CN115003682A - 核酸寡聚物的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供核酸寡聚物的高效的制造方法、特别是氧化具有亚磷酸三酯键的核酸前体来高效地制造具有磷酸三酯键的核酸分子的方法。另外，本发明提供在5’末端具有式(I)所示的核苷酸的核酸化合物的、基于亚磷酰胺法的制造方法，该制造方法包括使在5’末端具有式(II)(式(I)及(II)的取代基的定义与说明书中的定义相同)所示的亚磷酸三酯键的前体、与含有碘、吡啶及水且碘酸与碘的摩尔比(碘酸mol/碘mol)为30×10‑3以下的氧化溶液进行反应的工序。

Description

核酸寡聚物的制造方法
技术领域
本专利申请基于日本专利申请2020-012787号(于2020年1月29日提出申请)主张巴黎公约规定的优先权及利益，上述申请中记载的全部内容通过引用并入本说明书中。
本发明涉及核酸寡聚物的制造方法。
作为核酸寡聚物的DNA、RNA可用作DNA探针、RNA探针、反义链(反义)、核酶、siRNA、适配体等，是有用的材料。
核酸寡聚物可利用固相合成法合成，固相合成法中将核苷的亚磷酰胺(以下称作“酰胺(amidite)”)作为原料使用。将在固相载体上使经过偶联、氧化及去保护的工序的核酸延伸而合成的核酸寡聚物从固相载体切出，接着，除去保护基，制造作为目标的核酸寡聚物。以此方式合成的核酸寡聚物的纯度并不总令人满意，合成也并非是高效的(非日本专利文献1)。
现有技术文献
非日本专利文献
非日本专利文献1：Tetrahedron 69(2013)3615-3637
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供核酸寡聚物的高效的制备方法。
用于解决课题的手段
本申请发明人为了达成上述目的而反复进行了认真研究，结果提供核酸寡聚物的高效的制造方法，其特征在于，核酸寡聚物的合成中，作为将通过使用了亚磷酰胺的偶联反应而生成的亚磷酸酯氧化时所使用的氧化溶液，使用含有碘、水及吡啶且碘酸相对于碘的比率为一定的水平以下的溶液。
本发明包含以下方式，但不限定于此。
项1.制造方法，其为在5’末端具有式(I)所示的核苷酸的核酸化合物的、基于亚磷酰胺法的制造方法，所述制造方法包括使在5’末端具有式(II)所示的亚磷酸三酯键的前体、与含有碘、吡啶及水且碘酸与碘的摩尔比(碘酸mol/碘mol)为30×10-3以下的氧化溶液(以下，本说明书中，称作“本发明的氧化溶液”)进行反应的工序，
[化学式1]
Figure BDA0003770296790000021
式(I)中，
G1及G2各自独立地表示羟基的保护基，Ba表示可被保护基保护的核酸碱基，
R表示被保护的羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基、或OQ’基，
Q’表示与核糖的4’位的碳原子键合的亚甲基、与4’位的碳原子键合的亚乙基、或与4’位的碳原子键合的乙叉基，并且，
带*的键表示朝向核酸的3’末端侧的键；
[化学式2]
Figure BDA0003770296790000022
式(II)中，
G1、G2、Ba、R及*与前述定义相同。
项2.如项1所述的制造方法，其中，具有亚磷酸三酯键的前体为式(4)所示的化合物，具有磷酸三酯键的化合物为式(5)所示的核酸化合物，
[化学式3]
Figure BDA0003770296790000031
式(4)中，
G1表示羟基的保护基，
G2相同或彼此不同，各自独立地表示羟基的保护基，
Ba相同或彼此不同，各自独立地表示可被保护基保护的核酸碱基，
R相同或彼此不同，各自独立地表示被保护的羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基、或OQ’基，
Q’相同或彼此不同，各自独立地表示与核糖的4’位的碳原子键合的亚甲基、与4’位的碳原子键合的亚乙基、或与4’位的碳原子键合的乙叉基，
Y相同或彼此不同，各自独立地表示氧原子或硫原子，
n表示1以上至200的任一整数，
当X表示OZ时，W表示OV基，V表示羟基的保护基，
当X表示R基时，W表示OZ所表示的基团，
Z为具有由固相载体及连接基团组成的结构的基团，
并且，n为2以上的整数时，式(4)所示的核酸化合物也可以组入非核苷酸接头来代替各5’末端和3’末端的核苷酸之间的至少1个核苷酸；
[化学式4]
Figure BDA0003770296790000041
式(5)中，
G1、G2、Ba、R、n、W、X及Y与前述相同，并且，
与式(4)中的定义相同，也可以组入非核苷酸接头来代替核苷酸。
项3.如项2所述的核酸寡聚物的制造方法，其还包括以下工序：
得到利用酰胺法将式(5)的核酸化合物任意延伸了链长的式(5’)所示的核酸化合物的工序；
从式(5’)的化合物切出式(6)所示的化合物，进一步对式(6)的化合物进行去保护来制造式(7)所示的经去保护的核酸寡聚物的工序，
[化学式5]
Figure BDA0003770296790000042
式(5’)中，
G2、Ba、R、X及W与式(5)中的定义相同，
G5表示羟基的保护基、或氢原子，
m为满足m≥n的整数，并且，
Y各自独立地表示氧或硫，
其中，至少1个Y为氧原子；
[化学式6]
Figure BDA0003770296790000051
式(6)中，
G5、R及m与前述相同，
Bc相同或彼此不同，各自独立地表示核酸碱基，
G4表示氢原子、碱金属离子、铵离子、烷基铵离子、或羟基烷基铵离子，
Y各自独立地表示氧或硫，且至少1个为氧原子，并且，
X1表示羟基，且W1表示OV基，此处V表示羟基的保护基，或者，
X1表示R基，且W1表示羟基；
[化学式7]
Figure BDA0003770296790000052
式(7)中，
m、Y、G4及Bc与前述定义相同，
R’相同或彼此不同，各自独立地表示羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基、或OQ’基，
Q’相同或彼此不同，各自独立地表示与核糖的4’位的碳原子键合的亚甲基、与4’位的碳原子键合的亚乙基、或与4’位的碳原子键合的乙叉基，
并且，
X10及W10分别各自独立地表示羟基，或者，
X10表示R’基，且W10表示羟基。
项4.如项2或3中任一项所述的制造方法，其中，非核苷酸接头为包含氨基酸骨架的接头。
项5.如项4所述的制造方法，其中，包含氨基酸骨架的接头为具有选自由下式(A14-1)、(A14-2)及(A14-3)组成的组中的结构的接头。
[化学式8]
Figure BDA0003770296790000061
项6.如项1～5中任一项所述的制造方法，其中，氧化溶液的碘的浓度为0.005～2M。
项7.如项1～5中任一项所述的制造方法，其中，氧化溶液的碘的浓度为0.005～0.2M。
项8.如项1～5中任一项所述的制造方法，其中，氧化溶液的碘的浓度为0.007～0.1M。
项9.如项1～5中任一项所述的制造方法，其中，氧化溶液的碘的浓度为0.008～0.07M。
项10.如项1～9中任一项所述的制造方法，其中，氧化溶液是将碘、吡啶及水进行混合而配制的。
项11.如项10所述的制造方法，其中，氧化溶液为还含有选自由乙腈及四氢呋喃组成的组中的至少1种的溶剂的氧化溶液。
项12.如项10或11所述的制造方法，其中，氧化溶液为还含有乙腈溶剂的氧化溶液。
项13.如项11所述的制造方法，其中，氧化溶液的溶剂为将吡啶、水、乙腈及四氢呋喃以1～90:1～50:0～90:0～90的体积比率进行混合而得的混合溶剂。
项14.如项11或12所述的制造方法，其中，氧化溶液的溶剂为将吡啶、水及乙腈以1～90:1～50:0～90的体积比率进行混合而得的混合溶剂。
项15.如项1～14中任一项所述的制造方法，其中，碘酸与碘的摩尔比(碘酸mol/碘mol)为25×10-3以下。
项16.如项1～14中任一项所述的制造方法，其中，碘酸与碘的摩尔比(碘酸mol/碘mol)为20×10-3以下。
项17.如项1～14中任一项所述的制造方法，其中，碘酸与碘的摩尔比(碘酸mol/碘mol)为15×10-3以下。
项18.如项1～14中任一项所述的制造方法，其中，碘酸与碘的摩尔比(碘酸mol/碘mol)为10×10-3以下。
项19.如项1～14中任一项所述的制造方法，其中，碘酸与碘的摩尔比(碘酸mol/碘mol)为5×10-3以下。
项20.如项1～14中任一项所述的制造方法，其中，碘酸与碘的摩尔比(碘酸mol/碘mol)为3×10-3以下。
项21.如项1～20中任一项所述的制造方法，其中，氧化溶液为从配制至用于氧化反应为止的时间经过了1周以上的氧化溶液。
项22.如项1～20中任一项所述的制造方法，其中，氧化溶液为从配制至用于氧化反应为止的时间经过了2周以上的氧化溶液。
项23.如项1～22中任一项所述的制造方法，其中，核酸为核糖核苷(RNA)。
项24.如项2～23中任一项所述的制造方法，其中，核酸为核糖核苷(RNA)，其2’保护基为式(12)中示出的保护基，
[化学式9]
Figure BDA0003770296790000081
式(12)中，
q表示1～5的整数，
Ra及Rb相同或彼此不同，分别各自表示甲基、乙基或氢原子，
带*标记的键与OQ基的氧键合，并且，
EW表示吸电子基团。
项25.如项24所述的制造方法，其中，Ra及Rb同时为氢原子，EW为氰基。
项26.如项1～25中任一项所述的制造方法，其中，核酸为40链长以上的核糖核苷(RNA)。
项27.如项1～26中任一项所述的制造方法，其还包括配制项1所述的氧化溶液的工序。
发明效果
本发明提供高效的核酸寡聚物的制造方法。利用本发明的制造方法，能够期待所制造的核酸寡聚物的纯度提高。
附图说明
[图1]为示出本发明的制法的工序(1)至(6)的路线的附图。
具体实施方式
针对在5’末端具有前述式(I)所示的核苷酸的核酸化合物的、基于亚磷酰胺法的制造方法进行说明，前述制造方法包括使在5’末端具有前述式(II)所示的亚磷酸三酯键的前体、与含有碘、吡啶及水且碘酸与碘的摩尔比(碘酸mol/碘mol)为30×10-3以下的氧化溶液(本发明的氧化溶液)进行反应的工序。
针对包括使具有亚磷酸三酯键的核酸前体、与含有碘、吡啶及水的氧化溶液进行反应从而氧化为磷酸三酯键的工序的核酸化合物的制造方法进行说明，前述氧化溶液中的碘酸与碘的摩尔比(碘酸mol/碘mol)为30×10-3以下。
含有碘、吡啶及水的本发明的氧化溶液中的碘酸与碘的摩尔比(碘酸mol/碘mol)通常为30×10-3以下。碘酸与碘的摩尔比(碘酸mol/碘mol)优选为25×10-3以下，进一步优选为20×10-3以下，进一步更优选为15×10-3以下，进一步更优选为10×10-3以下，进一步更优选为5×10-3以下，更进一步优选为3×10-3以下。此处，碘及碘酸的量利用后述离子色谱法进行测定。
作为前述氧化溶液，典型地由碘、水及吡啶进行配制。就所配制的溶液而言，使用满足前述的碘酸与碘的摩尔比的溶液。
能够使用在从氧化溶液的配制至核酸合成为止的期间例如于25～60℃保存1天以上、优选配制后1周以上、更优选配制后2周以上、进一步优选配制后1个月以上的、前述规定的碘酸与碘的摩尔比以下的溶液。氧化溶液在配制后的保存温度不限定于前述范围，只要于0～80℃保存，并且满足前述规定的条件即可。
含有碘、吡啶及水的氧化溶液中的碘的浓度通常被调整为0.005～2M、优选0.005～0.2M、更优选0.007～0.1M、进一步优选0.008～0.07M。
前述氧化溶液典型地由碘、水及吡啶配制，也可以在该氧化溶液中混合选自由乙腈及四氢呋喃(THF)组成的组中的至少1者的溶剂而使用。
相对于溶液的总体积而言，氧化溶液的溶剂是例如以吡啶1～90、水1～50、乙腈0～90、四氢呋喃0～90的体积比率进行混合而得到的，优选为以吡啶5～90、水2～30、乙腈0～80、四氢呋喃0～80的体积比率进行混合而得到的混合溶剂。在配制氧化溶液时，反应体系的搅拌不是必须的，但通常以搅拌动力Pv为0.0～0.5kW/m3的范围进行搅拌，优选Pv为0.1～0.3kW/m3的搅拌。
如前述所配制的氧化溶液也能够就碘的浓度而言以高于在氧化反应中使用时的浓度进行配制并保存。该高浓度的氧化溶液也可以在使用时通过用前述溶剂稀释来调整为最终所期望的浓度而使用。
亚磷酸三酯键的氧化反应中，前述氧化溶液也可以进一步加入选自由N-甲基咪唑(NMI)、N-甲基吗啉、二甲基吡啶及三乙胺组成的组中的至少一种的化合物。或者也可以添加碘化钾等碘化物。
氧化溶液的保存能够使用玻璃制容器、塑料制容器、或金属制容器。作为塑料制容器，能够使用聚乙烯或聚丙烯制等容器，作为金属制容器，能够使用SUS制容器或哈氏合金制等容器。
能够在空气气氛下或非活性气体气氛下保存氧化溶液，作为非活性气体，能够使用氩气、氮气、二氧化碳或氦气等。
作为含亚磷酸(亚磷酸盐)三酯键的化合物，可例示出前述式(4)的化合物。作为使氧化溶液发挥作用而生成的核酸化合物，可例示出前述式(5)所示的核酸化合物。
式(4)及式(5)中，作为Q’所表示的、相同或彼此不同且各自独立地表示与核糖的4’位的碳原子键合的亚甲基、与4’位的碳原子键合的亚乙基、或与4’位的碳原子键合的乙叉基的化合物，具体而言，表示下式(8)的结构。
[化学式10]
Figure BDA0003770296790000111
(式中，Ba表示可被保护的核酸碱基)
作为Z所示的、由固相载体、及将固相载体与核酸寡聚物的3’末端的核糖的2’位或3’位的羟基的氧原子连接的连接部形成的基团，更具体而言，Z表示下式(9)所示的结构，
[化学式11]
Figure BDA0003770296790000112
式(9)中，Sp表示间隔基。
作为间隔基(Sp)，例如可例示出具有下式(10)中示出的结构式的基团。
[化学式12]
Figure BDA0003770296790000113
Linker例如可以为下式(11)中示出的结构，或者也可以为式(11)的结构中不具有六亚甲基氨基(hexamethylene amino group)部分的结构、氨基丙基键合于Si的结构。或者，Linker也可以为下式(15)所示的结构。
[化学式13]
Figure BDA0003770296790000121
(式中，
A可以为羟基、烷氧基、或烷基中的任一者。作为烷氧基，例如可举出甲氧基及乙氧基。作为烷基，例如可举出甲基、乙基、异丙基、正丙基。表示Si与载体表面的羟基的氧键合)
作为固相载体(Solid support)，可举出无机多孔载体、有机系树脂载体等。对于无机多孔载体，例如可举出可控多孔玻璃(Controlled Pore Glass(CPG))。对于有机系树脂载体，例如可举出由聚苯乙烯形成的载体。
作为本发明中使用的核酸寡聚物内所含的核苷(核糖及脱氧核糖)，可例示出DNA、RNA、2’-O-MOE(2’-O-甲氧基乙基)、2’-O-Me、2’-F RNA及前述的LNA，但前述核苷不限定于此。
利用包括前述基于氧化溶液的氧化工序的固相合成法进行的核酸寡聚物的合成方法典型地包括以下的工序。
(1)对介由接头与固相载体键合的羟基被保护的核苷的5’位的羟基进行去保护的工序；
(2)使前述工序中生成的5’位的羟基与亚磷酰胺化合物进行偶联反应，从而得到亚磷酸三酯化合物的工序；
(3)将前述工序中生成的亚磷酸三酯氧化转化成磷酸三酯键而制造延伸的核酸分子的工序，或者转化成硫代磷酸三酯的任意工序；
(4)反复进行任意次数前述工序(1)～(3)、即由生成的核酸分子的5’位的羟基的去保护工序、5’位的羟基与酰胺化合物的偶联工序、以及生成的亚磷酸三酯的氧化工序所构成的一系列的反应的循环，从而在固相载体上合成核酸分子的工序；以及
(5)将在工序(4)中生成的固相载体上的核酸分子供于切出及去保护的工序，使其自固相载体游离，从而制造保护基被除去的核酸寡聚物的工序。
其中，前述核酸寡聚物的合成方法中，在工序(2)或(3)之后，可以包括对未进行与亚磷酰胺化合物的偶联反应的5’位的羟基进行加帽(capping)的工序，也可以在构成工序(4)的一系列的反应的循环的任何工序之间附加加帽工序。
对于前述(5)的工序，更具体而言，通过将工序(4)中生成的固相载体上的核酸分子以以下的工序(5-1)及(5-2)的反应的顺序实施，接着供于工序(5-3)的反应来实施。此处，工序(5-1)的反应的实施也可以是任意的，工序(5-2)的反应的实施也可以使用日本专利第4705716号公报中记载的方法。其结果，能够由自固相载体游离的核酸分子制造保护基被除去的核酸寡聚物、或5’末端的羟基被保护的核酸寡聚物。
(5-1)对核酸分子的5’末端的羟基的保护基进行去保护的反应；
(5-2)将核酸分子从固相载体切出并使其游离的反应；以及
(5-3)对构成核酸分子的核糖的2’位或3’末端的羟基的3’位的羟基的保护基进行去保护的反应。
图1中示出前述工序(1)至(6)的路线。图1所示的工序(3)或工序(4)中的氧化反应使用前述的氧化溶液来实施。路线A中的化学式中的取代基的定义与前述定义相同。
式(5)的核酸化合物能够进一步利用酰胺法使用核苷酸型或非核苷酸型的接头仅延伸任意的链长，并用于前述式(5’)所示的核酸化合物的制造。从与前述式(5’)的固相载体键合的核酸化合物仅切出核酸化合物，得到前述式(6)所示的核酸寡聚物之后，进而进行去保护，能够得到前述式(7)所示的核酸寡聚物。以下，针对各式中的取代基进行进一步详细说明。
Ba所示的可被保护基保护的核酸碱基没有特别限定。作为该核酸碱基，可举出腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶等。另外，核酸碱基也可以利用取代基进行取代。作为这样的取代基，例如可举出氟基、氯基、溴基、碘基这样的卤原子、乙酰基这样的酰基、甲基、乙基这样的烷基、苄基这样的芳烷基、甲氧基这样的烷氧基、甲氧基乙基这样的烷氧基烷基、氰基乙基这样的氰烷基、羟基、羟基烷基、酰氧基甲基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基及硝基等、以及上述中的2种以上的取代基的组合。
核酸碱基在环外具有氨基的情况下，作为该氨基的保护基，没有特别限定，能够使用已知的核酸化学中使用的保护基，作为这样的保护基，例如可举出苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基及(二甲基氨基)亚甲基等、以及上述中的2种以上的保护基的组合。
更具体而言，Ba表示下式中任一者所示的基团。
[化学式14]
Figure BDA0003770296790000141
(上式中，
R4表示氢原子、甲基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、苯乙酰基、乙酰基或苯甲酰基，
R5表示氢原子、乙酰基、异丁酰基或苯甲酰基，
R6表示氢原子、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、苯乙酰基、乙酰基或异丁酰基，
R7表示2-氰基乙基，
R8表示氢原子、甲基、苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基或4-甲基苯甲酰基，并且，
R9表示二甲基氨基亚甲基)
作为G1，只要能够作为保护基发挥功能，则能够没有特别限制地使用，能够广泛使用酰胺化合物中使用的已知的保护基。
G1优选以下基团。
[化学式15]
Figure BDA0003770296790000151
(式中，R1、R2及R3相同或彼此不同，各自独立地表示氢或烷氧基)
R1、R2及R3优选1个为氢、剩余的2个为相同或彼此不同(优选相同)的烷氧基，作为烷氧基，特别优选甲氧基。
作为G2，只要能够作为保护基发挥功能，则能够没有特别限制地使用，能够广泛使用酰胺化合物中使用的已知的保护基。作为G2，例如可举出烷基、链烯基、炔基、环烷基、卤代烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟基烷基、氨基烷基、烷氧基烷基、杂环基链烯基、杂环基烷基、杂芳烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、单烷基甲硅烷基、二烷基甲硅烷基或三烷基甲硅烷基、单烷基甲硅烷氧基烷基、二烷基甲硅烷氧基烷基或三烷基甲硅烷氧基烷基等，它们可被1个以上的吸电子基团取代。
G2优选为已被吸电子基团取代的烷基。作为该吸电子基团，例如可举出氰基、硝基、烷基磺酰基、卤原子、芳基磺酰基、三卤代甲基、三烷基氨基等，优选氰基。
作为G2，特别优选以下基团。
[化学式16]
Figure BDA0003770296790000161
对G3而言，可以2个G3彼此键合而形成环状结构。作为G3，优选两者为异丙基。
前述R1、R2、R3及G2的定义中的烷基可以为直链状或支链状中的任一种，优选为碳原子数为1～12的烷基，更优选为碳原子数为1～6的烷基。作为具体的烷基的例子，例如可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基及己基。前述取代基的定义中的构成烷氧基的烷基部分具有与此处的烷基的定义相同的定义。
另外，本发明的方法中，酰胺化合物能够以游离的状态或盐的状态来使用。作为酰胺化合物的盐，可举出碱加成盐或酸加成盐，但没有特别限制。作为碱加成盐，具体而言，可举出钠盐、镁盐、钾盐、钙盐、铝盐等与无机碱形成的盐；与甲胺、乙胺、乙醇胺等有机碱形成的盐；与赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸等碱性氨基酸形成的盐；及铵盐。作为酸加成盐，具体而言，可举出与盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸；甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、苹果酸、酒石酸、富马酸、琥珀酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、乙磺酸等有机酸；及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸形成的酸加成盐。酰胺化合物也包括盐、水合物、溶剂合物、多晶型等形态。
R表示被保护的羟基时，其保护基只要在酰胺法中能够使用即可，例如2’-叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS基)、2’-双(2-乙酰氧基)甲基(ACE基)、2’-(三异丙基甲硅烷氧基)甲基(TOM基)、2’-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE基)、2’-(2-氰基乙氧基)甲基(CEM基)、2’-对甲苯磺酰基乙氧基甲基(TEM基)、2’-EMM基(国际公开2006/022323号)，此外，能够使用国际公开第2013/027843号及国际公开第2019/208571号中记载的基团。这些核糖核苷(RNA)的2’保护基中，可例示出前述式(12)所示的保护基作为优选保护基。进一步优选例示出具有氰基作为EW所示的吸电子基团的式(13)所示的保护基。
[化学式17]
Figure BDA0003770296790000171
(式(13)中，
q、Ra及Rb与前述式(12)中的定义相同。其中，Ra及Rb不同时表示氢原子)
式(13)所示的保护基能够依照例如国际公开第2013/027843号及国际公开第2019/208571号中的记载来合成，能够将具有该保护基的酰胺化合物用于核酸化合物的制造。
核酸的延伸反应中，使用图1的路线A中记载的式(3)的酰胺化合物。
作为非核苷酸接头，可例示出包含氨基酸骨架的接头(例如，日本专利第5157168号公报或日本专利第5554881号公报中记载的包含氨基酸骨架的接头)。具体而言，作为非限定的例子，例如可例示出式(A14-1)或(A14-2)或(A14-3)(例如，WO2019/074110中记载)所表示的接头。除这些接头以外，可例示出WO2012/005368、WO2018/182008或WO2019/074110中记载的接头。
[化学式18]
Figure BDA0003770296790000181
式(3)中的R基及式(4)中的R’基为除羟基以外的取代基的核苷酸及酰胺也能够从利用日本专利第3745226号公报等中记载的已知的方法、WO2001/053528号公报或日本特开2014-221817号公报及它们引用的已知的方法合成的核苷进行制造，此外，能够使用可作为市售品购入的物质，基于后述的实施例中记载的方法或利用对这些方法加以适当变更的方法进行制造。
对利用前述工序(1)至(6)的酰胺法进行的核酸化合物的合成而言，除图1的路线中的工序(3)中的本发明涉及的氧化反应工序以外，能够依照通常已知的方法(例如，前述日本专利第5157168号公报或日本专利第5554881号公报中记载的方法)，通过反复进行去保护工序、缩合工序中的各工序来进行核酸延伸反应。以下，针对各工序进行说明。
G4表示氢原子、碱金属离子、铵离子、烷基铵离子、或羟基烷基铵离子。作为碱金属离子，例如可举出钠离子及锂离子。另外，作为烷基铵离子，作为具体的烷基的例子，例如可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基及己基，更具体而言，例如可举出二乙基铵离子、三乙基铵离子、四丁基铵离子、己基铵离子及二丁基铵离子等。另外，作为羟基烷基铵离子，作为具体的羟基烷基部分的例子，例如可举出羟基甲基、羟基乙基、羟基正丙基、羟基异丙基、羟基正丁基、三羟基甲基，作为更具体的羟基烷基铵离子的例子，可举出三羟基甲基铵离子等。
G5表示氢原子、或保护基，在表示保护基的情况下表示与G1相同的保护基。G5在被去保护的情况下为氢原子，该情况下的核苷酸化合物也供于一系列的核酸延伸反应的工序。
(核酸延伸反应)
本说明书中，“核酸延伸反应”是指通过介由磷酸二酯键使核苷酸依次键合，从而使寡核苷酸延伸的反应。核酸延伸反应能够依照通常的亚磷酰胺法的步骤进行。核酸延伸反应也可以使用采用亚磷酰胺法的核酸自动合成装置等进行。
核酸寡聚物的链长例如可以为2～200mer、10～150mer、15～110mer。
工序(1)的5’去保护工序为对担载于固相载体上的RNA链末端的5’羟基的保护基进行去保护的工序。作为通常的保护基，可使用4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr基)、4-单甲氧基三苯甲基、4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基。去保护能够使用酸来进行。作为去保护用的酸，例如可举出三氟乙酸、二氯乙酸、三氟甲磺酸、三氯乙酸、甲磺酸、盐酸、乙酸、对甲苯磺酸等。
工序(2)的缩合工序为使图1的路线A中记载的下式(3)所示的核苷亚磷酰胺与利用前述去保护工序进行了去保护的寡核苷酸链末端的5’羟基键合的反应。需要说明的是，作为核酸延伸中使用的亚磷酰胺，使用式(3)或(A12)所示的酰胺化合物。另外，作为其他可使用的亚磷酰胺，可举出2’-OMe、2’-F、2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基，2’-O-甲氧基乙基，2’-H,2’-氟-2’-脱氧-β-D-阿糖呋喃基等。作为前述核苷亚磷酰胺，使用5’羟基被保护基(例如DMTr基)保护的核苷亚磷酰胺。缩合工序能够使用激活前述核苷亚磷酰胺的激活剂而进行。作为激活剂，例如可举出5-苄硫基-1H-四氮唑(BTT)、1H-四氮唑、4,5-二氰基咪唑(DCI)、5-乙硫基-1H-四氮唑(ETT)、N-甲基苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(N-MeBIT)、苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(BIT)、N-苯基咪唑鎓三氟甲磺酸盐(N-PhIMT)、咪唑鎓三氟甲磺酸盐(IMT)、5-硝基苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(NBT)、1-羟基苯并三唑(HOBT)或5-(双-3,5-三氟甲基苯基)-1H-四氮唑等。
图1的路线A中记载的式(3)所示的核苷亚磷酰胺(以下称作酰胺)所指如下。
式(3)所示的化合物。
[化学式19]
Figure BDA0003770296790000201
(式(3)中，
G1、G2、G3、Ba及R与前述相同)
在缩合工序之后，也可以适当对未反应的5’羟基进行加帽。加帽能够使用乙酸酐-四氢呋喃溶液、苯氧乙酸酐/N-甲基咪唑溶液等已知的加帽溶液而进行。
工序(3)的氧化工序为将利用前述缩合工序而形成的亚磷酸基转化成磷酸基或硫代磷酸基的工序。本工序为使用氧化剂将三价磷转化成五价磷的反应，能够通过使氧化剂作用于担载于固相载体的寡核酸衍生物来实施。
在将亚磷酸基转化成磷酸基的情况下，作为“氧化剂”，例如能够使用碘。该氧化剂能够以成为0.005～2M的浓度的方式进行配制而使用。作为氧化的氧源，能够使用水，作为使反应进行的碱，能够使用吡啶、N-甲基咪唑(NMI)、N-甲基吗啉、三乙胺。另外，作为溶剂，只要不参与反应，则没有特别限定，能够使用乙腈、四氢呋喃(THF)、或将它们以任意的比例进行混合而使用。例如能够使用碘/水/吡啶/乙腈、或碘/水/吡啶或碘/水/吡啶/NMI、或碘/水/吡啶/THF。反应温度优选为5℃～50℃。反应时间通常适宜为1分钟～30分钟。相对于担载于固相载体的化合物1mol，使用的试剂的量优选为1～100mol，更优选为1～10mol。
在将亚磷酸三酯基转化成硫代磷酸基的情况下，作为“氧化剂”，例如能够使用硫、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物(Beaucage试剂)、3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(ADTT)、5-苯基-3H-1,2,4-二噻唑-3-酮(POS)、[(N,N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑啉-3-硫酮([(N,N-Dimethylaminomethylidene)amino]-3H-1,2,4-dithiazoline-3-thione)(DDTT)及苯乙酰二硫化物(PADS)。该氧化剂能够以成为0.001～2M的浓度的方式用适宜的溶剂进行稀释而使用。作为反应中使用的溶剂，只要不参与反应，则没有特别限定，例如可举出二氯甲烷、乙腈、吡啶或它们的任意的混合溶剂。氧化工序可以在前述加帽操作之后进行，反之也可以在氧化工序之后进行加帽操作，该顺序没有限定。
工序(5)中，对磷酸保护基进行去保护的工序为，在具有所期望的序列的核酸的合成完成后，使胺化合物发挥作用，以对磷酸部分的保护基进行去保护。作为胺化合物，例如可举出日本专利第4705716号公报中记载的二乙胺等。
对于在延伸的最后引入的核苷的5’羟基的保护基而言，可以在后述从固相载体切出及保护基的去保护之后，出于以5’保护基为标签的柱纯化的目的而使用，也可以在柱纯化后对5’羟基的保护基进行去保护。
就工序(5)中的在固相载体上延伸了所期望的链长的核酸寡聚物从固相载体的切出而言，通常使用浓氨水作为切出剂来实施。
进一步使用氨水或胺化合物等，例如从固相载体切断寡核苷酸链并回收。作为胺化合物，例如可举出甲胺、乙胺、异丙胺、乙二胺、二乙胺等。
工序(6)中，工序(5)中从固相载体切出的核酸化合物(6)的核糖的2位或3位的羟基的保护基能够依照国际公开2006/022323号)、国际公开第2013/027843号、或国际公开第2019/208571号中记载的方法来去除，从而能够得到经去保护的核酸寡聚物(7)。
作为可使用本发明的制造方法制造的核酸寡聚物，可举出核酸寡聚物内所含的核苷为RNA、DNA、以及具有2’-O-MOE、2’-O-Me、2’-F的RNA、及LNA的核酸寡聚物，但不限定于此。例如可举出Xiulong,Shen等著、Nucleic Acids Research,2018,Vol.46,No.46,1584-1600、及Daniel O'Reilly等著、Nucleic Acids Research,2019,Vol.47,No.2,546-558中记载的各种各样的核苷的例子。
对于在本发明的制造方法中可使用的核酸寡聚物的典型的例子，除了实施例中记载的例子以外，还示出了下述例子，但不限定于此。
以下，序列的说明中，U表示尿苷，C表示胞苷，A表示腺苷，或G表示鸟苷。
可举出国际公开第2019/060442号中记载的具有下述序列(B)及(C)的核酸寡聚物。
序列(B)：5’-AUGGAAUmACUCUUGGUUmACdTdT-3’(反义)(序列号3)21mer
序列(C)：5’-GUmAACmCmAAGAGUmAUmUmCmCmAUmdTdT-3’(正义)(序列号4)21mer
序列(B)及(C)中，Um表示2'-O-甲基尿苷，Cm表示2'-O-甲基胞苷，且dT表示胸苷。
可举出Daniel O'Reilly等著、Nucleic Acids Research,2019,Vol.47,No.2,546-558中记载的核酸寡聚物(参见553页)。作为典型例，可举出具有下述序列(D)的核酸寡聚物。
序列(D)：5’-AGAGCCAGCCUUCUUAUUGUUUUAGAGCUAUGCUGU-3’(序列号5)36mer
可举出JP4965745中记载的核酸寡聚物。作为典型例，可举出具有下述序列(E)的核酸寡聚物。
序列(E)：5’-CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-P-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU-3’49mer。CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC(序列号6)、GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU(序列号7)。
序列(E)中，“P”由在以下式(A5)中用波浪线划分的局部结构表示。
可举出Nucleic Acids Research,2019,Vol.47,No.2:547中记载的具有下述序列(F)的核酸寡聚物。
序列(F)：5’-ACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3’(序列号8)67mer
可举出JP 2015-523856,173中记载的具有下述序列(G)的核酸寡聚物。
序列(E)：5’-GUUUUCCCUUUUCAAAGAAAUCUCCUGGGCACCUAUCUUCUUAGGUGCCCUCCCUUGUUUAAACCUGACCAGUUAACCGGCUGGUUAGGUUUUU-3’(序列号9)94mer
可举出JP 2017-537626中记载的核酸寡聚物。作为典型例，可举出具有下述序列(F)(G)(H)(J)的核酸寡聚物。
序列(F)：5’-AGUCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUUAGAGCUAGUAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’(序列号10)100mer
序列(G)：5’-GCAGAUGUAGUGUUUCCACAGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU-3’(序列号11)113mer
序列(H)：5’-dAdGdTdCdCdTdCdAdTdCdTdCdCdCdTdCdAdAdGdCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU-3’(序列号12)113mer
序列(H)中，dT表示胸苷，dC表示2'-脱氧胞苷，dA表示2'-脱氧腺苷，且dG表示2'-脱氧鸟苷。
序列(J)：5’-AmsGmsUmsCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUmsUmsUmsU-3’(序列号13)113mer
序列(J)中，Um表示2'-O-甲基尿苷，Am表示2'-O-甲基腺苷，Gm表示2'-O-甲基鸟苷，且s表示硫代磷酸修饰。
实施例
以下，利用实施例进一步详细地说明本发明，但本发明不限定于此。
＜测定方法＞
首先，在以下的试验中使用的各种测定方法如下所示。
寡核苷酸纯度使用HPLC进行测定。
将HPLC测定条件示于下述表1。
(测定方法1：寡核苷酸纯度的测定)
[表1]
Figure BDA0003770296790000241
(测定方法2：寡核苷酸收量的测定)
测定前述粗产物的OD260。OD260表示1mL溶液(pH＝7.5)中每10mm光程的UV260nm的吸光度。通常，已知RNA中1OD＝40μg，因此基于前述OD260的测定值计算收量。
(测定方法3：碘酸浓度的测定)
碘酸的测定利用离子色谱法进行。与标准品(NaIO3)进行比较并计算浓度。将离子色谱法的测定条件示于下述表2。
[表2]
色谱柱 IONPac AS18 4mm×250mm
流速 0.8mL/min
检测器 电导检测器
洗脱液 KOH
梯度条件 5mM(0min)-5mM(8min)-60mM(8.1min)-60mM(25min)
抑制器 ASRS500 4mm 149mA
柱温 30℃
(测定方法4：碘浓度的测定)
碘的测定利用离子色谱法进行。与标准品(I2)进行比较并计算浓度。将离子色谱法的测定条件示于下述表3。
[表3]
色谱柱 IONPac AS11-HC 4mm×250mm
流速 0.8mL/min
检测器 电导检测
洗脱液 KOH
梯度条件 60mM等度
抑制器 ASRS500 4mm 119mA
柱温 30℃
<寡核苷酸的固相合成>
序列(I)：5’-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G-3’(序列号1、2)53mer
前述序列(I)中，“A”由在以下式(A1)中用波浪线划分的局部结构表示。“C”由在以下式(A2)中用波浪线划分的局部结构表示。“G”由在以下式(A3)中用波浪线划分的局部结构表示。“U”由在以下式(A4)中用波浪线划分的局部结构表示。“P”由在以下式(A5)中用波浪线划分的局部结构表示。需要说明的是，5’末端的“A”由在以下式(A6)中用波浪线划分的局部结构表示。另外，3’末端的“G”由在以下式(A7)中用波浪线划分的局部结构表示。
AGCAGAGUAC ACACAGCAUA UACC(序列号1)
GGUAUAUGCU GUGUGUACUC UGCUUC(序列号2)
[化学式20]
Figure BDA0003770296790000261
[化学式21]
Figure BDA0003770296790000262
[化学式22]
Figure BDA0003770296790000263
[化学式23]
Figure BDA0003770296790000271
[化学式24]
Figure BDA0003770296790000272
[化学式25]
Figure BDA0003770296790000273
[化学式26]
Figure BDA0003770296790000281
作为固相载体，使用可控多孔玻璃(CPG)，作为核酸合成仪，使用NTS M-4MX-E(Nihon Techno Service公司制)或AKTA oligopilot plus100(GE Healthcare公司制)，利用亚磷酰胺固相合成法。从3’端向5’端合成由上述序列(I)组成的寡核苷酸。对合成而言，在使用NTS M-4MX-E(Nihon Techno Service公司制)的情况下以约1μmol规模实施，在使用AKTA oligopilot plus100(GE Healthcare公司制)的情况下以约80μmol规模实施。另外，合成中使用US2012/0035246的实施例2中记载的尿苷EMM酰胺、实施例3中记载的胞苷EMM酰胺、实施例4中记载的腺苷EMM酰胺、实施例5中记载的鸟苷EMM酰胺及WO2017/188042中记载的化合物(3)，使用高纯度三氯乙酸甲苯溶液作为去保护(deblocking)溶液，使用5-苄巯基-1H-四氮唑作为缩合剂，使用碘溶液作为氧化剂，使用苯氧基乙酸酐溶液和N-甲基咪唑溶液作为加帽溶液。
[化学式27]
Figure BDA0003770296790000282
[化学式28]
Figure BDA0003770296790000291
[化学式29]
Figure BDA0003770296790000292
[化学式30]
Figure BDA0003770296790000293
[化学式31]
Figure BDA0003770296790000294
接着，示出利用本发明的制法制造的核酸寡聚物的具体的制造例。此处，下述实施例中利用本发明的制法制造的寡核苷酸为具有前述序列号1及2所示的序列(I)的核酸寡聚物。
另外，以下实施例及比较例中记载的鸟苷衍生物是指下述结构式所示的化合物。下述结构式中图示的圆圈示意性地示出了CPG。
[化学式32]
Figure BDA0003770296790000301
(实施例1)
使用担载了1.08μmol的鸟苷衍生物的可控多孔玻璃(CPG)和式(A8)、式(A9)、式(A10)、式(A11)、或式(A12)中示出的酰胺，利用NTS M-4MX-E(Nihon Techno Service公司制)从3’端向5’端自动合成序列(I)中示出的核酸寡聚物。对自动合成的步骤而言，首先，将3％三氯乙酸甲苯溶液以每次1.4mL送液至CPG，对5’位的三苯甲基保护基进行去保护，然后，将各种酰胺0.3mL和作为缩合剂的5-苄巯基-1H-四氮唑各0.4mL分量送液至CPG，与5’位的羟基进行偶联反应。接着，将配制了含11mM碘的乙腈：水：吡啶＝58.2:34.4:7.2(重量％)的溶液后于25℃保存2年的前述溶液以0.7mL进行送液，将亚磷酸基转化成磷酸基。用于核酸合成时的氧化溶液中的碘的摩尔浓度能够利用测定方法4进行测定，其浓度为11mM，碘酸浓度能够利用测定方法3进行测定，其浓度为0.029mM。即，用于合成时的氧化溶液中的碘酸的摩尔浓度相对于碘的摩尔浓度而言的比为2.6×10-3。然后，使用0.1M苯氧基乙酸酐乙腈溶液0.5mL和10％N-甲基咪唑/10％2,6-二甲基吡啶乙腈溶液0.5mL作为加帽溶液，在未进行偶联的反应点实施加帽。进一步将这些工序共计反复52次，在CPG载体上合成序列(I)所示的序列的核酸寡核苷酸后，以3％三氯乙酸甲苯溶液对5’位的三苯甲基保护基进行去保护。然后，对担载了全部量的寡核苷酸的CPG载体使用752μL的氨水和252μL的乙醇，使核酸寡聚物自固相载体游离后，利用氮吹除去氨水和乙醇。接着，将游离寡核苷酸溶解于400μL的二甲基亚砜后，加入硝基甲烷5.3μL和搅拌子后，在基于搅拌器的搅拌下于30℃流入以分子筛4A实施了脱水处理的1M的四正丁基氟化铵(TBAF)的二甲基亚砜溶液530μL(相对于每1摩尔保护基而言，TBAF的量为10.2mol)，通过对混合物进行4小时保温来进行2’-EMM保护基的去保护。利用沉淀操作得到核酸寡聚物。利用测定方法2进行测定的结果，收量为9.1mg，利用测定方法1进行测定的结果，纯度为61％。
(实施例2)
实施例1的实验中，设为使用担载了78.20μmol的鸟苷衍生物的可控多孔玻璃(CPG)的规模，使用AKTA oligopilot plus100(GE Healthcare公司制)，使用表2中记载的溶液作为含碘的氧化溶液，以及核酸合成操作结束后，采集担载了20.13μmol分量的寡核苷酸的CPG载体，使用7.5mL的氨水和2.5mL的乙醇，使核酸寡聚物自固相载体游离后，通过基于蒸发器的浓缩除去氨水和乙醇，接着，将游离寡核苷酸溶解于8.0mL的二甲基亚砜后，加入硝基甲烷106μL和搅拌子后，使用以分子筛4A实施了脱水处理的1M的四正丁基氟化铵(TBAF)的二甲基亚砜溶液10.6mL(相对于每1摩尔保护基而言，TBAF的量为10.2mol)，除上述以外，以同样的方法得到序列(I)的核酸寡聚物。收量为170.5mg，纯度为60％。
(实施例3)
实施例1的实验中，使用担载了1.10μmol的鸟苷衍生物的可控多孔玻璃(CPG)，使用表2中记载的溶液作为含碘的氧化溶液，除上述以外，以同样的方法得到序列(I)的核酸寡聚物。收量为8.4mg，纯度为60％。
(实施例4)
实施例2的实验中，使用下述表中记载的溶液作为氧化溶液，设为使用担载了78.20μmol的鸟苷衍生物的可控多孔玻璃(CPG)的规模，使用表2中记载的氧化溶液作为含碘的氧化溶液，以及核酸合成操作结束后，采集担载了20.16μmol分量的寡核苷酸的CPG载体，除上述以外，以同样的方法得到序列(I)的核酸寡聚物。收量为180.0mg，纯度为59％。
(实施例5)
实施例1的方法中，使用担载了1.06μmol的鸟苷衍生物的可控多孔玻璃(CPG)、和表2中记载的含碘的氧化溶液，除上述以外，以同样的方法得到序列(I)的核酸寡聚物。收量为9.1mg，纯度为56％。
(实施例6)
实施例2的方法中，使用表2中记载的氧化溶液作为含碘的氧化溶液，以及核酸合成操作结束后，采集担载了20.20μmol分量的寡核苷酸的CPG载体，除上述以外，以同样的方法得到序列(I)的核酸寡聚物。收量为154.8mg，纯度为57％。
(实施例7)
实施例1的方法中，使用担载了1.09μmol的鸟苷衍生物的可控多孔玻璃(CPG)、和表2中记载的氧化溶液，除上述以外，以同样的方法得到序列(I)的核酸寡聚物。利用沉淀操作得到粗产物。收量为9.2mg，纯度为49％。
(实施例8)
实施例1的方法中，使用担载了1.04μmol的鸟苷衍生物的可控多孔玻璃(CPG)、和表2中记载的氧化溶液，除上述以外，以同样的方法得到序列(I)的核酸寡核苷酸。收量为7.7mg，纯度为46％。
(实施例9)
实施例1的方法中，使用担载了1.00μmol的鸟苷衍生物的可控多孔玻璃(CPG)、和表2中记载的氧化溶液，除上述以外，以同样的方法得到序列(I)的核酸寡聚物。收量为7.9mg，纯度为42％。
参考例1
实施例1的方法中，使用担载了1.04μmol的鸟苷衍生物的可控多孔玻璃(CPG)、和表2中记载的氧化溶液，除上述以外，以同样的方法得到序列(I)的核酸寡聚物。收量为7.8mg，纯度为35％。
将实施例1～9及参考例1的结果示于表4。
[表4]
Figure BDA0003770296790000331
根据上述表的结果，与使用参考例1的氧化溶液的情况相比，在使用一定的比率的碘酸相对于碘的摩尔比率为30×10-3以下的本发明的氧化溶液的情况下，可得到高纯度的核酸寡聚物。
工业上的可利用性
本发明提供高效的核酸寡聚物的制造方法。另外，能够期待依照核酸寡聚物的制造方法制造的核酸寡聚物的纯度提高。
[序列表自由文本]
序列表的序列号1～13表示依照本发明的制造方法制造的寡核苷酸的碱基序列。
Figure IDA0003770296870000011
Figure IDA0003770296870000021
Figure IDA0003770296870000031
Figure IDA0003770296870000041
Figure IDA0003770296870000051

Claims (27)

1.制造方法，其为在5’末端具有式(I)所示的核苷酸的核酸化合物的、基于亚磷酰胺法的制造方法，所述制造方法包括使在5’末端具有式(II)所示的亚磷酸三酯键的前体、与含有碘、吡啶及水且碘酸与碘的摩尔比(碘酸mol/碘mol)为30×10-3以下的氧化溶液进行反应的工序，
[化学式1]
Figure FDA0003770296780000011
式(I)中，
G1及G2各自独立地表示羟基的保护基，Ba表示可被保护基保护的核酸碱基，
R表示被保护的羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基、或OQ’基，
Q’表示与核糖的4’位的碳原子键合的亚甲基、与4’位的碳原子键合的亚乙基、或与4’位的碳原子键合的乙叉基，并且，
带＊的键表示朝向核酸的3’末端侧的键；
[化学式2]
Figure FDA0003770296780000012
式(II)中，
G1、G2、Ba、R及＊与前述定义相同。
2.如权利要求1所述的制造方法，其中，具有亚磷酸三酯键的前体为式(4)所示的化合物，具有磷酸三酯键的化合物为式(5)所示的核酸化合物，
[化学式3]
Figure FDA0003770296780000021
式(4)中，
G1表示羟基的保护基，
G2相同或彼此不同，各自独立地表示羟基的保护基，
Ba相同或彼此不同，各自独立地表示可被保护基保护的核酸碱基，
R相同或彼此不同，各自独立地表示被保护的羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基、或OQ’基，
Q’相同或彼此不同，各自独立地表示与核糖的4’位的碳原子键合的亚甲基、与4’位的碳原子键合的亚乙基、或与4’位的碳原子键合的乙叉基，
Y相同或彼此不同，各自独立地表示氧原子或硫原子，
n表示1以上至200的任一整数，
当X表示OZ时，W表示OV基，V表示羟基的保护基，
当X表示R基时，W表示OZ所表示的基团，
Z为具有由固相载体及连接基团组成的结构的基团，
并且，n为2以上的整数时，式(4)所示的核酸化合物也可以组入非核苷酸接头来代替各5’末端和3’末端的核苷酸之间的至少1个的核苷酸；
[化学式4]
Figure FDA0003770296780000031
式(5)中，
G1、G2、Ba、R、n、W、X及Y与前述相同，并且，
与式(4)中的定义相同，也可以组入非核苷酸接头来代替核苷酸。
3.如权利要求2所述的核酸寡聚物的制造方法，其还包括以下工序：
得到利用酰胺法将式(5)的核酸化合物任意延伸了链长的式(5’)所示的核酸化合物的工序；
从式(5’)的化合物切出式(6)所示的化合物，进一步对式(6)的化合物进行去保护来制造式(7)所示的经去保护的核酸寡聚物的工序，
[化学式5]
Figure FDA0003770296780000032
式(5’)中，
G2、Ba、R、X及W与式(5)中的定义相同，
G5表示羟基的保护基、或氢原子，
m为满足m≥n的整数，并且，
Y各自独立地表示氧或硫，
其中，至少1个Y为氧原子；
[化学式6]
Figure FDA0003770296780000041
式(6)中，
G5、R及m与前述相同，
Bc相同或彼此不同，各自独立地表示核酸碱基，
G4表示氢原子、碱金属离子、铵离子、烷基铵离子、或羟基烷基铵离子，
Y各自独立地表示氧或硫，且至少1个为氧原子，并且，
X1表示羟基，且W1表示OV基，此处V表示羟基的保护基，或者，
X1表示R基，且W1表示羟基；
[化学式7]
Figure FDA0003770296780000042
式(7)中，
m、Y、G4及Bc与前述定义相同，
R’相同或彼此不同，各自独立地表示羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基、或OQ’基，
Q’相同或彼此不同，各自独立地表示与核糖的4’位的碳原子键合的亚甲基、与4’位的碳原子键合的亚乙基、或与4’位的碳原子键合的乙叉基，
并且，
X10及W10分别各自独立地表示羟基，或者，
X10表示R’基，且W10表示羟基。
4.如权利要求2或3中任一项所述的制造方法，其中，非核苷酸接头为包含氨基酸骨架的接头。
5.如权利要求4所述的制造方法，其中，包含氨基酸骨架的接头为具有选自由下式(A14-1)、(A14-2)及(A14-3)组成的组中的结构的接头。
[化学式8]
Figure FDA0003770296780000051
6.如权利要求1～5中任一项所述的制造方法，其中，氧化溶液的碘的浓度为0.005～2M。
7.如权利要求1～5中任一项所述的制造方法，其中，氧化溶液的碘的浓度为0.005～0.2M。
8.如权利要求1～5中任一项所述的制造方法，其中，氧化溶液的碘的浓度为0.007～0.1M。
9.如权利要求1～5中任一项所述的制造方法，其中，氧化溶液的碘的浓度为0.008～0.07M。
10.如权利要求1～9中任一项所述的制造方法，其中，氧化溶液是将碘、吡啶及水进行混合而配制的。
11.如权利要求10所述的制造方法，其中，氧化溶液为还含有选自由乙腈及四氢呋喃组成的组中的至少1种的溶剂的氧化溶液。
12.如权利要求10或11所述的制造方法，其中，氧化溶液为还含有乙腈溶剂的氧化溶液。
13.如权利要求11所述的制造方法，其中，氧化溶液的溶剂为将吡啶、水、乙腈及四氢呋喃以1～90:1～50:0～90:0～90的体积比率进行混合而得的混合溶剂。
14.如权利要求11或12所述的制造方法，其中，氧化溶液的溶剂为将吡啶、水及乙腈以1～90:1～50:0～90的体积比率进行混合而得的混合溶剂。
15.如权利要求1～14中任一项所述的制造方法，其中，碘酸与碘的摩尔比(碘酸mol/碘mol)为25×10-3以下。
16.如权利要求1～14中任一项所述的制造方法，其中，碘酸与碘的摩尔比(碘酸mol/碘mol)为20×10-3以下。
17.如权利要求1～14中任一项所述的制造方法，其中，碘酸与碘的摩尔比(碘酸mol/碘mol)为15×10-3以下。
18.如权利要求1～14中任一项所述的制造方法，其中，碘酸与碘的摩尔比(碘酸mol/碘mol)为10×10-3以下。
19.如权利要求1～14中任一项所述的制造方法，其中，碘酸与碘的摩尔比(碘酸mol/碘mol)为5×10-3以下。
20.如权利要求1～14中任一项所述的制造方法，其中，碘酸与碘的摩尔比(碘酸mol/碘mol)为3×10-3以下。
21.如权利要求1～20中任一项所述的制造方法，其中，氧化溶液为从配制至用于氧化反应为止的时间经过了1周以上的氧化溶液。
22.如权利要求1～20中任一项所述的制造方法，其中，氧化溶液为从配制至用于氧化反应为止的时间经过了2周以上的氧化溶液。
23.如权利要求1～22中任一项所述的制造方法，其中，核酸为核糖核苷(RNA)。
24.如权利要求2～23中任一项所述的制造方法，其中，核酸为核糖核苷(RNA)，其2’保护基为式(12)中示出的保护基，
式(12)：
[化学式9]
Figure FDA0003770296780000071
式(12)中，
q表示1～5的整数，
Ra及Rb相同或彼此不同，分别各自表示甲基、乙基或氢原子，
带＊标记的键与OQ基的氧键合，并且，
EW表示吸电子基团。
25.如权利要求24所述的制造方法，其中，Ra及Rb同时为氢原子，EW为氰基。
26.如权利要求1～25中任一项所述的制造方法，其中，核酸为40链长以上的核糖核苷(RNA)。
27.如权利要求1～26中任一项所述的制造方法，其还包括配制权利要求1所述的氧化溶液的工序。
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