JP2021178789A - 無機多孔質担体、および核酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】核酸の製造において純度等をより高められる無機多孔質担体、およびこれを用いた核酸の製造方法の提供。【解決手段】式（ｉ−１）で表されるシリル基、および式（ｉｉ−１）等で表されるシリル基を有し、（ｉｉｉ）細孔径が２０ｎｍ以上であること、（ｉｖ）外表面ｔＰＳＡ値（Å２）が５６以上、８３以下であること、を特徴とする、無機多孔質担体、およびこれを用いた核酸の製造方法。【選択図】なし

Description

本発明は、無機多孔質担体、およびこれを用いた核酸の製造方法に関する。

核酸の化学合成法としては、ホスホロアミダイト法による固相合成法が広く用いられている。この方法では、まず、シランカップリング剤等を用いて無機多孔質体上にアミノ基等の官能基を導入し、前記官能基に核酸の３’末端となるヌクレオシドを結合させる。その後、前記ヌクレオシドを起点として、固相担体上で核酸伸長反応を行う。固相合成法では、特に合成する核酸の鎖長が長くなると、合成効率が急速に低下し、多量の副生成物が混入する結果になりがちである。固相担体をメチルトリメトキシシランで修飾した例が報告されている（特許文献１参照）が、合成された核酸の純度は、必ずしも満足いくものではなく、合成は効率的ではなかった。

特開平３−１８１３３４

本発明は、上記のような事情に鑑みてなされたものであり、核酸の製造において純度等をより高められる無機多孔質担体、および同無機多孔質担体を用いた核酸の製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、核酸の合成において、外表面のトポジカル極性表面積（ｔＰＳＡ）の値を一定の大きさに調整した無機多孔性担体を用いることにより、長鎖の核酸の合成において、核酸の純度を向上させることができることを見出した。よって、本発明は、ある特定の構造を有するシリル基を有し、且つ細孔径が一定の大きさを有し、また、外表面ｔＰＳＡが一定の大きさを有する、無機多孔質担体、および同無機多孔質担体を用いた核酸の製造方法を提供する。

上記課題を解決するため、具体的には以下の態様を包含するが、これらに限定されるものではない。
［１］ 下記（ｉ）および（ｉｉ）で表されるシリル基を有し、かつ下記（ｉｉｉ）〜（ｉｖ）の特徴を有する無機多孔質担体。
（ｉ）シリル基（Ａ）：下記式（ｉ−１）で表されるシリル基、
（ｉｉ）シリル基（Ｂ）：下記式（ii−１）、（ii−２）、および（ii−３）で表されるシリル基からなる群より選ばれる少なくとも１つのシリル基、
（ｉｉｉ）細孔径が２０ｎｍ以上であること、
（ｉｖ）下記数式（iv−１）で規定される外表面ｔＰＳＡ値（Å２）が５６以上、８３以下であること。

［式（ｉ−１）中、
Ｘ１は、無機多孔質担体との結合を表し、
Ｚ１は、それぞれ独立して、炭素数１〜６のアルキル基、または炭素数６〜１２のアリール基を表し、
Ａ１は、炭素数１〜２０の有機基を表し、
Ｂ１は、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、および炭素数６〜１２のアリール基からなる群から選ばれるいずれかを表わし、そして、
Ｃ１は、反応性の基が、保護または脱保護された、ヌクレオシド又はヌクレオチド構造を有する基を表す。］、

、

、

、
［式（ii−１）、（ii−２）、または（ii−３）中、
Ｐ１は、無機多孔質担体との結合を表し、
Ｑ１およびＲ１は、それぞれ独立して、無機多孔質担体との結合、水酸基、アミノ基、炭素数１〜６のアルコキシ基、および炭素数１〜６のアルキルアミノ基からなる群から選ばれるいずれかを表し、
Ｊ１は、炭素数１〜２０のアルキル基、または１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数７〜２０のアリール基を表し、
Ｋ１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキル基、または１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数５〜２０のアリール基を表し、
Ｍ１は、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、そして、
Ｎ１は、炭素数２〜２０のアルキル基、または１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数５〜２０のアリール基を表わす。］

ｔＰＳＡ値の総和値（Å^２ ・ μｍｏｌ／ｇ）：下記式（iv−２）で表される値

外表面官能基ｔＰＳＡ値(Å^２)：無機多孔質担体の外表面官能基に対するｔＰＳＡ値を表わし、ソフトウェア計算により導出される値
［２］ 前記無機多孔質担体が粒子状であり、そして粒子径が１μｍＬ以上である、［１］に記載の無機多孔質担体。
［３］ 前記無機多孔質担体の細孔径が、４０ｎｍ以上、５００ｎｍ以下である、［１］〜［２］のいずれかに記載の無機多孔質担体。
［４］ 前記無機多孔質担体の細孔径４０ｎｍから１０００ｎｍの範囲における累積細孔容積が、０．３２ｍＬ／ｇよりも大きく４ｍＬ／ｇ以下であることを特徴とする、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
［５］ 前記無機多孔質担体の比表面積が、０．１ｍ^２／ｇ以上、２００ｍ^２／ｇ以下である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
［６］ 前記無機多孔質体が、シリカ、シリカゲル、ゼオライト、またはガラスから構成される、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
［７］ 反応性の基が、保護または脱保護された、ヌクレオシドまたはヌクレオチド構造を含有する基の量が下記数式（Ｎｕ＃１）を満たすことを特徴とする、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。

Ｉ１：無機多孔質担体中の、反応性の基が保護または脱保護された、ヌクレオシド又はヌクレオチド構造を有する基（μｍｏｌ／ｇ）、
Ｓ１：窒素吸脱着等温線測定により得られる、無機多孔質担体の比表面積（ｍ^２／ｇ）
［８］ 前記一般式（ｉ−１）中のＣ１が、スクシニルリンカーまたはユニバーサルリンカーを含むことを特徴とする、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
［９］ 上記式（ii−３）で表されるシリル基をシリル基（Ｂ）として有する、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
［１０］ 上記式（ii−３）で表されるシリル基が下記式（ii−３−１）で表されるシリル基である、［１］〜［９］のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。

［式（ii−３−１）中、
Ｐ１は、無機多孔質担体との結合を表し、
Ｋ２は、それぞれ独立して、炭素数１〜６のアルキル基、または１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数６〜１０アリール基を表し、
Ｍ２は、炭素数１〜４のアルキレン基を表し、そして、
Ｎ２は、炭素数２〜６のアルキル基、または１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数６〜１０のアリール基を表わす。］
［１１］ 上記式（ｉ−１）中のＡ１が、アシルイミノ基、オキシ基、またはチオ基のいずれか１つ以上を含んでいてもよい炭素数１〜２０のアルキレン基であることを特徴とする、［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
［１２］ 前記シリル基（Ａ）が下記式（ｉ−１−１）で表されることを特徴とする、［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。

［式（ｉ−１−１）中、
Ｘ１は、無機多孔質担体との結合を表し、
Ｚ１は、それぞれ独立して、炭素数１〜６のアルキル基、または炭素数６〜１２のアリール基を表し、
Ａ２は、アシルイミノ基、オキシ基、またはチオ基のいずれか１つ以上を含んでいてもよい炭素数炭素数１〜１５のアルキレン基を表し、
Ｂ２は、水素原子、または炭素数１〜２のアルキル基のいずれかを表わし、そして、
Ｃ２は、スクシニルリンカーを含み、かつ反応性の基が保護または脱保護された、ヌクレオシドまたはヌクレオチド構造を有する基を表す。］
［１３］ 上記式（ｉ−１）中のＣ１が、反応性の基としてヒドロキシル基が保護されたヌクレオシドまたはヌクレオチド構造を有する基を持つ無機多孔質担体を用い、
前記のヌクレオシドの５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程（Ａ）、
前記工程（Ａ）において生成したヌクレオシドの５’位のヒドロキシル基と、第２のヌクレオシド塩基を有するアミダイト化合物とを縮合反応させて、ホスファイトを生成する工程（Ｂ）、
前記工程（Ｂ）において生成したホスファイトを酸化させて、ヌクレオチドを生成する工程（Ｃ）、および、
前記工程（Ｃ）において生成したヌクレオチドの５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程（Ｄ）
を含む、核酸の製造方法。
［１４］ 前記工程（Ｄ）において生成した生成物と、次に導入予定のヌクレオシド塩基を有するアミダイト化合物とをさらに縮合反応させて、ホスファイトを生成する工程（Ｂ’）、
前記工程（Ｂ’）において生成したホスファイトを酸化させて、オリゴヌクレオチドを生成する工程（Ｃ’）、および、
前記工程（Ｃ’）において生成したオリゴヌクレオチド鎖末端の５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程（Ｄ’）を含む、［１３］に記載の核酸の製造方法。
［１５］ 前記の工程（Ｂ’）、工程（Ｃ’）および工程（Ｄ’）からなる一連の工程を、さらにｍ回（ｍは、１以上の整数を表す。）繰り返して、ｍ個のアミダイト化合物を反応させた後、伸長した核酸を切り出す工程（Ｅ）を含む、［１４］に記載の核酸の製造方法。
［１６］ ［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の無機多孔質担体の、ホスホロアミダイト法による核酸の製造における使用。

本発明により、固相担体の外表面のトポジカル極性表面積（ｔＰＳＡ）値を一定の大きさに調整することにより、長鎖の核酸合成においても純度を向上させることができる無機多孔質担体、および同無機多孔質担体を用いた高純度の核酸の製造方法が提供される。

図１は、オリゴ核酸生成物における、外表面ｔＰＳＡ値（Å^２）に対する相対１０％幅の関係を示す図面である。

本発明の無機多孔質担体は、下記（ｉ）および（ｉｉ）で表されるシリル基を有し、かつ下記（ｉｉｉ）〜（ｉｖ）の特徴を有する無機多孔質担体である。
（ｉ）シリル基（Ａ）：下記式（ｉ−１）で表されるシリル基。
（ｉｉ）シリル基（Ｂ）：下記式（ii−１）、（ii−２）、および（ii−３）で表されるシリル基からなる群より選ばれる少なくとも１つのシリル基。
（ｉｉｉ）細孔径が２０ｎｍ以上であること。
（ｉｖ）下記数式（iv−１）で規定される外表面ｔＰＳＡ値（Å^２）が５６以上、８３以下であること。

［式（ｉ−１）中、
Ｘ１は、無機多孔質担体との結合を表し、
Ｚ１は、それぞれ独立して、炭素数１〜６のアルキル基、または炭素数６〜１２のアリール基を表し、
Ａ１は、炭素数１〜２０の有機基を表し、
Ｂ１は、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、および炭素数６〜１２のアリール基からなる群から選ばれるいずれかを表わし、そして、
Ｃ１は、反応性の基が、保護または脱保護された、ヌクレオシドまたはヌクレオチド構造を有する基を表す。］、

、

、

、
［式（ii−１）、（ii−２）、または（ii−３）中、
Ｐ１は、無機多孔質担体との結合を表し、
Ｑ１およびＲ１は、それぞれ独立して、無機多孔質担体との結合、水酸基、アミノ基、炭素数１〜６のアルコキシ基、および炭素数１〜６のアルキルアミノ基からなる群から選ばれるいずれかを表し、
Ｊ１は、炭素数１〜２０のアルキル基、または１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数７〜２０のアリール基を表し、
Ｋ１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキル基、または１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数５〜２０のアリール基を表し、
Ｍ１は、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、そして、
Ｎ１は、炭素数２〜２０のアルキル基、または１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数５〜２０のアリール基を表わす。］

ｔＰＳＡ値の総和値（Å^２ ・ μｍｏｌ／ｇ）：下記式（iv−２）で表される値

外表面官能基ｔＰＳＡ値(Å^２)：無機多孔質担体の外表面官能基に対するｔＰＳＡ値を表わし、ソフトウェア計算により導出される値。

上記式（ｉ−１）中、Ｘ１における無機多孔質担体との結合とは、具体的には無機多孔質担体表面上の−Ｏ−結合を介しての結合である。

上記式（ｉ−１）中、Ｚ１は、それぞれ独立して、炭素数１〜６のアルキル基、または炭素数６〜１２のアリール基を表す。
Ｚ１における炭素数１〜６のアルキル基とは、直鎖または分枝のアルキル基、およびシクロアルキル基を含み得て、好ましくは直鎖または分枝の炭素数１〜６のアルキル基を意味する。具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｉ−プロピル基、ｉ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロペンチル基、およびシクロヘキシル基が挙げられる。好ましくは、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−プロピル基、ｉ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、およびシクロヘキシル基であり、より好ましくはエチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−プロピル基、ｉ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、およびシクロヘキシル基であり、更に好ましくはエチル基、ｎ−ブチル基、およびｉ−プロピル基であり、特に好ましくはｉ−プロピル基である。

Ｚ１における炭素数６〜１２のアリール基としては、フェニル基、および１つ以上の置換基を有するフェニル基が挙げられる。置換基を有するフェニル基の置換基としては、炭素数１〜６のアルキル基、および炭素数１〜６のアルコキシ基が挙げられる。

上記式（ｉ−１）中、Ａ１は、炭素数１〜２０の有機基を表わす。具体的には、
炭素数１〜２０のアルキレン基、
炭素数１〜２０のアリーレン基、
アシルイミノ基、オキシ基、またはチオ基のいずれか１つ以上を含んでいてもよい炭素数１〜２０のアルキレン基、および
アシルイミノ基、オキシ基、またはチオ基のいずれか１つ以上を含んでいてもよい炭素数１〜２０のアリーレン基、
が挙げられる。

上記式（ｉ−１）中、Ｂ１は、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、および炭素数６〜１２のアリール基からなる群から選ばれるいずれかを表わす。
Ｂ１における炭素数１〜６のアルキル基の具体例と好ましい例としては、Ｚ１における炭素数１〜６のアルキル基と同様なものを挙げることができる。
Ｂ１における炭素数６〜１２のアリール基の具体例と好ましい例としては、Ｚ１における炭素数６〜１２のアリール基と同様なものを挙げることができる。

Ｃ１は、反応性の基が、保護または脱保護された、ヌクレオシドまたはヌクレオチド構造を有する基を表す。合成の観点から、下記に示す担体合成の段階では反応性の基が保護されたヌクレオシドまたはヌクレオチド構造を有する基であり、適宜、保護基を脱保護することができる。同保護基としては、トリチル系保護基が好ましく、具体的には４，４’−ジメトキシトリチル基などを用いることができる。

式（ii−１）中、Ｐ１における無機多孔質担体との結合とは、上記Ｘ１における無機多孔質担体との結合と同様である。

式（ii−１）中、Ｑ１およびＲ１は、それぞれ独立して、無機多孔質担体との結合、水酸基、アミノ基、炭素数１〜６のアルコキシ基、および炭素数１〜６のアルキルアミノ基からなる群から選ばれるいずれかを表す。Ｑ１およびＲ１における、無機多孔質担体との結合とは、上記Ｘ１、およびＰ１における無機多孔質担体との結合と同様である。

Ｑ１およびＲ１における、炭素数１〜６のアルコキシ基としては、好ましくは炭素数１〜３のアルコキシ基であり、具体的にはメトキシ基、エトキシ基、およびｎ−プロポキシ基およびｉ−プロポキシ基が挙げられる。
Ｑ１およびＲ１における、炭素数１〜６のアルキルアミノ基としては、モノアルキルアミノ基およびジアルキルアミノ基が挙げられ、好ましくはジアルキルアミノ基であり、具体的にはジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジ（ｎ−プロピル）アミノ基、およびジ（ｉ−プロピル）アミノ基が挙げられる。

Ｊ１は、炭素数１〜２０のアルキル基、または１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数７〜２０のアリール基を表す。
Ｊ１における炭素数１〜２０のアルキル基とは、直鎖または分枝のアルキル基、およびシクロアルキル基を含み得て、好ましくは直鎖または分枝の炭素数１〜６のアルキル基を意味する。好ましくは炭素数１〜６のアルキル基であり、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｉ−プロピル基、ｉ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロペンチル基、およびシクロヘキシル基が挙げられる。また、Ｊ１における炭素数１〜２０のアルキル基は、１つ以上の置換基を有していてもよい。置換基としては、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基、シアノ基、炭素数６〜１０のアリール基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭素数６〜１０のアリールオキシ基、炭素数１〜１０のアシルアミノ基、炭素数１〜１０のアシルオキシ基、炭素数１〜１０のアシル基、炭素数１〜６のアルキルカルバモイル基、および炭素数６〜１０のアリールカルバモイル基が挙げられる。
Ｊ１における１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数５〜２０のアリール基としては、芳香族炭化水素基または芳香族ヘテロ環状基のいずれであってもよく、例えば、フェニル基、ピリジル基、およびチエニル基を挙げることができ、好ましくはフェニル基が挙げられる。ここでのフェニル基、ピリジル基、およびチエニル基は置換基を有していてもよく、該置換基としては炭素数１〜６のアルキル基、および炭素数１〜６のアルコキシ基が挙げられる。

式（ii−２）または式（ii−３）中、Ｋ１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキル基、または１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数５〜２０のアリール基を表す。
Ｋ１における炭素数１〜２０のアルキル基としては、Ｊ１における炭素数１〜２０のアルキル基と同様である。また、Ｋ１における１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数５〜２０のアリール基としては、Ｊ１における１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数５〜２０のアリール基と同様である。

式（ii−３）中、Ｍ１は、炭素数１〜６の二価のアルキレン基を表す。Ｍ１における炭素数１〜６のアルキレン基としては、好ましくは炭素数１〜４のアルキレン基が挙げられ、具体的には、メチレン基、エチレン基、ｎ−プロピレン基、およびｎ−ブチレン基が挙げられる。より好ましくは、メチレン基、およびエチレン基が挙げられる。

式（ii−３）中、Ｎ１は、炭素数２〜２０のアルキル基、または１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数５〜２０のアリール基を表わす。Ｎ１における炭素数２〜２０のアルキル基としては、好ましくは炭素数２〜１０のアルキル基が挙げられ、より好ましくは炭素数２〜６のアルキル基が挙げられ、具体的には、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、およびｎ−ヘキシル基が挙げられる。また、Ｎ１における炭素数１〜２０のアルキル基は、１つ以上の置換基を有していてもよい。置換基としては、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基、シアノ基、素数６〜１５のアリール基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭素数６〜１５のアリールオキシ基、炭素数１〜１０のアシルアミノ基、炭素数１〜１０のアシルオキシ基、炭素数１〜１０のアシル基、炭素数１〜６のアルキルカルバモイル基、および炭素数６〜１５のアリールカルバモイル基が挙げられる。
Ｎ１における１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数５〜２０のアリール基としては、Ｋ１における１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数５〜２０のアリール基と同様である。

本発明における無機多孔質担体は、核酸合成に適用する観点から、２０ｎｍ以上の細孔径を有する。合成する核酸の鎖長に応じて、使用する無機多孔質担体は、適宜選択することができる。通常、合成する核酸の鎖長が長い場合には、細孔径の大きいものを選択することが好ましい。好ましい細孔径としては、２０ｎｍ以上、５００ｎｍ以下であり、より好ましくは２５ｎｍ以上、５００ｎｍ以下であり、より更に好ましくは３０ｎｍ以上、５００ｎｍ以下であり、より一層更に好ましくは４０ｎｍ以上、５００ｎｍ以下であり、特に好ましくは４０ｎｍ以上、３００ｎｍ以下である。
ここでの細孔径は、無機多孔質担体の原料である無機成形体について、水銀圧入法による分析を行い、得られる細孔径分布のグラフ（Ｘ軸は細孔径の値を用い、Ｙ軸は細孔容積を細孔径で微分した値を用いてプロットしたグラフ）において、Ｙ軸の極大値におけるＸ軸の値から得られる細孔径（モード径）にて求めることができる。

以下に本発明の無機多孔質担体の調製法について説明する。無機多孔質担体は、出発原料の無機成形体を特定のシランカップリング剤と反応させ、活性ＮＨ基を有する無機多孔質基材へと誘導した後、該活性ＮＨ基に、反応性の基が保護または脱保護された、ヌクレオシドまたはヌクレオチド構造を有する基を導入することで製造される。
なお、ここでの活性ＮＨ基とは、下記式（ＮＨ−１）の構造を有するＮＨ基を表す。

［式（ＮＨ−１）中、
Ａ１００は、炭素数１〜２０の有機基を表し、
Ｂ１は、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、および炭素数６〜１２のアリール基からなる群から選ばれるいずれかを表わし、そして、
上記構造の要件を満たすＮＨ基を活性ＮＨ基とする。］

上記式（ＮＨ−１）中のＢ１の具体例、好ましい例は、上記式（ｉ−１）中のＢ１と同じものを挙げることができる。

上記式（ＮＨ−１）中のＡ１００は、炭素数１〜２０の有機基を表わす。
具体的には、
炭素数１〜２０のアルキレン基、
炭素数６〜２０のアリーレン基、
イミノ基、オキシ基、またはチオ基のいずれか１つ以上を含んでいてもよい炭素数１〜２０のアルキレン基、および、
イミノ基、オキシ基、またはチオ基のいずれか１つ以上を含んでいてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、
が挙げられる。

［無機成形体の製造方法］
本実施形態の無機多孔質基材の原料である無機成形体は、細孔径が２０ｎｍ以上である細孔分布を有し、シランカップリング剤を用いてシリル基を担持することができる水酸基を有する無機成形体である。かかる無機成形体として典型的にはシラノール基を含むものが挙げられ、構成物質としてシリカ、シリカゲル、ゼオライト、ガラス、および石英が例示される。好ましくはシリカ、シリカゲル、ゼオライトまたはガラスである。これらのものは、市販のものを使用するか、あるいは以下のような合成方法で調製したものを使用してもよい。

シラノール基を含む無機成形体の製造方法としては、乾式法と湿式法が例示される。前者の具体例としては、燃焼法やアーク法が挙げられ、後者の具体例としては、沈降法、ゾルゲル法、水熱合成法等の合成方法が挙げられる（参考文献：TOSOH Research & Technology Review Vol. 45 (2001).）。かかる無機成形体の調製は、例えば、ケイ酸塩、アルコキシシラン、クロロシラン類等を原料とし、溶媒やテンプレート剤を用いて前記のような合成方法で調製される。

無機成形体へ多孔質構造を付与する手法としては、例えば、１．シリカを析出させた後、シリカの骨格中に含まれる溶媒を除去する方法、２．シリカ以外の、例えばアルミニウムやホウ素などの異種金属を混ぜて固体を析出させた後、シリカ成分とシリカ以外の成分とに相分離させ、シリカ以外の成分を除去する方法、３．アンモニウム塩や高分子をテンプレート剤として混ぜてシリカを析出させた後、テンプレート剤を除去する方法、または、４．析出させたシリカを凝集させる方法を用いて行うことができる。これらの方法を２つ以上組み合わせて用いてもよい。
前記の、溶媒またはテンプレート剤を除去する方法としては、乾燥、超臨界抽出、および焼成等を用いることができる。

得られた無機成形体は、その形態として粒子が好ましく、球状に成形されていてもよいし、塊状または破砕状でもよいが、これらを担体として使用する際、核酸合成カラムへの充填性の観点から、球状または破砕状が好ましい。成形法としては、特に限定されないが、噴霧乾燥法やエマルジョン法などを用いることができる。また、適宜、粉砕、篩別などを行ってもよい。

［無機多孔質基材の製造方法］
無機多孔質基材の製造は、前記無機成形体と、下記式（ｉ−１ａ）または（ｉ−１ｂ）で表されるシランカップリング剤、および下記式（ii−３ａ）で表されるシランカップリング剤を反応させる方法で行われる。これにより、これらシランカップリング剤が無機成形体の表面の水酸基と反応して、上記式（ＮＨ−１）の構造を有するシリル基（Ａ０）およびシリル基（Ｂ）（例えば、後述するもの）がそれぞれ導入される。なお、同反応においては、適宜、溶媒を併用してもよい。

前記シリル基（Ａ０）の構造を付与するシランカップリング剤としては、下記式（ｉ−１ａ）または（ｉ−１ｂ）で表されるシランカップリング剤を用いることができる。

［式（ｉ−１ａ）中、
Ｙ０は、それぞれ独立して、水酸基、アミノ基、炭素数１〜６のアルコキシ基、および炭素数１〜１２のアルキルアミノ基からなる群から選ばれるいずれかを表し、
Ｚ１、およびＢ１は、前記（ｉ−１）式中のＺ１、およびＢ１とそれぞれ同様な基を表わし、そして、
Ａ１００は前記式（ＮＨ−１）中のＡ１００と同様な基を表わす。］、

［式（ｉ−１ｂ）中、
Ｙ０は、それぞれ独立して、水酸基、アミノ基、炭素数１〜６のアルコキシ基、および炭素数１〜６のアルキルアミノ基からなる群から選ばれるいずれかを表し、
Ｚ１、およびＢ１は、前記（ｉ−１）式中のＺ１、およびＢ１とそれぞれ同様な基を表わし、そして、
Ａ１００は前記式（ＮＨ−１）中のＡ１００と同様な基を表わす。］

上記式（ｉ−１ａ）中のＹ０における、炭素数１〜６のアルコキシ基としては、好ましくは炭素数１〜３のアルコキシ基であり、具体的にはメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基およびｉ−プロポキシ基が挙げられる。
Ｙ０における炭素数１〜６のアルキルアミノ基としては、モノアルキルアミノ基およびジアルキルアミノ基が挙げられ、好ましくはジアルキルアミノ基であり、具体的にはジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジ（ｎ−プロピル）アミノ基、およびジ（ｉ−プロピル）アミノ基が挙げられる。

前記シリル基（Ｂ）の構造を付与するシランカップリング剤としては、下記式（ii−１ａ）、（ii−２ａ）、および（ii−３ａ）で表されるシランカップリング剤を用いることができる。

、

、

、
［式（ii−１ａ）、（ii−２ａ）、または（ii−３ａ）中、
Ｑ０、Ｒ０およびＳ０は、それぞれ独立して、水酸基、アミノ基、クロロ基、ブロモ基、ヨード基、炭素数１〜６のアルコキシ基、および炭素数１〜６のアルキルアミノ基からなる群から選ばれるいずれかを表し、そして、
Ｊ１、Ｋ１、Ｍ１、およびＮ１は、前記（ii−１）、（ii−２）、および（ii−３）式中のＪ１、Ｋ１、Ｍ１、およびＮ１と同様な基を表す。］

上記式（ii−１ａ）、式（ii−２ａ）および上記式（ii−３ａ）中のＱ０、Ｒ０およびＳ０における、炭素数１〜６のアルコキシ基、および炭素数１〜６のアルキルアミノ基の具体例および好ましい例は、上記式（ii−１）、式（ii−２）および上記式（ii−３）中のＱ１およびＲ１における、炭素数１〜６のアルコキシ基、および炭素数１〜６のアルキルアミノ基の具体例および好ましい例と同様なものを挙げることができる。

上記の無機成形体とシランカップリング剤との反応では、無機成形体と、上記式（ｉ−ａ）または（ｉ−ｂ）で表されるシランカップリング剤を反応させた後に、上記式（ii−１ａ）、式（ii−２ａ）または上記式（ii−３ａ）で表されるシランカップリング剤を反応させてもよく、あるいは無機成形体と、上記式（ii−１ａ）、式（ii−２ａ）または上記式（ii−３ａ）で表されるシランカップリング剤を反応させた後に、上記式（ｉ−ａ）または（ｉ−ｂ）で表されるシランカップリング剤を反応させてもよく、あるいは無機成形体に上記式（ｉ−ａ）または（ｉ−ｂ）で表されるシランカップリング剤と、上記式（ii−１ａ）、式（ii−２ａ）または上記式（ii−３ａ）で表されるシランカップリング剤を同時に反応させてもよい。

上記式（ｉ−１ａ）または（ｉ−１ｂ）で表されるシランカップリング剤の具体例としては以下が挙げられる。

上記式（ii−１ａ）で表されるシランカップリング剤の具体例としては以下が挙げられる。

上記式（ii−２ａ）で表されるシランカップリング剤の具体例としては以下が挙げられる。

上記式（ii−３ａ）で表されるシランカップリング剤の具体例としては以下が挙げられる。

上記式（ｉ−１ａ）または（ｉ−１ｂ）で表されるシランカップリング剤の添加量は、窒素吸脱着測定により求められる、無機成形体の質量当たり比表面積に対して、活性ＮＨ基量が０．０５〜６０μｍｏｌ／ｍ^２になる量であり、好ましくは０．０５〜６．０μｍｏｌ／ｍ^２になる量である。無機成形体の質量当たり比表面積は、原料である無機成形体について窒素吸脱着等温線測定を行い、αｓ−ｐｌｏｔ法によるαｓ＝１．７〜２．１の範囲の平均勾配から求められる比表面積の値を適用することができる。

上記式（ii−１ａ）、（ii−２ａ）または（ii−３ａ）で表されるシランカップリング剤の添加量は、特に制限は無いが、無機成形体と上記式（ii−１ａ）、（ii−２ａ）または（ii−３ａ）で表されるシランカップリング剤を反応させた後に、上記式（ｉ−１ａ）または（ｉ−１ｂ）で表されるシランカップリング剤を反応させる場合、および無機成形体に上記式（ｉ−１ａ）または（ｉ−１ｂ）で表されるシランカップリング剤と上記式（ii−１ａ）、（ii−２ａ）または（ii−３ａ）で表されるシランカップリング剤を同時に反応させる場合においては、シリル基（Ａ０）の導入量が大幅に阻害されないように適宜、上記式（ii−１ａ）、（ii−２ａ）または（ii−３ａ）で表されるシランカップリング剤の添加量を調整することが望ましい。

溶媒を、前記無機成形体と、上記式（ｉ−１ａ）または（ｉ−１ｂ）で表されるシランカップリング剤および上記式（ii−１ａ）、（ii−２ａ）または（ii−３ａ）で表されるシランカップリング剤を反応させる際に用いてもよい。溶媒としては特に限定はされないが、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、トルエン、キシレン、メシチレン、１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン、アニソール、クロロベンゼン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、２−ヘプタノン、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、水等、またはこれらの２種類以上の混合物を用いることができる。これらの中でも、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、トルエン、キシレン、メシチレン、および１，２，３，４−テトラヒドロナフタレンが好ましく、トルエン、およびキシレンがより好ましい。

上記式（ii−１ａ）、（ii−２ａ）または（ii−３ａ）で表されるシランカップリング剤中、Ｑ０、Ｒ０およびＳ０のいずれかにおいて、クロロ基、ブロモ基、およびヨード基が含まれる場合、前記無機成形体と上記式（ii−１ａ）、（ii−２ａ）または（ii−３ａ）で表されるシランカップリング剤との反応において、含窒素有機塩基を併用してもよい。上記含窒素有機塩基の具体例としては、１−メチルイミダゾール、２，６−ルチジン、ピリジン、および４−ジメチルアミノピリジンなどの含窒素芳香族複素環化合物や、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、およびトリエチルアミンなどの第３級アルキルアミンが挙げられる。

前記の無機成形体及び溶媒は、前記シランカップリング剤同士の重合の抑制や、前記シランカップリング剤と無機成形体表面との反応促進の観点から、脱水して用いることが好ましい。脱水方法は、特に限定されないが、例えば、無機成形体を常圧または減圧下にて加熱する方法、および、無機成形体を溶媒に分散させた後に常圧または減圧下にて溶媒を留去して共沸脱水する方法などが挙げられる。

前記の無機成形体とシランカップリング剤との反応は、反応促進のため加熱してもよく、これに限定されず、室温でもよいし、室温以下に冷却してもよい。溶媒を併用する場合も同様である。
同反応は、通常、１〜１２時間程度で行うが、適宜、反応時間を長くしても短くしてもよい。
上記反応後、テトラヒドロフラン、エタノール等の溶媒により反応混合物の洗浄を行い、乾燥させることで無機多孔質基材が得られる。

［無機多孔質担体の製造方法］
本発明の無機多孔質担体は、前記無機多孔質基材中の活性ＮＨ基に、反応性の基が、保護または脱保護された、ヌクレオシド又はヌクレオチド構造を有する基（上記式（ｉ−１）中のＣ１）を導入することで製造される。本発明の無機多孔質担体の好例の一つとして、担体合成および核酸合成の点から、上記一般式（ｉ−１）中のＣ１が、スクシニルリンカーまたはユニバーサルリンカーを含むものが挙げられる。より好ましくは、後述のようにスクシニルリンカーで連結されたヌクレオシド構造を有する基を導入することが好ましい。
具体的な製造の一例として、前記無機多孔質基材中の活性ＮＨ基に、反応性の基が保護されたヌクレオシド構造とスクシニルリンカーとを有する化合物を反応させる製造法を以下に示す。反応性の基が保護されたヌクレオシド構造とスクシニルリンカーとを有する化合物の好ましい例としては、カルボン酸末端を有する化合物が挙げられる（以下、ｎｓｕｃ化合物と呼ぶ場合もある）。具体的には下記式（ｎｓｕｃ−１）で表されるものを例示することができる。好ましい反応としては、前記無機多孔質基材中の活性ＮＨ基と、ｎｓｕｃ化合物の縮合反応が挙げられる。

［式（ｎｓｕｃ−１）中、＊は水酸基、水酸基とピリジンからなる塩、または、水酸基とトリエチルアミンからなる塩を表し、ＴＢＤＭＳはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基を表す。］

ここでの縮合反応は、前記無機多孔質基材と、ｎｓｕｃ化合物と、縮合剤と、適切な溶媒とを混合し、通常、室温で振とうするか、あるいは縮合反応促進のために昇温して行われる。この縮合反応は、振とうせずに静置しても、撹拌しつつ行ってもよい。
また、同縮合反応は、４〜３０時間程度で行われるが、適宜、反応時間を長くしても短くしてもよい。

前記縮合反応の際に用いる縮合剤には、一般にアミド縮合に使用されているものであれば用いることができる。縮合剤として具体的には、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−ベンゾトリアゾリウム３−オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドテトラフルオロボラート（ＴＡＴＵ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−ベンゾトリアゾリウム３−オキシドテトラフルオロボラート（ＴＢＴＵ）、（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノモルホリノカルベニウムヘキサフルオロホスファート（ＣＯＭＵ）、およびＯ−［（エトキシカルボニル）シアノメチレンアミノ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＴＯＴＵ）等が例示される。
また、同縮合反応では、適宜、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、および１−メチルイミダゾールなどの添加剤を加えてもよい。

縮合反応後、固形分を濾別し、洗浄する。洗浄用の溶媒としては、アセトニトリル等が挙げられる。未反応の活性ＮＨ基および無機多孔質担体上のシリル基に含まれるその他のＮ−Ｈ部位を有するアミノ基に対してはキャッピング処理を行う。同キャッピング処理に用いる試薬としては、酸無水物と含窒素有機塩基の混合物を用いることができる。上記酸無水物の具体例としては、無水酢酸やフェノキシ酢酸無水物が挙げられ、好ましくは無水酢酸が挙げられる。上記含窒素有機塩基の具体例としては、１−メチルイミダゾール、２，６−ルチジン、ピリジン、および４−ジメチルアミノピリジンなどの含窒素芳香族複素環化合物や、トリエチルアミンなどの第３級アルキルアミンが挙げられる。同キャッピング処理に用いる試薬の添加量としては、酸無水物においては無機多孔質基材中に含まれるＮＨ基の量の１０倍モル当量以上を用い、含窒素有機塩基においては用いる酸無水物の等モル当量以上を用いる。このような添加量である場合に、該固形分中のＮＨ基が十分キャッピング処理される。また、同キャッピング処理に用いる試薬は、適宜、有機溶媒を併用してもよく、具体的には、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、およびアセトニトリルなどが挙げられる。有機溶媒の使用量としては上記固形分が十分浸漬できる容積量が望ましい。
キャッピング処理後、アセトニトリル等により反応混合物の洗浄を行い、乾燥させることで無機多孔質担体が得られる。

なお、活性ＮＨ基に、反応性の基が、保護または脱保護された、ヌクレオシド又はヌクレオチド構造を有する基が１つも導入されず、キャッピング処理されたシリル基は、核酸合成における機能の点から、シリル基（Ｂ）と分類することとする。
上記式（ii−１ａ）、（ii−２ａ）および（ii−３ａ）で表されるシランカップリング剤に由来するシリル基をシリル基（Ｂ）−１と呼ぶこともあり、活性ＮＨ基に、反応性の基が、保護または脱保護された、ヌクレオシドまたはヌクレオチド構造を有する基が１つも導入されず、キャッピング処理されたシリル基をシリル基（Ｂ）−２と呼ぶこともある。

本発明の無機多孔質担体は、核酸合成に適用する観点から、下記数式（ｉｖ−１）で規定される外表面ｔＰＳＡ値が５６以上、８３以下であることを特徴とする。

ｔＰＳＡ値の総和値（Å^２ ・ μｍｏｌ／ｇ）：下記式（iv−２）で表される値

外表面官能基ｔＰＳＡ値(Å^２)：無機多孔質担体の外表面官能基に対するｔＰＳＡ値を表わし、ソフトウェア計算により導出される値

上記数式（iv−１）中、原料の無機成形体における外表面シラノール担持量とは以下に示す測定方法で求めることができる。
［無機成形体における外表面シラノール担持量の測定方法］
担体（Ｔ）の調製
まず、２−（ｍ−トルイル）エタノール／ｎ−ドデカン混合溶液（２−（ｍ−トルイル）エタノール／ｎ−ドデカン＝１／１（重量比））を調製する。別途ガラス容器に無機成形体（１重量部）を導入し、ここに調製した２−（ｍ−トルイル）エタノール／ｎ−ドデカン混合溶液（４重量部）を添加する。この混合物を２００℃で、３時間加熱する。加熱後、ろ過にて固形分を取出し、トルエン（８０重量部）にて洗浄したのち、８０℃／真空下で４時間乾燥させる。このようにして、無機成形体の外表面におけるシラノール基の−ＯＨ基が２−（ｍ−トルイル）エトキシ基に置換された担体（Ｔ）を得る。

^１Ｈ−ＮＭＲ測定
３．６０ｗｔ％ＮａＯＤ／ジメチルスルホキシド−ｄ^６混合溶液（３．６０ｗｔ％ＮａＯＤ／ジメチルスルホキシド−ｄ^６＝１／３．５重量比）を調製する。ガラス容器に担体（Ｔ）を６０〜２００ｍｇ秤取り、調製した３．６０ｗｔ％ＮａＯＤ／ジメチルスルホキシド−ｄ^６混合溶液を８００〜１２００ｍｇ加える。混合物を４５℃で、２時間の超音波処理を行う。超音波処理後の混合物に１,３,５−トリオキサン水溶液（３０ｍｇ）を内部標準として添加し、混合する。得られた混合物をグラスウールで栓をしたパスツールピペット等のフィルターに導入し、固形分をろ別し、ろ液を得る。得られたろ液を^１Ｈ−ＮＭＲ測定し、ろ液中に含まれる２−（ｍ−トルイル）エタノールを内部標準との積分比から定量する。得られた２−（ｍ−トルイル）エタノールの定量値を用いた担体（Ｔ）の重量で除して、原料の無機成形体における外表面シラノール担持量（μｍｏｌ／ｇ）を求めることができる。

上記数式（iv−１）中、外表面のトポジカル極性表面積（ｔＰＳＡ）値とは、無機多孔質担体中の外表面官能基について、ソフトウェア計算により求められる。ここでのソフトウェア計算に用いるソフトウェアとしては、ＣｈｅｍＤｒａｗ １８．２を用いることができる。

上記ソフトウェア計算に適用する外表面シラノール基の構造は、下記式（Ｓｉ−１＃）の構造とする。

［式（Ｓｉ−１＃）中、＊は水酸基を表す。］

本ソフトウェア計算に適用するシリル基（Ａ）の構造としては、無機多孔質担体との結合を水酸基で置換した構造を採用することとする。具体的には、上記式（ｉ−１ａ）または（ｉ−１ｂ）で表されるシランカップリング剤を用いて無機多孔質担体を調製した場合、下記式（ｉ−１ｓｗ）で表される構造を適用してソフトウェア計算を行う。

［式（ｉ−１ｓｗ）中、
Ｃ１は、上記式（ｉ−１）におけるＣ１と同じものを表し、
＃は水酸基を表し、
Ｚ１０は、無機多孔質基材の合成に用いた上記式（ｉ−１ａ）または（ｉ−１ｂ）中のＺ１と同じ基を表し、
Ａ１０は、無機多孔質担体の合成に用いた上記式（ｉ−１ａ）または（ｉ−１ｂ）中のＡ１００に由来する基を表し、そして、
Ｂ１０は、無機多孔質担体の合成に用いた上記式（ｉ−１ａ）または（ｉ−１ｂ）中のＢ１と同じ基を表す。］

上記シリル基（Ａ０）が複数のＮ−Ｈ部位を有するアミノ基を含むシリル基であり、これがシリル基（Ａ）へ誘導された場合、上記ソフトウェア計算に適用する構造としては、シリル基（Ａ）末端側の活性ＮＨ基へ優先的に上記式（ｉ−１）におけるＣ１が導入され、残存するＮ−Ｈ部位を有するアミノ基が存在する場合は後述のようにその後のキャップ処理で全てキャップ基が導入されるとして、シリル基（Ａ）の構造を規定し、ソフトウェア計算を行うこととする。具体例として、２つのＮ−Ｈ部位を有するアミノ基を含むシリル基（Ａ０）にＣ１が一つ導入される場合の例を、下記式（ＮＨＣ１−１＃）に示す。

［式（ＮＨＣ１−１＃）中、
＊は無機多孔質担体との結合を表わし、
Ｃ１は、上記式（ｉ−１）におけるＣ１と同様なものを表し、そして、
ＣＡＰは、上記キャップ処理により導入されるキャップ基であり、アセチル基またはフェノキシアセチル基を表す。］

本ソフトウェア計算に適用するシリル基（Ｂ）構造としては、無機多孔質担体との結合が１つとみなし、同無機多孔質担体との結合を水酸基で置換した構造を採用することとする。具体的には、上記式（ii−１ａ）、（ii−２ａ）または（ii−３ａ）で表されるシランカップリング剤を用いて無機多孔質担体を調製した場合、下記式（ii−１ｓｗ）、（ii−２ｓｗ）、または（ii−３ｓｗ）で表される構造をそれぞれ適用してソフトウェア計算を行う。

、

、

［式（ii−１ｓｗ）、（ii−２ｓｗ）、（ii−３ｓｗ）中、
＃は水酸基を表し、そして
Ｒ０、Ｓ０、Ｊ１、Ｋ１、Ｍ１、およびＮ１は、無機多孔質基材の合成に用いた上記式（ii−１ａ）、（ii−２ａ）、または（ii−３ａ）中のＲ０、Ｓ０、Ｊ１、Ｋ１、Ｍ１、およびＮ１とそれぞれ同じものを表わす。］

上記数式（iv−１）中、各外表面官能基の担持量（μｍｏｌ／ｇ）とは、無機多孔質担体中のシリル基（Ａ）、シリル基（Ｂ）−１、シリル基（Ｂ）−２、およびいずれのシリル基も導入されていない外表面シラノール基のそれぞれについての担持量を表す。これらは以下に示す方法で求めることができる。

［シリル基（Ａ）担持量の測定方法］
シリル基（Ａ）は、担体調製時、反応性の基が保護されたヌクレオシドまたはヌクレオチド構造を有する基を有している。トリチル系保護基が導入されている場合、酸性条件でトリチル系保護基を脱保護し、生成するトリチルカチオン種の吸光度を測定することで、シリル基（Ａ）担持量を算出することができる。
４，４’−ジメトキシトリチル基が保護基として導入されている場合、以下の測定方法で求めることができる。すなわち、先ず７０％過塩素酸をメタノールで希釈し、３０％過塩素酸溶液を調製する。次いで、無機多孔質担体２０〜５０ｍｇをメスフラスコに採取し、３０％過塩素酸溶液で１０ｍＬに希釈する。この溶液を３０％過塩素酸溶液でさらに１０倍に希釈した後、脱離した４，４’−ジメトキシトリチルカチオンの４９８ｎｍでの吸光度を測定し、シリル基（Ａ）担持量を算出する。

［シリル基（Ｂ）−１担持量の測定方法］
上記式（ii−３ａ）で表されるシランカップリング剤により導入されたシリル基（Ｂ）−１担持量は、以下の方法で求めることができる。すなわち、前駆体の無機多孔質基材と水酸化ナトリウムなどのアルカリ成分を含有する重水素化溶媒を混合したのち、ここに１，３，５−トリオキサンなどの内部標準を添加し、混合する。得られた混合物をろ過し、ろ液を^１Ｈ ＮＭＲ測定する。ろ液中に含まれる遊離したシリル基（Ｂ）−１由来成分を内部標準との積分比から定量する。得られた定量値を用いた無機多孔質基材の重量で除して、シリル基（Ｂ）−１担持量（μｍｏｌ／ｇ）を求めることができる。より具体的には以下のような手法を例示することができる。
３．６０ｗｔ％ＮａＯＤ ａｑ．／ジメチルスルホキシド−ｄ^６混合溶液（３．６０ｗｔ％ＮａＯＤ ａｑ．／ジメチルスルホキシド−ｄ^６＝１／３．５重量比〜２／１重量比）を調製する。ガラス容器に前駆体の無機多孔質基材を６０〜２００ｍｇ秤取り、調製した３．６０ｗｔ％ＮａＯＤ ａｑ．／ジメチルスルホキシド−ｄ^６混合溶液を８００〜１２００ｍｇ加える。混合物を４５℃で、２時間の超音波処理を行う。超音波処理後の混合物に１，３，５−トリオキサン水溶液（３０ｍｇ）を内部標準として添加し、混合する。得られた混合物をグラスウールで栓をしたパスツールピペット等のフィルターに導入し、固形分をろ別し、ろ液を得る。得られたろ液を^１Ｈ ＮＭＲ測定し、ろ液中に含まれるＮａＯＤとの反応で遊離したシランカップリング剤により導入されたシリル基（Ｂ）−１由来成分を内部標準との積分比から定量する。得られた定量値を用いた無機多孔質基材の重量で除して、シリル基（Ｂ）−１担持量（μｍｏｌ／ｇ）を求めることができる。

［シリル基（Ｂ）−２担持量の測定方法］
シリル基（Ｂ）−２の担持量は、Ｎ−Ｈ部位を有するアミノ基のキャッピング処理は定量的に進行することから、下記式（Ｂ−２＃１）で求めることができる。

上記式（Ｂ−２＃１）中、シリル基（Ａ０）担持量（μｍｏｌ／ｇ）は以下の手法で求めることができる。
無機多孔質基材中のシリル基（Ａ０）担持量（μｍｏｌ／ｇ）は、２−ニトロベンゼンスルホン酸吸着法により測定される。「２−ニトロベンゼンスルホン酸吸着法」とは、アミノ基にイオン結合する２−ニトロベンゼンスルホン酸の量に基づき、アミノ基を定量する方法を意味する。

２−ニトロベンゼンスルホン酸吸着法によるアミノ基量の測定は、以下のように行うことができる。
３０ｍｇ程度の無機多孔質基材を、脱脂綿で栓をしたパスツールピペット等のフィルターに採取し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（ＤＩＰＥＡ ５容量％）１ｍＬを通液して洗浄する。次いで、２−ニトロベンゼンスルホン酸のＴＨＦ溶液（２−ニトロベンゼンスルホン酸 ５０ｍＭ）１ｍＬで４回通液した後、１ｍＬのＴＨＦで４回通液洗浄する。次いで、１０ｍＬメスフラスコ等の容器を受器として、希アンモニア水（２８％アンモニア水と水とを体積比１：１００で混合した溶液）とアセトニトリルとを体積比１：１で混合した混合溶液を通液する。受器に受けた流出液に、アセトニトリルの水溶液（アセトニトリル １５容量％）を添加して１０ｍＬとし、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析し、２−ニトロベンゼンスルホン酸のピーク面積値を測定する。ＨＰＬＣの分析条件は、２−ニトロベンゼンスルホン酸を測定可能な条件であれば、特に限定されないが、例えば、以下に示す分析条件等が例示される。
ＨＰＬＣの分析条件例
カラム：Ｓｃｈｅｒｚｏ ＳＭ−Ｃ１８（Ｉｍｔａｋｔ製），４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ，３μｍ
移動相：Ａ液 １０ｍＭ ギ酸アンモニウム水溶液
Ｂ液 アセトニトリル
グラジエント条件：Ａ／Ｂ＝８５％／１５％（一定）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出波長：２１０ｎｍ
注入量：１０μＬ
前記２−ニトロベンゼンスルホン酸のピーク面積値をＡＲ、分析に用いた無機多孔質基材の質量をＭＡ、２−ニトロベンゼンスルホン酸の標準溶液を用いて作成した検量線の傾きをａ０１、検量線の切片をｂ０１とすると、アミノ基量は、以下のように算出することができる。下記式中、「２０３．１７」は、２−ニトロベンゼンスルホン酸（Ｃ_６Ｈ_５ＮＯ_５Ｓ）の分子量である。

算出されたアミノ基量に基づき、シリル基（Ａ０）担持量（μｍｏｌ／ｇ）は以下のように導出することができる。

また、算出されたアミノ基量に基づき、活性ＮＨ基量は以下のように導出することができる。

［いずれのシリル基も導入されていない外表面シラノール基の測定方法］
いずれのシリル基も導入されていない外表面シラノール基の担持量は、下記式（ＳｉＯＨ＃１）で求めることができる。

本発明の無機多孔質担体は、核酸合成に適用する観点から、上記数式（iv−１）で規定される外表面ｔＰＳＡ値が５６以上、８３以下であることを特徴とし、
好ましくは５６以上、８３以下であり、
より好ましくは５７以上、８２以下であり、
更に好ましくは５８以上、８１以下であり、
より更に好ましくは６０以上、７９以下であり、
より一層更に好ましくは６２以上、７７以下であり、
特に好ましくは６３以上、７６以下である。

本発明の無機多孔質担体の粒子径は、後述の核酸の製造において、核酸合成機配管の閉塞防止などの観点から、１μｍ以上であることを特徴とする。好ましくは５μｍ以上であり、より好ましくは１０μｍ以上であり、より更に好ましくは２０μｍ以上であり、特に好ましくは３０μｍ以上である。粒子径の制御は、原料である無機成形体、無機多孔質基材または無機多孔質担体を、該当する粒子径以上の目開きの篩いで篩別を行い、微粒成分を取り除くことで行うことができる。
本発明の無機多孔質担体の粒子径は、原料である無機成形体について走査電子顕微鏡による２００倍の視野での観察を行い、同観察における任意の５０個の粒子の長径の平均値として求めることができる。

本発明における無機多孔質担体は、核酸合成に適用する観点から、細孔径４０ｎｍから１０００ｎｍの範囲における累積細孔容積が０．３２ｍＬ／ｇよりも大きく４ｍＬ／ｇ以下であることを特徴とする。同範囲での累積細孔容積として、好ましくは０．３５ｍＬ／ｇよりも大きく３．５ｍＬ／ｇ以下であり、より好ましくは０．４ｍＬ／ｇよりも大きく３ｍＬ／ｇ以下であり、更に好ましくは０．４３ｍＬ／ｇよりも大きく３ｍＬ／ｇ以下であり、より更に好ましくは０．４５ｍＬ／ｇよりも大きく２．５ｍＬ／ｇ以下である。ここでの細孔径４０ｎｍから１０００ｎｍの範囲にある累積細孔容積は、原料である無機成形体を水銀圧入法により分析することで求めることができる。

本発明の無機多孔質担体の好例の一つとして、核酸合成に用いる観点から、無機多孔質担体の比表面積が、０．１ｍ^２／ｇ以上、２００ｍ^２／ｇ以下であることが挙げられる。該比表面積は、原料である無機成形体について窒素吸脱着等温線測定を行い、αｓ−ｐｌｏｔ法によるαｓ＝１．７〜２．１の範囲の平均勾配から求められる比表面積の値を適用することができる。該比表面積は好ましくは１ｍ^２／ｇ以上、１５０ｍ^２／ｇ以下、より好ましくは５ｍ^２／ｇ以上、１００ｍ^２／ｇ以下、さらに好ましくは８ｍ^２／ｇ以上、８０ｍ^２／ｇ以下、特に好ましくは１０ｍ^２／ｇ以上、６０ｍ^２／ｇ以下である。

本発明の無機多孔質担体に用いられる無機材質としては、種々の無機材質を用いることができるが、シラノール基を伴うケイ素酸化物を含むものが好ましい。具体的には、シリカ、シリカゲル、ゼオライト、またはガラスからなるものが好ましく、このような無機材質からなる無機成形体を原料として用いることが好ましい。

本発明の無機多孔質担体は、反応性の基が保護または脱保護された、ヌクレオシドまたはヌクレオチド構造を有する基の量が下記式（Ｎｕ＃１）を満たすことを特徴とする。

Ｉ１：無機多孔質担体中の、反応性の基が、保護または脱保護された、ヌクレオシドまたはヌクレオチド構造を有する基（μｍｏｌ／ｇ）
Ｓ１：窒素吸脱着等温線測定により得られる、無機多孔質担体の比表面積（ｍ^２／ｇ）
無機多孔質担体中の、反応性の基が保護または脱保護された、ヌクレオシドまたはヌクレオチド構造を有する基（μｍｏｌ／ｇ）は、上記のシリル基（Ａ）担持量の測定方法におけるシリル基（Ａ）担持量（μｍｏｌ／ｇ）の値を適用することができる。窒素吸脱着等温線測定により得られる、無機多孔質担体の比表面積（ｍ^２／ｇ）は上記記載の手法により求めることができる。

Ｉ１／Ｓ１の好ましい範囲としては、０．１以上、２．０以下であり、より好ましくは０．３以上、１．８以下であり、さらに好ましくは０．４以上、１．６以下である。

本発明の無機多孔質担体の好例の一つとして、担体合成および核酸合成の点から、無機多孔質担体としての前記一般式（ｉ−１）中のＣ１が、スクシニルリンカーまたはユニバーサルリンカーを含むものが挙げられる。
ユニバーサルリンカーとは、核酸合成の起点となるヌクレオチドのヒドロキシル基とホスファイトを形成する官能基（典型的には、ヒドロキシル基）と、上記の活性ＮＨ基と結合する能力を有する官能基とを有し、かつ、同一分子内に、合成された核酸を切り離す際の条件下で、リン酸のリン原子を求核攻撃する能力を有する隣接する保護された官能基（例えば、いずれも保護されたアミノ基、ヒドロキシル基、またはチオール基）を有する。
より詳しくは、スクシニルリンカーとしては下記の式Ｌ１０＃で表される連結基が挙げられ、ユニバーサルリンカーとしては下記の式Ｌ１１で表される連結基が挙げられる。

、

式Ｌ１０＃および式Ｌ１１＃において、●を付した結合は、上記式（ｉ−１）中のＮへの結合を表す。▲を付した結合は、Ｃ１における反応性の基が、保護または脱保護された、ヌクレオシドまたはヌクレオチド構造部位中の第１級または第２級水酸基の酸素原子との結合を表す。
式Ｌ１１＃において、ＺＨは、保護されたアミノ基、ヒドロキシル基、またはチオール基を表す。ＺＣは炭素原子を含む任意の基を表し、ＺＣに結合している酸素原子およびＺＨは、互いに隣接（例えば、ビシナルに存在し、それぞれが結合しているＺＣ中の炭素原子同士は、互いに直接結合している）している基を表す。Ｌ１２は、上記式（ｉ−１）におけるＮと上記式（Ｌ１１＃）におけるＺＣとを連結する基を表す（具体的には、例えばＬ１０＃で表される基を挙げることができる）。

尚、ユニバーサルリンカーを用いた場合、合成を予定する核酸の３’末端がどのような種類のヌクレオシドまたはヌクレオチドであっても、３’末端になるヌクレオシドホスホロアミダイドを通常の核酸自動合成において核酸を伸長する工程と同じように反応させて導入することができる。かかるユニバーサルリンカーとしては、例えば、下記の文献に記載の化合物が例示されるが、それらに限定されるものではない。
文献：Ａ.Ｐ. Ｇｕｚａｅｖ, ａｎｄ Ｍ. Ｍａｎｏｈａｒａｎ, Ｊ. Ａｍ. Ｃｈｅｍ. Ｓｏｃ., ２００３, １２５, ２３８０−２３８１.
文献：Ｒ.Ｋ. Ｋｕｍａｒ, Ａ.Ｐ. Ｇｕｚａｅｖ, Ｃ. Ｒｅｎｔｅｌ, ａｎｄ Ｖ.Ｔ Ｒａｖｉｋｕｍａｒ, Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ, ２００６, ６２, ４５２８.

上記一般式（ｉ−１）中のＣ１がスクシニルリンカーまたはユニバーサルリンカーを含むものの中でも、より好ましいものとしてはスクシニルリンカーを含むものが挙げられる。

Ｃ１における反応性の基が、保護または脱保護された、ヌクレオシドまたはヌクレオチド構造部位は、核酸伸長反応の起点となるヌクレオシドの５’位のヒドロキシル基が、トリチル系保護基（例えば、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基等）により保護されたものが好ましい。
ユニバーサルリンカーを用いる場合も同様に、核酸伸長反応の起点となるヒドロキシル基が、トリチル系保護基（例えば、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基等）により保護されたものが好ましい。

スクシニルリンカーを含むＣ１の具体例としては、下記式（ｎｓｕｃ−２）で表されるものを挙げることができる。

［式（ｎｓｕｃ−２）中、＊は上記一般式（ｉ−１）中のＮへの結合を表す。］

本発明の無機多孔質担体において、シリル基（Ｂ）としては、上記式（ii−３）で表されるシリル基が好ましく、中でも下記式（ii−３−１）で表されるシリル基がより好ましい。

［式（ii−３−１）中、
Ｐ１は、無機多孔質担体との結合を表し、
Ｋ２は、それぞれ独立して、炭素数１〜６のアルキル基、または１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数６〜１０のアリール基を表し、
Ｍ２は、炭素数１〜４のアルキレン基を表し、そして、
Ｎ２は、炭素数２〜６のアルキル基、または１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数６〜１０のアリール基を表わす。］

上記式中のＰ１の定義は明細書中に前記する通りである。

式（ii−１−１）中、Ｋ２は、それぞれ独立して、炭素数１〜６のアルキル基、または１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数６〜１０のアリール基を表わす。
Ｋ２における炭素数１〜６のアルキル基の具体例および好ましい例としては、前記Ｋ１における炭素数１〜６のアルキル基と同様なものを挙げることができる。
Ｋ２における１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数６〜１０のアリール基としては、１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい香族炭化水素基が挙げられ、好ましくはフェニル基が挙げられる。ここでのフェニル基は置換基を有していてもよく、該置換基としては炭素数１〜４のアルキル基、および炭素数１〜４のアルコキシ基が挙げられる。

式（ii−１−１）中、Ｍ２は、炭素数１〜２のアルキレン基を表わし、具体的にはメチレン基、エチレン基が挙げられる。

式（ii−１−１）中、Ｎ２は、炭素数２〜６のアルキル基、または１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数６〜１０のアリール基を表わす。
Ｎ２における炭素数２〜６のアルキル基の具体例および好ましい例としては、前記Ｎ１における炭素数２〜６のアルキル基と同様なものを挙げることができる。
Ｎ２における１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数６〜１０のアリール基としては、前記Ｋ２における１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数６〜１０のアリール基と同様なものを挙げることができる。

上記式（ii−１−１）で表されるシリル基の具体例としては、下記式（ii−１−１−Ａ）を挙げることができる。

［式（ii−１−１−Ａ）中、＊は無機多孔質担体との結合を表わす。］

本発明の無機多孔質担体の好例の一つとして、上記式（ｉ−１）中のＡ１が、アシルイミノ基、オキシ基、またはチオ基のいずれか１つ以上を含んでいてもよい炭素数１〜２０のアルキレン基であるものが挙げられる。
なお、Ａ１におけるアシルイミノ基は、上記記載のように無機多孔質担体の前駆体である無機多孔質基材に含まれるＮＨ基が、上記キャッピング処理によりアシルイミノ基へ誘導されたものを含む。Ａ１におけるアシルイミノ基の具体例としては、−Ｎ（ＣＯＣＨ_３）−および−Ｎ（ＣＯＣＨ_２ＯＰｈ）−が挙げられ、好ましくは−Ｎ（ＣＯＣＨ_３）−である。
このようなＡ１の具体例としては、下記式（Ａ１−ｅｘ）を挙げることができる。

［式（Ａ１−ｅｘ）中、
（Ｎ）は、上記一般式（ｉ−１）中のＮへの結合を表し、
（Ｓｉ）は、上記一般式（ｉ−１）中のＳｉへの結合を表わし、そして、
ＣＡＰは、上記キャップ処理により導入されるキャップ基であり、アセチル基を表す。］

本発明の無機多孔質担体の好例の一つとして、前記シリル基（Ａ）が下記式（ｉ−１−１）で表されるものが挙げられる。

［式（ｉ−１−１）中、
Ｘ１は、無機多孔質担体との結合を表し、
Ｚ１は、それぞれ独立して、炭素数１〜６のアルキル基、または炭素数６〜１２のアリール基を表し、そして、
Ａ２は、アシルイミノ基、オキシ基、またはチオ基のいずれか１つ以上を含んでいてもよい炭素数１〜１５のアルキレン基を表し、
Ｂ２は、水素原子または炭素数１〜２のアルキル基のいずれかを表わし、そして、
Ｃ２は、スクシニルリンカーを含み、かつ反応性の基が、保護または脱保護された、ヌクレオシドまたはヌクレオチド構造を有する基を表す。］

上記式中のＸ１およびＺ１の定義は明細書中に前記する通りである。

式（ｉ−１−１）中、Ａ２は、アシルイミノ基、オキシ基、またはチオ基のいずれか１つ以上を含んでいてもよい炭素数１〜１５のアルキレン基を表わす。Ａ２の具体例としては、上記式（Ａ１−ｅｘ）中の（Ａ１−１）〜（Ａ１−１５）および（Ａ１−１７）を挙げることができる。

式（ｉ−１−１）中、Ｂ２は、水素原子、または炭素数１〜２のアルキル基からなる群から選ばれるいずれかを表わす。Ｂ２における炭素数１〜２のアルキル基としてはメチル基およびエチル基が挙げられる。好ましいＢ２としては水素原子およびメチル基であり、より好ましくは水素原子である。

式（ｉ−１−１）中、Ｃ２は、スクシニルリンカーを含み、かつ反応性の基が、保護または脱保護された、ヌクレオシドまたはヌクレオチド構造を有する基を表す。具体的には上記式（ｎｓｕｃ−２）で表されるものを挙げることができる。

上記式（ｉ−１−１）で表される基について、Ｘ１、Ｚ１、Ａ２、およびＢ２の好ましい組合せの例を下記式（ｉ−１−１＃）に示す。

［式（ｉ−１−１＃）中、
（Ｃ２）は、（ｉ−１−１）中のＣ２への結合を表し、
＊は、無機多孔質担体との結合を表わし、そして、
ＣＡＰは、上記キャップ処理により導入されるキャップ基であり、具体例としてアセチル基を表す］

本実施形態の固相担体は、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の固相合成用基材として好適なものである。中でも、本実施形態の固相担体は、ＤＮＡに比べて安定性に劣るとされるＲＮＡの合成に特に適している。

以下、ＲＮＡの固相合成を例に挙げて、以下に示す反応経路（縮合反応、酸化、および脱保護）を参照しながら核酸の製造方法について説明する。尚、以下に示す反応経路については、前記式（ｉ−１）中のＣ１にヌクレオシド構造を有する基を用いた例を示す。

反応経路の例

反応経路を示す前記化学式中、Ｒ^４は塩基；Ｔｒは保護基；Ｘは−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲ^５（Ｒ^５は保護基）、ＳＰは無機多孔質担体のヌクレオシド構造以外の部分をそれぞれ表している。

ヌクレオシド構造を有する無機多孔質担体（Ｓｐ−Ｎｕ）およびアミダイトモノマー（Ａｍ−１）のヌクレオシドを構成する塩基（Ｒ^４）は、通常、核酸、典型的にはＲＮＡを構成する天然の塩基であるが、非天然の塩基を適宜使用してもよい。かかる非天然の塩基としては、天然または非天然の塩基の修飾アナログが例示される。

Ｒ^４で表される塩基としては、例えば、アデニン、イソグアニン、キサンチン、ヒポキサンチン及びグアニン等のプリン塩基；シトシン、ウラシル及びチミン等のピリミジン塩基等が挙げられる。

また、Ｒ^４で表される塩基としては、例えば、２−アミノアデニン、６−メチル化プリン等のアルキル誘導体；２−プロピル化プリン等のアルキル誘導体；５−ハロウラシル及び５−ハロシトシン；５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシン；６−アゾウラシル、６−アゾシトシン及び６−アゾチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル；８−ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化及び他の８−置換プリン；５−トリフルオロメチル化及び他の５−置換ピリミジン；７−メチルグアニン；５−置換ピリミジン；６−アザピリミジン；Ｎ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）；５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；３−デアザ−５−アザシトシン；２−アミノプリン；５−アルキルウラシル；７−アルキルグアニン；５−アルキルシトシン；７−デアザアデニン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン；２，６−ジアミノプリン；５−アミノ−アリル−ウラシル；Ｎ３−メチルウラシル；置換１，２，４−トリアゾール；２−ピリジノン；５−ニトロインドール；３−ニトロピロール；５−メトキシウラシル；ウラシル−５−オキシ酢酸；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メチル−２−チオウラシル；５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル；５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ４−アセチルシトシン；２−チオシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；Ｎ６−イソペンチルアデニン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；Ｎ−メチルグアニン；および、Ｏ−アルキル化塩基等が挙げられる。

また、プリン化合物及びピリミジン化合物は、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」，８５８〜８５９頁，クロシュビッツ ジェー アイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０、及びイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈら）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０巻，ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。

好適なアミダイトモノマー（Ａｍ−１）としては、下記化学式（Ａｍ−１’）で表される化合物において、Ｒ^５がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基、ビス（２−アセトキシ）メチル（ＡＣＥ）基、（トリイソプロピルシリロキシ）メチル（ＴＯＭ）基、（２−シアノエトキシ）エチル（ＣＥＥ）基、（２−シアノエトキシ）メチル（ＣＥＭ）基、パラ−トルイルスルホニルエトキシメチル（ＴＥＭ）基、（２−シアノエトキシ）メトキシメチル（ＥＭＭ）基などで保護された、ＴＢＤＭＳアミダイト（ＴＢＤＭＳ ＲＮＡ Ａｍｉｄｉｔｅｓ、商品名、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＡＣＥアミダイト、ＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト（Chakhmakhchevaの総説：Protective Groups in the Chemical Synthesis of Oligoribonucleotides、Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2013, Vol. 39, No. 1, pp. 1-21.）、ＥＭＭアミダイト（国際公開第２０１３／０２７８４３号に記載）等が例示される。

［式中、Ｒ^５は、ヒドロキシル基の保護基を表す。Ｒ^４は、保護された核酸塩基を示す。］

本実施形態の無機多孔質担体は、ヌクレオシドや、ヌクレオチド以外の２価の基を核酸配列に組み込むために使うこともできる。例えば、プロリン骨格を有するアミダイト（後述のアミダイトＰなど）を、アミダイト法により、核酸配列に組み込むことができる（国際公開第２０１２／０１７９１９号の実施例Ａ４の方法と同様の方法を参照）。また、下記の構造式（Ａｍ−１１）、（Ａｍ−１２）および（Ａｍ−１３）でそれぞれ表されるアミダイト（国際公開第２０１３／１０３１４６号の実施例Ａ１〜Ａ３参照）を使用することもできる。

［式中、ｉＰｒはイソプロピル基を表す。ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリチル基を表す。Ｔｆａはトリフルオロアセチル基を表す。］

［ＲＮＡの固相合成］
無機多孔質担体（Ｓｐ−Ｎｕ）のＴｒ基を脱保護して、固相担体（Ａｍ−２）を得る。この後、アミダイトモノマー（Ａｍ−１）と、固相担体（Ａｍ−２）とを縮合反応させて、反応生成物（Ａｍ−３）を得る。この後、反応生成物（Ａｍ−３）を酸化して、生成物（Ａｍ−４）を得る。この後、生成物（Ａｍ−４）を脱保護（−Ｔｒ）して、生成物（Ａｍ−５）を得る。次いで、アミダイトモノマー（Ａｍ−１）と生成物（Ａｍ−５）とを更に縮合反応させて、ホスホジエステル結合を伸長していく。このように、伸長したオリゴヌクレオチド鎖末端の５’位のヒドロキシル基を、所望の配列となるように、一連の脱保護、縮合反応、酸化のサイクルを必要なだけ繰り返し、この後、固相担体から切り出すことにより、所望の配列の核酸分子を製造することができる。

より詳しくは、以下の工程を含む製造方法により核酸が製造される。
上記式（ｉ−１）中のＣ１が、反応性の基としてヒドロキシル基が保護されたヌクレオシドまたはヌクレオチド構造を有する基を持つ無機多孔質担体を用い、
工程（Ａ）：前記のヌクレオシドの５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程、
工程（Ｂ）：前記工程（Ａ）において生成したヌクレオシドの５’位のヒドロキシル基と、第２のヌクレオシド塩基を有するアミダイト化合物とを縮合反応させて、ホスファイトを生成する工程、
工程（Ｃ）：前記工程（Ｂ）において生成したホスファイトを酸化させて、ヌクレオチドを生成する工程、および、
工程（Ｄ）：前記工程（Ｃ）において生成したヌクレオチドの５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程。

前記の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む製造方法は、任意に以下の工程を含む。
工程（Ｂ’）：前記工程（Ｄ）において生成した生成物と、次に導入予定のヌクレオシド塩基を有するアミダイト化合物とをさらに縮合反応させて、ホスファイトを生成する工程、
工程（Ｃ’）：前記工程（Ｂ’）において生成したホスファイトを酸化させて、オリゴヌクレオチドを生成する工程、
工程（Ｄ’）：前記工程（Ｃ’）において生成したオリゴヌクレオチド鎖末端の５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程、および
工程（Ｅ）：前記の工程（Ｂ’）、工程（Ｃ’）及び工程（Ｄ’）の一連の工程を、さらにｍ回（ｍは、１以上の整数を表す。）繰り返して、ｍ個のアミダイト化合物を反応（核酸伸長反応）させた後、伸長した核酸を切り出す工程。

本実施形態における核酸伸長反応は、一般的なホスホロアミダイト法の手順に従い行うことができる。
本明細書において、「核酸伸長反応」とは、ホスホジエステル結合を介して、ヌクレオチドを順次結合させることにより、核酸鎖、特にＲＮＡ鎖を伸長させる反応を意味する。核酸伸長反応は、ホスホロアミダイト法を採用する核酸自動合成装置等を用いて行ってもよい。

脱保護する工程では、固相担体上に担持されるＲＮＡ鎖末端の５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する。一般的な保護基としては、トリチル系保護基（典型的には、ＤＭＴｒ基）が用いられる。脱保護は、酸を用いて行うことができる。脱保護用の酸としては、例えば、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が挙げられる。

縮合工程では、前記の脱保護する工程により脱保護したＲＮＡ鎖末端の５’位のヒドロキシル基に対して、ヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させて、ホスファイトを生成する。前記ヌクレオシドホスホロアミダイトとしては、５’位のヒドロキシル基が保護基（例えばＤＭＴｒ基）で保護されたものを用いる。

また、縮合工程は、前記ヌクレオシドホスホロアミダイトを活性化する活性化剤を用いて行うことができる。活性化剤としては、例えば、５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＢＴＴ）、１Ｈ−テトラゾール、４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）、Ｎ−メチルベンズイミダゾリウムトリフラート（Ｎ−ＭｅＢＩＴ）、ベンズイミダゾリウムトリフラート（ＢＩＴ）、Ｎ−フェニルイミダゾリウムトリフラート（Ｎ−ＰｈＩＭＴ）、イミダゾリウムトリフラート（ＩＭＴ）、５−ニトロベンズイミダゾリウムトリフラート（ＮＢＴ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、および５−（ビス−３，５−トリフルオロメチルフェニル）−１Ｈ−テトラゾール（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−４２）等が挙げられる。

縮合工程の後は、適宜、未反応の５’位のヒドロキシル基をキャッピングしてもよい。キャッピングは、無水酢酸−テトラヒドロフラン溶液、フェノキシ酢酸／Ｎ−メチルイミダゾール溶液等の公知のキャッピング溶液を用いて行うことができる。

酸化工程は、前記縮合工程により形成されたホスファイトを酸化する工程である。酸化工程は、酸化剤を用いて行うことができる。酸化剤としては、ヨウ素、ｍ−クロロ過安息香酸、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、２−ブタノンペルオキシド、ビス（トリメチルシリル）ペルオキシド、１，１−ジヒドロペルオキシシクロドデカン、および過酸化水素等が挙げられる。
酸化工程は、前記キャッピング操作の後で行ってもよいし、逆に、酸化工程の後でキャッピング操作を行ってもよいし、この順番は限定されない。

酸化工程後は、脱保護工程に戻り、合成すべきＲＮＡのヌクレオチド配列に応じて、上記の縮合反応、酸化、脱保護の一連の工程を繰り返すことにより、所望の配列を有するＲＮＡを合成することができる。

所望の配列を有するＲＮＡ鎖の合成が完了した後は、アンモニアまたはアミン類等を用いて、固相担体からＲＮＡ鎖を切断して回収する。
ここでのアミン類としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、イソプロピルアミン、エチレンジアミン、ジエチルアミン、およびトリエチルアミン等が挙げられる。ユニバーサルリンカーを用いる場合、ＲＮＡ鎖の合成が完了した後は、アンモニアまたはアミン類等を用いて、固相担体からの切断を行い、求核試薬によるユニバーサルリンカーの除去を行う。除去が完了した際には、末端ヌクレオチドの３’位はヒドロキシル基となり、ホスフェートはユニバーサルリンカーに結合して環状ホスホジエステルを形成する。回収したＲＮＡは、適宜、公知の方法で精製してもよい。

加えて、本実施形態の無機多孔質担体を核酸合成に適用することにより、高純度のオリゴ核酸を収率良く得ることができる。

本明細書において、「ＲＮＡの収率」は、反応に供したヌクレオシドの量から理論上計算されるＲＮＡの量に対する、実際に単離したＲＮＡの割合（％）をいう。ＵＶの吸光度の測定から核酸量を算出する。かかる測定の方法として、具体的には、水または緩衝水溶液中に核酸を溶解させ、光路長１ｃｍのセルに入れる。ＵＶの吸光度計を用いて、波長が２６０ｎｍにある吸光度から、下式により光学濃度Ｃを計算して、核酸量を算出する。係数αは、４０μｇ／ｍＬを使用している。

「ＲＮＡの純度」は、目的の鎖長の核酸が得られている割合（％）をいう。液体クロマトグラフィーによるクロマトグラムにおける面積百分率値、又はメインピークの１０％幅により求められる。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。

下記に、本発明の無機多孔質担体の製造に関する代表的な反応スキームを記載するが、本発明の製造法はこれらに限定されるものではない。

＜無機成形体の製造＞
（製造例１）
特許第５８７５８４３号公報に記載の実施例１と同様の方法でゼオライト成形体（１）を得た。このゼオライト成形体（１）を目開き３８μｍの篩いで篩別して微粒成分を取り除いた。同篩別品（５０ｇ）をオートクレーブに入れ、この中に、１．６mol/L水酸化カリウム水溶液（５００ｇ）を加え、約２０℃にて５時間撹拌した後、濾過により固体を分離した。この後、水（５００ｇ）にて水洗を３回繰り返した。次に２０ｗｔ％塩化アンモニウム水溶液（５００ｇ）にて洗浄を３回行ったのち、更に水（５００ｇ）にて水洗を３回繰り返した。最後に乾燥し、無機成形体ＳＰ（１）を得た。

＜無機多孔質基材の製造＞
（製造例２）
ガラスバイアルに３−アミノプロピルジイソプロピルエトキシシラン（８７ｍｇ）とトルエン（１２．４３ｇ）を混合し、３−アミノプロピルジイソプロピルエトキシシラン／トルエン溶液を調製した。無機成形体ＳＰ（１）（７．１３ｇ）を丸底フラスコに入れ、トルエン（６１ｇ）を加え、次いで室温撹拌下にて、調製した３−アミノプロピルジイソプロピルエトキシシラン／トルエン溶液（３．１１ｇ）を加えた。オイルバスにて同丸底フラスコを加熱して１１．５時間還流を行った。その後、一旦室温まで冷却し１０時間静置し、次いでさらに５時間還流した。反応混合物を濾過し、固形分をトルエンで洗浄した後、減圧下で乾燥させて、無機多孔質基材前駆体１を得た。

（製造例３）
無機多孔質基材前駆体１（０．４０ｇ）を丸底フラスコに入れ、トルエン（６１ｇ）を加えた。室温撹拌下で、さらにＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２１０ｍｇ）とトルエン（４．０ｇ）の混合物を加え、次いでトリブチルクロロシラン（３７９ｍｇ）とトルエン（４．０ｇ）の混合物を加え、同フラスコをオイルバスで加熱し、５時間還流した。その後、反応液を濾過し、固形分を５ｖｏｌ％Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン／エタノール溶液（１３ｍＬ）で洗浄した後、テトラヒドロフラン（１４ｍＬ）で洗浄した。洗浄物を減圧下で乾燥させて、無機多孔質基材１を得た。

（製造例４）
製造例３で用いたトリブチルクロロシラン（３７９ｍｇ）の代わりにクロロ(ヘキシル)ジメチルシラン（２８７ｍｇ）を用いたこと以外は製造例３に準じて合成を行い、無機多孔質基材２を得た。

（製造例５）
製造例３で用いたトリブチルクロロシラン（３７９ｍｇ）の代わりにベンジルクロロジメチルシラン（２９３ｍｇ）を用いたこと以外は製造例３に準じて合成を行い、無機多孔質基材３を得た。

（製造例６）
製造例３で用いたトリブチルクロロシラン（３７９ｍｇ）の代わりに(3-シアノプロピル)ジメチルクロロシラン（２６１ｍｇ）を用いたこと以外は製造例３に準じて合成を行い、無機多孔質基材４を得た。

（製造例７）
製造例３で用いたトリブチルクロロシラン（３７９ｍｇ）の代わりに２−アセトキシエチルジメチルクロロシラン（２９０ｍｇ）を用いたこと以外は製造例３に準じて合成を行い、無機多孔質基材５を得た。

（製造例８）
無機多孔質基材前駆体１（０．４０ｇ）を丸底フラスコに入れ、トルエン（６１ｇ）を加えた。室温撹拌下で、ヘキサメチルジシラザン（２６２ｍｇ）とトルエン（４．０ｇ）の混合物を加え、同フラスコをオイルバスで加熱し、５時間還流した。その後、反応液を濾過し、固形分を５ｖｏｌ％Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン／エタノール溶液（１３ｍＬ）で洗浄した後、テトラヒドロフラン（１４ｍＬ）で洗浄した。洗浄物を減圧下で乾燥させて、無機多孔質基材６を得た。

（製造例９）
製造例８で用いたヘキサメチルジシラザン（２６２ｍｇ）の代わりにトリメトキシ(メチル)シラン（５２ｍｇ）を用いたこと以外は製造例８に準じて合成を行い、無機多孔質基材７を得た。

（製造例１０）
製造例８で用いたヘキサメチルジシラザン（２６２ｍｇ）の代わりにトリエトキシフェニルシラン（５７ｍｇ）を用いたこと以外は製造例８に準じて合成を行い、無機多孔質基材８を得た。

（製造例１１）
製造例８で用いたヘキサメチルジシラザン（２６２ｍｇ）の代わりに２−（４−ピリジルエチル）トリエトキシシラン（６１ｍｇ）を用いたこと以外は製造例８に準じて合成を行い、無機多孔質基材９を得た。

＜無機多孔質担体の製造＞
（実施例１）
ガラスバイアルにＵ−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−スクシニルウリジン）（３１１．３ｍｇ）と、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−ベンゾトリアゾリウム３−オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）（１５５．２ｍｇ）と、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（９０．１μＬ）と、アセトニトリル（２５ｍＬ）とを混合した。調製した混合溶液（３．０８ｍL）と無機多孔質基材１（３００ｍｇ）を試験管に加えた。２５℃で１８時間静置した後、ろ過し、固体分をアセトニトリル（１０ｍＬ）で洗浄した。洗浄後の固形分に、無水酢酸と、２，６−ルチジンのテトラヒドロフラン溶液（無水酢酸／２，６−ルチジン／テトラヒドロフラン、容量比１／１／８）（１ｍＬ）と、１−メチルイミダゾールのテトラヒドロフラン溶液（１−メチルイミダゾール／テトラヒドロフラン、容量比１６／８４）（１ｍＬ）とを加えた。１分間静置した後にろ過し、固形分をアセトニトリル（１０ｍＬ）で洗浄した。洗浄後の固形分を真空乾燥し、ヌクレオシド構造を有する基が担持された無機多孔質担体１を得た。

（Ｕ−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）

（実施例２）
無機多孔質基材１の代わりに無機多孔質基材２を用いて実施例１に準じて反応を行い、無機多孔質担体２を得た。

（実施例３）
無機多孔質基材１の代わりに無機多孔質基材３を用いて実施例１に準じて反応を行い、無機多孔質担体３を得た。

（実施例４）
無機多孔質基材１の代わりに無機多孔質基材４を用いて実施例１に準じて反応を行い、無機多孔質担体４を得た。

（実施例５）
無機多孔質基材１の代わりに無機多孔質基材５を用いて実施例１に準じて反応を行い、無機多孔質担体５を得た。

（比較例１）
無機多孔質基材１の代わりに無機多孔質基材前駆体１を用いて実施例１に準じて反応を行い、無機多孔質担体６を得た。比較例１のデータは、シリル基（Ｂ）−１が無い場合のデータである。

（参考例１）
無機多孔質基材１の代わりに無機多孔質基材６を用いて実施例１に準じて反応を行い、無機多孔質担体７を得た。

（参考例２）
無機多孔質基材１の代わりに無機多孔質基材７を用いて実施例１に準じて反応を行い、無機多孔質担体８を得た。

（参考例３）
無機多孔質基材１の代わりに無機多孔質基材８を用いて実施例１に準じて反応を行い、無機多孔質担体９を得た。

（参考例４）
無機多孔質基材１の代わりに無機多孔質基材９を用いて実施例１に準じて反応を行い、無機多孔質担体１０を得た。

得られた一連の無機多孔質基材および無機多孔質担体に対して、水銀圧入法による細孔径、細孔径40nmから1000nmの範囲における累積細孔容積、窒素吸着法による外比表面積、活性NH基担持量、およびヌクレオシド担持量について、それぞれ前記の手法を用いて測定した。結果を表１に示す。

得られた無機成形体および一連の無機多孔質担体に対して、重量当たりのシリル基（Ａ）担持量、重量当たりのシリル基（Ｂ）担持量、および重量当たりの外表面シラノール担持量について、それぞれ前記の手法を用いて測定した。結果を表２に示す。

［表２中、＊は、無機多孔質担体との結合を表す。］

得られた一連の無機多孔質担体の各外表面官能基に関し、外表面官能基ｔＰＳＡ値についてChemDraw 18.2を用いてソフトウェア計算を行った。結果を表３に示す。

［表３中、＊は、無機多孔質担体との結合を表す。］

得られた一連の無機多孔質担体の外表面ｔＰＳＡ値について、前記手法に基づき、表２、３の結果を用いて算出した。結果を表４に示す。

＜オリゴ核酸の固相合成＞
下記の配列（Ａ）からなるオリゴヌクレオチドを、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＮＴＳ Ｍ−４−ＭＸ−Ｅ、日本テクノサービス株式会社製）を用い、３’側から５’側に向かって合成した（反応経路（縮合反応、酸化、脱保護）参照）。かかる固相合成には、上記で製造した無機多孔質担体を使用した。
また、アミダイトモノマーには、以下に示すアデノシンＥＭＭアミダイト（米国特許出願公開第２０１２／０３５２４６号明細書の実施例４に記載）、シチジンＥＭＭアミダイト（同ＵＳ文献の実施例３に記載）、グアノシンＥＭＭアミダイト（同ＵＳ文献の実施例５に記載）、及びウリジンＥＭＭアミダイト（同ＵＳ文献の実施例２記載）を使用した。

配列（Ａ）：５’−ＡＵＡＡＣＵＣＡＡＵＵＵＧＵＡＡＡＡＡＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ−３’（配列番号１）

また、かかる固相合成には、デブロッキング溶液として高純度トリクロロ酢酸トルエン溶液を使用し、縮合剤として５−ベンジルメルカプト−１Ｈ−テトラゾールを使用し、酸化剤としてヨウ素溶液を使用し、キャッピング溶液としてフェノキシ酢酸溶液と１−メチルイミダゾール溶液とを使用した。

合成終了後の無機多孔質担体を、蓋つきガラスバイアルに入れ、２８％アンモニア水とＥｔＯＨとの１：１ないし２：１溶液を加えた。その後、４０℃下で４時間静置した。反応後の溶液を濾過し、水、ＥｔＯＨで洗浄した。得られた溶液を乾燥して、未脱保護体の粗オリゴヌクレオチドとし、次いでニトロメタンの存在下でフッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）を作用させて脱保護を行い、粗生成物を得た。

［オリゴ核酸の純度の測定］
得られた粗オリゴヌクレオチドを用いて調製した溶液について、高速液体クロマトグラフィーＨＰＬＣ（波長２６０ｎｍ、カラムＤＮＡＰａｃＴＭ ＰＡ１００ ４×２５０ｍｍ）によって各成分に分離し、得られたクロマトグラムの、主生成物のＬＣピーク頂点の高さの１０％の高さにおけるピーク幅を「１０％幅」として求めた。
各無機多孔質担体による効果を検証するために、シリル基(B)−１を有さない無機多孔質担体６（比較例２）における「１０％幅」の値にて、各無機多孔質担体における「１０％幅」の値を除したものを「相対１０％幅」と規定し、算出した。ここで、純度が高い場合には「相対１０％幅」が小さな値となり、純度が低い場合には「相対１０％幅」が大きな値となる。

（実施例６）
無機多孔質担体１を用い、配列（Ａ）について、上記手法に従いオリゴ核酸の固相合成を行った。

（実施例７）
無機多孔質担体２を用い、配列（Ａ）について、上記手法に従いオリゴ核酸の固相合成を行った。

（実施例８）
無機多孔質担体３を用い、配列（Ａ）について、上記手法に従いオリゴ核酸の固相合成を行った。

（実施例９）
無機多孔質担体４を用い、配列（Ａ）について、上記手法に従いオリゴ核酸の固相合成を行った。

（実施例１０）
無機多孔質担体５を用い、配列（Ａ）について、上記手法に従いオリゴ核酸の固相合成を行った。

（比較例２）
無機多孔質担体６を用い、配列（Ａ）について、上記手法に従いオリゴ核酸の固相合成を行った。比較例２のデータは、シリル基（Ｂ）−１が無い場合のデータである。

（参考例５）
無機多孔質担体７を用い、配列（Ａ）について、上記手法に従いオリゴ核酸の固相合成を行った。

（参考例６）
無機多孔質担体８を用い、配列（Ａ）について、上記手法に従いオリゴ核酸の固相合成を行った。

（参考例７）
無機多孔質担体９を用い、配列（Ａ）について、上記手法に従いオリゴ核酸の固相合成を行った。

（参考例８）
無機多孔質担体１０を用い、配列（B）について、上記手法に従いオリゴ核酸の固相合成を行った。

一連の配列（A）のオリゴ核酸の固相合成の結果について、前記表４に示す。また、表４の結果より、外表面ｔＰＳＡ値に対する相対１０％幅の関係を表すグラフを図１に示す。
表４および図１より、配列（Ａ）のオリゴ核酸の固相合成結果において、実施例６〜１０で用いた外表面ｔＰＳＡ値が５６以上、８７以下の範囲にある無機多孔質担体は、比較例２および参考例５〜８で用いた外表面ｔＰＳＡ値が５６以上、８７以下の範囲外にある無機多孔質担体に比べ、より小さい相対１０％幅を示し、得られるオリゴ核酸がより高純度であることがわかった。

本発明により、オリゴ核酸製造において、オリゴ核酸の純度を向上させることができる、無機多孔質担体、およびオリゴ核酸製造法が提供される。本発明により得られるオリゴ核酸は医薬品等の原料として有用である。

配列表の配列番号１は、本発明の製造方法に従って製造されるオリゴヌクレオチドの塩基配列を表す。

Claims (16)

1. 下記（ｉ）および（ｉｉ）で表されるシリル基を有し、かつ下記（ｉｉｉ）〜（ｉｖ）の特徴を有する無機多孔質担体。
   （ｉ）シリル基（Ａ）：下記式（ｉ−１）で表されるシリル基、
   （ｉｉ）シリル基（Ｂ）：下記式（ii−１）、（ii−２）、および（ii−３）で表されるシリル基からなる群より選ばれる少なくとも１つのシリル基、
   （ｉｉｉ）細孔径が２０ｎｍ以上であること、
   （ｉｖ）下記数式（iv−１）で規定される外表面ｔＰＳＡ値（Å２）が５６以上、８３以下であること。
   

   

   ［式（ｉ−１）中、
   Ｘ１は、無機多孔質担体との結合を表し、
   Ｚ１は、それぞれ独立して、炭素数１〜６のアルキル基、または炭素数６〜１２のアリール基を表し、
   Ａ１は、炭素数１〜２０の有機基を表し、
   Ｂ１は、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、および炭素数６〜１２のアリール基からなる群から選ばれるいずれかを表わし、そして、
   Ｃ１は、反応性の基が、保護または脱保護された、ヌクレオシド又はヌクレオチド構造を有する基を表す。］、
   

   

   、
   

   

   、
   

   

   、
   ［式（ii−１）、（ii−２）、または（ii−３）中、
   Ｐ１は、無機多孔質担体との結合を表し、
   Ｑ１およびＲ１は、それぞれ独立して、無機多孔質担体との結合、水酸基、アミノ基、炭素数１〜６のアルコキシ基、および炭素数１〜６のアルキルアミノ基からなる群から選ばれるいずれかを表し、
   Ｊ１は、炭素数１〜２０のアルキル基、または１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数７〜２０のアリール基を表し、
   Ｋ１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキル基、または１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数５〜２０のアリール基を表し、
   Ｍ１は、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、そして、
   Ｎ１は、炭素数２〜２０のアルキル基、または１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数５〜２０のアリール基を表わす。］
   

   

   ｔＰＳＡ値の総和値（Å^２ ・ μｍｏｌ／ｇ）：下記式（iv−２）で表される値
   

   

   外表面官能基ｔＰＳＡ値（Å^２）：無機多孔質担体の外表面官能基に対するｔＰＳＡ値を表わし、ソフトウェア計算により導出される値
2. 前記無機多孔質担体が粒子状であり、そして粒子径が１μｍＬ以上である、請求項１に記載の無機多孔質担体。
3. 前記無機多孔質担体の細孔径が、４０ｎｍ以上、５００ｎｍ以下である、請求項１〜２のいずれかに記載の無機多孔質担体。
4. 前記無機多孔質担体の細孔径４０ｎｍから１０００ｎｍの範囲における累積細孔容積が、０．３２ｍＬ／ｇよりも大きく４ｍＬ／ｇ以下であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
5. 前記無機多孔質担体の比表面積が、０．１ｍ^２／ｇ以上、２００ｍ^２／ｇ以下である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
6. 前記無機多孔質体が、シリカ、シリカゲル、ゼオライト、またはガラスから構成される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
7. 反応性の基が、保護または脱保護された、ヌクレオシドまたはヌクレオチド構造を含有する基の量が下記数式（Ｎｕ＃１）を満たすことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
   

   

   Ｉ１：無機多孔質担体中の、反応性の基が保護または脱保護された、ヌクレオシド又はヌクレオチド構造を有する基（μｍｏｌ／ｇ）、
   Ｓ１：窒素吸脱着等温線測定により得られる、無機多孔質担体の比表面積（ｍ^２／ｇ）
8. 前記一般式（ｉ−１）中のＣ１が、スクシニルリンカーまたはユニバーサルリンカーを含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
9. 上記式（ii−３）で表されるシリル基をシリル基（Ｂ）として有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
10. 上記式（ii−３）で表されるシリル基が下記式（ii−３−１）で表されるシリル基である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
    

    

    ［式（ii−３−１）中、
    Ｐ１は、無機多孔質担体との結合を表し、
    Ｋ２は、それぞれ独立して、炭素数１〜６のアルキル基、または１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数６〜１０のアリール基を表し、
    Ｍ２は、炭素数１〜４のアルキレン基を表し、そして、
    Ｎ２は、炭素数２〜６のアルキル基、または１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数６〜１０のアリール基を表わす。］
11. 上記式（ｉ−１）中のＡ１が、アシルイミノ基、オキシ基、またはチオ基のいずれか１つ以上を含んでいてもよい炭素数１〜２０のアルキレン基であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
12. 前記シリル基（Ａ）が下記式（ｉ−１−１）で表されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
    

    

    ［式（ｉ−１−１）中、
    Ｘ１は、無機多孔質担体との結合を表し、
    Ｚ１は、それぞれ独立して、炭素数１〜６のアルキル基、または炭素数６〜１２のアリール基を表し、
    Ａ２は、アシルイミノ基、オキシ基、またはチオ基のいずれか１つ以上を含んでいてもよい炭素数炭素数１〜１５のアルキレン基を表し、
    Ｂ２は、水素原子、または炭素数１〜２のアルキル基のいずれかを表わし、そして、
    Ｃ２は、スクシニルリンカーを含み、かつ反応性の基が保護または脱保護された、ヌクレオシドまたはヌクレオチド構造を有する基を表す。］
13. 上記式（ｉ−１）中のＣ１が、反応性の基としてヒドロキシル基が保護されたヌクレオシドまたはヌクレオチド構造を有する基を持つ無機多孔質担体を用い、
    前記のヌクレオシドの５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程（Ａ）、
    前記工程（Ａ）において生成したヌクレオシドの５’位のヒドロキシル基と、第２のヌクレオシド塩基を有するアミダイト化合物とを縮合反応させて、ホスファイトを生成する工程（Ｂ）、
    前記工程（Ｂ）において生成したホスファイトを酸化させて、ヌクレオチドを生成する工程（Ｃ）、および、
    前記工程（Ｃ）において生成したヌクレオチドの５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程（Ｄ）
    を含む、核酸の製造方法。
14. 前記工程（Ｄ）において生成した生成物と、次に導入予定のヌクレオシド塩基を有するアミダイト化合物とをさらに縮合反応させて、ホスファイトを生成する工程（Ｂ’）、
    前記工程（Ｂ’）において生成したホスファイトを酸化させて、オリゴヌクレオチドを生成する工程（Ｃ’）、および、
    前記工程（Ｃ’）において生成したオリゴヌクレオチド鎖末端の５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程（Ｄ’）を含む、
    請求項１３に記載の核酸の製造方法。
15. 前記の工程（Ｂ’）、工程（Ｃ’）および工程（Ｄ’）からなる一連の工程を、さらにｍ回（ｍは、１以上の整数を表す。）繰り返して、ｍ個のアミダイト化合物を反応させた後、伸長した核酸を切り出す工程（Ｅ）を含む、請求項１４に記載の核酸の製造方法。
16. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の無機多孔質担体の、ホスホロアミダイト法による核酸の製造における使用。

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