JP2005514462A6 - 新規カリックス[4]アレーン−ヌクレオシドおよびカリックス[4]アレーン−オリゴヌクレオチドハイブリッド - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明の目的は、生理活性物質との相互作用を通じてオリゴヌクレオチドを認識できるカリックス[4]アレーン−オリゴヌクレオチドハイブリッドの製造に使用できるカリックス[4]アレーン−ヌクレオシドハイブリッドを提供することである。
【解決手段】本発明は、カリックス[4]アレーン残基を含むカリックス[4]アレーン−ヌクレオシドハイブリッドと主なビルディング・ブロック(building block)としてカリックス[4]アレーン−ヌクレオシドを用いて合成されたDNAヘアピン構造類似体(DNA hairpin structure mimics)として作用可能なカリックス[4]アレーン−オリゴヌクレオチドハイブリッドに関する。本発明のカリックス[4]アレーン−ヌクレオシドおよびカリックス[4]アレーン−オリゴヌクレオチドハイブリッドは空洞を有するカリックス[4]アレーンと生理活性物質間の結合による3重構造(triplex)形成を通じてDNAまたはRNAを効果的に認識できる。
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Description
本発明は、カリックス[4]アレーン残基を含むカリックス[4]アレーン−ヌクレオシドハイブリッド(calix[4]arene-nucleoside hybrid)と前記カリックス[4]アレーン−ヌクレオシドハイブリッドを用いてDNAヘアピン構造類似体(DNA hairpin structure mimics)として合成されたカリックス[4]アレーン−オリゴヌクレオチドハイブリッド(calix[4]arene-oligonucleotide hybrid)に関する。
多重官能基(multifunctional groups)の前形成(preorganization)および組合せは生物学的反応力学において非常に重要な役割を担当する(A. R. Fersht, Trends Biochem. Sci. 28, 3111, 1987)。カリックス[4]アレーン(calix[4]arene)は、結合官能基の方向性前形成および低エネルギー要求性形態的変化によって導入物質(guest)結合部位を迅速に組合せることができる能力を有する非常に有望な先導物質(host)として提示されている(T. Harade, J. M. et al., Tetrahedron 49, 5941, 1993; J. Scheerder, et al., Angew. Chem. 108, 1172, 1996; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35, 1090, 1996)。したがって、カリックス[4]アレーンは多重機能性酵素モデルのためのビルディング・ブロックとして使用されている(P. Molenveld, et al., J. Am. Chem. Soc. 120, 6726, 1998)。最近は、生物学的活性を有する合成受容体または酵素類似体(mimics)を開発するためにカリックス[4]アレーンが糖(A. Dondoni, et al., Tetrahedron Lett. 42, 3295, 2001)、アミノ酸(L. Frkanec, et al., Chem. Eur. J. 6, 442, 2000)およびペプチド(Y. Hamuro, et al., Angew. Chem. 109, 2797, 1997)と結合されている。しかし、カリックス[4]アレーン残基を含む変形されたオリゴヌクレオチド(modified oligodeoxynucleotide, ODNs)の前例はこれまでない。
そこで、本発明者らは、DNAヘアピン構造類似体として働けるカリックス[4]アレーン残基を含む変形されたODNsの開発を試みた。
したがって、本発明の目的は、生理活性物質との相互作用を通じてオリゴヌクレオチドを認識できるカリックス[4]アレーン−オリゴヌクレオチドハイブリッドの製造に使用できるカリックス[4]アレーン−ヌクレオシドハイブリッドを提供することである。
本発明の一実施態様によって、本発明では一つまたはその以上のアミノ基を有するカリックス[4]アレーンに由来するカリックス[4]アレーン残基にアミド結合を通じて結合している少なくとも一つのヌクレオシドを有するカリックス[4]アレーン−ヌクレオチドハイブリッドが提供される。
また、本発明の他の実施態様によって、カリックス[4]アレーン−ヌクレオシドハイブリッドに由来する残基に結合された二つのヌクレオシド残基の各々に結合した一つまたはその以上のヌクレオチド配列を有するカリックス[4]アレーン−オリゴヌクレオチドハイブリッドが提供される。
本発明の前記および他の目的および特徴は、下記の図面を伴う本発明の詳細な説明によって明白になる。
本発明は、カリックス[4]アレーン残基を含むカリックス[4]アレーン−ヌクレオシドハイブリッドおよび前記カリックス[4]アレーン−ヌクレオシドハイブリッドを主なビルディング・ブロックとして用いて合成され、DNAヘアピン構造と類似するカリックス[4]アレーン−オリゴヌクレオチドハイブリッドを提供する。
本発明で使用され得るヌクレオシドとしては、アデノシンおよびチミジンが好ましいが、これらに限定されない。
本発明の好ましい実施態様によれば、DNAヘアピン構造類似体、たとえば、図2に示す5’−A12−X−T12−3’(配列番号1、Xは式1のカリックスヌクレオシド1である。)の配列を有するカリックス[4]アレーン−オリゴヌクレオチドハイブリッド(以下、カリックスオリゴヌクレオチド(calixoligonucleotide)と略称する)を製造するための基礎骨格(scaffold)として各々使用され得る下記式1〜4のカリックス[4]アレーン−ヌクレオシドハイブリッド(以下、カリックスヌクレオシド(calixnucleoside)と略称する)1〜4を提供する。
本発明のカリックスヌクレオシドおよびカリックスオリゴヌクレオチドハイブリッドは新規な化合物であって、カリックスオリゴヌクレオチドは様々な構造的長所を有する変形されたオリゴデオキシヌクレオチド(modified oligodeoxynucleotide, ODNs)である:本発明のカリックスオリゴヌクレオチドは一定水準以上の硬度(rigidity)と柔軟性(flexibility)を同時に有する;これらは生体内で安定であり、優れた細胞透過性を有する。また、本発明のカリックスオリゴヌクレオチドは容易に大量生産できる。したがって、本発明のカリックスオリゴヌクレオチドは3重結合形成を通じてDNAまたはRNAを認識できるヘアピン形態のODNsとして使用できる(E. T. Kool, Acc. Chem. Res. 31, 502, 1998; S. Wang, et al., Biochemistry 34, 9774, 1995; E. Azhayeva, et al., Nucleic Acid Res. 23, 1170, 1995)。ODNsは一本鎖mRNAに結合するか(アンチセンス戦略、antisense strategy)または二本鎖DNAに結合して(アンチゲン戦略、antigene strategy)翻訳と転写を抑制することが報告されている(P. C. Zamecnik, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 280, 1978; E. Uhlmann, et al., Chem. Rev. 90, 543, 1990)。このような事実は癌やAIDSなどの疾患を治療するのに非常に有用である(A. D. Matteucci, et al., Nature 384, 20, 1996; D. H. Barton, et al., Tetrahetron Lett. 30, 4969, 1989)。したがって、本発明のカリックスヌクレオシドおよびカリックスオリゴヌクレオチドハイブリッドはDNAセンサーまたは遺伝子療法(gene therapy)に有用である。
また、本発明は、前記カリックスヌクレオシドおよびカリックスオリゴヌクレオチドハイブリッドの製造方法を提供する。
本発明の好ましい態様では、チミジン誘導体をヌクレオシドとして用いて4つのカリックスヌクレオシドハイブリッドを合成する過程を下記反応式1に詳しく示す。
カリックスヌクレオシドの合成において最も重要な段階は、式7のカリックス[4]アレーンのアミン官能基(amine group)と式6または8のチミジン(thymidine)ヌクレオシドのカルボン酸基(carboxylic acid group)の間でアミド結合(amide bond)を形成することである。
前記反応式1のa)段階では、式6のチミジン誘導体(D. H. Barton, et al., Tetrahedron Lett. 30, 4969, 1989)の5’−酸官能基(5’-acid functionality)を活性化するために(COCl)2、EDC(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride)、TBC(2,4,6-trichlorobenzoylchloride)またはTBTU(O-benzotriazole-1-yl-N,N,N’,N’-tetramethyluronium tetrafluoroborate)などのような様々なペプチドカップリング試薬(coupling reagents)を用いてもよい。たとえば、TBTUの使用は二つの同一なチミジン残基を有する産物(同種−結合産物、homo-coupled product)、すなわち、式3のカリックスヌクレオチドを95%の収率で生産する。
また、式8のチミジン誘導体(J. Lebreton, et al., Synlett. 137, 1994; J. Y. Kim, et al., Nucleodises, Nucleotide & Nucleic Acids 19, 637, 2000)は前記と類似する方法(段階c)で式7の1,3−ジアミノカリックス[4]アレーン(1,3-diaminocalix[4]arene)(D. M. Rudkevich, et al., J. Org. Chem. 59, 3683, 1994)と反応させて式4の同種−結合カリックスヌクレオシドを得る。
二つの互いに異なるチミジン残基を有する式1および2の異種結合(hetero-coupled)カリックスヌクレオシドは式6のチミジン誘導体(1.2当量)と式7の1,3−ジアミノカリックス[4]アレーンとのカップリングを通じて前記反応式1の段階b)で製造された式5の単一結合(mono-coupled)カリックスヌクレオシドを用いて合成される。式2のカリックスヌクレオシド2は反応式1の段階d)で式8のチミジン誘導体と式5の単一結合カリックスヌクレオシドとのカップリングによって生産される。
反応式1の段階e)では、式1の脱保護された(deprotected)カリックスヌクレオシドがテトラブチルアンモニウムフルオリド(Tetrabutylammonium fluoride)の作用によって式2のカリックスヌクレオシドからRおよびR’を除去して製造される。
式1〜4の本発明のカリックスヌクレオシドの物理学的特性を元素分析(elemental analysis)、質量分析装置(mass spectrometry)、IR、1H−NMR、13C−NMR、UV、X線結晶分析(X-ray crystallography)、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)および円二色性(circular dichroism, CD)によって分析した。
式4の本発明のカリックスヌクレオシドのX線回折等級単一結晶(X-ray diffraction grade single crystals)は前記化合物のMeOH溶液を低速溶媒蒸発(slow solvent evaporation)させて形成される。このようなX線結晶構造は本発明のカリックスヌクレオシドの固体状構造を確実に示し、二つのチミジン残基がU字形構造を形成しながら同じ方向に位置していることを提示する(図1参照)。
本発明のカリックスヌクレオシドを用いてDNAヘアピン構造類似体であるカリックスオリゴヌクレオチドを以下の方法によって容易に合成できる。
まず、式1のカリックスヌクレオシドのDMTrで保護された2−シアノエチルホスホロアミダイト・ビルディング・ブロック(DMTr protected 2-cyanoethyl phosphoroamidite building block)を製造した後これをパーセプティブ・バイオシステムズ8909エクスパダイトTM核酸合成システム(PerSeptive Biosystems 8909 ExpediteTM Nucleic Acid Synthesis System)上で固体相オリゴヌクレオチド合成方法に直接適用する(M. J. Gait, Oligonucleotide Synthesis. A Practical Approach. IRL Press, Oxford, Chapter 4, 1984)。これから配列の中間に式1のカリックスヌクレオシドを含む変形されたODN、すなわちDNAヘアピン構造類似体を合成する。このように合成された本発明のカリックスオリゴヌクレオチドはオリゴ1と命名され、5’−A12−X−T12−3’(配列番号1;Xはカリックスヌクレオシド1である。)の配列を有し、下記構造式1で示される(図2参照)。
前記カリックスオリゴヌクレオチドをDMTrで切断した結果、図3に示すように、カリックスヌクレオシドにヌクレオチドが連続的に付加されていることを確認した。本発明のカリックスオリゴヌクレオチドはPAGEと逆相HPLCを用いて分離し、フライト(fright)質量分析装置(MALDI-TOF)のマトリックス−補助レーザー脱着/イオン化時間(matrix-assisted laser desorption/ionization time)によってその分子量を8,539(m/e)と決定した。
さらに、本発明では他のカリックスオリゴヌクレオチドを合成して精製した:5’−T12−X−T12−3’の配列を有するオリゴ2(配列番号2;Xはカリックスヌクレオシド1である。)と5’−AAAAGATATCAA−X−TTGACATCTTTT−3’の配列を有するオリゴ3(配列番号3;Xはカリックスヌクレオシド1である)。オリゴ2および3は各々下記構造式2および3で表され、MALDI−TOF質量分析装置でこれらの分子量を各々8,453および8,556(m/e)と決定した。
本発明のカリックスオリゴヌクレオチドのヘアピン構造を立証するために、オリゴ1の熱的変性(thermal denaturation)様相をUV分光器を用いて観察した。図4に示すように、温度に対するλ260における吸光度プロットはS字形(sigmoidal shape)を示し、中点は二重体のTm値(40℃)を示す。したがって、オリゴ1が相補的な核酸−塩基(complementary nucleo-bases)(AおよびT)間の水素結合を通じた二重らせん構造(duplex helix structure)を形成しており、それによりDNAペアピン構造を有することを確認した。本発明のカリックスオリゴヌクレオチドのCDスペクトルもまたこれを立証している(図5参照)。前記プロットは281nmに中心のある陽性バンドを有し、249nmに中心のある陰性バンドを有し、260nm付近でゼロ値を示す。このようなCDデータはB−形態DNA(A. Rodger, et al., Circular Dichroism & Linear Dichroism; Oxford: Oxford University Press, pp. 24-29, 1997)の独特の特性を示し、本発明のカリックスオリゴヌクレオチドがDNAヘアピン構造を有することを示す。
以下、本発明を下記実施例によってさらに詳細に説明する。但し、本発明の内容は下記実施例に限定されない。
実施例1:カリックスヌクレオシドハイブリッドの合成
(段階1)カリックスヌクレオシド3の合成
式7の化合物の量を基準に2.4当量の式6のチミジン誘導体(65mg,0.176mmol,Samcheonri Chemical Ltd., D. H. Barton, et al., Tetrahedron Lett. 30:4969, 1989)をTBTU(59mg,0.183mmol)、HOBT(26mg,0.194mmol)、4−メチルモルホリン(20mg,0.182mmol)、CH2Cl2(6ml)と混合し、室温で30分間反応させた。活性化されたチミジン誘導体を式7の1,3−ジアミノカリックス[4]アレーン(49mg, 0.079 mmol, Sigma-Aldrich社, D. M. Rudkevich, et al., J. Org. Chem. 59:3683, 1994)と室温で4時間反応させて69%の収率で式3の同種−結合(homo-coupled)カリックスヌクレオシドを製造した。
(段階1)カリックスヌクレオシド3の合成
式7の化合物の量を基準に2.4当量の式6のチミジン誘導体(65mg,0.176mmol,Samcheonri Chemical Ltd., D. H. Barton, et al., Tetrahedron Lett. 30:4969, 1989)をTBTU(59mg,0.183mmol)、HOBT(26mg,0.194mmol)、4−メチルモルホリン(20mg,0.182mmol)、CH2Cl2(6ml)と混合し、室温で30分間反応させた。活性化されたチミジン誘導体を式7の1,3−ジアミノカリックス[4]アレーン(49mg, 0.079 mmol, Sigma-Aldrich社, D. M. Rudkevich, et al., J. Org. Chem. 59:3683, 1994)と室温で4時間反応させて69%の収率で式3の同種−結合(homo-coupled)カリックスヌクレオシドを製造した。
(段階2)カリックスヌクレオシド4の合成
式7の化合物の量を基準に2.4当量の式8のチミジン誘導体(652 mg, 1.247 mmol, Samcheonri Chemical Ltd., J. Lebreton, et al., Synlett 137:b, 1994; J. Y. Kim, et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 19:637, 2000)をTBTU(400mg,1.247mmol)、HOBT(84mg,0.624mmol)、4−メチルモルホリン(137μl,1.247mmol)、CH2Cl2(15ml)と混合し、室温で30分間反応させた。活性化されたチミジン誘導体を式7の1,3−ジアミノカリックス[4]アレーン(311.4mg,0.5mmol)と室温で1時間反応させて43%の収率で式4の同種結合(homo-coupled)カリックスヌクレオシドを製造した。
式7の化合物の量を基準に2.4当量の式8のチミジン誘導体(652 mg, 1.247 mmol, Samcheonri Chemical Ltd., J. Lebreton, et al., Synlett 137:b, 1994; J. Y. Kim, et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 19:637, 2000)をTBTU(400mg,1.247mmol)、HOBT(84mg,0.624mmol)、4−メチルモルホリン(137μl,1.247mmol)、CH2Cl2(15ml)と混合し、室温で30分間反応させた。活性化されたチミジン誘導体を式7の1,3−ジアミノカリックス[4]アレーン(311.4mg,0.5mmol)と室温で1時間反応させて43%の収率で式4の同種結合(homo-coupled)カリックスヌクレオシドを製造した。
(段階3)カリックスヌクレオシド1および2の合成
式7の化合物の量を基準に1.2当量の式6のチミジン誘導体(346mg,0.935mmol)をTBTU(450mg,1.40mmol)、HOBT(126mg,0.935mmol)、4−メチルモルホリン(54μl,1.40mmol)、CH2Cl2(15ml)と混合し、室温で30分間反応させた。活性化されたチミジン誘導体を1.0当量の式7の1,3−ジアミノカリックス[4]アレーン(612mg,0.935mmol)と1時間反応させて58%の収率で式5の単一結合(mono-coupled)カリックスヌクレオシドを製造した。式8のチミジン誘導体(129mg,0.246mmol)にTBTU(79mg,0.246mmol)、HOBT(17mg,0.123mmol)、4−メチルモルホリン(27μl,0.246mmol)、CH2Cl2(10ml)を室温で30分間処理して活性化させた後、前記で合成された式5のカリックスヌクレオシド(110mg,0.113mmol)を添加し、室温で3時間反応させて64%の収率で式2のカリックスヌクレオシドを製造した。最終的にカリックスヌクレオシド2(107.5mg,0.072mmol)の保護基を室温で10分間TBAF(75.2mg,0.288mmol)およびTHF(10ml)処理によって除去することにより83%の収率で式1のカリックスヌクレオシドを合成した。
式7の化合物の量を基準に1.2当量の式6のチミジン誘導体(346mg,0.935mmol)をTBTU(450mg,1.40mmol)、HOBT(126mg,0.935mmol)、4−メチルモルホリン(54μl,1.40mmol)、CH2Cl2(15ml)と混合し、室温で30分間反応させた。活性化されたチミジン誘導体を1.0当量の式7の1,3−ジアミノカリックス[4]アレーン(612mg,0.935mmol)と1時間反応させて58%の収率で式5の単一結合(mono-coupled)カリックスヌクレオシドを製造した。式8のチミジン誘導体(129mg,0.246mmol)にTBTU(79mg,0.246mmol)、HOBT(17mg,0.123mmol)、4−メチルモルホリン(27μl,0.246mmol)、CH2Cl2(10ml)を室温で30分間処理して活性化させた後、前記で合成された式5のカリックスヌクレオシド(110mg,0.113mmol)を添加し、室温で3時間反応させて64%の収率で式2のカリックスヌクレオシドを製造した。最終的にカリックスヌクレオシド2(107.5mg,0.072mmol)の保護基を室温で10分間TBAF(75.2mg,0.288mmol)およびTHF(10ml)処理によって除去することにより83%の収率で式1のカリックスヌクレオシドを合成した。
実施例2:カリックスヌクレオシド1〜4の物理学的特性分析
前記実施例1で製造された本発明のカリックスヌクレオシド1〜4の物理学的特性を元素分析(elemental analysis)、質量分析装置(mass spectrometry)、IR、1H−NMR、13C−NMR、UV、X線結晶分析(X-ray crystallography)、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)および円二色性(circular dichroism, CD)によって以下のように分析した。
前記実施例1で製造された本発明のカリックスヌクレオシド1〜4の物理学的特性を元素分析(elemental analysis)、質量分析装置(mass spectrometry)、IR、1H−NMR、13C−NMR、UV、X線結晶分析(X-ray crystallography)、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)および円二色性(circular dichroism, CD)によって以下のように分析した。
カリックスヌクレオシド1
m.p.: > 212.5℃ (decomp);
MS (FAB): m/z: 1127.6 (M+H+);
[α]20D=+6.70 (c=0.0094 in CHCl3);
IR (neat): υ=3309, 3065, 2961, 2931, 2875, 1682, 1465 cm-1;
1H NMR (300 MHz, [D6]Acetone/CDCl3 1/1 (v/v)): δ=10.05 (s, 1H), 9.88 (s, 1H), 9.02 (s, 1H), 8.66 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.66 (s, 1H), 6.90 (s, 1H), 6.84 (s, 1H), 6.79 (s, 1H), 6.65-6.45 (m, 7H), 6.31 (dd, 1H), 6.01 (dd, 1H), 5.39 (s, 1H), 4.85 (br, 1H), 4.57 (br, 1H), 4.40 (s, 2H), 4.35 (s, 2H), 4.34 (s, 1H), 4.22 (br, 1H), 3.87 (m, 1H), 3.77 (m, 9H), 3.07 (t, J=13.8Hz, 4H), 2.75 (m, 1H), 2.47 (m, 2H), 2.32 (m, 2H), 2.22 (m, 2H), 1.88 (br, 11H), 1.80 (s, 3H), 0.94 (q, J=3.6Hz, 12H);
13C NMR (75.5 MHz, [D6]アセトン/CDCl3 1/1 (v/v)): δ=169.9, 168.6, 164.5, 164.2, 156.8, 153.8, 153.5, 151.4, 150.9, 135.6, 135.5, 135.2, 132.5, 132.1, 128.5, 122.4, 120.8, 111.2, 109.7, 88.7, 87.1, 86.7, 85.1, 77.1, 77.0, 75.0, 61.6, 39.5, 38.5, 38.1, 33.9, 31.3, 23.5, 12.6, 10.6, 10.5;
元素分析:C62H74N6O14, 計算値:C 66.06, H 6.62, N 7.45;
実測値:C 65.75, H 6.97, N 7.73.
m.p.: > 212.5℃ (decomp);
MS (FAB): m/z: 1127.6 (M+H+);
[α]20D=+6.70 (c=0.0094 in CHCl3);
IR (neat): υ=3309, 3065, 2961, 2931, 2875, 1682, 1465 cm-1;
1H NMR (300 MHz, [D6]Acetone/CDCl3 1/1 (v/v)): δ=10.05 (s, 1H), 9.88 (s, 1H), 9.02 (s, 1H), 8.66 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.66 (s, 1H), 6.90 (s, 1H), 6.84 (s, 1H), 6.79 (s, 1H), 6.65-6.45 (m, 7H), 6.31 (dd, 1H), 6.01 (dd, 1H), 5.39 (s, 1H), 4.85 (br, 1H), 4.57 (br, 1H), 4.40 (s, 2H), 4.35 (s, 2H), 4.34 (s, 1H), 4.22 (br, 1H), 3.87 (m, 1H), 3.77 (m, 9H), 3.07 (t, J=13.8Hz, 4H), 2.75 (m, 1H), 2.47 (m, 2H), 2.32 (m, 2H), 2.22 (m, 2H), 1.88 (br, 11H), 1.80 (s, 3H), 0.94 (q, J=3.6Hz, 12H);
13C NMR (75.5 MHz, [D6]アセトン/CDCl3 1/1 (v/v)): δ=169.9, 168.6, 164.5, 164.2, 156.8, 153.8, 153.5, 151.4, 150.9, 135.6, 135.5, 135.2, 132.5, 132.1, 128.5, 122.4, 120.8, 111.2, 109.7, 88.7, 87.1, 86.7, 85.1, 77.1, 77.0, 75.0, 61.6, 39.5, 38.5, 38.1, 33.9, 31.3, 23.5, 12.6, 10.6, 10.5;
元素分析:C62H74N6O14, 計算値:C 66.06, H 6.62, N 7.45;
実測値:C 65.75, H 6.97, N 7.73.
カリックスヌクレオシド2
m.p.: 176.4-178.2℃;
MS (FAB): m/z: 1479.3 (M+H+);
[α]23D=+16.8 (c=0.0079 in CH2Cl2);
IR(neat): υ=3306, 3066, 2958, 2931, 2958, 1694, 1552, 1468 cm-1;
1H NMR (300 MHz, [D6]アセトン): δ=10.23 (s, 1H), 9.95 (s, 1H), 9.46 (s, 1H), 8.97 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.79-7.75 (m, 4H), 7.54 (d, J=1.0Hz, 1H), 7.48-7.37 (m, 8H), 7.28 (d, J=3.6Hz, 2H), 6.40-6.33 (m, 6H), 6.27 (dd, J1=5.3Hz, J2=9.3Hz, 1H), 6.20 (dd, J1=4.9Hz, J2=7.0Hz, 1H), 4.79 (d, J=5.0Hz, 1H), 4.49 (d, J=3.8Hz, 2H), 4.45 (d, J=3.8Hz, 2H), 4.38 (d, J=1.3Hz, 1H), 4.09 (dd, J1=7.7Hz, J2=9.0Hz, 1H), 4.00-3.95 (m, 6H), 3.76 (t, J=7.0Hz, 4H), 3.15 (d, J=8.0Hz, 2H), 3.11 (d, J=6.7Hz, 2H), 3.01 (q, J=7.7Hz, 1H), 2.63-2.48 (m, 2H), 2.42-2.18 (m, 3H), 1.96 (m, 8H), 1.87 (s, 3H), 1.56 (d, J=0.9Hz, 3H), 1.09 (m, 15H), 0.96 (m, 15H), 0.20 (s, 3H), 0.19 (s, 3H);
13C NMR(75.5 MHz, [D6]アセトン): δ=170.0, 168.9, 164.6, 157.0, 155.1, 154.7, 152.4, 151.7, 139.9, 137.6, 137.5, 136.9, 136.8, 136.7, 135.0, 134.9, 134.5, 133.8, 131.2, 129.2, 129.0, 123.3, 121.5, 121.3, 111.8, 111.2, 90.9, 88.7, 86.6, 85.4, 78.1, 78.0, 77.3, 65.8, 40.7, 39.4, 39.0, 36.5, 32.2, 27.9, 26.7, 24.6, 24.3, 20.5, 19.1, 13.0, 12.9, 11.5, 10.9, -4.1, -4.2;
元素分析:C84H106N6O14Si2, 計算値:C 68.17, H 7.21, N 5.67;
実測値:C 67.79, H 7.53, N 5.85.
m.p.: 176.4-178.2℃;
MS (FAB): m/z: 1479.3 (M+H+);
[α]23D=+16.8 (c=0.0079 in CH2Cl2);
IR(neat): υ=3306, 3066, 2958, 2931, 2958, 1694, 1552, 1468 cm-1;
1H NMR (300 MHz, [D6]アセトン): δ=10.23 (s, 1H), 9.95 (s, 1H), 9.46 (s, 1H), 8.97 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.79-7.75 (m, 4H), 7.54 (d, J=1.0Hz, 1H), 7.48-7.37 (m, 8H), 7.28 (d, J=3.6Hz, 2H), 6.40-6.33 (m, 6H), 6.27 (dd, J1=5.3Hz, J2=9.3Hz, 1H), 6.20 (dd, J1=4.9Hz, J2=7.0Hz, 1H), 4.79 (d, J=5.0Hz, 1H), 4.49 (d, J=3.8Hz, 2H), 4.45 (d, J=3.8Hz, 2H), 4.38 (d, J=1.3Hz, 1H), 4.09 (dd, J1=7.7Hz, J2=9.0Hz, 1H), 4.00-3.95 (m, 6H), 3.76 (t, J=7.0Hz, 4H), 3.15 (d, J=8.0Hz, 2H), 3.11 (d, J=6.7Hz, 2H), 3.01 (q, J=7.7Hz, 1H), 2.63-2.48 (m, 2H), 2.42-2.18 (m, 3H), 1.96 (m, 8H), 1.87 (s, 3H), 1.56 (d, J=0.9Hz, 3H), 1.09 (m, 15H), 0.96 (m, 15H), 0.20 (s, 3H), 0.19 (s, 3H);
13C NMR(75.5 MHz, [D6]アセトン): δ=170.0, 168.9, 164.6, 157.0, 155.1, 154.7, 152.4, 151.7, 139.9, 137.6, 137.5, 136.9, 136.8, 136.7, 135.0, 134.9, 134.5, 133.8, 131.2, 129.2, 129.0, 123.3, 121.5, 121.3, 111.8, 111.2, 90.9, 88.7, 86.6, 85.4, 78.1, 78.0, 77.3, 65.8, 40.7, 39.4, 39.0, 36.5, 32.2, 27.9, 26.7, 24.6, 24.3, 20.5, 19.1, 13.0, 12.9, 11.5, 10.9, -4.1, -4.2;
元素分析:C84H106N6O14Si2, 計算値:C 68.17, H 7.21, N 5.67;
実測値:C 67.79, H 7.53, N 5.85.
カリックスヌクレオシド3
m.p.: 212.3-214.2℃;
MS (FAB): m/z: 1327.3 (M+H+);
[α]24D=-9.42 (c=0.0046 in CH2Cl2);
IR(neat): υ=3284, 3063, 2957, 2930, 2857, 1682, 1466 cm-1;
1H NMR(300 MHz, CDCl3): δ=9.02 (s, 2H), 8.95 (s, 2H), 7.37 (d, J=2.2Hz, 2H), 7.17 (s, 4H), 6.27 (s, 6H), 6.00 (dd, J1=4.9Hz, J2=9.8Hz, 2H), 4.72 (d, J=4.5Hz, 2H), 4.41 (d, J=4.2Hz, 4H), 4.37 (s, 2H), 3.91 (t, J=7.8Hz, 4H), 3.67 (t, J=6.9Hz, 4H), 3.14 (d, J=4.6Hz, 2H), 3.09 (d, J=4.6Hz, 2H), 2.72 (m, 2H), 2.04 (dd, J1=5.0Hz, J2=12.7Hz, 2H), 1.96-1.80 (m, 14H), 1.04 (t, J=7.3Hz, 6H), 0.92 (s, 18H), 0.88 (t, J=7.5Hz, 6H), 0.18 (s, 6H), 0.15 (s, 6H);
13C NMR(75.5 MHz, CDCl3): δ=167.5, 163.8, 155.6, 154.8, 150.7, 138.9, 137.1, 137.1, 133.5, 133.5, 131.4, 127.8, 122.3, 120.5, 111.9, 110.8, 91.8, 87.8, 77.1, 75.8, 37.4, 31.2, 26.0, 23.6, 23.1, 18.2, 12.6, 10.9, 10.2, -4.5, -4.7;
元素分析:C72H98N6O14Si2・3H2O, 計算値:C 62.58, H 7.58, N 6.08;
実測値:C 62.92, H 7.65, N 5.84.
m.p.: 212.3-214.2℃;
MS (FAB): m/z: 1327.3 (M+H+);
[α]24D=-9.42 (c=0.0046 in CH2Cl2);
IR(neat): υ=3284, 3063, 2957, 2930, 2857, 1682, 1466 cm-1;
1H NMR(300 MHz, CDCl3): δ=9.02 (s, 2H), 8.95 (s, 2H), 7.37 (d, J=2.2Hz, 2H), 7.17 (s, 4H), 6.27 (s, 6H), 6.00 (dd, J1=4.9Hz, J2=9.8Hz, 2H), 4.72 (d, J=4.5Hz, 2H), 4.41 (d, J=4.2Hz, 4H), 4.37 (s, 2H), 3.91 (t, J=7.8Hz, 4H), 3.67 (t, J=6.9Hz, 4H), 3.14 (d, J=4.6Hz, 2H), 3.09 (d, J=4.6Hz, 2H), 2.72 (m, 2H), 2.04 (dd, J1=5.0Hz, J2=12.7Hz, 2H), 1.96-1.80 (m, 14H), 1.04 (t, J=7.3Hz, 6H), 0.92 (s, 18H), 0.88 (t, J=7.5Hz, 6H), 0.18 (s, 6H), 0.15 (s, 6H);
13C NMR(75.5 MHz, CDCl3): δ=167.5, 163.8, 155.6, 154.8, 150.7, 138.9, 137.1, 137.1, 133.5, 133.5, 131.4, 127.8, 122.3, 120.5, 111.9, 110.8, 91.8, 87.8, 77.1, 75.8, 37.4, 31.2, 26.0, 23.6, 23.1, 18.2, 12.6, 10.9, 10.2, -4.5, -4.7;
元素分析:C72H98N6O14Si2・3H2O, 計算値:C 62.58, H 7.58, N 6.08;
実測値:C 62.92, H 7.65, N 5.84.
カリックスヌクレオシド4
m.p.: 222.4-223.7℃;
MS (FAB): m/z: 1630.5 (M+);
[α]24D=+9.27 (c=0.0035 in CH2Cl2);
IR (neat): υ=3314, 3068, 2960, 2931, 2873, 1688, 1605, 1544, 1468 cm-1;
1H NMR(300 MHz, CDCl3/CD3OD 15/1 (v/v)): δ=10.5 (br, 2H), 8.46 (br, 2H), 7.59 (s, 2H), 7.41 (s, 2H), 7.34-7.24 (m, 12H), 6.80 (s, 2H), 6.75 (s, 2H), 6.51 (d, J=7.1Hz, 4H), 6.42 (t, J=7.1Hz, 2H), 6.05 (t, J=5.8Hz, 2H), 4.36 (d, J=13.2Hz, 4H), 3.94 (d, J=7.8Hz, 2H), 3.75 (s, 10H), 3.30 (s, 1H), 3.17 (s, 1H), 3.05 (d, J=13.3Hz, 4H), 2.84 (br, 2H), 2.34-2.03 (m, 8H), 1.84 (q, J=7.2Hz, 8H), 1.49 (s, 6H), 1.01 (s, 18H), 0.91 (dd, J1=7.6Hz, J2=16.2Hz, 12H);
13C NMR(75.5 MHz, CDCl3/CD3OD 15/1 (v/v)): δ=169.2, 164.5, 156.4, 153.7, 150.9, 135.7, 135.7, 135.4, 134.7, 133.3, 132.7, 131.6, 130.1, 130.0, 128.4, 128.1, 128.0, 128.0, 122.1, 120.6, 120.5, 111.2, 85.3, 84.6, 76.9, 64.5, 39.7, 38.2, 35.5, 31.1, 27.0, 23.3, 23.2, 19.5, 12.0, 10.4, 10.3;
元素分析:C96H114N6O14Si2・2H2O, 計算値:C 69.12, H 7.13, N 5.04;
実測値:C 69.19, H 7.13, N 4.81.
m.p.: 222.4-223.7℃;
MS (FAB): m/z: 1630.5 (M+);
[α]24D=+9.27 (c=0.0035 in CH2Cl2);
IR (neat): υ=3314, 3068, 2960, 2931, 2873, 1688, 1605, 1544, 1468 cm-1;
1H NMR(300 MHz, CDCl3/CD3OD 15/1 (v/v)): δ=10.5 (br, 2H), 8.46 (br, 2H), 7.59 (s, 2H), 7.41 (s, 2H), 7.34-7.24 (m, 12H), 6.80 (s, 2H), 6.75 (s, 2H), 6.51 (d, J=7.1Hz, 4H), 6.42 (t, J=7.1Hz, 2H), 6.05 (t, J=5.8Hz, 2H), 4.36 (d, J=13.2Hz, 4H), 3.94 (d, J=7.8Hz, 2H), 3.75 (s, 10H), 3.30 (s, 1H), 3.17 (s, 1H), 3.05 (d, J=13.3Hz, 4H), 2.84 (br, 2H), 2.34-2.03 (m, 8H), 1.84 (q, J=7.2Hz, 8H), 1.49 (s, 6H), 1.01 (s, 18H), 0.91 (dd, J1=7.6Hz, J2=16.2Hz, 12H);
13C NMR(75.5 MHz, CDCl3/CD3OD 15/1 (v/v)): δ=169.2, 164.5, 156.4, 153.7, 150.9, 135.7, 135.7, 135.4, 134.7, 133.3, 132.7, 131.6, 130.1, 130.0, 128.4, 128.1, 128.0, 128.0, 122.1, 120.6, 120.5, 111.2, 85.3, 84.6, 76.9, 64.5, 39.7, 38.2, 35.5, 31.1, 27.0, 23.3, 23.2, 19.5, 12.0, 10.4, 10.3;
元素分析:C96H114N6O14Si2・2H2O, 計算値:C 69.12, H 7.13, N 5.04;
実測値:C 69.19, H 7.13, N 4.81.
図1に示すように、X線結晶構造分析結果から本発明のカリックスヌクレオシドハイブリッドの固体相構造を確認した。
実施例3:DNAヘアピン構造を有するカリックスオリゴヌクレオチドの合成
(段階1)2−シアノエチルホスホロアミダイト・ビルディング・ブロックの製造
まず、カリックスヌクレオシド1のDMTrで保護された2−シアノエチルホスホロアミダイト・ビルディング・ブロック(DMTr protected 2-cyanoethyl phosphoroamidite building block)をアグラワルの方法(Agrawal, S. (ed.), Methods in Molecular Biology Protocols foroligonucleotides and analogs; synthesis and properties. Totowa, New Jersey p42, 1993)に従って以下のように製造した。
(段階1)2−シアノエチルホスホロアミダイト・ビルディング・ブロックの製造
まず、カリックスヌクレオシド1のDMTrで保護された2−シアノエチルホスホロアミダイト・ビルディング・ブロック(DMTr protected 2-cyanoethyl phosphoroamidite building block)をアグラワルの方法(Agrawal, S. (ed.), Methods in Molecular Biology Protocols foroligonucleotides and analogs; synthesis and properties. Totowa, New Jersey p42, 1993)に従って以下のように製造した。
具体的に、カリックスヌクレオシド1(325mg,0.289 mmol)をDMTr−Cl(221mg,0.650mmol)、Et3N(91μl,0.65mmol)、ピリジン10mlと混合し、室温で6時間反応させてDMTrで保護されたカリックスヌクレオシド1を得た。DMTrで保護されたカリックスヌクレオシド化合物(129mg,0.09mmol)をTHF 5mlに溶かした後、これにDIPEA(22μl,0.14mmol)を加えた。前記混合物を室温で30分間攪拌した後、これにクロロ(ジイソプロピルアミノ)−β−シアノエトキシホスフィン(chloro[diisopropylamino]-β-cyanoethoxyphospine, 0.16 mmol)24.2μlを添加し、これを1時間反応させてDMTrで保護された2−シアノエチルホルホロアミダイトビルディングブロックを74%の収率で製造した。
(段階2)カリックスオリゴヌクレオチドハイブリッドの合成
段階1で製造されたDMTrで保護された2−シアノエチルホルホロアミダイト・ビルディング・ブロックをパーセプティブ・バイオシステムズ8909エクスパダイトTM核酸合成システム(PerSeptive Biosystems 8909 ExpediteTM Nucleic Acid Synthesis System)上で固体相オリゴヌクレオチド合成方法に直接適用した(M. J. Gait, Oligonucleotide Synthesis A Practical Approach. IRL Press, Oxford, Chapter 4, 1984)。DNAヘアピン構造類似体を製造するために、配列の中間にカリックスヌクレオシド1を含む変形されたODNを合成した。このようにして合成されたカリックスオリゴヌクレオチドは5’−A12−X−T12−3’(配列番号1;Xはカリックスヌクレオシド1である。)で記載される配列を有し、以下の構造を有する(図2)。
段階1で製造されたDMTrで保護された2−シアノエチルホルホロアミダイト・ビルディング・ブロックをパーセプティブ・バイオシステムズ8909エクスパダイトTM核酸合成システム(PerSeptive Biosystems 8909 ExpediteTM Nucleic Acid Synthesis System)上で固体相オリゴヌクレオチド合成方法に直接適用した(M. J. Gait, Oligonucleotide Synthesis A Practical Approach. IRL Press, Oxford, Chapter 4, 1984)。DNAヘアピン構造類似体を製造するために、配列の中間にカリックスヌクレオシド1を含む変形されたODNを合成した。このようにして合成されたカリックスオリゴヌクレオチドは5’−A12−X−T12−3’(配列番号1;Xはカリックスヌクレオシド1である。)で記載される配列を有し、以下の構造を有する(図2)。
図3に示すように、DMTr切断結果から前記で合成された本発明のカリックスオリゴヌクレオチドがカリックスヌクレオシドに連続的に付加されたヌクレオチドを有することを確認した。本発明のカリックスオリゴヌクレオチドを20×20cm PAGEゲルに載せ、200Vで8時間、300Vで2時間連続的に運転した。ゲルを蒸留水7mlに溶解し、30℃で200rpmで12時間溶出させた。ゲルは漉して除去し、溶出液を蒸留して濃縮させた。これから得られた残滓を蒸留水1mlに溶解し、逆相HPLCで精製した(条件:カラムは10mm×250mm ODS;CH3CN/0.1M、TEAA=95/5の溶液A;CH3CN/0.1M,TEAA=50/50の溶液B;0〜10、10〜10、20〜100、25〜100、30〜10の勾配(溶液Bのmin%);3ml/分の流速;20〜24分の保有時間)。精製したカリックスオリゴヌクレオチドの分子量はフライト(fright)質量分析装置(MALDI-TOF MS、基質:3-hydroxypicolic acid, Positive Mode)のマトリックス−補助レーザー脱着/イオン化時間(matrix-assisted laser desorption/ionization time)によって8,539(m/e)と決定された。
実施例4:カリックスオリゴヌクレオチドの構造分析
(4−1)熱的変性実験
本発明のカリックスオリゴヌクレオチド(オリゴ1)のヘアピン構造を立証するために、熱的変性(thermal denaturation)実験を行った:カリックスオリゴヌクレオチド(0.35OD,10.5μg)を10mM Tris−HCl緩衝溶液(pH7.2,[NaCl]=1.0M)に溶解した後75℃で5分間加熱し、室温に徐々に冷却した。その後、UV吸光光度計(UV-2501PC Spectropotometer, Shimazu社)を用いて温度による260nmにおける吸光度を測定した。
(4−1)熱的変性実験
本発明のカリックスオリゴヌクレオチド(オリゴ1)のヘアピン構造を立証するために、熱的変性(thermal denaturation)実験を行った:カリックスオリゴヌクレオチド(0.35OD,10.5μg)を10mM Tris−HCl緩衝溶液(pH7.2,[NaCl]=1.0M)に溶解した後75℃で5分間加熱し、室温に徐々に冷却した。その後、UV吸光光度計(UV-2501PC Spectropotometer, Shimazu社)を用いて温度による260nmにおける吸光度を測定した。
図4に示すように、温度に対する吸光度をプロッテリングして得た曲線はS字形(sigmoidal shape)を示し、中点は二重体のTm値(40℃)を示した。
(4−2)CDスペクトル分析
CDスペクトル(circular dichroism spectrum)分析をpH7.0、10mM Tris−HCl緩衝溶液、100mM NaCl、20mM MgCl2の条件下で吸光偏光計(Jasco J715 Spectropolarimeter)を用いて行った。
CDスペクトル(circular dichroism spectrum)分析をpH7.0、10mM Tris−HCl緩衝溶液、100mM NaCl、20mM MgCl2の条件下で吸光偏光計(Jasco J715 Spectropolarimeter)を用いて行った。
その結果、図5に示すように、これは相補的な核酸−塩基(complementary nucleo-bases)(AおよびT)の間の水素結合を通じた二重らせん構造(duplex helix structure)の形成およびカリックスオリゴヌクレオチドのDNAヘアピン構造に対する強力な証拠である。さらに、カリックスオリゴヌクレオチドのCDスペクトルは281nmに中心のある陽性バンドを有し、249nmに中心のある陰性バンドを有し、260nm付近でゼロ値を示した。これらの結果はB−形態DNA(A. Rodger, et al., Circular Dichroism & Linear Dichroism; Oxford: Oxford University Press, pp. 24-29, 1997)の独特の特性を示すものであり、本発明のカリックスオリゴヌクレオチドが実際にDNAヘアピン構造を有することを立証するものである。
Claims (15)
- 一つまたはそれ以上のアミノ基を有するカリックス[4]アレーンに由来するカリックス[4]アレーン残基にアミド結合を通じて結合された少なくとも一つ以上のヌクレオシドを有するカリックス[4]アレーン−ヌクレオシドハイブリッド。
- 前記ヌクレオシドがチミジンであり、カリックス[4]アレーンが二つのアミノ基を有することを特徴とする請求項1記載のカリックス[4]アレーン−ヌクレオシドハイブリッド。
- 請求項1のカリックス[4]アレーン−ヌクレオシドハイブリッドに由来する残基に結合された二つのヌクレオシド残基の各々に結合した一つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を有するカリックス[4]アレーン−ヌクレオチドハイブリッド。
- カリックス[4]アレーンのアミン基とヌクレオシドのカルボン酸基の間にアミド結合を形成する段階を含む、請求項1記載のカリックス[4]アレーン−ヌクレオシドハイブリッドの製造方法。
- 前記ヌクレオシドがチミジンであり、チミジン誘導体の5’−酸または3’−酸基がカップリング試薬(coupling reagents)によって活性化され、1,3−ジアミノカリックス[4]アレーン(1,3-diaminocalix[4]arene)と反応することを特徴とする請求項11記載の製造方法。
- カリックス[4]アレーン−ヌクレオシド誘導体のTBDMSSおよび/またはTBDPS保護基をテトラブチルアンモニウムフルオリド(tetrabutylammonium fluoride)処理によって除去する段階をさらに含むことを特徴とする請求項11記載の製造方法。
- 前記ペプチドカップリング試薬が(COCl)2、EDC、TBCおよびTBTUからなる群から選ばれることを特徴とする請求項12記載の製造方法。
- 式1のカリックス[4]アレーン−ヌクレオシドのDMTrで保護された2−シアノエチルホスホロアミダイト・ビルディング・ブロック(DMTr protected 2-cyanoethyl phosphoroamidite building block)を製造した後、これを固体相オリゴヌクレオチド合成方法に適用する段階を含む、請求項4のカリックス[4]アレーン−オリゴヌクレオチドハイブリッドの製造方法。
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