JP2013128492A - オリゴヌクレオチドの精製 - Google Patents

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Abstract

【課題】大規模な合成のためのオリゴヌクレオチド及び中間体のための効率的な精製方法を提供する。
【解決手段】a)溶媒Bの沸点以下の沸点を有する少なくとも1種の溶媒Aにおける保護オリゴヌクレオチドの溶液を提供する工程、少なくとも30℃且つ少なくとも1種の溶媒Aの沸点以下の温度で該溶液を加熱する工程、物質の沈降が溶液中で見えるまで溶媒Bを加える工程、前記溶媒Bは1〜6個のC-原子を有するアルコール又は2〜6個のC-原子を有するジオールである、該溶液を上澄み液及び残渣の形成まで攪拌下で冷却する工程、該上澄み液を除去する工程を含むか、又はb)溶媒Bを提供する工程、前記溶媒Bは1〜6個のC-原子を有するアルコール又は2〜6個のC-原子を有するジオールである、30℃以上且つ溶媒Bの沸点以下の温度で溶媒Bを加熱する工程、物質の沈降が溶液中で見えるまで少なくとも1種の溶媒Aにおける保護オリゴヌクレオチドの溶液を加える工程、該溶液を上澄み液及び残渣の形成まで攪拌下で冷却する工程、該上澄み液を除去する工程を含む、保護オリゴヌクレオチドを精製するための方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、オリゴヌクレオチドを精製するための方法に関する。
オリゴヌクレオチドの合成は、長期間に渡って集中的な研究の主題である。自動化された合成手順が開発され、該自動化合成のための装置が市場で入手可能である。これらの手順の大部分は、どちらかと言えば小量のオリゴヌクレオチド(mgの範囲)のために開発された。これらの量は、大部分の研究目的には十分である。
特にアンチセンス療法の発展により、大規模な合成がかなりの重要事項となった。比較的大規模な合成手順が開発されているが、1つの主要な欠点は中間体及び生成物の精製である。小規模な合成では、逆-相HPLCが、短時間におけるmg量の精製を良好な精製結果で可能にする適切な方法である。大規模な生産では、逆-相HPLCが、大量の溶媒、高価な装置などを必要とする困難な手順となる。
オリゴヌクレオチド合成の生成物を精製するための改善方法が継続して必要とされている。
米国特許出願公開第2003/0055241号明細書は、オリゴヌクレオチドの溶液を凝集化剤及び沈降賦活剤で処理することを含む精製オリゴヌクレオチドを調製するための方法を開示している。該方法は、非保護オリゴヌクレオチド又は5´保護オリゴヌクレオチドの精製に用いられる。該沈降賦活剤が該分子と相互作用をするためのイオン形態が必要とされる。
欧州特許出願公開第0512768A1号明細書は、DNAを精製するための方法を開示している。該DNAは天然源から調製される。
上記の両方法は、非保護又はほぼ完全に非保護のオリゴヌクレオチドにのみ用いることができる。合成中にオリゴヌクレオチドは保護されるので、米国特許出願公開第2003/0055241号明細書及び欧州特許出願公開第0512768A1号明細書の方法を適用することができない。
本発明の目的は、先行技術の欠点を克服すること、及び特に大規模な合成のためのオリゴヌクレオチド及び中間体のための効率的な精製方法を提供することである。
一つの実施態様では、本発明は、
溶媒Bの沸点以下の沸点を有する少なくとも1種の溶媒Aにおける保護オリゴヌクレオチドの溶液を提供する工程、
少なくとも30℃且つ少なくとも溶媒Aの沸点以下の温度で該溶液を加熱する工程、
該溶液が濁るまで溶媒Bを加える工程、前記溶媒Bは1〜6個のC-原子を有するアルコール又は2〜6個のC-原子を有するジオールである、
該溶液を上澄み液及び残渣の形成まで攪拌下で冷却する工程、
該上澄み液を除去する工程、
を含む保護オリゴヌクレオチドを精製するための方法を提供する。
さらなる実施態様では、本発明は、
溶媒Bを提供する工程、前記溶媒Bは1〜6個のC-原子を有するアルコール又は2〜6個のC-原子を有するジオールである、
30℃以上且つ溶媒Bの沸点以下の温度で溶媒Bを加熱する工程、
該溶液が濁るまで少なくとも1種の溶媒Aにおける保護オリゴヌクレオチドの溶液を加える工程、
該溶液を上澄み液及び残渣の形成まで攪拌下で冷却する工程、
該上澄み液を除去する工程、
を含む保護オリゴヌクレオチドを精製するための方法を提供する。
“濁る”とは、該溶液が飽和しており、例えば該保護オリゴヌクレオチドを溶解することができないことを描写する知見である。物質の沈降が見えると溶液は濁る。
“冷却する”とは、該溶液の温度を減少させることを意味する。典型的な冷却は室温(約25℃)に達するまで行われる。ある場合には、さらなる冷却、すなわち少なくとも20℃又は少なくとも10℃又は0℃に達することが好ましい。
“保護オリゴヌクレオチド”とは、例えば糖部分の基の5´、3´、2´位及び/又は複素環塩基及び/又はP-結合(例えばリン酸塩又はチオリン酸塩)に1種以上の保護基を含むオリゴヌクレオチドである。
“保護基”という用語は、オリゴヌクレオチドの使用前に除去されない基、例えばオリゴヌクレオチドの安定性を増加させるのに用いられる修飾を含む。
2'-ヒドロキシル-基に好適な保護は、限定はしないが、tert-ブチルジメチルシリル(TBDMS)、トリイソプロピルシリルオキシメチル(TOM)、フルオロフェニルメトキシピペリジニル(FPMP)、及びCH2-O-Et、及び2´F又は2´MeOのような開裂不可能な修飾を含む。
3'-ヒドロキシル-基に好適な保護基は、限定はしないが、tert-ブチルジメチルシリル(TBDMS)、レブリニル、ベンゾイルを含む。
好適な修飾はLNA(2´O-4´C-メチレン架橋)を含む。
好適な保護核酸塩基は当業者に公知であり、例えばN-4-ベンゾイルシトシン、N-6-ベンゾイルアデニン、N-2-イソブチリルグアニン、N-4-アセチル又はイソブチリルシトシン、N-6-フェノキシアセチルアデニン、N-2-tert-ブチルフェノキシアセチルグアニンである。好適な非塩基性残基はまた、リンカーとして用いることができる1´,2´-ジデオキシリボース(Glen ResearchからのdSpacer)を導くか、又はオリゴヌクレオチドにおける塩基性部位を模倣する水素(H)を含む(Takeshita et al., J. Biol. Chem., 1987, 262, 10171)。
好適な5'-保護基は、限定はしないが、トリチル基、好ましくはジメトキシトリチル基(DMTr)又はモノメトキシトリチル基(MMTr)を含む。これらの保護基は、従来の先行技術である固相オリゴヌクレオチド合成に用いられる。他の好適な5'-保護基は、限定はしないが、tert-ブチルジメチルシリル(TBDMS)、レブリニル、ベンゾイル、フルオレンメトキシカルボニル(FMOC)、9-フェニルチオキサンテン-9-イル(S-pixyl)を含む。
好ましい実施態様では、保護オリゴヌクレオチドが非-イオン性化合物である。
“オリゴヌクレオチド”は、複素環塩基に結合されている糖ユニットを含む単量体ユニットのオリゴマーであり、前記単量体ユニットは結合を介して連結されている。典型的な結合は燐光物質の誘導体であり、例えばリン酸塩、チオリン酸塩又はそれらの誘導体である。該用語はまた、RNA及びDNAの形態のオリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、修飾オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドミメティックなどを含む。一般的に、これらの化合物は結合されている単量体サブユニットのバックボーンを含み、各結合単量体サブユニットは、複素環塩基部分に直接的又は間接的に付着している。単量体サブユニットを連結する結合、単量体サブユニット及び複素環塩基部分は、得られる化合物のための多くの誘引を生じる構造で変化することができる。
本発明の好ましい実施態様では、保護オリゴヌクレオチドが、2〜30個、好ましくは2〜9個、好ましくは2〜6個のヌクレオチドの長さを有する。
当技術分野で公知の修飾は、複素環塩基、糖又は単量体サブユニットを連結する結合の修飾である。ヌクレオチド間結合の変形は、例えば参照のために組み込まれるWO 2004/011474の11頁の下部から記載されている。
典型的な誘導体は、ホスホチオエート、ホスホロジチオエート、メチル及びアルキルホスホネート及びホスホノアセト誘導体である。
さらなる典型的な修飾は糖部分である。リボースは異なる糖で置換されているか、又は1つ以上の位置がF、O-アルキル、S-アルキル、N-アルキルなどの他の基で置換されている。好ましい実施態様は、2´-メチル及び2´-メトキシエトキシである。全てのこれらの修飾は当技術分野で知られている。
複素環塩基部分に関しては当技術分野で用いられている多くの他の合成塩基があり、例えば5-メチル-シトシン、5-ヒドロキシ-メチル-シトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6-又は2-アルキル誘導体、2-チオウラシルである。そのような修飾は、WO 2004/011474の21頁からにも記載されている。
保護オリゴヌクレオチドは、5´及び3´保護基を有するか、又は5´保護基を有して3´保護基を有さないか、又は3´保護基を有して5´保護基を有さない。オリゴヌクレオチドの構造に依存して、2´保護基を有してもよい。
P-結合及び複素環塩基が好適に保護されていることが好ましい。
一つの実施態様では、保護オリゴヌクレオチドを溶媒又は1種が溶媒Aである溶媒混合物に溶解する。好適な溶媒Aは、例えばCH2Cl2、CHCl3、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ジクロロエタン、テトラクロロエタン、ジオキサン、アセトンである。
1種の溶媒で数種の保護オリゴヌクレオチドに対して十分であり得るが、別の実施態様では、例えばCH2Cl2、CHCl3、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ジクロロエタン、テトラクロロエタン、ジオキサン、アセトンから選択される溶媒の混合物を用いるのが好ましい。
本発明では、保護オリゴヌクレオチドの溶液が、少なくとも30℃であるが少なくとも1種の溶媒Aの沸点以下の温度で加熱される。溶媒の混合物が保護オリゴヌクレオチドの溶液に用いられる場合、該溶液が該混合物の全ての成分の沸点以上に加熱されないことが好ましい。
その後、溶媒B、アルコール又はジオールを該溶液に加える。
溶媒Aが溶媒Bの沸点以下の沸点を有することが好ましいが、良好な結果は類似の沸点を有する溶媒A及びBでも、又は溶媒Aの沸点が溶媒Bの沸点よりも高い状況でも達成することができる。
非常に好ましい溶媒AはCH2Cl2(好ましくは少なくとも90質量%)を含み、非常に好ましい溶媒Bはイソプロパノール(好ましくは少なくとも90質量%)を含む。CH2Cl2及びイソプロパノールの組み合わせは特に有用であり、従って好ましい。
本発明のさらなる実施態様は、
少なくとも1種の溶媒Aにおける保護非イオン性オリゴヌクレオチドの溶液を提供する工程、
前記溶液を溶媒Bと混合して溶媒A+Bを形成する工程、溶媒A及び溶媒Bの量は溶媒A+Bにおける非イオン性保護オリゴヌクレオチドの飽和溶液が得られるように選択される、及び 上澄み液及び残渣の形成まで待つ工程、
を含む方法である。
この溶媒Bは、1〜6個のC-原子を有するアルコール又は2〜6個のC-原子を有するジオールである。
必要量は正確に知られていないが、溶媒Bを液滴で加えるのが好ましい。溶媒Bの添加により該溶液は濁るが、ほとんどの場合に、該溶液はさらなる攪拌及び/又は加熱により再び透明になる。溶媒Bの沸点は溶媒Aの沸点よりも高いため、該溶液の温度はさらなる加熱により増加する。溶媒Bの好ましい量は、該溶液を濁ったままにするのに加えられる必要のある量又はより少ない量の溶媒Bである。
一つの実施態様では、沸点以下5〜10℃の範囲の温度で加熱される。該溶液が濁ったら沸点で1分間加熱し、続いて冷却させる。
該溶液の加熱は、不純物が多い場合、すなわちオリゴヌクレオチドの純度が85%以下の場合に特に好ましい。この場合、該加熱は精製効率を増加させる。純度がさらに高い場合(すなわち、少なくとも約90%)又は精製効率の減少が許容される場合、本発明の方法は約25〜30℃の温度又は15〜25℃の温度でも行うことができる。精製は低い温度では効率が下がる。
ある実施態様では、本発明の方法を繰り返すのが有用である。これらの場合では、第一の精製工程を少なくとも30℃の温度で行うことができ、それに続く精製工程をより低い温度、すなわち20℃又は25℃で行うことができる。その後、該溶液を攪拌下で冷却させる。冷却は、例えば冷蔵庫で室温又はより低い温度まで行うことができる。
これらの溶液を冷却中に攪拌するのが好ましい。好ましい実施態様では、攪拌は、少なくとも3時間、好ましくは6時間及び最も好ましくは終夜続ける。
本発明の方法では、上澄み液及び残渣が形成される。上澄み液は不純物を含み、除去及び廃棄される。残渣は異なる形態にすることができ、ゲル、オイル又は結晶質形態にすることができる。ある実施態様では、エーテルを残渣に加え、該エーテルを再びさらなる不純物と共に除去するのが有益である。保護オリゴヌクレオチドはエーテルに可溶ではない。
ある場合では、エーテルによるこの処理が、残渣が結晶質又は粉末形態を形成する傾向を増加させる。
好ましい実施態様では、精製処理が少なくとも一回繰り返される。溶媒又は溶媒タイプAの溶媒混合物を加え、オリゴヌクレオチドを再溶解する。その後、本発明の精製方法を繰り返す。
本発明の方法は、大規模な合成、すなわち1kgの量に対して約100mgの量から出発する合成に特に好適である。本発明の方法に必要な設備は、大規模なHPLCに比べて安価である。
本発明の方法は、テトラゾール、DCI又はBMTなどの触媒及びPADSなどの硫化剤を除去するのに特に有用である。
本発明は、以下の非限定例を参照してさらに説明される:
1)5'-O-DMTr-CBz-P(S,OCNE)-CBz-3'-O-Lev(10.8mmol)を25mLのジクロロメタン中に溶解し、40℃まで加熱した。120mLの2-プロパノール(1:4.8)を加え、該溶液を55-60℃まで加熱した。2-プロパノールの添加後、該混合物を室温まで冷却して終夜攪拌した。精製した生成物は無色の残渣として単離された。1回の精製後に純度は77.2〜88.0%に増加した。5'-O-TBDMS-CBz-P(S,OCNE)-CBz-3'-O-Levを用いることにより、2回の精製後に純度は78.1%〜94.8%に増加した。
2)5'-O-DMTr-ABz-P(S,OCNE)-GiBu-3'-O-Lev(15mmol)を50mLのジクロロメタン中に溶解し、40℃まで加熱した。450mLの2-プロパノール(1:9)を加え、該溶液を50-55℃まで加熱した。2-プロパノールの添加後、該混合物を室温まで冷却して終夜攪拌した。精製した生成物は無色の残渣として単離された。2回の精製後に純度は50.8〜79.5%に増加した。
3)5'-O-DMTr-ABz-P(S,OCNE)-GiBu-3'-OH(1.63mmol)を20mLのジクロロメタン中に溶解し、40℃まで加熱した。400mLの2-プロパノール(1:20)を加え、該溶液を50-55℃まで加熱した。2-プロパノールの添加後、該混合物を室温まで冷却して終夜攪拌した。精製した生成物は無色の残渣として単離された。2回の精製後に純度は79.5〜93.2%に増加した。
4)5'-O-DMTr-CBz-P(S,OCNE)-GiBu-3'-O-Lev(7.58mmol)を12mLのジクロロメタン中に溶解し、40℃まで加熱した。130mLの2-プロパノール(1:10.8)を加え、該溶液を50-55℃まで加熱した。2-プロパノールの添加後、該混合物を室温まで冷却して終夜攪拌した。精製した生成物は無色の残渣として単離された。2回の精製後に純度は62.5〜88.7%に増加した。
5)5'-O-DMTr-CBz-P(S,OCNE)-GiBu-3'-OH(2.0mmol)を10mLのジクロロメタン中に溶解し、40℃まで加熱した。70mLの2-プロパノール(1:4.8)を加え、該溶液を50-55℃まで加熱した。2-プロパノールの添加後、該混合物を室温まで冷却して終夜攪拌した。精製した生成物は無色の残渣として単離された。2回の精製後に純度は88.2〜95.5%に増加した。
6)5'-O-DMTr-T-P(S,OCNE)-GiBu-3'-O-Lev(10.2mmol)を30mLのジクロロメタン中に溶解し、40℃まで加熱した。450mLの2-プロパノール(1:15)を加え、該溶液を50-55℃まで加熱した。2-プロパノールの添加後、該混合物を室温まで冷却して終夜攪拌した。精製した生成物は無色の残渣として単離された。1回の精製後に純度は68.0〜96.2%に増加した。
7)5'-O-DMTr-T-P(S,OCNE)-CBz-P(S,OCNE)-CBz-P(S,OCNE)-CBz-3'-O-Lev(1.41mmol)を15mLのジクロロメタン中に溶解し、40℃まで加熱した。50mLの2-プロパノール(1:3.3)を加え、該溶液を50-55℃まで加熱した。2-プロパノールの添加後、該混合物を室温まで冷却して終夜攪拌した。精製した生成物は無色の残渣として単離された。2回の精製後に純度は68.0〜89.6%に増加した。
8)5'-O-H-T-P(S,OCNE)-CBz-P(S,OCNE)-CBz-P(S,OCNE)-CBz-3'-O-Lev(0.33mmol)を5mLのジクロロメタン中に溶解し、40℃まで加熱した。11mLの2-プロパノール(1:2.2)を加え、該溶液を50-55℃まで加熱した。2-プロパノールの添加後、該混合物を室温まで冷却して終夜攪拌した。精製した生成物は無色の残渣として単離された。2回の精製後に純度は59.2〜83.7%に増加した。
9)5'-O-DMTr-T-P(S,OCNE)-CBz-P(S,OCNE)-T-P(S,OCNE)-CBz-P(S,OCNE)-CBz-P(S,OCNE)-CBz-3'-O-Lev(0.26mmol)を5mLのジクロロメタン中に溶解し、40℃まで加熱した。11mLの2-プロパノール(1:2.2)を加え、該溶液を50-55℃まで加熱した。2-プロパノールの添加後、該混合物を室温まで冷却して終夜攪拌した。精製した生成物は無色の残渣として単離された。3回の精製後に純度は57.6〜94.3%に増加した。
10)5'-O-DMTr-T-P(S,OCNE)-CBz-P(S,OCNE)-T-P(S,OCNE)-CBz-P(S,OCNE)-CBz-P(S,OCNE)-CBz-3'-OH(0.22mmol)を10mLのジクロロメタン中に溶解し、40℃まで加熱した。30mLの2-プロパノール(1:3)を加え、該溶液を50-55℃まで加熱した。2-プロパノールの添加後、該混合物を室温まで冷却して終夜攪拌した。精製した生成物は無色の残渣として単離された。1回の精製後に純度は90.1〜95.2%に増加した。
11)5'-O-DMTr-CBz-P(S,OCNE)-GiBu-P(S,OCNE)-T-P(S,OCNE)-GiBu-3'-O-Lev(0.74mmol)を10mLのジクロロメタン中に溶解し、40℃まで加熱した。60mLの2-プロパノール(1:6)を加え、該溶液を55-60℃まで加熱した。2-プロパノールの添加後、該混合物を室温まで冷却して終夜攪拌した。精製した生成物は無色の残渣として単離された。2回の精製後に純度は47.6〜80.6%に増加した。
12)5'-OH-CBz-P(S,OCNE)-GiBu-P(S,OCNE)-T-P(S,OCNE)-GiBu-3'-O-Lev(0.23mmol)を20mLのジクロロメタン中に溶解し、40℃まで加熱した。100mLの2-プロパノール(1:5)を加え、該溶液を55-60℃まで加熱した。2-プロパノールの添加後、該混合物を室温まで冷却して終夜攪拌した。精製した生成物は無色の残渣として単離された。2回の精製後に純度は70.2〜85.2%に増加した。
13)5'-O-DMTr-ABz-P(S,OCNE)-GiBu-P(S,OCNE)-CBz-P(S,OCNE)-GiBu-P(S,OCNE)-T-P(S,OCNE)-GiBu-3'-O-Lev(0.2mmol)を10mLのジクロロメタン中に溶解し、40℃まで加熱した。45mLの2-プロパノール(1:4.5)を加え、該溶液を50-55℃まで加熱した。2-プロパノールの添加後、該混合物を室温まで冷却して終夜攪拌した。精製した生成物は無色の残渣として単離された。2回の精製後に純度は45.2〜77.9%に増加した。
14)5'-O-DMTr-ABz-P(S,OCNE)-GiBu-P(S,OCNE)-CBz-P(S,OCNE)-GiBu-P(S,OCNE)-T-P(S,OCNE)-GiBu-3'-OH(0.1mmol)を5mLのジクロロメタン中に溶解し、40℃まで加熱した。8mLの2-プロパノール(1:1.6)を加え、該溶液を50-55℃まで加熱した。2-プロパノールの添加後、該混合物を室温まで冷却して終夜攪拌した。精製した生成物は無色の残渣として単離された。3回の精製後に純度は72.2〜88.4%に増加した。
15)5'-OH-CBz-P(S,OCNE)-CBz-P(S,OCNE)-ABz-P(S,OCNE)-T-3'-O-Lev(0.72mmol)を25mLのジクロロメタン中に溶解し、40℃まで加熱した。120mLの2-プロパノール(1:4.8)を加え、該溶液を55-60℃まで加熱した。2-プロパノールの添加後、該混合物を室温まで冷却して終夜攪拌した。精製した生成物は無色の残渣として単離された。2回の精製後に純度は75.3%〜92.1%に増加した。
16)5'-O-H-CBz-P(S,OCNE)-GiBu-P(S,OCNE)-CBz-P(S,OCNE)-CBz-P(S,OCNE)-ABz-P(S,OCNE)-T-3'-O-Lev(0.69mmol)を100mLのジクロロメタン中に溶解し、40℃まで加熱した。300mL
の2-プロパノール(1:3)を加え、該溶液を55-60℃まで加熱した。2-プロパノールの添加後、該混合物を室温まで冷却して終夜攪拌した。精製した生成物は無色の残渣として単離された。3回の精製後に純度は55.3%〜95.3%に増加した。
17)5'-O-DMTr-CBz-P(S,OCNE)-ABz-P(S,OCNE)-T-3'-O-Lev(6.0mmol)を25mLのジクロロメタン及び1mLのメタノール中に溶解し、40℃まで加熱した。120mLの2-プロパノール(1:4.8)を加え、該溶液を50-55℃まで加熱した。2-プロパノールの添加後、該混合物を室温まで冷却して終夜攪拌した。精製した生成物は無色の残渣として単離された。2回の精製後に純度は66.2%〜91.8%に増加した。
18)5'-O-DMTr-T-P(O,OCNE)-CBz-3'-OH(15.1mmol)を20℃で50mLのジクロロメタン中に溶解した。700mLの2-プロパノール(1:14)を加え、該溶液を30℃で攪拌した。2-プロパノールの添加後、該混合物を室温まで冷却して終夜攪拌した。精製した生成物は無色の残渣として単離された。2回の精製後に純度は79.2%〜91.3%に増加した。
19)5'-O-DMTr-GiBu-P(O,OCNE)-T-P(O,OCNE)-T-P(O,OCNE)-GiBu-3'-O-Lev(0.76mmol)を20℃で10mLのジクロロメタン及び1mLのメタノール中に溶解した。30mLの2-プロパノール(1:3)を加え、該溶液を30℃で攪拌した。2-プロパノールの添加後、該混合物を室温まで冷却して終夜攪拌した。精製した生成物は無色の残渣として単離された。1回の精製後に純度は79.2%〜91.3%に増加した。
20)5'-O-DMTr-T-P(O,OCNE)-CBz-P(O,OCNE)-GiBu-P(O,OCNE)-T-P(O,OCNE)-T-P(O,OCNE)-GiBu-3'-O-Lev(0.38mmol)を20℃で10mLのジクロロメタン及び1mLのメタノール中に溶解した。50mLの2-プロパノール(1:5)を加え、該溶液を30℃で攪拌した。2-プロパノールの添加後、該混合物を室温まで冷却して終夜攪拌した。精製した生成物は無色の残渣として単離された。1回の精製後に純度は50.8%〜70.3%に増加した。

Claims (19)

  1. a)溶媒Bの沸点以下の沸点を有する少なくとも1種の溶媒Aにおける保護オリゴヌクレオチドの溶液を提供する工程、
    少なくとも30℃且つ少なくとも1種の溶媒Aの沸点以下の温度で該溶液を加熱する工程、 物質の沈降が溶液中で見えるまで溶媒Bを加える工程、前記溶媒Bは1〜6個のC-原子を有するアルコール又は2〜6個のC-原子を有するジオールである、
    該溶液を上澄み液及び残渣の形成まで攪拌下で冷却する工程、
    該上澄み液を除去する工程、
    を含むか、又は
    b)溶媒Bを提供する工程、前記溶媒Bは1〜6個のC-原子を有するアルコール又は2〜6個のC-原子を有するジオールである、
    30℃以上且つ溶媒Bの沸点以下の温度で溶媒Bを加熱する工程、
    物質の沈降が溶液中で見えるまで少なくとも1種の溶媒Aにおける保護オリゴヌクレオチドの溶液を加える工程、
    該溶液を上澄み液及び残渣の形成まで攪拌下で冷却する工程、
    該上澄み液を除去する工程、
    を含む、保護オリゴヌクレオチドを精製するための方法。
  2. 保護オリゴヌクレオチドが2〜30個のヌクレオチドの長さを有する、請求項１記載の方法。
  3. 保護オリゴヌクレオチドが、
    3´及び5´保護基を有するか、
    5´保護基を有し且つ3´保護基を有さないか、又は
    3´保護基を有し且つ5´保護基を有さない、
    請求項１又は２記載の方法。
  4. 5´-保護基が、DMTr、MMTr、tert-ブチルジメチルシリル(TBDMS)、レブリニル、ベンゾイル、フルオレンメトキシカルボニル(FMOC)、又は9-フェニルチオキサンテン-9-イル(S-pixyl)である、請求項３記載の方法。
  5. 溶媒Aが、CH2Cl2、CHCl3、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ジクロロエタン、テトラクロロエタン、ジオキサン、及びアセトンから選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 保護オリゴヌクレオチドの溶液が、CH2Cl2、CHCl3、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ジクロロエタン、テトラクロロエタン、ジオキサン、及びアセトンからなる群から選択される溶媒の混合物を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 保護オリゴヌクレオチド及び溶媒Bを含む溶液を、40〜70℃の温度で加熱する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 溶媒Bが液滴で加えられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 保護オリゴヌクレオチドの溶液の体積及び溶媒Bの体積間の比が、1:1〜1:100、好ましくは1:1〜1:10である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 残渣が、ゲル、オイル又は結晶質である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. エーテルを該残渣に加え、該エーテルをその後に不純物と一緒に除去する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 該残渣を再溶解させて少なくとも1種の溶媒Aを含む溶液を形成し、請求項１記載の工程を少なくとも一回繰り返す、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. a)溶媒Bを、さらなる加熱をしても物質の沈降が溶液中で見えるまで加えるか、又は
    b)溶媒Aにおける保護オリゴヌクレオチドの溶液を、さらなる加熱をしても物質の沈降が溶液中で見えるまで加える、
    請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 溶媒Bが、メタノール、エタノール、1,2-ジヒドロキシエタン、1-プロパノール、2-プロパノール、ブタノール及びペンタノールからなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 溶媒AがCH2Cl2であり、且つ溶媒Bが2-プロパノールである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. a)少なくとも1種の溶媒Aにおける保護非イオン性オリゴヌクレオチドの溶液を提供する工程;
    b)前記溶液を溶媒Bと混合して溶媒A+Bを形成する工程であって、前記溶媒Bは1〜6個のC-原子を有するアルコール又は2〜6個のC-原子を有するジオールであり、
    保護非イオン性オリゴヌクレオチドの25℃における溶解度(質量/体積)が、溶媒Aにおけるよりも溶媒Bにおける方が高く、且つ
    溶媒A及び溶媒Bの量が、溶媒A+Bにおいて非イオン性保護オリゴヌクレオチドの飽和溶液が得られるように選択される、工程;
    c)上澄み液及び残渣の形成まで待つ工程;
    d)該上澄み液を除去する工程、
    を含む、保護非イオン性オリゴヌクレオチドを精製するための方法。
  17. 溶媒Aが、CH2Cl2、CHCl3、テトラヒドロフラン及びジオキサンから選択される、請求項１６記載の方法。
  18. 溶媒Bが、イソプロパノール、1-プロパノール又はエタノールから選択される、請求項１６又は１７記載の方法。
  19. 溶液A+Bを少なくとも10℃に冷却し、上澄み液及び残渣の形成を強める、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
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