KR20220107246A - 3'-rna 올리고뉴클레오타이드의 합성 - Google Patents

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후안 씨. 살리나스
존 프레드릭 브리온스
마크 케이. 슐레겔
시게오 마쓰다
알렉산더 브이. 켈'린
리강 장
마틴 에이. 마이어
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알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

본 개시내용은 3'-하이드록실기를 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오사이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 합성하기 위한 단량체 및 방법에 관한 것이다.

Description

3'-RNA 올리고뉴클레오타이드의 합성
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2019년 11월 27일자로 출원된 미국 가출원 제62/941,153호의 이익을 주장하고, 이의 전문은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 일반적으로 핵산 화학 및 올리고뉴클레오타이드의 화학적 합성에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 3'-하이드록실기를 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오사이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 합성하기 위한 단량체 및 방법에 관한 것이다.
변형된 올리고뉴클레오타이드는 분자 생물학 연구 및 치료적 응용에서의 가치가 대단히 높다. 변형된 올리고뉴클레오타이드의 화학적 합성이 통상적이지만, 많은 변형된 올리고뉴클레오타이드의 용이성 및 수율은 낮다. 예를 들어, 흔히 사용되는 보호기는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드를 탈보호하기 위해 사용되는 조건에 불안정하다. 이는 3'-하이드록실기를 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오사이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 경우에 특히 문제가 된다. 따라서, 당해 기술분야에서는 이 같은 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위한 단량체 및 방법이 여전히 요구되고 있다. 본 개시내용은 적어도 부분적으로는 이러한 요구를 해결한 것이다.
본 개시내용은 수율이 개선되고 보다 낮은 불순물을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위한 단량체 및 방법을 제공하며, 이때 올리고뉴클레오타이드는 3'-하이드록실기를 갖는 적어도 하나, 예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 뉴클레오사이드를 갖는다. 일반적으로, 이 방법은 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드 상의 유리 하이드록실기를 트리이소프로필실릴에테르(TIPS)-보호된 3'-하이드록실기를 갖는 뉴클레오사이드 포스포아미다이트 단량체와 결합시키는 단계를 포함한다. 결합에 의해 포스파이트 트리에스테르 중간체가 형성되며, 이는 산화 또는 황화(sulfurization)되어 포스페이트 트리에스테르 또는 포스포로티오에이트 중간체를 형성할 수 있다.
소정의 길이 및 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 상기 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 약 6 내지 약 50개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 본원에 기술되어 있는 방법 및 단량체를 이용하여 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 약 10 내지 약 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 트리이소프로필실릴에테르-보호된 3'-하이드록실기를 갖는 단량체, 예를 들어 뉴클레오사이드 포스포아미다이트 단량체를 제공한다. 일반적으로, 단량체는 화학식 I을 갖는다:
[화학식 I]
Figure pct00001
화학식 I에서, B는 변형되거나 변형되지 않은 핵염기이고; R1은 산 분해성 하이드록실 보호기이고; R2는 -Si(R4)3이고; R3은 -P(NR5R6)OR7이고; 각각의 R4는 독립적으로는 선택적으로 치환된 알킬, 아릴, 아르알킬, 알카릴, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 알키닐 또는 사이클로알키닐이고; R5 및 R6은 독립적으로는 선택적으로 치환된 알킬, 아릴, 아르알킬, 알카릴, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 알키닐 또는 사이클로알키닐이거나, R5 및 R6은 연결되어 헤테로사이클릴을 형성하고; R7은 선택적으로 치환된 알킬, 아릴, 아르알킬, 알카릴, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 알키닐 또는 사이클로알키닐이다.
화학식 I의 일부 단량체에서, B는 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 우라실이고; R1은 디메톡시트리틸이고; R4, R5 및 R6은 이소프로필이고; R7은 β-시아노에틸이다.
본 특허 또는 출원 파일에는 색으로 나타낸 적어도 하나의 도면이 포함된다. 칼라 도면(들)을 갖는 본 특허 또는 특허 출원 공개공보의 사본은 요청 시에 필요한 수수료의 납부와 함께 특허청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 FLP-2'-OTBS, FLP-OH 및 개열(16-머(16mer))의 생성을 보여주는, 에탄올 중의 수산화암모늄을 이용한 탈보호 이후 N17 위치에 U-2'-OTBS를 갖는 서열 1(aUfcaaAf(U-2'-OTBS)CfAfcuuuAfuUfgaguuuc; 서열 번호 1)의 HPLC 트레이스(HPLC trace)이다.
도 2는 FLP-3'-OTBS, FLP-OH 및 개열(16-머)의 생성을 보여주는, 에탄올 중의 수산화암모늄을 이용한 탈보호 이후 N17 위치에 U-3'-OTBS를 갖는 서열 2(aUfcaaAf(U-3'-OTBS)CfAfcuuuAfuUfgaguuuc; 서열 번호 2)의 PLC 트레이스이다.
도 3은 FLP-3'-OTBS, FLP-OH 및 개열(16-머)의 생성을 보여주는, 에탄올 중의 수산화암모늄을 이용한 탈보호 이후 N17 위치에 G-3'-OTBS를 갖는 서열 3(aUfcaaAf(G-3'-OTBS)CfAfcuuuAfuUfgaguuuc; 서열 번호 3)의 HPLC 트레이스이다.
도 4는 FLP-2'-OTOM, FLP-OH 및 개열(16-머)의 생성을 보여주는, 에탄올 중의 수산화암모늄을 이용한 탈보호 이후 N17 위치에 U-2'-OTOM을 갖는 서열 4(aUfcaaAf(U-2'-OTOM)CfAfcuuuAfuUfgaguuuc; 서열 번호 4)의 HPLC 트레이스이다.
도 5는 FLP-3'-OTOM, FLP-OH 및 개열(16-머)의 생성을 보여주는, 에탄올 중의 수산화암모늄을 이용한 탈보호 이후 N17 위치에 U-3'-OTOM을 갖는 서열 5(aUfcaaAf(U-3'-OTOM)CfAfcuuuAfuUfgaguuuc; 서열 번호 5)의 HPLC 트레이스이다.
도 6은 FLP-3'-OTIPS, FLP-OH 및 개열(16-머)의 생성을 보여주는, 에탄올 중의 수산화암모늄을 이용한 탈보호 이후 N17 위치에 U-3'-OTIPS를 갖는 서열 6(aUfcaaAf(U-3'-OTIPS)CfAfcuuuAfuUfgaguuuc; 서열 번호 6)의 HPLC 트레이스이다.
도 7은 FLP-OH의 생성을 보여주는, 에탄올 및 HF/피리딘 중의 수산화암모늄을 이용한 탈보호 이후 N17 위치에 U-3'-OTIPS를 갖는 서열 6(aUfcaaAf(U-3'-OTIPS)CfAfcuuuAfuUfgaguuuc, 서열 번호 6)의 HPLC 트레이스이다. RNA 내의 3'-OTPS 보호기는 HF/피리딘 처리를 사용하여 효과적으로 개열될 수 있다.
도 8은 실온에서 하룻밤 동안 농축 수산화암모늄 수용액으로 탈보호된 서열 8(asCfsguuu(U2p)caaagcAfcUfuuauusgsa, 서열 번호 8)의 디콘볼루션(deconvolution)된 질량 스펙트럼을 보여준다. 주요 피크는 목적하는 FLP(서열 8) 및 3'-단편(서열 9(caaagcAfcUfuuauusgsa; 서열 번호 9))에 상응한다. 대략 14%의 FLP는 단일 N-2-이소부티릴 보호기(M = 7,663)를 여전히 유지한다.
도 9는 실온에서 하룻밤 동안 농축 메틸아민 수용액으로 탈보호된 서열 8(asCfsguuu(U2p)caaagcAfcUfuuauusgsa; 서열 번호 8)의 디콘볼루션된 질량 스펙트럼을 보여준다. 주요 피크는 목적하는 FLP(서열 8) 및 3'-단편(서열 9(caaagcAfcUfuuauusgsa; 서열 번호 9))에 상응한다.
도 10은 실온에서 하룻밤 동안 농축 메틸아민 수용액으로 탈보호된 서열 8(asCfsguuu(U2p)caaagcAfcUfuuauusgsa; 서열 번호 8)의 디콘볼루션된 질량 스펙트럼을 보여준다. 주요 피크는 목적하는 FLP(서열 8), 3'-단편(서열 9(caaagcAfcUfuuauusgsa; 서열 번호 9)) 및 5'-단편(서열 10(asCfsguuu(U2p)P; 서열 번호 10))에 상응한다.
도 11은 일부 예시적인 3'-트리이소프로필실릴 에테르(3'-TIPS) 뉴클레오사이드 단량체의 구조를 보여준다.
하나의 양태에서, 본 개시내용은 3'-하이드록실기를 갖는 적어도 하나의 뉴클레오사이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위한 개선된 방법을 제공한다. 트리이소프로필실릴에테르(TIPS)-보호된 3'-하이드록실기를 포함하는 뉴클레오사이드 포스포아미다이트 단량체는 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드 상의 유리 하이드록실, 예를 들어 5'-OH, 3'-OH 또는 2'-OH, 바람직하게는 5'-OH에 결합된다.
뉴클레오사이드 포스포아미다이트 단량체를 하이드록실기에 결합시키기 위한 방법 및 시약은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 따라서, 올리고뉴클레오타이드는 당업자에게 알려져 있는 절차 및 장비를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 플라스크와 같은 유리 반응기가 적절하게 이용될 수 있다. 바람직하게는, 고체상 합성 절차 및 제어 공극 유리와 같은 고체 지지체가 이용된다. 더욱더 바람직하게는, 본 발명의 방법은 자동 DNA 합성기를 사용하여 실시될 수 있다. 자동화 합성 기법을 비롯한 적합한 고체상 기법이 문헌[F. Eckstein (ed.), Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, Oxford University Press, New York (1991)]에 기술되어 있다.
또한, 올리고뉴클레오타이드는 소규모 또는 대규모로 제조될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 μmol 규모 또는 ㎎ 규모로 제조될 수 있다.
결합 단계 및 산화/황화 단계는 공통 용매에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 결합 및 산화/황화는 아세토니트릴에서 수행될 수 있다.
산화 단계는 포스포트리에스테르 작용기의 형성을 구현하기에 충분한 시간 동안 포스파이트 트리에스테르 중간체를 산화 시약과 접촉시킴으로써 실시될 수 있다. 본 발명의 포스파이트 중간체의 산화에 사용하기에 적합한 용매 시스템은 2개 이상의 용매의 혼합물, 바람직하게는 비양자성 용매와 양자성 또는 염기성 용매와의 혼합물을 포함한다. 바람직한 용매 혼합물은 아세토니트릴과 약염기와의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 산화 단계는 약염기의 존재 하에 실시될 수 있다. 예시적인 염기로는 피리딘, 루티딘, 피콜린 또는 콜리딘을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 산화 단계는 I2/H2O의 존재 하에 실시될 수 있다.
황화(황 전달 시약을 이용한 산화)는 포스포로티오에이트 작용기의 형성을 구현하기에 충분한 시간 동안 포스파이트 트리에스테르 중간체를 황 전달 시약과 접촉시킴으로써 실시될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 합성에 사용하기 위한 예시적인 황 전달 시약으로는 페닐아세틸 디설파이드, 아릴아세틸 디설파이드 및 아릴-치환된 페닐아세틸 디설파이드를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 황 전달 시약은 3-(디메틸아미노메틸리덴)아미노-3H-1,2,4-디티아졸-3-티온(DDTT) 또는 3H-1,2-벤조디티올-3-온 1,1-디옥사이드(보카지(Beaucage) 시약)일 수 있다.
합성이 완료된 후, 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어 올리고뉴클레오타이드 상의 임의의 보호기를 제거하여 목적하는 생성물을 얻기 위한 방법 및 시약을 사용하여 탈보호될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서 이 방법은 합성된 올리고뉴클레오타이드를 염기로 처리하여 올리고뉴클레오타이드 상의 임의의 비-TIPS 보호기를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 올리고뉴클레오타이드의 합성에 사용된 비-TIPS 보호기를 제거하는 데 사용하기 위한 예시적인 염기로는 수산화암모늄, 메틸아민 및 이의 혼합물을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 염기를 이용한 처리는 실온 또는 승온에서 적절하게 실시될 수 있다. "실온"은 약 20℃ 내지 약 30℃의 주위 온도를 포함한다. "승온"은 30℃보다 높은 온도를 포함한다. 예를 들어, 승온은 약 32℃ 내지 약 65℃의 온도일 수 있다. 일부 실시형태에서, 염기를 이용한 처리는 약 35℃에서 이루어진다. 처리 시간은, 예를 들어 수 분(예를 들어, 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 45분 또는 60분) 내지 수 시간(예를 들어, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 10시간, 15시간 24시간 또는 그 이상의 시간) 정도이다. 일부 실시형태에서, 염기를 이용한 처리는 약 15시간 동안 이루어진다. 일부 실시형태에서, 염기를 이용한 처리는 약 15시간 동안 약 35℃에서 이루어진다.
비-TIPS 보호기가 제거된 후, 부분적으로 탈보호된 올리고뉴클레오타이드를 TIPS-보호된 하이드록실기를 유리 하이드록실기로 전환시키는 데 효과적인 탈보호 시약으로 처리함으로써 TIPS 보호기를 제거할 수 있다. 하이드록실 보호기를 함유하는 실릴을 제거하기 위한 방법 및 시약은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 탈보호 시약은 불소 음이온을 포함한다. TIPS 보호기를 제거하기 위한 하나의 예시적인 탈보호 시약은 HFㆍ피리딘이다. TIPS 기를 제거하기 위한 탈보호 단계는 실온 또는 승온에서 적절하게 실시될 수 있다. 예를 들어, 탈보호 단계는 35℃ 내지 약 65℃의 온도에서 실시된다. 일부 실시형태에서, 탈보호 단계는 대략 50℃에서 실시된다. 탈보호 시간은, 예를 들어 수 분(예를 들어, 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 45분 또는 60분) 내지 수 시간(예를 들어, 2시간, 3시간, 4시간 또는 5시간) 정도이다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 약 1시간 동안 탈보호 시약으로 처리된다.
탈보호 이후, 올리고뉴클레오타이드를 단리 및 정제하기 위한 분야에 알려져 있는 방법을 이용하여 목적하는 생성물을 단리 및 정제할 수 있다. 이 같은 방법으로는 여과 및/또는 HPLC 정제를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 트리이소프로필실릴에테르(TIPS)-보호된 3'-하이드록실기를 갖는 뉴클레오사이드 단량체, 예를 들어 화학식 I의 구조를 갖는 단량체를 제공한다:
[화학식 I]
Figure pct00002
화학식 I의 단량체에서, B는 변형되거나 변형되지 않은 핵염기이다. 선택적으로, 핵염기는 하나 이상의 보호기를 포함할 수 있다. 예시적인 핵염기로는 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실, 티민, 이노신, 크산틴, 히포크산틴, 누불라린(nubularine), 이소구아니신(isoguanisine), 투베르시딘(tubercidine) 및 아데닌, 구아닌, 시토신 및 우라실의 치환 또는 변형된 유사체, 예를 들어 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌 및 구아닌의 기타 알킬 유도체, 2-프로필 및 아데닌 및 구아닌의 기타 알킬 유도체, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 5-할로우라실, 5-(2-아미노프로필)우라실, 5-아미노 알릴 우라실, 8-할로, 아미노, 티올, 티오알킬, 하이드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린(2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함함), 디하이드로우라실, 3-데아자-5-아자시토신, 2-아미노퓨린, 5-알킬우라실, 7-알킬구아닌, 5-알킬 시토신, 7-데아자아데닌, N6,N6-디메틸아데닌, 2,6-디아미노퓨린, 5-아미노-알릴-우라실, N3-메틸우라실, 치환된 1,2,4-트리아졸, 2-피리디논, 5-니트로인돌, 3-니트로피롤, 5-메톡시우라실, 우라실-5-옥시아세트산, 5-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메틸-2-티오우라실, 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오우라실, 5-메틸아미노메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우라실, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N4-아세틸 시토신, 2-티오시토신, N6-메틸아데닌, N6-이소펜틸아데닌, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, N-메틸구아닌 또는 O-알킬화 염기를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 추가의 퓨린 및 피리미딘은 미국 특허 제3,687,808호에 개시되어 있는 것, 문헌[Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, pages 858~859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990]에 개시되어 있는 것, 및 문헌[Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613]에 개시되어 있는 것들을 포함한다.
일부 실시형태에서, 핵염기는 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실, 티민, 이노신, 크산틴, 히포크산틴, 누불라린, 이소구아니신, 투베르시딘, 2-(할로)아데닌, 2-(알킬)아데닌, 2-(프로필)아데닌, 2-(아미노)아데닌, 2-(아미노알킬)아데닌, 2-(아미노프로필)아데닌, 2-(메틸티오)-N6-(이소펜테닐)아데닌, 6-(알킬)아데닌, 6-(메틸)아데닌, 7-(데아자)아데닌, 8-(알케닐)아데닌, 8-(알킬)아데닌, 8-(알키닐)아데닌, 8-(아미노)아데닌, 8-(할로)아데닌, 8-(하이드록실)아데닌, 8-(티오알킬)아데닌, 8-(티올)아데닌, N6-(이소펜틸)아데닌, N6-(메틸)아데닌, N6,N6-(디메틸)아데닌, 2-(알킬)구아닌, 2-(프로필)구아닌, 6-(알킬)구아닌, 6-(메틸)구아닌, 7-(알킬)구아닌, 7-(메틸)구아닌, 7-(데아자)구아닌, 8-(알킬)구아닌, 8-(알케닐)구아닌, 8-(알키닐)구아닌, 8-(아미노)구아닌, 8-(할로)구아닌, 8-(하이드록실)구아닌, 8-(티오알킬)구아닌, 8-(티올)구아닌, N-(메틸)구아닌, 2-(티오)시토신, 3-(데아자)-5-(아자)시토신, 3-(알킬)시토신, 3-(메틸)시토신, 5-(알킬)시토신, 5-(알키닐)시토신, 5-(할로)시토신, 5-(메틸)시토신, 5-(프로피닐)시토신, 5-(프로피닐)시토신, 5-(트리플루오로메틸)시토신, 6-(아조)시토신, N4-(아세틸)시토신, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우라실, 2-(티오)우라실, 5-(메틸)-2-(티오)우라실, 5-(메틸아미노메틸)-2-(티오)우라실, 4-(티오)우라실, 5-(메틸)-4-(티오)우라실, 5-(메틸아미노메틸)-4-(티오)우라실, 5-(메틸)-2,4-(디티오)우라실, 5-(메틸아미노메틸)-2,4-(디티오)우라실, 5-(2-아미노프로필)우라실, 5-(알킬)우라실, 5-(알키닐)우라실, 5-(알릴아미노)우라실, 5-(아미노알릴)우라실, 5-(아미노알킬)우라실, 5-(구아니디늄알킬)우라실, 5-(1,3-디아졸-1-알킬)우라실, 5-(시아노알킬)우라실, 5-(디알킬아미노알킬)우라실, 5-(디메틸아미노알킬)우라실, 5-(할로)우라실, 5-(메톡시)우라실, 우라실-5-옥시아세트산, 5-(메톡시카르보닐메틸)-2-(티오)우라실, 5-(메톡시카르보닐-메틸)우라실, 5-(프로피닐)우라실, 5-(프로피닐)우라실, 5-(트리플루오로메틸)우라실, 6-(아조)우라실, 디하이드로우라실, N3-(메틸)우라실, 5-우라실(즉, 슈도우라실), 2-(티오)슈도우라실, 4-(티오)슈도우라실, 2,4-(디티오)슈도우라실, 5-(알킬)슈도우라실, 5-(메틸)슈도우라실, 5-(알킬)-2-(티오)슈도우라실, 5-(메틸)-2-(티오)슈도우라실, 5-(알킬)-4-(티오)슈도우라실, 5-(메틸)-4-(티오)슈도우라실, 5-(알킬)-2,4-(디티오)슈도우라실, 5-(메틸)-2,4-(디티오)슈도우라실, 1-치환된 슈도우라실, 1-치환된 2-(티오)-슈도우라실, 1-치환된 4-(티오)슈도우라실, 1-치환된 2,4-(디티오)슈도우라실, 1-(아미노카르보닐에틸레닐)-슈도우라실, 1-(아미노카르보닐에틸레닐)-2(티오)-슈도우라실, 1-(아미노카르보닐에틸레닐)-4-(티오)슈도우라실, 1-(아미노카르보닐에틸레닐)-2,4-(디티오)슈도우라실, 1-(아미노알킬아미노카르보닐에틸레닐)-슈도우라실, 1-(아미노알킬아미노-카르보닐에틸레닐)-2(티오)-슈도우라실, 1-(아미노알킬아미노카르보닐에틸레닐)-4-(티오)슈도우라실, 1-(아미노알킬아미노카르보닐에틸레닐)-2,4-(디티오)슈도우라실, 1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일, 1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-페녹사진-1-일, 1,3-(디아자)-2-(옥소)-펜티아진-1-일, 1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-펜티아진-1-일, 7-치환된 1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일, 7-치환된 1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-페녹사진-1-일, 7-치환된 1,3-(디아자)-2-(옥소)-펜티아진-1-일, 7-치환된 1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-펜티아진-1-일, 7-(아미노알킬하이드록시)-1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일, 7-(아미노알킬하이드록시)-1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-페녹사진-1-일, 7-(아미노알킬하이드록시)-1,3-(디아자)-2-(옥소)-펜티아진-1-일, 7-(아미노알킬하이드록시)-1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-펜티아진-1-일, 7-(구아니디늄알킬하이드록시)-1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일, 7-(구아니디늄알킬하이드록시)-1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-페녹사진-1-일, 7-(구아니디늄알킬-하이드록시)-1,3-(디아자)-2-(옥소)-펜티아진-1-일, 7-(구아니디늄알킬하이드록시)-1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-펜티아진-1-일, 1,3,5-(트리아자)-2,6-(디옥사)-나프탈렌, 이노신, 크산틴, 히포크산틴, 누불라린, 투베르시딘, 이소구아니신, 이노시닐, 2-아자-이노시닐, 7-데아자-이노시닐, 니트로이미다졸일, 니트로피라졸일, 니트로벤즈이미다졸일, 니트로인다졸일, 아미노인돌일, 피롤로피리미딘일, 3-(메틸)이소카르보스티릴일, 5-(메틸)이소카르보스티릴일, 3-(메틸)-7-(프로피닐)이소카르보스티릴일, 7-(아자)인돌일, 6-(메틸)-7-(아자)인돌일, 이미디조피리딘일, 9-(메틸)-이미디조피리딘일, 피롤로피리진일, 이소카르보스티릴일, 7-(프로피닐)이소카르보스티릴일, 프로피닐-7-(아자)인돌일, 2,4,5-(트리메틸)페닐, 4-(메틸)인돌일, 4,6-(디메틸)인돌일, 페닐, 나프탈렌일, 안트라세닐, 페난트라세닐, 피레닐, 스틸베닐, 테트라세닐, 펜타세닐, 디플루오로톨일, 4-(플루오로)-6-(메틸)벤즈이미다졸, 4-(메틸)벤즈이미다졸, 6-(아조)티민, 2-피리디논, 5-니트로인돌, 3-니트로피롤, 6-(아자)피리미딘, 2-(아미노)퓨린, 2,6-(디아미노)퓨린, 5-치환된 피리미딘, N2-치환된 퓨린, N6-치환된 퓨린, O6-치환된 퓨린, 치환된 1,2,4-트리아졸 및 이의 임의의 O-알킬화 또는 N-알킬화된 유도체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵염기는 아데닌, 구아닌, 시토신 및 우라실로 이루어진 군으로부터 선택된다.
R1은 하이드록실 보호기이다. 뉴클레오사이드 5'-하이드록실의 보호를 위해 통상적으로 사용되는 보호기는 4,4'-디메톡시트리틸("DMT")이다. 그러나, 올리고뉴클레오타이드의 합성을 위한 분야에 알려져 있고 사용되는 임의의 하이드록실 보호기가 사용될 수 있다. 이 같은 보호기로는 모노메톡시트리틸("MMT"), 9-플루오렌일메틸카르보네이트("Fmoc"), o-니트로페닐카르보닐, p-페닐아조페닐카르보닐, 페닐카르보닐, p-클로로페닐카르보닐 및 5'-(α-메틸-2-니트로피페로닐)옥시카르보닐("MeNPOC")을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, R1은 산 분해성 하이드록실 보호기, 예를 들어 DMT 또는 MMT이다. 일부 실시형태에서, R1은 DMT이다.
각각의 R4는 알킬, 아릴, 아르알킬, 알카릴, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 알키닐 또는 사이클로알키닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있으며, 이들 각각은, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 독립적으로는 선택된 치환기로 선택적으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 각각의 R4는 독립적으로는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬일 수 있다. R4에 대한 예시적인 알킬로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 2-메틸프로필, t-부틸 및 펜틸을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 각각의 R4는 이소프로필이다.
R3은 H 또는 -P(NR5R6)OR7일 수 있다. 일부 실시형태에서, R3은 H이다. 일부 기타 실시형태에서, R3은 -P(NR5R6)OR7이다. R3이 -P(NR5R6)OR7인 경우, R5 및 R6은 알킬, 아릴, 아르알킬, 알카릴, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 알키닐 및 사이클로알키닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있으며, 이들 각각은, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 독립적으로는 선택된 치환기로 선택적으로 치환될 수 있거나, R5 및 R6은 연결되어 헤테로사이클릴을 형성할 수 있으며, 이때 헤테로사이클릴은, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 독립적으로는 선택된 치환기로 선택적으로 치환될 수 있다. 예를 들어, R5 및 R6은 독립적으로는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬일 수 있다. R5 및 R6에 대한 예시적인 알킬로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 2-메틸프로필, t-부틸 및 펜틸을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, R5 및 R6은 이소프로필이다.
R7은 알킬, 아릴, 아르알킬, 알카릴, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 알키닐 또는 사이클로알키닐이며, 이들 각각은, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 독립적으로는 선택된 치환기로 선택적으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 각각의 R7은 독립적으로는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬일 수 있다. R7에 대한 예시적인 알킬로는 선택적으로 치환된 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 2-메틸프로필, t-부틸 및 펜틸을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, R7은 β-시아노에틸이다.
화학식 I의 단량체의 일부 실시형태에서, B는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 또는 우라실이고; R1은 모노메톡시트리틸 또는 디메톡시트리틸이고; R4는 독립적으로는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬이고; R3은 H이고, R7은 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬이다. 예를 들어, B는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 또는 우라실이고; R1은 디메톡시트리틸이고; R4는 독립적으로는 이소프로필이고; R3은 H이다.
화학식 I의 단량체의 일부 실시형태에서, B는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 또는 우라실이고; R1은 모노메톡시트리틸 또는 디메톡시트리틸이고; R4는 독립적으로는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬이고; R5 및 R6은 독립적으로는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬이거나, R5 및 R5는 연결되어 4원 내지 8원의 헤테로사이클릴을 형성하고; R7은 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬이다. 예를 들어, B는 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실 또는 티민이고; R1은 디메톡시트리틸이고; R4, R5 및 R6은 이소프로필이고; R7은 β-시아노에틸이다.
예시적인 실시형태는 번호가 매겨진 하기 실시형태에 의해 설명될 것이다:
실시형태 1: 3'-OH 기를 갖는 적어도 하나의 뉴클레오사이드를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 합성하기 위한 방법으로서, (i) 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드 상의 유리 하이드록실기를 트리이소프로필실릴에테르(TIPS)-보호된 3'-하이드록실기를 갖는 뉴클레오사이드 포스포아미다이트 단량체와 결합시켜 포스파이트 트리에스테르 중간체를 형성하는 단계; 및 (ii) 상기 포스파이트 트리에스테르 중간체를 산화 또는 황화시켜 보호된 중간체를 형성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
실시형태 2: 실시형태 1에 있어서, 모든 합성 단계는 자동화 올리고뉴클레오타이드 합성기 상에서 수행되는 것인 방법.
실시형태 3: 실시형태 1 또는 실시형태 2에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 대규모로 합성되는 것인 방법.
실시형태 4: 실시형태 1 내지 실시형태 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 산화 단계는 약염기의 존재 하에 이루어지는 것인 방법.
실시형태 5: 실시형태 4에 있어서, 상기 약염기는 피리딘, 루티딘, 피콜린 또는 콜리딘인 것인 방법.
실시형태 6: 실시형태 1 내지 실시형태 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 산화 단계는 I2/H2O의 존재 하에 이루어지는 것인 방법.
실시형태 7: 실시형태 1 내지 실시형태 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 황화 단계는 황 전달 시약의 존재 하에 이루어지는 것인 방법.
실시형태 8: 실시형태 7에 있어서, 상기 황 전달 시약은 3-(디메틸아미노메틸리덴)아미노-3H-1,2,4-디티아졸-3-티온(DDTT) 또는 3H-1,2-벤조디티올-3-온 1,1-디옥사이드인 것인 방법.
실시형태 9: 실시형태 1 내지 실시형태 8 중 어느 하나에 있어서, 보호된 중간체를 염기로 탈보호하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
실시형태 10: 실시형태 9에 있어서, 상기 염기는 수산화암모늄, 메틸아민 또는 수산화암모늄과 메틸아민의 혼합물인 것인 방법.
실시형태 11: 실시형태 9 또는 실시형태 10에 있어서, 상기 염기를 이용한 처리 단계는 실온 또는 승온에서 이루어지는 것인 방법.
실시형태 12: 실시형태 9 내지 실시형태 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 염기를 이용한 처리 단계는 30℃ 이상의 온도에서 이루어지는 것인 방법.
실시형태 13: 실시형태 9 내지 실시형태 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 염기를 이용한 처리 단계는 적어도 30분 동안 이루어지는 것인 방법.
실시형태 14: 실시형태 9 내지 실시형태 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 염기를 이용한 처리 단계는 적어도 4시간 동안 이루어지는 것인 방법.
실시형태 15: 실시형태 9 내지 실시형태 14 중 어느 하나에 있어서, TIPS-보호된 하이드록실기를 유리 하이드록실기로 전환시키는 데 효과적인 탈보호 시약으로 염기-처리된 중간체를 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
실시형태 16: 실시형태 15에 있어서, 탈보호 시약은 불소 음이온을 포함하는 것인 방법.
실시형태 17: 실시형태 15 또는 실시형태 16에 있어서, 탈보호 시약은 HFㆍ피리딘인 것인 방법.
실시형태 18: 실시형태 15 내지 실시형태 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 탈보호 시약을 이용한 처리 단계는 30℃ 이상의 온도에서 이루어지는 것인 방법.
실시형태 19: 실시형태 1 내지 실시형태 18 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 약 6 내지 약 50개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 방법.
실시형태 20: 실시형태 1 내지 실시형태 19 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 약 10 내지 약 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 방법.
실시형태 21: 화학식 I의 구조를 갖는 뉴클레오사이드 단량체:
[화학식 I]
Figure pct00003
(상기 식에서, B는 변형되거나 변형되지 않은 핵염기이고; R1은 하이드록실 보호기이고; R2는 -Si(R4)3이고; R3은 H 또는 -P(NR5R6)OR7이고; 각각의 R4는 독립적으로는 선택적으로 치환된 알킬, 아릴, 아르알킬, 알카릴, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 알키닐 또는 사이클로알키닐이고; R5 및 R6은 독립적으로는 선택적으로 치환된 알킬, 아릴, 아르알킬, 알카릴, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 알키닐 또는 사이클로알키닐이거나, R5 및 R6은 연결되어 헤테로사이클릴을 형성하고; R7은 선택적으로 치환된 알킬, 아릴, 아르알킬, 알카릴, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 알키닐 또는 사이클로알키닐임).
실시형태 22: 실시형태 21에 있어서, 하이드록실 보호기는 4,4'-디메톡시트리틸(DMT), 모노메톡시트리틸(MMT), 9-플루오렌일메틸카르보네이트(Fmoc), o-니트로페닐카르보닐, p-페닐아조페닐카르보닐, 페닐카르보닐, p-클로로페닐카르보닐 및 5'-(α-메틸-2-니트로피페로닐)옥시카르보닐(MeNPOC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 뉴클레오사이드 단량체.
실시형태 23: 실시형태 21 또는 실시형태 22에 있어서, 각각의 R4는 독립적으로는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬인 것인 뉴클레오사이드 단량체.
실시형태 24: 실시형태 21 내지 실시형태 23 중 어느 하나에 있어서, 각각의 R4는 이소프로필인 것인 뉴클레오사이드 단량체.
실시형태 25: 실시형태 21 내지 실시형태 24 중 어느 하나에 있어서, R5 및 R6는 독립적으로는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬인 것인 뉴클레오사이드 단량체.
실시형태 26: 실시형태 21 내지 실시형태 25 중 어느 하나에 있어서, R5 및 R6은 이소프로필인 것인 뉴클레오사이드 단량체.
실시형태 27: 실시형태 21 내지 실시형태 26 중 어느 하나에 있어서, R7은 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬인 것인 뉴클레오사이드 단량체.
실시형태 28: 실시형태 21 내지 실시형태 27 중 어느 하나에 있어서, R7은 메틸 또는 β-시아노에틸인 것인 뉴클레오사이드 단량체.
실시형태 29: 실시형태 21 내지 실시형태 28 중 어느 하나에 있어서, B는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 또는 우라실이고; R1은 모노메톡시트리틸 또는 디메톡시트리틸이고; R4는 독립적으로는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬이고; R5 및 R6은 독립적으로는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬이거나, R5 및 R5는 연결되어 4원 내지 8원의 헤테로사이클릴을 형성하고; R7은 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬인 것인 뉴클레오사이드 단량체.
실시형태 30: 실시형태 21 내지 실시형태 29 중 어느 하나에 있어서, B는 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 우라실이고; R1은 디메톡시트리틸이고; R4, R5 및 R6은 이소프로필이고; R7은 β-시아노에틸인 것인 뉴클레오사이드 단량체.
일부 선택된 정의
편의 상, 본원에서, 즉 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에서 사용된 특정 용어는 본원에 수록되어 있다. 달리 언급하지 않거나 문맥 상 내포하지 않는 한, 하기 용어 및 문구는 하기에서 제공되는 의미를 포함한다. 달리 명시적으로 언급하지 않거나 문맥 상 명백한 경우, 하기 용어 및 문구는 용어 및 문구가 본 발명이 속하는 당해 기술분야에서 획득한 의미를 포함한다. 정의는 특정 실시형태를 기술하는데 도움을 주기 위해 제공되며, 본 발명의 범주가 청구범위에 의해서만 제한되기 때문에 청구 발명을 제한하기 위한 것은 아니다. 또한, 문맥 상 달리 요구하지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하며, 복수 용어는 단수를 포함한다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 흔히 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 임의의 알려진 방법, 장치 및 재료가 본 발명의 실시 또는 교시에 사용될 수 있지만, 이와 관련한 방법, 장치 및 재료는 본원에 기술되어 있다.
또한, 본 발명의 실시는, 달리 표시하지 않는 한, 당해 기술분야 내에 있는 통상적인 분자 생물학(재조합 기법을 포함함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 기법을 이용할 수 있다. 이 같은 기법은 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989)]; 문헌["Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984)]; 문헌["Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987)]; 문헌["Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)]; 문헌["Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, 및 주기적 갱신)]; 문헌["PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994)]; 문헌["A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988)]; 문헌["Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001)]과 같은 문헌에 상세히 설명되어 있다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥 상 명확하게 달리 나타내지 않는 한, 이 범위의 상한과 하한 사이의 하한의 단위의 1/10까지 각각의 중간값(intervening value), 및 이러한 명시된 범위에서의 임의의 기타 명시된 값 또는 중간값은 본 발명 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이들의 보다 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 보다 작은 범위에 포함될 수 있으며, 본 발명에 또한 포함되며, 이는 명시된 범위에서 임의의 특별히 제외된 한계치에 포함된다. 명시된 범위가 한계치 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계치 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위가 본 발명에 또한 포함된다
특정 범위는 본원에서 "약"이란 용어에 의해 전제되는 수치값으로 제공된다. "약"이란 용어는 본원에서 이것이 전제하는 정확한 수치뿐만 아니라, 이 용어가 전제하는 수치에 근접한 수치 또는 대략적으로 그 수치인 수에 대한 문자적 뒷받침을 제공하기 위해 사용된다. 수치가 구체적으로 열거된 수치에 근접한 수치 또는 대략적으로 그 수치인 수인지를 결정하는 데에 있어서, 근접한 수치 또는 대략적으로 열거되지 않은 수치는 이것이 나타나 있는 문맥에서 구체적으로 열거된 수치의 실질적 등가물을 제공하는 수일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "포함하는" 또는 "포함하다"란 용어는 본 발명에 필수적인 조성물, 방법 및 이의 각각의 성분(들)을 참고하여 사용되며, 이는 여전히 필수적이든 그렇지 않든 나열되지 않은 요소의 포함할 여지가 있다.
문맥 상 명확하게 달리 나타내지 않는 한, "일", "하나" 및 "그"라는 단수 용어는 복수의 인용대상을 포함한다. 유사하게, "또는"이란 단어는 문맥 상 명확하게 달리 나타내지 않는 한 "및"을 포함하는 것으로 의도된다. 게다가, 청구범위는 임의의 선택적 요소를 제외하도록 초안 작성될 수 있다는 것에 유의한다. 이와 같이, 이러한 지정은 청구범위의 요소의 인용과 관련하여 "단독으로", "단지" 등과 같은 배타적 용어의 사용 및 "부정적" 제한의 사용에 대한 선행 기준으로서 역할을 하도록 의도된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "올리고뉴클레오타이드"란 용어는 예를 들어 100개, 200개, 300개 또는 400개 미만의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 핵산 분자(RNA 또는 DNA)를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 올리고뉴클레오타이드는 또한 디뉴클레오타이드, 트리뉴클레오타이드, 테트라뉴클레오타이드, 펜타뉴클레오타이드, 헥사뉴클레오타이드 및 헵타뉴클레오타이드를 포함한다. 게다가, 본원에서 사용된 바와 같은 "뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드, 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오사이드"란 용어는 당업자에게 알려져 있는 바와 같이 자연적으로 발생하는 종 및 자연적으로 발생하지 않거나 변형된 종 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다.
"선택적으로 치환된"이란 용어는 명시된 기 또는 모이어티(moiety)가 비치환되거나, 하기 "치환기"에 대한 정의에서 나열되거나 별도로 명시된 치환기의 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상(전형적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 치환기로 치환된다는 것을 의미한다. "치환기"란 용어는 치환된 기의 임의의 원자에 있는 치환된 기 상의 "치환된" 기를 지칭한다. 적합한 치환기로는 수소, 하이드록시, 카르복시, 옥소, 니트로, 할로알킬, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알카릴, 아릴, 헤테로아릴, 사이클릴, 헤테로사이클릴, 아르알킬, 알콕시, 아릴옥시, 아미노, 아실아미노, 알킬카바모일, 아릴카바모일, 아미노알킬, 알콕시카르보닐, 카르복시, 하이드록시알킬, 알칸설포닐, 아렌설포닐, 알칸설폰아미도, 아렌설폰아미도, 아르알킬설폰아미도, 알킬카르보닐, 아실옥시, 시아노 또는 우레이도를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우, 2개의 치환기는 이들이 부착된 탄소와 함께 고리를 형성할 수 있다.
본원에서 상호 교환 가능하게 사용된 바와 같이, "본질적으로" 및 "실질적으로"란 용어는 적어도 약 60%, 또는 바람직하게는 적어도 약 70% 또는 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99% 또는 그 이상, 또는 70%와 100% 사이의 임의의 정수의 비율을 의미한다. 일부 실시형태에서, "본질적으로"란 용어는 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 그 이상, 또는 90%와 100% 사이의 임의의 정수의 비율을 의미한다. 일부 실시형태에서, "본질적으로"란 용어는 100%를 포함할 수 있다.
본 개시내용을 판독할 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에 기술되고 예시된 개개의 양태 각각은 본 발명의 범주 및 진의에서 벗어나지 않으면서 기타 몇몇 양태 중 임의의 것의 특징부와 용이하게 분리되거나 이와 조합될 수 있는 별개의 성분 및 특징부를 갖는다. 임의의 나열된 방법은 나열된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 기타 순서로 실시될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 추가로 제한하기 위한 것으로 이해되어서는 안 된다. 본 출원 전반에 인용된 모든 참고문헌, 계류 중인 특허 출원 및 공개 특허의 내용은 본원에서 참고로 명시적으로 포함된다.
실시예
하기 실시예에는 본 발명의 일부 실시형태 및 양태가 예시되어 있다. 다양한 변형, 첨가, 치환 등이 본 발명의 범주 및 진의를 변경하지 않으면서 수행될 수 있으며, 하기 청구범위에서 정의된 바와 같이 이 같은 변형 및 변경이 본 발명의 범주 내에 포함된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 임의의 방식으로 제한하지 않는다.
실시예 1: TIPS 보호기를 갖는 포스포아미다이트의 합성
[반응식 1]
Figure pct00004
화합물 2: 무수 피리딘(450 ㎖) 중의 5'-ODMTr 우리딘 1(50 g, 91.48 mmol)의 교반 용액에 이미다졸(24.91 g, 365.92 mmol) 및 클로로(트리이소프로필)실란(47.0 ㎖, 220 mmol)을 순차적으로 첨가하였다. 50℃에서 24시간 동안 교반한 후, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다. 잔류물을 NaHCO3(400 ㎖)과 EtOAc(500 ㎖)의 포화 수용액과 조합하고, 5분 동안 교반하였다. 혼합물을 분별 깔때기 내로 옮기고, 층을 분리하고, 유기층을 NaHCO3의 포화 수용액 및 염수로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 증발 건조하였다. 잔류물을 ISCO 자동화 칼럼에 의해 정제하고, 최소 DCM에서 용해하고, 헥산 중의 0% 내지 30% EtOAc을 용출액으로 사용하여 120 g의 실리카 겔 칼럼 상에 적재하여 화합물 2(26.1 g, 41%)를 수득하였다. 1 H NMR (500 MHz, 아세토니트릴-d3) δ 7.70 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.45 - 7.37 (m, 2H), 7.35 - 7.19 (m, 8H), 6.93 - 6.84 (m, 4H), 5.82 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 5.37 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.42 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 4.17 (td, J = 5.3, 3.9 Hz, 1H), 3.77 (s, 6H), 3.49 (dd, J = 10.9, 2.7 Hz, 1H), 3.31 - 3.23 (m, 2H), 1.06 - 0.90 (m, 22H). LRMS (ESI) C39H50N2O8Si [M+H]+ m/z에 대한 실측치 = 703.34, 관측치 = 703.4.
화합물 3: 0℃에서 무수 EtOAc(600 ㎖) 중의 화합물 2(25.93 g, 36.89 mmol)의 교반 용액에 DIPEA(19.3 ㎖, 111 mmol), 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포아미다이트(24.7 ㎖, 110.7 mmol) 및 N-메틸이미다졸(2.9 ㎖, 36.9 mmol)을 순차적으로 첨가하였다. 냉수조를 제거하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 MeCN/톨루엔 중의 트리에탄올아민(2.7 M, 50 ㎖)의 용액을 사용하여 켄칭(quenching)하고, 5분 동안 교반하였다. 혼합물을 에틸아세테이트로 희석하고, 분별 깔때기로 옮겼으며, 층을 분리하고, 유기층을 5% NaCl 용액 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조하고, 증발 건조하였다. 잔류물을 트리에틸아민-전처리된 실리카 겔 상에 예비 흡착시켰다. 칼럼을 1% NEt3을 함유하는 헥산으로 평형화시켰다. 잔류물을 헥산 중의 0% 내지 40% EtOAc을 용출액으로 사용하여 ISCO 자동화 칼럼에 의해 정제하여 화합물 3(26.5 g, 79%)을 얻었다. 1 H NMR (500 MHz, CD3CN) δ 8.73 (s, 1H), 7.59 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.44 - 7.41 (m, 2H), 7.36 - 7.28 (m, 7H), 6.89 - 6.85 (m, 4H), 6.06 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 5.51 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.32 - 4.23 (m, 2H), 4.11 - 4.07 (m, 1H), 3.84 - 3.67 (m, 10H), 3.67 - 3.54 (m, 3H), 3.46 (dd, J = 10.9, 3.7 Hz, 1H), 3.28 (dd, J = 11.0, 4.2 Hz, 1H), 2.57 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 1.16 - 1.11 (m, 11H), 1.04 - 0.95 (m, 23H). 31 P NMR (202 MHz, CD3CN) δ 150.83, 150.80, 149.64, 149.61. LRMS (ESI) C48H67N4O9PSi [M+H]+ m/z에 대한 실측치 = 902.44, 관측치 = 925.2.
[반응식 2]
Figure pct00005
화합물 5: 무수 피리딘(15.0 ㎖) 중의 화합물 4(2.0 g, 3.0 mmol, 1 당량)의 교반 용액에 이미다졸(1.62 g, 23.7 mmol, 8 당량) 및 클로로(트리이소프로필)실란(1.52 ㎖, 7.12 mol, 2.4 당량)을 순차적으로 첨가하였다. 50℃에서 24시간 동안 교반한 후, NaHCO3(50 ㎖)의 포화 수용액 및 Et2O를 첨가하고, 얻어진 혼합물을 분별 깔때기로 옮겼으며, 층을 분리하고, 수성층을 Et2O(50 ㎖ x 2)로 추출하였다. 모은 유기층을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 증발 건조하였다. 잔류물을 헥산 중의 0% 내지 40% EtOAc을 용출액으로 사용하여 ISCO 자동화 칼럼에 의해 정제하여 화합물 5(0.78 mg, 31%)를 얻었다. 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 11.22 (s, 1H), 8.64 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.08 - 8.02 (m, 2H), 7.67 - 7.61 (m, 1H), 7.57 - 7.52 (m, 2H), 7.39 - 7.32 (m, 2H), 7.28 - 7.16 (m, 8H), 6.88 - 6.80 (m, 4H), 6.06 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 5.50 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 4.96 (q, J = 5.6 Hz, 1H), 4.65 - 4.59 (m, 1H), 4.15 (q, J = 4.6 Hz, 1H), 3.72 (s, 6H), 3.41 (dd, J = 10.5, 4.6 Hz, 1H), 3.20 (dd, J = 10.5, 5.1 Hz, 1H), 1.14 - 0.93 (m, 24H). 13 C NMR (101 MHz, DMSO) δ 166.15, 158.59, 152.51, 151.85, 151.01, 145.26, 144.51, 135.91, 135.88, 133.87, 132.92, 130.16, 128.98, 128.94, 128.22, 128.09, 127.15, 126.62, 113.60, 113.58, 88.78, 86.22, 84.61, 72.88, 72.65, 63.83, 55.51, 40.03, 18.34, 18.11, 18.01, 12.27. LRMS (ESI) C47H56N5O7Si [M+H]+ m/z에 대한 실측치 = 830.39, 관측치 = 830.4.
화합물 6: 무수 DCM(10 V) 중의 화합물 5(201.5 g, 1.0 당량)의 교반 용액에 피리딘(6.0 당량), 2-시아노에틸 N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트(3.0 당량) 및 DCI(2.0 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 4시간 동안 교반하였다. 후처리(workup) 이후, 유기층을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 증발 건조하였다. 반응 조질물을 DCM/헵탄을 이용하여 침전시켜 화합물 6(130 g, 52%)을 얻었다. 31 P NMR (202 MHz, CDCl3) δ 150.82, 150.66. LRMS (ESI) C56H73N7O8PSi [M+H]+ m/z에 대한 실측치 = 1,031.49, 관측치 = 1,031.5.
[반응식 3]
Figure pct00006
화합물 8: 무수 피리딘(150.0 ㎖) 중의 화합물 7(20.0 g, 30.5 mmol)의 교반 용액에 이미다졸(16.61 g, 0.24 mol) 및 클로로(트리이소프로필)실란(26.1 ㎖, 0.12 mol)을 순차적으로 첨가하였다. 50℃에서 24시간동안 교반한 후, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다. 잔류물을 NaHCO3(100 ㎖)과 EtOAc(500 ㎖)의 포화 수용액과 조합하고, 10분 동안 교반하였다. 혼합물을 분별 깔때기로 옮겼으며, 층을 분리하고, 유기층을 NaHCO3의 포화 수용액(50 ㎖) 및 염수(50 ㎖)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 증발 건조하였다. 잔류물을 헥산 중의 0% 내지 70% EtOAc을 용출액으로 사용하여 ISCO 자동화 칼럼에 의해 정제하여 화합물 8(9.85 g, 40%)을 얻었다. 칼럼을 1% NEt3을 함유하는 헥산으로 평형화시켰다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 11.96 (s, 1H), 7.88 - 7.81 (m, 1H), 7.54 - 7.48 (m, 1H), 7.42 - 7.36 (m, 1H), 7.30 - 7.18 (m, 1H), 6.85 - 6.76 (m, 1H), 5.70 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 4.95 - 4.88 (m, 1H), 4.62 - 4.57 (m, 1H), 4.54 - 4.50 (m, 1H), 4.17 - 4.13 (m, 1H), 3.77 (d, J = 3.5 Hz, 9H), 3.59 - 3.52 (m, 1H), 3.27 - 3.16 (m, 1H), 3.14 - 3.05 (m, 1H), 1.72 - 1.62 (m, 1H), 1.33 - 1.20 (m, 1H), 1.01 - 0.88 (m, 1H), 0.72 (d, J = 6.9 Hz, 4H), 0.60 - 0.45 (m, 3H). LRMS (ESI) C44H57N5O8Si [M+H]+ m/z에 대한 실측치 = 811.40, 관측치 = 812.2.
화합물 9: 무수 DCM(1.4 ℓ) 중의 화합물 8(140 g, 1.0 당량)의 교반 용액에 2-시아노에틸 N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트(5.0 당량) 및 DCI(3.0 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응물을 10% NaHCO3(10 x 1,000 ㎖) 및 염수(2 x 1,000 ㎖)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조한 후, 35℃에서 농축하여 연황핵 오일로서 조질 생성물(387 g)을 얻었다. 화합물 9(81 g, 46%)가 백색 고체로서 수득될 때까지 조질물(386 g)을 DCM/MTBE로 수 회(8회) 침전시켰다. 31 P NMR (202 MHz, CDCl3) δ 150.72, 149.33. LRMS (ESI) C53H75N7O9PSi [M+H]+ m/z에 대한 실측치 = 1,012.5, 관측치 = 1,012.4.
[반응식 4]
Figure pct00007
화합물 11: 무수 CH2Cl2(2.8 ㎖) 중의 화합물 10(0.5 g, 0.85 mmol, 1 당량)의 교반 용액에 무수 디이소프로필아민(0.72 ㎖, 5.1 mmol, 6 당량) 및 클로로(트리이소프로필)실란(0.55 ㎖, 2.5 mmol, 3 당량)을 순차적으로 첨가하였다. 실온에서 4일 동안 교반한 후, 메탄올(3 ㎖)을 첨가하고, 얻어진 용액을 15분 동안 교반하였다. 혼합물을 DCM(10 ㎖)로 희석하고, 층을 분리하였다. 유기층을 물(10 ㎖ x 2)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 증발 건조하였다. 잔류물을 헥산 중의 0% 내지 60% EtOAc을 용출액으로 사용하여 ISCO 자동화 칼럼(칼럼은 1% NEt3을 함유하는 헥산으로 평형화하였음)에 의해 정제하여 화합물 11(287 mg, 45%)을 얻었다. 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.89 (s, 1H), 8.36 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.40 - 7.18 (m, 10H), 7.04 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 6.89 (dq, J = 8.3, 3.2 Hz, 4H), 5.84 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 5.47 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 4.28 (dd, J = 7.1, 4.8 Hz, 1H), 4.12 - 4.08 (m, 1H), 4.07 - 4.04 (m, 1H), 3.75 (d, J = 0.8 Hz, 6H), 3.54 (dd, J = 11.0, 2.9 Hz, 1H), 3.24 (dd, J = 11.0, 3.8 Hz, 1H), 2.10 (s, 3H), 1.05 - 0.82 (m, 24H). 13 C NMR (101 MHz, DMSO) δ 170.97, 170.30, 162.35, 158.24, 158.23, 154.47, 144.69, 144.19, 134.98, 134.93, 129.81, 129.78, 127.82, 126.91, 113.17, 113.13, 95.34, 91.03, 86.20, 82.34, 74.15, 70.29, 61.98, 59.73, 55.01, 39.52, 24.34, 20.74, 17.74, 14.07, 11.63. LRMS (ESI) C41H53N3O8SiNa [M+Na]+ m/z에 대한 실측치 = 766.35, 관측치 = 766.3.
화합물 12: 무수 DCM(8 V) 중의 화합물 11(1.0 당량)의 교반 용액에 피리딘(6.5 당량), 2-시아노에틸 N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트(1.3 당량) 및 DCI(1.2 당량)를 첨가하였다. 25℃에서 20시간 동안 교반한 후, 혼합물을 포화 NaHCO3 및 염수로 세척하였다. 후처리 이후, 유기층을 농축하여 조질 화합물 12를 얻었으며, 이를 1% 피리딘을 함유하는 n-헵탄 중의 0% 내지 50% EtOAc을 용출액으로 사용하여 칼럼에 의해 정제하여 화합물 12(수율: 76.6%)를 얻었다. 31 P NMR (202 MHz, CDCl3) δ 151.96, 148.56. LRMS (ESI) C50H71N5O9PSi [M+H]+ m/z에 대한 실측치 = 944.4, 관측치 = 944.1.
실시예 2: 3'-TOM 및 POM 보호기를 갖는 우리딘의 합성
[반응식 5]
Figure pct00008
화합물 13: THF(50 ㎖) 중의 화합물 2(7 g, 13.1 mmol) 및 N-에틸-N-이소프로필-프로판-2-아민(8.01 ㎖, 46.01 mmol)을 함유하는 용액을 디부틸(디클로로)스타난(4.58 g, 14.46 mmol, 3.36 ㎖)으로 처리하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 66℃까지 가열한 후, 클로로메톡시(트리이소프로필)실란(4.13 g, 15.77 mmol, 4.31 ㎖)을 첨가하고, 66℃에서 40분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다. 조질 잔류물을 DCM과 NaHCO3 포화 용액 사이에 분할하고, 층을 분리하고, 유기층을 NaHCO3 수용액과 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 증발 건조하였다. 잔류물을 헥산 중의 0% 내지 40% EtOAc을 용출액으로 사용하여 ISCO 자동화 칼럼에 의해 정제하여 화합물 13(3.48 g, 37%)을 얻었다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.77 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.39 - 7.22 (m, 1H), 6.87 - 6.80 (m, 1H), 5.96 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 5.39 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.06 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 4.90 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 4.35 - 4.22 (m, 1H), 3.80 (s, 6H), 3.59 - 3.51 (m, 1H), 3.43 - 3.36 (m, 1H), 2.05 (s, 2H), 1.60 (s, 2H), 1.13 - 1.01 (m, 2H). LRMS (ESI) C40H52N2O9Si [M+Na]+ m/z에 대한 실측치 = 732.34, 관측치 = 755.4.
화합물 14: 0℃에서 무수 EtOAc(100 ㎖) 중의 화합물 13(3.5 g, 4.9 mmol)의 교반 용액에 DIPEA(1.7 ㎖, 9.8 mmol), 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포아미다이트(2.2 ㎖, 9.81 mmol) 및 N-메틸이미다졸(0.39 ㎖, 4.9 mmol)을 순차적으로 첨가하였다. 빙수조를 제거하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 MeCN/톨루엔 중의 트리에탄올아민(2.7 M, 11 ㎖)의 용액으로 켄칭하고, 5분 동안 교반하였다. 혼합물을 에틸아세테이트로 희석하고, 분별 깔때기로 옮겼으며, 층을 분리하고, 유기층을 5% NaCl 용액 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조하고, 증발 건조하였다. 잔류물을 트리에틸아민-전처리된 실리카 겔 상에 예비 흡착시켰다. 칼럼을 1% NEt3을 함유하는 헥산으로 평형화시켰다. 잔류물을 헥산 중의 0% 내지 40% EtOAc을 용출액으로 사용하여 ISCO 자동화 칼럼에 의해 정제하여 화합물 14(3.26 g, 71%)를 얻었다. 1 H NMR (400 MHz, CD3CN) δ 7.69 (dd, J = 9.7, 8.2 Hz, 1H), 7.46 (dd, J = 7.2, 1.1 Hz, 2H), 7.36 - 7.21 (m, 7H), 6.90 (dd, J = 7.6, 1.3 Hz, 4H), 6.00 - 5.96 (m, 1H), 5.43 - 5.35 (m, 1H), 5.12 - 4.96 (m, 2H), 4.56 - 4.48 (m, 1H), 4.42 - 4.36 (m, 1H), 4.33 - 4.25 (m, 1H), 3.91 - 3.58 (m, 11H), 3.47 - 3.33 (m, 2H), 2.68 - 2.61 (m, 2H), 1.25 - 0.94 (m, 36H). 31P NMR (162 MHz, CD3CN) δ 150.61, 150.55. LRMS (ESI) C49H69N4O10PSi [M+H]+ m/z에 대한 실측치 = 932.45, 관측치 = 955.5(M+Na).
[반응식 6]
Figure pct00009
화합물 15: 비어 있는 마이크로파 튜브에 화합물 2(2 g, 3.76 mmol)를 첨가한 후, 디부틸(옥소)주석(1.22 g, 4.88 mmol, 769.23 uL) 및 테트라부틸암모늄 브로마이드(1.57 g, 4.88 mmol)를 첨가하였다. 튜브를 고무 격막으로 밀폐하고, 시스템을 5분 동안 Ar로 플러싱(flushing)하였다. 1,2-DCE(10 ㎖)를 첨가하고, 얻어진 현탁액을 1분 동안 교반한 후, 클로로메틸 피발레이트(1.41 g, 9.39 mmol, 1.35 ㎖)를 첨가하였다. 격막을 마이크로파 튜브 캡으로 신속하게 교환하고, 튜브를 300 W에서 2.5시간 동안 마이크로파에서 75℃까지 가열하였다. 총 6 g의 화합물 2에 대하여 동일한 양의 시약을 이용하여 2회 더 반응을 수행하였다. 3개의 모은 조질 반응 혼합물을 모으고, 감압 하에 증발 건조하였다. 샘플을 트리에틸아민으로 전처리된 실리카 상에 예비 흡착시켰다. 잔류물을 헥산 중의 0% 내지 40% EtOAc을 용출액으로 사용하여 ISCO 자동화 칼럼(실리카를 NEt3으로 전처리하였음)에 의해 정제하여 화합물 15(1.68 g, 23%)를 얻었다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.87 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.48 - 7.36 (m, 3H), 7.35 - 7.22 (m, 4H), 6.94 - 6.84 (m, 2H), 5.89 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 5.41 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 5.37 - 5.27 (m, 1H), 4.50 - 4.38 (m, 2H), 4.23 - 4.17 (m, 1H), 3.54 - 3.39 (m, 1H), 3.35 - 3.28 (m, 1H), 1.20 - 1.08 (m, 4H). LRMS (ESI) C36H40N2O10 [M+H]+ m/z에 대한 실측치 = 660.27, 관측치 = 661.7.
화합물 16: 0℃에서 무수 EtOAc(50 ㎖) 중의 화합물 15(1.6 g, 2.5 mmol)의 교반 용액에 DIPEA(1.1 ㎖, 6.2 mmol), 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포아미다이트(1.4 ㎖, 6.2 mmol) 및 N-메틸이미다졸(0.19 ㎖, 2.4 mmol)을 순차적으로 첨가하였다. 냉수조를 제거하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 MeCN/톨루엔 중의 트리에탄올아민(2.7 M, 6 ㎖)의 용액으로 켄칭하고, 5분 동안 교반하였다. 혼합물을 에틸아세테이트로 희석하고, 분별 깔때기로 옮겼으며, 층을 분리하고, 유기층을 5% NaCl 용액 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조하고, 증발 건조하였다. 잔류물을 트리에틸아민-전처리된 실리카 겔 상에 예비 흡착시켰다. 칼럼을 1% NEt3을 함유하는 헥산으로 평형화시켰다. 잔류물을 헥산 중의 0% 내지 60% EtOAc을 용출액으로 사용하여 ISCO 자동화 칼럼에 의해 정제하여 화합물 16(1.517 g, 74%)을 얻었다. 1 H NMR (500 MHz, CD3CN) δ 7.65 - 7.59 (m, 1H), 7.46 - 7.41 (m, 1H), 7.35 - 7.21 (m, 6H), 6.93 - 6.83 (m, 3H), 5.98 - 5.91 (m, 1H), 5.46 - 5.37 (m, 1H), 5.34 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 5.20 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 4.61 - 4.50 (m, 1H), 4.47 - 4.38 (m, 1H), 4.21 - 4.14 (m, 1H), 3.67 - 3.57 (m, 3H), 3.40 - 3.31 (m, 2H), 2.69 - 2.59 (m, 1H), 1.19 - 1.16 (m, 6H), 1.12 (t, J = 6.4 Hz, 11H). 31 P NMR (202 MHz, CD3CN) δ 150.84, 150.47.
실시예 3: 3'-OTIPS-보호된 뉴클레오사이드 및 포스포아미다이트의 선택적 합성
[반응식 7]
Figure pct00010
포르브뤼겐(
Figure pct00011
) 조건 하에 당 17의 아노머 위치에 우라실을 배치시킴으로써 합성을 시작하였다. 수득된 화합물 18을 탄산칼륨으로 처리하여 아세테이트기를 개열하여 뉴클레오사이드 19를 생성하였으며, 이를 5'-O 위치에서 DMTCl로 보호하여 뉴클레오사이드 2를 얻었다. 포스포아미다이트 4의 형성은 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포아미다이트를 이용하여 표준 조건 하에서 달성되었다.
[반응식 8]
Figure pct00012
뉴클레오사이드 18을 출발 물질로 하여, 2-단계 트리아졸화/암모니아 분해(ammonolysis) 순서로 우라실 핵염기를 시토신으로 변형시켜 뉴클레오사이드 20을 얻었다. DMTCl을 이용한 1차 하이드록실기의 보호 및 핵염기에서의 벤조에이트기의 선택적 배치를 통해 뉴클레오사이드 21을 얻었다. 포스포아미다이트 22의 형성은 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포아미다이트를 이용하여 표준 조건 하에 달성되었다.
[반응식 9]
Figure pct00013
뉴클레오사이드 23으로의 당 17의 변형은 N-벤조일 아데닌을 이용하여 포르브뤼겐 조건 하에 달성된 후, 염기성 조건 하에 아세테이트기가 개열되었다. 뉴클레오사이드 23 내의 1차 하이드록실을 DMT 에테르로서 보호하여 뉴클레오사이드 5를 얻었으며, 이를 추후에 표준 조건 하에 상응하는 포스포아미다이트 6으로 변형시켰다.
[반응식 10]
Figure pct00014
당 17을 출발 물질로 사용하여, 구아닌 모이어티를 배치하기 위한 2-단계 순서를 이용하여 뉴클레오사이드 24를 수득하였다. 이소부티르산 무수물을 이용한 핵염기의 보호를 통해 화합물 25를 얻었다. 아세테이트기를 염기성 조건 하에 개열하고, 1차 하이드록실기를 DMT 에테르로서 보호하여 뉴클레오사이드 8을 얻었다. 포스포아미다이트 9의 형성은 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포아미다이트를 이용하여 표준 조건 하에 달성되었다.
실시예 4: 3'-O-보호된 뉴클레오사이드를 이용한 siRNA 합성
올리고뉴클레오타이드 합성: 하기 표에 나타나 있는 파라미터를 이용하여 대표적인 올리고뉴클레오타이드의 합성을 수행하였다. 본 연구의 목표는 본 발명자의 현재의 개열 및 탈보호 방법(수성 염기에 대한 장기간 노출을 수반함)과 양립 가능하고, RNA 가수분해/개열을 초래할 수 있는 보호기의 조기 이탈과 같은 부반응을 최소화할 가장 최적의 RNA 보호기를 결정하기 위한 것이다. 합성 조건은 표 1 및 표 2에 나타나 있으며, 이들 연구를 위한 합성된 올리고뉴클레오타이드의 서열은 표 3에 요약되어 있다.
서열 asCfsguuuXcaaagcAfcUfuuauusgsa(X = 3'-RNA)(서열 번호 11)
규모 1 μmol
화학 3' 23-머로부터 17번째 위치의 3'-RNA 단량체("X"란 문자로 나타냄)
합성 동안에 적용된 구체적인 파라미터 ㆍ 모든 아미다이트는 100% MeCN 또는 85:15 MeCN:DMF 중에 100 mM로 용해되고; 활성제는 100% MeCN 중에 250 mM로 용해됨
ㆍ 모든 아미다이트의 결합 정보: 아미다이트 부피: 80 ㎕ (이중 결합됨; 활성제 부피: 120 ㎕; 활성제:아미다이트 = 3.8:1
합성 장비 MerMade 192
지지체 통상의 지지체(1,000 Å)
서열 aUfcaaAfXCfAfcuuuAfuUfgaguuuc(X = 3'-RNA)(서열 번호 12)
규모 300 μmol
화학 3' 23-머로부터 17번째 위치의 3'-RNA 단량체("X"란 문자로 나타냄)
합성 동안에 적용된 구체적인 파라미터 ㆍ 결합 정보: 아미다이트 부피: 303 umol * 2 당량 = 3.03 ㎖:활성제 부피: 8.08 ㎖; 활성제:아미다이트 = 4:1
ㆍ X 위치의 RNA 단량체의 경우: 2 당량의 아미다이트가 사용됨; 결합 부피: 3.03 ㎖
ㆍ 아미다이트 흐름: 1.77 ㎖/분; 활성제 흐름: 4.72 ㎖/분
ㆍ 모든 염기에 대한 11분의 재생; 모두 12.88 ㎖/분의 속도
ㆍ 표준 최종 Detrit
ㆍ 75 ㎝/시간으로 20분 동안 DEA 처리(12 CV)
합성 장비 12 ㎖ 칼럼을 이용하는 AKTA Oligo Pilot Plus 100
지지체 2'-OMe-C(Ac) 600A CPG
Figure pct00015
개열 및 탈보호: 이러한 탈보호는 합성의 품질을 평가하기 위해, 보다 구체적으로는 RNA 보호기의 조기 탈보호로부터 유래하는 불순물을 식별하기 위해 사용된다. 합성 규모(소규모용의 절차 1 및 대규모용의 절차 2)에 따라 2개의 상이한 절차를 사용하였다. 절차 둘 모두에 있어서, NH4OH, NH4OH/EtOH, MeNH2 또는 암모니아/메틸아민(AMA) 혼합물을 사용할 수 있다.
절차 1:
1. 합성 이후, 칼럼을 포함하는 플레이트를 96-딥웰 플레이트 상부의 개열 척(cleavage chuck) 내에 넣었다.
2. 농축 메틸아민 수용액 또는 농축 수산화암모늄 용액(150 ㎕)을 각각의 칼럼에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 배양하였다. 이어, 진공을 이용하여 칼럼을 통해 용액을 완전히 인출하였다.
3. 단계 #2를 한 번 더 반복하고, 플레이트를 밀봉하고, 소정의 시간 동안 실온에서 진탕하였다.
4. 조질물의 샘플을 RODI 물로 100배 희석하고, LCMS를 이용하여 분석하였다.
절차 2:
1. 합성 이후에 소량의 건조된 지지체(약 30 ㎎)를 2 ㎖의 유리 스크류 캡 바이알 내에 놓는다.
2. 수산화암모늄 용액(1 ㎖)을 첨가하고, 바이알을 35℃에서 15시간 동안 방치한다. (주석: 이 단계에서, 조질물을 실온까지 냉각시킨 후, 샘플을 분취하고, RODI 물로 30배 희석한 후, 초기 조질물 분석을 위해 HPLC에 의해 분석하였다).
3. 탈실릴화 단계에 있어서: 조질 용액을 디캔팅(decanting)하고, 수지를 0.5 ㎖의 DMSO로 3회 세척하였다. 바이알을 볼텍싱(vortexing)한 후, 모든 수지가 침강하도록 2분 동안 방치하였다. DMSO 용액을 디캔팅하고, 초기 여과액과 조합하여 4 ㎖의 섬광 바이알(scintillation vial)에 넣었으며, 이를 빙수조를 이용하여 0℃까지 냉각시켰다.
4. 혼합물에 피리딘*HF(시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 0.75 ㎖)를 첨가하고(반응물이 뿌옇게 변하였음), 바이알을 50℃에서 1시간 동안 방치하였다.
5. 반응물을 실온까지 냉각시키고, 물(2.5 ㎖)로 켄칭하였다. 바이알을 볼텍싱하여 모든 고체를 용해시켰다.
6. HPLC 분석을 위해 샘플을 분취하고, RODI 물로 30배 희석하였다.
HPLC에 의한 조질 올리고뉴클레오타이드 혼합물의 분석: 표 4에 나타나 있는 조건을 이용하는 IPRP-LCMS를 이용하여 조질물 분석을 실시하였다.
분석 칼럼 ACQUITY UPLC 펩타이드 BEH C18, 2.1 ㎜ x 100 ㎜, 1.7 ㎛
완충액/용매 용매 A = 550 mM HFIP, 13 mM TEA, 10% MeOH, 5 μM EDTA
용매 B = MeOH, 5 μM EDTA
작업 구배(%B) 구배 A: 38분 내의 8% 내지 21%
구배 B: 38분 내의 5% 내지 27%
결과: 상이한 RNA 보호기를 갖는 7개의 상이한 23-머 올리고뉴클레오타이드를 합성하고(표 3), 여기에 다양한 개열 및 탈보호 조건을 적용하였다. 해당되는 경우, 염기 처리 동안에 다양한 보호기의 안정성을 결정하기 위해 HF 처리 이전에 초기 HPLC 분석을 실시하였다. 간결성을 위해, 4개의 관심 종, 즉 실릴기 또는 기타 기로 보호된 3' 또는 2' 하이드록실기를 갖는 완전히 탈보호된 올리고(FLP-OX; 여기서 X = TBS, TOM, TIPS 또는 피발로일옥시메틸), 탈보호된 올리고(FLP-OH), 개열된 3'-단편 및 개열된 5'-단편을 이용하여 모든 HPLC 및 MS 통합을 실시하였다. 표 5에 나타나 있는 바와 같이, 실릴 보호기(TBS 및 TIPS) 및 TOM 보호기는 상이한 정도에 불구하고 장기간 염기 처리에 불안정하다. TIPS-보호된 RNA를 함유하는 23-머는 단지 3%의 탈보호된 FLP 및 1%의 개열될 가수분해 생성물을 이용하여 최상의 종합 결과를 얻었다. FLP-OH를 생성하기 위해 과량의 HF 피리딘을 이용하여 보호기(TIPS)를 용이하게 제거할 수 있다(도 7). 또한, FLP-OH의 생성 및 염기성 조건에 대한 이의 장기간 처리는 표 5 및 도 8 내지 도 10에 나타나 있는 바와 같은 다양한 수준의 가닥 개열을 초래할 수 있다.
RNA 서열 * 변형(X) C&D 조건 FLP-OX(%) ** %FLP-OH 개열(3'-단편)(%) 개열(5'-단편)(%)
1 2'-OTBS-U NH4OH, 35℃, 15시간 87 9 4 n.d.
2 3'-OTBS-U NH4OH, 35℃, 15시간 87 2 11 n.d.
3 3'-OTBS-G NH4OH, 35℃, 15시간 84 4 12 n.d.
4 2'-OTOM-U NH4OH, 35℃, 15시간 84 14 2 n.d.
5 3'-OTOM-U NH4OH, 35℃, 15시간 84 13 3 n.d.
6 3'-OTIPS-U NH4OH, 35℃, 15시간 96 1 3 n.d.
8 3'-OPivOM-U NH4OH, 실온, 15시간 n.d. 75 12 n.d.
8 3'-OPivOM-U MeNH2, 실온, 2시간 n.d. 84 16 n.d.
8 3'-OPivOM-U MeNH2, 실온, 15시간 n.d. 27 58 15
6 3'-OTIPS-U NH4OH, 35℃, 15시간 95 1 4 n. d.
*표 3으로부터의 RNA 서열. **X = 3' 또는 2'(TBS, TOM, TIPS) 상의 보호기; n.d. = 미검출
확인된 모든 특허, 특허 출원 및 공개물은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 이 같은 공개물에 기술되어 있는 방법을 설명 및 개시할 목적으로 본원에서 참고로 명시적으로 포함된다. 이들 공개물은 특허 출원의 출원일 이전에 이들의 개시를 위해서만 제공된다. 이와 관련하여 어떠한 것도 본 발명자들이 이전 발명에 의해 또는 임의의 기타 이유로 인해 이 같은 개시내용보다 날짜가 선행한다는 권리를 부여받지 않음을 허용하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 날짜와 관련한 모든 기술내용 또는 이들 문헌의 내용과 관련한 표현은 본 출원인에 허용 가능한 정보에 기반을 두고 있으며, 이들 문헌의 일자 또는 내용의 정확성과 관련하여 임의로 허용하는 것이 성립되지 않는다.
상술한 설명의 견지에서 이들 및 기타 변경은 실시형태에 대해 이루어질 수 있다. 일반적으로, 하기 청구범위에서 사용된 용어는 청구범위를 본 명세서 및 청구범위에 개시되어 있는 구체적인 실시형태로 제한하는 것으로 이해되어서는 안 되지만, 이 같은 청구범위가 부여하는 등가물의 전체 범주와 함께 가능한 모든 실시형태를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시내용에 의해 제한되지 않는다.

Claims (30)

  1. 3'-OH 기를 갖는 적어도 하나의 뉴클레오사이드를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 합성하기 위한 방법으로서,
    (i) 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드 상의 유리 하이드록실기를 트리이소프로필실릴에테르(TIPS)-보호된 3'-하이드록실기를 갖는 뉴클레오사이드 포스포아미다이트 단량체와 결합시켜 포스파이트 트리에스테르 중간체를 형성하는 단계; 및
    (ii) 상기 포스파이트 트리에스테르 중간체를 산화 또는 황화(sulfurization)시켜 보호된 중간체를 형성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 모든 합성 단계는 자동화 올리고뉴클레오타이드 합성기 상에서 수행되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 대규모로 합성되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 산화 단계는 약염기의 존재 하에 이루어지는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 약염기는 피리딘, 루티딘, 피콜린 또는 콜리딘인 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 산화 단계는 I2/H2O의 존재 하에 이루어지는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 황화 단계는 황 전달 시약의 존재 하에 이루어지는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 황 전달 시약은 3-(디메틸아미노메틸리덴)아미노-3H-1,2,4-디티아졸-3-티온(DDTT) 또는 3H-1,2-벤조디티올-3-온 1,1-디옥사이드인 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 보호된 중간체를 염기로 탈보호하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 염기는 수산화암모늄, 메틸아민 또는 수산화암모늄과 메틸아민의 혼합물인 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 염기를 이용한 상기 처리 단계는 실온 또는 승온에서 이루어지는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 염기를 이용한 상기 처리 단계는 30℃ 이상의 온도에서 이루어지는 것인 방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 염기를 이용한 상기 처리 단계는 적어도 30분 동안 이루어지는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 염기를 이용한 상기 처리 단계는 적어도 4시간 동안 이루어지는 것인 방법.
  15. 제9항에 있어서, 상기 TIPS-보호된 하이드록실기를 유리 하이드록실기로 전환시키는 데 효과적인 탈보호 시약으로 염기-처리된 중간체를 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 탈보호 시약은 불소 음이온을 포함하는 것인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 탈보호 시약은 HFㆍ피리딘인 것인 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 탈보호 시약을 이용한 상기 처리 단계는 30℃ 이상의 온도에서 이루어지는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 약 6 내지 약 50개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 방법.
  20. 제10항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 약 10 내지 약 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 방법.
  21. 화학식 I의 구조를 갖는 뉴클레오사이드 단량체:
    [화학식 I]
    Figure pct00016

    (상기 식에서,
    B는 변형되거나 변형되지 않은 핵염기이고;
    R1은 하이드록실 보호기이고;
    R2는 -Si(R4)3이고;
    R3은 H 또는 -P(NR5R6)OR7이고;
    각각의 R4는 독립적으로는 선택적으로 치환된 알킬, 아릴, 아르알킬, 알카릴, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 알키닐 또는 사이클로알키닐이고;
    R5 및 R6은 독립적으로는 선택적으로 치환된 알킬, 아릴, 아르알킬, 알카릴, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 알키닐 또는 사이클로알키닐이거나, R5 및 R6은 연결되어 헤테로사이클릴을 형성하고;
    R7은 선택적으로 치환된 알킬, 아릴, 아르알킬, 알카릴, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 알키닐 또는 사이클로알키닐임).
  22. 제21항에 있어서, 상기 하이드록실 보호기는 4,4'-디메톡시트리틸(DMT), 모노메톡시트리틸(MMT), 9-플루오렌일메틸카르보네이트(Fmoc), o-니트로페닐카르보닐, p-페닐아조페닐카르보닐, 페닐카르보닐, p-클로로페닐카르보닐 및 5'-(α-메틸-2-니트로피페로닐)옥시카르보닐(MeNPOC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 뉴클레오사이드 단량체.
  23. 제21항에 있어서, 각각의 R4는 독립적으로는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬인 것인 뉴클레오사이드 단량체.
  24. 제21항에 있어서, 각각의 R4는 이소프로필인 것인 뉴클레오사이드 단량체.
  25. 제21항에 있어서, R5 및 R6은 독립적으로는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬인 것인 뉴클레오사이드 단량체.
  26. 제21항에 있어서, R5 및 R6은 이소프로필인 것인 뉴클레오사이드 단량체.
  27. 제6항에 있어서, R7은 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬인 뉴클레오사이드 단량체.
  28. 제21항에 있어서, R7은 메틸 또는 β-시아노에틸인 뉴클레오사이드 단량체.
  29. 제6항에 있어서, B는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 또는 우라실이고; R1은 모노메톡시트리틸 또는 디메톡시트리틸이고; R4는 독립적으로는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬이고; R5 및 R6은 독립적으로는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬이거나, R5 및 R5는 연결되어 4원 내지 8원의 헤테로사이클릴을 형성하고; R7은 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬인 것인 뉴클레오사이드 단량체.
  30. 제29항에 있어서, B는 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 우라실이고; R1은 디메톡시트리틸이고; R4, R5 및 R6은 이소프로필이고; R7은 β-시아노에틸인 것인 뉴클레오사이드 단량체.
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