JP7368455B2 - 無機多孔質担体、及びこれを用いた核酸の製造方法 - Google Patents

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Description

本特許出願は、日本国特許出願２０１９－０６７９９６号（２０１９年３月２９日出願）に基づくパリ条約上の優先権および利益を主張するものであり、ここに引用することによって、上記出願に記載された内容の全体が本明細書中に組み込まれるものとする。
本発明は、無機多孔質担体、及びこれを用いた核酸の製造方法に関する。
核酸の化学合成法としては、ホスホロアミダイト法による固相合成法が広く用いられている。この方法では、まず、シランカップリング剤等を用いて無機多孔質体上にアミノ基等の官能基を導入し、前記官能基に核酸の３’末端となるヌクレオシドを結合させる。その後、前記ヌクレオシドを起点として、固相担体上で核酸伸長反応を行う。
固相合成法では、合成する核酸の鎖長が長くなると、合成効率が急速に低下し、多量の副生成物（目的鎖長より短鎖長の物質）が混入する結果になりがちである。これは、多孔質担体の細孔内で核酸分子が伸長するにつれ、細孔が閉塞され、伸長反応の阻害や副反応等が生じているためと考えられる。
核酸分子の伸長による細孔の閉塞を防ぐには、無機多孔質体の表面に膨潤性の高分子を被覆することが提案されている（特許文献１）。
米国特許出願公開第２００９／０００５５３６号明細書
一般的に、合成する核酸が長くなるほど、細孔の閉塞が起こりやすくなるため、核酸合成の純度は低下しやすい。特に、４０ｍｅｒ以上の長鎖核酸を合成する場合、従来の固相担体では、目的鎖長よりも短鎖長の核酸が生成しやすく、長鎖核酸の純度が問題となる。
本発明は、上記のような事情に鑑みてなされたものであり、核酸の製造において純度をより高められる無機多孔質担体、及びこれを用いた核酸の製造方法を提供することを課題とする。
上記課題を解決するため、本発明は、以下の構成を採用する。
すなわち、本発明の第１の態様は、下記一般式（１）で表されるリンカーを有し、水銀圧入法により測定される細孔分布において、細孔径の最頻値（モード径）が０．０４μｍから１μｍであり、下記無機多孔質体表面の画像解析により得られる、開口面積０．００２５μｍ２以上を有する空隙の密度が１２個／μｍ２から３０個／μｍ２であることを特徴とする、無機多孔質担体である。
Figure 0007368455000001
 ［式中、＊を付された結合は、無機多孔質体のシラノール基の酸素原子への結合を表す。
ｎは、１、２又は３の整数を表す。
Ｒは、それぞれ独立して、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよい炭素数が３～１０のアルキル基；アルキル基、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよいフェニル基；ヒドロキシル基；又は、炭素数が１～４のアルコキシ基を表す。
Ｌは、単結合、炭素数が１～２０のアルキレン基、又は、炭素数２～２０のアルキレン基であって、当該アルキレン基を構成する少なくとも１つの－ＣＨ２－ＣＨ２－基に、－Ｏ－、－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－及び－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－からなる群から選ばれる何れかの基Ｑが挿入されている基：－ＣＨ２－Ｑ－ＣＨ２－を含む基を表す。ただし、基Ｑと結合しているメチレン基の炭素原子は、さらに別の基Ｑと同時に結合することはない。］
本発明の第２の態様は、下記一般式（２）で表されるリンカーを有し、水銀圧入法により測定される細孔分布において、細孔径の最頻値（モード径）が０．０４μｍから１μｍであり、下記無機多孔質体表面の画像解析により得られる、開口面積０．００２５μｍ２以上を有する空隙の密度が１２個／μｍ２から３０個／μｍ２であることを特徴とする、無機多孔質担体（以下この無機多孔質担体を「固相担体」と記すこともある。）である。
Figure 0007368455000002
 ［式中、＊を付された結合は、無機多孔質体のシラノール基の酸素原子への結合を表す。
ｎは、１、２又は３の整数を表す。
Ｒは、それぞれ独立して、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよい炭素数が３～１０のアルキル基；アルキル基、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよいフェニル基；ヒドロキシル基；又は、炭素数が１～４のアルコキシ基を表す。
Ｌは、単結合、炭素数が１～２０のアルキレン基、又は、炭素数２～２０のアルキレン基であって、当該アルキレン基を構成する少なくとも１つの－ＣＨ２－ＣＨ２－基に、－Ｏ－、－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－及び－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－からなる群から選ばれる何れかの基Ｑが挿入されている基：－ＣＨ２－Ｑ－ＣＨ２－を含む基を表す。ただし、基Ｑと結合しているメチレン基の炭素原子は、さらに別の基Ｑと同時に結合することはない。
Ｒｂは、反応性の基が保護あるいは脱保護されたヌクレオシド又はヌクレオチドを表す。
Ｌ１は、Ｒｂの１級又は２級のヒドロキシル基の酸素原子と結合している２価の基を表す。］
本発明の第２の態様における、ある１実施態様によれば、前記無機多孔質体の体積当たり比表面積は、０．１ｍ２／ｍＬ以上１００ｍ２／ｍＬ以下であってもよい。
本発明の第２の態様における、ある１実施態様によれば、前記無機多孔質体の体積当たり細孔容積は、０．０５ｍＬ／ｍＬ以上０．６ｍＬ／ｍＬ以下であってもよい。
本発明の第２の態様における、ある１実施態様によれば、前記無機多孔質体の気孔率は、５０％以上であってもよい。
本発明の第２の態様における、ある１実施態様によれば、前記リンカーの担持密度は、前記無機多孔質体の質量当たり比表面積に対して、０．１μｍｏｌ／ｍ２以上５．０μｍｏｌ／ｍ２以下であってもよい。
本発明の第２の態様における、ある１実施態様によれば、前記無機多孔質体の粒子径（メジアン径）は、１μｍ以上１０００μｍ以下であってもよい。
本発明の第２の態様における、ある１実施態様によれば、前記無機多孔質体は、シリカ、シリカゲル、ゼオライト又はガラスであってもよい。
本発明の第２の態様における、ある１実施態様によれば、前記一般式（２）中のＬ１は、スクシニルリンカー又はユニバーサルリンカーであってもよい。
本発明の第３の態様は、前記一般式（２）中のＲｂが、反応性の基としてヒドロキシル基が保護されたヌクレオシド又はヌクレオチドを表す無機多孔質担体を用い、前記のヌクレオシドの５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程（Ａ）、前記工程（Ａ）において生成したヌクレオシドの５’位のヒドロキシル基と、第２のヌクレオシド塩基を有するアミダイト化合物とを縮合反応させて、ホスファイトを生成する工程（Ｂ）、前記工程（Ｂ）において生成したホスファイトを酸化させて、ヌクレオチドを生成する工程（Ｃ）、及び、前記工程（Ｃ）において生成したヌクレオチドの５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程（Ｄ）を含むことを特徴とする、核酸の製造方法である。
本発明の第３の態様における、ある１実施態様によれば、核酸の製造方法は、
前記工程（Ｄ）において生成した生成物と、次に導入予定のヌクレオシド塩基を有するアミダイト化合物とをさらに縮合反応させて、ホスファイトを生成する工程（Ｂ’）、
前記工程（Ｂ’）において生成したホスファイトを酸化させて、オリゴヌクレオチドを生成する工程（Ｃ’）、及び、
前記工程（Ｃ’）において生成したオリゴヌクレオチド鎖末端の５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程（Ｄ’）
を含んでいてもよい。
本発明の第３の態様における、ある１実施態様によれば、前記の工程（Ｂ’）、工程（Ｃ’）及び工程（Ｄ’）からなる一連の工程を、さらにｍ回（ｍは、１以上の整数を表す。）繰り返して、ｍ個のアミダイト化合物を反応させた後、伸長した核酸を切り出す工程（Ｅ）を含んでいてもよい。
本発明の第４の態様は、前記第１の態様に係る無機多孔質担体、又は前記第２の態様に係る固相担体、のホスホロアミダイト法による核酸の製造における使用である。
本発明に係る無機多孔質担体によれば、核酸の製造において純度をより高められる。
本発明に係る核酸の製造方法によれば、核酸の製造において純度をより高められ、特に長鎖核酸を高純度で得ることができる。
無機多孔質体表面のＳＥＭ像（図１（ａ））、及びその二値化処理済み画像（図１（ｂ））を示した図である。
本明細書中、ある数値範囲について、「ＡからＢ」または「Ａ～Ｂ］という場合には、特に断らない限り、「Ａ以上から（～）Ｂ以下」の範囲を意味する。
（無機多孔質担体）
本発明の第１の態様である無機多孔質担体について説明する。
＜無機多孔質体＞
本実施形態の無機多孔質担体を構成する無機多孔質体は、水銀圧入法により測定される細孔分布において、細孔径の最頻値（モード径）が０．０４μｍから１μｍであり、無機多孔質体表面の画像解析により得られる、開口面積０．００２５μｍ２以上を有する空隙の密度が１２個／μｍ２から３０個／μｍ２である。
かかる無機多孔質体は、典型的には、シランカップリング剤を担持することができる、シラノール基を有するものである。かかる無機多孔質体として典型的には、シリカ、シリカゲル、ゼオライト、ガラス、石英が例示され、好ましくはシリカ、シリカゲル、ゼオライト又はガラスである。これらのものは、市販のものを使用するか、あるいは以下のような合成方法で調製したものを使用してもよい。
［シラノール基を含む無機多孔質体の製造方法］
シラノール基を含む無機多孔質体の製造方法としては、乾式法と湿式法が例示される。前者の具体例としては、燃焼法やアーク法が挙げられ、後者の具体例としては、沈降法、ゾルゲル法、水熱合成法等の合成方法が挙げられる（参考文献：TOSOH Research ＆ Technology Review Vol. 45 (2001).）。
かかる無機多孔質体の調製は、例えば、ケイ酸塩、アルコキシシラン、クロロシラン類等を原料とし、溶媒やテンプレートを用いて前記のような合成方法で調製される。
かかる無機多孔質体の調製は、例えば、１．シリカを析出させた後、シリカの骨格中に含まれる溶媒を除去する方法、２．シリカ以外の、例えばアルミニウムやホウ素などの異種金属を混ぜて固体を析出させた後、シリカ成分とシリカ以外の成分とに相分離させ、シリカ以外の成分を除去する方法、３．アンモニウム塩や高分子をテンプレート剤として混ぜてシリカを析出させた後、テンプレート剤を除去する方法、又は、４．析出させたシリカを凝集させる方法、のいずれかを用いて行うことができる。これら２つ以上の方法を組み合わせて用いてもよい。
前記の１および３の、溶媒又はテンプレート剤を除去する方法としては、乾燥、超臨界抽出、焼成等を用いることができる。
前記の４．の方法で凝集させるシリカとしては、シリカ、シリカゲル、ゼオライト、ガラス、石英、またはそれらの２種以上を用いることができる。
前記ゼオライトとは、その骨格を構成する元素としてケイ素及び酸素を含むものであり、実質的にケイ素と酸素から骨格が構成される結晶性シリカであってもよいし、骨格を構成する元素としてさらに他の元素を含む結晶性メタロシリケート等であってもよい。
メタロシリケート等の場合、ケイ素及び酸素以外に存在し得る元素としては、例えば、Ｂｅ、Ｂ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｇａ、Ｇｅ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｓｂ、Ｌａ、Ｈｆ、又はＢｉ等から選ばれるいずれか１種が挙げられ、必要に応じてそれらの２種以上が含まれていてもよい。また、これらのケイ素及び酸素以外に存在し得る元素に対するケイ素の原子比は、好ましくは５以上であり、さらに好ましくは５００以上である。
前記ゼオライトは、ケイ素化合物、水及び第四級アンモニウム水酸化物を含む混合物を用いた水熱合成反応により合成することができる。
前記ケイ素化合物としては、非晶質シリカ；珪酸ナトリウム、珪酸カリウム等の珪酸アルカリ；オルトケイ酸テトラメチル、オルトケイ酸テトラエチル、オルトケイ酸テトラプロピル、オルトケイ酸テトラブチル等のオルトケイ酸テトラアルキルが挙げられ、必要に応じてそれらの２種以上を用いることもできる。
前記第四級アンモニウム水酸化物としては、水酸化テトラアルキルアンモニウムが好ましい。水酸化テトラアルキルアンモニウムとしては、例えば、水酸化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラエチルアンモニウム、水酸化ｎ－プロピルトリメチルアンモニウム、水酸化テトラ－ｎ－プロピルアンモニウム、水酸化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム、水酸化トリエチルメチルアンモニウム、水酸化トリ－ｎ－プロピルメチルアンモニウム、水酸化トリ－ｎ－ブチルメチルアンモニウム等、またはそれらの２種以上が挙げられる。
水熱合成に付する前記混合物中のケイ素に対する水のモル比は、５～１００が好ましく、より好ましくは１０～６０である。
水熱合成に付する前記混合物中のケイ素に対する第四級アンモニウムイオンのモル比は、０．１～０．６が好ましく、より好ましくは０．２～０．５である。
水熱合成に付する前記混合物中のケイ素に対する水酸化物イオンのモル比は、通常０．１～０．６、好ましくは０．２～０．５に調整される。該混合物中のケイ素に対する水酸化物イオンのモル比が大きいほど、得られるゼオライトの１次粒子径は小さくなる傾向にある。
前記混合物中のケイ素に対するカリウムのモル比は、０～０．１に調整することが好ましく、０．０４～０．１に調整することがより好ましい。該混合物中のケイ素に対するカリウムのモル比は、例えば、ケイ素化合物の使用量を調節することや、各原料、特に第四級アンモニウム水酸化物に不純物として含まれ得るカリウム化合物の含有量を制御することにより、適宜調整することができる。
混合物が水熱合成反応に付される際、水熱合成における温度は、８０～１６０℃が好ましく、１００～１４０℃がより好ましい。また、水熱合成時間は、１～２００時間が好ましく、１２～７２時間がより好ましい。水熱合成における圧力は、絶対圧で、０．１０～１．０ＭＰａの範囲が好ましく、より好ましくは０．１１～０．５０ＭＰａの範囲である。
水熱合成の方法は、特に限定されないが、例えば、前記混合物をオートクレーブ等の反応容器に封入し、密閉状態で前記温度条件下、撹拌することにより行われる。
前記の無機多孔質体の調製における１．～４．のいずれか、又はそれら２つ以上を組み合わせた方法により得られた無機多孔質体は、その形態として粒子が好ましく、球状に成形されていてもよいし、塊状又は破砕状でもよいが、これらを担体として使用する際、核酸合成カラムへの充填性の観点から、球状又は破砕状が好ましい。成形法としては、特に限定されないが、噴霧乾燥法やエマルジョン法を用いることができる。
本実施形態における無機多孔質体の細孔径の最頻値（モード径）は、水銀圧入法により得られる細孔径分布（Ｘ軸を細孔径の値とし、Ｙ軸を細孔容積を細孔径で微分した値としたグラフとする）において、ピークトップのＸ軸の値から求められる。
［水銀圧入法］
無機多孔質体の細孔径は、以下のようにして求めることができる。
まず、試料の入った容器内を真空排気した上で、容器内に水銀を満たす。水銀は表面張力が高く、そのまま（常圧）では試料の表面の細孔に水銀は浸入しないが、水銀に圧力をかけ、徐々に昇圧していくと、径の大きい細孔から径の小さい細孔へと順に、徐々に細孔の中に水銀が浸入していく。圧力を連続的に増加させながら細孔への水銀圧入量を測定していくことにより、水銀に加えた圧力と水銀圧入量との関係から水銀圧入曲線が得られる。
ここで、細孔の形状を円筒状と仮定し、水銀に加えられた圧力をＰ、その細孔径（細孔直径）をＤ、水銀の表面張力をσ、水銀と試料との接触角をθとすると、細孔径（細孔直径）は、次式（Ａ）で表される。
Figure 0007368455000003
 水銀の表面張力σは一般に、０．４８～０．４９Ｎ／ｍの値が用いられ、接触角θは１３０～１４０°の値が使用される。
σ、θは定数であるから、式（Ａ）より、水銀に加えられた圧力Ｐと細孔径Ｄとの関係が求められる。そのときの水銀浸入体積を測定することにより、細孔容積を導くことができる。すなわち、水銀に加えられた圧力Ｐと、水銀が浸入する細孔径Ｄとの間には相関があることから、得られた水銀圧入曲線に基づいて、試料の細孔径の大きさとその体積との関係を表す細孔分布曲線を得ることができる。
尚、水銀圧入法による細孔径のおおよその測定限界は、下限が約０．００４μｍ以上、上限が約２００μｍ以下である。水銀圧入法による測定は、水銀ポロシメータ等の装置を用いて行うことができる。水銀ポロシメータの具体例としては、ＡｕｔｏＰｏｒｅＩＶ９５２０（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ社製）等が挙げられる。
本実施形態における無機多孔質体には、水銀圧入法により測定される細孔分布において、細孔径の最頻値（モード径）が０．０４μｍから１μｍである無機多孔質体が使用される。使用する無機多孔質体は、合成する核酸の鎖長に応じて適宜選択することができる。通常、合成する核酸の鎖長が長い場合には、細孔径の大きいものを選択することが好ましい。例えば、４０～２００ｍｅｒのＲＮＡを合成する場合、細孔径としては、０．０４μｍ以上０．５μｍ以下であることが好ましく、０．０４μｍ以上０．３μｍ以下であることがより好ましい。
無機多孔質体表面の空隙の密度（個／μｍ２）について：
本実施形態における無機多孔質体表面の空隙の密度（個／μｍ２）は、無機多孔質体表面の画像解析により得られる、開口面積０．００２５μｍ２以上を有する空隙の合計の個数を、解析範囲の面積で除した値である。
空隙の開口面積が０．００２５μｍ２以上であると、核酸合成の原料が細孔内部へ供給されやすく、目的鎖長までオリゴ核酸の伸長反応が進みやすい。
無機多孔質体表面の空隙の密度（個／μｍ２）は、以下のようにして求めることができる。
走査型電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ＳＥＭ）を用いて、無機多孔質体表面を、走査電子顕微鏡像（ＳＥＭ像）として観察する。ＳＥＭによる観察は、例えば、測定倍率を５００００倍に調整して行うことができる。
次に、得られたＳＥＭ像を、コンピュータに取り込み、画像解析ソフト「Ｉｍａｇｅ Ｊ」を用い、該ＳＥＭ像中における最大輝度及び最小輝度の中間値で二値化処理を行う。二値化処理は、該ＳＥＭ像中の空隙部を黒色とし、該ＳＥＭ像中の担体部を白色として変換を行い、二値化処理済み画像を得る。その際、無機多孔質体表面に対応する画像を目視し、空隙部と担体部との齟齬が無いことを確認する。
次に、黒色の領域（空隙部）から、その面積（開口面積）が０．００２５μｍ２以上であるものを抽出する。そして、その面積が０．００２５μｍ２以上を有する空隙の個数を数えて総数を求める。求めた空隙の総数を、解析に用いた画像の面積で除することで、無機多孔質体表面の空隙の密度（個／μｍ２）を算出する。
図１は、無機多孔質体表面のＳＥＭ像（図１（ａ））、及びその二値化処理済み画像（図１（ｂ））を示している。
図１（ａ）のＳＥＭ像における担体部ａ１は、二値化処理により白色に変換されて、図１（ｂ）の二値化処理済み画像では白色部ｂ１に対応する。
図１（ａ）のＳＥＭ像における空隙部ａ２は、二値化処理により黒色に変換されて、図１（ｂ）の二値化処理済み画像では黒色部ｂ２に対応する。
上記一連の操作は、同一の無機多孔質体の異なる複数の表面についてのＳＥＭ像に対して行う。そして、開口面積０．００２５μｍ２以上を有する空隙の平均総数を、解析に用いた画像の面積で除することで、無機多孔質体表面の空隙の密度（個／μｍ２）を算出する。
尚、二値化処理後、空隙の総数を数える際、黒色で閉ざされている領域を空隙１個と数える。空隙部が繋がっている場合、黒色で閉ざされている領域として１つであれば、空隙１個と数えるものとする。
本実施形態における無機多孔質体表面の画像解析により得られる、開口面積０．００２５μｍ２以上を有する空隙の密度（個／μｍ２）は、１２個／μｍ２から３０個／μｍ２であり、１４個／μｍ２から２８個／μｍ２であることが好ましい。
かかる空隙の密度が、前記範囲の下限値以上であれば、無機多孔質体の細孔内部まで原料が供給されやすくなる。一方、前記範囲の上限値以下であれば、核酸伸長反応の際、オリゴ核酸同士の立体障害がより生じにくくなる。
本実施形態における無機多孔質体の大きさは、特に限定されないが、カラム充填効率及びカラム充填時の送液速度等の観点から、レーザー回折法（散乱式）により測定される粒子径（メジアン径、以下同じ）が１～１０００μｍであることが好ましく、５～５００μｍであることがより好ましく、１０～３００μｍであることがさらに好ましい。
無機多孔質体の細孔容積は、特に限定されない。一般的には、カラム当たりの核酸の生成量を高めるために、核酸の鎖長に関わらず、体積当たりの細孔容積（ｍＬ／ｍＬ）は高い方が好ましい。体積当たり細孔容積は０．０５～０．６ｍＬ／ｍＬであることが好ましく、０．０５～０．５ｍＬ／ｍＬであることがより好ましい。
前記体積当たり細孔容積は、水銀圧入法により得られる嵩密度（ｇ／ｍＬ）と、細孔径が０．０４μｍから１μｍの範囲にある累積細孔容積（ｍＬ／ｇ）との積により求められる。
本実施形態における無機多孔質体の体積当たり比表面積は、特に限定されない。カラム当たりの核酸の生成量を高めるために、核酸の鎖長に関わらず、体積当たり比表面積は高い方が好ましい。体積当たり比表面積として具体的には、０．１ｍ２／ｍＬ以上１００ｍ２／ｍＬ以下であることが好ましく、１ｍ２／ｍＬ以上５０ｍ２／ｍＬ以下であることがより好ましく、３ｍ２／ｍＬ以上２０ｍ２／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。
体積当たり比表面積は、水銀圧入法により得られる嵩密度（ｇ／ｍＬ）と、Ｎ２吸脱着等温線測定により得られる、質量当たり比表面積（ｍ２／ｇ）との積により求められる。なお、ここでの質量当たり比表面積は、αｓ－ｐｌｏｔ法といった手法により、αｓ＝１．７～２．１の範囲の平均勾配から求められる値を用いる。
無機多孔質体の気孔率は、特に限定されず、一般的には、カラム当たりの核酸の生成量を高めるために、核酸の鎖長に関わらず、高い方が好ましい。前記気孔率は、水銀圧入法により求められ、５０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがさらに好ましい。
ここでの気孔率は、水銀圧入法の測定範囲である細孔径０．００４～２００μｍの範囲での細孔容積から算出する。すなわち、０．００４μｍから２００μｍの範囲にある累積細孔容積（ｍＬ／ｇ）と嵩密度（ｇ／ｍＬ）との積により求められる。
本実施形態の無機多孔質担体は、下記一般式（１）で表されるリンカーを有する。
Figure 0007368455000004
 ［式中、＊を付された結合は、無機多孔質体のシラノール基の酸素原子への結合を表す。
ｎは、１、２又は３の整数を表す。
Ｒは、それぞれ独立して、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよい炭素数が３～１０のアルキル基；アルキル基、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよいフェニル基；ヒドロキシル基；又は、炭素数が１～４のアルコキシ基を表す。
Ｌは、単結合、炭素数が１～２０のアルキレン基、又は、炭素数２～２０のアルキレン基であって、当該アルキレン基を構成する少なくとも１つの－ＣＨ２－ＣＨ２－基に、－Ｏ－、－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－及び－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－からなる群から選ばれる何れかの基Ｑが挿入されている基：－ＣＨ２－Ｑ－ＣＨ２－を含む基を表す。ただし、基Ｑと結合しているメチレン基の炭素原子は、さらに別の基Ｑと同時に結合することはない。］
前記式（１）中、Ｒにおけるアルキル基は、直鎖状アルキル基、分岐鎖状アルキル基又は環状アルキル基のいずれであってもよく、収率を高められやすいことから、分岐鎖状アルキル基であることが好ましい。Ｒにおけるアルキル基は、炭素数が３～１０であり、炭素数が３～６であることが好ましく、炭素数が３又は４であることがより好ましい。
Ｒにおけるアルキル基としては、例えば、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ－オクチル基等の直鎖状アルキル基；イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、２－エチルヘキシル基、３，７－ジメチルオクチル基等の分岐鎖状アルキル基；及び、シクロプロピル基、シクロヘキシル基等の環状アルキル基が挙げられる。
Ｒで表されるアルキル基に置換していてもよい置換基は、アルコキシ基、フッ素原子である。このアルコキシ基としては、炭素数が１～３のアルコキシ基が挙げられる。
Ｒで表されるフェニル基に置換していてもよい置換基は、アルキル基、アルコキシ基、フッ素原子である。ここでのアルキル基としては、炭素数が１～５のアルキル基が挙げられる。ここでのアルコキシ基としては、炭素数が１～３のアルコキシ基が挙げられる。
前記式（１）中のｎが１である場合、複数のＲは、相互に同一であってもよいし異なっていてもよく、合成上（例えば、簡便さ、効率さ）の点から、同一であることが好ましい。
前記式（１）中、Ｒにおけるアルコキシ基は、炭素数が１～４であり、炭素数１～３のアルキコキシ基が好ましく、メトキシ基、又はエトキシ基がより好ましい。
前記式（１）中、Ｌにおけるアルキレン基は、直鎖状アルキレン基、分岐鎖状アルキレン基のいずれであってもよく、収率を高められやすいことから、直鎖状アルキレン基であることが好ましい。Ｌにおけるアルキレン基は、炭素数が１～２０であり、炭素数が１～１０であることが好ましく、炭素数が１～６であることがより好ましい。
また、Ｌにおけるアルキレン基は、炭素数２～２０のアルキレン基であって、当該アルキレン基を構成する少なくとも１つの－ＣＨ２－ＣＨ２－基に、－Ｏ－、－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－及び－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－からなる群から選ばれる何れかの基Ｑが挿入されている基：－ＣＨ２－Ｑ－ＣＨ２－を含む基を表すものでもよい。
ただし、本実施形態において、前記一般式（１）で表されるリンカーは、基Ｑと結合しているメチレン基の炭素原子は、さらに別の基Ｑと同時に結合することはない。
かかる無機多孔質担体としては、例えば、以下のような式（１－１）、（１－２）もしくは（１－３）で表されるリンカーの何れか、又はこれらから選ばれる複数の形態のものを包含するものが例示される。
Figure 0007368455000005
前記の式（１－１）、（１－２）及び（１－３）中、＊、Ｒ及びＬは、前記式（１）中の＊、Ｒ及びＬについての説明と同様である。
本実施形態の無機多孔質担体は、例えば、前記無機多孔質体を、下記一般式（３）で表されるシランカップリング剤で表面処理する方法により製造することができる。
Figure 0007368455000006
 ［式中、ｎは、１、２又は３の整数を表す。
Ｒは、それぞれ独立して、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよい炭素数が３～１０のアルキル基；アルキル基、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよいフェニル基；ヒドロキシル基；又は、炭素数が１～４のアルコキシ基を表す。
Ｒ１は、それぞれ独立して、水素原子又はアルキル基を表す。Ｌは、単結合、炭素数が１～２０のアルキレン基、又は、炭素数２～２０のアルキレン基であって、当該アルキレン基を構成する少なくとも１つの－ＣＨ２－ＣＨ２－基に、－Ｏ－、－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－及び－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－からなる群から選ばれる何れかの基Ｑが挿入されている基：－ＣＨ２－Ｑ－ＣＨ２－を含む基を表す。ただし、基Ｑと結合しているメチレン基の炭素原子は、さらに別の基Ｑと同時に結合することはない。］
前記式（３）中、Ｒ及びＬについての説明は、前記式（１）中のＲ及びＬについての説明と同様である。
前記式（３）中、Ｒ１におけるアルキル基は、炭素数１～３のアルキル基が好ましく、メチル基、又はエチル基がより好ましい。
前記一般式（１）で表されるリンカーを有する無機多孔質担体の製造は、例えば、前記無機多孔質体と、特定のシランカップリング剤と、溶媒とを混合した後、溶媒を除去する方法で行われる。この場合、前記混合により、特定のシランカップリング剤が無機多孔質体の表面のシラノール基と共有結合して、一般式（１）で表されるリンカーを担持する無機多孔質担体が生成する。
ここでの溶媒には、アセトニトリル、トルエン、アニソール、２－ヘプタノン、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、キシレン、メシチレン、ジクロロメタン、クロロベンゼン、水等、またはこれらの２種以上を用いることができ、これらの中でもトルエンが好ましい。
前記の無機多孔質体及び溶媒は、シランカップリング剤同士の重合の抑制や、シランカップリング剤と無機多孔質体表面との反応促進の観点からは、脱水して用いることが好ましい。脱水方法は、特に限定されないが、例えば、無機多孔質体を減圧下で加熱する方法や、無機多孔質体を溶媒に分散させた後、常圧あるいは減圧下に溶媒を留去して共沸脱水する方法が挙げられる。
無機多孔質体とシランカップリング剤と溶媒との前記混合の際、通常は反応促進のために溶媒の沸点近くまで加熱するが、これに限定されず、室温でもよいし、室温以下に冷却してもよい。
無機多孔質体とシランカップリング剤との反応は、通常、１～１２時間程度で行うが、アミノ基を有するシランカップリング剤の場合、それ自身が反応を促進する触媒効果があるため、数分間程度で行ってもよい。
シランカップリング剤の添加量は、Ｎ２吸脱着測定により求められる、無機多孔質体の質量当たり比表面積に対して、通常、リンカーの担持密度が０．１～５．０μｍｏｌ／ｍ２になる量であり、好ましくは０．５～２．０μｍｏｌ／ｍ２になる量である。
シランカップリング剤との反応に使われなかったシラノール基は、所望であれば、トリメチルシリル基のような核酸合成に不活性な官能基でキャッピングしてもよい。
このように、前記無機多孔質体を、特定のシランカップリング剤で表面処理することによって、アミノシリル基で修飾された無機多孔質担体を製造することができる。
上記の一般式（３）のシランカップリング剤は、以下に示す反応経路（合成ルート１、合成ルート２、又は合成ルート３）により製造することができる。
Figure 0007368455000007
合成ルート１（化合物１→化合物２→化合物３→化合物６の合成ルート）の説明：
例えば化合物１がトリクロロシランである場合、この化合物１に、Ｒに対応する有機リチウム化合物又は有機マグネシウム化合物を反応（求核置換反応）させて、化合物２を得る（Ｓｔｅｐ１）。次いで、Ｒ１ＯＨ（例えばメタノール、エタノール、又はプロパノール等）を塩基の存在下で反応させるか、又はＲ１ＯＮａ等のアルコラートもしくは水（Ｒ１：水素）を反応させて、シラン化合物３を得る（Ｓｔｅｐ２）。その後、末端オレフィンを有するアミン化合物又はハロゲン化合物である化合物４（例えば、アリルアミン、又は６－クロロ－１－ヘキセン）を、白金触媒の存在下でヒドロシリル化反応させて、シラン化合物６を合成することができる（Ｓｔｅｐ３）。
あるいは、化合物１がアルコキシシラン（例えば、トリメトキシシラン、又はトリエトキシシラン等）である場合、この化合物１に、前記と同様の反応により、置換基（Ｒ）を求核置換反応によって導入し、その後、前記ヒドロシリル化反応によって、シラン化合物６を合成してもよい。又は、化合物１がアルコキシシラン（例えば、トリメトキシシラン、又はトリエトキシシラン等）である場合、この化合物１に、前記ヒドロシリル化反応を行い化合物５を得て、さらに、前記と同様の反応により、置換基（Ｒ）を求核置換反応によって導入してシラン化合物６を合成してもよい。
合成ルート２（化合物１→化合物５→化合物７→化合物６）の説明：
例えば化合物１がトリクロロシランである場合、この化合物１を、白金触媒の存在下で、化合物４（Ｙはハロゲンを表す。ｍは１から１８の整数を表す。）をヒドロシリル化反応させることにより、化合物５を得る。次いで、前記と同様の反応により、置換基（Ｒ）を求核置換反応によって導入して化合物７を得る。次いで、Ｒ１ＯＨ（例えばメタノール、エタノール、又はプロパノール等）を塩基の存在下で反応させるか、又はＲ１ＯＮａ等のアルコラートもしくは水（Ｒ１：水素）を反応させて、シラン化合物６（Ｌｇ：Ｒ１Ｏ基を表す）を得る。
Ｒ１基（Ｒ：メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基等）の導入は、試薬としてメタノール、エタノール、又はプロパノール等を、化合物２（Ｌｇ：ハロゲン）又は化合物４（Ｌｇ：ハロゲン）を含む溶液に添加する方法、あるいは化合物２又は化合物６を、対応するアルコールもしくは対応するアルコールを含む溶液中に滴下する方法により行うことができる。
合成ルート３（化合物６→シランカップリング剤の合成ルート）の説明：
上述の合成ルート１及び合成ルート２においては、官能基Ｙ（アミノ基あるいはハロゲン原子）を有するシラン化合物６が得られる。
官能基Ｙがアミノ基である場合、シラン化合物６のアミノ基を、カルバモイル化あるいはアミド化あるいはウレイド化する方法を用いることにより、種々のシランカップリング剤を製造することができる。
官能基Ｙがハロゲン原子である場合、シラン化合物６に、アンモニアあるいは１級アミン化合物を反応させることにより、ハロゲン原子を脱離させてアミノ基もしくはイミノ基（－ＮＨ－）を導入するか、あるいはエーテル結合を導入することにより、種々のシランカップリング剤を製造することができる。
上述した何れの反応においても、反応溶媒を用いることが好ましい。その反応溶媒としては、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、トルエン、テトラヒドロフラン等、またはこれらの２種以上の有機溶媒が好ましい。
シラン化合物の精製には、通常、常圧あるいは減圧条件下での蒸留が用いられる。得られたシランカップリング剤の精製には、例えば、分液や蒸留、カラムクロマトグラフィーが用いられる。
（核酸製造方法）
本実施形態の核酸の製造方法は、上述の無機多孔質担体を用い、公知の方法を適用して核酸を合成することができる。なかでもホスホロアミダイト法による核酸の製造が好適である。以下、ホスホロアミダイト法による核酸合成法について説明する。
［固相担体の作製］
固相担体とは、上述の無機多孔質担体が有するアミノ基（－ＮＨ２）に、２価の基を介して、反応性の基が保護あるいは脱保護されたヌクレオシド、ヌクレオチド又はユニバーサルリンカーが結合したものをいう。
本実施形態においては、下記一般式（２）で表されるリンカーを有し、水銀圧入法により測定される細孔分布において、細孔径の最頻値（モード径）が０．０４μｍから１μｍであり、下記無機多孔質体表面の画像解析により得られる、開口面積０．００２５μｍ２以上を有する空隙の密度が１２個／μｍ２から３０個／μｍ２である無機多孔質担体を、固相担体として用いることができる。
Figure 0007368455000008
 ［式中、＊を付された結合は、無機多孔質体のシラノール基の酸素原子への結合を表す。
ｎは、１、２又は３の整数を表す。
Ｒは、それぞれ独立して、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよい炭素数が３～１０のアルキル基；アルキル基、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよいフェニル基；ヒドロキシル基；又は、炭素数が１～４のアルコキシ基を表す。
Ｌは、単結合、炭素数が１～２０のアルキレン基、又は、炭素数２～２０のアルキレン基であって、当該アルキレン基を構成する少なくとも１つの－ＣＨ２－ＣＨ２－基に、－Ｏ－、－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－及び－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－からなる群から選ばれる何れかの基Ｑが挿入されている基：－ＣＨ２－Ｑ－ＣＨ２－を含む基を表す。ただし、基Ｑと結合しているメチレン基の炭素原子は、さらに別の基Ｑと同時に結合することはない。
Ｒｂは、反応性の基が保護あるいは脱保護されたヌクレオシド又はヌクレオチドを表す。
Ｌ１は、Ｒｂの１級又は２級のヒドロキシル基の酸素原子と結合している２価の基を表す。］
前記式（２）中、Ｒ及びＬについての説明は、前記式（１）中のＲ及びＬについての説明と同様である。
前記式（２）中、イミノ基（－ＮＨ－）と結合する２価の基Ｌ１としては、官能基としてスクシニル基を有するものが好ましい。
２価の基Ｌ１の典型的な例としては、スクシニルリンカー、ユニバーサルリンカー、又は前記式（２）中のイミノ基（－ＮＨ－）とユニバーサルリンカーとを連結する基と、ユニバーサルリンカーとから構成される連結基が例示される。
ユニバーサルリンカーとは、核酸合成の起点となるヌクレオチドのヒドロキシル基とホスファイトを形成する官能基（典型的には、ヒドロキシル基）と、前記式（１）で表されるリンカー末端のアミノ基と結合する能力を有する官能基とを有し、かつ、同一分子内に、合成された核酸を切り離す際の条件下で、リン酸のリン原子を求核攻撃する能力を有する隣接する保護された官能基（例えば、いずれも保護されたアミノ基、ヒドロキシル基、チオール基）を有する。
より詳しくは、２価の基Ｌ１としては、下記の式Ｌ１０で表される連結基、又は式Ｌ１１で表される連結基が例示される。
Figure 0007368455000009
ここで、式Ｌ１０及び式Ｌ１１において、●を付した結合は、前記式（２）中のイミノ基（－ＮＨ－）への結合を表す。
＃を付した結合は、前記式（２）中のＲｂの１級又は２級のヒドロキシル基の酸素原子との結合を表す。
式Ｌ１１において、Ｚ１は、いずれも保護されたアミノ基、ヒドロキシル基又はチオール基を表す。Ｚに結合している酸素原子及びＺ１は、互いに隣接（例えば、ビシナルに存在し、それぞれが結合しているＺの炭素原子同士は、互いに直接結合している）している基を表す。
Ｌ１２は、イミノ基（－ＮＨ－）とユニバーサルリンカーとを連結する基を表す（例えば、●－ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯ－＆を表す。
＆を付した結合は、Ｚとの結合を表す）。
尚、ユニバーサルリンカーを用いた場合、合成したい核酸の３’末端がどのような種類のヌクレオシド又はヌクレオチドであっても、３’末端になるヌクレオシドホスホロアミダイドを通常の核酸自動合成において核酸を伸長する工程と同じように反応させて導入することができる。かかるユニバーサルリンカーとしては、例えば、下記の文献に記載の化合物が例示されるが、それらに限定されるものではない。
文献：Ａ.Ｐ. Ｇｕｚａｅｖ, ａｎｄ Ｍ. Ｍａｎｏｈａｒａｎ, Ｊ ＡｍＣｈｅｍ Ｓｏｃ, ２００３, １２５, ２３８０－２３８１.
文献：Ｒ.Ｋ. Ｋｕｍａｒ, Ａ.Ｐ. Ｇｕｚａｅｖ, Ｃ. Ｒｅｎｔｅｌ, ａｎｄ Ｖ.Ｔ.Ｒａｖｉｋｕｍａｒ, Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ, ２００６, ６２, ４５２８.
前記式（２）中、Ｒｂは、核酸伸長反応の起点となるヌクレオシドの５’位のヒドロキシル基が、トリチル系保護基（例えば、４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基等）により保護されたものが好ましい。
ユニバーサルリンカーを用いる場合も同様に、核酸伸長反応の起点となるヒドロキシル基が、トリチル系保護基（例えば、４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基等）により保護されたものが好ましい。
前記式（２）で表されるリンカーを有する固相担体の調製は、典型的には、前記一般式（１）で表されるリンカーを有する無機多孔質担体と、化合物（Ｒｂ－Ｌ１０－Ｗ）とを縮合反応させて行われる。このＬ１０は、前記の式Ｌ１０で表される連結基を表す。Ｗは、反応性の官能基（例えば、ヒドロキシル基）を表す。
ヌクレオシドリンカーを用いる場合、合成するＲＮＡの配列に応じて、３’末端の塩基に対応するヌクレオシドリンカーを選択する。前記ヌクレオシドリンカーとしては、アミノ基（－ＮＨ２）と反応する官能基としてスクシニル基を有するヌクレオシドリンカーを挙げられる。
スクシニル基を含むヌクレオシドリンカーを以下に例示する。
式中の＊は、前記式（２）中のイミノ基（－ＮＨ－）への結合を表す。ＴＢＤＭＳは、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基を意味する。Ａｃは、アセチル基を意味する。
Figure 0007368455000010
ここでの縮合反応は、前記無機多孔質担体と、前記化合物（Ｒｂ－Ｌ１０－Ｗ）と、縮合剤と、適切な溶媒とを混合し、通常、室温で振とうするか、あるいは縮合反応促進のために昇温して行われる。この縮合反応は、振とうせずに静置し、撹拌しつつ行ってもよい。
前記縮合反応の際に用いる縮合剤には、一般にアミド縮合に使用されているものであれば用いることができる。縮合剤として具体的には、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドテトラフルオロボラート（ＴＡＴＵ）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドテトラフルオロボラート（ＴＢＴＵ）、（１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノモルホリノカルベニウムヘキサフルオロホスファート（ＣＯＭＵ）、Ｏ－［（エトキシカルボニル）シアノメチレンアミノ］－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＴＯＴＵ）等、またはこれらの２種以上が例示される。Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジン（ＤＭＡＰ）や、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンなどの添加剤を加えてもよい。
縮合反応後の固相担体は、溶媒を用いてろ過を行うことにより濾別する。ろ過用の溶媒としては、アセトニトリル等が挙げられる。未反応のアミノ基に対してはキャッピング処理を行う。キャッピング処理剤には、例えば無水酢酸（無水酢酸－テトラヒドロフラン溶液など）やフェノキシ酢酸無水物（フェノキシ酢酸無水物／Ｎ－メチルイミダゾール溶液など等）が用いられる。キャッピングの成否は、ニンヒドリン試験で行う。４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基などの保護基を有するヌクレオシドリンカーやユニバーサルリンカーを用いた場合、反応したヌクレオシドの定量は、酸によるＤＭＴｒ基の切断と吸光度測定によって行う。
前記（Ｒｂ－Ｌ１）の担持量は、Ｎ２吸脱着測定により求められる、無機多孔質体の質量当たり比表面積に対して、通常、０．１～５．０μｍｏｌ／ｍ２になる量であり、好ましくは０．５～２．０μｍｏｌ／ｍ２になる量である。
本実施形態の固相担体は、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の固相合成用基材として好適なものである。中でも、本実施形態の固相担体は、ＤＮＡに比べて安定性に問題のあるとされるＲＮＡの合成に特に適している。
以下、ＲＮＡの固相合成を例に挙げて、以下に示す反応経路（縮合反応、酸化、脱保護）を参照しながら核酸の製造方法について説明する。
尚、以下に示す反応経路については、前記式（２）中のＲｂにヌクレオシドを用いた例を示す。
Figure 0007368455000011
反応経路を示す化学式中、Ｒ６は塩基；Ｔｒは保護基；Ｘは－Ｈ、－ＯＨ又は－ＯＲ７（Ｒ７は保護基）をそれぞれ表している。
前記一般式（２）で表されるリンカーを有する固相担体（Ｓｐ－Ｎｕ）及びアミダイトモノマー（Ａｍ－１）のヌクレオシドを構成する塩基（Ｒ６）は、通常、核酸、典型的にはＲＮＡを構成する天然の塩基であるが、非天然の塩基を場合によっては使用してもよい。かかる非天然の塩基としては、天然あるいは非天然の塩基の修飾アナログが例示される。
Ｒ６で表される塩基としては、例えば、アデニン、イソグアニン、キサンチン、ヒポキサンチン及びグアニン等のプリン塩基；及び、シトシン、ウラシル及びチミン等のピリミジン塩基等が挙げられる。
また、Ｒ６で表される塩基としては、例えば、２－アミノアデニン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン等のアミノ誘導体；５－メチルウラシル、５－メチルシトシン、７－メチルグアニン、６－メチルプリン、２－プロピルプリン等のアルキル誘導体；５－ハロウラシル及び５－ハロシトシン；５－プロピニルウラシル及び５－プロピニルシトシン；６－アザウラシル、６－アザシトシン及び６－アザチミン；５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、５－（２－アミノプロピル）ウラシル、５－アミノアリルウラシル；８－ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化及び他の８－置換プリン；５－トリフルオロメチル化及び他の５－置換ピリミジン；６－アザピリミジン；Ｎ－２、Ｎ－６及びＯ－６置換プリン（２－アミノプロピルアデニンを含む）；ジヒドロウラシル；３－デアザ－５－アザシトシン；７－デアザアデニン；Ｎ６－メチルアデニン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン；５－アミノ－アリル－ウラシル；Ｎ３－メチルウラシル；置換１，２，４－トリアゾール；２－ピリジノン；５－ニトロインドール；３－ニトロピロール；５－メトキシウラシル；ウラシル－５－オキシ酢酸；５－メトキシカルボニルメチルウラシル；２－チオウラシル、５－メチル－２－チオウラシル；５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウラシル；５－メチルアミノメチル－２－チオウラシル；３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウラシル；３－メチルシトシン；Ｎ４－アセチルシトシン；２－チオシトシン；Ｎ６－メチルアデニン；Ｎ６－イソペンチルアデニン；２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン；Ｎ－メチルグアニン；Ｏ－アルキル化塩基等；およびこれらの２種以上が挙げられる。
また、プリン化合物及びピリミジン化合物は、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」，８５８～８５９頁，クロシュビッツ ジェー アイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９０、及びイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈら）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０巻，ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。
好適なアミダイトモノマー（Ａｍ－１）としては、下記化学式（Ａｍ－１’）で表される化合物において、Ｒ７がｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基、ビス（２－アセトキシ）メチル（ＡＣＥ）基、（トリイソプロピルシリロキシ）メチル（ＴＯＭ）基、（２－シアノエトキシ）エチル（ＣＥＥ）基、（２－シアノエトキシ）メチル（ＣＥＭ）基、パラ－トルイルスルホニルエトキシメチル（ＴＥＭ）基、（２－シアノエトキシ）メトキシメチル（ＥＭＭ）基などで保護された、ＴＢＤＭＳアミダイト（ＴＢＤＭＳ ＲＮＡ Ａｍｉｄｉｔｅｓ、商品名、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＡＣＥアミダイト、ＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト（Chakhmakhchevaの総説：Protective Groups in the Chemical Synthesis of Oligoribonucleotides、Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2013, Vol. 39, No. 1, pp. 1-21.）、ＥＭＭアミダイト（国際公開第２０１３／０２７８４３号に記載）等が例示される。
Figure 0007368455000012
 ［式中、Ｒ７は、ヒドロキシル基の保護基を表す。Ｒ６は、保護された核酸塩基を示す。］
本実施形態の固相担体は、ヌクレオシドやヌクレオチド以外の２価の基を核酸配列に組み込むために使うこともできる。例えば、プロリン骨格を有するアミダイト（後述のアミダイトＰなど）を、アミダイト法により、核酸配列に組み込むことができる（国際公開第２０１２／０１７９１９号の実施例Ａ４の方法と同様の方法を参照）。また、下記の構造式（Ａｍ－１１）、（Ａｍ－１２）及び（Ａｍ－１３）でそれぞれ表されるアミダイト（国際公開第２０１３／１０３１４６号の実施例Ａ１～Ａ３参照）を使用することもできる。
Figure 0007368455000013
 ［式中、ｉＰｒはイソプロピル基を表す。ＤＭＴｒは４，４’－ジメトキシトリチル基を表す。Ｔｆａはトリフルオロアセチル基を表す。］
［ＲＮＡの固相合成］
前記一般式（２）で表されるリンカーを有する固相担体（Ｓｐ－Ｎｕ）を脱保護（－Ｔｒ）して、固相担体（Ａｍ－２）を得る。この後、アミダイトモノマー（Ａｍ－１）と、固相担体（Ａｍ－２）とを縮合反応させて、反応生成物（Ａｍ－３）を得る。この後、反応生成物（Ａｍ－３）を酸化して、生成物（Ａｍ－４）を得る。この後、生成物（Ａｍ－４）を脱保護（－Ｔｒ）して、生成物（Ａｍ－５）を得る。次いで、アミダイトモノマー（Ａｍ－１）と生成物（Ａｍ－５）とをさらに縮合反応させて、ホスホジエステル結合を伸長していく。
このように、伸長したオリゴヌクレオチド鎖末端の５’位のヒドロキシル基を、所望の配列となるように、一連の脱保護、縮合反応、酸化のサイクルを必要なだけ繰り返し、この後、固相担体から切り出すことにより、所望の配列の核酸分子を製造することができる。
より詳しくは、以下の工程を含む製造方法により核酸が製造される。
工程（Ａ）：前記一般式（２）中のＲｂが、反応性の基としてヒドロキシル基が保護されたヌクレオシド又はヌクレオチドを表す無機多孔質担体を用い、前記のヌクレオシドの５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程；
工程（Ｂ）：前記工程（Ａ）において生成したヌクレオシドの５’位のヒドロキシル基と、第２のヌクレオシド塩基を有するアミダイト化合物とを縮合反応させて、ホスファイトを生成する縮合工程；
工程（Ｃ）：前記工程（Ｂ）において生成したホスファイトを酸化させて、ヌクレオチドを生成する酸化工程；
工程（Ｄ）：前記工程（Ｃ）において生成したヌクレオチドの５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程。
前記の工程（Ａ）～（Ｄ）を含む製造方法は、任意に以下の工程を含む。
工程（Ｂ’）：前記工程（Ｄ）において生成した生成物と、次に導入予定のヌクレオシド塩基を有するアミダイト化合物とをさらに縮合反応させて、ホスファイトを生成する工程；
工程（Ｃ’）：前記工程（Ｂ’）において生成したホスファイトを酸化させて、オリゴヌクレオチドを生成する工程；
工程（Ｄ’）：前記工程（Ｃ’）において生成したオリゴヌクレオチド鎖末端の５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程；
工程（Ｅ）：前記の工程（Ｂ’）、工程（Ｃ’）及び工程（Ｄ’）からなる一連の工程を、さらにｍ回（ｍは、１以上の整数を表す。）繰り返して、ｍ個のアミダイト化合物を反応（核酸伸長反応）させた後、伸長した核酸を切り出す工程。
本実施形態における核酸伸長反応は、一般的なホスホロアミダイト法の手順に従い行うことができる。
本明細書において、「核酸伸長反応」とは、ホスホジエステル結合を介して、ヌクレオチドを順次結合させることにより、核酸鎖、特にＲＮＡ鎖を伸長させる反応を意味する。核酸伸長反応は、ホスホロアミダイト法を採用する核酸自動合成装置等を用いてってもよい。
脱保護する工程では、固相担体上に担持されるＲＮＡ鎖末端の５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する。一般的な保護基としては、トリチル系保護基（典型的には、ＤＭＴｒ基）が用いられる。脱保護は、酸を用いて行うことができる。脱保護用の酸としては、例えば、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸、及びｐ－トルエンスルホン酸等が挙げられる。
縮合工程では、前記の脱保護する工程により脱保護したＲＮＡ鎖末端の５’位のヒドロキシル基に対して、ヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させて、ホスファイトを生成する。前記ヌクレオシドホスホロアミダイトとしては、５’位のヒドロキシル基が保護基（例えばＤＭＴｒ基）で保護されたものを用いる。
また、縮合工程は、前記ヌクレオシドホスホロアミダイトを活性化する活性化剤を用いて行うことができる。活性化剤としては、例えば、５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＢＴＴ）、１Ｈ－テトラゾール、４，５－ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）、Ｎ－メチルベンズイミダゾリウムトリフラート（Ｎ－ＭｅＢＩＴ）、ベンズイミダゾリウムトリフラート（ＢＩＴ）、Ｎ－フェニルイミダゾリウムトリフラート（Ｎ－ＰｈＩＭＴ）、イミダゾリウムトリフラート（ＩＭＴ）、５－ニトロベンズイミダゾリウムトリフラート（ＮＢＴ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、又は５－（ビス－３，５－トリフルオロメチルフェニル）－１Ｈ－テトラゾール（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－４２）等、またはこれらの２種以上が挙げられる。
縮合工程の後は、適宜、未反応の５’位のヒドロキシル基をキャッピングしてもよい。キャッピングは、無水酢酸－テトラヒドロフラン溶液、フェノキシ酢酸／Ｎ－メチルイミダゾール溶液等の公知のキャッピング溶液を用いて行うことができる。
酸化工程は、前記縮合工程により形成されたホスファイトを酸化する工程である。酸化工程は、酸化剤を用いて行うことができる。酸化剤としては、ヨウ素、ｍ－クロロ過安息香酸、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド、２－ブタノンペルオキシド、ビス（トリメチルシリル）ペルオキシド、１，１－ジヒドロペルオキシシクロドデカン、過酸化水素等、またはこれらの２種以上が挙げられる。
酸化工程は、前記キャッピング操作の後で行ってもよいし、逆に、酸化工程の後でキャッピング操作を行ってもよいし、この順番は限定されない。
酸化工程後は、脱保護工程に戻り、合成すべきＲＮＡのヌクレオチド配列に応じて、上記の縮合反応、酸化、脱保護の工程を繰り返すことにより、所望の配列を有するＲＮＡを合成することができる。
所望の配列を有するＲＮＡ鎖の合成が完了した後は、アンモニア又はアミン類等を用いて、固相担体からＲＮＡ鎖を切断して回収する。
ここでのアミン類としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、イソプロピルアミン、エチレンジアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン等、またはこれらの２種以上が挙げられる。
ユニバーサルリンカーを用いる場合、ＲＮＡ鎖の合成が完了した後は、アンモニア又はアミン類等を用いて、固相担体からの切断を行い、求核試薬によるユニバーサルリンカーの除去を行う。除去が完了した際には、末端ヌクレオチドの３’位はヒドロキシル基となり、ホスフェートはユニバーサルリンカーに結合して環状ホスホジエステルを形成する。回収したＲＮＡは、適宜、公知の方法で精製してもよい。
以上説明した本実施形態の無機多孔質担体においては、特定の細孔分布、すなわち、細孔径の最頻値（モード径）が０．０４μｍから１μｍの範囲に存在し、かつ、無機多孔質体表面の画像解析により得られる、開口面積０．００２５μｍ２以上を有する空隙の密度が１２個／μｍ２から３０個／μｍ２である固相担体が採用されている。かかる固相担体は、目的とする鎖長の伸長反応に対し、適切な開口面積を有する空隙が担体表面に数多く存在する。このため、かかる固相担体においては、核酸合成の原料が細孔内部へ供給されやすく、オリゴ核酸の伸長反応が進行しやすい。また、かかる固相担体は、適切な細孔径の細孔が高い均一性で存在する。したがって、本実施形態の無機多孔質担体からなる固相担体によれば、目的鎖長まで容易に伸長可能となり、核酸の製造において純度をより高められる。また、本実施形態の核酸の製造方法によれば、核酸の製造において純度をより高められ、特に長鎖ＲＮＡを、より高純度で安定に得ることができる。
加えて、本実施形態の無機多孔質担体を核酸合成に適用することにより、特に４０ｍｅｒ以上の長鎖ＲＮＡを合成する場合でも、高純度のＲＮＡを得ることができる。ＲＮＡ鎖の鎖長の上限は、特に限定されないが、例えば、２００ｍｅｒ以下又は１５０ｍｅｒ以下とすることができる。
本明細書において、「ＲＮＡの純度」は、目的の鎖長の核酸が得られている割合（％）をいう。液体クロマトグラフィーによるクロマトグラムにおける面百値（すなわち、面積百分率値）、又はメインピークの半値幅により求められる。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
＜無機多孔質体の作製＞
無機多孔質体として、下記のＳＰ（１）～ＳＰ（４）を用いた。無機多孔質体ＳＰ（１）～ＳＰ（４）のそれぞれについて、細孔径（モード径；μｍ）、粒子径（メジアン径；μｍ）、担体表面の空隙の密度（個／μｍ２）、体積当たり細孔容積（ｍＬ／ｍＬ）、体積当たり比表面積（ｍ２／ｍＬ）及び気孔率（％）を求めた。この結果を表１に示した。
細孔径（モード径；μｍ）、体積当たり細孔容積（ｍＬ／ｍＬ）及び気孔率（％）は、後述の［水銀圧入法による細孔分布の測定］によりそれぞれ求めた。粒子径（μｍ）は、レーザー回折法（散乱式）によりメジアン径を測定した。体積当たり比表面積（ｍ２／ｍＬ）は、水銀圧入法により得られる嵩密度（ｇ／ｍＬ）と、Ｎ２吸脱着等温線測定により得られる、質量当たり比表面積（ｍ２／ｇ）との積により求めた。担体表面の空隙の密度（個／μｍ２）は、後述のＳＥＭ観察及びその画像解析により求めた。
無機多孔質体ＳＰ（１）：
特許第５８７５８４３号公報に記載の実施例１と同様の方法でゼオライト成形体を得た。得られたゼオライト成形体を、アセトニトリル溶媒中で縣濁させて縣濁液を調製した。次いで、目開き１２５μｍ及び３８μｍのＪＩＳ篩で前記縣濁液を順次篩った。その後、目開き３８μｍの篩上に残存した粉末固体を、室温にて風乾して、白色粉末状固体である無機多孔質体ＳＰ（１）を得た。
無機多孔質体ＳＰ（２）：
容量１．５Ｌのステンレス製オートクレーブに、オルトケイ酸テトラエチル［Ｓｉ（ＯＣ２Ｈ５）４］１５５ｇ、４０質量％水酸化テトラ－ｎ－プロピルアンモニウム水溶液１３６ｇ、水酸化カリウム（純度８５％）０．３ｇ及び水１６２ｇを入れ、室温にて１２０分間激しく撹拌した。得られた混合液中のケイ素に対する、水、テトラ－ｎ－プロピルアンモニウムイオン、水酸化物イオン及びカリウムイオンのモル比は、それぞれ１８、０．３６、０．３８及び０．０４８であった。この混合液を、１０５℃にて４８時間、３００ｒｐｍの回転数で撹拌し、水熱合成反応を行った。得られた反応混合物を濾過し、濾液のｐＨが９．０以下になるまで繰り返し純水で洗浄した。得られたウェットケーキを１１０℃で乾燥させた後、乳鉢で粉砕した。得られた粉砕品を目開き２．３６ｍｍ及び目開き１．００ｍｍの篩いで順次篩別した。これを、管状炉を用い、５３０℃にて１時間窒素流通下に焼成し、次いで、さらに５３０℃にて１時間窒素と空気の混合ガス〔窒素：空気（体積比
）＝９：１〕流通下で焼成することにより白色の焼成物を得た。
次いで、上記で得られた焼成物１０ｇをシャーレに入れ、水１００ｍＬを入れた２リットルのセパラブルフラスコ中に静置し、蓋を閉めた後、セパラブルフラスコを８０℃の恒温槽に入れ、５時間放置した。セパラブルフラスコを取り出した後、２０℃まで放冷した。この固体８ｇをオートクレーブに入れ、この中に、７．５質量％硝酸アンモニウム水溶液８８ｇと２５質量％アンモニア水溶液１３４ｇとの混合液２２２ｇを加え、９０℃にて１時間撹拌した後、濾過により固体を分離した。この固体に対し、前記と同様の硝酸アンモニウム水溶液とアンモニア水溶液との混合液による処理をさらに２回繰り返した後、水洗、乾燥を行った。最後に、得られた白色固体を乳鉢で粉砕し、目開き１０６μｍ及び目開き３８μｍの篩いで順次篩別し、無機多孔質体ＳＰ（２）を得た。
無機多孔質体ＳＰ（３）：
無機多孔質体ＳＰ（３）として、市販の球状シリカゲル粉末（商品名：Ｍ．Ｓ．ＧＥＬ、ＡＧＣエスアイテック株式会社製）を用いた。
無機多孔質体ＳＰ（４）：
無機担体ＳＰ（４）として、市販の球状シリカゲル粉末（商品名：ＣＡＲｉＡＣＴ Ｑ－５０、富士シリシア化学株式会社製）を用いた。
［水銀圧入法による細孔分布の測定］
無機多孔質体ＳＰ（１）から無機多孔質体ＳＰ（４）について、水銀圧入法により、細孔径が約０．００４～２００μｍの細孔分布（細孔容積を細孔径で微分した値）の測定を行った。
前記測定には、ＡｕｔｏＰｏｒｅＩＶ９５２０（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ社製）を用いた。前処理として、無機多孔質体に対し、１５０℃で４時間の恒温乾燥を行った。
細孔径は、次式（Ａ）を用いて算出した。
Figure 0007368455000014
 Ｐ：圧力、Ｄ：細孔径、σ：水銀の表面張力、θ：水銀と試料との接触角
本測定において、水銀の表面張力σを０．４８Ｎ／ｍ、水銀と試料との接触角θを１４０°とした。
細孔径の最頻値（モード径）：
細孔径の最頻値（モード径）は、前記水銀圧入法により得られる細孔径分布（Ｘ軸を細孔径の値とし、Ｙ軸を細孔容積を細孔径で微分した値としたグラフとする）において、ピークトップのＸ軸の値から求めた。
空隙の密度（個／μｍ２）：
無機多孔質体ＳＰ（１）から無機多孔質体ＳＰ（４）について、ＳＥＭを用い、無機多孔質体表面を、走査電子顕微鏡像（ＳＥＭ像）として観察した。ＳＥＭによる観察は、下記の条件で行った。
使用したＳＥＭ：株式会社日立ハイテクノロジーズ製の製品名「Ｓ－４８００」
加速電圧：２ｋＶ
エミッション電流：１０μＡ
測定倍率：５００００倍
得られたＳＥＭ像を、コンピュータに取り込み、画像解析ソフト「Ｉｍａｇｅ Ｊ」を用い、該ＳＥＭ像中における最大輝度及び最小輝度の中間値で二値化処理を行った。図１に示したように、二値化処理によって、該ＳＥＭ像中の空隙部を黒色とし、該ＳＥＭ像中の担体部を白色として変換した、二値化処理済み画像を得た。その際、担体表面に対応する画像を目視し、空隙部と担体部との齟齬が無いことを確認した。
次に、黒色の領域（空隙部）から、その面積（開口面積）が０．００２５μｍ２以上であるものを抽出した。そして、その面積が０．００２５μｍ２以上を有する空隙の個数を数えて総数を求めた。
上記一連の操作を、同一の無機多孔質体の異なる５箇所の表面についてのＳＥＭ像に対して行った。そして、開口面積０．００２５μｍ２以上を有する空隙の平均総数を、解析範囲の面積で除することで、空隙の密度（個／μｍ２）を算出した。
＜シランカップリング剤＞
シランカップリング剤として、下記の（Ｃ１）成分、（Ｃ２）成分を用いた。
（Ｃ１）成分：
市販の３－アミノプロピルジイソプロピルエトキシシランを購入して使用した。
（Ｃ２）成分：
３－アミノプロピルトリエトキシシラン（TCI, CAS RN：919-30-2 製品コード：A0439）を使用した。
＜無機多孔質担体の製造＞
各実施例の無機多孔質担体は、上記製造した無機多孔質体ＳＰ（１）～ＳＰ（４）を、シランカップリング剤（Ｃ１）～（Ｃ２）成分で表面処理することにより得た。
（実施例１）
無機多孔質体ＳＰ（１）２．００ｇを四つ口フラスコに入れ、トルエン１００ｍＬを加えた。撹拌下で、さらに（Ｃ１）成分４．８ｍｇを加え、室温にて３時間撹拌した。その後、反応液を濾過し、トルエンで洗浄した後、減圧下で乾燥させて、実施例１の無機多孔質担体を得た。
（実施例２）
無機多孔質体ＳＰ（１）を無機多孔質体ＳＰ（２）（２．００ｇ）に変更し、かつ、（Ｃ１）成分の添加量を６．８ｍｇに変更した以外は、実施例１の製造方法と同様にして、実施例２の無機多孔質担体を得た。
（実施例３）
無機多孔質体ＳＰ（１）を無機多孔質体ＳＰ（３）（１．００ｇ）に変更し、かつ、（Ｃ１）成分の添加量を２．４ｍｇに変更した以外は、実施例１の製造方法と同様にして、実施例３の無機多孔質担体を得た。
（比較例１）
無機多孔質体ＳＰ（１）を無機多孔質体ＳＰ（４）（２．００ｇ）に変更し、かつ、（Ｃ１）成分を（Ｃ２）成分（２３ｍｇ）に変更した以外は、実施例１の製造方法と同様にして、比較例１の無機多孔質担体を得た。
＜固相担体の製造＞
Ｕ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ（５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－３’－Ｏ－スクシニルウリジン）２５．１ｍｇと、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）１２．５ｍｇと、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン５．９μＬと、アセトニトリル２．７ｍＬとを混合し、この混合物に、各実施例および比較例の無機多孔質担体３００．０ｍｇをそれぞれ加えた。
２５℃で１８時間静置した後、ろ過し、固体（残渣）をアセトニトリル１０ｍＬで洗浄した。洗浄後の固体に、無水酢酸と、２，６－ルチジンのＴＨＦ溶液（無水酢酸／２，６－ルチジン／ＴＨＦ、容量比１／１／８）１ｍＬと、Ｎ－メチルイミダゾールのＴＨＦ溶液（Ｎ－メチルイミダゾール／ＴＨＦ、容量比１６／８４）１ｍＬとを加えた。１分間静置した後にろ過し、固体をアセトニトリル１０ｍＬで洗浄した。洗浄後の固体を真空乾燥し、無機多孔質担体にヌクレオシドが担持した、各固相担体を得た。
７０％過塩素酸溶液をメタノールで希釈し、３０％過塩素酸／メタノール溶液を調製した。上記で製造した、ヌクレオシドを担持した各固相担体１０ｍｇをメスフラスコに採取し、３０％過塩素酸／メタノール溶液で１０ｍＬに希釈した。この溶液を３０％過塩素酸／メタノール溶液でさらに１０倍に希釈した後、４９８ｎｍでの吸光度を測定し、ヌクレオシド担持密度を下式より算出した。その結果を表１に示した。
Figure 0007368455000015
＜オリゴ核酸の固相合成＞
配列（Ａ）：５’－ＧＣＡＧＡＧＵＡＣＡＣＡＣＡＧＣＡＵＡＵＡＣＣ－Ｐ－ＧＧＵＡＵＡＵＧＣＵＧＵＧＵＧＵＡＣＵＣＵＧＣＵＵ－３’（配列番号１，２）（４９ｍｅｒ）。ＧＣＡＧＡＧＵＡＣＡＣＡＣＡＧＣＡＵＡＵＡＣＣ（配列番号１）およびＧＧＵＡＵＡＵＧＣＵＧＵＧＵＧＵＡＣＵＣＵＧＣＵＵ（配列番号２）。
前記の配列（Ａ）において、Ｐは、下記の波線で区切られた結合部位を表す。
Figure 0007368455000016
前記の配列（Ａ）からなるオリゴヌクレオチドを、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＮＴＳ Ｍ－４－ＭＸ－Ｅ、日本テクノサービス株式会社製）を用い、３’側から５’側に向かって合成した（反応経路（上記縮合反応、酸化、脱保護）参照）。
かかる固相合成には、上記で製造した各固相担体を使用した。
また、アミダイトモノマーには、以下に示すアデノシンＥＭＭアミダイト（米国特許出願公開第２０１２／０３５２４６号明細書の実施例４に記載）、シチジンＥＭＭアミダイト（同ＵＳ文献の実施例３に記載）、グアノシンＥＭＭアミダイト（同ＵＳ文献の実施例５に記載）、ウリジンＥＭＭアミダイト（同ＵＳ文献の実施例２記載）及びアミダイトＰ（国際公開第２０１７／１８８０４２号に記載）を使用した。
Figure 0007368455000017
また、かかる固相合成には、デブロッキング溶液として高純度トリクロロ酢酸トルエン溶液を使用し、縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを使用し、酸化剤としてヨウ素溶液を使用し、キャッピング溶液としてフェノキシ酢酸溶液とＮ－メチルイミダゾール溶液とを使用した。
合成終了後の固相担体を、蓋つきガラスバイアルに入れ、２８％ＮＨ４ＯＨとＥｔＯＨとの１：１ないし２：１溶液を加えた。その後、４０℃下で４時間静置した。反応後の溶液を濾過し、水、ＥｔＯＨで洗浄した。得られた溶液を乾燥して、未脱保護体の粗オリゴヌクレオチドとし、次いでニトロメタンの存在下でフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）を作用させて脱保護を行い、粗生成物を得た。
［オリゴ核酸の純度の測定］
オリゴ核酸の純度の測定は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；波長２６０ｎｍ、カラムＤＮＡＰａｃＴＭ ＰＡ１００ ４×２５０ｍｍ）により行った。
前記粗生成物を、前記ＨＰＬＣによって各成分に分離し、ＨＰＬＣにより得られたクロマトグラムにおけるメインピークの半値幅から、オリゴ核酸の純度を算出した。その結果を表１に示した。
Figure 0007368455000018
表１に示す結果から、実施例１～３の固相担体を用いた場合の方が、比較例１の固相担体を用いた場合に比べて、オリゴ核酸の純度が高いことが確認できる。
すなわち、本発明の適用した固相担体によれば、核酸の製造において純度をより高められる、と言える。
本発明により、長鎖核酸の合成においても純度を向上させることができる、核酸の製造方法が提供される。本発明の実施態様にかかる無機多孔質担体及びこれを用いた製造方法により得られる核酸は、医薬品の原料として有用である。
配列表の配列番号１および２は、本発明の製造方法に従って製造されるオリゴヌクレオシドの塩基配列を表す。

Claims (13)

  1. 下記一般式（１）で表されるリンカーを有し、
    水銀圧入法により測定される細孔分布において、細孔径の最頻値（モード径）が０．０４μｍから１μｍであり、下記無機多孔質体表面の画像解析により得られる、開口面積０．００２５μｍ２以上を有する空隙の密度が１２個／μｍ２から３０個／μｍ２である、
    無機多孔質担体。
    Figure 0007368455000019
     ［式中、＊を付された結合は、無機多孔質体のシラノール基の酸素原子への結合を表す。
    ｎは、１、２又は３の整数を表す。
    Ｒは、それぞれ独立して、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよい炭素数が３～１０のアルキル基；アルキル基、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよいフェニル基；ヒドロキシル基；又は、炭素数が１～４のアルコキシ基を表す。
    Ｌは、単結合、炭素数が１～２０のアルキレン基、又は、炭素数２～２０のアルキレン基であって、当該アルキレン基を構成する少なくとも１つの－ＣＨ２－ＣＨ２－基に、－Ｏ－、－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－及び－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－からなる群から選ばれる何れかの基Ｑが挿入されている基：－ＣＨ２－Ｑ－ＣＨ２－を含む基を表す。ただし、基Ｑと結合しているメチレン基の炭素原子は、さらに別の基Ｑと同時に結合することはない。］
  2. 下記一般式（２）で表されるリンカーを有し、
    水銀圧入法により測定される細孔分布において、細孔径の最頻値（モード径）が０．０４μｍから１μｍであり、下記無機多孔質体表面の画像解析により得られる、開口面積０．００２５μｍ２以上を有する空隙の密度が１２個／μｍ２から３０個／μｍ２である、
    無機多孔質担体。
    Figure 0007368455000020
     ［式中、＊を付された結合は、無機多孔質体のシラノール基の酸素原子への結合を表す。
    ｎは、１、２又は３の整数を表す。
    Ｒは、それぞれ独立して、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよい炭素数が３～１０のアルキル基；アルキル基、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよいフェニル基；ヒドロキシル基；又は、炭素数が１～４のアルコキシ基を表す。
    Ｌは、単結合、炭素数が１～２０のアルキレン基、又は、炭素数２～２０のアルキレン基であって、当該アルキレン基を構成する少なくとも１つの－ＣＨ２－ＣＨ２－基に、－Ｏ－、－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－及び－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－からなる群から選ばれる何れかの基Ｑが挿入されている基：－ＣＨ２－Ｑ－ＣＨ２－を含む基を表す。ただし、基Ｑと結合しているメチレン基の炭素原子は、さらに別の基Ｑと同時に結合することはない。
    Ｒｂは、反応性の基が保護あるいは脱保護されたヌクレオシド又はヌクレオチドを表す。
    Ｌ１は、Ｒｂの１級又は２級のヒドロキシル基の酸素原子と結合している２価の基を表す。］
  3. 前記無機多孔質体の体積当たり比表面積が、０．１ｍ２／ｍＬ以上１００ｍ２／ｍＬ以下である、請求項１又は２に記載の無機多孔質担体。
  4. 前記無機多孔質体の体積当たり細孔容積が、０．０５ｍＬ／ｍＬ以上０．６ｍＬ／ｍＬ以下である、請求項１～３のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
  5. 前記無機多孔質体の気孔率が、５０％以上である、請求項１～４のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
  6. 前記リンカーの担持密度が、前記無機多孔質体の質量当たり比表面積に対して、０．１μｍｏｌ／ｍ２以上５．０μｍｏｌ／ｍ２以下である、請求項２～５のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
  7. 前記無機多孔質体の粒子径（メジアン径）が、１μｍ以上１０００μｍ以下である、請求項１～６のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
  8. 前記無機多孔質体が、シリカ、シリカゲル、ゼオライト又はガラスである、請求項１～７のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
  9. 前記一般式（２）中のＬ１が、スクシニルリンカー又はユニバーサルリンカーである、請求項２～８のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
  10. 請求項２における一般式（２）中のＲｂが、反応性の基としてヒドロキシル基が保護されたヌクレオシド又はヌクレオチドを表す無機多孔質担体を用い、
    前記のヌクレオシドの５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程（Ａ）、
    前記工程（Ａ）において生成したヌクレオシドの５’位のヒドロキシル基と、第２のヌクレオシド塩基を有するアミダイト化合物とを縮合反応させて、ホスファイトを生成する工程（Ｂ）、
    前記工程（Ｂ）において生成したホスファイトを酸化させて、ヌクレオチドを生成する工程（Ｃ）、及び、
    前記工程（Ｃ）において生成したヌクレオチドの５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程（Ｄ）、
    を含む、核酸の製造方法。
  11. 前記工程（Ｄ）において生成した生成物と、次に導入予定のヌクレオシド塩基を有するアミダイト化合物とをさらに縮合反応させて、ホスファイトを生成する工程（Ｂ’）、
    前記工程（Ｂ’）において生成したホスファイトを酸化させて、オリゴヌクレオチドを生成する工程（Ｃ’）、及び、
    前記工程（Ｃ’）において生成したオリゴヌクレオチド鎖末端の５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程（Ｄ’）
    を含む、請求項１０に記載の核酸の製造方法。
  12. 前記の工程（Ｂ’）、工程（Ｃ’）及び工程（Ｄ’）を、さらにｍ回（ｍは、１以上の整数を表す。）繰り返して、ｍ個のアミダイト化合物を反応させた後、伸長した核酸を切り出す工程（Ｅ）を含む、請求項１１に記載の核酸の製造方法。
  13. 請求項１～９のいずれか一項に記載の無機多孔質担体のホスホロアミダイト法による核酸の製造における使用。
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