には炭素原子数3〜6を含んでなる。
R4、R5またはR6置換基のうち少なくとも1つは、式
で示され得るヘテロ原子または三級炭素原子を含む。好適な実施態様にて、2つの置換基は同一であり、そして炭素原子数1〜6、好ましくは炭素原子数1〜4を含む。3番目の置換基は、好ましくは炭素原子数が少なくとも3、好適には炭素原子数3〜12、より好適には炭素原子数3〜6を含んでなる。
故に、1つの実施態様にて、置換基R4、R5および/またはR6のうち少なくとも1つは(C4〜C24)−三級−アルキルおよび/またはアリールであり、好ましくは(C5〜C18)−三級−アルキルおよび/またはアリールであり、より好ましくは(C6〜C12)−三級−アルキルおよび/またはアリールであり、ここで前記三級炭素原子は、Si原子と隣接している。かかる置換基の例としては、例えば、tert−ブチル、tert−ペンチル、tert−ヘキシル、tert−ヘプチル、tert−オクチル、tert−ノニル、tert−デシル、tert−ウンデシル、tert−ドデシル、テキシル(1,1,2−トリメチル−プロピル)、1,1,2−トリメチル−ブチル、1,1,2−トリメチル−ペンチル、1,1,2−トリメチル−ヘキシル、1,1,2,2−テトラメチル−プロピル、1,1,2,2−テトラメチル−ブチルが含まれ得るが、これらの基に限定されることを意図しない。好適な実施態様にて、前記置換基は、tert−ペンチルまたはより高級な基であり、より好適な実施態様にて、前記置換基は、tert−ヘキシルまたはより高級な基である。より好適な例としては、例えば、1,1−ジメチル−エチル、1,1−ジメチル−プロピル、1,1−ジメチル−ブチル、1,1−ジメチル−ペンチル、1,1−ジメチル−ヘキシル、1,1,2−トリメチル−プロピル、1,1,2−トリメチル−ブチル、1,1,2−トリメチル−ペンチル、1,1,2−トリメチル−ヘキシル、1,1,2,2−テトラメチル−プロピル、1,1,2,2−テトラメチル−ブチルが含まれる。他の実施態様にて、R4、R5および/またはR6は、ヘテロ原子を含む。
三級炭素原子を含まない置換基(複数可)は、同一または異なる置換基であってよい。これらの置換基は、好ましくはアルキル−置換基またはアリール−置換基であるか、あるいはアルキル−アリール−置換基である。好適には、置換基が炭素原子数1〜12、好ましくは炭素原子数1〜8、より好ましくは炭素原子数1〜4を含む。かかる置換基の例としては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、i−プロピル、sec−ブチル、イソブチル、sec−ペンチルが含まれるが、これらの基に限定されることを意図しない。
他の実施態様にて、R4、R5および/またはR6は、置換ヘテロ原子、例えばシリコン、ゲルマニウム、錫、鉛、窒素、酸素、硫黄を含み、例えば、
式:
[式中、Xは、SiまたはGe、SnあるいはPbであり、R’、R’’およびR’’’は式2に定義のとおりであり、そしてR4およびR6は上記に定義にとおりである]
で示される「四価」ヘテロ原子として表すことができる。置換基R4、R5またはR6のいずれかは、Si原子と隣接するヘテロ原子を含んでいてよく、好適には1つのみが、式3に例示したとおりである。酸素のような「二価」ヘテロ原子、あるいは窒素のような三価ヘテロ原子について、式3を、当業者に容易に理解されるように適合させてよい。本発明の好適な実施態様にて、Xは酸素である。
式:
で示される「四価」ヘテロ原子として表すことができる。置換基R4、R5またはR6のいずれかは、Si原子と隣接するヘテロ原子を含んでいてよく、好適には1つのみが、式3に例示したとおりである。酸素のような「二価」ヘテロ原子、あるいは窒素のような三価ヘテロ原子について、式3を、当業者に容易に理解されるように適合させてよい。本発明の好適な実施態様にて、Xは酸素である。
前記化合物は、当業者に周知の方法、例えば有機金属経路を介して製造され得る。この経路は、例えば国際特許出願WO99/09044号に記載されている(6)。反応4→5a/5b→6は、有機金属経路を介して本発明の化合物を製造する例である。簡単に説明すると、5’−Oのリボヌクレオシド保護は、例えば、本発明の適切な有機金属塩、例えばジブチル錫ジクロイドまたはジブチル錫オキシド中におけるクロロメチル[ジメチル−(1,1,2−トリメチルプロピル)シリル]エーテル(またはTHEX−Cl)と反応させる。THEX−Cl自身は、既報(7)の方法に従ってTOM−Clと同様の方法で製造される。しかしながら、TOM−Clとは異なっており、THEX−Clの製造では、リボヌクレオシドとの反応の前に最終的な蒸留工程が必要なく、そのことは大幅な簡略化を意味する。5’−O−保護リボヌクレオシドとTHEX−Clの反応にて、2’−および3’−保護リボヌクレオシドの混合物が得られ、ここで2’−置換リボヌクレオシドは、例えばクロマトグラフィー法により精製される。次工程にて、精製した化合物5aの3’−OH基は、当業者に周知の方法に従いホスホアミダイト6に変換される(Sinha,N.D.et al.,Tetrahedron Lett.1983,24,5843; Sinha, N.D.et al.,Nucleic Acid Res.1984,12,4539)。
この方法は、置換シリルオキシメチル・エーテル(ここに、置換基が、アルキル、アリールまたはアリールアルキル基を含み、そして互いに連結して環状であってよい)の使用を必要とする。さらなる実施態様にて、この方法は、シリルオキシメチルエーテル(ここに、置換基のうち少なくとも1つが、例えばシリコン、ゲルマニウム、錫、鉛、窒素、酸素、硫黄などの少なくとも1つの置換ヘテロ原子を含む)に応用することができる。
前記反応は、溶液中でまたは固相上で、あるいはポリマー担持試薬の使用により実施できる。溶媒は、炭化水素溶媒、エーテル溶媒、ニトリル溶媒、塩素化溶媒、ヘテロ環式溶媒、スルホキシド溶媒などであり得る。適切な溶媒の特定の例としては、ピリジン、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)、テトラヒドロフラン(THF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトニトリル、ジクロロエタンおよび塩化メチレンが含まれる。ジクロロエタンの使用が、好ましい。
前記反応は、室温で実施され得るが、0〜150℃の温度で、好ましくは10〜100℃の温度で実施されてもよい。
本方法は、2’−O−アルキルチオメチル基、アリールチオメチル基、アルキルアリールチオメチル基またはアリールアルキルチオメチル基をまず用いることにより2’−OH保護基の選択的導入を可能にする。それは、有機金属経路に記載の非選択的工程を避ける。この新しい方法は、一般的に、リボヌクレオシドの2’−OH基に選択的にオキシメチル誘導体を導入することに適用可能であり、それは上記のような保護基の導入に限られない。保護されたリボヌクレオチドの製造方法は、現在、例えば有機金属経路として当業者に周知であり、それは、保護基の導入に関して2’−3’選択性はない。この方法は、2’位にメチルチオメチル基を選択的に導入することを可能にし、それにより合成スキームの最後の非選択的工程を避けることが可能となる。
この新しい経路にて、
式
[式中、R7は、アルキルまたはアリールであるか、アルキルおよびアリールの組合せである]
で示され得る2’−O−アルキルチオメチル−リボヌクレオシドを、一般式HOSiR4R5R6のシラノールと反応させる。好適な実施態様にて、R7は(C1〜C20)−であり、より好適には(C1〜C10)−アルキルおよび/またはアリールである。他の好適な実施態様にて、R7は、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、イソ−プロピル、sec−ブチル、イソ−ブチル、sec−ペンチルである。シラノールの置換基R4、R5およびR6は、同一または異なるアルキルまたはアリールであるか、あるいはアルキル置換基およびアリール置換基の組合せであり、または置換ヘテロ原子であり、そして互いに連結して環状であってもよい。好適な実施態様にて、3つの置換基は共に、それぞれ炭素原子数3〜30を含んでなる。
式
で示され得る2’−O−アルキルチオメチル−リボヌクレオシドを、一般式HOSiR4R5R6のシラノールと反応させる。好適な実施態様にて、R7は(C1〜C20)−であり、より好適には(C1〜C10)−アルキルおよび/またはアリールである。他の好適な実施態様にて、R7は、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、イソ−プロピル、sec−ブチル、イソ−ブチル、sec−ペンチルである。シラノールの置換基R4、R5およびR6は、同一または異なるアルキルまたはアリールであるか、あるいはアルキル置換基およびアリール置換基の組合せであり、または置換ヘテロ原子であり、そして互いに連結して環状であってもよい。好適な実施態様にて、3つの置換基は共に、それぞれ炭素原子数3〜30を含んでなる。
他の好適な実施態様にて、化合物11を、上記に定義した置換基R4、R5、R6を有する一般式HOSiR4R5R6のシラノールと、当業者に周知の適切な条件下で反応させる。これらは、求電子的活性化試薬、または限定されないが、例えばN−ハロスクシンイミドおよび触媒量の酸などの試薬の組合せを含む。前記反応は、溶液中でまたは固相上で、あるいはポリマー担持試薬を用いて実施され得る。溶媒は、炭化水素溶媒、エーテル溶媒、ニトリル溶媒、塩素化溶媒、ヘテロ環式溶媒、スルホキシド溶媒などであり得る。適切な溶媒の特定の例としては、ピリジン、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)、テトラヒドロフラン(THF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトニトリル、ジクロロエタンおよび塩化メチレンが含まれる。ジクロロエタンの使用が、好ましい。前記反応は、室温で実施され得るが、−78℃〜100℃の温度で、好ましくは0〜50℃の温度で実施されてもよい。
2’−OH基のアルキルチオメチル−置換基は、好ましくは(C1〜C12)−アルキル基および/またはアリール基、好ましくは(C1〜C6)−アルキル基および/またはアリール基を含む。好適な置換基の例としては、メチルチオメチル、エチルチオメチル、プロピルチオメチル、イソプロピルチオメチルまたはブチルチオメチルを含む。
以下の実施例は、本発明を例示するものであり、いかなる場合もその範囲を限定するものではない。
実施例
1. 有機金属経路によるTHEX構成単位の製造
スキーム1は、5’−O−DMTrウリジンのTHEX保護基の導入、およびそれに続くホスフィチレーション(phosphitylation)に関する合成スキームを示す。
(1,1,2−トリメチル−プロピル)−ジメチルシリルオキシメチル・クロリド(THEX−Cl)の製造
エタンチオール 11.1ml(0.15mol)およびパラホルムアルデヒド 4.5g(0.15mol)の懸濁液を、NaOMe/MeOH(30%)2滴で処理し、40℃で1時間撹拌した。冷却後、CH2Cl2 150mlおよびイミダゾール22.66g(0.333mol)を添加した。10分後、(1,1,2−トリメチル−プロピル)−ジメチルシリル・クロリド 32.66g(0.167mol)を滴下添加した。生じた懸濁液を室温で24時間撹拌し、n−ヘキサン 300mlで希釈した。2M NaH2PO4溶液 200mlを添加後、撹拌し(15分間)、相を分離し、有機相をNa2SO4で濃縮乾燥した。残渣をCH2Cl2 100mlに溶解し、塩化スルフリル 12.3ml(20.4g、0.152mol)をCH2Cl2 50ml中に滴下処理した。1時間後、混合液を濃縮した。産物を、蝋状物として得た(31.5g)。
1H-NMR (400 MHz,CDCl3):0.5 (s,6H,SiMe2); 0.65 (12H,CH3);1.40 (sept,1H,CH);5.43 (s,2H,CH2)
1. 有機金属経路によるTHEX構成単位の製造
スキーム1は、5’−O−DMTrウリジンのTHEX保護基の導入、およびそれに続くホスフィチレーション(phosphitylation)に関する合成スキームを示す。
(1,1,2−トリメチル−プロピル)−ジメチルシリルオキシメチル・クロリド(THEX−Cl)の製造
エタンチオール 11.1ml(0.15mol)およびパラホルムアルデヒド 4.5g(0.15mol)の懸濁液を、NaOMe/MeOH(30%)2滴で処理し、40℃で1時間撹拌した。冷却後、CH2Cl2 150mlおよびイミダゾール22.66g(0.333mol)を添加した。10分後、(1,1,2−トリメチル−プロピル)−ジメチルシリル・クロリド 32.66g(0.167mol)を滴下添加した。生じた懸濁液を室温で24時間撹拌し、n−ヘキサン 300mlで希釈した。2M NaH2PO4溶液 200mlを添加後、撹拌し(15分間)、相を分離し、有機相をNa2SO4で濃縮乾燥した。残渣をCH2Cl2 100mlに溶解し、塩化スルフリル 12.3ml(20.4g、0.152mol)をCH2Cl2 50ml中に滴下処理した。1時間後、混合液を濃縮した。産物を、蝋状物として得た(31.5g)。
1H-NMR (400 MHz,CDCl3):0.5 (s,6H,SiMe2); 0.65 (12H,CH3);1.40 (sept,1H,CH);5.43 (s,2H,CH2)
1−[5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−O−[((1,1,2−トリメチル−プロピル)−ジメチルシリル)]−オキシメチル−ベータ−D−リボフラノシル]−ウラシル(5a)の製造
1,2−ジクロロエタン 200ml中5’−O−ジメトキシトリチル化ウリジン(1)9.5g(17.4mmol)の溶液を、ヒューニッヒの塩基 11.23g(87mmol)で処理し、その後、ジブチル−錫ジクロリド 5.81g(19.2mmol)で処理した。30分後、混合液を80℃に加熱し、ジクロロエタン 50ml中(1,1,2−トリメチル−プロピル)−ジメチルシリルオキシメチル・クロリド(THEX−Cl)4.2g(22.6mmol)で処理し、80℃で2時間撹拌した。冷却後、混合液をCH2Cl2 400mlで希釈し、飽和NaHCO3水溶液 350mlを添加した。30分撹拌後、相を分離し、有機相を濃縮した。残渣を、0.1%N−メチルモルホリンを含む酢酸エチル/ヘキサン(3:1)を用いて、シリカゲル上でクロマトグラフィーした。産物を、固形泡状物で得た(4.52g)。
1H-NMR (400 MHz,CDCl3):0.1 (s,6H,CH3);0.6−0.8 (sおよびd,12H,CH3);1.45 (m,1H,CH);3.15 (d,2H,CH2);3.64 (s,6H,OCH3);3.85 (q,2H,CH2);4.05 (m,1H,CH);4.15 (m,1H,CH);4.80 (q,2H,CH2);5.12 (d,1H,OH);5.30 (q,1H,CH);5.78 d,1H CH);6.8−5.3 (m,13H);7.6 (d.1H)
1,2−ジクロロエタン 200ml中5’−O−ジメトキシトリチル化ウリジン(1)9.5g(17.4mmol)の溶液を、ヒューニッヒの塩基 11.23g(87mmol)で処理し、その後、ジブチル−錫ジクロリド 5.81g(19.2mmol)で処理した。30分後、混合液を80℃に加熱し、ジクロロエタン 50ml中(1,1,2−トリメチル−プロピル)−ジメチルシリルオキシメチル・クロリド(THEX−Cl)4.2g(22.6mmol)で処理し、80℃で2時間撹拌した。冷却後、混合液をCH2Cl2 400mlで希釈し、飽和NaHCO3水溶液 350mlを添加した。30分撹拌後、相を分離し、有機相を濃縮した。残渣を、0.1%N−メチルモルホリンを含む酢酸エチル/ヘキサン(3:1)を用いて、シリカゲル上でクロマトグラフィーした。産物を、固形泡状物で得た(4.52g)。
1H-NMR (400 MHz,CDCl3):0.1 (s,6H,CH3);0.6−0.8 (sおよびd,12H,CH3);1.45 (m,1H,CH);3.15 (d,2H,CH2);3.64 (s,6H,OCH3);3.85 (q,2H,CH2);4.05 (m,1H,CH);4.15 (m,1H,CH);4.80 (q,2H,CH2);5.12 (d,1H,OH);5.30 (q,1H,CH);5.78 d,1H CH);6.8−5.3 (m,13H);7.6 (d.1H)
1−[5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−O−[((1,1,2−トリメチル−プロピル)−ジメチルシリル)]−オキシメチル−ベータ−D−リボフラノシル]−ウラシル−3’−(2−シアノエチルジイソプロピル)ホスホアミダイト(6)の製造
CH2Cl2 150ml中保護されたウリジン(2)4.0g(5.56mmol)、ジイソプロピルアミノテトラゾリド 1.14g(6.68mmol)およびビス(N,N−ジイソプロピルアミノ)−2−シアノエトキシ・ホスフィン 2.01g(6.68mmol)の溶液を、室温で24時間撹拌した。混合液をCH2Cl2 100mlで希釈し、飽和NaHCO3水溶液50mlで2度洗浄した。乾燥した(Na2SO4)有機相を濃縮し、その後、残渣を、カラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン、3:2。0.1%N−メチルモルホリンを添加)した。産物を固形泡状物で得た(4.12g)。
31P-NMR (400 MHz,CDCl3):151.183 (秒)および151.537 (秒)
CH2Cl2 150ml中保護されたウリジン(2)4.0g(5.56mmol)、ジイソプロピルアミノテトラゾリド 1.14g(6.68mmol)およびビス(N,N−ジイソプロピルアミノ)−2−シアノエトキシ・ホスフィン 2.01g(6.68mmol)の溶液を、室温で24時間撹拌した。混合液をCH2Cl2 100mlで希釈し、飽和NaHCO3水溶液50mlで2度洗浄した。乾燥した(Na2SO4)有機相を濃縮し、その後、残渣を、カラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン、3:2。0.1%N−メチルモルホリンを添加)した。産物を固形泡状物で得た(4.12g)。
31P-NMR (400 MHz,CDCl3):151.183 (秒)および151.537 (秒)
2. 2’−O−メチルチオメチル経路によるTHEX構成単位の製造
3’,5’−O−ジアセチル−2’−O−メチルチオメチル−ウリジン(8)
ピリジン 50ml中2’−O−メチルチオメチル・ウリジン7(8)4.53g(14.8mmol)の溶液を、Ac2O 3.04g(29.7mmol)で処理した。24時間撹拌後、溶液を濃縮した。残渣をEtOAc40mlで希釈し、水で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。濃縮後、純粋な標記化合物を得た(5.05g)。
3’,5’−O−ジアセチル−2’−O−メチルチオメチル−ウリジン(8)
ピリジン 50ml中2’−O−メチルチオメチル・ウリジン7(8)4.53g(14.8mmol)の溶液を、Ac2O 3.04g(29.7mmol)で処理した。24時間撹拌後、溶液を濃縮した。残渣をEtOAc40mlで希釈し、水で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。濃縮後、純粋な標記化合物を得た(5.05g)。
3’,5’−O−ジアセチル−2’−O−[((1,1,2−トリメチル−プロピル)−ジメチルシリル)−オキシメチル]−ウリジン(9)
THF 3ml中 N−ヨードスクシンイミド 0.33g(1.47mmol)を、0.5g(1.287mmol)の8、(1,1,2−トリメチル−プロピル)−ジメチル・シラノール 0.978g(6.1mmol)、CH2Cl2 10mlおよびMeOSO3H 1滴の溶液に添加した。2時間撹拌後、NaHSO3(37%)2mlを添加し、その後CH2Cl2 100mlを添加した。有機相を分離し、Na2SO4で乾燥した。ろ過後、溶液を濃縮し、552mgの純粋な標記化合物を得た。
THF 3ml中 N−ヨードスクシンイミド 0.33g(1.47mmol)を、0.5g(1.287mmol)の8、(1,1,2−トリメチル−プロピル)−ジメチル・シラノール 0.978g(6.1mmol)、CH2Cl2 10mlおよびMeOSO3H 1滴の溶液に添加した。2時間撹拌後、NaHSO3(37%)2mlを添加し、その後CH2Cl2 100mlを添加した。有機相を分離し、Na2SO4で乾燥した。ろ過後、溶液を濃縮し、552mgの純粋な標記化合物を得た。
2’−O−[((1,1,2−トリメチル−プロピル)−ジメチルシリル)−オキシメチル]−ウリジン(10)
187mg(0.37mmol)の9、MeOH 20mlおよびNaOMe/MeOH(30%)0.135ml(0.74mmol)の溶液を、0℃で30分撹拌した。濃縮後、残渣を小さなシリカゲルカラム(EtOAc/MeOH、4:1)に通してろ過し、粉末として140mgの10を得た。
187mg(0.37mmol)の9、MeOH 20mlおよびNaOMe/MeOH(30%)0.135ml(0.74mmol)の溶液を、0℃で30分撹拌した。濃縮後、残渣を小さなシリカゲルカラム(EtOAc/MeOH、4:1)に通してろ過し、粉末として140mgの10を得た。
3. ホスホアミダイト化学によるオリゴデオキシヌクレオチド中への6の挿入、およびその早い脱保護の方法
オリゴヌクレオチド合成は典型的に、ABI394自動化DNA合成装置(Applied Biosystems)にて行った。DNAホスホアミダイト、THEX保護したウリジン・ホスホアミダイト(6)またはTOM保護したウリジン・ホスホアミダイト(Xeragon, Inc.)を、5%w/v濃度で乾燥アセトニトリル中に溶解した;カップリングを、アセトニトリル中0.2Mのベンズイミダゾリウム トリフレート(9)溶液を用いたホスホアミダイトの活性化により行った。カップリング時間は、1〜5分であった。最初のカップリングを、標準的なカップリング試薬を用いて行った。酸化を、THF/水/ピリジン(1:1:1)中0.1Mヨウ素溶液を用いて行った。2番目のカップリングを酸化の後に行った。次のカップリングの前の脱トリチル化を、ジクロロエタン中2%ジクロロ酢酸で行った。
オリゴヌクレオチド合成は典型的に、ABI394自動化DNA合成装置(Applied Biosystems)にて行った。DNAホスホアミダイト、THEX保護したウリジン・ホスホアミダイト(6)またはTOM保護したウリジン・ホスホアミダイト(Xeragon, Inc.)を、5%w/v濃度で乾燥アセトニトリル中に溶解した;カップリングを、アセトニトリル中0.2Mのベンズイミダゾリウム トリフレート(9)溶液を用いたホスホアミダイトの活性化により行った。カップリング時間は、1〜5分であった。最初のカップリングを、標準的なカップリング試薬を用いて行った。酸化を、THF/水/ピリジン(1:1:1)中0.1Mヨウ素溶液を用いて行った。2番目のカップリングを酸化の後に行った。次のカップリングの前の脱トリチル化を、ジクロロエタン中2%ジクロロ酢酸で行った。
オリゴヌクレオチド鎖伸長の完了後、固体支持体をエッペンドルフチューブに移した。
THEX保護したウリジン・ホスホアミダイト(6)で製造した場合、以下のようにオリゴヌクレオチドを支持体から切断し、脱保護した:
1. 32%アンモニア水溶液/EtOH、3:1(0.2μmoleスケールにつき250μl)、室温、2時間、凍結乾燥乾固。
2. THF中1Mテトラブチル・フッ化アンモニウム(0.2μmoleスケールにつき250μl)、30分、室温。
3. 1M Tris.HCl、pH=7.4(0.2μmoleスケールにつき250μl)。
TOM保護したウリジン・ホスホアミダイトで製造した場合、以下のようにオリゴヌクレオチドを支持体から切断し、脱保護した:
1. 32%アンモニア水溶液/EtOH、3:1(0.2μmoleスケールにつき250μl)、室温、2時間、凍結乾燥乾固。
2. THF中1Mテトラブチル・フッ化アンモニウム(0.2μmoleスケールにつき250μl)、6時間、室温。
3. 1M Tris.HCl、pH=7.4(0.2μmoleスケールにつき250μl)。
THEX保護したウリジン・ホスホアミダイト(6)で製造した場合、以下のようにオリゴヌクレオチドを支持体から切断し、脱保護した:
1. 32%アンモニア水溶液/EtOH、3:1(0.2μmoleスケールにつき250μl)、室温、2時間、凍結乾燥乾固。
2. THF中1Mテトラブチル・フッ化アンモニウム(0.2μmoleスケールにつき250μl)、30分、室温。
3. 1M Tris.HCl、pH=7.4(0.2μmoleスケールにつき250μl)。
TOM保護したウリジン・ホスホアミダイトで製造した場合、以下のようにオリゴヌクレオチドを支持体から切断し、脱保護した:
1. 32%アンモニア水溶液/EtOH、3:1(0.2μmoleスケールにつき250μl)、室温、2時間、凍結乾燥乾固。
2. THF中1Mテトラブチル・フッ化アンモニウム(0.2μmoleスケールにつき250μl)、6時間、室温。
3. 1M Tris.HCl、pH=7.4(0.2μmoleスケールにつき250μl)。
生じた粗溶液を、キャピラリー・ゲル電気泳動により分析した。
結果を表1にまとめた。
表1、および図1〜4に示したように、THEX保護したウリジン・ホスホアミダイト6およびTOM保護したウリジン・ホスホアミダイトで得られた粗物質の量は、ほとんど同じであった。
2’−O−THEX保護基の方法の使用は、35℃で6時間(既報6に記載のように)〜室温で30分間に、2’脱保護の縮小を可能とした。
結果を表1にまとめた。
表1、および図1〜4に示したように、THEX保護したウリジン・ホスホアミダイト6およびTOM保護したウリジン・ホスホアミダイトで得られた粗物質の量は、ほとんど同じであった。
2’−O−THEX保護基の方法の使用は、35℃で6時間(既報6に記載のように)〜室温で30分間に、2’脱保護の縮小を可能とした。
参考文献
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2. Elbashir, Sayda M.; Harborth, Jens; Lendeckel, Winfried; Yalcin, Abdullah; Weber, Klaus; Tuschl, Thomas. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature (London, United Kingdom) (2001), 411(6836), 494-498.
3. Usman, N.; Ogilvie, K. K.; Jiang, M. Y.; Cedergren, R. J.. The automated chemical synthesis of long oligoribuncleotides using 2'-O-silylated ribonucleoside 3'-O-phosphoramidites on a controlled-pore glass support: synthesis of a 43-nucleotide sequence similar to the 3'-half molecule of an Escherichia coli formylmethionine tRNA. J. Am. Chem. Soc. (1987), 109(25), 7845-54.
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7. Gundersen, Lise Lotte; Benneche, Tore; Undheim, Kjell. Chloromethoxysilanes as protecting reagents for sterically hindered alcohols. Acta Chem. Scand. (1989), 43(7), 706-9.
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9. Hayakawa, Yoshihiro; Kataoka, Masanori; Noyori, Ryoji. Benzimidazolium Triflate as an Efficient Promoter for Nucleotide Synthesis via the Phosphoramidite Method. Journal of Organic Chemistry (1996), 61(23), 7996-7997.
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Claims (17)
- Si原子と隣接する三級炭素原子を包含する前記置換基が、4〜24個の炭素原子を含んでなる、請求項1記載のリボヌクレオシド誘導体。
- Si原子と隣接する三級炭素原子を包含する前記置換基が、tert−ブチル、tert−ペンチル、tert−ヘキシル、tert−ヘプチル、tert−オクチル、tert−ノニル、tert−デシル、tert−ウンデシル、tert−ドデシルからなる群から選択されるアルキル置換基である、請求項1または2記載のリボヌクレオシド誘導体。
- Si原子と隣接する三級炭素原子を包含する前記置換基が、1,1−ジメチルエチル、1,1−ジメチル−プロピル、1,1−ジメチル−ブチル、1,1−ジメチル−ペンチル、1,1−ジメチル−ヘキシル、1,1,2−トリメチル−プロピル、1,1,2−トリメチル−ブチル、1,1,2−トリメチル−ペンチル、1,1,2−トリメチル−ヘキシル、1,1,2,2テトラメチル−プロピル、1,1,2,2−テトラメチル−ブチルからなる群から選択される、請求項1、2または3記載のリボヌクレオシド誘導体。
- Si原子と隣接する前記置換基が置換ヘテロ原子を含んでなる、請求項1記載のリボヌクレオシド誘導体。
- Si原子と隣接する前記置換基が置換二価ヘテロ原子を含んでなる、請求項5記載のリボヌクレオシド誘導体。
- 前記ヘテロ原子が酸素である、請求項6記載のリボヌクレオシド誘導体。
- 前記Yがハロゲンである請求項8記載の方法。
- 前記R4、R5およびR6が合わせて、3〜30個の炭素原子を含んでなる、請求項8または9記載の方法。
- 前記R4、R5またはR6が、Si原子と隣接する少なくとも1つの置換ヘテロ原子を含んでなる、請求項8または9記載の方法。
- 前記ヘテロ原子が二価原子である、請求項11記載の方法。
- 前記ヘテロ原子が酸素である、請求項12に記載の方法。
- 前記リボヌクレオシド誘導体が、ホスホン酸の誘導体を包含する群で3’位の酸素をさらに置換されてなる、請求項11、12または13記載の方法。
- R4、R5およびR6が請求項1〜7に定義のとおりである、請求項15記載の方法。
- 前記リボヌクレオシド誘導体が、ホスホン酸の誘導体を包含する群で3’位の酸素をさらに置換されてなる、請求項15または16記載の方法。
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