WO2021153047A1 - 核酸オリゴマーの製造方法 - Google Patents

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WO2021153047A1
WO2021153047A1 PCT/JP2020/046572 JP2020046572W WO2021153047A1 WO 2021153047 A1 WO2021153047 A1 WO 2021153047A1 JP 2020046572 W JP2020046572 W JP 2020046572W WO 2021153047 A1 WO2021153047 A1 WO 2021153047A1
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nucleic acid
iodine
production method
formula
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PCT/JP2020/046572
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宮川　卓也
匡 西尾
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住友化学株式会社
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
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    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • DNA and RNA which are nucleic acid oligomers, can be used as DNA probes, RNA probes, antisense, ribozymes, siRNA, aptamers, etc., and are useful materials.
  • Nucleic acid oligomers can be synthesized by the solid-phase synthesis method, and the nucleoside phosphoramidite (hereinafter referred to as "amidite”) is used as a raw material in the solid-phase synthesis method.
  • the nucleic acid oligomer synthesized by extending the nucleic acid through the steps of coupling, oxidation and deprotection on the solid-phase carrier is excised from the solid-phase carrier, and then the protecting group is removed to produce the desired nucleic acid oligomer. Has been done. The purity of the nucleic acid oligomer synthesized in this way was not always satisfactory, and the synthesis was not efficient (Non-Patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide an efficient method for producing a nucleic acid oligomer.
  • an oxidation solution used to oxidize a phodic acid ester produced by a coupling reaction using phosphoramidite in the synthesis of nucleic acid oligomers As a result of diligent research to achieve the above object, the present inventors have conducted an oxidation solution used to oxidize a phodic acid ester produced by a coupling reaction using phosphoramidite in the synthesis of nucleic acid oligomers.
  • an efficient method for producing a nucleic acid oligomer which comprises using a solution containing iodine, water and pyridine and having an iodic acid ratio to iodine of a certain level or less.
  • Q' represents a methylene group bonded to the carbon atom at the 4'position of ribose, an ethylene group bonded to the carbon atom at the 4'position, or an ethylidene group bonded to the carbon atom at the 4'position.
  • oxidation solution of the present invention a production method including a step of reacting in the present specification.
  • Item 2 The precursor having a phosphite triester bond is the formula (4) :.
  • G 1 represents a hydroxyl-protecting group
  • G 2 independently represents the same or different hydroxyl protecting groups.
  • B a are each independently the same or different, represents a nucleic acid base which may be protected by a protecting group
  • R independently represents a protected hydroxyl group, hydrogen atom, fluorine atom, methoxy group, 2-methoxyethyl group, or OQ'group, respectively, the same or differently.
  • Q' is independently the same or different from the methylene group bonded to the carbon atom at the 4'position of ribose, or the ethylene group bonded to the carbon atom at the 4'position, or the 4'position.
  • n represents any integer from 1 to 200
  • W represents an OV group
  • V represents a hydroxyl protecting group
  • W represents a group represented by OZ
  • Z is a group having a structure consisting of a solid phase carrier and a linking group.
  • the compound represented by the above and having a phosphoric acid triester bond is represented by the formula (5): (During the ceremony, G 1 , G 2 , Ba , R, n, W, X, and Y are as described above, and As defined in formula (4), a non-nucleotide linker may be incorporated in place of the nucleotide. )
  • nucleic acid compound of formula (5) is arbitrarily extended in chain length by the amidite method: (During the ceremony, G 2, B a, R, X and W are as defined for formula (5), G 5 represents a hydroxyl-protecting group or a hydrogen atom. m is an integer satisfying m ⁇ n, and Y independently represents oxygen or sulfur. However, at least one Y is an oxygen atom. ) Step of obtaining the nucleic acid compound represented by, From the compound of formula (5') to formula (6): (During the ceremony, G 5, R and m are as defined above, B c independently represent the same or different nucleobases, respectively.
  • G 4 represents a hydrogen atom, an alkali metal ion, an ammonium ion, an alkylammonium ion, or a hydroxyalkylammonium ion.
  • Y each independently represents oxygen or sulfur, and at least one is an oxygen atom, and X 1 represents a hydroxyl group and W 1 represents an OV group, where V represents a protecting group for the hydroxyl group, or X 1 represents an R group and W 1 represents a hydroxyl group.
  • R'independently represents a hydroxyl group, a hydrogen atom, a fluorine atom, a methoxy group, a 2-methoxyethyl group, or an OQ'group, respectively.
  • Q' is independently the same or different from the methylene group bonded to the carbon atom at the 4'position of ribose, or the ethylene group bonded to the carbon atom at the 4'position, or the 4'position.
  • Item 4 The production method according to any one of 2 or 3 above, wherein the non-nucleotide linker is a linker consisting of an amino acid skeleton.
  • linker consisting of an amino acid skeleton is a linker having a structure selected from the group consisting of the following formulas (A14-1), (A14-2) and (A14-3).
  • Item 6 The production method according to any one of the above items 1 to 5, wherein the iodine concentration of the oxidation solution is 0.005 to 2M.
  • Item 7. The production method according to any one of the above items 1 to 5, wherein the iodine concentration of the oxidation solution is 0.005 to 0.2 M.
  • Item 8. The production method according to any one of the above items 1 to 5, wherein the iodine concentration of the oxidation solution is 0.007 to 0.1 M.
  • Item 9 The production method according to any one of the above items 1 to 5, wherein the iodine concentration of the oxidation solution is 0.008 to 0.07 M.
  • the oxidation solution is prepared by mixing iodine, pyridine and water.
  • the oxidizing solution is an oxidizing solution further containing at least one solvent selected from the group consisting of acetonitrile and tetrahydrofuran.
  • the oxidizing solution is an oxidizing solution further containing an acetonitrile solvent.
  • Item 8 The production method according to any one of Items 1 to 14, wherein the molar ratio of iodic acid to iodine (mol of iodic acid / mol of iodine) is 10 ⁇ 10 -3 or less. Item 19. Item 8. The production method according to any one of Items 1 to 14, wherein the molar ratio of iodic acid to iodine (mol of iodic acid / mol of iodine) is 5 ⁇ 10 -3 or less. Item 20. Item 8.
  • RNA ribonucleoside
  • Item 24 The production method according to any one of Items 2 to 23, wherein the nucleic acid is ribonucleoside (RNA), and the 2'protecting group thereof is a protecting group represented by the formula (12). Equation (12): (During the ceremony, q represents an integer from 1 to 5 and represents R a and R b are the same or different from each other and represent a methyl group, an ethyl group or a hydrogen atom, respectively. Bonds marked with * bind to the oxygen of the OQ group and E W represents an electron-withdrawing group. ) Item 25.
  • R a and R b are simultaneously hydrogen atom, an E W is a cyano group,
  • Item 26. The production method according to any one of Items 1 to 25, wherein the nucleic acid is a ribonucleoside (RNA) having a length of 40 chains or more.
  • Item 2. The production method according to any one of Items 1 to 26, further comprising a step of preparing the oxidation solution according to Item 1.
  • the present invention provides an efficient method for producing a nucleic acid oligomer.
  • the production method of the present invention can be expected to improve the purity of the produced nucleic acid oligomer.
  • the body comprises a step of reacting an oxidizing solution (oxidation solution of the present invention) containing iodine, pyridine and water and having a molar ratio of iodic acid to iodine (mol of iodic acid / mol of iodine) of 30 ⁇ 10 -3 or less. , The manufacturing method will be described.
  • a method for producing a nucleic acid compound which comprises a step of reacting an oxidation solution containing iodine, pyridine and water with a nucleic acid precursor having a phosphite triester bond to oxidize the nucleic acid triester bond, in the oxidation solution.
  • a production method in which the molar ratio of iodic acid to iodine (mol iodic acid / mol iodium) is 30 ⁇ 10 -3 or less will be described.
  • the molar ratio of iodic acid to iodine (mol of iodic acid / mol of iodine) in the oxidation solution of the present invention containing iodine, pyridine and water is usually 30 ⁇ 10 -3 or less.
  • the molar ratio of iodic acid to iodine (mol of iodic acid / mol of iodine) is preferably 25 ⁇ 10 -3 or less, more preferably 20 ⁇ 10 -3 or less, and even more preferably 15 ⁇ 10 -3 or less. Even more preferably, it is 10 ⁇ 10 -3 or less, even more preferably 5 ⁇ 10 -3 or less, and even more preferably 3 ⁇ 10 -3 or less.
  • the amounts of iodine and iodic acid are measured by an ion chromatograph method described later.
  • the oxidation solution is typically prepared from iodine, water and pyridine.
  • a solution satisfying the above-mentioned molar ratio of iodic acid to iodine is used.
  • the period from the preparation of the oxidation solution to the synthesis of nucleic acid for example, at 25 to 60 ° C. for 1 day or longer, preferably 1 week or longer after preparation, more preferably 2 weeks or longer after preparation, still more preferably 1 month or longer after preparation.
  • a solution having a molar ratio of iodine to the predetermined iodic acid or less can be used.
  • the storage temperature after preparation of the oxidation solution is not limited to the above range, and may be stored at 0 to 80 ° C. and satisfy the above-mentioned predetermined conditions.
  • the concentration of iodine in the oxidative solution containing iodine, pyridine and water is usually 0.005 to 2M, preferably 0.005 to 0.2M, more preferably 0.007 to 0.1M, even more preferably. It is adjusted to 0.008 to 0.07M.
  • the oxidation solution is typically prepared from iodine and water and pyridine, but the oxidation solution is mixed with at least one solvent selected from the group consisting of acetonitrile and tetrahydrofuran (THF). May be good.
  • the solvent of the oxidation solution is obtained by mixing, for example, pyridine in a volume ratio of 1 to 90, water in an amount of 1 to 50, acetonitrile in an amount of 0 to 90, and tetrahydrofuran in a volume ratio of 0 to 90, based on the total volume of the solution.
  • a mixed solvent is preferably obtained by mixing pyridine in a volume ratio of 5 to 90, water in a volume ratio of 2 to 30, acetonitrile in a volume ratio of 0 to 80, and tetrahydrofuran in a volume ratio of 0 to 80.
  • Stirring of the reaction system is not essential when preparing the oxidation solution, but usually, stirring is performed in the range of stirring power Pv of 0.0 to 0.5 kW / m 3 , and Pv is 0.1 to 0.3 kW / m. Stirring of 3 is preferable.
  • the oxidation solution prepared as described above can also be stored by preparing the iodine concentration at a higher concentration than that at the time of use in the oxidation reaction. At the time of use, such a high-concentration oxidation solution may be finally adjusted to a desired concentration by diluting with the above-mentioned solvent before use.
  • at least one compound selected from the group consisting of N-methylimidazole (NMI), N-methylmorpholin, lutidine and triethylamine may be further added to the oxidation solution. ..
  • iodide such as potassium iodide may be added.
  • a glass container, a plastic container, or a metal container can be used for storing the oxidation solution.
  • a container made of polyethylene or polypropylene can be used
  • a container made of SUS or Hastelloy can be used as the plastic container.
  • the oxidizing solution can be stored in an air atmosphere or an inert gas atmosphere, and as the inert gas, argon, nitrogen, carbon dioxide, helium or the like can be used.
  • Examples of the compound containing a phosphite (phosphite) triester bond include the compound of the above formula (4).
  • Examples of the nucleic acid compound produced by reacting the oxidation solution include the nucleic acid compound represented by the above formula (5).
  • the methylene group represented by Q' which is independently the same or differently bonded to the carbon atom at the 4'position of ribose, and the carbon atom at the 4'position.
  • the structure of the following formula (8) is shown as a compound representing an ethylene group bonded or an ethylidene group bonded to a carbon atom at the 4'position.
  • B a represents a nucleic acid base which may be protected.
  • the group consisting of the solid-phase carrier and the connecting portion connecting the solid-phase carrier and the oxygen atom of the hydroxyl group at the 2'- or 3'-position of ribose at the 3'end of the nucleic acid oligomer which is represented by Z.
  • Z represents a structure represented by the following formula (9).
  • Sp represents a spacer. Examples of the spacer (Sp) include those having the structural formula shown in the following formula (10).
  • the Linker may have, for example, a structure represented by the following formula (11), or a structure having no hexamethyleneamino group moiety in the structure of the formula (11) and having an aminopropyl group bonded to Si. ..
  • the Linker may have a structure represented by the following formula (15).
  • A may be either a hydroxyl group, an alkoxy group, or an alkyl group.
  • the alkoxy group include a methoxy group and an ethoxy group.
  • Examples of the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, an isopropyl group and an n-propyl group.
  • Si indicates that it is bonded to oxygen of the hydroxyl group on the surface of the carrier.
  • the solid support include an inorganic porous carrier and an organic resin carrier.
  • the inorganic porous carrier include Controlled Pole Glass (CPG).
  • the organic resin carrier include a carrier made of polystyrene.
  • 2'-F RNA and the above-mentioned LNA are exemplified, but the above-mentioned nucleoside is not limited thereto.
  • the method for synthesizing a nucleic acid oligomer by a solid-phase synthesis method including an oxidation step with the oxidation solution typically includes the following steps. (1) A step of deprotecting the 5'-hydroxyl group of a nucleoside in which the hydroxyl group bonded to the solid-phase carrier via a linker is protected. (2) A step of coupling the hydroxyl group at the 5'position generated in the above step with a phosphoramidite compound to obtain a phosphite triester compound.
  • the above steps (1) to (3) that is, the deprotection step of the 5'-position hydroxyl group of the produced nucleic acid molecule, the coupling step of the 5'-position hydroxyl group and the amidite compound, and the produced subphosphorus.
  • a series of reaction cycles consisting of an acid triester oxidation step is repeated an arbitrary number of times to synthesize a nucleic acid molecule on the solid phase carrier, and (5) on the solid phase carrier produced in step (4).
  • the method for synthesizing the nucleic acid oligomer includes a step of capping the hydroxyl group at the 5'position in which the coupling reaction with the phosphoramidite compound has not proceeded, following the step (2) or (3).
  • a capping step may be added between any steps of the series of reaction cycles constituting step (4).
  • the step (5) is carried out in the order of the following steps (5-1) and (5-2) on the nucleic acid molecule on the solid-phase carrier produced in the step (4). Then, it is carried out by subjecting it to the reaction of step (5-3).
  • the reaction of the step (5-1) may be carried out arbitrarily, and the reaction of the step (5-2) may be carried out by the method described in Japanese Patent No. 4705716.
  • the nucleic acid compound of the formula (5) can be further extended by an arbitrary chain length using a nucleotide-type or non-nucleotide-type linker by the amidite method, and used for producing the nucleic acid compound represented by the above formula (5'). can. Only the nucleic acid compound is cut out from the nucleic acid compound bound to the solid phase carrier of the formula (5') to obtain the nucleic acid oligomer represented by the formula (6), and then further deprotected and represented by the formula (7). Nucleic acid oligomers can also be obtained.
  • the substituents in each formula will be described in more detail.
  • B nucleic acid base which may be protected by a protecting group represented by a is not particularly limited.
  • the nucleobase include adenine, cytosine, guanine, uracil, thymine, 5-methylcytosine, pseudouracil, 1-methyl pseudouracil and the like.
  • the nucleobase may be substituted with a substituent.
  • substituents include, for example, halogen atoms such as fluoro, chloro, bromo and iodo groups, acyl groups such as acetyl groups, alkyl groups such as methyl and equyl groups, and benzyl groups.
  • Arylalkyl group alkoxy group such as methoxy group, alkoxyalkyl group such as methoxyethyl group, cyanoalkyl group such as cyanoethyl group, hydroxy group, hydroxyalkyl group, acyloxymethyl group, amino group, monoalkylamino group , Dialkylamino groups, carboxy groups, cyano groups, nitro groups and the like, as well as combinations of two or more substituents thereof.
  • the protecting group for the amino group is not particularly limited, and a protecting group used in known nucleic acid chemistry can be used, and as such a protecting group, For example, benzoyl group, 4-methoxybenzoyl group, acetyl group, propionyl group, butyryl group, isobutyryl group, phenylacetyl group, phenoxyacetyl group, 4-tert-butylphenoxyacetyl group, 4-isopropylphenoxyacetyl group, and (dimethyl). Amino) methylene groups and the like, as well as combinations of two or more of these protecting groups can be mentioned.
  • R 4 represents a hydrogen atom, a methyl group, a phenoxyacetyl group, a 4-tert-butylphenoxyacetyl group, a 4-isopropylphenoxyacetyl group, a phenylacetyl group, an acetyl group or a benzoyl group.
  • R 5 represents a hydrogen atom, an acetyl group, an isobutyryl group or a benzoyl group.
  • R 6 represents a hydrogen atom, a phenoxyacetyl group, a 4-tert-butylphenoxyacetyl group, a 4-isopropylphenoxyacetyl group, a phenylacetyl group, an acetyl group or an isobutylyl group.
  • R 7 represents a 2-cyanoethyl group
  • R 8 represents a hydrogen atom, a methyl group, a benzoyl group, a 4-methoxybenzoyl group or a 4-methylbenzoyl group
  • R 9 represents a dimethylaminomethylene group.
  • any one that can function as a protecting group can be used without particular limitation, and a known protecting group used in an amidite compound can be widely used.
  • G 1 is preferably the following group. (In the formula, R 1 , R 2 and R 3 independently represent the same or different hydrogen or alkoxy groups.)
  • R 1, R 2 and R 3 one is hydrogen and it is preferable that remaining two are the same or different (the same is preferred) alkoxy group, the alkoxy group and particularly preferably a methoxy group.
  • G 2 any one that can function as a protecting group can be used without particular limitation, and a known protecting group used in an amidite compound can be widely used.
  • Examples of G 2 include an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, a cycloalkyl group, a haloalkyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an arylalkyl group, a cycloalkyl group, a cycloalkylalkyl group, a cyclylalkyl group, and a hydroxyalkyl.
  • G 2 is preferably an alkyl group substituted with an electron attracting group.
  • the electron attracting group include a cyano group, a nitro group, an alkylsulfonyl group, a halogen atom, an arylsulfonyl group, a trihalomethyl group, a trialkylamino group and the like, and a cyano group is preferable.
  • the G 3 may be formed by combining two G 3s with each other to form a ring structure.
  • the alkyl group in the definition of R 1 , R 2 , R 3 and G 2 may be linear or branched, preferably an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms, and more preferably 1 to 6 carbon atoms.
  • Alkyl group of. Examples of specific alkyl groups include, for example, methyl, ethyl, n-provyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, and hexyl.
  • the alkyl group moiety constituting the alkoxy group in the definition of the substituent has the same definition as the definition of the alkyl group here.
  • the amidite compound can be used in a free state or in a salt state.
  • the salt of the amidite compound include base addition salts and acid addition salts, but are not particularly limited.
  • Specific examples of the base addition salt include salts with inorganic bases such as sodium salt, magnesium salt, potassium salt, calcium salt and aluminum salt; salts with organic bases such as methylamine, ethylamine and ethanolamine; lysine, Salts with basic amino acids such as ornithine, arginine; and ammonium salts.
  • the acid addition salt include mineral acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, nitric acid, and phosphoric acid; formic acid, acetic acid, propionic acid, oxalic acid, malonic acid, and malic acid.
  • Organic acids such as tartrate, fumaric acid, succinic acid, lactic acid, maleic acid, citric acid, methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, ethanesulfonic acid; and acid addition salts with acidic amino acids such as aspartic acid and glutamic acid. Be done.
  • Amidite compounds also include forms such as salts, hydrates, solvates, polymorphs.
  • the protective group may be any as long as it can be used in the amidite method, for example, a 2'-tert-butyldimethylsilyl (TBDMS) group, 2'-bis (2-acetoxy).
  • TDMS 2'-tert-butyldimethylsilyl
  • ACE Methyl
  • TOM triisopropylsilyloxy
  • CEE 2-cyanoethoxy
  • CEM 2'-(2-cyanoethoxy) methyl
  • TEM 2'-para-toluylsulfonylethoxymethyl
  • 2'-EMM International Publication No.
  • RNA ribonucleoside
  • the protecting group represented by the above formula (12) is exemplified as a preferable protecting group. More preferably, the protecting group represented by the formula (13) having a cyano group are exemplified as the electron withdrawing group represented by E W.
  • E W electron withdrawing group
  • the protecting group represented by the formula (13) can be synthesized, for example, according to International Publication No. 2013/027843 and International Publication No. 2019/208571, and an amidite compound having such a protecting group can be used for producing a nucleic acid compound. can do.
  • the amidite compound of the formula (3) shown in Scheme A of FIG. 1 is used.
  • the non-nucleotide linker include a linker having an amino acid skeleton (for example, a linker having an amino acid skeleton described in Japanese Patent No. 5157168 or Japanese Patent No. 5554881).
  • a linker represented by the formula (A14-1) or (A14-2) or (A14-3) (for example, described in WO2019 / 074110) is exemplified. ..
  • the linkers described in WO2012 / 00568, WO2018 / 182008 or WO2019 / 074110 are exemplified.
  • Nucleotides and amidites in which the R group in the formula (3) and the R'group in the formula (4) are substituents other than hydroxyl groups are known methods described in Japanese Patent No. 3745226 and the like, WO2001 / 0535528 or It can also be produced from JP-A-2014-221817 and a nucleoside synthesized by a known method cited therein, and further, using a commercially available product, the method described in Examples described later. It can be produced according to the above or by a method obtained by appropriately modifying these methods.
  • the synthesis of the nucleic acid compound by the amidite method of the steps (1) to (6) is a generally known method (for example, the above-mentioned method) except for the oxidation reaction step according to the present invention in the step (3) in the scheme of FIG.
  • the nucleic acid extension reaction can be carried out by repeating each step of the deprotection step and the condensation step according to the method described in Japanese Patent No. 5157168 or Japanese Patent No. 5554881). Hereinafter, each step will be described.
  • G 4 represents a hydrogen atom, an alkali metal ion, an ammonium ion, an alkylammonium ion, or a hydroxyalkylammonium ion.
  • the alkali metal ion include sodium ion and lithium ion.
  • Specific examples of the alkyl group as the alkylammonium ion include methyl, ethyl, n-provyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, and hexyl.
  • hydroxyalkylammonium ion examples of a specific hydroxyalkyl moiety include, for example, hydroxymethyl, hydroxyethyl, hydroxy-n-provir, hydroxyisopropyl, hydroxy-n-butyl, and trishydroxymethyl. More specific examples of hydroxyalkylammonium ions include trishydroxymethylammonium ions.
  • G 5 represents a hydrogen atom or a protecting group, and when representing a protecting group, it represents the same protecting group as G 1.
  • G 5 is a hydrogen atom when deprotected, but the nucleotide compound in that case is also subjected to a series of nucleic acid extension reaction steps.
  • nucleic acid extension reaction means a reaction in which an oligonucleotide is extended by sequentially binding nucleotides via a phosphodiester bond.
  • the nucleic acid extension reaction can be carried out according to the procedure of a general phosphoramidite method.
  • the nucleic acid extension reaction may be carried out using an automatic nucleic acid synthesizer or the like that employs the phosphoramidite method.
  • the chain length of the nucleic acid oligomer may be, for example, 2 to 200 mer, 10 to 150 mer, or 15 to 110 mer.
  • the 5'deprotection step of the step (1) is a step of deprotecting the protecting group of the 5'hydroxyl group at the end of the RNA chain supported on the solid phase carrier.
  • a general protecting group a 4,4'-dimethoxytrityl group (DMTr group), a 4-monomethoxytrityl group, and a 4,4', 4 "-trimethoxytrityl group are used.
  • DMTr group 4,4'-dimethoxytrityl group
  • 4-monomethoxytrityl group 4-monomethoxytrityl group
  • a 4,4', 4 "-trimethoxytrityl group are used for deprotection.
  • an acid is used for deprotection.
  • deprotecting acid examples include trifluoroacetic acid, dichloroacetic acid, trifluoromethanesulfonic acid, trichloroacetic acid, methanesulfonic acid, hydrochloric acid, acetic acid, p-toluenesulfonic acid and the like.
  • the nucleoside phosphoramidite represented by the following formula (3) shown in the scheme A of FIG. 1 is subjected to the 5'hydroxyl group at the terminal of the oligonucleotide chain deprotected by the deprotection step. Is a reaction that binds.
  • an amidite compound represented by the formula (3) or (A12) is used as the phosphoramidite used for nucleic acid elongation.
  • phosphoramidite that can be used, 2'-OMe, 2'-F, 2'-O-tert-butyldimethylsilyl group, 2'-O-methoxyethyl group, 2'-H, 2' -Fluoro-2'-deoxy- ⁇ -D-arabinofuranosyl and the like can be mentioned.
  • the nucleoside phosphoramidite one in which a 5'hydroxyl group is protected with a protecting group (eg, DMTr group) is used.
  • the condensation step can be carried out using an activator that activates the nucleoside phosphoramidite.
  • Examples of the activator include 5-benzylthio-1H-tetrazole (BTT), 1H-tetrazole, 4,5-dicyanoimidazole (DCI), 5-ethylthio-1H-tetrazole (ETT), and N-methylbenzimidazolium.
  • Triflate N-MeBIT
  • benzimidazolium triflate BIT
  • N-PhIMT N-phenylimidazolium triflate
  • IMT imidazolium triflate
  • NBT 1-hydroxybenzotriazole
  • HOBT 1-hydroxybenzotriazole
  • 5- (bis-3,5-trifluoromethylphenyl) -1H-tetrazole and the like can be mentioned.
  • amidite The nucleoside phosphoramidite (hereinafter referred to as amidite) represented by the formula (3) described in Scheme A of FIG. 1 is as follows. formula: (During the ceremony, G 1 , G 2 , G 3 , Ba , and R are as described above. ).
  • Capping can be performed using known capping solutions such as acetic anhydride-tetrahydrofuran solution and phenoxyacetic acid anhydride / N-methylimidazole solution.
  • the oxidation step of the step (3) is a step of converting the phosphorous acid group formed by the condensation step into a phosphorous acid group or a thiophosphate group.
  • This step is a reaction for converting trivalent phosphorus to pentavalent phosphorus using an oxidizing agent, and can be carried out by allowing an oxidizing agent to act on the oligonucleic acid derivative supported on the solid-phase carrier. ..
  • iodine can be used as the "oxidizing agent”.
  • the oxidizing agent can be prepared and used so as to have a concentration of 0.005 to 2M.
  • Water can be used as the oxygen source for oxidation, and pyridine, N-methylimidazole (NMI), N-methylmorpholin, and triethylamine can be used as the base for advancing the reaction.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, but acetonitrile, tetrahydrofuran (THF) or any ratio thereof may be mixed and used.
  • iodine / water / pyridine / acetonitrile, iodine / water / pyridine, iodine / water / pyridine / NMI, or iodine / water / pyridine / THF can be used.
  • the reaction temperature is preferably 5 ° C to 50 ° C.
  • the reaction time is usually 1 to 30 minutes.
  • the amount of the reagent used is preferably 1 to 100 mol, more preferably 1 to 10 mol, based on 1 mol of the compound supported on the solid phase carrier.
  • an "oxidizing agent” for example, sulfur, 3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1-dioxide (Beaucage reagent), 3-Amino-1,2,4-dithiazole-5-thione (ADTT), 5-phenyl-3H-1,2,4-dithiazole-3-one (POS), [(N, N-dimethylaminomethylidene) ) Amino] -3H-1,2,4-dithiazolin-3-thione (DDTT), and phenylacetyldisulfide (PADS) can be used.
  • an "oxidizing agent” for example, sulfur, 3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1-dioxide (Beaucage reagent), 3-Amino-1,2,4-dithiazole-5-thione (ADTT), 5-phenyl-3H-1,2,4-dithiazole-3-one (POS), [(N, N-dimethylamino
  • the oxidizing agent can be used by diluting it with a suitable solvent so as to have a concentration of 0.001 to 2M.
  • the solvent used in the reaction is not particularly limited as long as it is not involved in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, pyridine, and any mixed solvent thereof.
  • the oxidation step may be performed after the capping operation, or conversely, the capping operation may be performed after the oxidation step, and the order is not limited.
  • step (5) in the step of deprotecting the phosphoric acid protecting group, after the synthesis of the nucleic acid having the desired sequence is completed, an amine compound is allowed to act in order to deprotect the protecting group of the phosphoric acid moiety.
  • the amine compound include diethylamine described in Japanese Patent No. 4705716.
  • the protecting group for the 5'hydroxyl group of nucleoside introduced at the end of the extension was used for column purification tagged with the 5'protecting group after excision from the solid phase carrier and deprotection of the protecting group described below.
  • the protecting group of the 5'hydroxyl group may be deprotected after column purification.
  • step (5) the nucleic acid oligomer extended to a desired chain length on the solid-phase carrier is usually cut out from the solid-phase carrier using concentrated aqueous ammonia as a cutting agent.
  • the oligonucleotide chain is cleaved from the solid phase carrier and recovered.
  • the amine compound include methylamine, ethylamine, isopropylamine, ethylenediamine, diethylamine and the like.
  • step (6) the protecting group for the hydroxyl group at the 2- or 3-position of ribose of the nucleic acid compound (6) excised from the solid-phase carrier in step (5) is International Publication No. 2006/022233), International Publication No. 2013.
  • the deprotected nucleic acid oligomer (7) can be obtained by removing it according to the method described in / 027443 or WO 2019/208571.
  • the nucleoside contained in the nucleic acid oligomer has RNA, DNA, and 2'-O-MOE, 2'-O-Me, and 2'-F.
  • examples include, but are not limited to, RNA and nucleic acid oligomers that are LNAs.
  • RNA and nucleic acid oligomers that are LNAs.
  • nucleic acid oligomers that can be used in the production method of the present invention are shown below in addition to the examples described in Examples, but the present invention is not limited thereto.
  • U stands for uridine
  • C stands for cytidine
  • A stands for adenosine
  • G stands for guanosine.
  • Nucleic acid oligomers having the following sequences (B) and (C), which are described in WO 2019/060442, can be mentioned.
  • a typical example is a nucleic acid oligomer having the following sequence (D). Sequence (D): 5'-AGAGCCAGCCUUCUUAUUGUUUUAGAGCUAUGCUGU-3' (SEQ ID NO: 5) 36mer Nucleic acid oligomers described in JP4965745 can be mentioned. A typical example is a nucleic acid oligomer having the following sequence (E). Sequence (E): 5'-CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-P-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU-3'49mer. CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC (SEQ ID NO: 6), GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU (SEQ ID NO: 7).
  • P is represented by a partial structure separated by wavy lines in the following formula (A5).
  • Examples thereof include nucleic acid oligomers having the following sequence (F) described in Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No. 2: 547. Sequence (F): 5'-ACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3' (SEQ ID NO: 8) 67mer Examples thereof include nucleic acid oligomers having the following sequence (G), which are described in JP 2015-523856, 173.
  • U indicates 2'-O-methyluridine
  • Am indicates 2'-O-methyladenosine
  • Gm indicates 2'-O-methylguanosine
  • s indicates phosphorothioate modification.
  • Oligonucleotide purity was measured using HPLC.
  • the HPLC measurement conditions are shown in Table 1 below. (Measurement method 1: Measurement of oligonucleotide purity)
  • the "A” at the 5'end is represented by a partial structure separated by a wavy line in the following formula (A6). Further, the "G” at the 3'end is represented by a partial structure separated by a wavy line in the following formula (A7).
  • AGCAGAGUAC ACACAGCAUA UACC (SEQ ID NO: 1) GGUAUAUGCU GUGUGUACUC UGCUUC (SEQ ID NO: 2)
  • oligonucleotide using Controlled Pole Glass (CPG) as a solid-phase carrier and NTS M-4MX-E (manufactured by Nippon Techno Service Co., Ltd.) or AKTA oligonucleotide plus100 (manufactured by GE Healthcare) as a nucleic acid synthesizer.
  • CPG Controlled Pole Glass
  • NTS M-4MX-E manufactured by Nippon Techno Service Co., Ltd.
  • AKTA oligonucleotide plus100 manufactured by GE Healthcare
  • the synthesis was carried out on a scale of about 1 ⁇ mol when NTS M-4MX-E (manufactured by Nippon Techno Service Co., Ltd.) was used, and on a scale of about 80 ⁇ mol when AKTA oligopilot plus100 (manufactured by GE Healthcare Co., Ltd.) was used. It was carried out at. Further, for the synthesis, the uridine EMM amidite described in Example 2 of US2012 / 0035246, the cytidine EMM amidite described in Example 3, the adenosine EMM amidite described in Example 4, the guanosine EMM amidite described in Example 5, and the like.
  • Compound (3) according to WO2017 / 188042 is used, a high-purity trichloroacetate toluene solution is used as a deblocking solution, 5-benzyl mercapto-1H-tetrazole is used as a condensing agent, and an iodine solution is used as an oxidizing agent. Then, a phenoxyacetic acid anhydride solution and an N-methylimidazole solution were used as the capping solution.
  • the oligonucleotide produced by the production method of the present invention in the following examples is a nucleic acid oligomer having the sequences (I) shown in SEQ ID NOs: 1 and 2.
  • the guanosine derivative described in the following Examples and Comparative Examples means a compound represented by the following structural formula.
  • the circles illustrated in the following structural formulas schematically represent CPG.
  • Example 1 Using a Controlled Pole Glass (CPG) carrying a 1.08 ⁇ mol guanosine derivative and an amidite represented by the formula (A8), formula (A9), formula (A10), formula (A11), or formula (A12).
  • CPG Controlled Pole Glass
  • the nucleic acid oligomer shown in sequence (I) was automatically synthesized from the 3'side to the 5'side by NTS M-4MX-E (manufactured by Nippon Techno Service Co., Ltd.).
  • the procedure for automatic synthesis is as follows: First, a 3% toluene trichloroacetate solution is sent to 1.4 mL CPG each time to deprotect the trityl protecting group at the 5'position, and then 0.3 mL of various amidites and 5 as a condensing agent are used. -Benzyl mercapto-1H-tetrazole was sent to CPG for 0.4 mL each, and the coupling reaction was allowed to proceed to the hydroxyl group at the 5'position.
  • the ratio of the molar concentration of iodic acid to the molar concentration of iodine in the oxidizing solution when used for synthesis was 2.6 ⁇ 10 -3 .
  • 0.5 mL of 0.1 M phenoxyacetic anhydride acetonitrile solution and 0.5 mL of 10% N-methylimidazole / 10% 2,6-lutidine acetonitrile solution were used as capping solutions, and the coupling did not proceed. Capping was applied to the reaction point.
  • nucleic acid oligonucleotide of the sequence shown in sequence (I) on the CPG carrier, and then the trityl protecting group at the 5'position was deprotected with a 3% toluene trichloroacetate solution. .. Then, the nucleic acid oligomer was liberated from the solid-phase carrier using 752 ⁇ L of aqueous ammonia and 252 ⁇ L of ethanol on the CPG carrier carrying the entire amount of oligonucleotide, and then the aqueous ammonia and ethanol were removed by spraying nitrogen.
  • the free oligonucleotide was dissolved in 400 ⁇ L of dimethyl sulfoxide, 5.3 ⁇ L of nitromethane and a stirrer were added, and then dehydration treatment was performed with molecular sieve 4A to obtain 1 M tetra-n-butylammonium fluoride (TBAF) dimethyl.
  • TBAF tetra-n-butylammonium fluoride
  • 530 ⁇ L of sulfoxide solution (TBAF amount: 10.2 mol per 1 mol of protecting group) was introduced at 30 ° C. under stirring with a stirrer, and the mixture was kept warm for 4 hours to deprotect the 2'-EMM protecting group. Nucleic acid oligomers were obtained by precipitation operation.
  • the yield was 9.1 mg
  • as a result of the measurement by the measuring method 1 the purity was 61%.
  • Example 2 In the experiment of Example 1, a scale using Controlled Pole Glass (CPG) carrying a 78.20 ⁇ mol guanosine derivative was used, and AKTA oligonucleotide plus100 (manufactured by GE Healthcare) was used as an oxidation solution containing iodine, as shown in Table 2. After using the above solution and completing the nucleic acid synthesis operation, a CPG carrier carrying 20.13 ⁇ mol worth of oligonucleotide was collected, and 7.5 mL of aqueous ammonia and 2.5 mL of ethanol were used to prepare the nucleic acid oligomer.
  • CPG Controlled Pole Glass
  • AKTA oligonucleotide plus100 manufactured by GE Healthcare
  • Example 3 In the experiment of Example 1, a sequence (I) was used in the same manner except that the solution shown in Table 2 was used as the oxidation solution containing iodine by using it with Controlled Pole Glass (CPG) carrying a 1.10 ⁇ mol guanosine derivative. ) Nucleic acid oligomer was obtained. The yield was 8.4 mg and the purity was 60%.
  • CPG Controlled Pole Glass
  • Example 4 In the experiment of Example 2, the oxidation solution described in the table below was used, and the scale was set using Controlled Pole Glass (CPG) carrying 78.20 ⁇ mol of guanosine derivative, and the oxidation solution containing iodine was shown in Table 2.
  • CPG Controlled Pole Glass
  • the nucleic acid oligomer of sequence (I) was obtained in the same manner except that the above-mentioned oxidation solution was used and a CPG carrier carrying an oligonucleotide of 20.16 ⁇ mol was collected after the nucleic acid synthesis operation was completed. The yield was 180.0 mg and the purity was 59%.
  • Example 5 In the method of Example 1, the nucleic acid oligomer of sequence (I) is used in the same manner except that the Controlled Pole Glass (CPG) carrying a 1.06 ⁇ mol guanosine derivative and the oxidation solution containing iodine shown in Table 2 are used. Got The yield was 9.1 mg and the purity was 56%.
  • CPG Controlled Pole Glass
  • Example 6 In the method of Example 2, except that the oxidation solution shown in Table 2 was used as the oxidation solution containing iodine and the CPG carrier carrying 20.20 ⁇ mol of oligonucleotide was collected after the nucleic acid synthesis operation was completed. , The nucleic acid oligomer of sequence (I) was obtained in the same manner. The yield was 154.8 mg and the purity was 57%.
  • Example 7 In the method of Example 1, the nucleic acid oligomer of sequence (I) was obtained in the same manner except that Controlled Pole Glass (CPG) carrying a 1.09 ⁇ mol guanosine derivative and the oxidation solution shown in Table 2 were used. .. The crude product was obtained by precipitation operation. The yield was 9.2 mg and the purity was 49%.
  • CPG Controlled Pole Glass
  • Example 8 In the method of Example 1, the nucleic acid oligonucleotide of sequence (I) is obtained in the same manner except that Controlled Pole Glass (CPG) carrying a 1.04 ⁇ mol guanosine derivative and the oxidation solution shown in Table 2 are used. rice field. The yield was 7.7 mg and the purity was 46%.
  • CPG Controlled Pole Glass
  • Example 9 In the method of Example 1, the nucleic acid oligomer of sequence (I) was obtained in the same manner except that Controlled Pole Glass (CPG) carrying a 1.00 ⁇ mol guanosine derivative and the oxidation solution shown in Table 2 were used. .. The yield was 7.9 mg and the purity was 42%.
  • CPG Controlled Pole Glass
  • the present invention provides an efficient method for producing a nucleic acid oligomer. Further, the purity of the nucleic acid oligomer produced according to the method for producing the nucleic acid oligomer can be expected to be improved.
  • SEQ ID NOs: 1 to 13 in the sequence listing represent the base sequences of oligonucleotides produced according to the production method of the present invention.

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Abstract

本発明は、核酸オリゴマーの効率的な製造方法、とりわけ、亜リン酸トリエステル結合を有する核酸前駆体を酸化して、リン酸トリエステル結合を有する核酸分子を効率よく製造する方法、を提供することを目的とする。本発明はまた、式（Ｉ）で示されるヌクレオチドを５'末端に有する核酸化合物の、ホスホロアミダイト法による製造方法であって、５'末端に式（ＩＩ）（式（Ｉ）および（ＩＩ）の置換基の定義は、明細書に定義のとおりである。）で示される亜リン酸トリエステル結合を有する前駆体に、ヨウ素、ピリジンおよび水を含み、ヨウ素酸とヨウ素のモル比（ヨウ素酸ｍｏｌ／ヨウ素ｍｏｌ）が３０×１０－３以下である酸化溶液を反応させる工程を含む、製造方法、を提供する。

Description

核酸オリゴマーの製造方法
　本特許出願は、日本国特許出願２０２０－０１２７８７号（２０２０年１月２９日出願）に基づくパリ条約上の優先権および利益を主張するものであり、ここに引用することによって、上記出願に記載された内容の全体が本明細書中に組み込まれるものとする。
　本発明は、核酸オリゴマーの製造方法に関する。
　核酸オリゴマーであるＤＮＡやＲＮＡは、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、アンチセンス、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、アプタマーなどとして利用可能であり、有用な素材である。
　核酸オリゴマーは、固相合成法により合成可能であり、固相合成法ではヌクレオシドのホスホロアミダイト（以下、「アミダイト」と称する）が原料として用いられる。固相担体上で、カップリング、酸化および脱保護の工程を経て核酸を伸長して合成された核酸オリゴマーは、固相担体から切り出し、次いで、保護基を除いて、目的とする核酸オリゴマーが製造されている。このようにして合成された核酸オリゴマーの純度は、必ずしも満足いくものではなく、合成は効率的ではなかった(非特許文献１)。
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　６９　（２０１３）　３６１５―３６３７
　本発明は、核酸オリゴマーの効率的な製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、核酸オリゴマーの合成において、ホスホロアミダイトを用いたカップリング反応により生成する亜リン酸エステルを酸化する際に使用する酸化溶液として、ヨウ素、水およびピリジンを含み、ヨウ素酸のヨウ素に対する比率が一定の水準以下の溶液を使用することを特徴とする、核酸オリゴマーの効率的な製造方法を提供する。
　本発明は、以下の態様を包含するが、これらに限定されるものではない。
項１．　式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （式中、
　Ｇ１およびＧ２は各々、独立して、水酸基の保護基を示し、Ｂａは、保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し、
　Ｒは、保護された水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
　Ｑ’は、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、そして、
　＊のついた結合は、核酸の３’末端側への結合を示す。）
で示されるヌクレオチドを５’末端に有する核酸化合物の、ホスホロアミダイト法による製造方法であって、５’末端に式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 （式中、
　Ｇ１、Ｇ２、Ｂａ、Ｒおよび＊は、前記定義のとおりである。）
で示される亜リン酸トリエステル結合を有する前駆体に、ヨウ素、ピリジンおよび水を含み、ヨウ素酸とヨウ素のモル比（ヨウ素酸ｍｏｌ／ヨウ素ｍｏｌ）が３０×１０－３以下である酸化溶液（以下、本明細書中、「本発明の酸化溶液」と称す）を反応させる工程を含む、製造方法。
項２．　亜リン酸トリエステル結合を有する前駆体が、式（４）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 （式中、
　Ｇ１は、水酸基の保護基を表し、
　Ｇ２は、それぞれ独立して、同一又は相異なる水酸基の保護基を表し、
　Ｂａは、それぞれ独立して、同一又は相異なり、保護基で保護されていてもよい核酸塩基を表し、
　Ｒは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、保護された水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
　Ｑ’は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、
　Ｙは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、酸素原子または硫黄原子を表し、
　ｎは、１以上２００までの何れかの整数を表し、
　ＸがＯＺを表すとき、ＷはＯＶ基を表し、Ｖは水酸基の保護基を表し、
　ＸがＲ基を表すとき、ＷはＯＺで表される基を表し、
　Ｚは、固相担体および連結基からなる構造を有する基である。
　そして、ｎが２以上の整数のとき、式（４）で示される核酸化合物は、それぞれの５’末端と３’末端のヌクレオチドの間の少なくとも１つのヌクレオチドの代わりに、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい。）
で示される化合物であり、リン酸トリエステル結合を有する化合物が、式（５）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 （式中、
　Ｇ１、Ｇ２、Ｂａ、Ｒ、ｎ、Ｗ、Ｘ、およびＹは、前記のとおりであり、そして、
　式（４）において定義されたとおり、ヌクレオチドの代わりに、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい。）
で示される核酸化合物である、前項１に記載の製造方法。
項３．　式（５）の核酸化合物をアミダイト法で任意に鎖長を伸長した式（５’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 （式中、
　Ｇ２、Ｂａ、Ｒ、ＸおよびＷは、式（５）について定義されたとおりであり、
　Ｇ５は、水酸基の保護基、もしくは水素原子を表し、
　ｍは、ｍ≧ｎを満たす整数であり、そして、
　Ｙは、それぞれ独立して、酸素または硫黄を表す。
　ただし、少なくとも１つのＹは、酸素原子である。）
で示される核酸化合物を得る工程、
　式（５’）の化合物から式（６）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 （式中、
　Ｇ５、Ｒおよびｍは、前記のとおりであり、
　Ｂｃはそれぞれ独立して同一又は相異なる核酸塩基を表し、
　Ｇ４は水素原子、アルカリ金属イオン、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、またはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表し、
　Ｙは、それぞれ独立して、酸素または硫黄を表し、かつ、少なくとも１つが、酸素原子であり、そして、
　Ｘ１は、水酸基を表し、かつＷ１は、ＯＶ基を表し、ここでＶは、水酸基の保護基を表すか、あるいは
　Ｘ１は、Ｒ基を表し、かつＷ１は、水酸基を表す。）
で示される化合物を切り出し、
　さらに式（６）の化合物を脱保護して、式（７）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 （式中、
　ｍ、Ｙ、Ｇ４およびＢｃは、前記定義のとおりであり、
　Ｒ’は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
　Ｑ’は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、
　そして、
　Ｘ１０およびＷ１０は各々、それぞれ独立して、水酸基を表すか、あるいは
　Ｘ１０は、Ｒ’基を表し、かつ、Ｗ１0は、水酸基を表す。）
で示される脱保護した核酸オリゴマーを製造する工程をさらに含む、前項２に記載の核酸オリゴマーの製造方法。
項４．　非ヌクレオチドリンカーが、アミノ酸骨格からなるリンカーである、前項２または３のいずれかに記載の製造方法。
項５．　アミノ酸骨格からなるリンカーが、下記式（Ａ１４－１）、（Ａ１４－２）および（Ａ１４－３）からなる群から選ばれる構造を有するリンカーである、前項４に記載の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
項６．　酸化溶液のヨウ素の濃度が、０．００５～２Ｍである、前項１～５の何れか一項に記載の製造方法。
項７．　酸化溶液のヨウ素の濃度が、０．００５～０．２Ｍである、前項１～５の何れか一項に記載の製造方法。
項８．　酸化溶液のヨウ素の濃度が、０．００７～０．１Ｍである、前項１～５の何れか一項に記載の製造方法。
項９．　酸化溶液のヨウ素の濃度が、０．００８～０．０７Ｍである、前項１～５の何れか一項に記載の製造方法。
項１０．　酸化溶液が、ヨウ素、ピリジンおよび水を混合して調製される、前項１～９の何れか一項に記載の製造方法。
項１１．　酸化溶液が、アセトニトリルおよびテトラヒドロフランからなる群から選ばれる少なくとも１つの溶媒をさらに含む酸化溶液である、前項１０に記載の製造方法。
項１２．　酸化溶液が、アセトニトリル溶媒をさらに含む酸化溶液である、前項１０または１１に記載の製造方法。
項１３．　酸化溶液の溶媒が、ピリジン、水、アセトニトリル、およびテトラヒドロフランを、１～９０：１～５０：０～９０：０～９０の体積比率で混合した混合溶媒である、前項１１に記載の製造方法。
項１４．　酸化溶液の溶媒が、ピリジン、水、およびアセトニトリルを、１～９０：１～５０：０～９０の体積比率で混合した混合溶媒である、前項１１または１２に記載の製造方法。
項１５．　ヨウ素酸とヨウ素のモル比（ヨウ素酸ｍｏｌ／ヨウ素ｍｏｌ）が２５×１０－３以下である、項１～１４の何れか一項に製造方法。
項１６．　ヨウ素酸とヨウ素のモル比（ヨウ素酸ｍｏｌ／ヨウ素ｍｏｌ）が２０×１０－３以下である、項１～１４の何れか一項に製造方法。
項１７．　ヨウ素酸とヨウ素のモル比（ヨウ素酸ｍｏｌ／ヨウ素ｍｏｌ）が１５×１０－３以下である、項１～１４の何れか一項に記載の製造方法。
項１８．　ヨウ素酸とヨウ素のモル比（ヨウ素酸ｍｏｌ／ヨウ素ｍｏｌ）が１０×１０－３以下である、項１～１４の何れか一項に記載の製造方法。
項１９．　ヨウ素酸とヨウ素のモル比（ヨウ素酸ｍｏｌ／ヨウ素ｍｏｌ）が５×１０－３以下である、項１～１４の何れか一項に記載の製造方法。
項２０．　ヨウ素酸とヨウ素のモル比（ヨウ素酸ｍｏｌ／ヨウ素ｍｏｌ）が３×１０－３以下である、項１～１４の何れか一項に記載の製造方法。
項２１．　酸化溶液が、調製から酸化反応に使用するまでの時間が１週間以上経た酸化溶液である、項１～２０の何れか一項に記載の製造方法。
項２２．　酸化溶液が、調製から酸化反応に使用するまでの時間が２週間以上経た酸化溶液である、項１～２０の何れか一項に記載の製造方法。
項２３．　核酸がリボヌクレオシド（ＲＮＡ）である、項１～２２の何れか一項に記載の製造方法。
項２４．　核酸が、リボヌクレオシド（ＲＮＡ）であり、その２’保護基が、式（１２）に示す保護基である、項２～２３の何れか一項に記載の製造方法。
　式（１２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 （式中、
　ｑは、１～５の整数を表し、
　ＲａおよびＲｂは各々、それぞれ同一又は相異なって、メチル基、エチル基または水素原子を表し、
　＊印のついた結合は、ＯＱ基の酸素に結合し、そして、
　ＥＷは、電子求引基を表す。）
項２５．　ＲａおよびＲｂが同時に水素原子であり、ＥＷがシアノ基である、項２４に記載の製造方法。
項２６．　核酸が４０鎖長以上のリボヌクレオシド（ＲＮＡ）である、項１～２５の何れか一項に記載の製造方法。
項２７．　さらに項１に記載の酸化溶液を調製する工程を含む、項１～２６の何れか一項に記載の製造方法。
　本発明は、効率的な核酸オリゴマーの製造方法を提供する。本発明の製造方法により、製造される核酸オリゴマーの純度向上が期待できる。
本発明の製法の工程（１）から（６）のスキームを示す図面である。
　前記式（Ｉ）で示されるヌクレオチドを５’末端に有する核酸化合物のホスホロアミダイト法による製造方法であって、５’末端に前記式（ＩＩ）で示される亜リン酸トリエステル結合を有する前駆体に、ヨウ素、ピリジンおよび水を含み、ヨウ素酸とヨウ素のモル比（ヨウ素酸ｍｏｌ／ヨウ素ｍｏｌ）が３０×１０－３以下である酸化溶液（本発明の酸化溶液）を反応させる工程を含む、製造方法について説明する。
　亜リン酸トリエステル結合を有する核酸前駆体に、ヨウ素、ピリジンおよび水を含む酸化溶液を反応させ、リン酸トリエステル結合に酸化する工程を含む核酸化合物の製造方法であって、前記酸化溶液におけるヨウ素酸とヨウ素のモル比（ヨウ素酸ｍｏｌ／ヨウ素ｍｏｌ）が３０×１０－３以下である、製造方法について説明する。
　ヨウ素、ピリジンおよび水を含む本発明の酸化溶液中のヨウ素酸とヨウ素のモル比（ヨウ素酸ｍｏｌ／ヨウ素ｍｏｌ）は、通常、３０×１０－３以下である。ヨウ素酸とヨウ素のモル比（ヨウ素酸ｍｏｌ／ヨウ素ｍｏｌ）は、好ましくは、２５×１０－３以下、さらに好ましくは、２０×１０－３以下、さらにより好ましくは、１５×１０－３以下、さらにより好ましくは、１０×１０－３以下、さらにより好ましくは、５×１０－３以下、よりさらに好ましくは、３×１０－３以下である。ここで、ヨウ素およびヨウ素酸の量は、後述するイオンクロマトグラフ法により測定されたものである。
　前記酸化溶液としては、典型的には、ヨウ素と、水およびピリジンから調製される。調製された溶液は、前記のヨウ素酸とヨウ素のモル比を満たすものが使用される。
　酸化溶液の調製から核酸合成までの期間、例えば、２５～６０℃で１日以上、好ましくは調製後１週間以上、より好ましくは調製後２週間以上、更に好ましくは調製後１ヶ月以上保管し、前記所定のヨウ素酸とヨウ素のモル比以下の溶液が使用できる。酸化溶液の調製後の保管温度は、前記範囲に限定されず、０～８０℃で保管し、前記所定の条件を満たすものであればよい。
　ヨウ素、ピリジンおよび水を含む酸化溶液中のヨウ素の濃度は、通常、０．００５～２Ｍ、好ましくは０．００５～０．２Ｍ、より好ましくは、０．００７～０．１Ｍ、更に好ましくは、０．００８～０．０７Ｍに調整される。
　前記酸化溶液は、典型的には、ヨウ素と、水およびピリジンから調製されるが、かかる酸化溶液には、アセトニトリルおよびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）からなる群から選ばれる少なくとも１つの溶媒を混合して用いてもよい。
　酸化溶液の溶媒は、溶液の総体積当たり、例えば、ピリジンを１～９０、水を１～５０、アセトニトリルを０～９０、テトラヒドロフランを０～９０の体積比率で、混合して得られたものであり、好ましくは、ピリジンを５～９０、水を２～３０、アセトニトリルを０～８０、テトラヒドロフランを０～８０の体積比率で混合して得られた混合溶媒である。酸化溶液を調製する時に反応系の攪拌は必須ではないが、通常、攪拌動力Ｐｖが０．０～０．５ｋＷ／ｍ３の範囲で攪拌を行い、Ｐｖが０．１～０．３ｋＷ／ｍ３の攪拌が好ましい。
　前記のごとく調製される酸化溶液は、ヨウ素の濃度を酸化反応での使用時よりも高濃度で調製して保管することもできる。かかる高濃度の酸化溶液は、使用に際して、前記溶媒で希釈することにより最終的に所望の濃度に調整して、使用してもよい。
　亜リン酸トリエステル結合の酸化反応においては、前記酸化溶液に、Ｎ－メチルイミダゾール（ＮＭＩ）、Ｎ－メチルモルフォリン、ルチジンおよびトリエチルアミンからなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物をさらに加えてもよい。あるいはヨウ化カリウムなどのヨウ化物を添加してもよい。
　酸化溶液の保管には、ガラス製容器、プラスチック製容器、または金属製容器を使用することができる。プラスチック製容器としては、ポリエチレンまたはポリプロピレン製等の容器を使用することができ、金属製容器としては、ＳＵＳ製容器またはハステロイ製等の容器を使用することができる。
　空気雰囲気下または不活性ガス雰囲気下で酸化溶液を保管することができ、不活性ガスとしては、アルゴン、窒素、二酸化炭素またはヘリウム等を使用することができる。
　亜リン酸（ホスファイト）トリエステル結合を含む化合物としては、前記式（４）の化合物が例示される。酸化溶液を作用させて生成する核酸化合物としては、前記式（５）で示される核酸化合物が例示される。
　式（４）および（５）において、Ｑ’で表される、それぞれ独立して同一又は相異なって、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表す化合物として、具体的には下記式（８）の構造が示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 （式中、Ｂaは、保護されていてもよい核酸塩基を表す。）
　Ｚで示される、固相担体、および固相担体と核酸オリゴマーの３’末端のリボースの２’位もしくは３’位の水酸基の酸素原子とをつなぐ連結部からなる基としては、より具体的には、Ｚは、下記式（９）で示される構造を表し、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 　式（９）において、Ｓｐは、スペーサーを表す。
　スペーサー（Ｓｐ）としては、例えば、下記式（１０）に示す構造式を有するものが例示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　Ｌｉｎｋｅｒは、例えば、下記式（１１）に示す構造でもよいし、または式（１１）の構造においてヘキサメチレンアミノ基部分を有さない構造であって、アミノプロピル基がＳｉに結合した構造でもよい。または、Ｌｉｎｋｅｒは下記式（１５）で示す構造でもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 （式中、
　Ａは、水酸基、アルコキシ基、またはアルキル基のいずれかであってもよい。アルコキシ基としては、例えばメトキシ基およびエトキシ基が挙げられる。アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ－プロピル基が挙げられる。Ｓｉは、担体表面の水酸基の酸素と結合していることを示す。）
　Ｓｏｌｉｄ　ｓｕｐｐｏｒｔとしては、無機多孔質担体や有機系樹脂担体などが挙げられる。無機多孔質担体には、例えば、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）が挙げられる。有機系樹脂担体には、例えば、ポリスチレンからなる担体が挙げられる。
　本発明で使用される核酸オリゴマー内に含まれるヌクレオシド（リボース、およびデオキシリボース）としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、２’－Ｏ－ＭＯＥ（２’－Ｏ－メトキシエチル）、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆ　ＲＮＡ、および前記のＬＮＡが例示されるが、前記ヌクレオシドは、これらに限定されない。
　前記の酸化溶液による酸化工程を含む固相合成法による核酸オリゴマーの合成方法は、典型的には、以下の工程を含む。
（１）固相担体にリンカーを介して結合している水酸基が保護されたヌクレオシドの５’位の水酸基を脱保護する工程、
（２）前記工程で生成した５’位の水酸基をホスホロアミダイト化合物とカップリング反応させて亜リン酸トリエステル化合物を得る工程、
（３）前記工程で生成した亜リン酸トリエステルを酸化してリン酸トリエステル結合に変換して伸長した核酸分子を製造する工程、あるいは、チオリン酸トリエステルに変換する任意の工程、
（４）前記工程（１）～（３）、すなわち、生成した核酸分子の５’位の水酸基の脱保護工程、５’位の水酸基とアミダイト化合物とのカップリング工程、および、生成した亜リン酸トリエステルの酸化工程、から構成される一連の反応のサイクルを、任意の回数繰り返し、固相担体上に核酸分子を合成する工程、および
（５）工程（４）で生成した固相担体上の核酸分子を、切り出しおよび脱保護する工程に供し、固相担体から遊離させて、保護基が除かれた核酸オリゴマーを製造する工程。
ただし、前記核酸オリゴマーの合成方法においては、工程（２）または（３）に続けて、ホスホロアミダイト化合物とのカップリング反応が進行しなかった５’位の水酸基をキャッピングする工程を含んでいてもよく、工程（４）を構成する一連の反応のサイクルの何れかの工程の間にキャッピング工程が付加されていてもよい。
　前記（５）の工程は、より具体的には、工程（４）で生成した固相担体上の核酸分子を、以下の工程（５－１）および（５－２）の反応の順に実施し、次いで工程（５－３）の反応に供することにより実施される。ここで工程（５－１）の反応の実施は、任意であってもよいし、工程（５－２）の反応の実施は、特許第４７０５７１６号公報に記載の方法を用いてもよい。その結果、固相担体から遊離した核酸分子から保護基が除かれた核酸オリゴマー、あるいは、５’末端の水酸基が保護された核酸オリゴマーを製造することができる。
　　（５－１）核酸分子の５’末端の水酸基の保護基を脱保護する反応、
　　（５－２）核酸分子を固相担体から切りだして遊離させる反応、および、
　　（５－３）核酸分子を構成するリボースの２’位もしくは３’末端の水酸基の３’位の水酸基の保護基を脱保護する反応。
　前記工程（１）から（６）のスキームを、図１に示す。図１に示される工程（３）または工程（４）における酸化反応が、前記の酸化溶液を用いて実施される。スキームＡにおける化学式中の置換基の定義は、前記定義のとおりである。
　式（５）の核酸化合物は、さらにアミダイト法によりヌクレオチド型または非ヌクレオチド型のリンカーを用いて任意の鎖長だけ伸長し、前記式（５’）で示される核酸化合物の製造に使用することができる。前記式（５’）の固相担体に結合した核酸化合物から核酸化合物のみを切り出して、前記式（６）で示される核酸オリゴマーを得たのち、更に脱保護して前記式（７）で示される核酸オリゴマーを得ることもできる。以下、各式中の置換基についてさらに詳細に説明する。
　Ｂａで示される保護基で保護されていてもよい核酸塩基は、特に限定されない。当該核酸塩基としては、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミン、５－メチルシトシン、シュードウラシル、１－メチルシュードウラシルなどが挙げられる。また、核酸塩基は、置換基により置換されていてもよい。そのような置換基としては、例えば、フルオロ基やクロロ基やブロモ基やヨード基のようなハロゲン原子、アセチル基のようなアシル基、メチル基やエキル基のようなアルキル基、ベンジル基のようなアリールアルキル基、メトキシ基のようなアルコキシ基、メトキシエチル基のようなアルコキシアルキル基、シアノエチル基のようなシアノアルキル基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、アシルオキシメチル基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシ基、シアノ基、およびニトロ基など、並びにそれらの２種類以上の置換基の組み合わせが挙げられる。
　核酸塩基が環外にアミノ基を有する場合、当該アミノ基の保護基としては、特に限定されず、公知の核酸化学で用いられる保護基を使用することができ、そのような保護基としては、例えば、ベンゾイル基、４－メトキシベンゾイル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、および（ジメチルアミノ）メチレン基など、並びにそれらの２種類以上の保護基の組み合わせが挙げられる。
　Ｂａは、より具体的には、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
（上記式中、
　Ｒ４は、水素原子、メチル基、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はベンゾイル基を表し、
　Ｒ５は、水素原子、アセチル基、イソブチリル基又はベンゾイル基を表し、
　Ｒ６は、水素原子、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はイソブチリル基を表し、
　Ｒ７は、２－シアノエチル基を表し、
　Ｒ８は、水素原子、メチル基、ベンゾイル基、４－メトキシベンゾイル基又は４－メチルベンゾイル基を表し、そして、
　Ｒ９は、ジメチルアミノメチレン基を表す。）
のいずれかで表される基を表す。
　Ｇ１としては、保護基として機能し得るものであれば特に制限なく使用することができ、アミダイト化合物で使用される公知の保護基を広く使用することができる。
　Ｇ１は、好ましくは、以下の基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 （式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、同一又は相異なって水素又はアルコキシ基を表す。）
　Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、１つが水素であり、残りの２つが同一または相異なる（同一が好ましい）アルコキシ基であることが好ましく、アルコキシ基としてはメトキシ基が特に好ましい。
　Ｇ２としては、保護基として機能し得るものであれば特に制限なく使用することができ、アミダイト化合物で使用される公知の保護基を広く使用することができる。Ｇ２としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、ハロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、シクロアルケニル基、シクロアルキルアルキル基、シクリルアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリルアルケニル基、ヘテロシクリルアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、シリル基、シリルオキシアルキル基、モノ、ジ又はトリアルキルシリル基、モノ、ジ又はトリアルキルシリルオキシアルキル基などが挙げられ、これらは１つ以上の電子求引基で置換されていてもよい。
　Ｇ２は、好ましくは、電子求引基で置換されたアルキル基である。当該電子求引基としては、例えば、シアノ基、ニトロ基、アルキルスルホニル基、ハロゲン原子、アリールスルホニル基、トリハロメチル基、トリアルキルアミノ基などが挙げられ、好ましくはシアノ基である。
　Ｇ２としては、特に好ましいのは、以下の基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　Ｇ３は、２つのＧ３が互いに結合して環状構造を形成していてもよい。Ｇ３としては、両方がイソプロピル基であることが好ましい。
　前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＧ２の定義におけるアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれでもよく、好ましくは炭素数１～１２のアルキル基、より好ましくは炭素数１～６のアルキル基である。具体的なアルキル基の例としては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロビル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、及びヘキシルが挙げられる。前記置換基の定義におけるアルコキシ基を構成するアルキル基部分は、ここでのアルキル基の定義と同じ定義を有する。
　また、本発明の方法において、アミダイト化合物は、フリーの状態又は塩の状態で使用することができる。アミダイト化合物の塩としては、塩基付加塩または酸付加塩が挙げられるが、特に制限されない。塩基付加塩としては、具体的には、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩等の無機塩基との塩；メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン等の有機塩基との塩；リジン、オルニチン、アルギニン等の塩基性アミノ酸との塩；及びアンモニウム塩が挙げられる。酸付加塩としては、具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、酒石酸、フマル酸、コハク酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、エタンスルホン酸等の有機酸；および、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸との酸付加塩が挙げられる。アミダイト化合物には、塩、水和物、溶媒和物、結晶多形などの形態も含まれる。
　Ｒが、保護された水酸基を示すとき、その保護基は、アミダイト法において使用できるものであればよく、例えば、２’－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基、２’－ビス（２－アセトキシ）メチル（ＡＣＥ）基、２’－（トリイソプロピルシリロキシ）メチル（ＴＯＭ）基、２’－（２－シアノエトキシ）エチル（ＣＥＥ）基、２’－（２－シアノエトキシ）メチル（ＣＥＭ）基、２’－パラ－トルイルスルホニルエトキシメチル（ＴＥＭ）基、２’－ＥＭＭ基（国際公開２００６/０２２３２３号）の他に、国際公開第２０１３／０２７８４３号および国際公開第２０１９／２０８５７１号に記載のものが使用できる。これらのリボヌクレオシド（ＲＮＡ）の２’保護基のうち、前記式（１２）で示される保護基が好ましい保護基として例示される。さらに好ましくは、ＥＷで示される電子求引基としてシアノ基を有する式（１３）で示される保護基が例示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 （式中、
　ｑ、ＲａおよびＲｂは、前記式（１２）における定義と同義である。ただし、ＲａおよびＲｂが同時に水素原子を表すことはない。）
　式（１３）で示される保護基は、例えば国際公開第２０１３／０２７８４３号および国際公開第２０１９／２０８５７１号に記載に従って合成することができ、かかる保護基を有するアミダイト化合物を核酸化合物の製造に使用することができる。
　核酸の伸長反応には、図１のスキームＡに記載の式（３）のアミダイト化合物が使用される。
　非ヌクレオチドリンカーとしては、アミノ酸骨格からなるリンカー（例えば、特許第５１５７１６８号公報または特許第５５５４８８１号公報に記載されたアミノ酸骨格からなるリンカー）が例示される。具体的には、非限定的な例として、例えば、式（Ａ１４－１）もしくは（Ａ１４－２）もしくは（Ａ１４－３）（例えば、ＷＯ２０１９／０７４１１０に記載）で表されるリンカーが例示される。これらのリンカー以外にＷＯ２０１２／００５３６８、ＷＯ２０１８／１８２００８またはＷＯ２０１９／０７４１１０に記載のリンカーが例示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　式（３）におけるＲ基および式（４）におけるＲ’基が、水酸基以外の置換基であるヌクレオチドおよびアミダイトは、特許第３７４５２２６号公報などに記載された公知の方法、ＷＯ２００１／０５３５２８号公報あるいは特開２０１４－２２１８１７号公報およびそれらに引用される公知の方法で合成されるヌクレオシドから製造することもでき、さらには、市販品として入手可能なものを用いて、後述する実施例に記載の方法に則して又はこれらの方法に適宜変更を加えた方法により製造することができる。
　前記工程（１）から（６）のアミダイト法による核酸化合物の合成は、図１のスキーム中の工程（３）における本発明に関わる酸化反応工程以外は、一般的に公知の方法（例えば、前記の特許第５１５７１６８号公報または特許第５５５４８８１号公報に記載の方法）に従って、脱保護工程、縮合工程、の各工程を繰り返し行うことにより、核酸伸長反応を行うことができる。以下、各工程について説明する。
　Ｇ４は、水素原子、アルカリ金属イオン、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、またはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表す。アルカリ金属イオンとしては、例えば、ナトリウムイオン、およびリチウムイオンが挙げられる。また、アルキルアンモニウムイオンとして、具体的なアルキル基の例としては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロビル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、及びヘキシルが挙げられるが、より具体的には、例えば、ジエチルアンモニウムイオン、トリエチルアンモニウムイオン、テトラブチルアンモニウムイオン、ヘキシルアンモニウムイオン、およびジブチルアンモニウムイオンなどが挙げられる。また、ヒドロキシアルキルアンモニウムイオンとして、具体的なヒドロキシアルキル部分の例としては、例えば、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシ－ｎ－プロビル、ヒドロキシイソプロピル、ヒドロキシ－ｎ－ブチル、トリスヒドロキシメチルが挙げられるが、より具体的なヒドロキシアルキルアンモニウムイオンの例としては、トリスヒドロキシメチルアンモニウムイオンなどが挙げられる。
　Ｇ５は、水素原子、または保護基を表し、保護基を表す場合はＧ１と同じ保護基を表す。Ｇ５は脱保護された場合には水素原子であるが、その場合のヌクレオチド化合物もまた、一連の核酸伸張反応の工程に供される。
（核酸伸長反応）
　本明細書において、「核酸伸長反応」とは、ホスホジエステル結合を介して、ヌクレオチドを順次結合させることにより、オリゴヌクレオチドを伸長させる反応を意味する。核酸伸長反応は、一般的なホスホロアミダイト法の手順に従い行うことができる。核酸伸長反応は、ホスホロアミダイト法を採用する核酸自動合成装置等を用いて行ってもよい。
　核酸オリゴマーの鎖長は、例えば、２～２００ｍｅｒや１０～１５０ｍｅｒ、１５～１１０ｍｅｒであってもよい。
　工程（１）の５’脱保護工程は、固相担体上に担持されるＲＮＡ鎖末端の５’ヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程である。一般的な保護基としては、４，４’－ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ基）や４－モノメトキシトリチル基、４，４’，４”－トリメトキシトリチル基が用いられる。脱保護は、酸を用いて行うことができる。脱保護用の酸としては、例えば、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸、ｐ－トルエンスルホン酸等が挙げられる。
　工程（２）の縮合工程は、前記脱保護工程により脱保護したオリゴヌクレオチド鎖末端の５’ヒドロキシル基に対して、図１のスキームＡに記載の下記式（３）で示されるヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させる反応である。なお、核酸伸長に用いるホスホロアミダイトとしては、式（３）または（Ａ１２）で示されるアミダイト化合物を用いる。また、他に使用可能なホスホロアミダイトとして、２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、２’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基，２’－Ｏ－メトキシエチル基，２’－Ｈ，２'－フルオロ－２’－デオキシ－β－Ｄ－アラビノフラノシル等が挙げられる。前記ヌクレオシドホスホロアミダイトとしては、５’ヒドロキシル基が保護基（例、ＤＭＴｒ基）で保護されたものを用いる。縮合工程は、前記ヌクレオシドホスホロアミダイトを活性化する活性化剤を用いて行うことができる。活性化剤としては、例えば、５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＢＴＴ）、１Ｈ－テトラゾール、４，５－ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）、Ｎ－メチルベンズイミダゾリウムトリフラート（Ｎ－ＭｅＢＩＴ）、ベンズイミダゾリウムトリフラート（ＢＩＴ）、Ｎ－フェニルイミダゾリウムトリフラート（Ｎ－ＰｈＩＭＴ）、イミダゾリウムトリフラート（ＩＭＴ）、５－ニトロベンズイミダゾリウムトリフラート（ＮＢＴ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）又は５－（ビス－３，５－トリフルオロメチルフェニル）－１Ｈ－テトラゾール等が挙げられる。
　図１のスキームＡに記載の式（３）で示されるヌクレオシドホスホロアミダイト（以下、アミダイトと呼称する）とは、以下のとおりである。
　式:
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 （式中、
　Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｂａ、およびＲは、前記の通りである。）で示される化合物。
　縮合工程の後は、適宜、未反応の５’ヒドロキシル基をキャッピングしてもよい。キャッピングは、無水酢酸－テトラヒドロフラン溶液、フェノキシ酢酸無水物／Ｎ－メチルイミダゾール溶液等の公知のキャッピング溶液を用いて行うことができる。
　工程（３）の酸化工程は、前記縮合工程により形成された亜リン酸基をリン酸基又はチオリン酸基に変換する工程である。本工程は、３価のリンから５価のリンに酸化剤を使用して変換する反応であり、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に酸化剤を作用させることにより実施することができる。
　亜リン酸基をリン酸基に変換する場合には、「酸化剤」として、例えば、ヨウ素を使用することができる。該酸化剤は、０．００５～２Ｍの濃度になるように調製して使用することができる。酸化の酸素源としては水を用いることができ、反応を進行させる塩基としてはピリジン、Ｎ－メチルイミダゾール（ＮＭＩ）、Ｎ－メチルモルフォリン、トリエチルアミンを用いることができる。また、溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）又はこれらの任意の割合で混合して使用することもできる。例えば、ヨウ素／水／ピリジン／アセトニトリル、あるいはヨウ素／水／ピリジンあるいはヨウ素／水／ピリジン／ＮＭＩ、あるいはヨウ素／水／ピリジン／ＴＨＦを用いることができる。反応温度は、５℃～５０℃が好ましい。反応時間は、通常１分～３０分が適当である。使用する試薬の量は固相担体に担持されている化合物１ｍｏｌに対して１～１００ｍｏｌが好ましく、より好ましくは１～１０ｍｏｌである。
　亜リン酸トリエステル基をチオリン酸基に変換する場合には、「酸化剤」として、例えば、硫黄、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン－１，１－ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＡＤＴＴ）、５－フェニル－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－オン（ＰＯＳ）、［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾリン－３－チオン（ＤＤＴＴ）、およびフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）を使用することができる。該酸化剤は、０．００１～２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。反応に使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、ピリジン又はこれらの任意の混合溶媒が挙げられる。酸化工程は、前記キャッピング操作の後で行ってもよいし、逆に、酸化工程の後でキャッピング操作を行ってもよいし、この順序は限定されない。
　工程（５）において、リン酸保護基を脱保護する工程は、所望の配列を有する核酸の合成が完了した後は、リン酸部分の保護基を脱保護するためにアミン化合物を作用させる。アミン化合物としては、例えば、特許第４７０５７１６号公報に記載されるジエチルアミン等が挙げられる。
　伸長の最後に導入したヌクレオシドの５’ヒドロキシル基の保護基は、後述の固相担体からの切り出し及び保護基の脱保護の後、５’保護基をタグとするカラム精製のために使用してもよく、カラム精製後、５’ヒドロキシル基の保護基を脱保護してもよい。
　工程（５）における、固相担体上で所望の鎖長に伸長した核酸オリゴマーの、固相担体からの切り出しは、通常、切り出し剤として濃アンモニア水を用いて実施される。
　更にアンモニア又はアミン化合物等を用いて、例えば、固相担体からオリゴヌクレオチド鎖を切断して回収する。アミン化合物としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、イソプロピルアミン、エチレンジアミン、ジエチルアミン等が挙げられる。
　工程（６）において、工程（５）において固相担体から切り出された核酸化合物（６）のリボースの２位もしくは３位の水酸基の保護基は、国際公開２００６／０２２３２３号）、国際公開第２０１３／０２７８４３号、または国際公開第２０１９／２０８５７１号に記載の方法に従って除くことができて、脱保護した核酸オリゴマー（７）を得ることができる。
　本発明の製造方法を用いて製造可能な核酸オリゴマーとしては、核酸オリゴマー内に含まれるヌクレオシドが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、並びに２’－Ｏ－ＭＯＥ、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆを有するＲＮＡ、およびＬＮＡである核酸オリゴマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、Xiulong, Shenら著、Nucleic Acids Research, 2018, Vol. 46, No.46, 1584-1600、およびDaniel O'Reillyら著、Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No.2, 546-558に記載された、様々なヌクレオシドの例が挙げられる。
　本発明の製造方法において使用可能な核酸オリゴマーの典型的な例を、実施例に記載の例に加えて下記の例を示すが、これらに限定されるものではない。
　以下、配列の説明中、Uはウリジンを、Cはシチジンを、Aはアデノシンを、またGはグアノシンを示す。
　国際公開第２０１９／０６０４４２号に記載されている、下記の配列（Ｂ）および（Ｃ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｂ）：５’－AUGGAAUmACUCUUGGUUmACdTdT－３’（Antisense）（配列番号３）　２１ｍｅｒ
配列（Ｃ）：５’－GUmAACmCmAAGAGUmAUmUmCmCmAUmdTdT－３’（Sense）（配列番号４）　２１ｍｅｒ
　配列（Ｂ）および（Ｃ）中、Umは2'-O-メチルウリジンを、Cmは2'-O-メチルシチジンを、またdTはチミジンを示す。
　Daniel O'Reillyら著、Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No.2, 546-558に記載されている核酸オリゴマー（553頁参照）が挙げられる。典型例として、下記の配列（Ｄ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｄ）：５’－AGAGCCAGCCUUCUUAUUGUUUUAGAGCUAUGCUGU－３’（配列番号５）　３６ｍｅｒ
　ＪＰ４９６５７４５に記載されている核酸オリゴマーが挙げられる。典型例として、下記の配列（Ｅ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｅ）：５’－CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-P-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU－３’　４９ｍｅｒ。CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC（配列番号６）、GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU（配列番号７）。
　配列（Ｅ）中、”Ｐ”は、以下の式（Ａ５）において波線で区切られる部分構造で示される。
　Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No. 2: 547に記載されている、下記の配列（Ｆ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｆ）：５’－ACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU－３’（配列番号８）　６７ｍｅｒ
　ＪＰ　２０１５－５２３８５６, １７３に記載されている、下記の配列（Ｇ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｅ）：５’－GUUUUCCCUUUUCAAAGAAAUCUCCUGGGCACCUAUCUUCUUAGGUGCCCUCCCUUGUUUAAACCUGACCAGUUAACCGGCUGGUUAGGUUUUU－３’（配列番号９）　９４ｍｅｒ
　ＪＰ　２０１７－５３７６２６に記載されている核酸オリゴマーが挙げられる。典型例として、下記の配列（F）（G）（Ｈ）（Ｊ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（F）：５’－AGUCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUUAGAGCUAGUAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU－３’（配列番号１０）　１００ｍｅｒ
配列（G）：５’－GCAGAUGUAGUGUUUCCACAGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU－３’（配列番号１１）　１１３ｍｅｒ
配列（H）：５’－dAdGdTdCdCdTdCdAdTdCdTdCdCdCdTdCdAdAdGdCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU －３’（配列番号１２）　１１３ｍｅｒ
配列（H）中、dTはチミジンを、dCは2'-デオキシシチジンを、dAは2'-デオキシアデノシンを、またdGは2'-デオキシグアノシンを示す。
配列（Ｊ）：５’－AmsGmsUmsCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUmsUmsUmsU－３’（配列番号１３）　１１３ｍｅｒ
　配列（Ｊ）中、Umは2'-O-メチルウリジンを、Amは2'-O-メチルアデノシンを、Gmは2'-O-メチルグアノシンを、またsはホスホロチオエート修飾を示す。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
＜測定方法＞
　まず、以下の試験で用いた各種測定方法を以下に示す。
　オリゴヌクレオチド純度は、ＨＰＬＣを用いて測定した。
　ＨＰＬＣ測定条件を下記表１に示す。
（測定方法１：オリゴヌクレオチド純度の測定）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
（測定方法２：オリゴヌクレオチド収量の測定）
　前記粗生成物のＯＤ２６０を測定した。ＯＤ２６０とは１ｍＬ溶液（ｐＨ＝７．５）における１０ｍｍ光路長あたりのＵＶ２６０ｎｍの吸光度を表す。一般的にＲＮＡでは１ＯＤ＝４０μｇであることが知られていることから、前記ＯＤ２６０の測定値に基づき、収量を算出した。
（測定方法３：ヨウ素酸濃度の測定）
　ヨウ素酸の測定は、イオンクロマトグラフ法により行った。標準品(ＮａＩＯ３)と比較して濃度を算出した。イオンクロマトグラフ法の測定条件を下記表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
（測定方法４：ヨウ素濃度の測定）
　ヨウ素の測定は、イオンクロマトグラフ法により行った。標準品(Ｉ２)と比較して濃度を算出した。イオンクロマトグラフ法の測定条件を下記表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
＜オリゴヌクレオチドの固相合成＞
　配列（Ｉ）：５’－AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G－３’（配列番号１、２）　５３ｍｅｒ
　前記配列（Ｉ）において、”Ａ”は、以下の式（Ａ１）において波線で区切られる部分構造で示される。”Ｃ”は、以下の式（Ａ２）において波線で区切られる部分構造で示される。”Ｇ”は、以下の式（Ａ３）において波線で区切られる部分構造で示される。Ｕは、以下の式（Ａ４）において波線で区切られる部分構造で示される。”Ｐ”は、以下の式（Ａ５）において波線で区切られる部分構造で示される。なお、５‘末端の”Ａ”は、以下の式（Ａ６）において波線で区切られる部分構造で示される。また、３‘末端の”Ｇ”は、以下の式（Ａ７）において波線で区切られる部分構造で示される。
AGCAGAGUAC ACACAGCAUA UACC（配列番号１）
GGUAUAUGCU GUGUGUACUC UGCUUC（配列番号２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　固相担体として、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）を使用し、核酸合成機としてＮＴＳ　Ｍ－４ＭＸ－Ｅ（日本テクノサービス社製）若しくはＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、ホスホロアミダイト固相合成法により、上記配列（Ｉ）からなるオリゴヌクレオチドを３’側から５’側に向かって合成した。合成は、ＮＴＳ　Ｍ－４ＭＸ－Ｅ（日本テクノサービス社製）を用いた場合には、約１μｍｏｌスケールにて実施し、ＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００（ＧＥヘルスケア社製）を用いた場合には約８０μｍｏｌスケールにて実施した。また、合成には、ＵＳ２０１２／００３５２４６の実施例２に記載のウリジンＥＭＭアミダイト、実施例３に記載のシチジンＥＭＭアミダイト、実施例４に記載のアデノシンＥＭＭアミダイト、実施例５に記載のグアノシンＥＭＭアミダイトおよびＷＯ２０１７／１８８０４２に記載の化合物（３）を使用し、デブロッキング溶液として高純度トリクロロ酢酸トルエン溶液を使用し、縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを使用し、酸化剤としてヨウ素溶液を使用し、キャッピング溶液としてフェノキシ酢酸無水物溶液とＮ－メチルイミダゾール溶液を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
　次に、本発明の製法により製造される核酸オリゴマーの具体的な製造例を示す。ここで、下記の実施例において本発明の製法により製造されるオリゴヌクレオチドは、前記配列番号１および２で示される配列（Ｉ）を有する核酸オリゴマーである。
　また、以下の実施例および比較例中に記載するグアノシン誘導体とは、下記の構造式で示される化合物を意味する。下記構造式において図示されたサークルは、ＣＰＧを模式的に示すものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
（実施例１）
　１．０８μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）に示す核酸オリゴマーをＮＴＳ　Ｍ－４ＭＸ－Ｅ（日本テクノサービス社製）により、３’側から５’側に向かって自動合成した。自動合成の手順は、まず、３％トリクロロ酢酸トルエン溶液を各回１．４ｍＬＣＰＧに送液し、５’位のトリチル保護基を脱保護し、続いて、各種アミダイトを０．３ｍＬと縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを各０．４ｍＬ分ＣＰＧに送液し、５’位の水酸基にカップリング反応を進行させた。続いて、１１ｍＭヨウ素を含むアセトニトリル：水：ピリジン＝５８．２：３４．４：７．２（重量％）溶液を調製した後、２５℃で２年間保管したものを０．７ｍＬ送液し、亜リン酸基をリン酸基に変換した。核酸合成に用いた時の酸化溶液中のヨウ素のモル濃度は、測定方法４により測定することができ、その濃度は１１ｍＭであり、ヨウ素酸濃度は、測定方法３により測定することができ、その濃度は０．０２９ｍＭであった。すなわち、合成に使用した際の酸化溶液中のヨウ素のモル濃度に対するヨウ素酸のモル濃度の比は２.６ｘ１０-3であった。続いて、キャッピング溶液として０．１Ｍフェノキシ酢酸無水物アセトニトリル溶液０．５ｍＬと１０％Ｎ－メチルイミダゾール／１０％２，６－ルチジンアセトニトリル溶液０．５ｍＬを使用し、カップリングが進行しなかった反応点にキャッピングを施した。更にこれらの工程を合計５２回繰り返し、配列（Ｉ）に示される配列の核酸オリゴヌクレオチドをＣＰＧ担体上に合成した後、５’位のトリチル保護基を３％トリクロロ酢酸トルエン溶液にて脱保護した。その後、全量のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体に対して、７５２μＬのアンモニア水と２５２μLのエタノールを用いて、核酸オリゴマーを固相担体から遊離させた後、窒素吹付によりアンモニア水とエタノールを除去した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを４００μＬのジメチルスルホキシドに溶解後、ニトロメタン５．３μＬと撹拌子を入れた後、モレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液５３０μＬ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１０．２ｍｏｌ）をスターラーによる攪拌下３０℃で流入し、混合物を４時間保温することで２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。核酸オリゴマーを沈殿操作により得た。測定方法２による測定の結果、収量は９．１ｍｇ、測定方法１による測定の結果、純度は６１％であった。
（実施例２）
　実施例１の実験において、７８．２０μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）を用いるスケールにし、ＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００（ＧＥヘルスケア社製）を用い、ヨウ素を含む酸化溶液として、表２に記載の溶液を用いること及び、核酸合成操作終了後、２０．１３μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取して、７．５ｍＬのアンモニア水と２．５ｍLのエタノールを用いて、核酸オリゴマーを固相担体から遊離させた後、エバポレーターによる濃縮によりアンモニア水とエタノールを除去して、次いで遊離オリゴヌクレオチドを８．０ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解後、ニトロメタン１０６μＬと撹拌子を入れた後、モレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液１０．６ｍＬ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１０．２ｍｏｌ）を用いたこと以外は、同様のやり方で、配列（Ｉ）の核酸オリゴマーを得た。収量は１７０．５ｍｇ、純度は６０％であった。
（実施例３）
　実施例１の実験において、１．１０μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と用い、ヨウ素を含む酸化溶液として、表２に記載の溶液を用いる以外は、同様のやり方で配列（Ｉ）の核酸オリゴマーを得た。収量は８．４ｍｇ、純度は６０％であった。
（実施例４）
　実施例２の実験において、酸化溶液として、下記表に記載のものを用い、７８．２０μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）を用いるスケールとし、ヨウ素を含む酸化溶液として、表２に記載の酸化溶液を用いること及び、核酸合成操作終了後、２０．１６μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取したこと以外は、同様のやり方で配列（Ｉ）の核酸オリゴマーを得た。収量は１８０．０ｍｇ、純度は５９％であった。
（実施例５）
　実施例１の方法において、１．０６μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と、表２に記載のヨウ素を含む酸化溶液を用いる以外は、同様のやり方で配列（Ｉ）の核酸オリゴマーを得た。収量は９．１ｍｇ、純度は５６％であった。
（実施例６）
　実施例２の方法において、ヨウ素を含む酸化溶液として、表２に記載の酸化溶液を用いること及び、核酸合成操作終了後、２０．２０μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取したこと以外は、同様のやり方で配列（Ｉ）の核酸オリゴマーを得た。収量は１５４．８ｍｇ、純度は５７％であった。
（実施例７）
　実施例１の方法において、１．０９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と、表２に記載の酸化溶液を用いる以外は、同様のやり方で配列（Ｉ）の核酸オリゴマーを得た。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は９．２ｍｇ、純度は４９％であった。
（実施例８）
　実施例１の方法において、１．０４μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と表２に記載の酸化溶液を用いる以外は、同様のやり方で、配列（Ｉ）の核酸オリゴヌクレオチドを得た。収量は７．７ｍｇ、純度は４６％であった。
（実施例９）
　実施例１の方法において、１．００μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と、表２に記載の酸化溶液を用いる以外は、同様のやり方で配列（Ｉ）の核酸オリゴマーを得た。収量は７．９ｍｇ、純度は４２％であった。
参考例１
　実施例１の方法において、１．０４μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と、表２に記載の酸化溶液を用いる以外は、同様のやり方で配列（Ｉ）の核酸オリゴマーを得た。収量は７．８ｍｇ、純度は３５％であった。
　実施例１～９、および参考例１の結果を、表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
　上記表の結果より、一定の比率のヨウ素酸のヨウ素に対するモル比率が３０×１０－３以下である本発明の酸化溶液を用いた場合には、参考例１の酸化溶液を用いた場合と比較して、高純度の核酸オリゴマーが得られた。
　本発明は、効率的な核酸オリゴマーの製造方法を提供する。また、核酸オリゴマーの製造方法に従って製造される核酸オリゴマーの純度向上が期待できる。
　配列表の配列番号１～１３は、本発明の製造方法に従って製造されるオリゴヌクレオチドの塩基配列を表す。

Claims (27)

  1. 　式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、
    　Ｇ１およびＧ２は各々、独立して、水酸基の保護基を示し、Ｂａは、保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し、
    　Ｒは、保護された水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
    　Ｑ’は、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、そして、
    　＊のついた結合は、核酸の３’末端側への結合を示す。）
    で示されるヌクレオチドを５’末端に有する核酸化合物の、ホスホロアミダイト法による製造方法であって、５’末端に式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、
    　Ｇ１、Ｇ２、Ｂａ、Ｒおよび＊は、前記定義のとおりである。）
    で示される亜リン酸トリエステル結合を有する前駆体に、ヨウ素、ピリジンおよび水を含み、ヨウ素酸とヨウ素のモル比（ヨウ素酸ｍｏｌ／ヨウ素ｍｏｌ）が３０×１０－３以下である酸化溶液を反応させる工程を含む、製造方法。
  2. 　亜リン酸トリエステル結合を有する前駆体が、式（４）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、
    　Ｇ１は、水酸基の保護基を表し、
    　Ｇ２は、それぞれ独立して、同一又は相異なる水酸基の保護基を表し、
    　Ｂaは、それぞれ独立して、同一又は相異なり、保護基で保護されていてもよい核酸塩基を表し、
    　Ｒは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、保護された水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
    　Ｑ’は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、
    　Ｙは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、酸素原子または硫黄原子を表し、
    　ｎは、１以上２００までの何れかの整数を表し、
    　ＸがＯＺを表すとき、ＷはＯＶ基を表し、Ｖは水酸基の保護基を表し、
    　ＸがＲ基を表すとき、ＷはＯＺで表される基を表し、
    　Ｚは、固相担体および連結基からなる構造を有する基である。
    　そして、ｎが２以上の整数のとき、式（４）で示される核酸化合物は、それぞれの５’末端と３’末端のヌクレオチドの間の少なくとも１つのヌクレオチドの代わりに、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい。）
    で示される化合物であり、リン酸トリエステル結合を有する化合物が、式（５）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式中、
    　Ｇ１、Ｇ２、Ｂａ、Ｒ、ｎ、Ｗ、Ｘ、およびＹは、前記のとおりであり、そして、
    　式（４）において定義されたとおり、ヌクレオチドの代わりに、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい。）
    で示される核酸化合物である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　式（５）の核酸化合物をアミダイト法で任意に鎖長を伸長した式（５’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     （式中、
    　Ｇ２、Ｂａ、Ｒ、ＸおよびＷは、式（５）について定義されたとおりであり、
    　Ｇ５は、水酸基の保護基、もしくは水素原子を表し、
    　ｍは、ｍ≧ｎを満たす整数であり、そして、
    　Ｙは、それぞれ独立して、酸素または硫黄を表す。
    　ただし、少なくとも１つのＹは、酸素原子である。）
    で示される核酸化合物を得る工程、
    　式（５’）の化合物から式（６）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （式中、
    　Ｇ５、Ｒおよびｍは、前記のとおりであり、
    　Ｂｃはそれぞれ独立して同一又は相異なる核酸塩基を表し、
    　Ｇ４は水素原子、アルカリ金属イオン、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、またはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表し、
    　Ｙは、それぞれ独立して、酸素または硫黄を表し、かつ、少なくとも１つが、酸素原子であり、そして、
    　Ｘ１は、水酸基を表し、かつＷ１は、ＯＶ基を表し、ここでＶは、水酸基の保護基を表すか、あるいは
    　Ｘ１は、Ｒ基を表し、かつＷ１は、水酸基を表す。）
    で示される化合物を切り出し、
    　さらに式（６）の化合物を脱保護して、式（７）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     （式中、
    　ｍ、Ｙ、Ｇ４およびＢｃは、前記定義のとおりであり、
    　Ｒ’は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
    　Ｑ’は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、
    　そして、
    　Ｘ１０およびＷ１０は各々、それぞれ独立して、水酸基を表すか、あるいは
    　Ｘ１０は、Ｒ’基を表し、かつ、Ｗ１０は、水酸基を表す。）
    で示される脱保護した核酸オリゴマーを製造する工程をさらに含む、前項２に記載の核酸オリゴマーの製造方法。
  4. 　非ヌクレオチドリンカーが、アミノ酸骨格からなるリンカーである、請求項２または３のいずれかに記載の製造方法。
  5. 　アミノ酸骨格からなるリンカーが、下記式（Ａ１４－１）、（Ａ１４－２）および（Ａ１４－３）からなる群から選ばれる構造を有するリンカーである、請求項４に記載の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
  6. 　酸化溶液のヨウ素の濃度が、０．００５～２Ｍである、請求項１～５の何れか一項に記載の製造方法。
  7. 　酸化溶液のヨウ素の濃度が、０．００５～０．２Ｍである、請求項１～５の何れか一項に記載の製造方法。
  8. 　酸化溶液のヨウ素の濃度が、０．００７～０．１Ｍである、請求項１～５の何れか一項に記載の製造方法。
  9. 　酸化溶液のヨウ素の濃度が、０．００８～０．０７Ｍである、請求項１～５の何れか一項に記載の製造方法。
  10. 　酸化溶液が、ヨウ素、ピリジンおよび水を混合して調製される、請求項１～９の何れか一項に記載の製造方法。
  11. 　酸化溶液が、アセトニトリルおよびテトラヒドロフランからなる群から選ばれる少なくとも１つの溶媒をさらに含む酸化溶液である、請求項１０に記載の製造方法。
  12. 　酸化溶液が、アセトニトリル溶媒をさらに含む酸化溶液である、請求項１０または１１に記載の製造方法。
  13. 　酸化溶液の溶媒が、ピリジン、水、アセトニトリル、およびテトラヒドロフランを、１～９０：１～５０：０～９０：０～９０の体積比率で混合した混合溶媒である、請求項１１に記載の製造方法。
  14. 　酸化溶液の溶媒が、ピリジン、水、およびアセトニトリルを、１～９０：１～５０：０～９０の体積比率で混合した混合溶媒である、請求項１１または１２に記載の製造方法。
  15. 　ヨウ素酸とヨウ素のモル比（ヨウ素酸ｍｏｌ／ヨウ素ｍｏｌ）が２５×１０－３以下である、請求項１～１４の何れか一項に製造方法。
  16. 　ヨウ素酸とヨウ素のモル比（ヨウ素酸ｍｏｌ／ヨウ素ｍｏｌ）が２０×１０－３以下である、請求項１～１４の何れか一項に製造方法。
  17. 　ヨウ素酸とヨウ素のモル比（ヨウ素酸ｍｏｌ／ヨウ素ｍｏｌ）が１５×１０－３以下である、請求項１～１４の何れか一項に製造方法。
  18. 　ヨウ素酸とヨウ素のモル比（ヨウ素酸ｍｏｌ／ヨウ素ｍｏｌ）が１０×１０－３以下である、請求項１～１４の何れか一項に製造方法。
  19. 　ヨウ素酸とヨウ素のモル比（ヨウ素酸ｍｏｌ／ヨウ素ｍｏｌ）が５×１０－３以下である、請求項１～１４の何れか一項に記載の製造方法。
  20. 　ヨウ素酸とヨウ素のモル比（ヨウ素酸ｍｏｌ／ヨウ素ｍｏｌ）が３×１０－３以下である、請求項１～１４の何れか一項に記載の製造方法。
  21. 　酸化溶液が、調製から酸化反応に使用するまでの時間が１週間以上経た酸化溶液である、請求項１～２０の何れか一項に記載の製造方法。
  22. 　酸化溶液が、調製から酸化反応に使用するまでの時間が２週間以上経た酸化溶液である、請求項１～２０の何れか一項に記載の製造方法。
  23. 　核酸がリボヌクレオシド（ＲＮＡ）である、請求項１～２２の何れか一項に記載の製造方法。
  24. 　核酸が、リボヌクレオシド（ＲＮＡ）であり、その２’保護基が、式（１２）に示す保護基である、請求項２～２３の何れか一項に記載の製造方法。
    　式（１２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     （式中、
    　ｑは、１～５の整数を表し、
    　ＲａおよびＲｂは各々、それぞれ同一又は相異なって、メチル基、エチル基または水素原子を表し、
    　＊印のついた結合は、ＯＱ基の酸素に結合し、そして、
    　ＥＷは、電子求引基を表す。）
  25. 　ＲａおよびＲｂが同時に水素原子であり、ＥＷがシアノ基である、請求項２４に記載の製造方法。
  26. 　核酸が４０鎖長以上のリボヌクレオシド（ＲＮＡ）である、請求項１～２５の何れか一項に記載の製造方法。
  27. 　さらに項１に記載の酸化溶液を調製する工程を含む、請求項１～２６の何れか一項に記載の製造方法。
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