JP2013128492A - オリゴヌクレオチドの精製 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】a)溶媒Bの沸点以下の沸点を有する少なくとも1種の溶媒Aにおける保護オリゴヌクレオチドの溶液を提供する工程、少なくとも30℃且つ少なくとも1種の溶媒Aの沸点以下の温度で該溶液を加熱する工程、物質の沈降が溶液中で見えるまで溶媒Bを加える工程、前記溶媒Bは1〜6個のC-原子を有するアルコール又は2〜6個のC-原子を有するジオールである、該溶液を上澄み液及び残渣の形成まで攪拌下で冷却する工程、該上澄み液を除去する工程を含むか、又はb)溶媒Bを提供する工程、前記溶媒Bは1〜6個のC-原子を有するアルコール又は2〜6個のC-原子を有するジオールである、30℃以上且つ溶媒Bの沸点以下の温度で溶媒Bを加熱する工程、物質の沈降が溶液中で見えるまで少なくとも1種の溶媒Aにおける保護オリゴヌクレオチドの溶液を加える工程、該溶液を上澄み液及び残渣の形成まで攪拌下で冷却する工程、該上澄み液を除去する工程を含む、保護オリゴヌクレオチドを精製するための方法。
【選択図】なし
Description
特にアンチセンス療法の発展により、大規模な合成がかなりの重要事項となった。比較的大規模な合成手順が開発されているが、1つの主要な欠点は中間体及び生成物の精製である。小規模な合成では、逆-相HPLCが、短時間におけるmg量の精製を良好な精製結果で可能にする適切な方法である。大規模な生産では、逆-相HPLCが、大量の溶媒、高価な装置などを必要とする困難な手順となる。
オリゴヌクレオチド合成の生成物を精製するための改善方法が継続して必要とされている。
欧州特許出願公開第0512768A1号明細書は、DNAを精製するための方法を開示している。該DNAは天然源から調製される。
上記の両方法は、非保護又はほぼ完全に非保護のオリゴヌクレオチドにのみ用いることができる。合成中にオリゴヌクレオチドは保護されるので、米国特許出願公開第2003/0055241号明細書及び欧州特許出願公開第0512768A1号明細書の方法を適用することができない。
一つの実施態様では、本発明は、
溶媒Bの沸点以下の沸点を有する少なくとも1種の溶媒Aにおける保護オリゴヌクレオチドの溶液を提供する工程、
少なくとも30℃且つ少なくとも溶媒Aの沸点以下の温度で該溶液を加熱する工程、
該溶液が濁るまで溶媒Bを加える工程、前記溶媒Bは1〜6個のC-原子を有するアルコール又は2〜6個のC-原子を有するジオールである、
該溶液を上澄み液及び残渣の形成まで攪拌下で冷却する工程、
該上澄み液を除去する工程、
を含む保護オリゴヌクレオチドを精製するための方法を提供する。
溶媒Bを提供する工程、前記溶媒Bは1〜6個のC-原子を有するアルコール又は2〜6個のC-原子を有するジオールである、
30℃以上且つ溶媒Bの沸点以下の温度で溶媒Bを加熱する工程、
該溶液が濁るまで少なくとも1種の溶媒Aにおける保護オリゴヌクレオチドの溶液を加える工程、
該溶液を上澄み液及び残渣の形成まで攪拌下で冷却する工程、
該上澄み液を除去する工程、
を含む保護オリゴヌクレオチドを精製するための方法を提供する。
“冷却する”とは、該溶液の温度を減少させることを意味する。典型的な冷却は室温(約25℃)に達するまで行われる。ある場合には、さらなる冷却、すなわち少なくとも20℃又は少なくとも10℃又は0℃に達することが好ましい。
“保護オリゴヌクレオチド”とは、例えば糖部分の基の5´、3´、2´位及び/又は複素環塩基及び/又はP-結合(例えばリン酸塩又はチオリン酸塩)に1種以上の保護基を含むオリゴヌクレオチドである。
“保護基”という用語は、オリゴヌクレオチドの使用前に除去されない基、例えばオリゴヌクレオチドの安定性を増加させるのに用いられる修飾を含む。
3'-ヒドロキシル-基に好適な保護基は、限定はしないが、tert-ブチルジメチルシリル(TBDMS)、レブリニル、ベンゾイルを含む。
好適な修飾はLNA(2´O-4´C-メチレン架橋)を含む。
好適な保護核酸塩基は当業者に公知であり、例えばN-4-ベンゾイルシトシン、N-6-ベンゾイルアデニン、N-2-イソブチリルグアニン、N-4-アセチル又はイソブチリルシトシン、N-6-フェノキシアセチルアデニン、N-2-tert-ブチルフェノキシアセチルグアニンである。好適な非塩基性残基はまた、リンカーとして用いることができる1´,2´-ジデオキシリボース(Glen ResearchからのdSpacer)を導くか、又はオリゴヌクレオチドにおける塩基性部位を模倣する水素(H)を含む(Takeshita et al., J. Biol. Chem., 1987, 262, 10171)。
好適な5'-保護基は、限定はしないが、トリチル基、好ましくはジメトキシトリチル基(DMTr)又はモノメトキシトリチル基(MMTr)を含む。これらの保護基は、従来の先行技術である固相オリゴヌクレオチド合成に用いられる。他の好適な5'-保護基は、限定はしないが、tert-ブチルジメチルシリル(TBDMS)、レブリニル、ベンゾイル、フルオレンメトキシカルボニル(FMOC)、9-フェニルチオキサンテン-9-イル(S-pixyl)を含む。
好ましい実施態様では、保護オリゴヌクレオチドが非-イオン性化合物である。
当技術分野で公知の修飾は、複素環塩基、糖又は単量体サブユニットを連結する結合の修飾である。ヌクレオチド間結合の変形は、例えば参照のために組み込まれるWO 2004/011474の11頁の下部から記載されている。
典型的な誘導体は、ホスホチオエート、ホスホロジチオエート、メチル及びアルキルホスホネート及びホスホノアセト誘導体である。
さらなる典型的な修飾は糖部分である。リボースは異なる糖で置換されているか、又は1つ以上の位置がF、O-アルキル、S-アルキル、N-アルキルなどの他の基で置換されている。好ましい実施態様は、2´-メチル及び2´-メトキシエトキシである。全てのこれらの修飾は当技術分野で知られている。
保護オリゴヌクレオチドは、5´及び3´保護基を有するか、又は5´保護基を有して3´保護基を有さないか、又は3´保護基を有して5´保護基を有さない。オリゴヌクレオチドの構造に依存して、2´保護基を有してもよい。
P-結合及び複素環塩基が好適に保護されていることが好ましい。
1種の溶媒で数種の保護オリゴヌクレオチドに対して十分であり得るが、別の実施態様では、例えばCH2Cl2、CHCl3、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ジクロロエタン、テトラクロロエタン、ジオキサン、アセトンから選択される溶媒の混合物を用いるのが好ましい。
本発明では、保護オリゴヌクレオチドの溶液が、少なくとも30℃であるが少なくとも1種の溶媒Aの沸点以下の温度で加熱される。溶媒の混合物が保護オリゴヌクレオチドの溶液に用いられる場合、該溶液が該混合物の全ての成分の沸点以上に加熱されないことが好ましい。
その後、溶媒B、アルコール又はジオールを該溶液に加える。
非常に好ましい溶媒AはCH2Cl2(好ましくは少なくとも90質量%)を含み、非常に好ましい溶媒Bはイソプロパノール(好ましくは少なくとも90質量%)を含む。CH2Cl2及びイソプロパノールの組み合わせは特に有用であり、従って好ましい。
少なくとも1種の溶媒Aにおける保護非イオン性オリゴヌクレオチドの溶液を提供する工程、
前記溶液を溶媒Bと混合して溶媒A+Bを形成する工程、溶媒A及び溶媒Bの量は溶媒A+Bにおける非イオン性保護オリゴヌクレオチドの飽和溶液が得られるように選択される、及び 上澄み液及び残渣の形成まで待つ工程、
を含む方法である。
この溶媒Bは、1〜6個のC-原子を有するアルコール又は2〜6個のC-原子を有するジオールである。
一つの実施態様では、沸点以下5〜10℃の範囲の温度で加熱される。該溶液が濁ったら沸点で1分間加熱し、続いて冷却させる。
ある実施態様では、本発明の方法を繰り返すのが有用である。これらの場合では、第一の精製工程を少なくとも30℃の温度で行うことができ、それに続く精製工程をより低い温度、すなわち20℃又は25℃で行うことができる。その後、該溶液を攪拌下で冷却させる。冷却は、例えば冷蔵庫で室温又はより低い温度まで行うことができる。
本発明の方法では、上澄み液及び残渣が形成される。上澄み液は不純物を含み、除去及び廃棄される。残渣は異なる形態にすることができ、ゲル、オイル又は結晶質形態にすることができる。ある実施態様では、エーテルを残渣に加え、該エーテルを再びさらなる不純物と共に除去するのが有益である。保護オリゴヌクレオチドはエーテルに可溶ではない。
ある場合では、エーテルによるこの処理が、残渣が結晶質又は粉末形態を形成する傾向を増加させる。
本発明の方法は、大規模な合成、すなわち1kgの量に対して約100mgの量から出発する合成に特に好適である。本発明の方法に必要な設備は、大規模なHPLCに比べて安価である。
本発明の方法は、テトラゾール、DCI又はBMTなどの触媒及びPADSなどの硫化剤を除去するのに特に有用である。
1)5'-O-DMTr-CBz-P(S,OCNE)-CBz-3'-O-Lev(10.8mmol)を25mLのジクロロメタン中に溶解し、40℃まで加熱した。120mLの2-プロパノール(1:4.8)を加え、該溶液を55-60℃まで加熱した。2-プロパノールの添加後、該混合物を室温まで冷却して終夜攪拌した。精製した生成物は無色の残渣として単離された。1回の精製後に純度は77.2〜88.0%に増加した。5'-O-TBDMS-CBz-P(S,OCNE)-CBz-3'-O-Levを用いることにより、2回の精製後に純度は78.1%〜94.8%に増加した。
の2-プロパノール(1:3)を加え、該溶液を55-60℃まで加熱した。2-プロパノールの添加後、該混合物を室温まで冷却して終夜攪拌した。精製した生成物は無色の残渣として単離された。3回の精製後に純度は55.3%〜95.3%に増加した。
Claims (19)
- a)溶媒Bの沸点以下の沸点を有する少なくとも1種の溶媒Aにおける保護オリゴヌクレオチドの溶液を提供する工程、
少なくとも30℃且つ少なくとも1種の溶媒Aの沸点以下の温度で該溶液を加熱する工程、 物質の沈降が溶液中で見えるまで溶媒Bを加える工程、前記溶媒Bは1〜6個のC-原子を有するアルコール又は2〜6個のC-原子を有するジオールである、
該溶液を上澄み液及び残渣の形成まで攪拌下で冷却する工程、
該上澄み液を除去する工程、
を含むか、又は
b)溶媒Bを提供する工程、前記溶媒Bは1〜6個のC-原子を有するアルコール又は2〜6個のC-原子を有するジオールである、
30℃以上且つ溶媒Bの沸点以下の温度で溶媒Bを加熱する工程、
物質の沈降が溶液中で見えるまで少なくとも1種の溶媒Aにおける保護オリゴヌクレオチドの溶液を加える工程、
該溶液を上澄み液及び残渣の形成まで攪拌下で冷却する工程、
該上澄み液を除去する工程、
を含む、保護オリゴヌクレオチドを精製するための方法。 - 保護オリゴヌクレオチドが2〜30個のヌクレオチドの長さを有する、請求項1記載の方法。
- 保護オリゴヌクレオチドが、
3´及び5´保護基を有するか、
5´保護基を有し且つ3´保護基を有さないか、又は
3´保護基を有し且つ5´保護基を有さない、
請求項1又は2記載の方法。 - 5´-保護基が、DMTr、MMTr、tert-ブチルジメチルシリル(TBDMS)、レブリニル、ベンゾイル、フルオレンメトキシカルボニル(FMOC)、又は9-フェニルチオキサンテン-9-イル(S-pixyl)である、請求項3記載の方法。
- 溶媒Aが、CH2Cl2、CHCl3、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ジクロロエタン、テトラクロロエタン、ジオキサン、及びアセトンから選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 保護オリゴヌクレオチドの溶液が、CH2Cl2、CHCl3、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ジクロロエタン、テトラクロロエタン、ジオキサン、及びアセトンからなる群から選択される溶媒の混合物を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 保護オリゴヌクレオチド及び溶媒Bを含む溶液を、40〜70℃の温度で加熱する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 溶媒Bが液滴で加えられる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 保護オリゴヌクレオチドの溶液の体積及び溶媒Bの体積間の比が、1:1〜1:100、好ましくは1:1〜1:10である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 残渣が、ゲル、オイル又は結晶質である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- エーテルを該残渣に加え、該エーテルをその後に不純物と一緒に除去する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 該残渣を再溶解させて少なくとも1種の溶媒Aを含む溶液を形成し、請求項1記載の工程を少なくとも一回繰り返す、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- a)溶媒Bを、さらなる加熱をしても物質の沈降が溶液中で見えるまで加えるか、又は
b)溶媒Aにおける保護オリゴヌクレオチドの溶液を、さらなる加熱をしても物質の沈降が溶液中で見えるまで加える、
請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。 - 溶媒Bが、メタノール、エタノール、1,2-ジヒドロキシエタン、1-プロパノール、2-プロパノール、ブタノール及びペンタノールからなる群から選択される、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 溶媒AがCH2Cl2であり、且つ溶媒Bが2-プロパノールである、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- a)少なくとも1種の溶媒Aにおける保護非イオン性オリゴヌクレオチドの溶液を提供する工程;
b)前記溶液を溶媒Bと混合して溶媒A+Bを形成する工程であって、前記溶媒Bは1〜6個のC-原子を有するアルコール又は2〜6個のC-原子を有するジオールであり、
保護非イオン性オリゴヌクレオチドの25℃における溶解度(質量/体積)が、溶媒Aにおけるよりも溶媒Bにおける方が高く、且つ
溶媒A及び溶媒Bの量が、溶媒A+Bにおいて非イオン性保護オリゴヌクレオチドの飽和溶液が得られるように選択される、工程;
c)上澄み液及び残渣の形成まで待つ工程;
d)該上澄み液を除去する工程、
を含む、保護非イオン性オリゴヌクレオチドを精製するための方法。 - 溶媒Aが、CH2Cl2、CHCl3、テトラヒドロフラン及びジオキサンから選択される、請求項16記載の方法。
- 溶媒Bが、イソプロパノール、1-プロパノール又はエタノールから選択される、請求項16又は17記載の方法。
- 溶液A+Bを少なくとも10℃に冷却し、上澄み液及び残渣の形成を強める、請求項16〜18のいずれか1項に記載の方法。
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