WO2006030906A1 - ヌクレオシド類似体またはその塩 - Google Patents

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WO2006030906A1
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Yukio Kitade
Yoshihito Ueno
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Gifu University
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    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a nucleoside analog or a salt thereof.
  • RNAi RNA interference
  • Dicer RNA interference
  • the siRNA forms an RNAZ mRNA double-stranded nucleic acid with the target mRNA, recognizes the double-stranded nucleic acid (called an RNA-induced silencing complex (RISC)), the double-stranded nucleic acid and Are bound, and the target mRNA is cleaved by this conjugate.
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • the method using RNA i the same effect is obtained in many cases using RNA having a concentration of about 1Z100 as compared with the antisense method. Therefore, the method using RNAi Expectations are rising as one of the effective treatment methods for diseases and genetic diseases caused by various viruses that have been considered difficult to cure.
  • Oligonucleotide analogs containing a ribose ring contained in natural oligonucleotides are extremely unstable chemically and biologically for use in antisense methods, RNAi-based methods, etc. (For example, see Non-Patent Document 1).
  • the ability to form double strands with natural oligonucleotides is also required, but chemically and biologically stable oligonucleotide analogues are required.
  • This ability to form a double strand is low (see, for example, Non-Patent Document 2).
  • Non-patent literature 2 Jin yan Tang, Jamal Temsamani and Sudhir Agrawal, “Self-stabilized antisense oligonucleotide phosphorothioates: properties and anti—HIV ac tivity”, Nucleic Acids Research, 1993, 21st, p.2729.
  • the present invention includes a nucleoside analog and its nucleoside analog that make it possible to produce an oligonucleotide analog that has two characteristics of chemical, biological stability and duplex-forming ability.
  • the purpose is to provide oligonucleotide analogues.
  • the present invention is a nucleoside analog represented by the following formula (I) or a salt thereof.
  • R 1 is a group of the following formula (1), a group of the following formula (1), the functional group of which is protected with a protecting group, or a group of the following formula (2)
  • the functional group is protected by a protective group
  • the group of the following formula (3) the functional group is protected by a protective group.
  • R 4 is H or an activated phosphate group for solid phase synthesis
  • k, 1, m and n are each independently an integer of 1 to 10.
  • FIG. 1 is a diagram showing the nuclease resistance of an example of the oligonucleotide analogue of the present invention and an example of the oligonucleotide of the comparative example.
  • Lane 1 Natural type 0 min
  • Lane 2 Natural type 5 min
  • Lane 3 Natural type 10 min
  • Lane 4 Natural type 15 min
  • Lane 5 Natural type 30 min
  • Lane 6 Modified type 0 min
  • Lane 7 Modified type 5 min
  • Lane 8 Modified type 10 rain
  • Lane 9 Modified type 15 min
  • Lane 10 Modified type 30 min.
  • the protecting group whose functional group is protected is selected from protecting groups known in nucleic acid chemistry.
  • protecting groups known in nucleic acid chemistry.
  • benzoyl (Bz), isoptyryl (iBu), phenoxyacetyl (Pac), aryloxycarbonyl (AOC), N, N-dimethylaminomethylene, acetyl (Ac) and the like can be used as the protecting group.
  • the protective group for R 2 and R 3 a conventionally known primary alcohol protective group can be used.
  • protecting groups include 4,4′-dimethoxytrityl (DMTr), tert-butyldimethylsilinole (TBDMS), 4-monomethoxytrityl (MMTr), tert-butyldiphenylsilinole (TBDPS), (9-phenyl) xanthene-9-yl [pixyl] isotropic force.
  • the protecting group for R 2 and the above, using the nucleoside analog of the present invention, in consideration of the conditions for finally producing an oligonucleotide analog can be selected appropriately.
  • producing the oligonucleotide analogue for example, producing the oligonucleotide analogue
  • nucleoside analog in which R ⁇ R 2 and ⁇ 3 are appropriately selected according to the final removal conditions of the protecting group may be used.
  • the activated phosphate group for solid phase synthesis includes solid phase synthesis.
  • phosphate groups can be used in the synthesis, and examples thereof include phosphate groups that form phosphoramidites, phosphates, thiophosphites, and the like.
  • Examples of the activated phosphate group for solid phase synthesis that forms phosphoramidite include a group represented by the following formula (10).
  • examples of the salt include a salt with an inorganic base, a salt with an organic base, a salt with an inorganic acid, a salt with an organic acid, and the like.
  • examples of salts with inorganic bases include, for example, alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts; alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts; and aluminum salts and ammonium salts.
  • Examples of salts with organic bases include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine, N, N, -dibenzylethylenediamine. Of the salt.
  • salts with inorganic acids include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
  • salts with organic acids include formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citrate, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p
  • salts with toluenesulfonic acid is preferably a pharmaceutically acceptable salt.
  • k, 1, m and n are each independently an integer of 1 to 10, and preferably an integer of 1 to 6. k, 1, m and n may be the same or different.
  • R 2 is H, 4, 4,
  • DMTr dimethoxytrityl
  • TDMS tert-butyldimethylsilyl
  • MMTr 4 monomethoxytrityl
  • TDPS tert butyldiphenylsilyl
  • R 3 is H, 4, 4, -dimethoxytrityl (DMTr), tert-butyldimethylsilyl (TBDM S), 4 monomethoxytrityl (MMTr), tert butyldiphenylsilyl (TBDPS) or Is (9-fuel) xanthene-9-il,
  • R 4 is preferably H or a group represented by the following formula (10):
  • R 1 is a group of the formula (1), the formula (2) A group of formula (3), a group of formula (4), a group of formula (5), a group of formula (6), a group of formula (7) and a group of formula (8)
  • any group selected from the group consisting of k, 1, m and n is 1.
  • nucleoside analog represented by the formula (I) of the present invention or a salt thereof,
  • R 1 is a group of the formula (7), the functional group of which is protected with benzoyl, R 2 is 4,4′-dimethoxytrityl (DMTr), and R 3 is tert-butyldiphenylsilyl. (T BDPS) and R 4 is a group represented by the following formula (10): Sid analogues are more preferred
  • nucleoside analog of the present invention or a salt thereof is not limited to the production of the oligonucleotide analog of the present invention, and can be applied to other uses.
  • the oligonucleotide analogue of the present invention is an oligonucleotide analogue in which one or more nucleosides constituting the oligonucleotide are each replaced by a nucleoside analogue, wherein the nucleoside analogue is represented by the formula In (I), R 1 is a group of the formula (1), a group of the formula (2), a group of the formula (3), a group of the formula (4), a group of the formula (5), The group of the formula (6), the group of the formula (7) and the group force which is the basic force of the formula (8) are also selected!
  • R 51 and R 52 are independently of each other a group of the formula (1), a group of the formula (2), a group of the formula (3), or a group of the formula (4).
  • the group of the formula (5), the group of the formula (6), the group of the formula (7) and the group force of the formula (8) are any group selected, kl, k2, 11, 12, ml, m2, nl and n2 are each independently an integer of 1 to 10.
  • the oligonucleotide analogue of the present invention may be a single-stranded oligonucleotide, a double-stranded oligonucleotide or the like. Oligonucleotide analogue force One or more nucleosides constituting one or both of the single-stranded oligonucleotides in the single-stranded oligonucleotide are represented by the formula (I), wherein R 1 is a group of the formula (1), or a group of the formula (2).
  • a group of the formula (3), a group of the formula (4), a group of the formula (5), a group of the formula (6), a group of the formula (7) and a group of the formula (8) Force group power may be any group selected and may be a nucleoside analog where R 2 , R 3 and R 4 are H! /.
  • the oligonucleotide analogue of the present invention preferably has the ability to form double strands. This is because the oligonucleotide analog of the present invention can be used for antisense, gene detection, etc. if it has the ability to form a double strand with the natural oligonucleotide.
  • the oligonucleotide analogue of the present invention is preferably nuclease resistant.
  • the ability of the oligonucleotide analogue of the present invention to prevent degradation by a nuclease when incorporated into cells, and as a result, the activity of the oligonucleotide analogue in cells can be maintained. Power is also.
  • the gene expression inhibitor of the present invention includes the oligonucleotide analog of the present invention.
  • a gene expression inhibitor acts as an oligonucleotide analog, for example, siRNA or antisense, and cleaves the target gene mRNA or forms a double strand with the target gene mRNA. Expression can be suppressed.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is for treating a disease associated with gene expression, and comprises the gene expression inhibitor.
  • a disease associated with gene expression for example, a disease is caused by the expression of a protein
  • this pharmaceutical composition can be used to suppress the gene expression and treat the disease associated with the gene expression. It is.
  • the test kit of the present invention is a kit that comprises the oligonucleotide analog of the present invention, and the oligonucleotide analog is hybridized with a gene in a specimen to test the gene.
  • a kit include a DNA chip and a DNA microarray.
  • the kit includes a plate on which a well and an oligonucleotide analogue etc. are immobilized, an immobilization carrier such as a fiber and a biochip, and the like.
  • such kits include, for example, drugs, coloring reagents that react and develop color, and tests that facilitate detection. It may contain a reagent to be discharged.
  • the DNA chip generally, a solution containing the oligonucleotide analogue of the present invention using a known gene sequence is fixed by spotting on a glass substrate, or the oligonucleotide of the present invention on a glass substrate. Some are fixed by synthesizing analogs.
  • the DNA chip for example, applies a gene in a specimen to an analysis unit on which the oligonucleotide analog is immobilized, and performs hybridization between the gene and the oligonucleotide analog on the substrate, for example, a fluorescent dye or the like. By detecting by this, the presence or absence of expression of the target gene can be detected. According to such a DNA chip, for example, even a small amount of sample can be effectively analyzed, and various DNA probes can be immobilized on one substrate. A multi-item analysis can be performed.
  • the gene expression suppression method of the present invention is a method of suppressing gene expression using an oligonucleotide analog.
  • the ability of oligonucleotide analogues acts as siRNA or antisense, cleaves the target gene mRNA or forms a double strand with the target gene mRNA, and as a result suppresses gene expression. be able to.
  • a group in which the functional group is protected with a protecting group, a group in the formula (8), and a group in the formula (8), wherein the functional group is selected from the group consisting of a group protected with a protecting group is any group, R 2, R 3 and R 4 Ah in H , Theory and an example of a method of manufacturing a nucleoside analog or a salt thereof represented by the following formula ([pi) Light up.
  • R 5 represents a group of the formula (1), a group of the formula (1), the functional group of which is protected with a protecting group, the formula (2)
  • the functional group is protected with a protective group
  • the functional group is protected with a protective group
  • the functional group is protected with a protecting group
  • the functional group is a protecting group.
  • the group of the formula (6), the group of the formula (6), the functional group is protected with a protecting group, the group of the formula (7), the group of the formula (7)
  • the group power that is a group in which the functional group is protected with a protecting group is selected.
  • K, 1, m and n are independently of each other. , An integer from 1 to 10.
  • R 12 and R 13 together are a group represented by the formula — CR 15 R 16 —
  • R 15 and R 16 are each independently selected from a hydrogen atom, a lower alkyl group, and a lower alkoxyl group force.
  • R 14 is a group represented by the formula SO—R 17 ,
  • R 17 may be substituted with lower alkyl, and may be an aryl group
  • X 2 is a halogen atom
  • k, 1, m and n are each independently an integer of 1 to 10.
  • the protecting group for R 11 a conventionally known primary alcohol protecting group can be used.
  • protecting groups include tert-butyldiphenylsilyl (TBDPS), tert-butyldimethylsilyl (TBDMS), 4, 4, -dimethoxytrityl (DMTr), 4-monomethoxytrityl (MMTr), (9— Phenyl) xanthene 9-yl [pixyl], acetyl (Ac), benzoyl (Bz) and the like.
  • the lower alkyl group is a linear or branched alkyl group, for example, containing 1 to 6 carbon atoms.
  • the lower Examples of the alkyl group include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl 2-ethylbutyl, isobutyl, tert-butyl, pentyl, n-hexyl and the like.
  • the group represented by the formula 1 CR 15 R 16 includes, for example, C (CH 3) —,
  • the aryl group for R 17 is an aromatic hydrocarbon residue, for example, containing 6 to 30 carbon atoms.
  • the aryl group include monocyclic aryl groups such as phenol and condensed polycyclic aryl groups such as naphthyl, indul and fluorenyl.
  • the aryl group may be, for example, 1-5 of the lower alkyl.
  • substituted aryl groups such as p-methylphenol and p-methoxyphenyl.
  • the halogen atom is a fluorine atom, a chlorine atom, an iodine atom, an iodine atom, or the like.
  • the compound represented by the formula (IX) and the compound represented by the formula (X) are converted into a base (for example, potassium carbonate, sodium carbonate, rubidium carbonate, lithium carbonate, cesium carbonate, etc.) ) And optionally crown ether (18 crown-1 6 ether, 21-crown 1 7 ether, is crown ether, 12 crown 4 ether, etc.) to obtain a compound represented by the following formula (XI) it can.
  • a base for example, potassium carbonate, sodium carbonate, rubidium carbonate, lithium carbonate, cesium carbonate, etc.
  • crown ether 18 crown-1 6 ether, 21-crown 1 7 ether, is crown ether, 12 crown 4 ether, etc.
  • the compounds represented may be made in-house with reference to known literature or may be obtained commercially.
  • R U , R 12 and R 13 of the compound represented by the formula (XI) a nucleoside analog represented by the formula ( ⁇ ) or a salt thereof can be obtained. it can.
  • a known removal method may be selected according to the respective groups of R U , R 12 and R 13. it can.
  • R 11 is a silyl group such as tert-butyldiphenylsilyl (TBDPS) or tert-butyldimethylsilyl (TBDMS)
  • TDPS tert-butyldiphenylsilyl
  • TAF tributylammonium fluoride
  • R 11 can be removed.
  • R 12 and R 13 taken together are a group represented by the formula —C (CH 2) 1, an acid (eg, trifluoroacetic acid,
  • R 12 and R 13 can be removed simultaneously by treatment with hydrochloric acid, acetic acid, etc.
  • the compound represented by the formula (VII) may be produced, for example, as shown in the following scheme 2.
  • R 12 and R 13 together are a group represented by the formula — CR 15 R 16 —
  • R 15 and R 16 are each independently selected from a hydrogen atom, a lower alkyl group, and a lower alkoxyl group force.
  • X 1 is a halogen atom
  • k, 1, m and n are each independently an integer of 1 to 10.
  • the compound represented by the formula (IV) and the compound represented by the formula (V) are optionally combined with a base (for example, imidazole, DABCO (l, 4-Diazabicycl o [2.2.2] OC t ane) , can Toriechiruamin etc.) are reacted in the presence, obtaining the formula I spoon compound represented by (VI).
  • a base for example, imidazole, DABCO (l, 4-Diazabicycl o [2.2.2] OC t ane
  • a base for example, imidazole, DABCO (l, 4-Diazabicycl o [2.2.2] OC t ane)
  • a base for example, imidazole, DABCO (l, 4-Diazabicycl o [2.2.2] OC t ane
  • a base for example, imidazole, DABCO (l, 4-Diazabicycl o [2.2.2] OC t ane
  • R 12 and R 13 are protected with R 12 and R 13 to obtain the compound represented by the formula (VII).
  • R 12 and R 13 are protected with R 12 and R 13 to obtain the compound represented by the formula (VII).
  • a method that protects R 12 and R 13 can be selected from known protecting method according to the kind of R 12 and R 13 is a protecting group.
  • R 12 and R 13 are represented by the formula C (CH) —
  • R 11 is a protecting group
  • R 12 and R 13 together are a group represented by the formula — CR 15 R 16 — R 15 and R 16 are each independently selected from a hydrogen atom, a lower alkyl group, and a lower alkoxyl group force.
  • R is a lower alkyl group.
  • the compound represented by the formula (VII-1) can be acidified to obtain the compound represented by the formula (XV).
  • an oxidizing agent for example, BaMnO
  • the compound represented by the formula (VII-1) may be, for example, a compound of the formula (VII) in which k 1 m and n are 1 in the formula (VII) in the scheme 2 .
  • k 1 m and n is 1, and a compound of formula (IV), for example, pentaerythritol, is used as a starting material according to the production method described in scheme 2 above.
  • a compound of formula (VII) in which k 1 m and n are 1 may be prepared.
  • the compound represented by the formula (XV) can be reacted with the iridium compound (XVI) to obtain the compound represented by the formula (XVII).
  • This irido compound (XVI) can be produced according to a method for producing an ylide compound prepared by a Wittig reaction, Horner-Emmons reaction, etc. known to those skilled in the art.
  • the compound represented by the formula (VII-2) can be obtained by catalytic reduction of the compound represented by the formula (XVII) and then reducing the ester (one COOR) moiety. it can.
  • Catalytic reduction can be performed, for example, with hydrogen gas in the presence of a transition metal catalyst.
  • the transition metal catalyst include platinum, palladium (eg, Pd—C), rhodium (eg, Rh 2 O), ruthenium, nickel catalyst, and the like.
  • lithium aluminum hydride LiAlH
  • LiAlH lithium aluminum hydride
  • the compound represented by the formula (VII-3) in which m is 2, and k, 1 and n are 1 in the above formula (VII) is, for example, as shown in the following scheme 4. May be manufactured.
  • R u is a protecting group
  • R 12 and R 13 together are a group represented by the formula — CR 15 R 16 —
  • X 1 and X 4 are independently of each other a halogen atom
  • R is a lower alkyl group
  • R 5Q is a protecting group
  • a conventionally known primary alcohol protecting group can be used as the protecting group.
  • protecting groups include tert-butyldiphenylsilyl (TBD PS), tert-butyldimethylsilyl (TBDMS), 4,4'-dimethoxytrityl (DMTr), 4-monomethoxytrityl (MMTr), ( Examples include 9-phenol) xanthene-9-yl [pixy 1], acetyl (Ac), benzoyl (Bz), and the like.
  • the halogen atom is a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom or the like.
  • the compound represented by the formula (VII-1) and the compound represented by the formula (XX) are optionally present in a base (for example, imidazole, DABCO, triethylamine, etc.)
  • a base for example, imidazole, DABCO, triethylamine, etc.
  • the compound represented by the formula (XXI) can be obtained.
  • the compound represented by the formula (XX) may be made in-house with reference to known literature, or commercially available.
  • the compound represented by the formula (XXI) can be oxidized to obtain a compound represented by the formula (XXII).
  • the oxidation can be carried out using the same conditions as in the above-mentioned scheme 3 for oxidizing the compound represented by the formula (VII-1).
  • the compound represented by the formula (XXIV) can be obtained by catalytic reduction of the compound represented by the formula (XXIII) and then reducing the ester (one COOR) moiety. it can.
  • Catalytic reduction and reduction of the ester moiety can be carried out using the same conditions as the catalytic reduction and ester reduction of the compound represented by the formula (XVII) in Scheme 3.
  • the compound represented by the formula (XXIV) is reacted with the compound represented by the formula (V), and then the group R 5Q is removed to represent the compound represented by the formula (VII-3). Can be obtained.
  • the reaction conditions with the compound of the formula (V) are the same as the reaction conditions of the compound represented by the formula (IV) in the scheme 2 and the compound represented by the formula (V). To do Can do. Further, removal of the group R 5 ° can, depending on the group R ⁇ , selects the known removal methods.
  • the compound represented by the formula (VII) in which k, m, 1 and n are integers of 1 to 10 is a conventionally known technique, ie, protection and deprotection, and ylide compound. It can be manufactured by combining the increased carbonization reaction used.
  • R 12 and R 13 together are a group represented by the formula — CR 15 R 16 —
  • k, 1, m and n are each independently an integer of 1 to 10.
  • the halogen atom is a fluorine atom, a chlorine atom, an iodine atom, an iodine atom, or the like.
  • R u , R 12 and R 13 of the compound represented by the formula ( ⁇ ) a known removal method should be selected according to the respective groups of R U , R 12 and R 13. Can do.
  • R 1 1 is a silyl group such as tert-butyldiphenylsilyl (TBDPS), tert-butyldimethylsilyl (TBDMS), etc.
  • TDPS tert-butyldiphenylsilyl
  • TDMS tert-butyldimethylsilyl
  • R 11 can be removed.
  • R 12 and R 13 are taken together to form a group represented by the formula —C (CH 2) —, an acid (for example,
  • a known removal method can be selected.
  • this hydrolysis can be carried out by treatment with an acid (eg, trifluoroacetic acid, hydrochloric acid, acetic acid, etc.).
  • an acid eg, trifluoroacetic acid, hydrochloric acid, acetic acid, etc.
  • this acid treatment for example, in the formula (R), when R 12 and R 13 are taken together to form a group represented by the formula —C (CH 3) —,
  • R 5 is represented by the formula (XI) in the formula (XI). You can make it home-made with reference to the method for producing the nucleoside analog that is the group of 8).
  • R 1 is a group of the formula (1), a group of the formula (1), the functional group of which is protected with a protecting group, the formula (2)
  • the functional group is protected with a protective group
  • the group of formula (3) the functional group is protected with a protective group.
  • the functional group is protected by a protecting group, in the group of the formula (6), in the group of the formula (6), A group in which the functional group is protected with a protecting group, a group of the formula (7), a group of the formula (7), a group in which the functional group is protected with a protecting group, a group of the formula (8), And, in the group of the formula (8), the functional group is any group selected as a basic group power protected by a protecting group, R 2 is a protecting group, and R 3 is a protecting group. , R 4 is an activated phosphate group for solid phase synthesis, and an example of a method for producing a nucleoside analog represented by the following formula (XXXIV) or a salt thereof will be described.
  • R 5 represents a group of the formula (1), a group of the formula (1) in which the functional group is protected with a protecting group, and the group of the formula (2)
  • the functional group is protected with a protective group
  • the functional group is protected with a protective group
  • the functional group is protected with a protecting group
  • the functional group is a protecting group.
  • a group in which the functional group is protected with a protective group, the group of the formula (8), and the group of the formula (8), wherein the functional group is a group protected with a protective group. is any group selected, R 11 is coercive Mamorumoto der , R 22 is a protecting group, R 23 is a solid-phase synthesis activating phosphate group.
  • the activated phosphate group for solid phase synthesis of R 23 a conventionally known phosphate group can be used in solid phase synthesis, such as phosphoramidite, phospho Examples thereof include phosphate groups that form narate, thiophosphite, and the like.
  • Examples of the activated phosphate group for solid phase synthesis that forms phosphoramidite include a group represented by the following formula (10).
  • R 5 represents the group of the formula (1), the group of the formula (1), the functional group of which is protected with a protecting group, the group of the formula (2), the formula In the group of (2), the functional group is protected with a protecting group, the group of the formula (3), the group of the formula (3), the functional group of which is protected with a protecting group, the formula In the group of (4), in the group of the formula (4), the functional group is a group protected with a protecting group, in the group of the formula (5), the functional group is protected with a protecting group, the formula In the group of (6), in the group of formula (6), the functional group is protected with a protecting group, in the group of formula (7), and in the group of formula (7), the functional group is a protecting group.
  • any of the group forces that are the groups whose functional groups are protected by the protecting group are also selected
  • R 11 is a protecting group
  • R 22 is R 23 is an activated phosphate group for solid phase synthesis
  • X 5 and X 6 are halogen atoms.
  • the halogen atom is a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, or the like.
  • a compound represented by the formula (XXX) can be obtained by removing R 12 and R 13 from the compound represented by the formula (XI).
  • a known removal method can be selected depending on the respective groups of R 12 and R 13 .
  • R 12 and R 13 together are a group represented by the formula —C (CH 2) 1, an acid (eg, trifluoroacetic acid, hydrochloric acid, acetic acid, etc.)
  • R 12 and R 13 can be removed simultaneously.
  • the compound represented by) may be obtained commercially or made in-house using known literature.
  • the compound represented by the formula ( ⁇ ) is added to the compound represented by the formula ( ⁇ ), optionally in the presence of a base (eg, diisopropylethylamine). Condense
  • R 1 is a group of the formula (5)
  • R 2 is a protecting group
  • R 3 is a protecting group
  • R 4 is an activity for solid phase synthesis.
  • R 11 is a protecting group
  • R is a protecting group
  • X 3 is a halogen atom.
  • K, 1, m and n are mutually exclusive It is an integer from 1 to 10.
  • R 11 is a protecting group
  • R 22 is a protecting group
  • R 23 is an active phosphoric acid group for solid phase synthesis
  • X 3 , X 5 and X 6 Is a halogen atom
  • k, 1, m and n are each independently an integer of 1 to 10.
  • the compound represented by the formula ( ⁇ ) by removing the R 12 and R 13, it is possible to obtain a compound represented by the formula (XXXV).
  • a known removal method can be selected depending on the respective groups of R 12 and R 13 .
  • R 12 and R 13 together are a group represented by the formula C (CH) 1, an acid (eg, trifluoroacetic acid, hydrochloric acid, acetic acid)
  • the compound represented by the formula (XXXV) is converted into a compound represented by the formula (XXXI), optionally a base (for example, pyridine and the like), and a catalyst (for example, dimethylamino).
  • a compound represented by the formula (XXXVI) can be obtained.
  • the compound represented by the formula (XXX I) may be obtained commercially or made in-house using known literature. A little.
  • a compound in which one of the three hydroxyl groups of the nucleoside analog of the present invention is activated with an activated phosphate group for solid phase synthesis and the remaining two hydroxyl groups are protected is prepared.
  • a compound represented by the above formula (XXXIV) or a compound represented by the above formula (XX XVII) can be used.
  • the activated phosphate group for solid-phase synthesis a conventionally known phosphate group can be used in solid-phase synthesis, and examples thereof include phosphate groups that form phosphoramidites, phosphonates, thiophosphites, and the like. It is done.
  • the oligonucleotide analog of the present invention can be used, for example, by subjecting this active compound to the sequence of the oligonucleotide analog using a conventionally known technique in the field of oligonucleotide synthesis.
  • nucleoside can be sequentially coupled on a solid phase.
  • nucleoside As the nucleoside, coupling reagent, deprotection reagent, washing reagent, etc., those usually used for nucleic acid solid phase synthesis are used.
  • the obtained oligonucleotide analog on the solid phase carrier is subjected to deprotection of the oligonucleotide side chain if necessary, and then the solid phase carrier force is cleaved to obtain a crude oligonucleotide analog.
  • the reagent used for excision can be appropriately selected from conventionally known reagents according to the structure of the solid phase carrier and the linker (part connecting the solid phase carrier and the oligonucleotide analog).
  • This crude oligonucleotide analog may be purified by HPLC or the like, if necessary.
  • Double stranded oligonucleotide Chid analogues can be obtained.
  • This double-stranded oligonucleotide analogue can be isolated and purified by further performing phenol Z chromatography, ethanol precipitation, etc., if necessary.
  • a protecting group may be introduced into each functional group, the protecting group may be deprotected, or the protecting group may be changed.
  • the selection of a protecting group according to the type of the functional group, the introduction of the protecting group, and the removal of the protecting group can be performed according to methods known in the art. For example, “protective group in organic synthesis (“ Protective group ” "Groups in Organic Synthesis j, T. Greene et al., John Wiley & 3 ⁇ 4ons, Inc.” can be referred to.
  • TBDPS-C1 tert-butyldiphenylsilylchlori de
  • the obtained organic layer was washed successively with a saturated aqueous NaCl solution and a saturated aqueous NaHCO solution and dried. Remove solvent from the organic layer
  • an oligonucleotide analog (DNA type) was produced by the phosphoramidite method using an automatic nucleic acid synthesizer and CPG resin.
  • the sequence represented by 2 includes 9- [2— (2 diaminoethoxy-N, N diisopropylaminophosphorooxymethyl-2- (4,4′-dimethoxytrityloxy) prepared in Example 8. ) 3-tert-butyldiphenylsilyloxy) propyl] N 6 benzoyladenine was introduced as the nucleoside monomer.
  • Other sequences were introduced using deoxyribose type nucleosides. 1 ⁇ mol CPG resin for solid phase synthesis was used, and each condensation time was 1 minute.
  • oligonucleotide bound to the CPG resin was reacted in a 28% aqueous ammonia solution (1.5 mL) at 55 ° C for 12 hours.
  • the reaction mixture was concentrated under reduced pressure.
  • TBAF solution (1 mL) was added to the resulting concentrate, and the mixture was stirred at room temperature for 12 hours to deprotect the silyl group.
  • the resulting mixture was then diluted with 0.1 M TEAA buffer (30 mL). This mixture was subjected to C-18 reverse phase column chromatography (Sep—Pak) (eluent: water, 50% CH CN (2 mL)), and similar to the desired single-stranded oligonucleotide
  • the 0.1 M TEAA buffer used in Example 9 was prepared as follows. First, add a mixture of 2N acetic acid (114.38mL) and triethylamine (277.6mL).
  • a single-stranded oligonucleotide was obtained in the same manner as in Example 9 according to the base sequence of SEQ ID NO: 2 (see the base sequence shown below) instead of SEQ ID NO: 1.
  • the oligonucleotide analog consisting of SEQ ID NO: 1 (0.8 nmmol) prepared in Example 9 was dissolved in annealing buffer (10 mM sodium phosphate (pH 7.0) and 1 M NaCl). Incubate the solution at 90 ° C for 1 minute, then at 37 ° C for 1 hour, from the oligonucleotide analog consisting of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, such as the base sequence shown below.
  • annealing buffer 10 mM sodium phosphate (pH 7.0) and 1 M NaCl
  • a single-stranded oligonucleotide was produced in the same manner as in Example 9 according to the base sequence of SEQ ID NO: 3 (see the base sequence shown below) instead of SEQ ID NO: 1.
  • Example 10 instead of the oligonucleotide analogue consisting of SEQ ID NO: 1 produced in Example 9 and using the oligonucleotide consisting of SEQ ID NO: 3 produced in Comparative Example 1, as in Example 10, A double-stranded oligonucleotide analogue was obtained that also had the oligonucleotide consisting of SEQ ID NO: 3 and the oligonucleotide consisting of SEQ ID NO: 2.
  • Table 1 shows the measured Tm values of the double-stranded oligonucleotide analog produced in Example 10 and the double-stranded oligonucleotide produced in Comparative Example 2.
  • Example 11 In the same manner as in Example 11 except that the oligonucleotide consisting of SEQ ID NO: 3 prepared in Comparative Example 1 was used instead of the oligonucleotide analog consisting of SEQ ID NO: 1 prepared in Example 9, the 5 ′ end was An oligonucleotide consisting of SEQ ID NO: 3 labeled with 32 P isotope was obtained.
  • the exonuclease resistance of the single-stranded oligonucleotide analog consisting of SEQ ID NO: 1 obtained in Example 11 and the natural single-stranded oligonucleotide consisting of SEQ ID NO: 3 obtained in Comparative Example 3 was evaluated.
  • snake venom phosphorodiesterase SVP
  • SVP selectively cleaves phosphodiester bonds and cleaves oligonucleotides into 5, monomonophosphate nucleotides.
  • the 10 M single-stranded oligonucleotide analog solution was prepared by adding SEQ ID NO: produced in Example 9 to the single-stranded oligonucleotide analogue (lOOpmol) consisting of SEQ ID NO: 1 produced in Example 11.
  • a single-stranded oligonucleotide analog (400 pmol) consisting of 1 was prepared and adjusted to 10 M using sterile water.
  • a 10 M single-stranded oligonucleotide solution was also prepared as described above.
  • each reaction solution (5 1) was added to each Eppendorf tube containing the loading solution (7 M urea XC BPB; 5 L).
  • the sample after 0 minutes does not contain the SVP aqueous solution.
  • the obtained samples at each time were electrophoresed by PAGE with 20% urea and separated in a gel.
  • the gel was contacted with an imaging plate to transfer the separated image in the gel. This image was captured using a bioimaging analyzer (trade name: BAS2000, manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.), and image processing was performed using RI image analysis software. The results are shown in Fig. 1.
  • single-stranded oligonucleotide analogues are compared with natural single-stranded oligonucleotides, It was confirmed that exonuclease resistance was improved. In addition, as shown in FIG. 1, it was confirmed that the single-stranded oligonucleotide analog exhibited nuclease resistance not only at site 1 but also at site 2. This site 1 is the binding site between the nucleoside analog and the natural nucleoside. Site 2 is a binding site between natural nucleosides.
  • nucleoside analog of the present invention is useful, for example, as a nucleoside for producing an oligonucleotide for a test kit.

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Description

明 細 書
ヌクレオシド類似体またはその塩
技術分野
[0001] 本発明は、ヌクレオシド類似体またはその塩に関するものである。
背景技術
[0002] 近年、遺伝情報そのものを治療の対象としてとらえるという方法論が普及しつつある 。この方法論の一つに、オリゴヌクレオチドを用いたアンチセンス法がある。アンチセ ンス法とは、化学合成したオリゴヌクレオチド類似体 (例えば、 15〜20の塩基対から 成る一本鎖 DNA)を細胞に加え、標的メッセンジャー RNA (mRNA)と DNA等 ZmR NA二本鎖核酸を形成させることにより、標的遺伝子の発現を塩基配列特異的に抑 制し、 mRNA力 タンパク質への翻訳過程を阻害する方法である。アンチセンス法で は、病因となるウィルスまたは遺伝子の塩基配列が既知の場合、アンチセンス分子を 理論的に設計し、それを合成するのが可能であることから、これまで治癒が困難と考 えられてきた様々なウィルスを原因とする疾患および遺伝子疾患に対する有効な治 療方法の一つとして期待されて 、る。
[0003] また、ごく最近、オリゴヌクレオチドを用いた遺伝子発現抑制法として、 RNAi (RNA inteference、 RNA干渉）を利用した方法に、注目が集まっている。この RNAiとは、 二本鎖 RNAを細胞に導入することにより、同じ塩基配列を有する細胞の染色体由来 の RNAが分解され、切断される現象を指す。この RNAiの機構は、現在のところ、次 のように考えられている。先ず、長鎖二本鎖 RNAが、酵素（Dicerと呼ばれる）により 3，— UU型のダングリングエンド構造を持つ 21塩基程度の長さの二本鎖 RNA (siR NA (short interfering RNA)と呼ばれる）に加水分解される。その siRNAが、標的 m RNAと RNAZmRNA二本鎖核酸を形成し、この二本鎖核酸を認識する細胞内タ ンパク質 (RISC (RNA-induced Silencing Complex)と呼ばれる）と、この二本鎖核酸 とが結合し、この結合体により、標的 mRNAが切断されるというものである。この RNA iを利用する方法によると、多くの場合、アンチセンス法と比較して 1Z100程度の濃 度の RNAを用いて同等の効果が得られている。従って、 RNAiを利用する方法も、こ れまで治癒が困難と考えられてきた様々なウィルスを原因とする疾患および遺伝子 疾患に対する有効な治療方法の一つとして期待が高まっている。
[0004] アンチセンス法、 RNAiを利用する方法等に用いるのには、天然型オリゴヌクレオチ ドに含まれるリボース環を含むオリゴヌクレオチド類似体は、化学的、生物学的に非 常に不安定であるという問題があった (例えば、非特許文献 1参照)。一方、アンチセ ンス法、 RNAiを利用する方法等で用いられるためには、天然型オリゴヌクレオチドと の二本鎖形成能力も要求されるが、化学的、生物学的に安定なオリゴヌクレオチド類 似体は、通常、この二本鎖形成能力が低いという問題があった (例えば、非特許文献 2参照)。このように、化学的、生物学的に安定という特性と、優れた二本鎖形成能力 という特性は、両立するのが困難であるという問題があった。しかし、 DNAチップ、遺 伝子診断薬等にオリゴヌクレオチド類似体を用いる場合、安定した診断結果を得るた めにも、これらの特性が優れたオリゴヌクレオチド類似体の提供が望まれて 、た。 非特許文献 l : Eugen Uhlmann and Anusch Peyman, Antisense oligonucleotide s: a new therapeutic principle", Chemical Reviews, 1990年、第 90卷、 p.543. 非特許文献 2 : Jin yan Tang, Jamal Temsamani and Sudhir Agrawal, "Self-stab ilized antisense oligonucleotide phosphorothioates： properties and anti— HIV ac tivity", Nucleic Acids Research, 1993年、第 21卷、 p.2729.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] そこで、本発明は、化学的、生物的安定性および二本鎖形成能の 2つの特性が優 れたオリゴヌクレオチド類似体を製造可能にするヌクレオシド類似体およびそのヌクレ オシド類似体を含むオリゴヌクレオチド類似体の提供を目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明は、下記式 (I)で表されるヌクレオシド類似体またはその塩である。
[0007] [化 10]
Figure imgf000004_0001
[0008] 前記式 (I)中、 R1は、下記式（1)の基、下記式（1)の基において、その官能基が保 護基で保護された基、下記式 (2)の基、下記式 (2)の基において、その官能基が保 護基で保護された基、下記式 (3)の基、下記式 (3)の基において、その官能基が保 護基で保護された基、下記式 (4)の基、下記式 (4)の基において、その官能基が保 護基で保護された基、下記式 (5)の基、下記式 (5)の基において、その官能基が保 護基で保護された基、下記式 (6)の基、下記式 (6)の基において、その官能基が保 護基で保護された基、下記式 (7)の基、下記式 (7)の基において、その官能基が保 護基で保護された基、下記式 (8)の基、および下記式 (8)の基において、その官能 基が保護基で保護された基カゝらなる群カゝら選択されるいずれかの基であり、 R2は、 Hまたは保護基であり、
R3は、 Hまたは保護基であり、
R4は、 Hまたは固相合成用活性化リン酸基であり、
k、 1、 mおよび nは、互いに独立して、 1〜10の整数である。
[0009] [化 11]
Figure imgf000005_0001
発明の効果
本発明は、従来にはない新規な化学構造を設計し、かつその化学構造を有するヌ クレオシド類似体の製造に成功したことに基づき、完成したものである。本発明は、こ のヌクレオシド類似体により、ヌクレアーゼ耐性および二本鎖形成能の 2つの特性が 優れたオリゴヌクレオチド類似体を提供することができる。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1 ]図 1は、 本発明めオリゴヌクレオチド類似体の一例と、 比較例のオリゴヌクレ ォチドの一例のヌクレア一ゼ耐性を示す図である。 Lane 1 ： 天然型 0 min, Lane 2： 天然型 5 min, Lane 3 ： 天然型 10 min, Lane 4 ： 天然型 15 min( Lane 5 ： 天然型 30 min, Lane 6 ： 修飾型 0 min, Lane 7 ： 修飾型 5 min, Lane 8 ： 修飾型 10 rain, Lane 9 ： 修飾型 15 min, Lane 10 ： 修飾型 30 min。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明において、「オリゴヌクレオチド」は、例えばヌクレオシドサブユニットのポリマ 一をいい、そのサブユニット数は特に限定されないが、例えば、 3から 100個である。 中でも、本発明のヌクレオチド類似体が DNAである場合には、それらのサブユニット 数は、 3〜100個が好ましく、 3〜30個がより好ましぐ RNAである場合には、 3〜50 個が好ましぐ 3〜30個がより好ましい。なお、本発明における「オリゴヌクレオチド類 似体」は、ヌクレオシドが、本発明のヌクレオシド類似体で置き換えられていること以 外は、特に限定されない。例えば、本発明のヌクレオシド類似体以外のヌクレオシド については、糖部および塩基部分は、当業者に公知な類似体であってもよい。
[0013] 本発明において、 R1について、官能基が保護されている保護基とは、核酸化学に おいて公知な保護基から選択される。例えば、ベンゾィル (Bz)、イソプチリル (iBu)、 フエノキシァセチル（Pac)、ァリルォキシカルボニル（AOC)、 N， N—ジメチルァミノ メチレン、ァセチル (Ac)等力 その保護基として用いられうる。
[0014] 本発明において、 R2および R3について前記保護基とは、従来公知の 1級アルコ— ルの保護基を用いることができる。そのような保護基としては、例えば、 4, 4'一ジメト キシトリチル（DMTr)、 tert-ブチルジメチルシリノレ（TBDMS)、 4—モノメトキシトリチ ル（MMTr)、 tert—ブチルジフエ二ルシリノレ（TBDPS)、（9—フエニル）キサンテン —9—ィル [ピキシル (pixyl) ]等力 挙げられる。
[0015] 本発明において、前記 、 R2およひ について前記保護基とは、本発明のヌクレ オシド類似体を用いて、最終的にオリゴヌクレオチド類似体を製造するための条件を 考慮して、適宜選択することができる。例えば、前記オリゴヌクレオチド類似体を製造
差替え用紙（規則 26) 4/1
する際、最終的な保護基の除去の条件に応じて、 R\ R2およひ τ3を、適宜、選択した ヌクレオシド類似体を用いてもよい。
本発明において、 R4について、前記固相合成用活性化リン酸基としては、固相合
差替え用紙 （規則 26) 成において従来公知のリン酸基を用いることができ、例えば、ホスホロアミダイト、ホス ホナート、チォホスファイト等を形成するリン酸基が挙げられる。ホスホロアミダイトを形 成する、固相合成用活性化リン酸基としては、例えば、下記式（10)で表される基が 挙げられる。
[0017] [化 12]
Figure imgf000008_0001
[0018] 本発明において、その塩とは、例えば無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸と の塩、有機酸との塩等などが挙げられる。無機塩基との塩の例としては、例えばナトリ ゥム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩;カルシウム塩、マグネシウム塩などのアル力 リ土類金属塩;ならびにアルミニウム塩、アンモ-ゥム塩などが挙げられる。有機塩基 との塩の例としては、例えばトリメチルァミン、トリェチルァミン、ピリジン、ピコリン、エタ ノールァミン、ジエタノールァミン、トリエタノールァミン、ジシクロへキシルァミン、 N, N，ージベンジルエチレンジァミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の例として は、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸と の塩の例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルォロ酢酸、フマル酸、シユウ酸、酒石 酸、マレイン酸、クェン酸、コノヽク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸 、 p トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。本発明において、その塩とは、薬 理学的に許容される塩が好まし 、。
[0019] 本発明において、 k、 1、 mおよび nは、互いに独立して 1〜10の整数であり、好まし くは 1〜6の整数である。 k、 1、 mおよび nは、同一または異なっていてもよい。
[0020] 本発明の式 (I)で表わされるヌクレオシド類似体またはその塩は、 R2が、 H、 4, 4，
ージメトキシトリチル（DMTr)、 tert-ブチルジメチルシリル（TBDMS)、 4 モノメトキ シトリチル (MMTr)、 tert ブチルジフエ-ルシリル（TBDPS)または（9 フエニル） キサンテン 9ーィルであり、
R3が、 H、 4, 4，ージメトキシトリチル（DMTr)、 tert-ブチルジメチルシリル（TBDM S)、 4 モノメトキシトリチル（MMTr)、 tert ブチルジフエ-ルシリル（TBDPS)また は（9—フエ-ル）キサンテン— 9—ィルであり、
R4が、 Hまたは下記式（10)で表される基であるのが好まし ヽ
[化 13]
Figure imgf000009_0001
[0022] また、本発明の式 (I)で表されるヌクレオシド類似体またはその塩は、前記式 (I)に おいて、 R1が、前記式（1)の基、前記式（2)の基、前記式（3)の基、前記式 (4)の基 、前記式（5)の基、前記式 (6)の基、前記式（7)の基および前記式 (8)の基からなる 群から選択されるいずれかの基であり、 k、 1、 mおよび nが、 1であるのが好ましい。
[0023] また、本発明の式 (I)で表わされるヌクレオシド類似体またはその塩は、
R1が前記式（1)の基であり、 R2、 R3および R4が Hである前記式 (I)で表されるヌクレ オシド類似体、
R1が前記式（2)の基であり、 R2、 R3および R4が Hである前記式 (I)で表されるヌクレ オシド類似体、
R1が前記式（3)の基であり、 R2、 R3および R4が Hである前記式 (I)で表されるヌクレ オシド類似体、
R1が前記式 (4)の基であり、 R2、 R3および R4が Hである前記式 (I)で表されるヌクレ オシド類似体、
R1が前記式（5)の基であり、 R2、 R3および R4が Hである前記式 (I)で表されるヌクレ オシド類似体、
R1が前記式（6)の基であり、 R2、 R3および R4が Hである前記式 (I)で表されるヌクレ オシド類似体、
R1が前記式（7)の基であり、 R2、 R3および R4が Hである前記式 (I)で表されるヌクレ オシド類似体、または
R1が前記式（7)の基において、その官能基がベンゾィルで保護された基であり、 R2 が 4, 4'—ジメトキシトリチル（DMTr)であり、 R3が、 tert—ブチルジフエ-ルシリル (T BDPS)であり、 R4が、下記式（10)で表される基である前記式 (I)で表されるヌクレオ シド類似体が、より好ましい
[化 14]
Figure imgf000010_0001
[0024] なお、本発明のヌクレオシド類似体またはその塩は、本発明のオリゴヌクレオチド類 似体の製造用に限定されず、他の用途にも適用可能である。
[0025] 本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、オリゴヌクレオチドを構成する 1以上のヌクレ オシドが、ヌクレオシド類似体でそれぞれ置き換えられて ヽるオリゴヌクレオチド類似 体であって、前記ヌクレオシド類似体が、前記式 (I)中、 R1が、前記式（1)の基、前記 式（2)の基、前記式（3)の基、前記式 (4)の基、前記式（5)の基、前記式（6)の基、 前記式（7)の基および前記式 (8)の基力もなる群力も選択される!ヽずれかの基であり 、 R2、 R3および R4が Hである本発明のヌクレオシド類似体である。例えば、オリゴヌク レオチドを構成するヌクレオシドの全て力 前記ヌクレオシド類似体で置き換えられて V、るオリゴヌクレオチド類似体は、以下の式で表される。
[0026] [化 15]
Figure imgf000010_0002
[0027] 前記式中、 R51および R52は、互いに独立して、前記式（1)の基、前記式（2)の基、 前記式（3)の基、前記式 (4)の基、前記式（5)の基、前記式（6)の基、前記式（7)の 基および前記式（8)の基力 なる群力 選択されるいずれかの基であり、 kl、 k2、 11 、 12、 ml、 m2、 nlおよび n2は、互いに独立して、 1〜10の整数である。
[0028] 本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌク レオチド等であってもよい。オリゴヌクレオチド類似体力 二本鎖である場合、前記二 本鎖オリゴヌクレオチドの一方または両方の一本鎖オリゴヌクレオチドを構成する 1以 上のヌクレオシドが、前記式 (I)中、 R1が、前記式（1)の基、前記式（2)の基、前記式 (3)の基、前記式 (4)の基、前記式（5)の基、前記式（6)の基、前記式（7)の基およ び前記式 (8)の基力 なる群力 選択されるいずれかの基でああり、 R2、 R3および R4 が Hであるヌクレオシド類似体であってもよ!/、。
[0029] オリゴヌクレオチド類似体が一本鎖である場合、本発明のオリゴヌクレオチド類似体 は、二本鎖形成能を有するのが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチド類似体力 天 然型オリゴヌクレオチドと二本鎖形成能を有すれば、アンチセンス、遺伝子検出等の ため用いることができるからである。
[0030] 本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、ヌクレアーゼ耐性であるのが好まし 、。本発 明のオリゴヌクレオチド類似体力 細胞内に取り込まれた際、ヌクレアーゼで分解され るのを防ぐことができ、その結果、オリゴヌクレオチド類似体の細胞内での活性を、持 続させることが可能だ力もである。
[0031] 本発明の遺伝子発現抑制剤は、本発明のオリゴヌクレオチド類似体を含む。このよ うな遺伝子発現抑制剤は、オリゴヌクレオチド類似体力 例えば、 siRNAやアンチセ ンスとして作用し、標的遺伝子の mRNAを切断したり、標的遺伝子の mRNAと二本 鎖を形成等して、その結果、遺伝子発現を抑制することができる。
[0032] 本発明の医薬組成物は、遺伝子発現に伴う疾患を治療するためであり、前記遺伝 子発現抑制剤を含むものである。遺伝子発現に伴う疾患、例えば、あるタンパク質が 発現されることにより疾患が引き起こされる場合、この医薬組成物により、その遺伝子 発現を抑制し、その遺伝子発現に伴う疾患を治療するのに用いることが可能である。
[0033] 本発明の検査キットは、本発明のオリゴヌクレオチド類似体を含み、前記オリゴヌク レオチド類似体が、検体中の遺伝子とハイブリッド形成することにより、前記遺伝子が 検査されるキットである。このようなキットとしては、例えば、 DNAチップ、 DNAマイク ロアレイ等が挙げられる。このキットには、本発明のオリゴヌクレオチド類似体の他に、 ゥエルとオリゴヌクレオチド類似体等とが固定されたプレート、ファイバー、バイオチッ プ等の固定化担体等が挙げられる。このようなキットには、前記オリゴヌクレオチド類 似体等のほかに、例えば、薬物、反応して発色する発色試薬、検出を容易にする検 出試薬等を含んでもよい。
[0034] DNAチップとしては、一般に、ガラス基板上に既知遺伝子配列を用いた本発明の オリゴヌクレオチド類似体を含む溶液をスポットして固定ィ匕したものや、ガラス基板上 で本発明のオリゴヌクレオチド類似体を合成することによって固定ィ匕したもの等がある 。前記 DNAチップは、例えば、検体中の遺伝子を、前記オリゴヌクレオチド類似体を 固定ィ匕した分析部にアプライし、前記遺伝子と基板上のオリゴヌクレオチド類似体と のハイブリッド形成を、例えば、蛍光色素等により検出することによって、 目的遺伝子 の発現の有無を検出できる。このような DNAチップによれば、例えば、少量の試料で も有効に分析が可能であり、また、多種の DNAプローブを一つの基板に固定化でき るため、一つの DNAチップにおいて同一検体につき、多項目の分析を行うことがで きる。
[0035] 本発明の遺伝子発現抑制方法は、オリゴヌクレオチド類似体を用いて、遺伝子の 発現を抑制する方法である。この方法では、オリゴヌクレオチド類似体力 例えば、 si RNAやアンチセンスとして作用し、標的遺伝子の mRNAを切断したり、標的遺伝子 の mRNAと二本鎖を形成等して、その結果、遺伝子発現を抑制することができる。
[0036] 次に、本発明のヌクレオシド類似体を製造するための製造方法にっ 、て、例を挙げ て説明する。このような製造方法により、従来にはない化学構造を有する、本発明の ヌクレオシド類似体の製造が可能になった。
[0037] まず、前記式 (I)中、 R1が、前記式（1)の基、前記式（1)の基において、その官能基 が保護基で保護された基、前記式 (2)の基、前記式 (2)の基において、その官能基 が保護基で保護された基、前記式 (3)の基、前記式 (3)の基において、その官能基 が保護基で保護された基、前記式 (4)の基、前記式 (4)の基において、その官能基 が保護基で保護された基、前記式 (5)の基において、その官能基が保護基で保護さ れた基、前記式 (6)の基、前記式 (6)の基において、その官能基が保護基で保護さ れた基、前記式 (7)の基、前記式 (7)の基において、その官能基が保護基で保護さ れた基、前記式 (8)の基、および前記式 (8)の基において、その官能基が保護基で 保護された基からなる群から選択されるいずれかの基であり、 R2、 R3および R4が Hで あり、下記式 (Π)で表されるヌクレオシド類似体またはその塩の製造方法の一例を説 明する。
[化 16]
Figure imgf000013_0001
[0039] 前記式 (Π)中、 R5は、前記式（1)の基、前記式（1)の基において、その官能基が保 護基で保護された基、前記式 (2)の基、前記式 (2)の基において、その官能基が保 護基で保護された基、前記式 (3)の基、前記式 (3)の基において、その官能基が保 護基で保護された基、前記式 (4)の基、前記式 (4)の基において、その官能基が保 護基で保護された基、前記式 (5)の基において、その官能基が保護基で保護された 基、前記式 (6)の基、前記式 (6)の基において、その官能基が保護基で保護された 基、前記式 (7)の基、前記式 (7)の基において、その官能基が保護基で保護された 基、前記式 (8)の基、および前記式 (8)の基において、その官能基が保護基で保護 された基力 なる群力 選択されるいずれかの基であり、 k、 1、 mおよび nは、互いに 独立して、 1〜10の整数である。
[0040] [化 17]
Figure imgf000013_0002
(1 ) , (2) ， (3) . (4) ， (5)
Figure imgf000013_0003
その製造方法を、例えば、以下のスキーム 1に示す。その製造方法によれば、例え ば、下記式 (VII)で表される化合物と、下記式 (VIII)で表される化合物とを反応させ 、下記式 (IX)で表される化合物を得、 前記式 (IX)で表される化合物と、下記式 (X)で表される化合物とを、塩基存在下 に縮合させ、下記式 (XI)で表される化合物を得、
前記式 (XI)で表される化合物の、 Ru、 R12および R13を除去することにより、式 (II) で表されるヌクレオシド類似体またはその塩を得ることができる。
[化 18]
Figure imgf000014_0001
スキーム 1
[0043] 前記式中、 R5は、下記式（1)の基、下記式（1)の基において、その官能基が保護 基で保護された基、下記式 (2)の基、下記式 (2)の基において、その官能基が保護 基で保護された基、下記式 (3)の基、下記式 (3)の基において、その官能基が保護 基で保護された基、下記式 (4)の基、下記式 (4)の基において、その官能基が保護 基で保護された基、前記式 (5)の基において、その官能基が保護基で保護された基 、下記式 (6)の基、下記式 (6)の基において、その官能基が保護基で保護された基 、下記式（7)の基、下記式（7)の基、下記式（8)の基、および下記式（8)の基におい て、その官能基が保護基で保護された基からなる群から選択される!、ずれかの基で あり、
[0044] [化 19]
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000015_0002
[0045] Ruは、保護基であり、
R12および R13は、一緒になつて、式— CR15R16—で表される基であり、
前記 R15および R16は、互いに独立して、水素原子、低級アルキル基および低級アル コキシル基力 なる群力 選択されるいずれかであり、
R14は、式 SO— R17で表される基であり、
2
前記 R17は、低級アルキルで置換されて 、てもよ 、ァリール基であり、
X2は、ハロゲン原子であり、
k、 1、 mおよび nは、互いに独立して、 1〜10の整数である。
[0046] 本発明において、 R11について前記保護基とは、従来公知の 1級アルコ―ルの保護 基を用いることができる。そのような保護基としては、例えば、 tert—ブチルジフエニル シリル（TBDPS)、 tert-ブチルジメチルシリル（TBDMS)、 4, 4，—ジメトキシトリチル (DMTr)、 4—モノメトキシトリチル（MMTr)、（9—フエ-ル）キサンテン一 9—ィル [ ピキシル（pixyl) ]、ァセチル (Ac)、ベンゾィル（Bz)等力 挙げられる。
[0047] また、本発明において、 R5について、官能基が保護されている保護基とは、核酸ィ匕 学において公知な保護基力 選択される。例えば、ベンゾィル (Bz)、イソプチリル (i Bu)、フエノキシァセチル（Pac)、ァリルォキシカルボ-ル (AOC)、 N, N ジメチル アミノメチレン、ァセチル (Ac)等が、その保護基として用いられうる。
[0048] 本発明にお 、て、 R15および R16につ 、て前記低級アルキル基とは、直鎖状または 分岐状のアルキル基であり、例えば 1〜6の炭素原子を含むものである。前記低級ァ ルキル基の例としては、メチル、ェチル、 n—プロピル、イソプロピル、 n—ブチル 2— ェチルブチル、イソブチル、 tert—ブチル、ペンチル、 n—へキシル等が挙げられる。
[0049] 本発明にお 、て、 R15および R16につ 、て前記低級アルコキシル基とは、直鎖状また は分岐状のアルコキシル基であり、例えば 1〜6の炭素原子を含むものである。前記 低級アルコキシル基の例としては、メトキシ、エトキシ、 n—プロピルォキシ、イソプロピ ルォキシ、 n ブチル 2—ェチルブチルォキシ、イソブチルォキシ、 tert—ブチルォ キシ、ペンチルォキシ、 n—へキシルォキシ等が挙げられる。
[0050] 本発明において、式一 CR15R16 で表される基としては、例えば、 C (CH ) ―、
3 2
-CH (OCH )一等が挙げられる。
3
[0051] 本発明において、 R17について前記ァリール基とは、芳香族炭化水素残基であり、 例えば、 6〜30の炭素原子を含むものである。前記ァリール基の例としては、単環式 ァリール基、例えば、フエ-ル等および、縮合多環式ァリール基、例えば、ナフチル、 インデュル、フルォレニル等が挙げられる。
[0052] 本発明にお!/、て、 R"につ!/、て、低級アルキルで置換されて!、てもよ 、ァリール基と しては、例えば、前記低級アルキルの 1〜5で置換されているァリール基が挙げられ る。その具体例としては、例えば、 p—メチルフエ-ル、 p—メトキシフエ-ル等である。
[0053] 本発明において、 X2について、前記ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭 素原子、ヨウ素原子等である。
[0054] 前記スキーム 1にお!/、て、まず、前記式 (VII)で表される化合物と、前記式 (VIII)で 表される化合物とを、任意に塩基 (例えば、 4—ジメチルァミノピリジン (DMAP)、 DA BCO等)存在下に反応させ、前記式 (IX)で表される化合物を得ることができる。なお 、前記式 (VIII)で表される化合物は、公知文献を参考に自家製造してもよいし、巿 販で入手してもよい。
[0055] 次に、前記式 (IX)で表される化合物と、前記式 (X)で表される化合物とを、塩基（ 例えば、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸ルビジウム、炭酸リチウム、炭酸セシウム 等）および任意にクラウンエーテル（18 クラウン一 6 エーテル、 21—クラウン一 7 エーテル、 is クラウン エーテル、 12 クラウン 4 エーテル等）存在下 に縮合させ、下記式 (XI)で表される化合物を得ることができる。なお、前記式 (X)で 表される化合物は、公知文献を参考に自家製造してもよいし、市販で入手してもよい
[0056] 最後に、前記式 (XI)で表される化合物の、 RU、 R12および R13を除去することにより 、式 (Π)で表されるヌクレオシド類似体またはその塩を得ることができる。前記式 (XI) で表される化合物の、 RU、 R12および R13を除去するには、 RU、 R12および R13それぞれ の基に応じて、公知の除去方法を選択することができる。例えば、 R11が tert—ブチル ジフエ-ルシリル（TBDPS)、 tert-ブチルジメチルシリル（TBDMS)等のシリル基で ある場合、トリブチルアンモ -ゥムフルオライド (TBAF)、塩ィ匕アンモ-ゥム等で処理 することにより、 R11を除去することが可能である。また、例えば、 R12および R13が、一緒 になって、式—C (CH ) 一で表される基である場合、酸 (例えば、トリフルォロ酢酸、
3 2
塩酸、酢酸等)で処理することにより、 R12および R13を同時に除去することが可能であ る。
[0057] 前記式 (VII)で表される化合物は、例えば、以下のスキーム 2に示すようにして製造 してちよい。
[0058] [化 20]
Figure imgf000017_0001
スキーム 2
[0059] 前記式中、 R11は、保護基であり、
R12および R13は、一緒になつて、式— CR15R16—で表される基であり、
前記 R15および R16は、互いに独立して、水素原子、低級アルキル基および低級アル コキシル基力 なる群力 選択されるいずれかであり、
X1は、ハロゲン原子であり、
k、 1、 mおよび nは、互いに独立して、 1〜10の整数である。
[0060] 本発明において、 X1について、前記ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭 素原子、ヨウ素原子等である。
[0061] 前記スキーム 2において、例えば、前記式 (IV)で表される化合物と、前記式 (V)で 表される化合物とを、任意に塩基（例えば、イミダゾール、 DABCO (l,4-Diazabicycl o[2.2.2]OCtane)、トリエチルァミン等)存在下に反応させ、前記式 (VI)で表されるィ匕 合物を得ることができる。なお、前記式 (IV)で表される化合物および前記式 (V)で表 される化合物は、公知文献を参考に自家製造してもよいし、市販で入手してもよい。
[0062] 次に、前記式 (VI)で表される化合物の 3つの水酸基のうち 2つを、 R12および R13で 保護して、前記式 (VII)で表される化合物を得ることができる。 R12および R13で保護す る方法としては、保護基である R12および R13の種類に応じて公知の保護方法を選択 することができる。例えば、 R12および R13が、一緒になつて、式一 C (CH ) —で表され
3 2 る基である場合、前記式 (VI)で表される化合物を、アセトン、酸触媒 (例えば、バラト ルェン安息香酸等)存在下に加熱することにより、前記式 (VII)中、 R12および R13が、 一緒になつて、式— C (CH ) —で表される基である化合物を得ることができる。
3 2
[0063] また、前記式 (VII)中、 kが 2であり、 1、 mおよび nが 1である式 (VII— 2)で表される 化合物は、例えば、以下のスキーム 3に示すようにして製造してもよい。
[0064] [化 21]
Figure imgf000018_0001
(VII- 1) (XV) (χνπ)
Figure imgf000018_0002
(VII-2)
スキーム 3
[0065] 前記式中、 R11は、保護基であり、
R12および R13は、一緒になつて、式— CR15R16—で表される基であり、 前記 R15および R16は、互いに独立して、水素原子、低級アルキル基および低級アル コキシル基力 なる群力 選択されるいずれかであり、
Rは、低級アルキル基である。
[0066] 本発明にお 、て、 Rにつ 、て前記低級アルキル基とは、直鎖状または分岐状のァ ルキル基であり、例えば 1 6の炭素原子を含むものである。前記低級アルキル基の 例としては、メチル、ェチル、 n—プロピル、イソプロピル、 n—ブチル 2—ェチルブチ ル、イソブチル、 tert—ブチル、ペンチル、 n キシル等が挙げられる。
[0067] 前記スキーム 3において、まず、前記式 (VII— 1)で表される化合物を酸ィ匕して、前 記式 (XV)で表される化合物を得ることができる。酸化剤としては、例えば、 BaMnO
4 Collins試薬 [CrO (C H N) ] PCC (ピリジニゥムクロ口クロマート） (C H N+HCrO
3 5 5 2 5 5
CI—) DCC-DMSO (ジシクロへキシルカルボジイミドージメチルスルホキシド）等
3
が挙げられる。なお、前記式 (VII— 1)で表される化合物は、例えば、前記スキーム 2 中、前記式 (VII)中、 k 1 mおよび nが 1である式 (VII)の化合物であってもよい。そ の場合、前記式 (IV)中 k 1 mおよび nが 1である式 (IV)の化合物、例えばペンタエ リスリトールを出発原料として、前記スキーム 2に記載の製造方法に従い、前記式 (VI I)中、 k 1 mおよび nが 1である式 (VII)の化合物を製造してもよい。
[0068] 次に、前記式 (XV)で表される化合物に、イリドィ匕合物 (XVI)を反応させ、式 (XVII )で表される化合物を得ることができる。このイリドィ匕合物 (XVI)は、当業者に公知の Wittig反応、 Horner— Emmons反応等にぉ 、て調製されるイリド化合物製造方法に従 い、製造することができる。
[0069] 次に、前記式 (XVII)で表される化合物を接触還元し、次いでエステル（一 COOR) 部分を還元することにより、前記式 (VII— 2)で表される化合物を得ることができる。接 触還元は、例えば、遷移金属触媒の存在下、水素ガスにより行うことができる。前記 遷移金属触媒としては、例えば、白金、パラジウム (例えば、 Pd— C等）、ロジウム (例 えば、 Rh O等）、ルテニウム、ニッケル触媒等を用いることができる。前記エステル部
2 3
分の還元は、例えば、水素化リチルムアルミニウム (LiAlH )等を用いることができる
4
[0070] なお、前記式 (VII— 2)で表される化合物の製造は、例えば、公知文献を参考にし て行ってもよい。その公知文献としては、例えば、 Satoshi Shuto, Satoshi Niizuma and Akira atsuaa, One-pot conversion or a, b— unsaturated alcohols into the corresponding carbon-elongated dienes with a staole phosphorus ylide— B aMnO system. Synthesis of D -methylene derivatives of Neplanocin A as p
4
otential antiviral nucleosides. New Neplanocin analogues 11.〃, The Journal of Organic Chemistry, 1998年,第 63卷、 p.4489等が挙げられる。
[0071] また、前記式 (VII)中、 mが 2であり、 k、 1および nが 1である式 (VII— 3)で表される 化合物は、例えば、以下のスキーム 4に示すようにして製造してもよい。
[0072] [化 22]
Figure imgf000020_0001
(VII- 1) (XXI) (ΧΧΠ)
Figure imgf000020_0002
(VII-3)
スキーム 4
[0073] 前記式中、 Ruは、保護基であり、
R12および R13は、一緒になつて、式— CR15R16—で表される基であり、
前記 R15および R16は、互いに独立して、水素原子、低級アルキル基および低級アル コキシル基力 なる群力 選択されるいずれかであり、
X1および X4は、互いに独立して、ハロゲン原子であり、
Rは、低級アルキル基であり、 R5Qは保護基である。
[0074] 前記 R5Qにつ ヽて前記保護基とは、従来公知の 1級アルコールの保護基を用いるこ とができる。そのような保護基としては、例えば、 tert—ブチルジフエ-ルシリル (TBD PS)、 tert-ブチルジメチルシリル（TBDMS)、 4, 4'ージメトキシトリチル（DMTr)、 4 —モノメトキシトリチル（MMTr)、（9—フエ-ル）キサンテン— 9—ィル [ピキシル（pixy 1) ]、ァセチル (Ac)、ベンゾィル（Bz)等が、挙げられる。
[0075] 本発明において、前記 X4について、前記ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子 、臭素原子、ヨウ素原子等である。
[0076] 前記スキーム 4において、まず、前記式 (VII— 1)で表される化合物に、式 (XX)で 表される化合物とを、任意に塩基 (例えば、イミダゾール、 DABCO、トリェチルァミン 等)存在下に反応させ、前記式 (XXI)で表される化合物を得ることができる。なお、 前記式 (XX)で表される化合物は、公知文献を参考に自家製造してもよいし、市販で 人手してちょい。
[0077] 次に、前記式 (XXI)で表される化合物を、酸化して、前記式 (XXII)で表される化 合物を得ることができる。酸化は、前記スキーム 3において前記式 (VII— 1)で表され る化合物を酸ィ匕するのと同様の条件を用いて行うことできる。
[0078] 次に、前記式 (XXII)で表される化合物に、イリドィ匕合物 (XVI)を反応させ、式 (XX III)で表される化合物を得ることができる。このイリドィ匕合物 (XVI)は、前記スキーム 3 におけるイリドィ匕合物 (XVI)と同様のものを用いることができる。
[0079] 次に、前記式 (XXIII)で表される化合物を接触還元し、次いでエステル（一 COOR )部分を還元することにより、前記式 (XXIV)で表される化合物を得ることができること ができる。接触還元およびエステル部分の還元は、前記スキーム 3における前記式（ XVII)で表される化合物の接触還元およびエステル還元と同様の条件を用いて行う ことができる。
[0080] 次に、式 (XXIV)で表される化合物に、前記式 (V)で表される化合物とを反応させ 、その後、基 R5Qを除去して前記式 (VII— 3)で表される化合物を得ることができる。こ の式 (V)の化合物との反応条件は、前記スキーム 2における前記式 (IV)で表される 化合物と、前記式 (V)で表される化合物との反応条件と同様の条件を用いて行うこと ができる。また、前記基 R5°の除去は、 R∞の基に応じて、公知の除去方法を選択する ことができる。
[0081] このように、 k、 m、 1および nが 1〜10の整数である前記式 (VII)で表される化合物 は、従来公知な技術、すなわち、保護および脱保護と、イリド化合物を用いた増炭反 応を組み合わせることにより、製造することができる。
[0082] また、前記式 (I)中、 R1が、前記式（5)の基であり、 R2、 R3および R4が Hであり、下記 式 (III)で表されるヌクレオシド類似体またはその塩の製造方法の一例を説明する。
[0083] [化 23]
Figure imgf000022_0001
[0084] 前記式中、 k、 1、 mおよび nは、互いに独立して、 1〜10の整数である。
[0085] その製造方法を、例えば、以下のスキーム 5に示す。この製造方法によれば、例え ば、前記式 (ΧΙΠ)で表される化合物の、 Ru、 R12および R13を除去すること、および加 水分解により、式 (ΠΙ)で表されるヌクレオシド類似体またはその塩を得ることができる
[0086] [化 24]
Figure imgf000022_0002
(XIII) (III)
スキーム 5 [0087] 前記式中、 R11は、保護基であり、
R12および R13は、一緒になつて、式— CR15R16—で表される基であり、
前記 R15および R16は、互いに独立して、水素原子、低級アルキル基および低級アル コキシル基力 なる群力 選択されるいずれかであり、
X3は、ハロゲン原子であり、
k、 1、 mおよび nは、互いに独立して、 1〜10の整数である。
[0088] 本発明において、 X3について、前記ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭 素原子、ヨウ素原子等である。
前記式 (ΧΙΠ)で表される化合物の、 Ru、 R12および R13を除去するには、 RU、 R12お よび R13それぞれの基に応じて、公知の除去方法を選択することができる。例えば、 R1 1が tert—ブチルジフエ-ルシリル（TBDPS)、 tert-ブチルジメチルシリル（TBDMS) 等のシリル基である場合、トリブチルアンモ -ゥムフルオライド (TBAF)、塩ィ匕アンモ -ゥム等で処理することにより、 R11を除去することが可能である。また、例えば、 R12お よび R13が、一緒になつて、式— C (CH ) —で表される基である場合、酸 (例えば、トリ
3 2
フルォロ酢酸、塩酸、酢酸等)で処理することにより、 R12および R13を同時に除去する ことが可能である。
[0089] 前記式 (XII)で表される化合物の加水分解は、公知の除去方法を選択することが できる。例えば、酸 (例えば、トリフルォロ酢酸、塩酸、酢酸等)で処理することにより、 この加水分解を行うことが可能である。この酸処理により、例えば、前記式 (ΧΙΠ)中、 R12および R13が、一緒になつて、式— C (CH ) —で表される基である場合、加水分
3 2
解と R12および R13の除去とを同時に行うことができる。
[0090] なお、前記式 (ΧΙΠ)で表される化合物は、公知文献を参考に自家製造してもよ!/、し 、前記スキーム 1において、式 (XI)中、 R5が前記式（8)の基であるヌクレオシド類似 体の製造方法を参考に自家製造してもよ 、。
[0091] 次に、前記式 (I)中、 R1が、前記式（1)の基、前記式（1)の基において、その官能 基が保護基で保護された基、前記式 (2)の基、前記式 (2)の基において、その官能 基が保護基で保護された基、前記式 (3)の基、前記式 (3)の基において、その官能 基が保護基で保護された基、前記式 (4)の基、前記式 (4)の基において、その官能 基が保護基で保護された基、前記式 (5)の基において、その官能基が保護基で保 護された基、前記式 (6)の基、前記式 (6)の基において、その官能基が保護基で保 護された基、前記式 (7)の基、前記式 (7)の基において、その官能基が保護基で保 護された基、前記式 (8)の基、および前記式 (8)の基において、その官能基が保護 基で保護された基力 なる群力 選択されるいずれかの基であり、 R2が保護基であり 、 R3が保護基であり、 R4が固相合成用活性化リン酸基であり、下記式 (XXXIV)で表 されるヌクレオシド類似体またはその塩の製造方法の一例を説明する。
[0092] [化 25]
Figure imgf000024_0001
[0093] 前記式 (XXXIV)において、 R5は、前記式（1)の基、前記式（1)の基において、そ の官能基が保護基で保護された基、前記式 (2)の基、前記式 (2)の基において、そ の官能基が保護基で保護された基、前記式 (3)の基、前記式 (3)の基において、そ の官能基が保護基で保護された基、前記式 (4)の基、前記式 (4)の基において、そ の官能基が保護基で保護された基、前記式 (5)の基において、その官能基が保護 基で保護された基、前記式 (6)の基、前記式 (6)の基において、その官能基が保護 基で保護された基、前記式 (7)の基、前記式 (7)の基において、その官能基が保護 基で保護された基、前記式 (8)の基、および前記式 (8)の基において、その官能基 が保護基で保護された基カゝらなる群カゝら選択されるいずれかの基であり、 R11は、保 護基であり、 R22は、保護基であり、 R23は、固相合成用活性化リン酸基である。
[0094] 本発明において、 R22について前記保護基とは、従来公知の 1級アルコ―ルの保護 基を用いることができる。そのような保護基としては、例えば、 4, 4'ージメトキシトリチ ル（DMTr)、 tert-ブチルジメチルシリル（TBDMS)、 4 モノメトキシトリチル（MMT r)、TBDPS、（9 フエ-ル）キサンテン 9ーィル [ピキシル（pixyl) ]等力 挙げられ る。
[0095] 本発明において、 R23について前記固相合成用活性化リン酸基としては、固相合成 において従来公知のリン酸基を用いることができ、例えば、ホスホロアミダイト、ホスホ ナート、チォホスファイト等を形成するリン酸基が挙げられる。ホスホロアミダイトを形 成する、固相合成用活性化リン酸基としては、例えば、下記式（10)で表される基が 挙げられる。
[0096] [化 26]
Figure imgf000025_0001
[0097] その製造方法を、例えば、以下のスキーム 6に示す。
[化 27]
R22- X5
Figure imgf000025_0002
(XXXIV)
スキーム 6
[0098] 前記式において、 R5は、前記式（1)の基、前記式（1)の基において、その官能基が 保護基で保護された基、前記式 (2)の基、前記式 (2)の基において、その官能基が 保護基で保護された基、前記式 (3)の基、前記式 (3)の基において、その官能基が 保護基で保護された基、前記式 (4)の基、前記式 (4)の基において、その官能基が 保護基で保護された基、前記式 (5)の基において、その官能基が保護基で保護され た基、前記式 (6)の基、前記式 (6)の基において、その官能基が保護基で保護され た基、前記式 (7)の基、前記式 (7)の基において、その官能基が保護基で保護され た基、前記式 (8)の基、および前記式 (8)の基において、その官能基が保護基で保 護された基力もなる群力も選択されるいずれかの基であり、 R11は、保護基であり、 R22 は、保護基であり、 R23は、固相合成用活性化リン酸基であり、 X5および X6はハロゲン 原子である。 [0099] 本発明にお 、て、 X5および X6につ 、て前記ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原 子、臭素原子、ヨウ素原子等である。
[0100] その製造方法によれば、例えば、前記式 (XI)で表される化合物の、 R12および R13を 除去して、式 (XXX)で表される化合物を得ることができる。前記式 (XI)で表される化 合物の、 R12および R13を除去するには、 R12および R13それぞれの基に応じて、公知の 除去方法を選択することができる。例えば、 R12および R13が、一緒になつて、式— C ( CH ) 一で表される基である場合、酸 (例えば、トリフルォロ酢酸、塩酸、酢酸等)で
3 2
処理することにより、 R12および R13を同時に除去することが可能である。
[0101] 次 ヽで、例えば、前記式 (XXX)で表される化合物を、式 (XXXI)で表される化合 物と、任意に塩基 (例えば、ピリジン等）、触媒 (例えば、ジメチルァミノピリジン等)等 の存在下に、反応させ、式 (XXXII)で表される化合物を得ることができる。式 (XXXI
)で表される化合物は、市販で入手してもよいし、公知文献を利用して自家製造して ちょい。
[0102] そして、例えば、前記式 (ΧΧΧΠ)で表される化合物に、式 (ΧΧΧΙΠ)で表される化 合物を、任意に塩基 (例えば、ジイソプロピルェチルァミン等)等の存在下に縮合させ
、前記式 (XXXIV)で表される化合物を得ることができる。
[0103] また、前記式 (I)中、 R1が、前記式 (5)の基であり、 R2が保護基であり、 R3が保護基 であり、 R4が固相合成用活性化リン酸基であり、下記式 (XXXVII)で表されるヌクレ オシド類似体またはその塩の製造方法の一例を説明する。
[0104] [化 28]
Figure imgf000026_0001
[0105] 前記式 (XXXVII)中、 R11は、保護基であり、 R ま、保護基であり、 は、固相合 成用活性化リン酸基であり、 X3は、ハロゲン原子であり、 k、 1、 mおよび nは、互いに独 立して、 1〜10の整数である。
その製造方法を、例えば、以下のスキーム 7に示す。
[化 29]
Figure imgf000027_0001
(XXXVII)
スキー厶 7
[0107] 前記式中、 R11は、保護基であり、 R22は、保護基であり、 R23は、固相合成用活性ィ匕 リン酸基であり、 X3、 X5および X6は、ハロゲン原子であり、 k、 1、 mおよび nは、互いに 独立して、 1〜10の整数である。
[0108] その製造方法によれば、例えば、前記式 (ΧΠΙ)で表される化合物の、 R12および R13 を除去して、式 (XXXV)で表される化合物を得ることができる。前記式 (ΧΙΠ)で表さ れる化合物の、 R12および R13を除去するには、 R12および R13それぞれの基に応じて、 公知の除去方法を選択することができる。例えば、 R12および R13が、一緒になつて、 式 C (CH ) 一で表される基である場合、酸 (例えば、トリフルォロ酢酸、塩酸、酢酸
3 2
等)で処理することにより、 R12および R13を同時に除去することが可能である。
[0109] 次 ヽで、例えば、前記式 (XXXV)で表される化合物を、式 (XXXI)で表される化合 物と、任意に塩基 (例えば、ピリジン等）、触媒 (例えば、ジメチルァミノピリジン等)等 の存在下に、反応させ、式 (XXXVI)で表される化合物を得ることができる。式 (XXX I)で表される化合物は、市販で入手してもよいし、公知文献を利用して自家製造して ちょい。
[0110] そして、例えば、前記式 (XXXVI)で表される化合物に、式 (ΧΧΧΙΠ)で表される化 合物を、任意に塩基 (例えば、ジイソプロピルェチルァミン等)等の存在下に縮合させ
、前記式 (XXXVII)で表される化合物を得ることができる。
[0111] つぎに、本発明のオリゴヌクレオチド類似体の製造方法の一例について説明する。
まず、例えば、本発明のヌクレオシド類似体の 3つの水酸基の内 1つを、固相合成用 活性化リン酸基で活性化させ、残りの 2つの水酸基を保護した化合物を用意する。そ の化合物としては、例えば、前記式 (XXXIV)で表わされる化合物または前記式 (XX XVII)で表わされる化合物を用いることができる。その固相合成用活性化リン酸基と しては、固相合成において従来公知のリン酸基を用いることができ、例えば、ホスホロ アミダイト、ホスホナート、チォホスファイト等を形成するリン酸基が挙げられる。そして 、本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、例えば、この活性ィ匕化合物を、オリゴヌタレ ォチド合成分野で従来公知の技術を用いて、オリゴヌクレオチド類似体の配列に従
V、、ヌクレオシドを順次固相上でカップリングさせて行うことができる。
[0112] なお、ヌクレオシド、カップリング試薬、脱保護試薬、洗浄試薬等は、通常核酸固相 合成に用いられるものを用いる。得られた固相担体上のオリゴヌクレオチド類似体は 、必要であればオリゴヌクレオチド側鎖の脱保護を行った後、固相担体力 切り出し て、粗オリゴヌクレオチド類似体を得る。切り出しに用いる試薬は、固相担体およびリ ンカー（固相担体とオリゴヌクレオチド類似体を接続する部分)構造等に応じて、従来 公知の試薬から、適宜選択することができる。この粗オリゴヌクレオチド類似体は、必 要であれば、 HPLC等で精製してもよい。
[0113] 次に、オリゴヌクレオチド類似体が二本鎖である場合の製造について例を挙げて説 明する。例えば前記のような方法に従い、一本鎖のオリゴヌクレオチド類似体をまず 製造する。そのオリゴヌクレオチド類似体と相補的な配列を有する、一本鎖の天然ォ リゴヌクレオチドも別途、従来公知の方法に従い、製造する。次いで、得られた一本 鎖のオリゴヌクレオチド類似体をアニーリング用緩衝液中に溶解させたものと、一本 鎖の天然オリゴヌクレオチドをアニーリング用緩衝液中に溶解させたものとを、例えば 混合し、加熱処理し、その後、徐々に室温まで冷却させて、二本鎖のオリゴヌクレオ チド類似体を得ることができる。この二本鎖のオリゴヌクレオチド類似体は、必要に応 じて、フエノール Zクロ口ホルム抽出、エタノール沈殿等をさらに行って、単離精製す ることがでさる。
[0114] なお、スキーム 1〜7の各工程において、必要であれば、各官能基に保護基を導入 したり、保護基を脱保護したり、保護基を変更してもよい。なお、官能基の種類に応じ た保護基の選択、保護基の導入および保護基の除去は、当該分野で公知の方法に 従い、行うことができ、例えば、「有機合成における保護基（"Protective Groups in Organic synthesis j , T. Greeneら著、 John Wiley & ¾ons, Inc.出版」等を参照 することができる。
実施例
[0115] 本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
DMAP : 4-ジメチルァミノピリジン （4- dimethylaminopyridine )
TBAF： トリブチルアンモ -ゥムフルオライド（tributylammoniumfluoride)
TBDPS - C1： tert -ブチルジフエ-ルシリルクロライド（tert- butyldiphenylsilylchlori de)
TFA：トリフルォロ酢酸（Trifluoroacetic acid)
Ar:ァノレゴン (Argon)
THF：テトラヒドロフラン（tetrahydroforan)
TEAA: 酢酸トリェチルアンモ-ゥム塩（Triethylammmoium Acetate)
[0116] (実施例 1)
9— (2, 2 ジヒドロキシメチル— 3 ヒドロキシプロピル）アデニンの製造
[0117] (1) l—tーブチルージフエ-ルシリルォキシ 2, 2 ジヒドロキシメチルー 3 プ ロノヽノ ~~ノレ (1— t— butyl— diphenylsilyloxy— 2,2— dihydroxymethyl— 3— propanol)の製造 ペンタエリスリトール（3. 00g、 22. 02mmol)とイミダゾール（3. 30g、 44. 04mmo 1)を乾燥させ、アルゴン雰囲気下において DMF (28. 5ml)に溶解させた。その溶液 に、 TBDPS— C1 (2. 22g、 24. 2mmol)をゆっくり滴下して加え、その混合物を室 温にて 5時間撹拌した。混合物から溶媒を留去後、得られた残渣を、酢酸ェチルと水 力 抽出した。抽出した酢酸ェチル溶液を、飽和 NaClaqで洗浄し、無水硫酸ナトリ ゥムで乾燥した。その酢酸ェチル溶液カゝら溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲル カラムクロマトグラフィー（CHC1 : MeOH= l : 0〜20 : l)で精製して、無色透明オイ
3
ル状の表題ィ匕合物を得た。（収量 5. 17g、 13. 82mmol、収率 62%)
[0118] JHNMR (400MHz, CDC1 ) δ ; 7.56 (4H, s, フエ-ノレ ), 7.32 ( 6H, s, フエ
3
二ノレ ), 3.57(8H, d, J = 30.8, CH— 1,2,2,3), 2.90 (3H, m, OH), 0.98 (9H,
2
s, ter-ブチノレ ).
[0119] (2) 2, 2 ジメチルー 5—t ブチルージフエ-ルシリルォキシルメチルー 5 ヒド 口キシメチル一 1, 3 ジォキサン（2,2- dimethy卜 5- 1- buty卜 diphenylsilyloxylmethy卜 5 - hydroxymethyト 1,3- dioxan)の製造
1 t ブチル ジフエニルシリルォキシ 2, 2 ジヒドロキシメチル 3 プロパノ ール（3. 50g、 9. 35mmol)および p トルエン安息香酸一水和物（2. 18g、 11. 2 2mmol)とを、アセトン（100ml)中で溶解した。その溶液に、 o ギ酸ェチル（20ml) を加え、その混合物を室温で 2時間攪拌した。その混合物を希アンモニア水で中和 して反応を停止した後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグ ラフィー（n— Hex： EtOAc = 20： 1〜 5： 1 )で精製して、黄色オイル状の表題化合物 を得た。（収量 3. 76g、 8. 98mmol、収率 96%)
[0120] JHNMR ( 400MHz, CDC1 ) δ ; 7.67 ( 5H, d, J=6.4 Hz, フエ-ノレ ), 7.40
3
( 5H, q, J = 8.0 Hz, フエ-ノレ ), 3.74 (8H, m, CH2— 4,5,5,6), 1.40 ( 6 H, d, J = 9.8 Hz, CH— 2,2 ), 1.062 ( 9H, s, ter—ブチノレ ).
3
[0121] (3) 2, 2 ジメチルー 5—t ブチルージフエ-ルシリルォキシルメチルー 5 トル エンスルホ-ルメチルー 1, 3 ジォキサン（2,2- dimethy卜 5- 1- buty卜 diphenylsilyloxyl methyl- 5- tolueneslufonylmethyト 1 ,3- dioxan)の製造
2, 2—ジメチル 5— t ブチル ジフエニルシリルォキシルメチル 5—ヒドロキシ メチル 1, 3 ジォキサン（1. 66g、 4. Olmmol)の CH CI (50ml)中溶液に、 D
2 2
MAP (1. 47g、 12. 03mmol)を加え、さらに氷冷下にて 5 トルエンスルホ-ルメチ ルクロライド（2. 29g、 12. 03mmol)を加えて、その混合物を約 5時間攪拌した。そ の混合物を、 CH C1および飽和 NaHCO水溶液で抽出および洗浄した。得られた
3 3
有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥し、有機溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカ ゲルカラムクロマトグラフィー（CHC1 : MeOH= 100 : l〜20 : l)で精製して、白色結
3
晶の表題ィ匕合物を得た。（収量 1. 7787g、3. 12mmol、収率 78%)
[0122] JHNMR ( 400MHz, CDC1 ) δ ; 7.66 ( 5H, m, フエ-ノレ ), 7.35 ( 9H, m
3
, フエ-ノレ ), 3.82 ( 4Η, s, CH— 4,6 ), 3.74 ( 4H, s, CH— 5, 5 ), 1.38 (
2 2
6H, s, CH— 2, 2 ), 1.05 ( 9H, s, ter—ブチノレ ), 1.05 ( 3H, s, Ts— Me )
3
[0123] (4) 2, 2 ジメチルー 5—t ブチルージフエ-ルシリルォキシルメチルー 5—(ァ デニンー9ーィルーメチル） 1, 3 ジォキサン（2,2- dimethy卜 5- 1- butyHiiphenylsil yloxylmethyi— 5— ( adenine— 9— yト metnyl ノ一 1,3— dioxanノの^造
2, 2—ジメチル 5— t ブチル ジフエニルシリルォキシルメチル 5—トルエン スルホ -ルメチル— 1, 3 ジォキサン（3. 48g、 6. 12mmol)に、アデニン（1. 65g 、 12. 2mmol)、炭酸カリウム（1. 27g、 9. 17mmol)、 18 クラウン一 6 エーテル (1. 94g、 7. 34mmol)をカ卩え、ー晚乾燥させた。その混合物に DMF ( 150ml)をカロ え、得られた混合物を 55°Cオイルバスで 48時間加熱した。その混合物に、 n—へキ サンおよび酢酸ェチルの混合物（n— Hex:EtoAc= 1： 1)および水を加えて、抽出 した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去 した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHC1： MeOH= 100： 1
3
〜30 : 1)で精製して、白色結晶の表題ィ匕合物を得た。 （収量 2. 49g、4. 69mmol、 収率 76. 6%)
[0124] 'HNMR ( 400MHz, CDC1 ) δ ;8.26 ( 1H, d, J = 2.0Hz, CH—アデニン— 2
3
), 7.76 ( 1H, d, J = 2.4Hz, CH—アデ-ン— 8 ), 7.61 ( 4H, m, フエ-ル ), 7.40 ( 6H, m, フエ-ル ), 5.85 ( 2H, s, NH -アデ-ン- 6 ), 2.58 ( 8H,
2
s, CH - 4, 5, 5, 6 ), 1.44 ( 3H, s, CH - 2 ), 1.35 ( 3H, s, CH - 2 ), 1
2 3 3
.10 ( 9H, s, ter-ブチノレ ) ;
Mass ( EI ) m/z ： 532.2666 ( M+ ) 516, 474, 416, 386, 366.
[0125] (5) 9— (2, 2 ジヒドロキシメチル— 3— t—ブチル—ジフエ-ルシリルォキシルメ チノレプロピノレ）アデ-ン（9- (2,2- dihydroxymethy卜 3- 1- buty卜 diphenylsilyloxylmethylp ropyl ) adenine)の製造 2, 2 ジメチル 5 t ブチル ジフエ-ルシリルォキシルメチル 5 (アデ- ン— 9—ィル—メチル）—1, 3 ジォキサン（1. 23g、 2. 32mmol)の THF (20ml) 中溶液に、 TBAF (5ml)を加えて、その混合物を室温で 3時間撹拌した。その混合 物から溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHC1 ： MeOH= 100 : l〜： LO : l)で精製して、白色結晶の表題化合物を得た。（収量 0. 7
3
8g、 1. 59mmol、収率 95%)
[0126] 'HNMR ( 400MHz, CDC1 ) δ ;8.04 ( 1H, s, CH—アデニン— 2 ), 7.87 (
3
1H, s, CH-アデ-ン- 8 ), 7.57 ( 4H, m, フエ-ル ), 7.57 ( 6H, m, フエ二 ル ；)， 7.18 ( 2H, s, NH -アデ-ン- 6 ), 5.07 ( 1H, t, J = 5.6Hz , 5- OH
2
), 3.20 ( 8Η, s, CH -4, 5, 5, 6 ), 1.21 ( 3H, s, CH— 2 ), 1.17 ( 3H,
2 3
s, CH -2 ), 0.84 ( 9H, s, ter—ブチノレ ) ;
3
Mass ( EI ) m/z ： 293.1488 ( M+ ) 278, 235, 206, 188, 148 ;
Anal, calcd for C H N O - 1/4 EtOH ： C, 53.19; H, 6.78; N, 22.97. foun
13 19 5 3
d: C, 53.03; H, 6.59; N, 22.94.
[0127] (6) 9- (2, 2 ジヒドロキシメチル一 3 ヒドロキシプロピル）アデニン（9- (2,2- dih ydroxymethyl-3-hydroxypropyl)adenine)の製造
9 (2, 2 ジヒドロキシメチルー 3—t—ブチルージフエニルシリルォキシルメチル プロピル）アデニン（30. 2mg、 0. 103mmol)の THF溶液に、 TFA(lml)をカ卩えて 、その混合物を 2時間撹拌した。その混合物に、水およびメタノールをカ卩え、その後、 混合物から溶媒を除去して減圧乾固した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグ ラフィー（CHC1： MeOH = 30 : l〜： L0 : 1)で精製して、表題ィ匕合物を得た。（収量 1
3
8mg、 0. 071mmol、収率 69%)
[0128] 'HNMR ( 400MHz, CDC1 ) δ ;8.30 ( 1H, s, CH—アデニン— 2 ), 8.20 (
3
1H, s, CH-アデニン- 8 ), 7.56 ( 2H, s, NH -アデニン- 6 ), 4.08 ( 3H, s,
2
OH- 2, 2, 3 ), 3.24 ( 8H, m, , CH - 1, 2, 2, 3 ) ;
2
Mass ( EI ) m/z ： 253.1175 ( M+ ) 253, 242, 222, 204, 188 ;
HRMS ( EI ) Calcd for C H O N 253.1175 Found 253.1172.
10 15 3 5
[0129] (実施例 2) 9- (2, 2 ジヒドロキシメチル一 3 ヒドロキシプロピル）グァニンの製造
[0130] (1) 2, 2 ジメチルー 5—t ブチルージフエ-ルォキシルメチルー 5—（2 アミ ノ一 6 クロ口プリン一 9—ィノレ一メチノレ）一 1, 3 ジォキサン（2,2- dimethyl- 5- 1- But hyト diphenyioxylmethyト 5- (2- amino- 6- chrolopurine- 9- yト methyl)- 1 ,3-dioxanノの製 造
2, 2—ジメチル 5— t ブチル ジフエニルシリルォキシルメチル 5—トルエン スルホ -ルメチル一 1, 3 ジォキサン（5. 88g、 10. 34mmol)、 2 ァミノ一 6 クロ 口—プリン（3. 51g、 12. 41mmol)、炭酸カリウム（2. 14g、 15. 51mmol)および 1 8 クラウン 6 エーテル（3. 28g、 12. 41mmol)をそれぞれー晚真空乾燥させ た。それらを、 DMF (170ml)に溶解させ、その溶液を 55°Cで 36時間加熱した。反 応混合物から溶媒を留去し、得られた残渣に n キサンおよび酢酸ェチルの混合 物（n— Hex:EtoAc= 1： 1)および水をカ卩え、抽出した。得られた有機層を、飽和食 塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層から溶媒を留去し、得られた残渣 をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHC1： MeOH= 100： 1〜20： 1)で精製して
3
、白色結晶の表題ィ匕合物を得た。（収量 2. 24g、 5. 27mmol、収率 51%)
[0131] 'HNMR ( 400MHz, CDC1 ) δ ;8.02 ( 1H, s, CH—プリン— 2 ), 7.78 ( 1H,
3
s, CH—プリン— 8 ), 7.61 ( 4H, m, フエ-ノレ ), 7.40 ( 6H, m, フエ-ノレ ), 6.61 ( 2H, s, NH—プリン— 2 ), 2.12 ( 3H, s, OH-3',4',5' ), 3.87 ( 2H, s,
2
CH ) 3.22 ( 6H, s, CH ) ;
2 2
Mass ( EI ) m/z ： 565.2276 ( M+ ) 550, 508, 450, 430, 420 ;
Anal, calcd for C H C1N O Si : C, 61.52; H, 6.41; N, 12.37. found: C,
29 36 5 3
61.58; H, 6.44; N, 12.24.
[0132] (2) 2, 2 ジメチル一 5— (2 ァミノ一 6 クロ口プリン一 9—ィル一メチル）5 ヒ ドロキシメチルー 1, 3 ジォキサン（2,2- dimethy卜 5- (2- amino- 6- chrolopurine- 9- y卜 methyl)5-hydroxym ethyl- 1,3-dioxan)の製造
2, 2 ジメチルー 5—t—ブチルージフエニルォキシルメチルー 5—（2 アミノー 6 —クロ口プリン一 9—イノレーメチノレ）一 1, 3 ジォキサン（426mg、 0. 783mmol)に 、 Ar置換下、 THF (約 lml)を加えて溶解させた。その溶液に TBAF (lml)をカロえ、 その混合物を約 2時間攪拌した。その混合物力も溶媒を留去し、得られた残渣をシリ 力ゲルカラムクロマトグラフィー（CHC1 : MeOH= 100 : l〜20 : l)で精製して、白色
3
結晶の表題化合物を得た。（収量 216mg、 0. 704mmol、収率 90%)
[0133] 'HNMR ( 400MHz, CDC1 ) δ ; 7.80 ( 1H, s, CH— 2—ァミノ— 6—クロ口プリン— 8
3
), 5.16 ( 2H, s, NH—2—ァミノ— 6—クロ口プリン— 2 ), 4.43 ( 2H, s, CH ), 3.
2 2
77 ( 2H, d, J=12.0Hz, CH ), 3.58 ( 2H, d, J = 13.0Hz, CH ), 1.591 (
2 2
1H, s, OH ), 1.59 ( 3H, s, CH ), 1.51 ( 3H, s, CH ).
3 3
[0134] (3) 9- (2, 2 ジヒドロキシメチル一 3 ヒドロキシプロピル）グァニン（9- (2,2- dihy droxymethyl-3-hydroxypropyl)guanine)の製造
2, 2 ジメチル一 5— (2 ァミノ一 6 クロ口プリン一 9—ィル一メチル）5 ヒドロ キシメチル— 1, 3 ジォキサン（58mg、 0. 187mmol)に 50%TFA(7. 84ml)をカロ え、その混合物を約 2時間攪拌した。その混合物に水およびメタノールを加え、その 後、混合物カゝら溶媒を除去して減圧乾固した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロ マトグラフィー（CHC1： MeOH = 30 : l〜： L0 : 1)で精製して、表題ィ匕合物を得た。（
3
収量 31mg、0. 118mmol、収率 63%)
[0135] JHNMR ( 400MHz, CDC1 ) δ ; 10.66 ( 1H, s, NH— 1 ), 7.62 ( 1H, s,
3
CH— 8 ), 6.61 ( 2H, s, NH— 2 ), 2.12 ( 3H, s, OH-3',4',5' ), 3.87 ( 2H,
2
s, CH ) 3.22 ( 6H, s, CH ) ;
2 2
Mass ( EI ) m/z ： 269.1124 ( M+ ) 269, 238, 220, 191, 165 ;
HRMS (EI) Calcd for 269.1124 Found 269.1118.
[0136] (実施例 3)
1— (2, 2 ジヒドロキシメチル一 3 ヒドロキシプロピル）ゥラシルの製造
[0137] (1) 2, 2 ジメチルー 5— t ブチル—ジフエ-ルォキシルメチル— 5— (ゥラシル
—9—ィル一メチル） 1, 3 ジォキサン（2,2- dimethy卜 5- 1- ButhyHiiphenyloxylmet hyl-5-(uracil-9-yl-methyl)-l,3-dioxan)の製造
2, 2—ジメチル 5— t ブチル ジフエニルシリルォキシルメチル 5—トルエン スルホ -ルメチル一 1, 3 ジォキサン（3. 65g、 6. 41mmol)、ゥラシル（1. 43g、 1
2. 83mmol)、炭酸カリウム（1. 06g、 7. 70mmol)および 18 クラウン一 6 エー テル（2. 04g、 7. 70mmol)をそれぞれー晚真空乾燥させた。それらを DMF (70ml )および DMSO (30ml)に溶解させ、その溶液を 55°Cで 36時間加熱した。反応混合 物から溶媒を留去し、得られた残渣に n キサンおよび酢酸ェチルの混合物（n— Hex:EtoAc = l： 1)および水をカ卩え、抽出した。得られた有機層を、飽和食塩水で 洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層から溶媒を留去し、得られた残渣をシリカ ゲルカラムクロマトグラフィー（CHC1 : MeOH= 100 : l 50 : l)で精製したn得られ
3
た無色透明のオイル状ィ匕合物を、ジェチルエーテルにて結晶化し、白色結晶の表題 化合物を得た。（収量 1. 62g、 3. 19mmol、収率 50%)
[0138] JHNMR ( 400MHz, CDC1 ) δ : 11.2 ( 1H, s, NH ), 7.63 ( 4H, m, Phe
3
), 7.44 ( 7H, m, Phe, CH-ゥラシル- 6 ), 5.45 ( 1H, d, J=10.4 Hz, CH-ゥ ラシノレ— 5 ), 3.09 ( 8H, m, CH— 4, 5, 5, 6 ), 1.31 ( 3H, s, CH— 2 ), 1.2
2 3
0 ( 3H, s, CH -2 ), 1.00 ( 9H, s, t—ブチノレ ) ;
3
Mass (FAB+) m/z ： 508.2394(M+ + H), 451, 307, 289, 154, 107 ;
Anal, calcd for C H N O Si : C, 66.11; H, 7.13; N, 5.51. found: C, 66.0
28 36 3 5
8; H, 7.03; N, 5.37.
[0139] (2) 2, 2 ジメチル— 5— (ゥラシル— 9—ィル—メチル）5 ヒドロキシメチル— 1, 3 -ジォキサン（2,2— dimethy卜 5— (uraci 9— yhnethyl)5— hydroxymethy卜 1 ,3— dioxan) の製造
2, 2 ジメチル 5 t ブチル ジフエ-ルォキシルメチル 5 (ゥラシル - 9 —ィル—メチル）— 1, 3 ジォキサン（200mg、 0. 39mmol)に、 Ar置換下、 THF ( 10ml)加えて溶解させた。その溶液に TBAF (3ml)を加え、その混合物をー晚攪拌 した。その混合物から溶媒を留去し、得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフ ィー（CHC1 : 1^^011= 100 : 1 20 : 1)で精製して、白色結晶の表題化合物を得た
3
。 （収量 94mg、 0. 35mmol、収率 89%)
[0140] Mass ( EI ) m/z ： 270.1216 ( M+ ) 255, 213, 194, 181, 166 ;
Anal, calcd for C H N O · 1/6 H O : C, 52.74; H, 6.76; N, 10.25. found:
12 18 2 5 2
C, 52.55; H, 6.43; N, 10.18.
[0141] (3) 1— (2, 2 ジヒドロキシメチル一 3 ヒドロキシプロピル）ゥラシル（1- (2,2- dihy droxymethyl-3-hydroxypropyl)uracil)の製造
2, 2 ジメチルー 5— (ゥラシルー 9—ィル—メチル）5 ヒドロキシメチル— 1, 3- ジォキサン（34mg、 0. 124mmol)に 30%TFA(10ml)を加え、その混合物を約 2 時間攪拌した。その混合物に水およびメタノールを加え、その後、混合物から溶媒を 除去して減圧乾固した。得られた残渣を、 n キサンおよびエーテルの混合物 (n —へキサン: Et 0 = 1 : 1)から結晶化させ、白色結晶の表題化合物を得た (収量 20
2
mg、 0. 087mmol、収率 70%)。
[0142] Mass ( EI ) m/z ： 230.0903 ( M+ ) 212, 200, 182, 166, 152 ;
Anal, calcd for C H N O ： C, 46.95; H, 6.13; N, 12.17. found: C, 46.
13 20 2 5
82; H, 5.97; N, 11.97.
[0143] (実施例 4)
1— (2, 2 ジヒドロキシメチル一 3 ヒドロキシプロピル）シトシンの製造
[0144] (1) 2, 2 ジメチルー 5—t ブチルージフエ-ルォキシルメチルー 5 （シトシン —9—ィル一メチル） 1, 3 ジォキサン（2,2- dimethy卜 5- 1- ButhyHiiphenyloxylmet hyト 5- (cytosme- 9- yhnetnyl)- 1 ,3- dioxan)の製造
2, 2—ジメチル 5— t ブチル ジフエニルシリルォキシルメチル 5—トルエン スルホ -ルメチル— 1, 3 ジォキサン（2. 80g、 4. 92mmol)、シトシン（1. 09g、 9 . 84mmol)、炭酸カリウム（0. 82g、 5. 91mmol)および 18 クラウン一 6 エーテ ル（1. 56g、 5. 9 lmmol)をそれぞれー晚真空乾燥させた。それらを、 DMF (30ml )および DMSO ( 10ml)に溶解させ、その溶液を 60°Cで 4日間加熱した。反応混合 物から溶媒を留去し、得られた残渣に n キサンおよび酢酸ェチルの混合物（n— Hex:EtoAc = l： 1)および水をカ卩え、抽出した。得られた有機層を、飽和食塩水で 洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層から溶媒を留去し、得られた残渣をシリカ ゲルカラムクロマトグラフィー（CHC1 : MeOH= 100 : l〜20 : l)で精製して、白色結
3
晶の表題ィ匕合物を得た。（収量 1. 20g、 2. 37mmol、収率 48%)
[0145] JHNMR ( 400MHz, CDC1 ) δ ； 7.65 ( 4Η, m, フエ-ノレ ), 7.40 ( 6H,
3
m, フエ-ノレ ), 7.26 ( 1H, s, 2— CH ), 5.32 ( 1H, d, J = 6.8 Hz 3— CH ), 3.78 ( 8H, m, CH ), 1.65 ( 2H, s, 4- NH ), 1.43 ( 3H, s, CH - 2 ), 1.34 ( 3H, s, CH -2 ), 1.11 ( 9H, s, ter-ブチノレ ) ;
3
Mass ( EI ) m/z ： 507.2553 ( M+ ) 492, 450, 392, 362, 292 ;
Anal, calcd for C H N O Si' 1/6 Hex ： C, 66.72; H, 7.59; N, 8.05. found
28 37 3 4
： C, 66.68; H, 7.53; N, 7.85.
[0146] (2) 2, 2 ジメチル— 5— (シトシン— 9—ィル—メチル）5 ヒドロキシメチル— 1, 3―ンォキサン (2,2— dimethyl— 5— (cytosine— 9— yl— methyl)5— hydroxymethyl— 1 ,3— dioxan )の製造
2, 2 ジメチル 5 t ブチル ジフエニルォキシルメチル 5 (シトシン 9— ィル—メチル）—1, 3 ジォキサン（200mg、 0. 39mmol)に、 Ar置換下、 THF (10 ml)を加えて溶解させた。その溶液に TBAF (lml)を加え、その混合物を約 2時間攪 拌した。その混合物から溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトダラ フィー（CHC1 : 1^011= 100 : 1 20 : 1)で精製して、白色結晶の表題化合物を得
3
た。（収量 95mg、 0. 35mmol、収率 91%)
Mass ( EI ) m/z ： 269.1376 ( M+ ) 254, 211, 201, 182, 164.
[0147] (3) 1— (2, 2 ジヒドロキシメチル一 3 ヒドロキシプロピル）シトシン（1- (2,2- dihy droxymethyl-3-hydroxypropyl)cytosine)の製造
2, 2 ジメチル— 5— (シトシン— 9—ィル—メチル）5 ヒドロキシメチル— 1, 3 ジ ォキサン（34mg、 0. 122mmol)に 30%TFA(10ml)を加え、その混合物を約 2時 間攪拌した。その混合物に水およびメタノールを加え、その後、混合物から溶媒を除 去して減圧乾固した。得られた残渣を、 n キサンおよびエーテルの混合物 (n— へキサン: Et 0 = 1 : 1)力も結晶化させ、白色結晶の表題化合物を得た (収量 20mg
2
、 0. 087mmol、収率 69%)。
[0148] JHNMR ( 400MHz, DMSO— d ) δ ; 7.66 (1H, s, 6— CH) , 5.85 (1H, s, C
6
H-5), 4.63 (3H, s, OH— 2,2,3), 3.69 (2H, s, NH— 2), 3.24 (8H, s, CH— 1,2
2 2
,2,3).
[0149] (実施例 5)
1— (2, 2 ジヒドロキシメチル一 3 ヒドロキシプロピル）チミンの製造
[0150] (1) 2, 2 ジメチルー 5—t ブチルージフエ-ルォキシルメチルー 5—(チミン 9 イノレーメチノレ） 1, 3 ジォキサン（2,2- dimethy卜 5- 1- Buthy卜 diphenyloxylmethy 卜 5- (thymine - 9- yHnethyl)- 1,3- dioxan)の製造
2, 2—ジメチル 5— t ブチル ジフエニルシリルォキシルメチル 5—トルエン スルホ -ルメチル— 1, 3 ジォキサン（2. 80g、 4. 92mmol)、チミン（1. 24g、 9. 8 4mmol)、炭酸カリウム（0. 82g、 5. 91mmol)および 18 クラウン一 6 エーテル（ 1. 56g、 5. 9 lmmol)をそれぞれー晚真空乾燥させた。それらを、 DMF (30ml)お よび DMSO (lOml)に溶解させ、その溶液を 60°Cで 4日間加熱した。反応混合物か ら溶媒を留去し、得られた残渣に n—へキサンおよび酢酸ェチルの混合物（n— Hex ： EtoAc = l： 1)および水を加え、抽出した。得られた有機層を、飽和食塩水で洗浄 し、硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層から溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲル カラムクロマトグラフィー（CHC1 : MeOH= 100 : l〜20 : l)で精製して、白色結晶
3
の表題化合物を得た。（収量 1. 25g、 2. 41mmol、収率 49%)
[0151] JHNMR ( 400MHz, CDC1 ) δ ;8.16 ( 1H, s, NH— 3 ), 7.62 ( 4H, m,
3
フエ-ノレ ), 7.42 ( 6H, m, フエ-ノレ ), 7.13 ( 1H, s, 6— CH ), 3.69 ( 8H, m, CH ), 1.72 ( 3H, s, 5— Me), 1.43 ( 3H, s, CH— 2 ), 1.32 ( 3H, s,
2 3
CH -2 ), 1.12 ( 9H, s, ter-ブチノレ ) ;
3
Mass (FAB+) m/z ： 522.2550(M+ + H), 465, 307, 154;
Anal, calcd for C H N O Si : C, 66.64; H, 7.33; N, 5.36. found: C, 66.5
29 38 2 5
0; H, 7.20; N, 5.29.
[0152] (2) 2, 2 ジメチル— 5— (チミン— 9—ィル—メチル）5 ヒドロキシメチル— 1, 3 ―ン才キサン (2,2— dimethy卜 5— (thymine— 9— yhnethyl)5— hydroxymethy卜 1 ,3— dioxan) の製造
2, 2 ジメチルー 5—t—ブチルージフエニルォキシルメチルー 5 （チミンー9ーィ ル—メチル）—1, 3 ジォキサン（200mg、 0. 38mmol)に、 Ar置換下、 THF (10 ml)をカ卩えて溶解させた。その溶液に TBAF (3ml)を加え、その混合物をー晚攪拌 した。その混合物から溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ 一（CHC1 : 1^011= 100 : 1〜20 : 1)で精製して、白色結晶の表題ィ匕合物を得た。
3
(収量 101mg、 0. 35mmol、収率 94%) [0153] Mass ( EI ) m/z ： 284.1372 ( M+ ) 269, 233, 208, 195, 180 ;
Anal, calcd for C H ON O · 1/5 H O : C, 54.23; H, 7.14; N, 9.73. found:
13 2 2 5 2
C, 54.30; H, 6.90; N, 9.65.
[0154] (3) 1— (2, 2 ジヒドロキシメチル一 3 ヒドロキシプロピル）チミン（1- (2,2- dihydr oxymethyi-J-hydroxypropyl) thymine)の製造
2, 2 ジメチル— 5— (チミン— 9—ィル—メチル）5 ヒドロキシメチル— 1, 3 ジ ォキサン（48mg、 0. 166mmol)に 30%TFA(10ml)を加え、その混合物を約 2時 間攪拌した。その混合物に水およびメタノールを加え、その後、混合物から溶媒を除 去して減圧乾固した。得られた残渣を、 n キサンおよびエーテルの混合物 (n— へキサン: Et 0 = 1 : 1)力も結晶化させ、白色結晶の表題化合物を得た (収量 28mg
2
、 0. 114mmol、収率 67%)。
[0155] Mass ( EI ) m/z ： 244.1059 ( M+ ), 195, 180, 152, 126, 96 ;
Anal, calcd for C H N O - 1/5H O ： C, 48.46 ； H, 6.67 ； N, 11.30. f
13 20 2 5 2
ound: C, 48.04 ； H, 6.27 ； N, 11.36.
[0156] (実施例 6)
1— (2, 2 ジヒドロキシメチル— 3 ヒドロキシプロピル） 5 フルォロウラシルの製造 [0157] (1) 2, 2 ジメチルー 5—t ブチルージフエ-ルシリルメチルー 5—（5 フルォ ロウラシルー 1ーィルーメチル） 1, 3 ジォキサン（2,2- dimethy卜 5- 1- ButhyHiiphe nylsilylmethyト 5- (5- fluorouraciト 1- yi- methyl)- 1 ,ύ- dioxan)の製造
2, 2—ジメチル 5— t ブチル ジフエニルシリルォキシルメチル 5—トルエン スルホ -ルメチル— 1, 3 ジォキサン（2. 23g、 3. 92mmol)の DMF (50ml)溶液 を、予め真空乾燥させておいた 5 フルォロウラシル（0. 765g、 5. 88mmol)、 60 % NaH (0. 235g、 5. 88mmol)および 18 クラウン— 6 エーテル（1. 06g、 3. 99mmol)の混合物にゆっくり滴下した。得られた混合物を、 Ar雰囲気下、約 85°Cで 24時間攪拌した。その混合物に n キサンおよび酢酸ェチルの混合物（酢酸ェチ ル:へキサン = 1 : 1)ならびに水を加えて、抽出した。得られた有機層を、飽和 NaCl 水溶液、飽和 NaHCO水溶液で順次洗浄し、乾燥させた。その有機層から溶媒を減
3
圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（n—Hex:EtOAc = 20 : 1〜0 : 1)で精製して、白色結晶の表題ィ匕合物を得た。（156mg, 0. 296mm ol, 8%)
[0158] JHNMR ( DMSO— d , 400MHz ) δ : 11.8 ( 1H, s, NH ), 7.81 ( 1H, d, J
6
=6.4 Hz, CH—ゥラシル— 6 ), 7.66 ( 4H, m, Phe ), 7.44 ( 6H, m,Phe ), 3. 67 ( 8H, m, CH— 4, 5, 5, 6 ), 1.31 ( 4H, m, CH— 2 ), 1.18 ( 2H, m,
2 3
CH -2 ), 1.00 ( 9H, s, t-ブチノレ ).
3
[0159] (2) 1一（2—t—ブチルージフエ-ルシリルメチルー 2—ヒドロキシメチルー 3—ヒド ロキシプロピル） 5 -フルォロウラシル (1- (2- 1- Buthy卜 diphenylsilylmethy卜 2- hydrox ymethyl-J-hydroxypropyl) 5- fluorouracu)の:^造
2, 2—ジメチルー 5—t—ブチルージフエ-ルシリルメチルー 5—（5—フルォロゥラ シル— 1—ィル—メチル）—1, 3—ジォキサン（151mg、 0. 287mmol)に 30%酢酸 を 40ml加え、その混合物を約 70°Cで 3時間加熱した。その混合物から溶媒を減圧 留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHC1： MeOH = 50 : l
3
〜30 : 1)で精製して、無色透明オイル状の表題ィ匕合物を得た。（41. 6mg、 0. 085 5mmol、 30%)
[0160] JHNMR ( CDC1 , 400MHz ) δ : 9.29 ( 1H, s, NH ), 7.64 ( 5H, m, Phe,
3
CH—ゥラシル— 6 ), 7.44 ( 6H, m,Phe ), 3.92 ( 2H, s, OH— 2, 3 ), 3.56 ( 2H, s, CH -2 ), 3.47 ( 2H, d, J=10.8 Hz, CH— 1 ), 3.32 ( 4H, d, J=l
2 2
3.2 Hz, CH— 2, 3 ), 1.12 ( 9H, s, t—ブチノレ ).
2
[0161] (3) 1— (2, 2—ジヒドロキシメチル一 3—ヒドロキシプロピル） 5—フルォロウラシル — (2,2— dihydroxymethyト 3— hydroxypropyl)5— fluorouracil)の合成
1一 （2— t一ブチル一ジフエニルシリルメチル一 2—ヒドロキシメチル一 3—ヒドロキ シプロピル） 5—フルォロウラシル（41. 6mg、 0. 0855 mmol)の THF溶液へ、 T BAF (0. 15ml)を加え、その溶液を 2時間攪拌した。その溶液力も溶媒を減圧留去 し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHC1： MeOH = 50 : l〜10
3
: 1)で精製して、白色結晶の表題ィ匕合物を得た。（14. 2mg、 0. 057mmol、 67%) [0162] JHNMR ( CDC1 , 400MHz ) δ : 9.29 ( 1H, s, NH ), 7.64 ( 5H, m, Phe
3
, CH—ゥラシル— 6 ), 7.44 ( 6H, m,Phe ), 3.92 ( 2H, s, OH— 2, 3 ), 3.56 ( 2H, s, CH -2 ), 3.47 ( 2H, d, J=10.8 Hz, CH— 1 ), 3.32 ( 4H, d, J=l
2 2
3.2 Hz, CH— 2, 3 ).
2
[0163] (実施例 7)
1— (2, 2 ジヒドロキシメチル一 3 ヒドロキシプロピル） 5 フルォロシトシンの製 造
[0164] (1) 2, 2 ジメチルー 5—t ブチルージフエ-ルシリルメチルー 5—（5 フルォ ロシトシン 1ーィルーメチル） 1, 3 ジォキサン（2,2- dimethy卜 5- 1- ButhyHiiphe nylsilylmethyl-5-( 5- Fluorocytosme- 1- yhnethyl)- 1,3- dioxan)の製造
2, 2—ジメチル 5— t ブチル ジフエニルシリルォキシルメチル 5—トルエン スルホ -ルメチル— 1, 3 ジォキサン（1. 67g、 2. 93mmol)の DMF (35ml)溶液 を、予め真空乾燥させておいた 5 フルォロシトシン（0. 568g、 4. 40mmol)、 60%
NaH (0. 176g、 4. 40mmol)および 18 クラウン— 6 エーテル（0. 790g、 2. 9 9mmol)の混合物にゆっくり滴下した。得られた混合物を、 Ar雰囲気下、約 75°Cで 4 8時間攪拌した。その混合物に、 n—へキサンおよび酢酸ェチルの混合物（酢酸ェチ ル:へキサン = 1 : 1)ならびに水を加えて、抽出した。得られた有機層を、飽和 NaCl 水溶液、飽和 NaHCO水溶液で順次洗浄し、乾燥させた。その有機層から溶媒を減
3
圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（n—Hex:EtOAc = 10 : 1〜0 : 1)で精製して、白色結晶の表題ィ匕合物を得た。（352mg、 0. 669mm ol、 23%)
[0165] JHNMR ( CDC1 , 400MHz ) δ : 9.29 ( 1H, s, NH ), 7.64 ( 5H, m, Phe,
3
CH—ゥラシル— 6 ), 7.44 ( 6H, m,Phe ), 3.92 ( 2H, s, OH— 2, 3 ), 3.56 ( 2H, s, CH -2 ), 3.47 ( 2H, d, J=10.8 Hz, CH— 1 ), 3.32 ( 4H, d, J=l
2 2
3.2 Hz, CH— 2, 3 ), 1.12 ( 9H, s, t—ブチノレ ).
2
[0166] (2) 1一（2—t—ブチルージフエ-ルシリルメチルー 2 ヒドロキシメチルー 3 ヒド ロキシプロピル） 5 -フルォロシトシン（ 1- (2- 1- Buthy卜 diphenylsilylmethy卜 2- hydrox ymethyl-J-hydroxypropyl) 5- fluorocytosmeノの製造
2, 2 ジメチルー 5—t—ブチルージフエニルシリルメチルー 5—（5 フルォロシト シン一 1—ィル一メチル）一1, 3 ジォキサン（352mg、 0. 669mmol)に 30%酢酸 (50ml)を加え、その混合物を約 70°Cで 4時間加熱した。この混合物カゝら溶媒を減 圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHC1： MeOH = 50 :
3
1〜30 : 1)で精製して、無色透明オイル状の化合物を得た。その化合物に、 n—へキ サンとジェチルエーテルを加えて結晶を析出させ， 白色結晶の表題ィ匕合物を得た。 ( 171mg、 0. 351mmol、 52%)
[0167] JHNMR ( CDC1 , 400MHz ) δ : 9.29 ( 1H, s, NH ), 7.64 ( 5H, m, Phe
3
, CH—ゥラシル— 6 ), 7.44 ( 6H, m,Phe ), 3.92 ( 2H, s, OH— 2, 3 ), 3.56 ( 2H, s, CH -2 ), 3.47 ( 2H, d, J=10.8 Hz, CH— 1 ), 3.32 ( 4H, d, J=l
2 2
3.2 Hz, CH— 2, 3 ), 1.12 ( 9H, s, t—ブチノレ ).
2
[0168] (3) 1— (2, 2 ジヒドロキシメチル一 3 ヒドロキシプロピル） 5 フルォロシトシ ン (1— (2,2— dihydroxymethyl— 3— hydroxypropyl) 5— fluorocytosine)の:^造
1一（2 t ブチル ジフエニルシリルメチル 2 ヒドロキシメチル 3 ヒドロキ シプロピル） 5 フルォロシトシン（171mg、 0. 351mmol)の THF溶液へ、 TBAF (0. 70ml)を加えて、その混合物を 2時間攪拌した。その混合物力も溶媒を減圧留 去し、得られた残渣へエタノールを加えて結晶を析出させて、白色結晶の表題化合 物を得た。（32. Omg、 0. 129mmol、 37%)
[0169] JHNMR ( DMSO— d , 400MHz ) δ : 11.3 ( 1H, s, NH ), 7.40 ( 1H, s, C
6
H—ゥラシノレ— 6 ), 3.62 ( 3H, br, OH— 2, 2, 3 ), 3.27 ( 8H, m, CH— 4, 5,
2
5, 6 ), 1.72 ( 3H, s, CH チミン ；).
3
[0170] (実施例 8)
9— [2— (2 ジアミノエトキシ一 N, N ジイソプロピルアミノホスフェイ-ルォキシメ チル— 2— (4, 4'—ジメトキシトリチルォキシ） 3— tert—ブチルジフエ-ルシリル ォキシ）プロピル] N6 べンゾィルーアデ-ン（9- [2- (2- cyanoethoxy- N,N- diisopro pylaminophosphimyloxymetnyl -2- (4,4 - mmethoxytntyioxy)- 3- tert- butyldiphenylsi lyloxy)propyl]-N6-benzoyladenine)の製造
[0171] (1) 2, 2 ジメチルー 5—t—ブチルージフエ-ルシリルォキシメチルー 5—（N6— ベンゾィルアデ-ン— 9—ィル—メチル）—1, 3 ジォキサン（2,2- Dimethy卜 5-t-but yト diphenvlsilyloxymethyト 5— (N6— benzoyladenine— 9— yト methyl)— 1,3— dioxanノの製造 実施例 1 (4)で得られた 2, 2 ジメチル 5 t ブチル ジフエ-ルシリルォキシ ルメチル— 5— (アデ-ン— 9—ィル—メチル）—1, 3 ジォキサン（2130mg、 4. 01 mmol)をピリジン（40ml)に溶解させ、その溶液へ、氷冷下にてベンゾイルクロリド（5 60 1、 4. 81mmol)を滴下した。室温で 16時間撹拌した後、その混合物にメタノー ルを加えて過剰の試薬を分解した。得られた残渣にトルエンを共存させ、減圧濃縮し てピリジンを除去した。得られたシロップにクロ口ホルムをカ卩え、クロ口ホルム層を 2N 塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、飽和食塩水にて順次洗浄した。硫酸ナトリウム により乾燥した後、そのクロ口ホルム層を減圧下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲ ルカラムクロマトグラフィー（酢酸ェチル：へキサン = 2 : 1)で精製して、白色粉末の標 題化合物を得た（収量 1530mg、 2. 41mmol、収率 60%)。
[0172] 'H-NMR (400MHZ, CDCl ) δ 11.1 (s, 1H, NH), 8.66 (s, 1H, H— 8), 8.3
3
0 (s, 1H, H-2), 8.05-7.41 (m, 15H, Ph— CO, 2Ph— Si), 4.37 (s, 2H, CH— N
2
) 3.76 (2d, 4H, 2CH - O- C), 1.25, 1.21 (2s, 6H, 2CH - C) 0.97 (s, 9H, t
2 3
ert-ブチノレ).
[0173] (2) 9— (2, 2 ヒドロキシメチルー 3— tert—ブチルジフエ-ルシリルォキシプロピ ル） N6 ベンゾィル -アデ-ン（9- (2,2- Hydroxymethy卜 3- tert- butyldiphenylsilylo xypropyl)- N -benzoyl-adenine の製造
2, 2—ジメチル 5— t ブチル ジフエニルシリルォキシメチル 5—（N6 ベン ゾィルアデ-ン— 9—ィル—メチル）—1, 3 ジォキサン（1600mg、 2. 52mmol)の メタノール（20ml)溶解に、 p—トルエンスルホン酸一水和物（500mg、 2. 63mmol) を加えて、その混合物を室温にて 48時間撹拌した。 TLC (クロ口ホルム:メタノール = 10 : 1)により、前記混合物中の原料の消失を確認後、前記混合物にトリェチルァミン を加えて中和した。前記混合物を減圧下にて濃縮して得られた残渣を、シリカゲル力 ラムクロマトグラフィー（クロ口ホルム:メタノール =60 : 1)で精製して、白色粉末の標 題化合物を得た（890mg、 1. 49mmol、収率 59%)。
[0174] JH-NMR (400MHz, CDCl ) ： δ 9.12 (brs, 1Η, NH), 8.75 (s, 1H, H— 8),
3
8.09 (s, 1H, H-2), 8.05-7.41 (m, 15H, Ph— CO, 2Ph— Si), 4.48 (s, 2H, C H -N) 3.61 (s, 2H, CH— O— Si), 3.45, 3.26 (2brd, 4H, 2CH— OH), 1.14 (s, 9H, tert-ブチル).
[0175] (3) 9— [2 ヒドロキシメチル— 2— (4, 4，—ジメトキシトリチルォキシル）—3— tert ブチルジフエ-ルシリルォキシプロピル] N6 ベンゾィル アデ-ン（9-[2-Hydr oxymethyl— 2— (4,4— dimethoxytrityloxyl)— 3— tert— butyldiphenylsilyloxypropylj— N—be nzoyト adenine)の製造
9 (2, 2 ヒドロキシメチルー 3— tert—ブチルジフエ-ルシリルォキシプロピル） — N6—ベンゾィル—アデニン（800mg、 1. 34mmol)のピリジン（20ml)溶液に、ジ メトキシトリチルクロリド（1360mg, 4. 02mmol)およびジメチルァミノピリジン（491m g, 4. 02mmol)をカ卩え、その混合物を室温にて 18時間撹拌した。 TLCにて前記混 合物中の原料の消失を確認後、前記混合物にメタノールを加えて過剰の試薬を分 解した。得られた残渣にトルエンを共存させ、減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸ェ チルに溶解させ、前記酢酸ェチル溶液を蒸留水で洗浄した。硫酸ナトリウムにより乾 燥した後、前記酢酸ェチル層を減圧下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラム クロマトグラフィー（クロ口ホルム:メタノール = 200： 1→100： 1)で精製して、白色粉 末の標題化合物を得た（680mg、 0. 76mmol、収率 57%)。
[0176] JH-NMR (400MHz, CDC1 ) ： δ 8.61 (s, 1Η, H— 8), 8.04—6.76 (m, 30H,
3
2Ph-OMe, Ph-C, Ph- CO 2Ph- Si, H- 2, NH), 4.39 (s, 2H, CH N), 3.71-3.6
2
9 (m, 8H, CH - O- Si, 2MeO), 3.45-3.37 (m, 4H, CH2- O- DMTr, CH OH),
2 2
0.90 (s, 9H, tert-ブチル).
[0177] (4) 9- [2- (2 ジアミノエトキシ一 N, N ジイソプロピルアミノホスフェイ-ルォキ シメチルー 2— (4, 4'ージメトキシトリチルォキシ） 3—tert—ブチルジフエ二ルシリ ルォキシ）プロピル]—N6 ベンゾィル—アデ-ン（9- [2- (2- cyanoethoxy- N,N- diisop ropylaminophosphimyloxymethyl —2— (4,4— dimetnoxytntyloxy)— 3— tert— butyldipheny lsilyloxy)propyl]-N6-benzoyladenine)の製造
9— [2 ヒドロキシメチル— 2— (4, 4，—ジメトキシトリチルォキシ 1)—3— tert—ブ チルジフエ-ルシリルォキシプロピル]— N6—ベンゾィル—アデニン（66. lmg, 73. 6 /z mol)のジクロロメタン（0. 37ml)溶液に、 Hunig' s base (76 ^ 1, 0. 44mmol) および亜リン酸化試薬（33 /z l, 0. 148mmol)を加えた。 TLCにより反応の完結を確 認した後、飽和 NaHCO水溶液を前記混合物に添加して反応を停止させた。前記
3
混合物を、クロ口ホルムと飽和 NaHCO水溶液により分液した。得られた有機層を減
3
圧濃縮し、その残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸ェチル：へキサン = 2： 1)で精製し、標題ィ匕合物を得た (44. 4mg, 44 mol、収率 60%)。
[0178] 31PNMR (400MHz, DMSO— d ) δ [ppm]: 147.47 ppm.
6
[0179] (実施例 9)
塩基配列の中央部に、ヌクレオシド類似体を 1つ導入した配列番号 1 (下記に示す 塩基配列参照）（ただし、ヌクレオシド類似体は、 tert プチルジフエニルシリル基を 有する）からなる一本鎖のオリゴヌクレオチド類似体の製造
[化 30]
5 d (AA G G AA AA * G A G G AAA G A) - 3 '
[0180] 配列番号 1の塩基配列に従い、核酸自動合成機および CPG榭脂を用いるホスホロ アミダイト法によりオリゴヌクレオチド類似体 (DNAタイプ）を製造した。塩基配列中、 2で示す配列には、実施例 8で製造した 9— [2— (2 ジアミノエトキシ— N, N ジ イソプロピルアミノホスフェイ二ルォキシメチルー 2— (4, 4'ージメトキシトリチルォキ シ） 3— tert ブチルジフエ-ルシリルォキシ）プロピル] N6 ベンゾィル アデ ニンをヌクレオシドモノマーとして用いて導入した。他の配列には、デォキシリボース タイプのヌクレオシドを用いて導入した。 1 μ molの固相合成用 CPG榭脂を使用し、 各縮合時間は、 1分とした。
[0181] 前記 CPG榭脂に結合した配列番号 1のオリゴヌクレオチド類似体は、ベンゾィル基 および 1—tert—プチルジフエニルシリルォキシ基で保護された状態で核酸自動合 成機による合成を終了した。
[0182] 前記 CPG榭脂に結合したオリゴヌクレオチドは、 28%アンモニア水溶液（1. 5mL) 中で 55°Cで 12時間反応させた。反応混合物を減圧下で濃縮した。得られた濃縮物 に、 TBAF溶液（lmL)をカ卩え、その混合物を 12時間室温で攪拌して、前記シリル基 を脱保護した。その後、得られた混合物を、 0. 1M TEAA緩衝液（30mL)で希釈 した。この混合物を C— 18逆相カラムクロマトグラフィー（Sep— Pak) (溶出液:水中、 50%CH CN (2mL) )により精製して、 目的とする一本鎖のオリゴヌクレオチド類似
3
体を得た。
MALDI-TOF/MS 計算値： 5598.96、実測値： 5594.03。
[0183] 前記実施例 9において用いた、 0.1Mの TEAA緩衝液は、以下のようにして調製し た。まず、 2Nの酢酸（114.38mL)およびトリェチルァミン（277.6mL)の混合物に
、水を加えて 1Lにした。その溶液に酢酸をカ卩えて、 pHを 7.0に調整し、次いでその 溶液を 20倍に希釈することにより調製した。
[0184] (参考例 1)
配列番号 1の代わりに配列番号 2 (下記に示す塩基配列参照)の塩基配列に従!、、 実施例 9と同様にして一本鎖オリゴヌクレオチドを得た。
[化 31]
5 d (TC TTT CCT CTT TTC CTT) 3'
[0185] (実施例 10)
実施例 9で製造した配列番号 1からなるオリゴヌクレオチド類似体 (0.8nmmol)を 、アニーリングバッファー（10mMのリン酸ナトリウム塩（pH7.0)および 1Mの NaCl) 中に溶解させた。その溶液を 90°Cで 1分間、次いで 37°Cで 1時間の間、インキュべ ートして、下記に示す塩基配列のような、配列番号 1からなるオリゴヌクレオチド類似 体と配列番号 2からなるオリゴヌクレオチドとからなる、二本鎖オリゴヌクレオチド類似 体を得た。
[化 32]
5 d (AAG GAA AA*G AGG AAA GA) 3'
3 d (TTC CTT TTC TCC TTT CT) - 5 '
[0186] (比較例 1)
配列番号 1の代わりに配列番号 3 (下記に示す塩基配列参照)の塩基配列に従!、、 実施例 9と同様にして、一本鎖のオリゴヌクレオチドを製造した。
[0187] [化 33] 5 d (AAG GAA AAG AGG AAA GA) 3
[0188] (比較例 2)
実施例 9で製造した配列番号 1からなるオリゴヌクレオチド類似体の代わりに、比較 例 1で製造した配列番号 3からなるオリゴヌクレオチドを用いて、実施例 10と同様にし て、下記に示すような、配列番号 3からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号 2からなる オリゴヌクレオチドを力もなる、二本鎖オリゴヌクレオチド類似体を得た。
[0189] [化 34]
5 d (AAG GAA AAG AGG AAA GA) - 3 '
3 d (TTC CTT TTC TCC TTT CT) - 5 '
[0190] (二本鎖の安定性）
実施例 10で製造した二本鎖オリゴヌクレオチド類似体および比較例 2で製造した 二本鎖オリゴヌクレオチドについて、測定したそれぞれの Tm値を、以下の表 1に示す
[0191] [表 1]
Figure imgf000047_0001
[0192] 前記表 1に示すように、本発明のヌクレオシド類似体で 1箇所の塩基が置き換えら れたオリゴヌクレオチド類似体 (ただし、ヌクレオシド類似体は、 tert—プチルジフエ- ルシリル基を有する）が二本鎖の形成能を有することを、確認できた。
[0193] (実施例 11)
実施例 9で製造した配列番号 1からなるオリゴヌクレオチド類似体（lOOpmol)を、 1 0 X PNK緩衝液（2 L)、 6unit/ μ Lの Τ4ポリヌクレオチドキナーゼ（E. Coli A1 9) (l^L), y -32P ATP (： L)および滅菌水（16 /zL)の混合液中で、氷冷下に 、混合し、その後、 37°Cで 30分間攪拌した。その後、スピンカラムを用いて前記混合 物から夾雑物を除去して、 5'末端が32 P同位体で標識された、配列番号 1からなるォ リゴヌクレオチド類似体を得た。
[0194] (比較例 3)
実施例 9で製造した配列番号 1からなるオリゴヌクレオチド類似体の代わりに、比較 例 1で製造した配列番号 3からなるオリゴヌクレオチドを用いた以外は、実施例 11と 同様にして、 5'末端が32 P同位体で標識された、配列番号 3からなるオリゴヌクレオチ ドを得た。
[0195] (ヌクレーゼ耐性）
一本鎖オリゴヌクレオチド類似体のェキソヌクレアーゼ耐性の評価
実施例 11で得られた配列番号 1からなる一本鎖オリゴヌクレオチド類似体、比較例 3で得られた配列番号 3からなる天然型の一本鎖オリゴヌクレオチドの、ェキソヌクレ ァーゼ耐性を評価した。ェキソヌクレアーゼとしては、へビ毒ホスホロジエステラーゼ（ SVP)を使用した。 SVPは、リン酸ジエステル結合を選択的に切断しオリゴヌクレオチ ドを 5， 一モノリン酸ヌクレオチドに分解する。なお、 10 Mの一本鎖オリゴヌクレオチ ド類似体溶液は、実施例 11で製造した配列番号 1からなる一本鎖オリゴヌクレオチド 類似体（lOOpmol)に、未標識の実施例 9で製造した配列番号 1からなる一本鎖オリ ゴヌクレオチド類似体 (400pmol)をカ卩え、滅菌水を用いて、 10 Mに調整して製造 した。 10 Mの一本鎖オリゴヌクレオチド溶液も、前記と同様にして製造した。
[0196] 以下に示す組成の反応溶液から、 1、 5、 10、 15、 30分後に、ローデイング溶液（7 M urea XC BPB ; 5 L)を含む各エツペンドルフチューブに、反応液（5 1)をサ ンプリングして反応を停止させた。なお、 0分後のサンプルは、 SVP水溶液をカ卩えて いないものである。得られた各時間におけるサンプルを、 20%ゥレア入り PAGEによ り電気泳動させて、ゲル中で分離した。前記ゲルを、イメージングプレートと接触させ て、前記ゲル中の分離されたイメージを転写した。このイメージをバイオイメージング アナライザー（商品名： BAS2000、富士写真フィルム株式会社製)を用いて取り込み 、 RIイメージ解析ソフトにより画像処理した。その結果を図 1に示す。
[0197] 一本鎖オリゴヌクレオチド類似体 (実施例 11)の反応溶液の組成
一本鎖オリゴヌクレオチド類似体 4 L
(最終濃度 10 M) 緩衝液（250mM Tris-HCU 50mM MgCl (pH7.0)) 6 μ L·
2
lunits/mL SVP水溶液 4 μ L·
滅菌水 26 u L
計 40 μ L·
[0198] 一本鎖オリゴヌクレオチド (比較例 3)の反応溶液の組成
一本鎖オリゴヌクレオチド 4 L
(最終濃度 10 M)
緩衝液（250mM Tris-HCU 50mM MgCl (pH7.0)) 6 μ L·
2
lunits/mL SVP水溶液 4 μ L·
滅菌水 26ひし
計 40 μ L·
[0199] 前記図 1に示すように、一本鎖オリゴヌクレオチド類似体 (ただし、ヌクレオシド類似 体は、 tert—ブチルジフエ-ルシリル基を有する）は、天然型一本鎖オリゴヌクレオチ ドと比較して、ェキソヌクレアーゼ耐性が向上していることが確認された。また、前記 図 1に示すように、前記一本鎖オリゴヌクレオチド類似体は、サイト 1のみならず、サイ ト 2においても、ヌクレアーゼ耐性を示することが確認された。このサイト 1は、前記ヌク レオシド類似体と、天然のヌクレオシドとの間の結合部位である。サイト 2は、天然のヌ クレオシド間の結合部位である力 一方の天然のヌクレオシド結合部位は、前記ヌク レオシド類似体と結合している。そのため、本発明のヌクレオシド類似体は、その隣接 するヌクレオシドとの結合部位のみならず、離れた位置にあるヌクレオシド間の結合 部位のヌクレアーゼ耐性も向上させることが、確認された。
産業上の利用可能性
[0200] 本発明のヌクレオシド類似体は、例えば、検査キット用オリゴヌクレオチドを製造す るためのヌクレオシドとして有用である。
配列表フリーテキスト
[0201] 配列番号 1 オリゴヌクレオチド類似体
配列番号 2 オリゴヌクレオチド
配列番号 3 オリゴヌクレオチド

Claims

請求の範囲
下記式 (I)で表されるヌクレオシド類似体またはその塩。
Figure imgf000050_0001
前記式 (I)中、 R1は、下記式（1)の基、下記式（1)の基において、その官能基が保護 基で保護された基、下記式 (2)の基、下記式 (2)の基において、その官能基が保護 基で保護された基、下記式 (3)の基、下記式 (3)の基において、その官能基が保護 基で保護された基、下記式 (4)の基、下記式 (4)の基において、その官能基が保護 基で保護された基、下記式 (5)の基、下記式 (5)の基において、その官能基が保護 基で保護された基、下記式 (6)の基、下記式 (6)の基において、その官能基が保護 基で保護された基、下記式 (7)の基、下記式 (7)の基において、その官能基が保護 基で保護された基、下記式 (8)の基、および下記式 (8)の基において、その官能基 が保護基で保護された基カゝらなる群カゝら選択されるいずれかの基であり、
R2は、 Hまたは保護基であり、
R3は、 Hまたは保護基であり、
R4は、 Hまたは固相合成用活性化リン酸基であり、
k、 1、 mおよび nは、互いに独立して、 1〜10の整数である。
[化 2]
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000051_0002
Rが、 H、 4, 4，ージメトキシトリチル（DMTr)、 tert-ブチルジメチルシリル（TBDM S)、 4 モノメトキシトリチル（MMTr)、 tert ブチルジフエ-ルシリル（TBDPS)また は（9—フエ-ル）キサンテン— 9—ィルであり、
R3が、 H、 4, 4，ージメトキシトリチル（DMTr)、 tert-ブチルジメチルシリル（TBDM S)、 4 モノメトキシトリチル（MMTr)、 tert ブチルジフエ-ルシリル（TBDPS)また は（9—フエ-ル）キサンテン— 9—ィルであり、
R4が、 Hまたは下記式（10)で表される基である請求項 1に記載のヌクレオシド類似 体またはその塩。
[化 3]
Figure imgf000051_0003
前記式 (I)において、 R1が、前記式（1)の基、前記式（2)の基、前記式（3)の基、前 記式 (4)の基、前記式（5)の基、前記式 (6)の基、前記式（7)の基および前記式 (8) の基からなる群から選択される!、ずれかの基であり、
k、 1、 mおよび nが、 1である請求項 1に記載のヌクレオシド類似体またはその塩。
R1が前記式（1)の基であり、 R2、 R3および R4が Hである前記式 (I)で表されるヌクレ オシド類似体、 R1が前記式（2)の基であり、 R2、 R3および R4が Hである前記式 (I)で表されるヌクレ オシド類似体、
R1が前記式（3)の基であり、 R2、 R3および R4が Hである前記式 (I)で表されるヌクレ オシド類似体、
R1が前記式 (4)の基であり、 R2、 R3および R4が Hである前記式 (I)で表されるヌクレ オシド類似体、
R1が前記式（5)の基であり、 R2、 R3および R4が Hである前記式 (I)で表されるヌクレ オシド類似体、
R1が前記式（6)の基であり、 R2、 R3および R4が Hである前記式 (I)で表されるヌクレ オシド類似体、
R1が前記式（7)の基であり、 R2、 R3および R4が Hである前記式 (I)で表されるヌクレ オシド類似体、および
R1が前記式（7)の基において、その官能基がベンゾィルで保護された基であり、 R2 が 4, 4'—ジメトキシトリチル（DMTr)であり、 R3が、 tert—ブチルジフエ-ルシリル (T BDPS)であり、 R4が、下記式（10)で表される基である前記式 (I)で表されるヌクレオ シド類似体力 なる群力 選択される請求項 1に記載のヌクレオシド類似体。
[化 4]
Figure imgf000052_0001
オリゴヌクレオチドを構成する 1以上のヌクレオシド力 ヌクレオシド類似体でそれぞ れ置き換えられているオリゴヌクレオチド類似体であって、
前記ヌクレオシド類似体が、前記式 (I)中、 R1が、前記式（1)の基、前記式 (2)の基 、前記式（3)の基、前記式 (4)の基、前記式（5)の基、前記式 (6)の基、前記式（7) の基および前記式 (8)の基力 なる群力 選択されるいずれかの基であり、 R2、 R3お よび R4が Hである請求項 1に記載のヌクレオシド類似体であるオリゴヌクレオチド類似 体。
[6] 前記オリゴヌクレオチド類似体が、一本鎖オリゴヌクレオチドである請求項 5に記載 のオリゴヌクレオチド類似体。
[7] 前記オリゴヌクレオチド類似体が、二本鎖形成能を有する請求項 5に記載のオリゴ ヌクレオチド類似体。
[8] 前記オリゴヌクレオチド類似体力 ヌクレアーゼ耐性である請求項 5に記載のオリゴ ヌクレオチド類似体。
[9] オリゴヌクレオチドを含む遺伝子発現抑制剤であって、前記オリゴヌクレオチドが、 請求項 5に記載のオリゴヌクレオチド類似体である遺伝子発現抑制剤。
[10] 遺伝子発現に伴う疾患を治療するための医薬組成物であって、
前記医薬組成物が、請求項 9に記載の遺伝子発現抑制剤を含む医薬組成物。
[11] 請求項 5に記載のオリゴヌクレオチド類似体を含む検査キットであって、
前記オリゴヌクレオチド類似体が、検体中の遺伝子とハイブリッド形成することにより、 前記遺伝子が検査されるキット。
[12] オリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を抑制する方法であって、前記オリゴヌタレ ォチドが、請求項 5に記載のオリゴヌクレオチド類似体である方法。
[13] 前記式 (I)中、 R1が、前記式（1)の基、前記式（1)の基において、その官能基が保 護基で保護された基、前記式 (2)の基、前記式 (2)の基において、その官能基が保 護基で保護された基、前記式 (3)の基、前記式 (3)の基において、その官能基が保 護基で保護された基、前記式 (4)の基、前記式 (4)の基において、その官能基が保 護基で保護された基、前記式 (5)の基において、その官能基が保護基で保護された 基、前記式 (6)の基、前記式 (6)の基において、その官能基が保護基で保護された 基、前記式 (7)の基、前記式 (7)の基において、その官能基が保護基で保護された 基、前記式 (8)の基、および前記式 (8)の基において、その官能基が保護基で保護 された基力 なる群力 選択されるいずれかの基であり、 R2、 R3および R4が Hであり、 下記式 (Π)で表される請求項 1に記載のヌクレオシド類似体またはその塩の製造方 法であって、
[化 5]
Figure imgf000054_0001
下記式 (VII)で表される化合物と、下記式 (VIII)で表される化合物とを反応させ、下 記式 (IX)で表される化合物を得、
[化 6]
Figure imgf000054_0002
前記式 (IX)で表される化合物と、下記式 (X)で表される化合物とを、塩基存在下 縮合させ、下記式 (XI)で表される化合物を得、
[化 7]
Figure imgf000054_0003
(IX) (XI) 前記式 (XI)で表される化合物の、 RU、 R12および R13を除去することにより、式 (Π)で 表されるヌクレオシド類似体またはその塩を得る製造方法。
前記式中、 R5は、下記式（1)の基、下記式（1)の基において、その官能基が保護基 で保護された基、下記式 (2)の基、下記式 (2)の基において、その官能基が保護基 で保護された基、下記式 (3)の基、下記式 (3)の基において、その官能基が保護基 で保護された基、下記式 (4)の基、下記式 (4)の基において、その官能基が保護基 で保護された基、前記式 (5)の基において、その官能基が保護基で保護された基、 下記式 (6)の基、下記式 (6)の基において、その官能基が保護基で保護された基、 下記式（7)の基、下記式（7)の基、下記式（8)の基、および下記式（8)の基において 、その官能基が保護基で保護された基からなる群から選択される!、ずれかの基であ り、
Figure imgf000055_0001
Figure imgf000055_0002
R は、保護基であり、
R12および R13は、一緒になつて、式— CR15R16—で表される基であり、
前記 R15および R16は、互いに独立して、水素原子、低級アルキル基および低級アル コキシル基力 なる群力 選択されるいずれかであり、
R14は、式 SO— R17で表される基であり、
2
前記 R17は、低級アルキルで置換されて 、てもよ 、ァリール基であり、
X2は、互いに独立して、ハロゲン原子であり、
k、 1、 mおよび nは、互いに独立して、 1〜10の整数である。
前記式 (I)中、 R1が、前記式（5)の基であり、 R2、 R3および R4が Hであり、下記式 (II I)で表される請求項 1に記載のヌクレオシド類似体またはその塩の製造方法であって
[化 9]
Figure imgf000055_0003
前記式 (ΧΠΙ)で表される化合物の、 RU、 R12および R13を除去すること、および加水分 解により、式 (ΠΙ)で表されるヌクレオシド類似体またはその塩を得る製造方法。 前記式中、 R11は、保護基であり、
R12および R13は、一緒になつて、式— CR15R16—で表される基であり、
前記 R15および R16は、互いに独立して、水素原子、低級アルキル基および低級アル コキシル基力 なる群力 選択されるいずれかであり、
X3は、ハロゲン原子であり、
k、 1、 mおよび nは、互いに独立して、 1〜10の整数である。
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