JP5360763B2 - 核酸固相合成用リンカー及び担体 - Google Patents

Description

本発明は、核酸固相合成に用いるリンカー、該リンカーを担持してなる固相合成用担体、及び該担体を用いた核酸の製造方法に関する。

ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の化学合成には、ホスホロアミダイト法を用いた固相合成法が広く用いられている。固相ホスホロアミダイト法では、概ね以下の工程により核酸合成を行う。
先ず、合成する核酸の３'末端になるヌクレオシドを、スクシニル基などの開裂性リンカーと、３'−ＯＨ基を介してエステル結合させ、固相合成用担体上にあらかじめ担持させる（ヌクレオシドリンカー）。次に、このヌクレオシドリンカーが担持された固相合成用担体を、反応カラムに入れ、核酸自動合成装置にセットする。
以降は核酸自動合成装置の合成プログラムに従い、反応カラム中、一般に以下の工程：
（１）トリクロロ酢酸／ジクロロメタン溶液などの酸により保護ヌクレオシドの５'−ＯＨ基の脱保護を行う工程；
（２）ヌクレオシドホスホロアミダイト（核酸モノマー）を活性化剤（テトラゾール等）の存在下、脱保護した５'−ＯＨ基ヘのカップリングを行う工程；
（３）無水酢酸などにより未反応の５'−ＯＨ基をキャップする工程；及び
（４）含水ヨウ素などによりホスファイトを酸化する工程：からなる合成反応が行われる。この合成サイクルを繰り返し、３'末端から５'末端方向にオリゴヌクレオチドの伸長反応を進めることで、目的の配列を持った核酸が合成される。
最後に、アンモニア水やメチルアミン溶液などにより開裂性リンカーを加水分解させ、合成した核酸を固相合成用担体から切り離す（非特許文献１）。

ところで上記のような合成を行う場合、前述したように、出発物質である３'末端となるヌクレオシドを、開裂性リンカーを介してあらかじめ固相合成用担体に担持しておく必要がある。しかも、合成したい核酸の配列により３'末端は異なり、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの場合はｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴの４種類が、ＲＮＡの場合にもｒＡ、ｒＧ、ｒＣ、ｒＵの４種類が必要となり、さらに修飾オリゴヌクレオチドを合成する場合には修飾されたヌクレオシドをあらかじめ担持した固相合成用担体が必要になり煩雑であった。

そこで前記の問題点を克服するため、固相担体と出発物質を繋ぐリンカーとして、これまで一般に用いられてきたヌクレオシド・スクシニルリンカー等に替わり、ユニバーサルリンカーを担持した固相合成用担体（ユニバーサルサポート）が考案されている。ユニバーサルサポートを用いると、合成したい核酸の３’末端がどのような種類のヌクレオシド又はヌクレオチドであっても、３’末端になるヌクレオシドホスホロアミダイドを通常の核酸自動合成と同じ工程で反応させて合成を開始し、目的の核酸を合成した後、通常と同様の方法で固相合成用担体から切り出すだけであり、前述のように種々のヌクレオシド−リンカーを担持した固相合成用担体を準備する必要がない。

合成したい核酸の３’末端を−ＯＨ基にするユニバーサルサポートがいくつか提案されている（特許文献１〜４並びに非特許文献２及び３）。これらのユニバーサルサポートの構造中には、隣り合う２個の炭素原子が有り、一方の炭素原子には核酸合成の開始点となる−ＯＨ基が、もう一方の炭素原子には保護基を外すと求核基となる基（例えば−ＯＨ基、−ＮＨ_２基、−ＳＨ基）が結合されており、核酸合成後のアンモニア水などによる核酸の切出し時に、これらの求核基の保護基も外れて３'末端のリンを攻撃し、シクロリン酸を生成する形で３'末端からリン酸基が切り離される。いずれも３'末端が−ＯＨ基となる核酸の合成に用いられる。

また、合成したい核酸の５'末端又は３'末端をリン酸基にするユニバーサルサポートがいくつか提案されている。例えば、特許文献５及び非特許文献４には、５'末端にリン酸基を有する核酸を合成可能なユニバーサルリンカー、該ユニバーサルリンカーを担持してなるユニバーサルサポート、及び該ユニバーサルサポートを用いた核酸合成法が開示されている。
５'末端又は３'末端にリン酸基を有する核酸は、核酸の化学的連結反応、末端リン酸基を利用した核酸の修飾、核酸の構造研究等、生化学の諸分野において幅広く用いられるため、非常に有用である。このような経緯から、５'末端又は３'末端にリン酸基を有する核酸を合成可能なユニバーサルリンカー及び該リンカーを担持してなるユニバーサルサポートが、求められている。

米国第５６８１９４５号公報 米国第６６５３４６８号公報 国際公開第２００５／０４９６２１号公報 米国第２００５／０１８２２４１号公報 米国第５９５９０９０号公報

Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry（2000） Bio Techniques，22，752-756（1997） Tetrahedron，57，4977-4986（2001） Tetrahedron Letters, 27:4705-4708 (1986)

本発明は、３'末端にリン酸基を有する核酸を合成可能なユニバーサルリンカー、該リンカーを担持してなるユニバーサルサポート、及び該ユニバーサルサポートを用いた核酸の合成法を提供することを目的とする。
特に、本発明は、修飾オリゴヌクレオチドを合成する場合にも修飾されたヌクレオシドをあらかじめ担持した固相合成用担体を用意する必要がなく、ユニバーサルに、３'末端にリン酸基を有する核酸を高純度で合成できる固相合成用担体を提供することを目的とする。

すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕下記一般式

〔式中、
Ｘは、酸により脱離する水酸基の保護基を表し、
Ｌは、アルカリにより切断される連結部分を表し、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基又はハロゲン原子を表す。〕
で示される化合物からなる、核酸固相合成用リンカー。
〔２〕Ｌがスクシニル基である、上記〔１〕に記載の核酸固相合成用リンカー。
〔３〕Ｘがジメトキシトリチル基である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の核酸固相合成用リンカー。
〔４〕下記一般式

〔式中、
Ｘは、酸により脱離する水酸基の保護基を表し、
Ｌは、アルカリにより切断される連結部分を表し、
Ｓｐは、固相担体を表し、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基又はハロゲン原子を表す。〕
で示される構造を有する、核酸固相合成用担体。
〔５〕Ｌがスクシニル基である、上記〔４〕に記載の核酸固相合成用担体。
〔６〕Ｘがジメトキシトリチル基である、上記〔４〕又は〔５〕に記載の核酸固相合成用担体。
〔７〕Ｓｐが多孔質合成ポリマー粒子又は多孔質ガラス粒子の固相担体である、上記〔４〕〜〔６〕のいずれかに記載の核酸固相合成用担体。
〔８〕上記〔４〕〜〔７〕のいずれかに記載の核酸固相合成用担体上で核酸合成反応を行う工程を含む、核酸の製造方法。
〔９〕該核酸合成反応が、固相ホスホロアミダイト法により行われる、上記〔８〕に記載の製造方法。

本発明の核酸固相合成用リンカーはユニバーサルリンカーであり、該リンカーを担持してなる本発明の核酸合成用担体は、ユニバーサルサポートである。本発明のリンカーを担持してなる核酸合成用担体は、合成したい核酸の３’末端になるヌクレオチドを担持した固相合成用担体を用意する必要がなく、かつ、３'末端にリン酸基が導入された核酸を高純度で合成することができる。修飾オリゴヌクレオチドを合成する場合にも、修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドをあらかじめ担持した固相合成用担体を用意する必要がなく、かつ、３'末端にリン酸基が導入された核酸を高純度で合成することができる。
従って、本発明の核酸合成用担体は、３’末端にリン酸基を有する核酸の自動合成に好適に用いられる。更に、本発明の核酸合成用担体を用いた核酸の製造方法は、従来法のように合成された核酸の３’末端に別途リン酸基を導入する必要がない。

図１は、実施例２（Ａ）、比較例１（Ｂ）、実施例３（Ｃ）及び比較例２（Ｄ）で得られたＤＮＡオリゴヌクレオチド溶液の、ＨＰＬＣチャートを示す図である。 図２は、実施例５（Ａ）、比較例３（Ｂ）、実施例６（Ｃ）及び比較例４（Ｄ）で得られたＤＮＡオリゴヌクレオチド溶液の、ＨＰＬＣチャートを示す図である。

本明細書において「核酸」とは、ヌクレオチドがホスホジエステル結合により連結された鎖状の化合物（オリゴヌクレオチド）を意味し、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが含まれる。核酸は１本鎖、２本鎖のいずれであってもよいが、核酸合成機による効率的な合成が可能であることから、好ましくは１本鎖である。本明細書において「核酸」には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）等のプリン塩基及びチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）等のピリミジン塩基を含有するオリゴヌクレオチドのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基を含有する修飾オリゴヌクレオチドも含まれる。

核酸のヌクレオチド長は特に限定されないが、好ましくは２〜２００ヌクレオチドである。ヌクレオチド長が長すぎると、得られる核酸の収量や純度が低下するためである。

本明細書において「リンカー」とは、共有結合を介して２つの物質を連結する分子をいう。本発明においては、リンカーは、固相担体と核酸とを連結する。

本発明の核酸固相合成用リンカーは、下記一般式にて表される。

式中：
Ｘは、酸により脱離する水酸基の保護基を表す。該保護基としては、例えば、トリチル基（Ｔｒ）、モノメトキシトリチル基（ＭＭＴｒ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）などが挙げられる。これらの保護基は、トリクロロ酢酸又はジクロロ酢酸などのブロンステッド酸のジクロロメタン又はトルエン溶液を用いて脱離することができる。酸による脱保護が容易であることから、ＤＭＴｒが最も好ましく用いられる。

Ｌは、アルカリにより切断される連結部分を表し、スクシニル基（スクシニルリンカー）又はＱリンカー（Pon et al., Nucleic Acids Res., 27, 1531 (1999) ）などが挙げられるが、これらに限定されない。またスクシニルリンカーが好ましく用いられる。これらの連結部分は、アンモニア水やアンモニア水／メチルアミン混合液などにより容易に加水分解して切断することができ、自動合成終了後に、オリゴヌクレオチドを固相合成用担体から切り離す。すなわち、上記式で示される本発明の核酸固相合成用リンカーからＬが切断され、Ｘの位置に合成されたオリゴヌクレオチドが結合した分子が生成すると同時に、オルト位又はパラ位に生成した「Ｏ⁻」の求核反応により合成オリゴヌクレオチドから本発明のリンカーがはずれ、３’末端にリン酸基を有する合成オリゴヌクレオチドが得られると考えられる。このような本発明のユニバーサルサポートとしての反応は、後述する。

Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基又はハロゲン原子を表す。炭素数１〜６のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ-プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−アミル基、イソアミル基、ｓｅｃ−アミル基、ｔｅｒｔ−アミル基、ヘキシル基などが挙げられる。中でもメチル基又はエチル基が好ましい。炭素数１〜６のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基などが挙げられる。中でもメトキシ基が好ましい。炭素数１〜６のアルキルアミノ基としては、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、ジエチルアミノ基、プロピルアミノ基、ジプロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基などが挙げられる。中でもジメチルアミノ基が好ましい。またハロゲン原子としては、塩素、フッ素、臭素、ヨウ素などが挙げられる。中でも塩素又はフッ素が好ましい。

本発明の核酸固相合成用固相担体は、上記の本発明の核酸固相合成用リンカーを担持してなり、下記一般式にて表される。

式中、Ｘ及びＬ、並びにＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４は、上記で定義されたものである。

式中、Ｓｐは固相担体を表す。固相担体は、過剰に用いた試薬を洗浄によって簡単に除去できるものであれば特に限定されないが、例えば、ガラス系多孔質担体、ポリスチレン系担体又はアクリルアミド系担体などの多孔質合成ポリマー担体等が挙げられる。

本発明の好ましい実施態様において、上記式中、Ｓｐは、ガラス系多孔質担体である。
ここで「ガラス系多孔質担体」とは、ガラスを構成成分として含む多孔質担体をいい、例えば、粒子形状の多孔質ガラス粒子（ＣＰＧ）等が挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、前記ＣＰＧとしては、長鎖のアミノアルキルスペーサーを有するＣＰＧ固相担体（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ固相担体）が好適に用いられ、更には、長鎖ヌクレオチドの合成の場合においては、ＣＰＧの孔が２０〜４００ｎｍ、より好ましくは５０〜２００ｎｍ、更に好ましくは１００ｎｍのものが最も好ましく用いられる。

本発明の別の好ましい実施態様において、上記式中、Ｓｐは、ポリスチレン系担体である。ここで「ポリスチレン系担体」とは、下記式：

で表される構造単位（Ａ）及び／又はその置換体を構造単位として含有する共重合体から構成される固相担体をいう。構造単位（Ａ）の置換体には、構造単位（Ａ）に含まれる１つ以上の水素原子（ベンゼン環の水素原子を含む）が、炭素数１〜６のアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、ｎ-プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−アミル基、イソアミル基、ｓｅｃ−アミル基、ｔｅｒｔ−アミル基）、ハロゲン原子、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、スルホン基、シアノ基、メトキシ基、ニトロ基、ビニル基等で置換された化合物が挙げられる。置換基は、好ましくはアミノ基又はヒドロキシ基である。置換基の位置は、特に限定されないが、好ましくはベンゼン環上の主鎖に対してパラ位である。構造単位（Ａ）の好ましい置換体としては、下記式で表されるヒドロキシスチレン構造単位（Ｂ）を挙げることが出来る。

ポリスチレン系担体を構成する共重合体に含まれる構造単位の合計量に対する構造単位（Ａ）及び／又はその置換体の量は、特に限定されないが、通常５０〜１００重量％、好ましくは６０〜１００重量％である。

上記構造単位（Ａ）と共重合可能なモノマー化合物としては、具体的には、スチレン；ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、エチルスチレン、トリメチルスチレン、及びｐ−ｔ−ブチルスチレン等の核アルキル置換スチレン；α−メチルスチレン、及びα−メチル−ｐ−メチルスチレン等といったα−アルキル置換スチレン；クロロスチレン、ジクロロスチレン、フルオロスチレン、ペンタフルオロスチレン、及びブロモスチレン等の核ハロゲン化スチレン；クロロメチルスチレン、及びフルオロメチルスチレン等のハロゲン化アルキルスチレン；ヒドロキシスチレン；ヒドロキシメチルスチレン；安息香酸ビニル；スチレンスルホン酸ナトリウム；シアノスチレン；メトキシスチレン；エトキシスチレン；ブトキシスチレン；ニトロスチレン；アセトキシスチレン、及びベンゾキシスチレン等のアシルオキシスチレン等が挙げられるが、これらに限定されない。更には、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート等に代表されるような（メタ）アクリル酸アルキルエステル系モノマー、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、エタクリロニトリル等に代表されるようなシアン化ビニル系モノマー等が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の別の実施態様においては、上記式中、Ｓｐは、上記構造単位（Ａ）及び（Ｂ）に加え、下記式：

で表されるジビニルベンゼン構造単位（Ｃ）を更に有する、スチレン−ヒドロキシスチレン−ジビニルベンゼン系共重合体粒子からなる固相担体（特開２００５−０９７５４５、特開２００５−３２５２７２及び特開２００６−３４２２４５）、又はスチレン−（メタ）アクリロニトリル−ヒドロキシスチレン−ジビニルベンゼン系共重合体からなる固相担体（特開２００８−０７４９７９）等であってもよい。また上記ジビニルベンゼン構造単位（Ｃ）における１つ以上の水素原子（ベンゼン環の水素原子を含む）は、炭素数１〜６のアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、ｎ-プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−アミル基、イソアミル基、ｓｅｃ−アミル基、ｔｅｒｔ−アミル基）、ハロゲン原子、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、スルホン基、シアノ基、メトキシ基、ニトロ基、ビニル基等で置換されていてもよい。置換基は、好ましくはアミノ基又はヒドロキシ基である。

上記式中、Ｓｐが、前記スチレン−（メタ）アクリロニトリル−ヒドロキシスチレン−ジビニルベンゼン系共重合体からなる固相担体である場合において、（メタ）アクリロニトリルの構造単位は、アクリロニトリル又はメタクリロニトリルの各構造単位がそれぞれ単独で含まれていても良く、両方含まれていても良い。スチレン−（メタ）アクリロニトリル−ヒドロキシスチレン−ジビニルベンゼン系共重合体における構造単位の合計量に対する（メタ）アクリロニトリルの構造単位の量は、多すぎても少なすぎても有機溶媒の種類による膨潤度の変動が大きくなる。従って好ましくは２〜１１ｍｍｏｌ／ｇである。

本発明の別の好ましい実施態様において、上記式中、Ｓｐは、アクリルアミド系担体である。より具体的には、上記式中、Ｓｐは、上記構造単位（Ａ）及び（Ｃ）に加え、（メタ）アクリルアミド誘導体系モノマーを更に含む芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリルアミド誘導体系共重合体からなる固相合成用担体であってよい。

上記式中、Ｓｐが前記の芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリルアミド誘導体系共重合体からなる固相担体である場合において、前記芳香族モノビニル化合物としては、特に限定されないが、例えば、スチレン；ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、エチルスチレン、トリメチルスチレン、及びｐ−ｔ−ブチルスチレン等の核アルキル置換スチレン；α−メチルスチレン、及びα−メチル−ｐ−メチルスチレン等といったα−アルキル置換スチレン；クロロスチレン、ジクロロスチレン、フルオロスチレン、ペンタフルオロスチレン、及びブロモスチレン等の核ハロゲン化スチレン；クロロメチルスチレン、及びフルオロメチルスチレン等のハロゲン化アルキルスチレン；ヒドロキシスチレン；ヒドロキシメチルスチレン；安息香酸ビニル；スチレンスルホン酸ナトリウム；シアノスチレン；メトキシスチレン；エトキシスチレン；ブトキシスチレン；ニトロスチレン；アセトキシスチレン、及びベンゾキシスチレン等のアシルオキシスチレン等が挙げられ、好ましくはスチレンである。

前記（メタ）アクリルアミド誘導体としては、例えば、Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド；Ｎ，Ｎ−ジアルキル（メタ）アクリルアミド；Ｎ−アルコキシアルキル（メタ）アクリルアミド；２−（メタ）アクリルアミドアルカンスルホン酸；Ｎ−メチロール（メタ）アクリルアミド等のＮ−アルキロール（メタ）アクリルアミド；アクリルアミド；メタクリルアミド；ダイアセトンアクリルアミド；Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド；アクロイルモルホリン；Ｎ−フェノキシメチル（メタ）アクリルアミド等が挙げられるが、これらに限定されない。

また、前記Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミドに含まれるアルキルは、通常炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜３の直鎖状又は分岐状のアルキルである。Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミドとしては、Ｎ−メチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリルアミド、及びＮ−ラウリル（メタ）アクリルアミド等を挙げることが出来る。

前記Ｎ，Ｎ−ジアルキル（メタ）アクリルアミドに含まれる２つのアルキルは、それぞれ、通常炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜３の直鎖状又は分岐状のアルキルである。Ｎ，Ｎ−ジアルキル（メタ）アクリルアミドとしては、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジラウリル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジ−ｔｅｒｔ−オクチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジラウリル（メタ）アクリルアミド、及びＮ，Ｎ−ジシクロヘキシル（メタ）アクリルアミド等を挙げることが出来る。

前記Ｎ−アルコキシアルキル（メタ）アクリルアミドに含まれるアルコキシは、通常炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜３の直鎖状又は分岐状のアルコキシである。Ｎ−アルコキシアルキル（メタ）アクリルアミドに含まれるアルキルは、通常炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜３の直鎖状又は分岐状のアルキルである。Ｎ−アルコキシアルキル（メタ）アクリルアミドとしては、Ｎ−メトキシメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エトキシメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−プロポキシメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ブトキシメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エトキシエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メトキシプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エトキシプロピル（メタ）アクリルアミド、及びＮ−イソプロポキシエチル（メタ）アクリルアミド等を挙げることが出来る。

前記２−（メタ）アクリルアミドアルカンスルホン酸に含まれるアルカンは通常炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜３の直鎖状又は分岐状のアルカンである。２−（メタ）アクリルアミドアルカンスルホン酸としては、２−アクリルアミドプロパンスルホン酸、２−アクリルアミド−ｎ−ブタンスルホン酸、２−アクリルアミド−ｎ−ヘキサンスルホン酸、及び２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸等を挙げることが出来る。

前記（メタ）アクリルアミド誘導体は、好ましくは、ダイアセトンアクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メトキシメチル（メタ）アクリルアミド又はＮ，Ｎ，−ジメチル（メタ）アクリルアミドである。

典型的な（メタ）アクリルアミド誘導体単量体由来の構造単位としては、下記構造単位を挙げることが出来る。

上記式中、Ｓｐが、アクリルアミド系固相担体である場合において、（メタ）アクリルアミド誘導体モノマー由来の構造単位の含有量は、少なすぎると核酸の合成量の減少及び合成純度の低下を回避し得るという効果が得られず、他方、多すぎると多孔質樹脂ビーズを形成し難い。従って好ましくは０．３〜４ｍｍｏｌ／ｇ、より好ましくは０．４〜３．５ｍｍｏｌ／ｇ、更に好ましくは０．６〜３ｍｍｏｌ／ｇである。

本発明の固相合成用担体として用いられる多孔質粒子は、核酸合成に寄与する官能基を有するものが好ましい。「核酸合成に寄与する」とは、核酸合成の開始点になりえる、リンカー付加が可能な官能基であり、具体的には、アミノ基、ヒドロキシ基等が挙げられる。
核酸合成に寄与する官能基の含有量は、特に限定されるものではないが、該官能基の含有量が少なすぎると核酸の収量が低下し、他方、該官能基の含有量が多すぎると、得られる核酸の純度が低下する。従って好ましくは１０〜２０００μｍｏｌ／ｇ、より好ましくは、５０〜１０００μｍｏｌ／ｇ、更に好ましくは１００〜８００μｍｏｌ／ｇである。

核酸合成に寄与する官能基がヒドロキシ基である場合、本発明の多孔質粒子の水酸基量はＪＩＳ Ｋ００７０に基づいた滴定により測定される。具体的には、無水酢酸２５ｇに全量１００ｍＬとなるようにピリジンを加えてアセチル化試薬を作製する。上記アセチル化試薬０．５ｍＬとピリジン４．５ｍＬと試料約０．５ｇをフラスコに入れ、９５〜１００℃で２時間加熱して水酸基をアセチル化する。次にフラスコに蒸留水１ｍＬを加えて加熱することによってアセチル化で消費されなかった無水酢酸を酢酸に分解し、この酢酸の量を０．５ｍｏｌ／Ｌの水酸化カリウム水溶液を用いた中和滴定により測定する。これとは別に試料を入れずに上記と同様の操作により、ブランクの測定を行う。上記２つの測定のモル数の差が、試料の水酸基のアセチル化に消費された無水酢酸のモル数（即ち、試料の水酸基量）であるので、この値を試料重量で割って試料１ｇ当たりの水酸基量を求める。

固相担体に結合するリンカーの量は、特に限定されるものではないが、リンカーの量が少なすぎると核酸の収量が低下し、他方、リンカーの量が多すぎると、得られる核酸の純度が低下する傾向にあり、得られる核酸のヌクレオチド数が所望の数よりも少なくなり易い。従って、好ましくは２０〜８００μｍｏｌ／ｇ、より好ましくは、２５〜５００μｍｏｌ／ｇの範囲内である。

前記多孔質固相担体の形状は、特に限定されず、平板状、粒子状、繊維状等いずれの形状であってもよいが、合成反応容器への充填効率を高くすることができ、該反応容器が破損し難いという点から、好ましくは粒子の形状を呈する多孔質合成ポリマー粒子である。本明細書にて、「粒子」とは、厳密な球状を呈することを意味するのではなく、一定形状（例えば、楕円球状などの略球状、多面体形状、円柱形状、金平糖形状などの異型形状など）を有していればよいことを意味する。
多孔質合成ポリマー粒子の１粒の大きさ（体積）は、特に限定されないが、多孔質粒子のレーザー回折（散乱式）により測定される平均粒径が１μｍよりも小さいと、カラムに充填して使用した場合に背圧が高くなりすぎる、又は送液速度が遅くなるという不具合が生じ、他方、平均粒径が１０００μｍよりも大きいと、カラムに充填したとき、担体粒子間の空隙が大きくなり、一定容量のカラムに効率よく担体粒子を充填することが困難となる。従って好ましくは１〜１０００μｍ、より好ましくは５〜５００μｍ、更に好ましくは１０〜２００μｍである。

前記多孔質合成ポリマー粒子の多点ＢＥＴ法により測定した比表面積は、特に限定されないが、比表面積が０．１ｍ^２／ｇより小さいと有機溶媒中での膨潤度が低くなるため、合成反応が起こりにくくなる傾向があり、他方、５００ｍ^２／ｇより大きいと、細孔径が小さくなるため、合成反応が起こりにくくなる傾向がある。従って好ましくは０．１〜５００ｍ^２／ｇ、より好ましくは１０〜３００ｍ^２／ｇ、更に好ましくは５０〜２００ｍ^２／ｇである。

また前記多孔質合成ポリマー粒子の水銀圧入法により測定される平均細孔径は、特に限定はされないが、孔径が小さすぎる場合、合成反応の場が小さくなり所望の反応が起き難くなる、又はヌクレオチド長が所望の数より少なくなる傾向があり、他方、孔径が大きすぎる場合には、反応場であるポリマー粒子表面の水酸基と反応に関わる物質との接触機会が少なくなるため、歩留まりが低下する傾向がある。従って好ましくは１〜２００ｎｍ、より好ましくは５〜１００ｎｍ、更に好ましくは２０〜７０ｎｍである。

本発明の固相担体の好ましい実施態様において、上記式中、Ｓｐは、ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）（日東電工株式会社製）として市販されている低膨潤性架橋ポリスチレン粒子である。ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）を用いた固相核酸合成方法は、不純物によるピーク面積が少なく、ラボスケールから大量合成系までの幅広いスケールにおいて高収率・高純度が保証されるため、好適に用いられる。

本発明の核酸固相合成用担体の製造方法
本発明の核酸固相合成用担体の製造方法は、特に限定されないが、例えば、以下のような方法で製造することができる。

オルト位又はパラ位にヒドロキシ基及びヒドロキシメチル基をもつ芳香環化合物（例えば、２−ヒドロキシベンジルアルコール、４−ヒドロキシベンジルアルコール）に、４,４’−ジメトキシトリチルクロリドなどを反応させて、ヒドロキシメチル基を保護する。次に、この化合物に無水コハク酸をトリエチルアミンとともに反応させて、ヒドロキシ基にスクシニルリンカー部分を結合させ、これを−ＯＨ基又は−ＮＨ_２基をもつ固相担体に結合することにより、本発明の核酸固相合成用担体が得られる。

本発明の核酸固相合成用担体による核酸の合成法
本発明の核酸固相合成用担体を用いた核酸合成は、核酸自動合成装置を用い、自体公知の種々の合成法を用いることができる。本明細書において、「核酸合成反応」とは、特に核酸を構成するヌクレオチドの伸長反応を意味する。即ち、固相担体上に結合したヌクレオシド、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに、ヌクレオチドを順次結合させることにより、伸長されたオリゴヌクレオチドを得る。
該核酸合成反応としては、Ｈ−ホスホネイト法、ホスホエステル法、固相ホスホロアミダイト法などが挙げられるが、なかでも、核酸の合成能力が高く、高純度の核酸が得られることから、固相ホスホロアミダイト法が好ましい。

固相ホスホロアミダイト法による核酸合成反応の好ましい実施態様としては、例えば、以下の各工程
（ａ）本発明の核酸固相合成用担体を核酸自動合成装置の反応カラムに入れる工程；
（ｂ）ジクロロ酢酸溶液等の酸を反応カラムに流し、ヒドロキシメチル基の保護基を脱保護し、洗浄する工程；
（ｃ）テトラゾール等により活性化した、３'末端に該当するヌクレオシドホスホロアミダイトを、前記ヒドロキシメチル基に結合させるカップリング、未反応ヒドロキシ基のキャップ、ホスファイトの酸化の各工程を順次行い、更にこの一連の工程を目的配列になるまで繰り返す工程；
（ｄ）装置での合成工程が終了後、核酸固相合成用担体をアンモニア水等に浸漬して連結部分を切断し、目的の核酸を得る工程：
から構成される方法が挙げられる。

前記の製造方法により、下記式で表される化学反応が生じ、３'末端にリン酸基を有する核酸が生成される。すなわち、本発明の好ましい実施態様として実施例１に示される核酸固相合成用担体（Ａ）を用いた核酸合成方法においては、下記式にて表される化学反応が生じ、３'末端にリン酸基を有する核酸が生成される。

また、本発明の好ましい実施態様として実施例４に示される本発明の核酸固相合成用担体（Ｂ）を用いた核酸合成方法においては、下記式にて表される化学反応が生じ、３'末端にリン酸基を有する核酸が生成される。

本発明の核酸製造方法において用いられる活性剤としては、１Ｈ−テトラゾール、４，５−ジシアノイミダゾール、５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール、ベンズイミダゾリウムトリフラート（ＢＩＴ）、Ｎ−フェニルベンズイミダゾリウムトリフラート、イミダゾリウムトリフラート（ＩＭＴ）、Ｎ−ＰｈＩＭＰ、５−ニトロベンズイミダゾリウムトリフラート、トリアゾリウムトリフラート、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）又はＮ−（シアノメチル）ピロリジニウムテトラフルオロポレートなどが挙げられるが、これらに限定されない。

以下に、実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下に記載の実施例によって限定されるものではない。

実施例１
核酸固相合成用担体（Ａ）の作製
２−ヒドロキシベンジルアルコール（東京化成製）をピリジンに溶解し、４,４’−ジメトキシトリチルクロリドを加えて室温で２２時間反応させ、ヒドロキシ基をジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）で保護した。ヒドロキシメチル基がＤＭＴｒ保護されたものの収率は、４１％であった。この生成物をジクロロメタンに溶解し、無水コハク酸とトリエチルアミンを加えて室温で２９時間反応させて、スクシニル基の連結部分を結合した化合物を得た。次に、ヒドロキシ基を有する多孔質ポリスチレン系固相担体（日東電工製、ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標））をアセトニトリルに分散し、前記の化合物、ＨＢＴＵ、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを加えて、２８℃で２３時間反応させ、前記の化合物を固相担体に担持した。続いて、無水酢酸、Ｎ−メチルイミダゾール、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン、アセトニトリルを加えて２８℃で２５時間反応させて未反応のヒドロキシ基をキャップし、下記式：

で表される、本発明の核酸合成用固相担体（Ａ）を得た。
前記のようにして得られた本発明のリンカーの固相担体ヘの結合量は、３２μｍｏｌ／ｇであった。

実施例２
核酸固相合成用担体（Ａ）を用いた、チミジン５ｍｅｒ の合成
実施例１で作製した本発明の核酸合成用固相担体（Ａ）３１ｍｇを反応カラムに充填し、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置 ＡＢＩ３４００（アプライドバイオシステムズ製）を用いて、チミジン５ｍｅｒ（５’−ＴＴＴＴＴ−３’）をＤＭＴ−ｏｆｆで（５’末端保護基を外す方法で）合成し（合成スケール１μｍｏｌ）、合成後に、該ＤＮＡオリゴヌクレオチドが結合した固相担体を３０％アンモニア水／エタノール（２：１）混合溶液に５５℃で１４時間浸漬して、固相担体からの該ＤＮＡオリゴヌクレオチドの切出しを行った。

実施例３
核酸固相合成用担体（Ａ）を用いたＤＮＡオリゴヌクレオチド２０ｍｅｒ の合成
実施例２と同様に、本発明の核酸合成用固相担体（Ａ）を用いて、２０ｍｅｒ（５’−ＡＴＡ ＣＣＧ ＡＴＴ ＡＡＧ ＣＧＡ ＡＧＴ ＴＴ−３’：配列番号１）のＤＮＡオリゴヌクレオチドをＤＭＴ−ｏｆｆで合成し（合成スケール１μｍｏｌ）、合成後に、固相担体からの該ＤＮＡオリゴヌクレオチドの切出しを行った。

比較例１
ＤＭＴ-ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ を結合した固相合成用担体を用いた、チミジン５ｍｅｒ の合成
実施例1と同様にして市販の固相担体ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）（日東電工製）に、開裂性リンカーＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ（Beijing OM Chemicals製）を結合した。該化合物の固相担体ヘの結合量は３８μｍｏｌ／ｇであった。この固相担体２７ｍｇを反応カラムに充填し、実施例１と同様にして５ｍｅｒ（５’−ＴＴＴＴＴ−３’）のＤＮＡオリゴヌクレオチドをＤＭＴ−ｏｆｆで合成し（合成スケール１μｍｏｌ）、合成後に、固相担体からの該ＤＮＡオリゴヌクレオチドの切出しを行った。

比較例２
ＤＭＴ-ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ を結合した固相合成用担体を用いた、ＤＮＡオリゴヌクレオチド２０ｍｅｒ の合成
比較例1で作製した、開裂性リンカーＤＭＴ−ｄＴ−３'−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ を結合した固相合成用担体を用いて、２０ｍｅｒ（５’−ＡＴＡ ＣＣＧ ＡＴＴ ＡＡＧ ＣＧＡ ＡＧＴ ＴＴ−３’：配列番号１）のＤＮＡオリゴヌクレオチドをＤＭＴ−ｏｆｆで合成し（合成スケール１μｍｏｌ）、合成後に、固相担体からの該ＤＮＡオリゴヌクレオチドの切出しを行った。

実験例１
実施例２及び３並びに比較例１及び２にて得られたＤＮＡオリゴヌクレオチド溶液について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定を行った（測定条件：カラム；Ｃｌａｒｉｔｙ３μｍ Ｏｌｉｇｏ−ＲＰ ５０×４．６ｍｍ（Phenomenex製）、ＵＶ検出；２６０ｎｍ、ＢｕｆｆｅｒＡ；１００ｍＭ ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）、ＢｕｆｆｅｒＢ；アセトニトリル）。図１Ａ〜ＤにそれぞれのＨＰＬＣチャートを示した。
また実施例２及び３並びに比較例１及び２について、高速液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ‐ＭＳ分析）（測定条件は、カラム；Ｃｌａｒｉｔｙ３μｍ Ｏｌｉｇｏ−ＲＰ ５０×４．６ｍｍ（Phenomenex製）、ＵＶ検出;２５４ｎｍ、ＢｕｆｆｅｒＡ；１００ｍＭ ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）、ＢｕｆｆｅｒＢ；アセトニトリル）を行った。
その結果、実施例２で作製したＤＮＡオリゴヌクレオチドのメインピークは、３’末端にリン酸基を有するＴ−５ｍｅｒであることが確認された（分子量（測定値）；１５３９）。また実施例３で作製した核酸のメインピークは、３'末端にリン酸基を有するＤＮＡオリゴヌクレオチド−２０ｍｅｒであることが確認された（分子量（測定値）；６２１９）。一方、比較例１及び２で作製したＤＮＡオリゴヌクレオチドのメインピークは、それぞれ、３'末端−ＯＨ基のＴ−５ｍｅｒ（分子量（測定値）；１４５９）及び３'末端−ＯＨ基のＤＮＡオリゴヌクレオチド−２０ｍｅｒ（分子量（測定値）；６１３９）であることが、確認された。

実施例４
核酸固相合成用担体（Ｂ）の作製
４−ヒドロキシベンジルアルコール（東京化成製）をピリジンに溶解し、４,４’−ジメトキシトリチルクロリドを加えて室温で１４時間反応させて、ヒドロキシ基をジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）で保護した。ヒドロキシメチル基がＤＭＴｒ保護されたものの収率は、９３％であった。この生成物をジクロロメタンに溶解し、無水コハク酸とトリエチルアミンを加えて室温で３１時間反応させて、スクシニル基の連結部分を結合した化合物を得た（収率８０％）。次に、ヒドロキシ基を有する架橋ポリスチレン系固相担体であるＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）（日東電工製）をアセトニトリルに分散し、前記の化合物、ＨＢＴＵ、Ｎ，Ｎ-ジイソプロピルエチルアミンを加えて２８℃で２３時間反応させ、前記の化合物を固相担体に担持した。次に、無水酢酸、Ｎ−メチルイミダゾール、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン、アセトニトリルを加えて２８℃で２３時間反応させて未反応のヒドロキシ基をキャップし、下記式：

で表される、本発明の核酸合成用固相担体（Ｂ）を得た。
前記のようにして得られた本発明のリンカーの固相担体ヘの結合量は、２９μｍｏｌ／ｇであった。

実施例５
核酸固相合成用担体（Ｂ）を用いた、チミジン５ｍｅｒ の合成
実施例４で作製した本発明の核酸合成用固相担体（Ｂ）３４ｍｇを、反応カラムに充填し、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置、ＡＢＩ３４００（アプライドバイオシステム製）を用いて、チミジン５ｍｅｒ（５’−ＴＴＴＴＴ−３’）のＤＮＡオリゴヌクレオチドをＤＭＴ−ｏｎで（５’末端保護基を外さない方法で）合成し（合成スケール１μｍｏｌ）、合成後に、該ＤＮＡオリゴヌクレオチドが結合した固相担体を３０％アンモニア水／エタノール（１：１）混合溶液に、５５℃で１５時間浸漬し、固相担体からの該ＤＮＡオリゴヌクレオチドの切出しを行った。

実施例６
核酸固相合成用担体（Ｂ）を用いた、ＤＮＡオリゴヌクレオチド２０ｍｅｒ の合成
実施例５と同様にして、本発明の核酸合成用固相担体（Ｂ）を用いて、２０ｍｅｒ（５’−ＡＴＡ ＣＣＧ ＡＴＴ ＡＡＧ ＣＧＡ ＡＧＴ ＴＴ−３’：配列番号１）のＤＮＡオリゴヌクレオチドをＤＭＴ−ｏｎで合成し（合成スケール１μｍｏｌ）、合成後に、固相担体から該ＤＮＡオリゴヌクレオチドの切出しを行った。

比較例３
ＤＭＴ-ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを結合した固相合成用担体を用いたチミジン５ｍｅｒの合成
比較例１で作製したＤＭＴ-ｄＴ−３’‐ｓｕｃｃｉｎａｔｅを結合した固相担体２５ｍｇを反応カラムに充填し、実施例５と同様にして、チミジン５ｍｅｒ（５'−ＴＴＴＴＴ−３'）のＤＮＡオリゴヌクレオチドをＤＭＴ−ｏｎで合成し（合成スケール１μｍｏｌ）、合成後に、固相担体からの該ＤＮＡオリゴヌクレオチドの切出しを行った。

比較例４
ＤＭＴ-ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを結合した固相合成用担体を用いたＤＮＡオリゴヌクレオチド２０ｍｅｒの合成
比較例1で作製したＤＭＴ-ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを結合した固相担体２５ｍｇを反応カラムに充填し、実施例６と同様にして、２０ｍｅｒ（５'−ＡＴＡ ＣＣＧ ＡＴＴ ＡＡＧ ＣＧＡ ＡＧＴ ＴＴ−３’：配列番号１）のＤＮＡオリゴヌクレオチドをＤＭＴ−ｏｎで合成し（合成スケール１μｍｏｌ）、合成後に、固相担体からの該ＤＮＡオリゴヌクレオチドの切出しを行った。

実験例２
実施例５及び６、並びに比較例３及び４にて得られたＤＮＡオリゴヌクレオチド溶液について、ＨＰＬＣ測定を行った。測定条件は、カラム；ＸＢｒｉｄｇｅ ＯＳＴ Ｃ１８ ２．５ｕｍ ５０×４．６ｍｍ（Waters製）、ＵＶ検出；２６０ｎｍ、ＢｕｆｆｅｒＡ；１００ｍＭ ＨＦＩＰ／７ｍＭ ＴＥＡ／水（ｐＨ８．０）、ＢｕｆｆｅｒＢ；メタノールである。図２Ａ〜ＤにそれぞれのＨＰＬＣチャートを示した。
また実施例５及び６、並びに比較例３及び４について、ＬＣ‐ＭＳ分析（測定条件は、カラム；ＸＢｒｉｄｇｅ ＯＳＴ Ｃ１８ ２．５ｕｍ ５０×４．６ｍｍ（Waters製）、ＵＶ検出；２５４ｎｍ、ＢｕｆｆｅｒＡ；１００ ｍＭ ＨＦＩＰ／７ｍＭ ＴＥＡ／水（ｐＨ８．０）、ＢｕｆｆｅｒＢ；メタノール）を行った。
その結果、実施例５で作製した核酸のメインピークは、３'末端にリン酸基を有するＴ−５ｍｅｒであることが確認され（分子量（測定値）；１８４０）、また実施例６で作製したＤＮＡオリゴヌクレオチドのメインピークは、３'末端にリン酸基を有するＤＮＡオリゴヌクレオチド−２０ｍｅｒであることが、確認された（分子量（測定値）；６５２１）。
一方、比較例３及び４で作製したＤＮＡオリゴヌクレオチドのメインピークは、それぞれ、３’末端−ＯＨ基のＴ−５ｍｅｒ（分子量（測定値）；１７６０）及び３’末端−ＯＨ基のＤＮＡオリゴヌクレオチド２０ｍｅｒ（分子量（測定値）；６４４１）であることが、確認された。

表１に、実験例１及び２で得られたデータをまとめて示す。

近年、核酸医薬品の開発に伴い、より効率的・機能的な核酸合成方法の開発が望まれている。本発明の核酸合成用固相担体を用いて自動合成された３'末端にリン酸基を有する核酸は、核酸の化学的連結反応、３'リン酸基を利用した核酸の修飾、核酸の構造研究などに幅広く用いることができる。

配列番号１：人工合成されたオリゴ２０ｍｅｒ

Claims (7)

1. 下記一般式
   〔式中、
   Ｘは、トリチル基、モノメトキシトリチル基及びジメトキシトリチル基からなる群より選ばれる水酸基の保護基を表し、
   Ｌは、スクシニル基を表し、
   Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基又はハロゲン原子を表す。〕
   で示される化合物からなる、核酸固相合成用リンカー。
2. Ｘがジメトキシトリチル基である、請求項１に記載の核酸固相合成用リンカー。
3. 下記一般式
   〔式中、
   Ｘは、トリチル基、モノメトキシトリチル基及びジメトキシトリチル基からなる群より選ばれる水酸基の保護基を表し、
   Ｌは、スクシニル基を表し、
   Ｓｐは、ヒドロキシ基を有する固相担体を表し、Ｓｐは当該ヒドロキシ基を介してＬと結合しており、
   Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基又はハロゲン原子を表す。〕
   で示される構造を有する、核酸固相合成用担体。
4. Ｘがジメトキシトリチル基である、請求項３に記載の核酸固相合成用担体。
5. Ｓｐが多孔質合成ポリマー粒子又は多孔質ガラス粒子の固相担体である、請求項３又は４に記載の核酸固相合成用担体。
6. 請求項３〜５のいずれか１項に記載の核酸固相合成用担体上で核酸合成反応を行う工程を含む、核酸の製造方法。
7. 該核酸合成反応が、固相ホスホロアミダイト法により行われる、請求項６に記載の製造方法。