WO2021210408A1 - 核酸オリゴマーの製造方法 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a nucleic acid oligomer. More specifically, the present invention relates to a method for producing a nucleic acid oligomer containing a phosphorothioate.
  • nucleic acid oligomers In recent years, there has been increasing interest in the application of nucleic acid oligomers to the medical field. For example, antisense nucleic acids, aptamers, ribozymes, and nucleic acids that induce RNA interference (RNAi) such as siRNA are mentioned, and these are called nucleic acid drugs.
  • RNAi RNA interference
  • the nucleic acid oligomer can be synthesized by a solid-phase synthesis method, and the nucleic acid oligomer synthesized by extending the nucleic acid on the solid-phase carrier is cut out from the solid-phase carrier, and then, for example, the nucleic acid oligomer containing ribose is of ribose.
  • the target nucleic acid oligomer is produced by deprotecting and removing the protecting group of the hydroxyl group at the 2'position.
  • Nucleic acid oligomers having a phosphorothioate bond are also known as useful compounds (Patent Document 1).
  • Nucleic acid oligomers having a phosphorothioate bond may have a problem in stability as compared with a nucleic acid oligomer consisting only of a phosphodiester bond.
  • An object of the present invention is to provide a method for stabilizing a nucleic acid oligomer having a phosphorothioate bond, and an efficient method for producing the nucleic acid oligomer, which comprises a step of isolating the nucleic acid oligomer stabilized by the method.
  • the present inventors applied a crude product of a nucleic acid oligomer having a phosphorothioate bond produced by a phosphoromidite method to reverse phase column chromatography, and subjected the nucleic acid to the nucleic acid. Stabilizing the nucleic acid oligomer having the phosphorothioate bond by obtaining a purified elution fraction containing an oligomer and then setting the atmosphere in contact with the obtained elution fraction to an inert gas atmosphere having a certain concentration or less. I found that I could do it.
  • the present invention provides a method for stabilizing a nucleic acid oligomer having a phosphorothioate bond, and an efficient method for producing a nucleic acid oligomer having a phosphorothioate bond, which comprises a step of isolating the nucleic acid oligomer stabilized by the method.
  • the present invention includes, but is not limited to, the following aspects.
  • Item 1 Fraction eluted from reverse phase column chromatography, formula (1) :.
  • B C represents the same or different nucleobase independently
  • R independently represents a hydrogen atom, a fluorine atom or an OQ group, which are the same or different from each other.
  • Q is independently the same or different from the hydrogen atom, the methyl group, the 2-methoxyethyl group, the methylene group bonded to the carbon atom at the 4'position of ribose, and the carbon atom at the 4'position of ribose.
  • X independently represents an oxygen atom or a sulfur atom, which is the same or different from each other.
  • Y represents a protecting group for a hydrogen atom or a hydroxyl group.
  • G represents ammonium ion, alkylammonium ion, alkali metal ion, hydrogen ion or hydroxyalkylammonium ion.
  • n is the equation (2): 60 ⁇ n (2) It is an integer satisfying the above, and up to 20% of n Xs are sulfur atoms.
  • a method for stabilizing a nucleic acid oligomer which comprises setting the atmosphere in contact with the solution containing the nucleic acid oligomer shown by (1) to an inert gas atmosphere having an oxygen concentration of 10% or less. Item 2.
  • the method for producing a stabilized purified nucleic acid oligomer solution which comprises the step of making the atmosphere in contact with the elution fraction according to Item 1 an inert gas atmosphere having an oxygen concentration of 10% or less.
  • a method for producing a purified nucleic acid oligomer further comprising a step of producing a purified nucleic acid oligomer solution by the step of the preceding item 2 and a step of isolating the purified nucleic acid oligomer from the purified nucleic acid oligomer solution.
  • Item 4. The method according to any one of items 1 to 3 above, wherein the oxygen concentration is 5% or less.
  • the method according to any one of the preceding items 1 to 4 wherein the oxygen concentration is 2.5% or less.
  • the reverse phase column chromatography is a reverse phase column chromatography using a mobile phase containing at least one ammonium salt selected from the group consisting of a monoalkylammonium salt and a dialkylammonium salt as a mobile phase.
  • the reverse phase column chromatography is any one of the above items 2 to 6, wherein the reverse phase column chromatography is a reverse phase column chromatography using a mobile phase containing at least one ammonium salt selected from the group consisting of dialkylammonium salts as the mobile phase.
  • the reverse phase column chromatography uses a mobile phase containing at least one water-soluble organic solvent selected from the group consisting of an alcohol-based water-soluble organic solvent and a nitrile-based water-soluble organic solvent as the mobile phase.
  • the method according to any one of the preceding paragraphs 2 to 7. Item 9. The method according to item 3 above, which comprises mixing the stabilized purified nucleic acid oligomer solution with an organic solvent of C1-C4 having at least one oxygen atom to isolate the precipitated nucleic acid oligomer.
  • Item 10 The method according to any one of the above items 1 to 9, wherein in the formula (1), R is independently a hydroxy group or a methoxy group.
  • Item 11 The production method according to any one of the above items 2 to 9, wherein R is a hydroxy group.
  • the present invention further includes, but is not limited to, the following aspects.
  • Item 1A Equation (1) generated by the phosphoramidite method:
  • B C represents the same or different nucleobase independently
  • R independently represents a hydrogen atom, a fluorine atom or an OQ group, which are the same or different from each other.
  • Q is independently the same or different from the hydrogen atom, the methyl group, the 2-methoxyethyl group, the methylene group bonded to the carbon atom at the 4'position of ribose, and the carbon atom at the 4'position of ribose.
  • X independently represents an oxygen atom or a sulfur atom, which is the same or different from each other.
  • Y represents a protecting group for a hydrogen atom or a hydroxyl group.
  • G represents ammonium ion, alkylammonium ion, alkali metal ion, hydrogen ion or hydroxyalkylammonium ion.
  • n is the equation (2): 60 ⁇ n (2) It is an integer satisfying the above, and up to 20% of n Xs are sulfur atoms.
  • the crude product of the nucleic acid oligomer represented by (1) is subjected to reverse phase column chromatography to obtain a purified elution fraction containing the nucleic acid oligomer of the formula (1), and the atmosphere in contact with the elution fraction is oxygenated.
  • a step of obtaining a stabilized purified nucleic acid oligomer solution as an inert gas atmosphere of 10% or less is included.
  • Method for producing nucleic acid oligomer Item 2A.
  • Item 2. The method for producing a nucleic acid oligomer according to Item 1A, further comprising a step of isolating the purified nucleic acid oligomer from the stabilized purified nucleic acid oligomer solution.
  • Item 5A The production according to any one of the above items 1A to 4A, wherein the mobile phase of the reverse phase column chromatography is a mobile phase containing at least one ammonium salt selected from the group consisting of a monoalkylammonium salt and a dialkylammonium salt. Method.
  • Item 6A The production method according to any one of the above items 1A to 4A, wherein the mobile phase of the reverse phase column chromatography is a mobile phase containing at least one ammonium salt selected from the group consisting of dialkylammonium salts.
  • Item 7A The production method according to any one of the above items 1A to 4A, wherein the mobile phase of the reverse phase column chromatography is a mobile phase containing at least one ammonium salt selected from the group consisting of dialkylammonium salts.
  • the reverse phase column chromatography uses a mobile phase containing at least one water-soluble organic solvent selected from the group consisting of an alcohol-based water-soluble organic solvent and a nitrile-based water-soluble organic solvent as the mobile phase.
  • Item 8A. The production method according to item 2A above, which comprises mixing the stabilized purified nucleic acid oligomer solution with an organic solvent of C1-C4 having at least one oxygen atom to isolate the precipitated nucleic acid oligomer.
  • Item 9A The production method according to any one of the above items 1A to 8A, wherein in the formula (1), R is independently a hydroxy group or a methoxy group.
  • Item 10A The production method according to any one of the above items 1A to 8A, wherein R is a hydroxy group.
  • Item 11A. Fraction eluted from reverse phase column chromatography, formula (1) :.
  • a method for stabilizing a nucleic acid oligomer which comprises setting the atmosphere in contact with the solution containing the nucleic acid oligomer shown by (1) to an inert gas atmosphere having an oxygen concentration of 10% or less.
  • a nucleic acid oligomer having a phosphorothioate bond is stabilized, and an efficient production method thereof is provided.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of synthesis of a nucleic acid oligomer by the phosphoramidite method.
  • a nucleic acid oligomer which is a fraction eluted from reverse phase column chromatography and is characterized in that the atmosphere in contact with the solution containing the nucleic acid oligomer represented by the above formula (1) is an inert gas atmosphere having an oxygen concentration of 10% or less.
  • the atmosphere in contact with the solution containing the nucleic acid oligomer represented by the above formula (1) is an inert gas atmosphere having an oxygen concentration of 10% or less.
  • the nucleic acid is expressed by B C base (hereinafter, sometimes, referred to as the "base”.) May be natural or non-natural nucleobases. Examples of such non-natural nucleobases include modified analogs of natural or non-natural nucleobases. Nucleobases typically include purine and pyrimidine compounds, eg, US Pat. No.
  • purine bases such as adenine, isoguanine, xanthine, hypoxanthine and guanine
  • pyrimidine bases such as cytosine, uracil and thymine
  • nucleic acid base represented by B C for example, 2-amino-adenine, 2-aminopurine, amino derivatives such as 2,6-diaminopurine; 5-methyl uracil, 5-methylcytosine, 7-methylguanine , 6-Methylpurine, 2-propylpurine and other alkyl derivatives; 5-halouracil and 5-halocytosine; 5-propynyluracil and 5-propynylcitosine; 6-azauracil, 6-azacitocin and 6-azatimine; 5-uracil (pseudo) Uracil), 4-thiouracil, 5- (2-aminopropyl) uracil, 5-aminoallyl uracil; 8-haloxation, amination, thiolation, thioalkylation, hydroxylation and other 8-substituted purines; 5-tri Fluoromethylated and other 5-substituted pyrimidines; 6-azapyr
  • R represents an OQ group
  • Q is a methylene group bonded to the carbon atom at the 4'position of ribose, an ethylene group bonded to the carbon atom at the 4'position of ribose, or a carbon atom at the 4'position of ribose.
  • the structure is represented by the structures of LNA-1, LNA-2 and LNA-3 represented by the following formula (3).
  • B c represents the nucleobase as described above.
  • the protecting group for the hydroxyl group represented by Y can be used without particular limitation as long as it can function as a protecting group in the amidite method.
  • a widely known protecting group used for an amidite compound is widely used. Can be used.
  • the hydroxyl-protecting group represented by Y is preferably the following group.
  • R 1 , R 2 and R 3 independently represent the same or different hydrogen or alkoxy groups.
  • alkoxy group examples include a methoxy group.
  • Examples of the chain length of the nucleic acid oligomer of the formula (1) include those with n ⁇ 60, n ⁇ 80, or n ⁇ 100. As the upper limit of the chain length, for example, n ⁇ 200 is exemplified. In the nucleic acid oligomer, up to 20% (including 20%) of n Xs are sulfur atoms. Preferably, the nucleic acid oligomer of formula (1) has one or more phosphorothioate bonds, more preferably three or more phosphorothioate bonds.
  • the nucleic acid oligomer of the formula (1) may be, for example, a DNA or RNA oligomer, or one in which these oligomers contain a non-natural nucleobase.
  • the nucleic acid oligomer is typically a single-stranded DNA or RNA oligomer.
  • the substituent R is preferably a hydroxy group or a methoxy group independently of each other.
  • the method of the present invention is suitable for RNA, which is a nucleic acid oligomer of the formula (1) in which the substituent R is independently a hydroxy group or a methoxy group. More specifically, it is suitable for producing a nucleic acid oligomer containing both a nucleotide in which the substituent R is a hydroxy group and a nucleotide in which the substituent R is a methoxy group.
  • Separation by reverse phase column chromatography is a reaction product containing a mobile phase containing an alkylammonium salt in a column containing a packing material and then a nucleic acid oligomer synthesized by the phosphoroamide method in the mobile phase.
  • the nucleic acid oligomer is adsorbed and bonded to the column, and the impurities contained in the nucleic acid oligomer and the target nucleic acid molecule are formed by a gradient that gradually increases the concentration of the organic solvent in the mobile phase. Is carried out by separating and elution.
  • the elution fraction obtained by reverse phase column chromatography is selected and collected by analyzing the composition by UV absorption at a wavelength of 260 nm under the chromatographic conditions generally used for separation and analysis of nucleic acids. From the collected fraction, a nucleic acid oligomer having a predetermined amount of phosphorothioate bond, which is a purified product, is obtained.
  • the analysis method for example, the method described in a non-patent document (Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products, CRC Press) can be used.
  • any one or more selected from, for example, a phenyl group, an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, and a cyanopropyl group as the silica or polymer which becomes a hydrophobic stationary phase is used.
  • Fixed silica or polymer is exemplified.
  • the silica or polymer as such a filler for example, one having a particle size of 2 ⁇ m or more or 5 ⁇ m or more is used.
  • a water-soluble mobile phase is eluted and obtained as a fractionation solution, and the solvent system serving as the mobile phase is an alcohol-based organic solvent (for example, methanol, ethanol, 2-propanol).
  • an alcohol-based organic solvent for example, methanol, ethanol, 2-propanol
  • n-propanol a nitrile-based organic solvent
  • water are exemplified.
  • the alcohol-based organic solvent C1-C3 alcohol is preferable, and methanol is more preferable.
  • Acetonitrile is preferable as the nitrile-based organic solvent.
  • Each organic solvent may be used alone or in combination of two or more.
  • a mobile phase containing an alkylammonium salt is usually used as the mobile phase of the reverse phase column chromatography, and the eluent also contains these alkylammonium salts.
  • a monoalkylammonium salt, a dialkylammonium salt and a trialkylammonium salt are usually used, preferably a monoalkylammonium salt and a dialkylammonium salt, and more preferably a dialkylammonium salt.
  • the monoalkylamine forming the monoalkylammonium salt preferably has 3 to 10 carbon atoms, more preferably 4 to 6 carbon atoms, and even more preferably hexylamine.
  • the number of carbon atoms of the dialkylamine forming the dialkylammonium salt is preferably 4 to 10, and more preferably 5 to 9.
  • a preferred dialkylamine is dibutylamine.
  • the trialkylamine forming the trialkylammonium salt preferably has 6 to 12 carbon atoms, more preferably 6 to 9 carbon atoms, and specifically, triethylamine is exemplified.
  • Examples of the acid forming the monoalkylammonium salt, dialkylammonium salt and trialkylammonium salt include carbonic acid, acetic acid, formic acid, trifluoroacetic acid and propionic acid.
  • the concentration of the ammonium salt is usually 1 to 200 mM, preferably 5 to 150 mM, and more preferably 20 to 100 mM.
  • the pH range of the mobile phase is usually pH: 6 to 8, preferably 6.5 to 7.5.
  • the temperature of the reverse phase column chromatography is usually 20 to 100 ° C, preferably 30 to 80 ° C, and more preferably 40 to 70 ° C.
  • the eluent fraction obtained by reverse phase column chromatography usually contains water, an alcohol-based organic solvent, a nitrile-based organic solvent, the alkylammonium salt, and the nucleic acid oligomer of the formula (1).
  • the amount of water in the eluent is usually 90% to 30%, preferably 80% to 40%, more preferably 70% to 40%.
  • the amount of the alcohol-based organic solvent in the eluent is usually 0 to 20%, preferably 0 to 15%, and more preferably 0% to 10%.
  • the amount of the nitrile-based organic solvent in the eluent is usually 10 to 70%, preferably 20 to 60%, more preferably 30 to 50% (all% represents mass%). .)
  • the molar concentration of the alkylammonium salt in the elution fraction is usually 1 mM to 200 mM, preferably 10 mM to 100 mM.
  • the concentration of the nucleic acid oligomer in the above-mentioned elution fraction is usually 0.05 mg / mL to 5 mg / mL, preferably 0.05 mg / mL to 1 mg / mL, and more preferably 0.1 mg / mL. ⁇ 0.5 mg / mL.
  • an inert gas having an oxygen concentration of 10% or less is supplied to a container containing a nucleic acid oligomer, and the oxygen concentration in the atmosphere in the container is within the set concentration range. It may be adjusted by measuring and confirming that. Specifically, a high-purity inert gas such as argon or nitrogen or an inert gas having an oxygen concentration adjusted to a predetermined concentration is circulated in the atmosphere inside the container, or the atmosphere inside the container is changed to the inert gas. Alternatively, it can be adjusted by substituting with an inert gas whose concentration has been adjusted.
  • the preparation of the inert gas atmosphere having an oxygen concentration of 10% or less may be performed at any stage before, during, or after the elution fraction is supplied to the container. Moreover, you may perform by combining them.
  • the above-mentioned inert gas includes, but is not limited to, nitrogen gas, argon gas, and helium gas.
  • Examples of the atmosphere replacement method in the container include reduced pressure replacement, pressure replacement, flow replacement, replacement by bubbling, or replacement by freezing and degassing, and at that time, ultrasonic waves may be applied or heating may be performed.
  • a more preferred method is flow substitution.
  • the oxygen concentration under the inert gas atmosphere is preferably 10% or less, more preferably 5.0% or less, still more preferably 2.5% or less, and even more preferably 0.1% or less.
  • the obtained elution fraction may be stored at 0 ° C. to 80 ° C., preferably 10 ° C. to 70 ° C., more preferably 20 ° C. to 60 ° C.
  • the elution fraction containing the nucleic acid oligomer obtained by reverse phase chromatography is, for example, after storage, a reprecipitation step, a liquid separation step, an ultrafiltration step, a deprotection step, and freeze-drying to isolate the nucleic acid oligomer. It may be attached to a single step or a plurality of steps selected from post-treatment steps such as steps.
  • the stabilized solution can be contacted with a poor solvent to precipitate a nucleic acid oligomer and isolate. If necessary, the liquid portion may be removed from the solid-liquid separated state, and then the nucleic acid oligomers precipitated by filtration or the like may be collected and isolated.
  • the poor solvent in the reprecipitation step include organic solvents of C1-C4 having at least one oxygen atom (for example, C1-C4 alcohol, tetrahydrofuran, dioxane). As such a solvent, ethanol or isopropanol is preferable.
  • At least one of acidic aqueous solution such as sodium acetate aqueous solution, water, and saline solution is mixed with the stabilized solution, and an organic solvent immiscible with water is added to form an aqueous layer and an organic layer.
  • the solution can be separated to obtain an aqueous layer containing the desired nucleic acid oligomer.
  • the nucleic acid oligomer present in the solution after the storage step can be separated from the low molecular weight components having a desired molecular weight or less by using the ultrafiltration membrane.
  • an acidic aqueous solution such as an aqueous acetic acid solution or a solution of an acidic substance such as acetic acid dissolved in an organic solvent is mixed with the solution after the storage step. By doing so, the protecting group of the nucleic acid oligomer can be deprotected.
  • water can be sublimated by reducing the pressure of the frozen aqueous solution of the nucleic acid oligomer, and the nucleic acid oligomer and water can be separated.
  • nucleic acid extension reaction For the synthesis of nucleic acid oligomers by the phosphoramidite method, a nucleic acid extension reaction can be carried out according to a known method (for example, the method described in Japanese Patent No. 5157168 or Japanese Patent No. 5554881).
  • a nucleic acid extension reaction taking the synthesis of RNA of the scheme shown in FIG. 1 as an example, the method for producing nucleic acid oligomers with reference to the reaction pathways (condensation reaction, oxidation, deprotection) shown below. Will be described.
  • Ba is a nucleobase that may be protected; Tr is a protecting group; X is as defined above, and SP is a portion other than the nucleoside structure of the inorganic porous carrier. Represents each.
  • nucleobases constituting the nucleosides of the inorganic porous carrier (Sp-Nu) having a nucleoside structure and the amidite monomer (Am-1) are the nucleobases as described above or the nucleobases protected by the protective group.
  • a suitable amidite monomer (Am-1) in the compound represented by the following chemical formula (Am-1'), when R represents a protected hydroxyl group, as a specific protective group, tert- Butyldimethylsilyl (TBDMS) group, bis (2-acetoxy) methyl (ACE) group, (triisopropylsilyloxy) methyl (TOM) group, (2-cyanoethoxy) ethyl (CEE) group, (2-cyanoethoxy) TBDMS amidite (TBDMS RNA Amidites, trade name, ChemGenes Corporation), ACE protected by methyl (CEM) group, para-toluylsulfonylethoxymethyl (TEM) group, (2-cyanoethoxy) methoxymethyl (EMM) group, etc.
  • TDMS tert- Butyldimethylsilyl
  • ACE acetoxy) methyl
  • TOM triisopropylsilyloxy) methyl
  • CEE
  • R represents a group as said, B a represents a nucleic acid base which may be protected.
  • RNA will be described as an example, but it can also be applied to nucleic acid compounds containing nucleotides other than ribonucleotides.
  • the protecting group of the hydroxyl group at the 5'position at the end of the RNA chain supported on the solid phase carrier is deprotected.
  • a trityl-based protecting group typically, a DMTr group
  • Deprotection can be performed with an acid.
  • the deprotective acid include trifluoroacetic acid, trichloroacetic acid, dichloroacetic acid, trifluoromethanesulfonic acid, methanesulfonic acid, hydrochloric acid, acetic acid, p-toluenesulfonic acid and the like.
  • nucleoside phosphoramidite is bound to the hydroxyl group at the 5'position at the end of the RNA chain deprotected by the deprotection step to produce phosphite.
  • a protecting group for example, DMTr group
  • the condensation step can be carried out by using an activator that activates the nucleoside phosphoramidite.
  • activator include 5-benzylthio-1H-tetrazole (BTT), 1H-tetrazole, 4,5-dicyanoimidazole (DCI), 5-ethylthio-1H-tetrazole (ETT), and N-methylbenzimidazolium.
  • N-MeBIT benzimidazolium triflate
  • BIT N-phenylimidazolium triflate
  • IMT imidazolium triflate
  • NBT 5-nitrobenzimidazolium triflate
  • HOBT 1-hydroxybenzotriazole
  • Activator-42 5- (bis-3,5-trifluoromethylphenyl) -1H-tetrazole
  • an unreacted hydroxyl group at the 5'position may be capped as appropriate.
  • Capping can be performed using known capping solutions such as acetic anhydride-tetrahydrofuran solution and phenoxyacetic acid anhydride / N-methylimidazole solution.
  • the oxidation step is a step of oxidizing the phosphite formed by the condensation step.
  • the oxidation step can be carried out using an oxidizing agent.
  • the oxidizing agent include iodine, m-chloroperbenzoic acid, tert-butyl hydroperoxide, 2-butanone peroxide, bis (trimethylsilyl) peroxide, 1,1-dihydroperoxycyclododecane, hydrogen peroxide and the like.
  • an "oxidizing agent" for example, sulfur, 3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1-dioxide (Beaucage reagent) ), 3-Amino-1,2,4-dithiazole-5-thione (A DTT), 5-phenyl-3H-1,2,4-dithiazole-3-one (POS), [(N, N-dimethyl) Aminomethylidene) Amino] -3H-1,2,4-dithiazolin-3-thione (DDTT), and phenylacetyldisulfide (PADS) can be used.
  • an "oxidizing agent” for example, sulfur, 3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1-dioxide (Beaucage reagent) ), 3-Amino-1,2,4-dithiazole-5-thione (A DTT), 5-phenyl-3H-1,2,4-dithiazole-3-one (POS), [(N, N-d
  • the oxidizing agent can be used by diluting it with a suitable solvent so as to have a concentration of 0.001 to 2M.
  • the solvent used in the reaction is not particularly limited as long as it is not involved in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, pyridine, and a mixed solvent of any ratio thereof.
  • the oxidation step may be performed after the capping operation, or conversely, the capping operation may be performed after the oxidation step, and the order is not limited.
  • RNA having a desired sequence is synthesized by repeating the above series of condensation reaction, oxidation, and deprotection steps according to the nucleotide sequence of the nucleic acid oligomer to be synthesized. be able to.
  • the RNA chain is cleaved and recovered from the solid phase carrier using ammonia or an amine compound.
  • Examples of the amine compound here include methylamine, ethylamine, isopropylamine, ethylenediamine, diethylamine, triethylamine and the like.
  • Examples of the chain length of the nucleic acid oligomer thus obtained are n ⁇ 60, n ⁇ 80 or n ⁇ 100, and n ⁇ 200.
  • an amine compound is allowed to act to deprotect the protecting group of the phosphoric acid moiety after the synthesis of the nucleic acid having the desired sequence is completed.
  • the amine compound include the described diethylamine and the like.
  • RNA purity measurement method The purity of RNA in the fractionated solution eluted by reverse phase chromatography was measured by HPLC. The separated RNA was separated into each component by HPLC (wavelength 260 nm, column DNA PacTM PA 200, 4.0 mm ⁇ 250 mm, 8.0 ⁇ m), and RNA was obtained from the area value of the main product in the total area value of the obtained chromatogram. The purity of was calculated.
  • HPLC measurement conditions are shown in Table 1 below.
  • the oxygen concentration in the atmosphere in contact with the fractionated solution eluted by reverse phase chromatography is determined by IIJIMA ELECTRONICS CORP. It was measured using PACK KEEPER (Resual Oxygen Meter) manufactured by Japan.
  • the device Before measuring the oxygen concentration, the device is calibrated by measuring the oxygen concentration in the air and pure nitrogen, and then the needle attached to the device is pierced into a container such as a flask covered with a septum or the like to measure the oxygen concentration in the gas phase part of the system. It was measured. The measured value of oxygen concentration was displayed in real time, and the place where the measured value was stable was taken as the oxygen concentration in the atmosphere.
  • RNA was synthesized from the 3'side to the 5'side using a nucleic acid synthesizer (AKTA oligopi lot plus100 GE Healthcare) based on the phosphoramidite method. The synthesis was carried out on a 63 ⁇ mol scale. Further, in the synthesis, as RNA amidite, uridine EMM amidite of the following formula (described in Example 2 of International Publication No. 2013/0278 43), citidine EMM amidite (described in Example 3), and adenosine EMM amidite, respectively.
  • porous glass was used as a solid phase carrier, a toluene dichloroacetate solution was used as a deblocking solution, and a condensing agent was used.
  • 5-benzylthio-1H-tetrazole is used as an oxidizing agent
  • iodine solution is used as an oxidizing agent
  • 3-amino-1,2,4-dithiazole-5-thione is used as a sulfide agent
  • anhydrous phenoxyacetic acid solution is used as a capping solution.
  • N-methylimidazole solution is used as N-methylimidazole solution.
  • EMM is an abbreviation for (2-cyanoethoxy) methoxymethyl group.
  • RNA synthesized under the conditions shown in Table 2 below was performed. However, before purification, the mobile phase A was passed through the column at a flow rate of 4.7 mL / min for 12.5 minutes, and then the sample was added. The holding time was 94.2 minutes-95.8 minutes, and the obtained solution was analyzed by HPLC. The purity was calculated by the method described in the measurement method 1. As a result, the purity of RNA in the fraction was 94%.
  • Example 1 Confirmation of storage stability of preparative solution [Example 1] 0.5 mL of the fractional solution containing the RNA separated and purified in Reference Example 1 was placed in a glass headspace vial (GL Science) having a capacity of 10 mL, and sealed with a septum and a crimp cap (GL Science). Furthermore, a needle that blows nitrogen from a nitrogen cylinder into a sealed system, a needle for removing the blown nitrogen, and a needle for measuring Oxygen Meter are pierced into the septum, and the atmosphere inside the system is replaced with nitrogen by flowing nitrogen. , The oxygen concentration in the atmosphere was set to 0.0%. Here, the oxygen concentration was measured using the method described in the measurement method 2.
  • Example 2 0.5 mL of the fractional solution containing the RNA separated and purified in Reference Example 1 was placed in a glass headspace vial (GL Science) having a capacity of 10 mL, and sealed with a septum and a crimp cap (GL Science). Furthermore, a needle that blows nitrogen from a nitrogen bomb into a sealed system, a needle for removing the blown nitrogen, and a needle for measuring Oxygen Meter are pierced into the septum, and the inside of the system is replaced with nitrogen by flowing nitrogen. The oxygen concentration in the atmosphere was set to 2.1%. Here, the oxygen concentration was measured using the method described in the measurement method 2.
  • Example 3 0.5 mL of the fractional solution containing the RNA separated and purified in Reference Example 1 was placed in a glass headspace vial (GL Science) having a capacity of 10 mL, and sealed with a septum and a crimp cap (GL Science). Furthermore, a needle that blows nitrogen from a nitrogen bomb into a sealed system, a needle for removing the blown nitrogen, and a needle for measuring Oxygen Meter are pierced into the septum, and the inside of the system is replaced with nitrogen by flowing nitrogen. The oxygen concentration in the atmosphere was set to 7.3%. Here, the oxygen concentration was measured using the method described in the measurement method 2.
  • Example 4 Recovery of RNA from the stored preparative solution
  • RNA as a precipitate When the obtained RNA was dissolved in 0.4 mL of water and the purity of RNA in the fraction was calculated by the method described in the measurement method 1, the purity was 77%.
  • RNA was synthesized from the 3'side to the 5'side using a nucleic acid synthesizer (AKTA oligopi lot plus100 GE Healthcare) based on the phosphoramidite method. The synthesis was carried out on a 53 ⁇ mol scale. Further, in the synthesis, as RNA amidite, uridine EMM amidite (described in Example 2 of International Publication No. 2013/0278 43), citidine EMM amidite (described in Example 3), and adenosine EMM amidite (described in Example 4).
  • a nucleic acid synthesizer AKTA oligopi lot plus100 GE Healthcare
  • guanosine EMM amidite (described in Example 5), respectively, using uridine 2'OMe amidite, citidin 2'OMe amidite, adenosine 2'OMe amidite, and guanosine 2'OMe amidite of the following formulas.
  • Porous glass is used as the solid phase carrier
  • dichloroacetate toluene solution is used as the deblocking solution
  • 5-benzylthio-1H-tetrazole is used as the condensing agent
  • iodine solution is used as the oxidizing agent
  • sulfurizing agent is used.
  • 3-Amino-1,2,4-dithiazole-5-thione was used, and an anhydrous phenoxyacetic acid solution and an N-methylimidazole solution were used as capping solutions.
  • the cyanoethyl protecting group of the phosphoric acid moiety was selectively deprotected by allowing a diethylamine solution to act on the nucleic acid on the carrier.
  • EMM is an abbreviation for (2-cyanoethoxy) methoxymethyl group.
  • RNA Column chromatography purification was performed under the conditions shown in Table 4 below. However, before purification, the mobile phase A was passed through the column at a flow rate of 4.7 mL / min for 12.5 minutes, and then the sample was added. The holding time was 66.7 minutes-70.9 minutes, and the obtained solution was analyzed by HPLC. The purity was calculated by the method described in the measurement method 1. As a result, the purity was 94%. The following Examples and Comparative Examples were tested using this preparatively purified RNA solution.
  • Example 5 0.5 mL of the solution of the fraction containing RNA separated and purified in Reference Example 2 was placed in a glass headspace vial (GL Science) having a capacity of 10 mL, and sealed with a septum and a crimp cap (GL Science). Furthermore, a needle that blows nitrogen from a nitrogen cylinder into a sealed system, a needle for removing the blown nitrogen, and a needle for measuring Oxygen Meter are pierced into the septum, and the atmosphere inside the system is replaced with nitrogen by flowing nitrogen. , The oxygen concentration in the atmosphere was set to 0.0%. Here, the oxygen concentration was measured using the method described in the measurement method 2.
  • Example 6 0.5 mL of the solution of the fraction containing RNA separated and purified in Reference Example 2 was placed in a glass headspace vial (GL Science) having a capacity of 10 mL, and sealed with a septum and a crimp cap (GL Science). Furthermore, a needle that blows nitrogen from a nitrogen bomb into a sealed system, a needle for removing the blown nitrogen, and a needle for measuring Oxygen Meter are pierced into the septum, and the inside of the system is replaced with nitrogen by flowing nitrogen. The oxygen concentration in the atmosphere was set to 2.1%. Here, the oxygen concentration was measured using the method described in the measurement method 2.
  • Example 7 0.5 mL of the solution of the fraction containing RNA separated and purified in Reference Example 2 was placed in a glass headspace vial (GL Science) having a capacity of 10 mL, and sealed with a septum and a crimp cap (GL Science). Furthermore, a needle that blows nitrogen from a nitrogen bomb into a sealed system, a needle for removing the blown nitrogen, and a needle for measuring Oxygen Meter are pierced into the septum, and the inside of the system is replaced with nitrogen by flowing nitrogen. The oxygen concentration in the atmosphere was 4.5%. Here, the oxygen concentration was measured using the method described in the measurement method 2.
  • the nucleic acid oligomer having a phosphorothioate bond in the elution fraction of the reverse phase chromatography can be stabilized, and the purified nucleic acid oligomer having a phosphorothioate bond (for example, RNA) can be efficiently produced.
  • SEQ ID NOs: 1 and 2 in the sequence listing represent the base sequences of oligonucleotides produced according to the production method of the present invention.

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Abstract

本発明は、ホスホロチオエート結合を有する核酸オリゴマー溶液の安定化方法および精製核酸オリゴマーの製造方法を提供することを目的とする。本発明は、式（１）(式中、記号は明細書に記載のとおり。）で示される核酸オリゴマーを含む粗核酸オリゴマーを逆相カラムクロマトグラフィー処理することで得られた溶離画分に接する雰囲気を、酸素濃度１０％以下の不活性ガス雰囲気とすることを特徴とする、核酸オリゴマーの安定化方法および前記溶離画分から精製核酸オリゴマーを製造する方法を提供する。

Description

核酸オリゴマーの製造方法
　本特許出願は、日本国特許出願２０２０－０７２２３３号（２０２０年４月１４日出願）に基づくパリ条約上の優先権および利益を主張するものであり、ここに引用することによって、上記出願に記載された内容の全体が本明細書中に組み込まれるものとする。
　本発明は、核酸オリゴマーの製造方法に関する。本発明は、さらに詳しくは、ホスホロチオエートを含む核酸オリゴマーの製造方法に関する。
　近年、核酸オリゴマーの医療分野への応用に関心が高まっている。例えば、アンチセンス核酸、アプタマー、リボザイム、およびｓｉＲＮＡなどのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導する核酸などが挙げられ、これらは核酸医薬品と呼ばれている。
　核酸オリゴマーは、固相合成法により合成可能であり、固相担体上で核酸を伸長して合成された核酸オリゴマーは、固相担体から切り出し、次いで、例えば、リボースを含む核酸オリゴマーは、リボースの２’位の水酸基の保護基を脱保護して除いて、目的とする核酸オリゴマーが製造されている。ホスホロチオエート結合を有する核酸オリゴマーも有用な化合物として知られている（特許文献１）。
国際公開第２０１７／０６８３７７号公報
　ホスホロチオエート結合を有する核酸オリゴマーは、ホスホジエステル結合のみからなる核酸オリゴマーとくらべると、安定性が問題となることがある。本発明は、ホスホロチオエート結合を有する核酸オリゴマーの安定化方法、および当該方法で安定化した核酸オリゴマーを単離する工程を含む前記核酸オリゴマーの効率的な製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ホスホロアミダイト法により生成する、ホスホロチオエート結合を有する核酸オリゴマーの粗生成物を逆相カラムクロマトグラフィーに付して、該核酸オリゴマーを含む精製された溶離画分を得て、次いで、得られた溶離画分と接する雰囲気を一定濃度以下の不活性ガス雰囲気とすることによって、該ホスホロチオエート結合を有する核酸オリゴマーを安定化することができることを見出した。本発明は、ホスホロチオエート結合を有する核酸オリゴマーの安定化方法、および当該方法で安定化した核酸オリゴマーを単離する工程を含む、ホスホロチオエート結合を有する核酸オリゴマーの効率的な製造方法を提供する。
　本発明は、以下の態様を包含するが、これらに限定されるものではない。
項１．　逆相カラムクロマトグラフィーから溶離した画分であって、式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
（式中、
　ＢＣは、それぞれ独立して同一又は相異なる核酸塩基を表し、
　Ｒは、それぞれ独立して同一又は相異なって、水素原子、フッ素原子またはＯＱ基を表し、
　Ｑは、それぞれ独立して同一又は相異なって、水素原子、メチル基、２－メトキシエチル基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、またはリボースの４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、
　Ｘは、それぞれ独立して同一又は相異なって、酸素原子または硫黄原子を表し、
　Ｙは、水素原子または水酸基の保護基を表し、
　Ｇは、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、アルカリ金属イオン、水素イオンまたはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表し、
　ｎは、式（２）：
　　　６０≦ｎ　　　　　　（２）
を満たす整数であり、かつ、ｎ個あるＸの２０％までが、硫黄原子である。）
で示される核酸オリゴマーを含む溶液に接する雰囲気を、酸素濃度１０％以下の不活性ガス雰囲気とすることを特徴とする、核酸オリゴマーの安定化方法。
項２．　ホスホロアミダイト法により生成する前記式（１）で示される核酸オリゴマーの粗生成物を逆相カラムクロマトグラフィーに付し、式（１）の核酸オリゴマーを含む精製された溶離画分を得る工程、および項１に記載の前記溶離画分と接する雰囲気を酸素濃度１０％以下の不活性ガス雰囲気とする工程を含む、安定化した精製核酸オリゴマー溶液の製造方法。
項３．　前項２に記載の工程により精製核酸オリゴマー溶液を製造する工程と、前記の精製核酸オリゴマー溶液から精製された核酸オリゴマーを単離する工程をさらに含む、精製核酸オリゴマーの製造方法。
項４．　酸素濃度が５％以下である、前項１～３の何れか一項に記載の方法。
項５．　酸素濃度が２．５％以下である、前項１～４の何れか一項に記載の方法。
項６．　前記逆相カラムクロマトグラフィーが、移動相として、モノアルキルアンモニウム塩及びジアルキルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも１つのアンモニウム塩を含む移動相を使用する逆相カラムクロマトグラフィーである、前項２～５の何れか一項に記載の方法。
項７．　前記逆相カラムクロマトグラフィーが、移動相として、ジアルキルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも１つのアンモニウム塩を含む移動相を使用する逆相カラムクロマトグラフィーである、前項２～６の何れか一項に記載の方法。
項８．　前記逆相カラムクロマトグラフィーが、移動相として、アルコール系水溶性有機溶媒及びニトリル系水溶性有機溶媒からなる群から選ばれる少なくとも一つの水溶性有機溶媒を含む移動相を使用する逆相カラムクロマトグラフィーである、前項２～７の何れか一項に記載の方法。
項９．　前記の安定化した精製核酸オリゴマー溶液と、酸素原子を少なくとも１つ有するＣ１－Ｃ４の有機溶媒とを混合して、析出した核酸オリゴマーを単離することを含む、前項３に記載の方法。
項１０．　前記式（１）において、Ｒが、それぞれ独立して、ヒドロキシ基またはメトキシ基である、前項１～９の何れか一項に記載の方法。
項１１．Ｒが、ヒドロキシ基である、前項２～９の何れか一項に記載の製造方法。
　本発明は、更に以下の態様を包含するが、これらに限定されるものではない。
項１Ａ．　ホスホロアミダイト法により生成する式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
（式中、
　ＢＣは、それぞれ独立して同一又は相異なる核酸塩基を表し、
　Ｒは、それぞれ独立して同一又は相異なって、水素原子、フッ素原子またはＯＱ基を表し、
　Ｑは、それぞれ独立して同一又は相異なって、水素原子、メチル基、２－メトキシエチル基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、またはリボースの４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、
　Ｘは、それぞれ独立して同一又は相異なって、酸素原子または硫黄原子を表し、
　Ｙは、水素原子または水酸基の保護基を表し、
　Ｇは、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、アルカリ金属イオン、水素イオンまたはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表し、
　ｎは、式（２）：
　　　６０≦ｎ　　　　　　（２）
を満たす整数であり、かつ、ｎ個あるＸの２０％までが、硫黄原子である。）
で示される核酸オリゴマーの粗生成物を逆相カラムクロマトグラフィーに付して、式（１）の核酸オリゴマーを含む精製された溶離画分を得る工程、および
　前記溶離画分と接する雰囲気を酸素濃度１０％以下の不活性ガス雰囲気として、安定化した精製核酸オリゴマー溶液を得る工程、を含む、
核酸オリゴマーの製造方法。
項２Ａ．　前記の安定化した精製核酸オリゴマー溶液から、精製された核酸オリゴマーを単離する工程をさらに含む、項１Ａ記載の核酸オリゴマーの製造方法。
項３Ａ．　酸素濃度が５％以下である、項１Ａまたは項２Ａのいずれかに記載の核酸オリゴマーの製造方法。
項４Ａ．　酸素濃度が２．５％以下である、項１Ａまたは項２Ａのいずれかに記載の核酸オリゴマーの製造方法。
項５Ａ．　前記逆相カラムクロマトグラフィーの移動相が、モノアルキルアンモニウム塩及びジアルキルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも１つのアンモニウム塩を含む移動相である、前項１Ａ～４Ａの何れか一項に記載の製造方法。
項６Ａ．　前記逆相カラムクロマトグラフィーの移動相が、ジアルキルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも１つのアンモニウム塩を含む移動相である、前項１Ａ～４Ａの何れか一項に記載の製造方法。
項７Ａ．　前記逆相カラムクロマトグラフィーが、移動相として、アルコール系水溶性有機溶媒及びニトリル系水溶性有機溶媒からなる群から選ばれる少なくとも一つの水溶性有機溶媒を含む移動相を使用する逆相カラムクロマトグラフィーである、前項１Ａ～６Ａの何れか一項に記載の製造方法。
項８Ａ．　前記の安定化した精製核酸オリゴマー溶液と、酸素原子を少なくとも１つ有するＣ１－Ｃ４の有機溶媒とを混合して、析出した核酸オリゴマーを単離することを含む、前項２Ａに記載の製造方法。
項９Ａ．　前記式（１）において、Ｒが、それぞれ独立して、ヒドロキシ基またはメトキシ基である、前項１Ａ～８Ａの何れか一項に記載の製造方法。
項１０Ａ．　Ｒが、ヒドロキシ基である、前項１Ａ～８Ａの何れか一項に記載の製造方法。
項１１Ａ．　逆相カラムクロマトグラフィーから溶離した画分であって、式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（式中、
　各基の定義は、項［１Ａ］と定義する通りである）
で示される核酸オリゴマーを含む溶液に接する雰囲気を、酸素濃度１０％以下の不活性ガス雰囲気とすることを特徴とする、核酸オリゴマーの安定化方法。
　本発明により、ホスホロチオエート結合を有する核酸オリゴマーが安定化され、その効率的な製造方法が提供される。
図１は、ホスホロアミダイト法による核酸オリゴマーの合成の例を示す図である。
　逆相カラムクロマトグラフィーから溶離した分画であって、前記式（１）で示される核酸オリゴマーを含む溶液と接する雰囲気を酸素濃度１０％以下の不活性ガス雰囲気とすることを特徴とする核酸オリゴマーの安定化方法について説明する。
　前記式（１）において、ＢＣで表される核酸塩基（以下、「塩基」と記すこともある。）は、天然または非天然の核酸塩基であってもよい。かかる非天然の核酸塩基としては、天然または非天然の核酸塩基の修飾アナログが例示される。核酸塩基としては、典型的には、プリン化合物及びピリミジン化合物が例示され、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅ ｎｃｅ Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」，８５８～８５９頁，クロシュビッツ  ジェー アイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１ ９９０、及びイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈら）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅ ｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０巻，ｐ．６１３ に開示される核酸塩基が例示される。
　具体的には、例えば、アデニン、イソグアニン、キサンチン、ヒポキサンチン及びグアニン等のプリン塩基；及び、シトシン、ウラシル及びチミン等のピリミジン塩基等が例示される。
　さらに、ＢＣで表される核酸塩基としては、例えば、２－アミノアデニン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン等のアミノ誘導体；５－メチルウラシル、５－メチルシトシン、７－メチルグアニン、６－メチルプリン、２－プロピルプリン等のアルキル誘導体；５－ハロウラシル及び５－ハロシトシン；５－プロピニルウラシル及び５－プロピニルシトシン；６－アザウラシル、６－アザシトシン及び６－アザチミン；５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、５－（２－アミノプロピル）ウラシル、５－アミノアリルウラシル；８－ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化及び他の８－置換プリン；５－トリフルオロメチル化及び他の５－置換ピリミジン；６－アザピリミジン；Ｎ－２、Ｎ－６及びＯ－６置換プリン（２－アミノプロピルアデニンを含む）；ジヒドロウラシル；３－デアザ－５－アザシトシン；７－デアザアデニン；Ｎ６－メチルアデニン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン；５－アミノ－アリル－ウラシル；Ｎ３－メチルウラシル；置換１，２，４－トリアゾール；２－ピリジノン；５－ニトロインドール；３－ニトロピロール；５－メトキシウラシル；ウラシル－５－オキシ酢酸；５－メトキシカルボニルメチルウラシル；２－チオウラシル、５－メチル－２－チオウラシル；５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウラシル；５－メチルアミノメチル－２－ チオウラシル；３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウラシル；３－メチルシトシン；Ｎ４－アセチルシトシン；２－チオシトシン；Ｎ６－メチルアデニン；Ｎ６－イソペンチルアデニン；２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン；Ｎ－メチルグアニン；Ｏ－アルキル化塩基等が例示される。
　ＲがＯＱ基を表し、Ｑがリボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているエチレン基またはリボースの４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表すとき、当該構造は、下記の式（３）において示すＬＮＡ－１、ＬＮＡ－２およびＬＮＡ－３の構造で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（式中、Ｂｃは、前記のとおりの核酸塩基を表す。）
　Ｙで示される水酸基の保護基としては、アミダイト法において、保護基として機能し得るものであれば特に制限なく使用することができ、例えば、アミダイト化合物に対して使用される公知の保護基を広く使用することができる。Ｙで示される水酸基の保護基は、好ましくは、以下の基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、同一又は相異なって水素又はアルコキシ基を表す。）
　前記アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基が例示される。
　式（１）の核酸オリゴマーの鎖長は、例えば、ｎ≧６０、ｎ≧８０またはｎ≧１００のものが例示される。鎖長の上限としては、例えば、ｎ≦２００が例示される。前記核酸オリゴマーにおいては、ｎ個あるＸの２０％（２０％を含む）までが、硫黄原子である。好ましくは、式（１）の核酸オリゴマーは１つ以上のホスホロチオエート結合を有し、さらに好ましくは３つ以上のホスホロチオエート結合を有する。
　式（１）の核酸オリゴマーは、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマー、あるいはこれらのオリゴマーに非天然型の核酸塩基を含むものであってもよい。前記核酸オリゴマーは、典型的には、一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマーである。前記式（１）の核酸オリゴマーにおいて、置換基Ｒは、好ましくは、それぞれ独立して、ヒドロキシ基またはメトキシ基である。本願発明の方法は、置換基Ｒが、それぞれ独立して、ヒドロキシ基またはメトキシ基である式（１）の核酸オリゴマーであるＲＮＡに好適である。さらに詳しくは、置換基Ｒ がヒドロキシ基であるヌクレオチドとメトキシ基であるヌクレオチドの両方を含む核酸オリゴマーの製造に好適である。
＜逆相カラムクロマトグラフィーによる核酸オリゴマーの精製方法＞
　逆相カラムクロマトグラフィーによる分離は、充填剤を含むカラムに、アルキルアンモニウム塩を含む移動相を通液し、次いで同移動相にホスホロアミダイト法を用いて合成された核酸オリゴマーを含む反応生成物を溶解した溶液を通液し、前記核酸オリゴマーをカラム内に吸着結合させ、移動相中の有機溶媒濃度を順次増大させる勾配（グラジエント）により前記核酸オリゴマーに含まれる不純物と目的とする核酸分子とを分離して溶離させることにより実施される。
　逆相カラムクロマトグラフィーにより得られる溶離画分は、一般的に核酸の分離分析に用いるクロマトグラフィーの条件下で、波長２６０ｎｍのＵＶ吸収で、組成を分析して、選択され集められる。集められた画分から、精製された目的物である所定量のホスホロチオエート結合を有する核酸オリゴマーが得られる。前記分析法としては、たとえば、非特許文献（Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products, CRC Press）に記載の方法を用いることができる。
　前記逆相カラムクロマトグラフィーの充填剤としては、疎水性の固定相となるシリカまたはポリマーとして、例えば、フェニル基、炭素数１～２０のアルキル基およびシアノプロピル基から選ばれるいずれか１種以上が固定されたシリカまたはポリマーが例示される。かかる充填剤であるシリカまたはポリマーとしては、例えば、粒子径が、２μｍ以上、あるいは、５μｍ以上のものが使用される。
　逆相カラムクロマトグラフィーにおいて、溶離して分画液として得られるのは、水溶性の移動相であり、移動相となる溶媒系としては、アルコール系有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、２－プロパノールもしくはｎ－プロパノール）、ニトリル系有機溶媒（例えば、アセトニトリル）、および水が例示される。アルコール系有機溶媒としてはＣ１－Ｃ３アルコールが好ましく、なかでもメタノールがより好ましい。ニトリル系有機溶媒としてはアセトニトリルが好ましい。各有機溶媒は、一種単独で用いても二種以上を併用しても良い。
　前記逆相カラムクロマトグラフィーの移動相には、通常、アルキルアンモニウム塩を含む移動相が使用され、溶離液にもこれらのアルキルアンモニウム塩が含まれる。前記アルキルアンモニウム塩としては、通常、モノアルキルアンモニウム塩、ジアルキルアンモニウム塩およびトリアルキルアンモニウム塩が使用され、好ましくはモノアルキルアンモニウム塩およびジアルキルアンモニウム塩、より好ましくはジアルキルアンモニウム塩が使用される。モノアルキルアンモニウム塩を形成するモノアルキルアミンの炭素数は、好ましくは３～１０であり、より好ましくは４～６であり、さらに好ましくはヘキシルアミンである。ジアルキルアンモニウム塩を形成するジアルキルアミンの炭素数は、好ましくは４～１０であり、より好ましくは５～９である。好ましいジアルキルアミンは、ジブチルアミンである。トリアルキルアンモニウム塩を形成するトリアルキルアミンは、炭素数６～１２のものが好ましく６～９のものがより好ましく、具体的にはトリエチルアミンが例示される。
　前記モノアルキルアンモニウム塩、ジアルキルアンモニウム塩およびトリアルキルアンモニウム塩を形成する酸としては、例えば、炭酸、酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸およびプロピオン酸が例示される。
　前記アンモニウム塩の濃度としては、通常、１～２００ｍＭであり、好ましくは５～１５０ｍＭであり、より好ましくは２０～１００ｍＭである。
　移動相のｐＨ範囲は、通常、ｐＨ：６～８であり、好ましくは６．５～７．５である。
　逆相カラムクロマトグラフィーの温度は、通常、２０～１００℃であり、好ましくは３０～８０℃であり、より好ましくは４０～７０℃である。
　逆相カラムクロマトグラフィーで得られた溶離液画分には、通常、水、アルコール系有機溶媒、ニトリル系有機溶媒、前記アルキルアンモニウム塩および式（１）の核酸オリゴマーが含まれる。上記溶離液中の水の量は、通常、９０％～３０％であり、好ましくは８０％～４０％であり、より好ましくは７０％～４０％である。上記溶離液中のアルコール系有機溶媒の量は、通常、０～２０％であり、好ましくは０～１５％であり、より好ましくは０％～１０％である。上記溶離液中のニトリル系有機溶媒の量は、通常、１０～７０％ であり、好ましくは２０～６０％であり、より好ましくは３０～５０％である(以上％は、すべて質量％を表す。)
　上記溶離画分中のアルキルアンモニウム塩のモル濃度は、通常、１ｍＭ～２００ｍＭであり、好ましくは１０ｍＭ～１００ｍＭである。
　上記上記溶離画分中の核酸オリゴマーの濃度は、通常、０．０５ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは０．０５ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは０．１ ｍｇ／ｍＬ～０．５ｍｇ／ｍＬである。
＜逆相クロマトグラフィーで得られた核酸オリゴマーを含む溶離画分の安定化工程＞
　酸素濃度が１０％以下の不活性ガス雰囲気は、例えば、核酸オリゴマーを含む容器に所定の酸素濃度以下の不活性ガスを供給し、容器内の雰囲気中の酸素濃度が前記設定濃度範囲内であることを測定して確認することにより調整してもよい。具体的には、容器内の雰囲気にアルゴンもしくは窒素などの高純度の不活性ガス、または酸素濃度を所定の濃度に調製した不活性ガスを流通させるか、あるいは容器内の雰囲気を前記不活性ガスまたは濃度調整した不活性ガスで置換することによって調整することができる。
　酸素濃度が１０％以下の不活性ガス雰囲気の調製は、前記溶離画分を容器に供給する前、または供給中、または容器に供給した後、のいずれの段階で行っても良い。また、それらを組み合わせて行っても良い。
　上記不活性ガスとは、窒素ガス、アルゴンガス、ヘリウムガスが挙げられるが、これらに限定されない。
　容器内の雰囲気置換方法は、減圧置換、加圧置換、フロー置換、バブリングによる置換、または凍結脱気による置換が挙げられ、その際超音波をかけても加熱してもよい。より好ましい方法は、フロー置換である。
　前記不活性ガス雰囲気下の酸素濃度は、好ましくは１０％以下、より好ましくは５．０％以下、さらに好ましくは２．５％以下であり、更により好ましくは０．１％以下である。
　前記不活性ガス雰囲気下では、得られた溶離画分を、通常、０℃～８０℃、好ましくは１０℃～７０℃、より好ましくは２０℃～６０℃で保管してもよい。
　逆相クロマトグラフィーで得られた核酸オリゴマーを含む溶離画分は、例えば、保管の後に、核酸オリゴマーを単離するため再沈殿工程、分液工程、限外濾過工程、脱保護工程、および凍結乾燥工程といった後処理工程から選ばれる単一もしくは複数の工程に付してもよい。
　再沈殿工程では、安定化した溶液を、貧溶媒と接触させ、核酸オリゴマーを析出させ、単離することができる。必要であれば、固液分離した状態から、液体部を除去し、次いでろ過等により析出した核酸オリゴマーを集めて単離してもよい。再沈殿工程の貧溶媒としては、酸素原子を少なくとも１つ有するＣ１－Ｃ４の有機溶媒（例えば、Ｃ１－Ｃ４アルコール、テトラヒドロフラン、ジオキサン）が挙げられる。かかる溶媒としては、エタノールまたはイソプロパノールが好ましい。
　分液工程では、安定化した溶液に酢酸ナトリウム水溶液等の酸性水溶液、水、および食塩水等のうちの少なくとも一種を混合し、さらに水と混和しない有機溶媒を加えることで水層と有機層に分液し、所望の核酸オリゴマーを含む水層を取得することができる。
　限外濾過工程では、限外濾過膜を用いて保管工程後の溶液中に存在する核酸オリゴマーを所望の分子量以下の低分子成分と分離することができる。
　核酸オリゴマーの５’末端部位に保護基がある場合は、これを脱保護するため、保管工程後の溶液に酢酸水溶液等の酸性水溶液、もしくは酢酸等の酸性物質を有機溶媒に溶解した溶液を混合することで、核酸オリゴマーの保護基を脱保護することができる。
　凍結乾燥工程では、凍結させた核酸オリゴマーの水溶液を減圧することで水を昇華させ、核酸オリゴマーと水分を分離することができる。
　ホスホロアミダイト法による核酸オリゴマーの合成は、公知の方法（例えば、前記の特許第５１５７１６８号公報または特許第５５５４８８１号公報に記載の方法）に従って、核酸伸長反応を行うことができる。ホスホロアミダイト法による核酸オリゴマーの製造については、図１に示すスキームのＲＮＡの合成を例に挙げて、以下に示す反応経路（縮合反応、酸化、脱保護）を参照しながら核酸オリゴマーの製造方法について説明する。
　反応経路を示す前記化学式中、Ｂａは、保護されていてもよい核酸塩基；Ｔｒは保護基；であり、Ｘは、前記定義のとおりであり、ＳＰは無機多孔質担体のヌクレオシド構造以外の部分をそれぞれ表している。
　ヌクレオシド構造を有する無機多孔質担体（Ｓｐ－Ｎｕ）およびアミダイトモノマー（Ａｍ－１）のヌクレオシドを構成する核酸塩基は、前記のとおりの核酸塩基もしくは保護基で保護された核酸塩基である。
　好適なアミダイトモノマー（Ａｍ－１）の例としては、下記化学式（Ａｍ－１’）で表される化合物において、Ｒが、保護された水酸基を表すとき、具体的な保護基としては、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基、ビス（２－アセトキシ）メチル（ＡＣＥ）基、（トリイソプロピルシリロキシ）メチル（ＴＯＭ）基、（２－シアノエトキシ）エチル（ＣＥＥ）基、（２－シアノエトキシ）メチル（ＣＥＭ）基、パラ－トルイルスルホニルエトキシメチル（ＴＥＭ）基、（２－シアノエトキシ）メトキシメチル（ＥＭＭ）基などで保護された、ＴＢＤＭＳアミダイト（ＴＢＤＭＳ　ＲＮＡ　Ａｍｉｄｉｔｅｓ、商品名、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＡＣＥアミダイト、ＴＯＭ アミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト（Chakhmakhcheva の総説：Protective Groups in the Chemical Synthesis of Oligoribonucleotides、Rus sian Journal of Bioorganic Chemistry, 2013, Vol. 39, No. 1, pp. 1-21.）、ＥＭＭ アミダイト（国際公開第２０１３／０２７８４３号に記載）等が例示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（式中、Ｒは、前記のとおりの基を表し、Ｂａは、保護されていてもよい核酸塩基を示す。）
［ＲＮＡの固相合成］
　無機多孔質担体（Ｓｐ－Ｎｕ）のＴｒ基を脱保護して、固相担体（Ａｍ－２）を得る。この後、アミダイトモノマー（Ａｍ－１）と、固相担体（Ａｍ－２）とを縮合反応させて、反応生成物（Ａｍ－３）を得る。この後、反応生成物（Ａｍ－３）を酸化して、生成物（Ａｍ－４）を得る。この後、生成物（Ａｍ－４）を脱保護（－Ｔｒ）して、生成物（Ａｍ－５）を得る。次いで、アミダイトモノマー（Ａｍ－１）と生成物（Ａｍ－５）とを更に縮合反応させて、ホスホジエステル結合を伸長していく。このように、伸長したオリゴヌクレオチド鎖末端の５’位のヒドロキシル基を、所望の配列となるように、一連の脱保護、縮合反応、酸化のサイクルを必要なだけ繰り返し、この後、固相担体から切り出すことにより、所望の配列の核酸分子を製造することができる。かかる合成は、ホスホロアミダイト法を採用する核酸自動合成装置等を用いて行ってもよい。ここでは、ＲＮＡを例に挙げ説明するが、リボヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む核酸化合物にも適用できるものである。
　Ｔｒ基を脱保護する工程では、固相担体上に担持されるＲＮＡ鎖末端の５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する。保護基としては、トリチル系保護基（典型的には、ＤＭＴｒ基）が用いられる。脱保護は、酸を用いて行うことができる。脱保護用の酸としては、例えば、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸、ｐ－トルエンスルホン酸等が挙げられる。
　縮合工程では、前記の脱保護する工程により脱保護したＲＮＡ鎖末端の５’位のヒドロキシル基に対して、ヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させて、ホスファイトを生成する。前記ヌクレオシドホスホロアミダイトとしては、５’位のヒドロキシル基が保護基（例えばＤＭＴｒ基）で保護されたものを用いる。
　また、縮合工程は、前記ヌクレオシドホスホロアミダイトを活性化する活性化剤を用いて行うことができる。活性化剤としては、例えば、５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＢＴＴ）、１Ｈ－テトラゾール、４，５－ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）、Ｎ－メチルベンズイミダゾリウムトリフラート（Ｎ－ＭｅＢＩＴ）、ベンズイミダゾリウムトリフラート（ＢＩＴ）、Ｎ－フェニルイミダゾリウムトリフラート（Ｎ－ＰｈＩＭＴ）、イミダゾリウムトリフラート（ＩＭＴ）、５－ニトロベンズイミダゾリウムトリフラート（ＮＢＴ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、および５－（ビス－３，５－トリフルオロメチルフェニル）－１ Ｈ－テトラゾール（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－４２）等が挙げられる。
　縮合工程の後は、適宜、未反応の５’位のヒドロキシル基をキャッピングしてもよい。キャッピングは、無水酢酸－テトラヒドロフラン溶液、フェノキシ酢酸無水物／Ｎ－メチルイミダゾール溶液等の公知のキャッピング溶液を用いて行うことができる。
　酸化工程は、前記縮合工程により形成されたホスファイトを酸化する工程である。酸化工程は、酸化剤を用いて行うことができる。酸化剤としては、ヨウ素、ｍ－クロロ過安息香酸、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド、２－ブタノンペルオキシド、ビス（トリメチルシリル）ペルオキシド、１，１－ジヒドロペルオキシシクロドデカン、および過酸化水素等が挙げられる。
　亜リン酸トリエステル基をチオリン酸トリエステル基に変換する場合には、「酸化剤」として、例えば、硫黄、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン－１，１－ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（Ａ ＤＴＴ）、５－フェニル－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－オン（ＰＯＳ）、［（ Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾリン－３－ チオン（ＤＤＴＴ）、およびフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）を使用することができる。該酸化剤は、０．００１～２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。反応に使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、ピリジン又はこれらの任意の割合の混合溶媒が挙げられる。
　酸化工程は、前記キャッピング操作の後で行ってもよいし、逆に、酸化工程の後でキャッピング操作を行ってもよいし、この順番は限定されない。
　酸化工程後は、脱保護工程に戻り、合成すべき核酸オリゴマーのヌクレオチド配列に応じて、上記の縮合反応、酸化、脱保護の一連の工程を繰り返すことにより、所望の配列を有するＲＮＡを合成することができる。
　所望の配列を有する核酸オリゴマーの合成が完了した後は、アンモニアまたはアミン化合物を用いて、固相担体からＲＮＡ鎖を切断して回収する。
　ここでのアミン化合物としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、イソプロピルアミン、エチレンジアミン、ジエチルアミン、およびトリエチルアミン等が挙げられる。
　かくして得られる核酸オリゴマーの鎖長は、例えば、ｎ≧６０、ｎ≧８０またはｎ≧１００、かつ、ｎ≦２００のものが例示される。
　リン酸保護基を脱保護する工程は、所望の配列を有する核酸の合成が完了した後は、リン酸部分の保護基を脱保護するためにアミン化合物を作用させる。アミン化合物としては、例えば、記載されるジエチルアミン等が挙げられる。
　リボースの２’位もしくは３’位の水酸基の保護基がある場合は、国際公開第２００６／ ０２２３２３号公報）、国際公開第２０１３／０２７８４３号公報、または国際公開第２０１９／２０８５７１号公報に記載の方法に従って除くことができる。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
測定方法
　以下の試験で用いた各測定方法を以下に示す。
（測定方法１：ＲＮＡの純度の測定方法）
　逆相クロマトグラフィーで溶離した分画溶液中のＲＮＡの純度の測定は、ＨＰＬＣにより行った。分取したＲＮＡをＨＰＬＣ（波長２６０ｎｍ、カラムＤＮＡＰａｃＴＭ ＰＡ ２００、４．０ｍｍ×２５０ｍｍ、８．０μｍ）によって各成分に分離し、得られたクロマトグラムの総面積値における主生成物の面積値からＲＮＡの純度を算出した。ＨＰＬＣ 測定条件を下記表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
（測定方法２：酸素濃度の測定）
　逆相クロマトグラフィーで溶離した分画溶液に接する雰囲気の酸素濃度はＩＩＪＩＭＡ ＥＬＥＣＴＲＯＮＩＣＳ　ＣＯＲＰ．製のＰＡＣＫ　ＫＥＥＰＥＲ（Ｒｅｓｉｄｕａｌ　Ｏｘｙｇｅｎ Ｍｅｔｅｒ）を用いて測定した。酸素濃度測定前には空気中及び純窒素中酸素濃度の測定により装置を校正後、装置に付属の針をセプタムなどで蓋をしたフラスコなどの容器に突き刺し、系中気相部分の酸素濃度を測定した。酸素濃度の測定値はリアルタイムで表示され、測定値が安定した所をその雰囲気の酸素濃度とした。
［参考例１］
ＲＮＡのアミダイト法による固相合成
　以下に示すＩの核酸配列を有するＲＮＡを合成した。当該鎖は１０３塩基長からなる。
鎖Ｉ：A*U*A*ACUCAAUUUGUAAAAAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*U*U*U (5'-3')　　　（配列番号１）
　前記配列の表記において、配列の説明中、Ｕはウリジンを、Ｃはシチジンを、Ａはアデノシンを、またはＧはグアノシンを表す。ヌクレオチドの間の記号＊は、ヌクレオチドを繋ぐリン酸結合が、ホスホロチオエートであることを表す。
　当該ＲＮＡは、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（ＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉ ｌｏｔ ｐｌｕｓ１００ ＧＥヘルスケア社）を用いて３’側から５’側に向かって合成した。合成は６３μｍｏｌスケールにて実施した。また、当該合成にはＲＮＡアミダイトとして、それぞれ下記の式のウリジンＥＭＭアミダイト（国際公開第２０１３／０２７８ ４３号の実施例２に記載）、シチジンＥＭＭアミダイト（同実施例３に記載）、アデノシンＥＭＭアミダイト（同実施例４に記載）、及びグアノシンＥＭＭアミダイト（同実施例５に記載）を使用し、固相担体として多孔質ガラスを使用し、デブロッキング溶液としてジクロロ酢酸トルエン溶液を使用し、縮合剤として５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾールを使用し、酸化剤としてヨウ素溶液を使用し、硫化剤として３－アミノ－１，２，４－ ジチアゾール－５－チオンを使用し、キャッピング溶液として無水フェノキシ酢酸溶液とＮ－メチルイミダゾール溶液とを使用して行った。核酸伸長終了後担体上の核酸にジエチルアミン溶液を作用させることでリン酸部分のシアノエチル保護基を選択的に脱保護した。ここで、ＥＭＭは、（２－シアノエトキシ）メトキシメチル基の略号である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　固相合成後の固相担体からの切出しと脱保護は、国際公開第２０１３／０２７８４３号に記載の方法に従った。すなわち、アンモニア水溶液とエタノールとを加え、しばらく静置した後に固相担体をろ過し、溶媒を留去した。その後、テトラブチルアンモニウムフルオリドを用いて水酸基の脱保護を行った。得られたＲＮＡを、注射用蒸留水を用いて所望の濃度となるように溶解した。
ＲＮＡの分取精製
　下記表２の条件で合成したＲＮＡのカラムクロマトグラフィー精製を行った。ただし、精製前にカラム内に移動相Ａを流速４．７ｍＬ／ｍｉｎで１２．５分間通液したのちにサンプルを添加した。保持時間９４．２分－９５．８分までを分取し、得られた溶液をＨＰＬＣにて分析した。なお、前記測定方法１に記載の方法で純度を算出した。その結果、分取された画分中のＲＮＡの純度は９４％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
分取溶液の保存安定性の確認
［実施例１］
　前記参考例１で分取精製したＲＮＡを含む画分の溶液０．５ｍＬを容量１０ｍＬのガラス製ヘッドスペースバイアル（ＧＬサイエンス社）に入れ、セプタム及びクリンプキャップ（ＧＬサイエンス社）にて密封した。更に密封した系内に窒素ボンベから窒素を吹き付ける針と、吹き付けた窒素を抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、窒素をフローすることで系内雰囲気を窒素に置換し、雰囲気中の酸素濃度を０．０％とした。ここで、酸素濃度は、前記測定方法２に記載の方法を用いて測定した。更に分取溶液の入ったガラス製ヘッドスペースバイアルを６０℃に温調されたインキュベータ（ケニス社）に入れ、８時間静置した。静置後、インキュベータから取り出したヘッドスペースバイアルを室温まで冷却し、前記測定方法１に記載の方法でＲＮＡの純度を算出すると、８３％であった。
［実施例２］
　前記参考例１で分取精製したＲＮＡを含む画分の溶液０．５ｍＬを容量１０ｍＬのガラス製ヘッドスペースバイアル（ＧＬサイエンス社）に入れ、セプタム及びクリンプキャップ（ＧＬサイエンス社）にて密封した。更に密封した系内に窒素ボンベから窒素を吹き付ける針と、吹き付けた窒素を抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、窒素をフローすることで系内を窒素に置換し、雰囲気中の酸素濃度を２．１％ とした。ここで、酸素濃度は、前記測定方法２に記載の方法を用いて測定した。更に分取溶液の入ったガラス製ヘッドスペースバイアルを６０℃に温調されたインキュベータ（ケニス社）に入れ、８時間静置した。静置後、インキュベータから取り出したヘッドスペースバイアルを室温まで冷却し、前記測定方法１に記載の方法でＲＮＡの純度を算出すると、７７％であった。
［実施例３］
　前記参考例１で分取精製したＲＮＡを含む画分の溶液０．５ｍＬを容量１０ｍＬのガラス製ヘッドスペースバイアル（ＧＬサイエンス社）に入れ、セプタム及びクリンプキャップ（ＧＬサイエンス社）にて密封した。更に密封した系内に窒素ボンベから窒素を吹き付ける針と、吹き付けた窒素を抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、窒素をフローすることで系内を窒素に置換し、雰囲気中の酸素濃度を７．３％ とした。ここで、酸素濃度は、前記測定方法２に記載の方法を用いて測定した。更に分取溶液の入ったガラス製ヘッドスペースバイアルを６０℃に温調されたインキュベータ（ケニス社）に入れ、８時間静置した。静置後、インキュベータから取り出したヘッドスペースバイアルを室温まで冷却し、前記測定方法１に記載の方法でＲＮＡの純度を算出すると、７３％であった。
［比較例１］
　前記参考例１で分取精製したＲＮＡを含む画分の溶液０．５ｍＬを容量１０ｍＬのガラス製ヘッドスペースバイアル（ＧＬサイエンス社）に入れ、雰囲気を窒素置換せずにセプタム及びクリンプキャップ（ＧＬサイエンス社）にて密封した。更に分取溶液の入ったガラス製ヘッドスペースバイアルを６０℃に温調されたインキュベータ（ケニス社）に入れ、８時間静置した。静置後、インキュベータから取り出したヘッドスペースバイアルを室温まで冷却した後、前記測定方法１に記載の方法で画分中のＲＮＡの純度を算出すると、純度は６０％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
 １）参考例１で分取精製した核酸（ＲＮＡ）の６０℃で８時間、所定の酸素濃度条件で静置保存した後、ＨＰＬＣで測定した核酸の純度（％）
２）核酸の保持率（％）＝保存後の核酸のＨＰＬＣ純度／参考例２で分取精製時の核酸の純度
保存した分取溶液からのＲＮＡの回収
［実施例４］
　実施例１で雰囲気の酸素濃度を０．０％にし、８時間静置した溶液０．４ｍＬを容量１５ｍＬのポリプロピレン製コニカルチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に入れ、酢酸ナトリウム水溶液（３Ｍ、ｐＨ＝５．２）を０．２ｍＬ、エタノールを１．２ｍＬ追加した。得られたスラリー溶液を１０分間、３０００ｇ、２５℃で遠心し、上澄みを除去した。続いて７０％エタノール水溶液を１ｍＬ入れ、１０分間、３０００ｇ、２５℃で遠心し、上澄みを除去する操作を２回繰り返して、沈殿としてＲＮＡを得た。得られたＲＮＡを水０．４ｍＬに溶解し、前記測定方法１に記載の方法で画分中のＲＮＡの純度を算出すると、純度は７７％であった。
［比較例２］
　比較例１で８時間静置した分取溶液０．４ｍＬを容量１５ｍＬのポリプロピレン製コニカルチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に入れ、酢酸ナトリウム水溶液（３Ｍ、ｐＨ＝５．２）を０．２ｍＬ、エタノールを１．２ｍＬ追加した。得られたスラリー溶液を１０分間、３０００ｇ、２５℃で遠心し、上澄みを除去した。続いて７０％エタノール水溶液を１ｍＬ入れ、１０分間、３０００ｇ、２５℃で遠心し、上澄みを除去する操作を２回繰り返してＲＮＡを得た。得られたＲＮＡを水０．４ｍＬに溶解し、前記測定方法１に記載の方法で画分中のＲＮＡの純度を算出すると、純度は６４％であった。
［参考例２］
ＲＮＡのアミダイト法による固相合成
　以下に示すIIの核酸配列を有するＲＮＡを合成した。当該鎖は６７塩基長からなる。
鎖II：Am*Gm*Cm*AmUmAmGmCAAGUUAmAAAUAAGGmC*U*AmG*U*C*CmGUUAUCAAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGGCACmCmGmAGUCGGmUmGmCm*Um*Um*U (5'-3')（配列番号２）
　前記配列の表記において、ヌクレオチドの間の記号＊は、ヌクレオチドを繋ぐリン酸結合が、ホスホロチオエートであることを表す。アルファベットAm, Um, Cm, Gmは2’水酸基がメトキシ基に置き換わったヌクレオチドを示す。当該ＲＮＡは、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（ＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉ ｌｏｔ ｐｌｕｓ１００ ＧＥヘルスケア社）を用いて３’側から５’側に向かって合成した。合成は５３μｍｏｌスケールにて実施した。また、当該合成にはＲＮＡアミダイトとして、ウリジンＥＭＭアミダイト（国際公開第２０１３／０２７８ ４３号の実施例２に記載）、シチジンＥＭＭアミダイト（同実施例３に記載）、アデノシンＥＭＭアミダイト（同実施例４に記載）、およびグアノシンＥＭＭアミダイト（同実施例５に記載）と、それぞれ下記の式のウリジン２’ＯＭｅアミダイト、シチジン２’ＯＭｅアミダイト、アデノシン２’ＯＭｅアミダイト、およびグアノシン２’ＯＭｅアミダイトを使用し、固相担体として多孔質ガラスを使用し、デブロッキング溶液としてジクロロ酢酸トルエン溶液を使用し、縮合剤として５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾールを使用し、酸化剤としてヨウ素溶液を使用し、硫化剤として３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオンを使用し、キャッピング溶液として無水フェノキシ酢酸溶液とＮ－メチルイミダゾール溶液とを使用して行った。核酸伸長終了後担体上の核酸にジエチルアミン溶液を作用させることでリン酸部分のシアノエチル保護基を選択的に脱保護した。ここで、ＥＭＭは、（２－シアノエトキシ）メトキシメチル基の略号である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　固相合成後の固相担体からの切出しと脱保護は、国際公開第２０１３／０２７８４３号に記載の方法に従った。すなわち、アンモニア水溶液とエタノールとを加え、しばらく静置した後に固相担体をろ過し、溶媒を留去した。その後、テトラブチルアンモニウムフルオリドを用いて水酸基の脱保護を行った。得られたＲＮＡを、注射用蒸留水を用いて所望の濃度となるように溶解した。
ＲＮＡの分取精製
　下記表４の条件でカラムクロマトグラフィー精製を行った。ただし、精製前にカラム内に移動相Ａを流速４．７ｍＬ／ｍｉｎで１２．５分間通液したのちにサンプルを添加した。保持時間６６．７分－７０．９分までを分取し、得られた溶液をＨＰＬＣにて分析した。なお、前記測定方法１に記載の方法で純度を算出した。その結果、純度９４％であった。この分取精製したＲＮＡ溶液を用いて以下の実施例および比較例の実験を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
分取溶液の保存安定性の確認
［実施例５］
　前記参考例２で分取精製したＲＮＡを含む画分の溶液０．５ｍＬを容量１０ｍＬのガラス製ヘッドスペースバイアル（ＧＬサイエンス社）に入れ、セプタム及びクリンプキャップ（ＧＬサイエンス社）にて密封した。更に密封した系内に窒素ボンベから窒素を吹き付ける針と、吹き付けた窒素を抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、窒素をフローすることで系内雰囲気を窒素に置換し、雰囲気中の酸素濃度を０．０％とした。ここで、酸素濃度は、前記測定方法２に記載の方法を用いて測定した。更に分取溶液の入ったガラス製ヘッドスペースバイアルを６０℃に温調されたインキュベータ（ケニス社）に入れ、８時間静置した。静置後、インキュベータから取り出したヘッドスペースバイアルを室温まで冷却し、前記測定方法１に記載の方法でＲＮＡの純度を算出すると、８７％であった。
［実施例６］
　前記参考例２で分取精製したＲＮＡを含む画分の溶液０．５ｍＬを容量１０ｍＬのガラス製ヘッドスペースバイアル（ＧＬサイエンス社）に入れ、セプタム及びクリンプキャップ（ＧＬサイエンス社）にて密封した。更に密封した系内に窒素ボンベから窒素を吹き付ける針と、吹き付けた窒素を抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、窒素をフローすることで系内を窒素に置換し、雰囲気中の酸素濃度を２．１％ とした。ここで、酸素濃度は、前記測定方法２に記載の方法を用いて測定した。更に分取溶液の入ったガラス製ヘッドスペースバイアルを６０℃に温調されたインキュベータ（ケニス社）に入れ、８時間静置した。静置後、インキュベータから取り出したヘッドスペースバイアルを室温まで冷却し、前記測定方法１に記載の方法でＲＮＡの純度を算出すると、８４％であった。
［実施例７］
　前記参考例２で分取精製したＲＮＡを含む画分の溶液０．５ｍＬを容量１０ｍＬのガラス製ヘッドスペースバイアル（ＧＬサイエンス社）に入れ、セプタム及びクリンプキャップ（ＧＬサイエンス社）にて密封した。更に密封した系内に窒素ボンベから窒素を吹き付ける針と、吹き付けた窒素を抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、窒素をフローすることで系内を窒素に置換し、雰囲気中の酸素濃度を４．５％ とした。ここで、酸素濃度は、前記測定方法２に記載の方法を用いて測定した。更に分取溶液の入ったガラス製ヘッドスペースバイアルを６０℃に温調されたインキュベータ（ケニス社）に入れ、８時間静置した。静置後、インキュベータから取り出したヘッドスペースバイアルを室温まで冷却し、前記測定方法１に記載の方法でＲＮＡの純度を算出すると、８３％であった。
［比較例３］
　前記参考例２で分取精製したＲＮＡを含む画分の溶液０．５ｍＬを容量１０ｍＬのガラス製ヘッドスペースバイアル（ＧＬサイエンス社）に入れ、雰囲気を窒素置換せずにセプタム及びクリンプキャップ（ＧＬサイエンス社）にて密封した。更に分取溶液の入ったガラス製ヘッドスペースバイアルを６０℃に温調されたインキュベータ（ケニス社）に入れ、８時間静置した。静置後、インキュベータから取り出したヘッドスペースバイアルを室温まで冷却した後、前記測定方法１に記載の方法で画分中のＲＮＡの純度を算出すると、純度は７９％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
 １）参考例２で分取精製した核酸（ＲＮＡ）の６０℃で８時間、所定の酸素濃度条件で静置保存した後、ＨＰＬＣで測定した核酸の純度（％）
２）核酸の保持率（％）＝保存後の核酸のＨＰＬＣ純度／参考例２で分取精製時の核酸の純度
　逆相クロマトグラフィーの溶離画分中のホスホロチオエート結合を有する核酸オリゴマーを安定化させることができ、精製された、ホスホロチオエート結合を有する核酸オリゴマー（例えば、ＲＮＡ）を効率よく製造できる。
　配列表の配列番号１および２は、本発明の製造方法に従って製造されるオリゴヌクレオチドの塩基配列を表す。

Claims (11)

  1. 　逆相カラムクロマトグラフィーから溶離した画分であって、式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、
    　ＢＣは、それぞれ独立して同一又は相異なる核酸塩基を表し、
    　Ｒは、それぞれ独立して同一又は相異なって、水素原子、フッ素原子またはＯＱ基を表し、
    　Ｑは、それぞれ独立して同一又は相異なって、水素原子、メチル基、２－メトキシエチル基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、またはリボースの４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、
    　Ｘは、それぞれ独立して同一又は相異なって、酸素原子または硫黄原子を表し、
    　Ｙは、水素原子または水酸基の保護基を表し、
    　Ｇは、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、アルカリ金属イオン、水素イオンまたはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表し、
    　ｎは、式（２）：
    　　　６０≦ｎ　　　　　　（２）
    を満たす整数であり、かつ、ｎ個あるＸの２０％までが、硫黄原子である。）
    で示される核酸オリゴマーを含む溶液に接する雰囲気を酸素濃度１０％以下の不活性ガス雰囲気とすることを特徴とする核酸オリゴマーの安定化方法。
  2. 　ホスホロアミダイト法により生成する前記式（１）で示される核酸オリゴマーの粗生成物を逆相カラムクロマトグラフィーに付し、式（１）の核酸オリゴマーを含む精製された溶離画分を得る工程、および請求項１に記載の前記溶離画分と接する雰囲気を酸素濃度１０％以下の不活性ガス雰囲気とする工程を含む安定化した精製核酸オリゴマー溶液の製造方法。
  3. 　請求項２に記載の工程により精製核酸オリゴマー溶液を製造する工程と、前記の精製核酸オリゴマー溶液から精製された核酸オリゴマーを単離する工程をさらに含む精製核酸オリゴマーの製造方法。
  4. 　酸素濃度が５％以下である、請求項１～３の何れか一項に記載の方法。
  5. 　酸素濃度が２．５％以下である、請求項１～４の何れか一項に記載の方法。
  6. 　前記逆相カラムクロマトグラフィーが、移動相として、モノアルキルアンモニウム塩及びジアルキルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも１つのアンモニウム塩を含む移動相を使用する逆相カラムクロマトグラフィーである、請求項２～５の何れか一項に記載の方法。
  7. 　前記逆相カラムクロマトグラフィーが、移動相として、ジアルキルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも１つのアンモニウム塩を含む移動相を使用する逆相カラムクロマトグラフィーである、請求項２～６の何れか一項に記載の方法。
  8. 　前記逆相カラムクロマトグラフィーが、移動相として、アルコール系水溶性有機溶媒及びニトリル系水溶性有機溶媒からなる群から選ばれる少なくとも一つの水溶性有機溶媒を含む移動相を使用する逆相カラムクロマトグラフィーである、請求項２～７の何れか一項に記載の方法。
  9. 　前記の安定化した精製核酸オリゴマー溶液と、酸素原子を少なくとも１つ有するＣ１－Ｃ４の有機溶媒とを混合して、析出した核酸オリゴマーを単離することを含む、請求項３に記載の方法。
  10. 　前記式（１）において、Ｒが、それぞれ独立して、ヒドロキシ基またはメトキシ基である、請求項１～９の何れか一項に記載の方法。
  11. 　Ｒが、ヒドロキシ基である、請求項１～９の何れか一項に記載の方法。
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