KR102362675B1

KR102362675B1 - 단일쇄 핵산 분자용 모노머의 제조 방법

Info

Publication number: KR102362675B1
Application number: KR1020187030258A
Authority: KR
Inventors: 가나코 사토; 히데키 이하라
Original assignee: 스미또모 가가꾸 가부시키가이샤
Priority date: 2016-04-26
Filing date: 2017-04-17
Publication date: 2022-02-11
Also published as: JP6787398B2; JPWO2017188042A1; CN109071579B; US20190100540A1; EP3450439A4; WO2017188042A1; KR20180136953A; EP3450439B1; US10308672B2; ES2853732T3; CN109071579A; EP3450439A1; EP3450439B8

Abstract

식 (1)

로 표시되는 화합물 또는 그 거울상 이성체를 용매 중, 1-히드록시벤조트리아졸 등의 첨가제, 및 축합제의 존재 하, 6-히드록시헥산산과 반응시킨 후, 얻어진 반응 혼합물과, 물과, 알칼리 금속 수산화물 등의 염기를 혼합하여 식 (2)

로 표시되는 화합물 또는 그 거울상 이성체를 제조하고, 얻어진 식 (2)로 표시되는 화합물 또는 그 거울상 이성체와 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트를, 디이소프로필아민테트라졸염 등의 커플링 액티베이터의 존재 하, 용매 중에서 반응시킴으로써, 표적 유전자의 발현을 억제 가능한 단일쇄 핵산 분자를 제조하기 위한 모노머인 식 (3)

으로 표시되는 화합물 또는 그 거울상 이성체를 얻을 수 있다.

Description

단일쇄 핵산 분자용 모노머의 제조 방법

본 발명은, 표적 유전자의 발현을 억제 가능한 단일쇄 핵산 분자의 제조에 이용하는 모노머의 제조 방법에 관한 것이다.

US2012/0035246에는 표적 유전자의 발현을 억제 가능한 단일쇄 핵산 분자의 제조 방법이 기재되어 있고, 그 제조에 사용하는 모노머로서, 실시예 A3에는 식 (3)

으로 표시되는 화합물(이하, 화합물 (3)이라 기재함) 및 그 거울상 이성체의 제조가 기재되어 있다.

그러나, US2012/0035246에 기재된 방법으로 얻어지는 화합물 (3)을 사용한 경우의 단일쇄 핵산 분자의 수량은 반드시 충분한 것은 아니었다.

본 발명은, 높은 수량으로 단일쇄 핵산 분자를 제조할 수 있는 화합물 (3)의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 이하와 같다.

[1] 식 (1)

로 표시되는 화합물(이하, 화합물 (1)이라 기재함) 또는 그 거울상 이성체를 용매 중, 1-히드록시벤조트리아졸, 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸, N-히드록시호박산이미드, 에틸(히드록시이미노)시아노아세테이트, 탄산 N,N'-디숙신이미딜, N-히드록시프탈이미드, N-히드록시피페리딘, 3-히드록시-4-옥소-3,4-디히드로-1,2,3-벤조트리아진 및 N-히드록시-5-노르보넨-2,3-디카르복실산이미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 첨가제 및 축합제의 존재 하, 6-히드록시헥산산과 반응시킨 후, 얻어진 반응 혼합물과, 물과, 알칼리 금속 수산화물, 알칼리 금속 탄산염, 이환식 아미딘 화합물, 알칼리 금속 알콕시드 및 제4급 암모늄 수산화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기를 혼합하여 식 (2)

로 표시되는 화합물(이하, 화합물 (2)라고 기재함) 또는 그 거울상 이성체를 제조하는 공정 및

상기 공정에서 얻어진 식 (2)로 표시되는 화합물 또는 그 거울상 이성체와 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트를, 커플링 액티베이터의 존재 하, 용매 중에서 반응시켜, 화합물 (3) 또는 그 거울상 이성체를 얻는 공정

을 포함하는 화합물 (3) 또는 그 거울상 이성체의 제조 방법.

[2] 염기가 알칼리 금속 수산화물인 [1]에 기재된 제조 방법.

[3] 축합제가 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드, N,N'-디이소프로필카르보디이미드, 1,1-카르보닐디이미다졸, 1-프로필포스폰산무수물 환상 삼량체 또는 2-클로로-4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진인 [1] 또는 [2]에 기재된 제조 방법.

[4] 첨가제가 1-히드록시벤조트리아졸, 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸, N-히드록시호박산이미드, 에틸(히드록시이미노)시아노아세테이트 또는 탄산 N,N'-디숙신이미딜인 [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.

[5] 커플링 액티베이터가 디이소프로필아민테트라졸염, 1H-테트라졸, 5-(에틸티오)-1H-테트라졸, 5-(벤질티오)-1H-테트라졸 또는 4,5-디시아노이미다졸인 [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.

본 발명의 제조 방법에 이용되는 화합물 (1)은, US2012/0035246에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있다. 보다 구체적으로는, 후술하는 참고예 4에 의해 얻을 수 있다.

화합물 (1)을 용매 중, 1-히드록시벤조트리아졸, 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸, N-히드록시호박산이미드, 에틸(히드록시이미노)시아노아세테이트, 탄산 N,N'-디숙신이미딜, N-히드록시프탈이미드, N-히드록시피페리딘, 3-히드록시-4-옥소-3,4-디히드로-1,2,3-벤조트리아진 및 N-히드록시-5-노르보넨-2,3-디카르복실산이미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 첨가제 및 축합제의 존재 하, 6-히드록시헥산산과 반응시킨 후, 얻어진 반응 혼합물과, 물과, 알칼리 금속 수산화물, 알칼리 금속 탄산염, 이환식 아미딘 화합물, 알칼리 금속 알콕시드 및 제4급 암모늄 수산화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기를 혼합하여 화합물 (2)를 제조하는 공정에 관해서 기재한다.

용매로서는, 탈수 축합 반응에 불활성인 용매, 예컨대, 디클로로메탄, 클로로포름 등의 할로겐화탄화수소류, 톨루엔, 크실렌 등의 방향족 탄화수소류, 테트라히드로푸란, 2-메틸테트라히드로푸란, 메틸 tert-부틸에테르, 시클로펜틸메틸에테르, 1,4-디옥산, 디에틸에테르 등의 에테르류, 아세톤, 2-부탄온, 메틸이소부틸케톤 등의 케톤류, 아세트산메틸, 아세트산에틸 등의 에스테르류, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 아미드류, 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논, N,N'-디메틸프로필렌요소 등의 우레아류, 아세토니트릴, 프로피오니트릴 등의 니트릴류, 및 디메틸술폭시드, 술포란 등의 함황화합물류를 들 수 있다. 용매의 사용량은, 일반적으로 화합물 (1)의 0.5∼100 중량배이다.

축합제로서는, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드, N,N'-디이소프로필카르보디이미드, 1,1-카르보닐디이미다졸, 1-프로필포스폰산무수물 환상 삼량체 또는 2-클로로-4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진 등의 탈수 축합 반응에 이용되는 축합제를 들 수 있다.

반응에는, 화합물 (1) 1몰에 대하여, 첨가제가 일반적으로 0.1몰∼20몰의 비율, 축합제가 일반적으로 1몰∼10몰의 비율로 사용된다.

반응에는 3급 아민을 첨가하여도 좋다. 3급 아민으로서는, 예컨대 트리에틸아민 및 디이소프로필에틸아민을 들 수 있다. 3급 아민의 첨가량은, 화합물 (1) 1몰에 대하여 일반적으로 0.1∼30몰의 비율이다.

반응 온도는, 비점이 70℃ 이상인 용매를 이용할 때에는, 통상 10℃∼70℃의 범위 내이며, 비점이 70℃ 미만인 용매를 이용할 때에는, 통상 10℃∼용매의 환류 온도의 범위 내이다.

반응 시간은 통상 0.5시간∼150시간이다.

반응 후, 물 및 염기와 혼합함에 있어서, 통상, 용매를 증류 제거하여 농축한다. 또한, 용매를 증류 제거하여 얻은 잔사에 다른 용매를 첨가한 후, 물 및 염기와 혼합하여도 좋다.

에테르류, 아미드류, 우레아류 또는 니트릴류를 용매로서 이용하는 경우에는, 얻어진 반응 혼합물을 그대로 또는 용매를 증류 제거함으로써 농축하여, 물 그리고 알칼리 금속 수산화물, 알칼리 금속 탄산염, 이환식 아미딘 화합물, 알칼리 금속 알콕시드 및 제4급 암모늄 수산화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기와 혼합한다. 또한, 할로겐화탄화수소류, 방향족 탄화수소류, 에스테르류, 케톤류 또는 함황화합물류를 용매로서 이용하는 경우에는, 얻어진 반응 혼합물의 용매를 증류 제거함으로써 농축한 잔사를 에테르류, 아미드류, 우레아류 또는 니트릴류로 희석한 후, 물 그리고 알칼리 금속 수산화물, 알칼리 금속 탄산염, 이환식 아미딘 화합물, 알칼리 금속 알콕시드 및 제4급 암모늄 수산화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기와 혼합한다.

알칼리 금속 수산화물로서는, 예컨대 수산화리튬, 수산화나트륨 및 수산화칼륨을 들 수 있다.

알칼리 금속 탄산염으로서는, 예컨대 탄산나트륨, 탄산칼륨 및 탄산세슘을 들 수 있다.

이환식 아미딘 화합물로서는, 예컨대 디아자비시클로운데센, 디아자비시클로노넨을 들 수 있다.

알칼리 금속 알콕시드로서는, 예컨대 나트륨메톡시드 및 칼륨 tert-부톡시드를 들 수 있다.

제4급 암모늄 수산화물로서는, 예컨대 수산화벤질트리메틸암모늄, 수산화트리에틸메틸암모늄 및 수산화트리부틸메틸암모늄을 들 수 있다.

염기의 사용량은, 화합물 (1) 1몰에 대하여 일반적으로 0.1몰∼10몰의 비율이다.

물의 사용량은, 일반적으로 화합물 (1)의 0.1∼10 중량배이다.

화합물 (1), 물 및 염기의 혼합 순서는 한정되지 않고, 염기와 물을 혼합한 후, 화합물 (1)과 혼합하여도 좋다.

혼합물은 통상 0.5∼150시간 유지된다.

비점이 70℃ 이상인 용매를 이용하는 경우에는, 통상 10℃∼70℃의 범위 내로 혼합물이 유지되고, 비점이 70℃ 미만인 용매를 이용하는 경우에는, 통상 10℃∼용매의 환류 온도의 범위 내에서 혼합물이 유지된다.

그 후, 유기 용매로 추출하고, 농축함으로써, 화합물 (2)를 단리할 수 있다.

다음에, 얻어진 화합물 (2)와 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트를, 커플링 액티베이터의 존재 하, 불활성인 용매 중에서 반응시켜 화합물 (3)을 얻는 공정에 관해서 기재한다.

용매로서는, 예컨대, 디클로로메탄, 클로로포름 등의 할로겐화탄화수소류, 톨루엔, 크실렌 등의 방향족 탄화수소류, 테트라히드로푸란, 2-메틸테트라히드로푸란, 메틸 tert-부틸에테르, 시클로펜틸메틸에테르, 1,4-디옥산, 디에틸에테르 등의 에테르류, 아세톤, 2-부타논, 메틸이소부틸케톤 등의 케톤류, 아세트산메틸, 아세트산에틸 등의 에스테르류, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 아미드류, 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논, N,N'-디메틸프로필렌요소 등의 우레아류, 아세토니트릴, 프로피오니트릴 등의 니트릴류, 및 디메틸술폭시드, 술포란 등의 함황화합물류를 들 수 있다. 용매의 사용량은, 일반적으로 화합물 (2)의 0.5∼100 중량배이다.

커플링 액티베이터란, 포스포로아미다이트법에 의한 올리고뉴클레오티드 합성에 이용되는 커플링 액티베이터를 의미하고, 예컨대 Tetrahedron, 69, 2013, 3615-3637에 기재가 있다. 커플링 액티베이터의 구체예는 이하의 (i), (ii) 및 (iii)이다.

(i) 아졸 커플링 액티베이터

1H-테트라졸;

5-(4-니트로페닐)-1H-테트라졸, 5-(비스-3,5-트리플루오로메틸페닐)-1H-테트라졸, 5-에틸티오-1H-테트라졸, 5-벤질티오-1H-테트라졸, 5-메틸티오-1H-테트라졸, 5-머캅토-1H-테트라졸 등의 수식 테트라졸 커플링 액티베이터;

4,5-디시아노이미다졸, 2-브로모-4,5-디시아노이미다졸, 2-벤질-4,5-디시아노이미다졸, 2-브로모-4,5-디에틸-카르복실이미다졸 등의 이미다졸 커플링 액티베이터;

1-히드록시-벤조트리아졸, 6-트리플루오로메틸-1-히드록시-벤조트리아졸, 4-니트로-1-히드록시-벤조트리아졸 등의 1-히드록시벤조트리아졸 커플링 액티베이터;

3-니트로트리아졸 등의 3-니트로트리아졸 커플링 액티베이터;

(ii) 염 착체 커플링 액티베이터

피리딘염산염, 트리플루오로아세트산피리딘염 등의 피리디늄염 착체 커플링 액티베이터;

벤즈이미다졸트리플루오로아세트산염, N-페닐이미다졸트리플루오로아세트산염 등의 아졸륨염 착체 커플링 액티베이터;

사카린-1-메틸이미다졸염 등의 사카린염 착체 커플링 액티베이터;

디알킬(시아노메틸)암모늄테트라플루오로보레이트, 디이소프로필아민테트라졸염 등의 암모늄염 착체 커플링 액티베이터;

(iii) 포스포로아미다이트법에 의한 올리고 핵산 합성에 이용되는 그 밖의 커플링 액티베이터

트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 디클로로아세트산, 2,4-디니트로안식향산 등의 카르복실산 커플링 액티베이터;

염화철(III), 염화알루미늄(III), 삼불화붕소디에틸에테르 착체, 염화지르코늄(IV), 염화비스무트(III) 등의 루이스산 커플링 액티베이터;

트리메틸클로로실란;

2,4-디니트로페놀;

반응에는, 화합물 (2) 1몰에 대하여 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트가 일반적으로 1몰∼10몰의 비율, 커플링 액티베이터가 일반적으로 0.1몰∼10몰의 비율로 사용된다.

반응 온도는 비점이 70℃ 이상인 용매를 이용할 때에는, 통상 10℃∼70℃의 범위 내이고, 비점이 70℃ 미만인 용매를 이용할 때에는, 통상 10℃∼용매의 환류 온도의 범위 내이다. 반응 시간은 통상 0.5시간∼150시간이다.

반응 종료 후에는, 포화 중조수 등으로 세정한 후, 유기층을 농축시킴으로써, 화합물 (3)을 단리할 수 있다.

또한, 얻어진 화합물 (3)은, 크로마토그래피 등에 의해 정제할 수 있다.

단일쇄 핵산 분자는, 포스포로아미다이트법에 기초하여, 화합물 (3)을 이용하여 제조할 수 있다.

상기한 화합물 (3)의 제조 방법은 화합물 (3)의 거울상 이성체에 적용할 수 있다. 원료가 되는 화합물 (1)의 거울상 이성체는 화합물 (1)과 마찬가지로 시판되고 있는 원료로부터 용이하게 조제할 수 있다. US2012/0035246에 기재되어 있는 바와 같이, 화합물 (3)의 거울상 이성체도 또한 유용하다.

실시예

실시예 1

화합물 (1) 16.94 mmol(8.28 g), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염 20.33 mmol(3.90 g), 1-히드록시벤조트리아졸 40.62 mmol(6.22 g), 트리에틸아민 61.00 mmol(8.50 ㎖) 및 무수디클로로메탄(160 ㎖)을 혼합하였다. 이 혼합액에, 질소 분위기 하 실온에서 6-히드록시헥산산 20.0 mmol(2.64 g)을 더 첨가하고, 그 후, 질소 분위기 하 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 얻어진 혼합액을 디클로로메탄 800 ㎖로 희석하고, 포화 식염수 1000 ㎖로 3회 세정하였다. 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조시킨 후, 용매를 감압 하에서 증류 제거하여 10.40 g의 잔사를 얻었다.

얻어진 잔사 5.20 g, 테트라히드로푸란 10.4 ㎖ 및 물 5.2 ㎖를 혼합하고, 거기에 수산화리튬일수화물 17.25 mmol(0.72 g)을 첨가하고, 40℃∼50℃에서 6시간 동안 교반하였다. 얻어진 혼합물을 실온까지 방랭한 후, 톨루엔 26 ㎖ 및 물 52 ㎖를 첨가하고, 실온에서 15분간 교반하였다. 분취한 유기층을 중조수(탄산수소나트륨 2.76 g과 물 52 ㎖를 혼합)로 2회 세정하고, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 잔사를 아세토니트릴 31.2 ㎖에 용해한 후, 감압 하에서 용매를 증류 제거하여 화합물 (2)를 얻었다(순도 93%, 수율 85%).

얻어진 화합물 (2) 7.13 mmol(4.30 g)을 무수아세토니트릴과 혼합하고, 실온에서 3회 공비(共沸) 탈수를 행하였다. 얻어진 잔사에 디이소프로필아민테트라졸염 8.53 mmol(1.46 g)을 첨가하고, 감압 하에서 탈기한 후 질소 가스를 충전하였다. 얻어진 혼합물에 무수아세토니트릴 5 ㎖를 첨가하고, 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트 8.56 mmol(2.58 g)의 무수아세토니트릴 용액 3.5 ㎖를 더 첨가하였다. 이 혼합물을, 질소 분위기 하 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 얻어진 혼합물을 디클로로메탄 50 ㎖로 희석하고, 포화 중조수 100 ㎖로 세정을 3회 행한 후, 포화 식염수 100 ㎖로 세정하였다. 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조시킨 후, 용매를 감압 하에서 증류 제거하였다. 얻어진 잔사를, 충전제로서 아미노실리카겔을 이용한 칼럼 크로마토그래피(전개용매 헥산:아세트산에틸=1:3, 0.05% 피리딘 함유)에 제공하고, 화합물 (3)을 얻었다(수율 82.4%).

실시예 2

참고예 4에 기재된 방법에 의해 얻어진 화합물 (1) 6.00 g 및 클로로포름 120 ㎖의 혼합물에, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염 2.83 g, 1-히드록시벤조트리아졸 4.51 g 및 트리에틸아민 4.47 g을 첨가하였다. 얻어진 혼합물에 6-히드록시헥산산 1.95 g을 첨가하고, 질소 분위기 하, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 얻어진 혼합물을 클로로포름으로 희석하고, 5% 염화나트륨 수용액으로 세정을 3회 행하였다. 유기층의 용매를 감압 하에서 증류 제거하였다. 이 잔사에 테트라히드로푸란 15 ㎖를 첨가한 후, 수산화리튬 0.59 g과 물 7.4 ㎖의 혼합물을 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 실온에서 22시간 동안 교반한 후, 톨루엔을 첨가하고, 물로 세정하여 얻어진 유기층을, 5% 탄산수소나트륨 수용액으로 세정을 3회 행한 후, 용매를 감압 하에서 증류 제거하였다. 잔사를 아세토니트릴과 혼합하고, 다시 감압 하에서 용매를 증류 제거함으로써, 화합물 (2)를 25.80 g 얻었다.

얻어진 화합물 (2) 20.64 g에 아세토니트릴 30 ㎖를 첨가한 후, 디이소프로필아민테트라졸염 2.02 g 및 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트 3.55 g을 첨가하고, 질소 분위기 하, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 얻어진 혼합물을 톨루엔으로 희석하고, 5% 탄산수소나트륨 수용액으로 세정을 3회 행하였다. 얻어진 유기층을 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 용매를 감압 하에서 증류 제거하였다. 얻어진 잔사의 일부를 트리에틸아민으로 처리한 실리카겔을 이용하여 칼럼 크로마토그래피(전개용매 헵탄:아세트산에틸=50:50)를 행하고, 화합물 (3)을 얻었다.

실시예 3

화합물 (1) 20.00 g 및 클로로포름 200 ㎖의 혼합물에, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염 9.42 g, 1-히드록시벤조트리아졸 15.04 g 및 트리에틸아민 14.91 g을 첨가하였다. 얻어진 혼합물에 6-히드록시헥산산 6.49 g을 첨가하고, 질소 분위기 하 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 얻어진 혼합물을 클로로포름으로 희석하고, 5% 염화나트륨 수용액으로 세정을 3회 행하였다. 유기층의 용매를 감압 하에서 증류 제거하고, 잔사 29.87 g을 얻었다. 잔사 4.98 g에 아세토니트릴 10 ㎖를 첨가한 후, 수산화나트륨 0.55 g과 물 5.0 ㎖의 혼합물을 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 30℃에서 18시간 동안 교반한 후, 톨루엔을 첨가하고, 물로 세정하여 얻어진 유기층을, 5% 탄산수소나트륨 수용액으로 2회 세정한 후, 용매를 감압 하에서 증류 제거하였다. 잔사를 아세토니트릴과 혼합하고, 다시 감압 하에서 용매를 증류 제거함으로써, 화합물 (2)를 5.03 g 얻었다.

얻어진 화합물 (2) 5.03 g에 아세토니트릴 21 ㎖를 첨가한 후, 디이소프로필아민테트라졸염 1.40 g 및 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트 2.47 g을 첨가하고, 질소 분위기 하 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 얻어진 혼합물을 톨루엔으로 희석하고, 5% 탄산수소나트륨 수용액으로 세정을 3회 행하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 용매를 감압 하에서 증류 제거하였다. 얻어진 잔사의 일부를 트리에틸아민으로 처리한 실리카겔을 이용하여 칼럼 크로마토그래피(전개용매 헵탄:아세트산에틸:트리에틸아민=40:60:10)를 행하고, 화합물 (3)을 얻었다.

실시예 4

화합물 (1) 20.00 g 및 클로로포름 200 ㎖의 혼합물에, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염 9.42 g, 1-히드록시벤조트리아졸 15.04 g 및 트리에틸아민 14.91 g을 첨가하였다. 얻어진 혼합물에 6-히드록시헥산산 6.49 g을 첨가하고, 질소 분위기 하 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 얻어진 혼합물을 클로로포름으로 희석하고, 5% 염화나트륨 수용액으로 세정을 3회 행하였다. 유기층의 용매를 감압 하에서 증류 제거하고, 잔사 29.87 g을 얻었다. 잔사 4.98 g에 테트라히드로푸란 10 ㎖를 첨가한 후, 디아자비시클로운데센 2.08 g과 물 1.0 ㎖의 혼합물을 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 50℃에서 1872시간 동안 교반한 후, 톨루엔을 첨가하고, 물로 세정하여 얻어진 유기층을, 5% 탄산수소나트륨 수용액으로 2회 세정한 후, 용매를 감압 하에서 증류 제거하였다. 잔사를 아세토니트릴과 혼합하고, 다시 감압 하에서 용매를 증류 제거함으로써, 화합물 (2)를 8.78 g 얻었다.

실시예 5

화합물 (1) 20.00 g 및 클로로포름 200 ㎖의 혼합물에, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염 9.42 g, 1-히드록시벤조트리아졸 15.04 g 및 트리에틸아민 14.91 g을 첨가하였다. 얻어진 혼합물에 6-히드록시헥산산 6.49 g을 첨가하고, 질소 분위기 하 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 얻어진 혼합물을 클로로포름으로 희석하고, 5% 염화나트륨 수용액으로 세정을 3회 행하였다. 유기층의 용매를 감압 하에서 증류 제거하고, 잔사 29.87 g을 얻었다. 잔사 4.98 g에 테트라히드로푸란 10 ㎖를 첨가한 후, 칼륨 tert-부톡시드 1.53 g과 물 5.0 ㎖의 혼합물을 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 30℃에서 22시간 동안 교반한 후, 톨루엔을 첨가하고, 물로 세정하여 얻어진 유기층을, 5% 탄산수소나트륨 수용액으로 2회 세정한 후, 용매를 감압 하에서 증류 제거하였다. 잔사를 아세토니트릴과 혼합하고, 다시 감압 하에서 용매를 증류 제거함으로써, 화합물 (2)를 4.78 g 얻었다.

얻어진 화합물 (2) 4.78 g에 아세토니트릴 21 ㎖를 첨가한 후, 디이소프로필아민테트라졸염 1.40 g 및 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트 2.47 g을 첨가하고, 질소 분위기 하 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 얻어진 혼합물을 톨루엔으로 희석하고, 5% 탄산수소나트륨 수용액으로 3회 세정하였다. 얻어진 유기층을 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 용매를 감압 하에서 증류 제거하였다. 얻어진 잔사의 일부를 트리에틸아민으로 처리한 실리카겔을 이용하여 칼럼 크로마토그래피(전개용매 헵탄:아세트산에틸:트리에틸아민=40:60:10)를 행하고, 화합물 (3)을 얻었다.

실시예 6

화합물 (1) 20.00 g 및 클로로포름 200 ㎖의 혼합물에, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염 9.42 g, 1-히드록시벤조트리아졸 15.04 g 및 트리에틸아민 14.91 g을 첨가하였다. 얻어진 혼합물에 6-히드록시헥산산 6.49 g을 첨가하고, 질소 분위기 하, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 얻어진 혼합물을 클로로포름으로 희석하고, 5% 염화나트륨 수용액으로 세정을 3회 행하였다. 얻어진 유기층의 용매를 감압 하에서 증류 제거하고, 잔사 29.87 g을 얻었다. 잔사 4.98 g에 테트라히드로푸란 10 ㎖를 첨가한 후, 수산화벤질트리메틸암모늄 수용액(40 wt%) 5.70 g과 물 1.6 ㎖의 혼합물을 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 30℃에서 6시간 동안 교반한 후, 톨루엔을 첨가하고, 물로 세정하여 얻어진 유기층을, 5% 탄산수소나트륨 수용액으로 2회 세정한 후, 용매를 감압 하에서 증류 제거하였다. 잔사를 아세토니트릴과 혼합하고, 다시 감압 하에서 용매를 증류 제거함으로써, 화합물 (2)를 10.21 g 얻었다.

얻어진 화합물 (2) 10.21 g에 아세토니트릴 21 ㎖를 첨가한 후, 디이소프로필아민테트라졸염 1.40 g 및 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트 2.47 g을 첨가하고, 질소 분위기 하 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 얻어진 혼합물을 톨루엔으로 희석하고, 5% 탄산수소나트륨 수용액으로 세정을 3회 행하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 용매를 감압 하에서 증류 제거하였다. 얻어진 잔사의 일부를 트리에틸아민으로 처리한 실리카겔을 이용하여 칼럼 크로마토그래피(전개용매 헵탄:아세트산에틸:트리에틸아민=40:60:10)를 행하고, 화합물 (3)을 얻었다.

참고예 1

실시예 1에서 제조한 화합물 (3)을 이용하여, US2012/0035246의 실시예 (B1)에 기재된 단일쇄 핵산 분자(식 (A)

(식 중, C는 시티딘모노인산나트륨염을 의미하고, A는 아데노신모노인산나트륨염을 의미하며, U는 우리딘모노인산나트륨염을 의미하고, G는 구아노신모노인산나트륨염을 의미함)

로 표시되는 핵산 분자. 이하, 화합물 (A)라 기재한다.)를 제조하였다.

핵산 합성기로서 NTS M-4MX-E(니폰테크노서비스가부시키가이샤 제조)를 이용하여 3'측으로부터 5'측을 향해 합성하였다. 합성에는, US2012/0035246의 실시예 2에 기재된 우리딘 EMM 아미다이트, 실시예 3에 기재된 시티딘 EMM 아미다이트, 실시예 4에 기재된 아데노신 EMM 아미다이트 및 실시예 5에 기재된 구아노신 EMM 아미다이트를 사용하고, 고상 담체로서 다공질 유리를 사용하며, 디블로킹 용액으로서 고순도 트리클로로아세트산톨루엔 용액을 사용하고, 축합제로서 5-벤질머캅토-1H-테트라졸을 사용하며, 산화제로서 요오드 용액을 사용하고, 캡핑 용액으로서 페녹시아세트산 용액과 N-메틸이미다졸 용액을 사용하여 행하였다.

화합물 (A)를 2회 합성한 결과, 2회의 평균 OD₂₆₀은 27.7 OD이며, 2회의 평균 순도는 94.0%였다. OD₂₆₀이란 1 ㎖ 용액(pH=7.5)에 있어서의 10 ㎜ 광로 길이당의 UV 260 ㎚의 흡광도를 나타낸다. 일반적으로 RNA에서는 1OD=40 ㎍인 것이 알려져 있기 때문에, 2회의 평균 수량은 1108 ㎍이 된다.

참고예 2

US2012/0035246의 실시예 (A3)의 (3) 및 (4)의 기재에 따라 화합물 (3)을 제조하였다(수율 85.5%). 얻어진 화합물 (3)을, 상기 참고예 1의 기재에 따라 화합물 (A)를 얻었다.

화합물 (A)를 2회 합성한 결과, 2회의 평균 OD₂₆₀은 17.8 OD이며, 2회의 평균 순도는 93.0%였다. 일반적으로 RNA에서는 1OD=40 ㎍인 것이 알려져 있기 때문에, 2회의 평균 수량은 712 ㎍이 된다.

참고예 1 및 참고예 2의 결과에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 제조 방법으로 얻어지는 화합물 (3)을 사용함으로써, 종래의 제조 방법으로 얻어지는 화합물 (3)을 사용하는 경우에 비해 화합물 (A)가 높은 수량으로 얻어진다.

참고예 3

상기 참고예 2에 기재된 화합물 (3), 실시예 3∼6에서 제조한 화합물 (3)을 이용하여, 상기 참고예 1의 기재에 준하여 화합물 (A)를 얻었다. 결과를 하기 표 1에 나타낸다. 참고예 3의 결과에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 제조 방법으로 얻어지는 화합물 (3)을 사용함으로써, 종래의 제조 방법으로 얻어지는 화합물 (3)을 사용하는 경우에 비해 화합물 (A)가 높은 수량으로 얻어진다.

* US2012/0035246의 실시예 (A3)의 (3) 및 (4)

참고예 4

질소 치환한 반응 용기에 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-프롤린 30.00 g과 아세토니트릴 420 ㎖를 혼합하고, 1-히드록시벤조트리아졸 32.68 g을 첨가하였다. 얻어진 혼합물에 4-아미노-1-부탄올 9.51 g을 첨가하고, 또한 디시클로헥실카르보디이미드 22.02 g의 아세토니트릴 용액 210 ㎖를 실온에서 적하한 후, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 생성된 침전을 여과에 의해 제거하고, 얻어진 여과액의 용매를 감압 하에서 증류 제거하였다. 잔사에 톨루엔을 첨가하고, 10% 탄산수소나트륨 수용액으로 세정하였다. 얻어진 유기층의 용매를 감압 하에서 증류 제거함으로써, 식 (a)

[식 중, Fmoc는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기를 나타낸다.]

로 표시되는 화합물을 얻었다.

얻어진 식 (a)로 표시되는 화합물 전량에 톨루엔 90 ㎖를 첨가하여 공비 탈수 조작을 행하였다. 얻어진 식 (a)로 표시되는 화합물의 톨루엔 용액 71.72 g, N,N-디메틸-4-아미노피리딘 91 ㎎ 및 피리딘 50 ㎖를 혼합하고, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 32.64 g을 0∼5℃에서 첨가한 후, 질소 분위기 하, 실온에서 30분간 교반하였다. 반응 종료 후, 메탄올을 첨가하여 20분간 교반하였다. 얻어진 혼합물을 톨루엔으로 희석하고, 5% 탄산수소나트륨 수용액으로 세정하였다. 얻어진 유기층의 용매를 감압 하에서 증류 제거함으로써, 식 (b)

로 표시되는 화합물을 얻었다.

얻어진 식 (b)로 표시되는 화합물에 톨루엔 50 ㎖를 첨가한 후, 피페리딘 59.89 g을 0∼5℃에서 적하한 후, 질소 분위기 하, 실온에서 30분간 교반하였다. 반응 종료 후, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 잔사에 톨루엔을 첨가하고, 공비 탈수 조작을 행하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(전개용매 아세트산에틸:메탄올=80:20)에 제공하고, 화합물 (1)을 얻었다.

산업상 이용가능성

본 발명 방법에 의해, 높은 수량으로 표적 유전자의 발현을 억제 가능한 단일쇄 핵산 분자를 제조할 수 있는 화합물 (3) 또는 그 거울상 이성체를 제조할 수 있다.

Claims

식 (1)

로 표시되는 화합물 또는 그 거울상 이성체를 용매 중, 1-히드록시벤조트리아졸, 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸, N-히드록시호박산이미드, 에틸(히드록시이미노)시아노아세테이트, 탄산 N,N'-디숙신이미딜, N-히드록시프탈이미드, N-히드록시피페리딘, 3-히드록시-4-옥소-3,4-디히드로-1,2,3-벤조트리아진 및 N-히드록시-5-노르보넨-2,3-디카르복실산이미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 첨가제 및 축합제의 존재 하, 6-히드록시헥산산과 반응시킨 후, 얻어진 반응 혼합물과, 물과, 알칼리 금속 수산화물, 알칼리 금속 탄산염, 이환식 아미딘 화합물, 알칼리 금속 알콕시드 및 제4급 암모늄 수산화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기를 혼합하여 식 (2)

로 표시되는 화합물 또는 그 거울상 이성체를 제조하는 공정, 및
상기 공정에서 얻어진 식 (2)로 표시되는 화합물 또는 그 거울상 이성체와 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트를, 디이소프로필아민테트라졸염, 1H-테트라졸, 5-(에틸티오)-1H-테트라졸, 5-(벤질티오)-1H-테트라졸 및 4,5-디시아노이미다졸로 이루어진 군으로부터 선택되는 커플링 액티베이터의 존재 하, 용매 중에서 반응시켜, 식 (3)

으로 표시되는 화합물 또는 그 거울상 이성체를 얻는 공정
을 포함하는 식 (3)으로 표시되는 화합물 또는 그 거울상 이성체의 제조 방법.
제1항에 있어서, 염기가 알칼리 금속 수산화물인 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 축합제가 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드, N,N'-디이소프로필카르보디이미드, 1,1-카르보닐디이미다졸, 1-프로필포스폰산무수물 환상 삼량체 또는 2-클로로-4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진인 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 첨가제가 1-히드록시벤조트리아졸, 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸, N-히드록시호박산이미드, 에틸(히드록시이미노)시아노아세테이트 또는 탄산 N,N'-디숙신이미딜인 제조 방법.
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