JP2007238550A

JP2007238550A - オリゴヌクレオチド誘導体

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Publication number: JP2007238550A
Application number: JP2006066135A
Authority: JP
Inventors: Koji Kiyoo; 康志清尾; Mitsuo Sekine; 光雄関根; Yuukai Takaku; 悠介高久
Original assignee: Tokyo Institute of Technology NUC
Current assignee: Tokyo Institute of Technology NUC
Priority date: 2006-03-10
Filing date: 2006-03-10
Publication date: 2007-09-20

Abstract

【課題】長鎖核酸との親和性が小さく、短鎖核酸との親和性が大きい、プローブ等として使用可能はオリゴヌクレオチド誘導体を提供すること。
【解決手段】本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、一般式（１）で表わされる。

（上記式中、Ｒは水素、アルキル基、又は水酸基の保護基を表し、ｎは１〜５０の整数を表し、Ｂ^ｎは天然又は非天然の核酸塩基を表わし、Ｘは、水素原子、水酸基、又は置換基を有していてもよい炭素数１〜５のアルコキシ基を表し、Ｗ^１及びＷ^２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、嵩高い置換基を表す。）
【選択図】なし

Description

本発明はオリゴヌクレオチド誘導体に関し、特には分子の末端に嵩高い置換基を有するオリゴヌクレオチド誘導体に関する。本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、鎖長を識別する性質を有するオリゴヌクレオチドプローブとして、特に生体内でプロセッシングを受ける核酸、例えば、マイクロＲＮＡ等の検出に有用である。

近年、プローブ核酸とターゲット核酸とのハイブリダイゼーションを利用した核酸検出技術が開発され、遺伝子診断、遺伝子検出、遺伝子解析等の分野において有用な技術である。また、最近、生体内でタンパク質をコードしていないＲＮＡ（非コーディングＲＮＡ）が発見され、これらの検出にも上述したハイブリダイゼーション技術が用いられている。非コーディングＲＮＡの１種であるマイクロＲＮＡは１９〜２５量体程度の短鎖ＲＮＡである。マイクロＲＮＡはＤＮＡから転写されて生じる、より長鎖の前駆体ＲＮＡがプロセッシングされて短鎖の成熟マイクロＲＮＡが生成され、これにより、初めて遺伝子発現等の機能分子として働くことがわかっている。従って、生体内に存在するマイクロＲＮＡを検出する際には、生理的に活性な成熟ＲＮＡと、生理的に不活性な前駆体ＲＮＡとを区別して検出することが重要であると考えられる。

通常のハイブリダイゼーション技術に用いられるプローブは、通常の天然型ヌクレオシドのみから構成されており、このような核酸検出プローブは、ターゲット核酸中にプローブと相補的な配列が含まれている場合、ターゲットの長さとは無関係に結合し、長鎖の前駆体ＲＮＡと、短鎖の成熟マイクロＲＮＡとを区別することができない。

上述したように、長鎖の前駆体ＲＮＡと短鎖の成熟マイクロＲＮＡとを区別するために、現在使用されている手法としては、例えば、生体内の全ＲＮＡをカラムクロマトグラフィーやゲル電気泳動で鎖長に従って分離し、短鎖ＲＮＡのみを含む画分を溶出した後、ハイブリダイゼーション技術により、短鎖ＲＮＡを検出する方法が知られている。この方法によれば、サンプル中に長鎖核酸が含まれていないため、短鎖核酸のみを分析できるという長所を有するが、カラムクロマトグラフィーや電気泳動を行なうのに時間やコストがかかること、操作が煩雑なため、熟練した技術者でなければ実施が困難である等の問題がある（例えば、非特許文献１、２、３、４、５及び６等）。

また、上述したような、短鎖ＲＮＡの分離工程を省略するために、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、短鎖ＲＮＡを鋳型とした場合のみ、鎖伸長が可能な蛍光ラベル標識されたプライマー核酸を用いる検出方法が報告されたが、この方法においても複数の酵素反応を用いているため、操作が煩雑となっている。

Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ｍ． et al. Nature Methods, 1, 47-53 (2004) Ｂａｒａｄ，Ｏ. et al. Genome Res. 14, 2486-2494 (2004) Ｍｉｓｋａ,Ｅ．Ａ． et al. Genome Biol. 5, R68 (2004) Baskerville, S.; Bartel, D. P. RNA, 11, 241-247 (2005) Barak, T et al. RNA, 10, 1813-1819 (2004) Liang, R. -Q. et al. Nuclec Acids Res. 33, e17 (2005)

上記問題を解決するためには、鎖長の長い前駆体ＲＮＡには結合せず、プロセシング後の短鎖マイクロＲＮＡにのみ結合するプローブが有用である。しかし、従来は、このような、短鎖マイクロＲＮＡにのみ結合するプローブは知られていなかった。
従って、本発明の目的は、ターゲット核酸の配列のみならず、その鎖長までも識別する能力を有し、長鎖核酸との親和性が小さく、短鎖核酸との親和性が大きい、プローブ等として使用可能はオリゴヌクレオチド誘導体を提供することにある。
また、本発明の目的は上記オリゴヌクレオチド誘導体を製造するための化合物を提供することにある。

上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、オリゴヌクレオチド誘導体の両末端に嵩高い置換基を導入することにより、上記目的を達成し得るという知見を得た。
本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体を提供するものである。

（上記式中、Ｒは水素、アルキル基、又は水酸基の保護基を表し、ｎは１〜５０の整数を表し、Ｂ^ｎは天然又は非天然の核酸塩基を表わし、Ｘは、水素原子、水酸基、又は置換基を有していてもよい炭素数１〜５のアルコキシ基を表し、Ｗ^１及びＷ^２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、嵩高い置換基を表す。）

また、本発明は、一般式（７）で表わされる化合物を提供する。

（式中、Ｒ^１６は水酸基の保護基を表し、Ｒ^１７及びＲ^１８は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ^１９はリン酸基の保護基を表し、Ｘ^２は、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜５のアルコキシ基、ケイ素原子上に炭素数１〜５のアルキル基を３個有するシリルオキシ基を表し、Ｗ^３は嵩高い置換基を表す。）

本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、完全に又は部分的に相補的な配列を有する一本鎖核酸とハイブリダイゼーションする際に、その一本鎖核酸が本発明のオリゴヌクレオチド誘導体よりも長鎖の場合にはハイブリダイゼーション能が低下し、一本鎖核酸が本発明のオリゴヌクレオチド誘導体よりも短鎖に対して強いハイブリダイゼーション能を示す。

以下、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体について説明する。
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、一般式（１）で表わされる。

上記一般式（１）において、Ｒは水素、アルキル基、又は水酸基の保護基を表す。アルキル基としては、炭素数が１〜４のアルキル基が挙げられ、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソブチル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基が挙げられる。水酸基の保護基としては、ホスホロアミダイト法で用いられるものであれば特に制限はなく、トリチル基等が挙げられ、置換基を結合していているトリチル基が挙げられる。置換基を結合しているトリチル基としては、例えば、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基等が挙げられる。
上記一般式（１）において、ｎは１〜５０の整数、好ましくは１０〜４０の整数、更に好ましくは１５〜３５の整数を表す。ｎは、分析しようとするオリゴヌクレオチドの長さによって適宜選択することができる。

また、Ｂ^ｎは天然又は非天然の核酸塩基である。具体的には、天然のアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルのほかに人工塩基である７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、３−デアザアデニン、６−チオグアニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、７位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザアデニン、８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入されたアデニン、８位に種々の置換基（アルキル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザアデニン、７位及び８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、３−デアザグアニン、７位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザグアニン、８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）を導入したグアニン、8位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザグアニン、７位と８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザグアニン、５位に種々の官能基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入されたシトシン、シュードイソシトシン、１位に種々の官能基（アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル基、水酸基等）が導入されたシュードイソシトシン、５位に種々の官能基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入されたウラシル、シュードウラシル、１位に種々の官能基（アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル基、水酸基等）が導入されたシュードウラシル等が挙げられる。また、上記核酸塩基がアミノ基を有する場合には、そのアミノ基が、アシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、Ｎ−アルキルカルバモイル基、チオカルバモイル基、Ｎ−アルキルチオカルバモイル基等のアシル基で置換されていてもよい。

また、Ｘは、水素原子、水酸基、又は置換基を有していてもよい炭素数１〜５のアルコキシ基である。アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、１−ブチルオキシ基、１−ペンチルオキシ基等が挙げられ、また、２−プロピルオキシ基、イソブチルオキシ基等のように分枝したアルコキシ基、シクロプロピルオキシ基、シクロブチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基等の、側鎖の一部もしくは全部が環化したアルコキシ基も含む。アルコキシ基の有する置換基としては、例えば、アルキル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ハロゲノ基、シクロアルキル基、アシル基、アシルオキシ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、シアノ基、置換基を有してもよいカルバモイルアミノ基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基等が挙げられる。

また、Ｗ^１及びＷ^２は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、嵩高い置換基を表わす。嵩高い置換基とは、オリゴヌクレオチド誘導体に、その塩基配列と相同性のあるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが結合しようとする際に、結合をさまたげる立体障害を起こす置換基を意味する。
嵩高い置換基の具体例としては、例えば、下記一般式（２）〜（６）からなる群から選択される置換基が挙げられる。

上記式（２）において、Ｒ^１及びＲ^２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表わす。アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ぶちる基、ｎ−ペンチル基等が挙げられ、また、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基等の、側鎖の一部もしくは全部が環化したアルキル基も含む。また、Ｒ^１とＲ^２が結合して環を形成していてもよい。

また、Ｒ^３は水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表す。炭素数１〜５のアルキル基としては、Ｒ^１及びＲ^２において説明したのと同様である。
Ｒ^４は置換基を有していてもよい炭素数６〜５０のアルキル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基又はヘテロアリール基を表す。
アルキル基としては、例えば、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等の炭素数６〜５０のアルキル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、また、アルキル鎖内の炭素原子の一部が酸素原子、窒素原子又は硫黄原子に置換されていてもよい。上記置換基としては、例えば、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ハロゲノ、シクロアルキル、アシル、アシルオキシ、アシルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、置換基を有してもよいカルバモイルアミノ、アリール、ヘテロアリール、アラルキル等が挙げられる。

上記シクロアルキル基としては、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクノニル、シクロデカニル等の、環員数６から２０のシクロアルキルを表わし、置換基を有していてもよく、また、環内の炭素原子の一部が酸素原子、窒素原子、硫黄原子などに置き換わっていてもよい。上記置換基としては、例えば、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ハロゲノ、シクロアルキル、アシル、アシルオキシ、アシルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、置換基を有してもよいカルバモイルアミノ、アリール、ヘテロアリール、アラルキル等が挙げられる。ビシクロアルキル基としては、例えば、ビシクロオクチル、ビシクロヘプチル、ノルボルニル、アダマンチルなど環内のふたつの炭素原子が互いに結合して新たな環を形成した最も大きな環の環員数が６〜２０のビシクロアルキルが好ましく、これらは置換基を有していてもよく、また環内の炭素原子の一部が酸素原子、窒素原子、硫黄原子等に置き換わっていてもよい。
アリール基としては、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、ピレニル、ペンタセニル等が挙げられ、複数のベンゼン環が互いに縮環してなる置換基であってもよい。これらのアリール基は、１個以上の置換基を有していてもよい。
これらの置換基としては、例えば、アルキル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ハロゲノ基、シクロアルキル基、アシル基、アシルオキシ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、置換基を有してもよいカルバモイルアミノ基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基等が挙げられる。また、これらの置換基が違いに結合して環を形成していてもよい。

アラルキル基としては、例えば、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等の炭素数６〜５０のアルキル基の一部にアリール基又はヘテロアリール基が１個以上結合した基を表し、アルキル鎖内の炭素原子の一部が酸素原子、窒素原子、硫黄原子等に置換していてもよい。これらのアラルキル基上のアリール基又はヘテロアリール基は、１個以上の置換基を有していてもよい。上記置換基としては、例えば、アルキル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ハロゲノ基、シクロアルキル基、アシル基、アシルオキシ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、置換基を有してもよいカルバモイルアミノ基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基等が挙げられる。また、これらの置換基が違いに結合して環を形成していてもよい。

ヘテロアリール基としては、例えば、ピリジン、ピリミジン、フラン、チオフェン、ピロール、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、インドール、キナゾリン等のヘテロ原子を少なくとも１つ含有する芳香族化合物から得られる置換基が挙げられる。これらのヘテロアリール基は置換基を有していてもよい。上記置換基としては、例えば、アルキル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ハロゲノ基、シクロアルキル基、アシル基、アシルオキシ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、置換基を有してもよいカルバモイルアミノ基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基等が挙げられる。これらは、上記と同様に、１個以上の置換基を有していてもよく、互いに環を形成していてもよい。
また、Ｘ^１は酸素原子又は硫黄原子である。

上記一般式（３）において、Ｒ^５及びＲ^６は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素原子、又は炭素原子１〜５のアルキル基を表す。炭素原子１〜５のアルキル基としては、Ｒ^１及びＲ^２において説明したのと同様である。

また、Ｒ^７は置換基を有していてもよい炭素数６〜５０のアルキル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基又はヘテロアリール基を表す。これらは、上述した、Ｒ^４について説明したのと同様である。
Ｘ^１は、酸素原子又は硫黄原子を表す。

上記一般式（４）において、Ｒ^８及びＲ^９は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素原子、又は炭素原子１〜５のアルキル基を表す。炭素原子１〜５のアルキル基としては、Ｒ^１及びＲ^２において説明したのと同様である。

また、Ｒ^１０は置換基を有していてもよい炭素数６〜５０のアルキル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基又はヘテロアリール基を表す。これらは、上述した、Ｒ^４について説明したのと同様である。
Ｘ^１は、酸素原子又は硫黄原子を表す。

上記一般式（５）において、Ｒ^１１は、水素原子、又は炭素原子１〜５のアルキル基を表す。炭素原子１〜５のアルキル基としては、Ｒ^１及びＲ^２において説明したのと同様である。

また、Ｒ^１２は置換基を有していてもよい炭素数６〜５０のアルキル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基又はヘテロアリール基を表す。これらは、上述した、Ｒ^４について説明したのと同様である。

上記一般式（６）において、Ｒ^１３は、水素原子、又は炭素原子１〜５のアルキル基を表す。炭素原子１〜５のアルキル基としては、Ｒ^１及びＲ^２において説明したのと同様である。

また、Ｒ^１４及びＲ^１５は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ置換基を有していてもよい炭素数６〜５０のアルキル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基又はヘテロアリール基を表す。これらは、上述した、Ｒ^４について説明したのと同様である。また、Ｒ^１４及びＲ^１５は少なくとも１個が水素でない。
Ｘ^１は、酸素原子又は硫黄原子を表す。

本発明のヌクレオチドの製造方法に特に制限はないが、ホスホロアミダイド法を用い、５’末端側と、３’末端側に、後述する本発明の化合物を用いることにより、製造することができる。ホスホロアミダイド法は、従来公知の条件によって実施することができる。

次に、本発明の化合物について説明する。
本発明の化合物は、下記一般式（７）で表わされる。

上記一般式（７）において、Ｒ^１６は水酸基の保護基を表す。水酸基の保護基としては、ホスホロアミダイト法で用いられるものであれば特に制限はなく、トリチル基等が挙げられ、置換基を結合していているトリチル基が挙げられる。置換基を結合しているトリチル基としては、例えば、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基等が挙げられる。
Ｒ^１７及びＲ^１８は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表す。炭素数１〜５のアルキル基としては、Ｒ^１及びＲ^２において説明したのと同様である。

Ｒ^１９はリン酸基の保護基を表す。リン酸基の保護基としては、ホスホロアミダイト法に用いられるものであれば、特に制限なく用いることができ、例えば、メチル基、２−シアノエチル基、２−トリメチルシリルエチル基等が挙げられる。
Ｘ^２は、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜５のアルコキシ基、ケイ素原子上に炭素数１〜５のアルキル基を３個有するシリルオキシ基を表わす。
Ｗ^３は嵩高い置換基を表す。嵩高い置換基とは、オリゴヌクレオチド誘導体に、その塩基配列と相同性のあるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが結合しようとする際に、結合をさまたげる立体障害を起こす置換基を意味する。
嵩高い置換基の具体例としては、例えば、上述した、一般式（２）〜（６）からなる群から選択される置換基が挙げられる。

本発明の化合物の具体例としては、例えば、下記式（８）で表わされる化合物〔５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−４−Ｎ−シクロヘキシルカルバモイルデオキシシチジン３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト〕、下記式（９）で表わされる化合物〔５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−Ｎ−（シクロヘキシルカルバモイルメチル）チミジン３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト〕、下記式（１０）で表される化合物〔５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−Ｎ−（ジシクロヘキシルカルバモイルメチル）チミジン３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト〕等が挙げられる。

上記式（８）、（９）及び（１０）において、Ｒ^２０は、ジメトキシトリチル基である。

本発明の化合物の製造は、従来公知の方法を組み合わせて行うことができる。具体的には、後述する実施例に記載の方法によって製造することができる。
本発明の化合物は、上述した、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を製造するためのユニットとして用いられる。

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
公知の化合物、３’，５’−Ｏ−(テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジル)シチジン（300mg , 0.62mmol）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（脱水）6.2mlに溶解し、得られた溶液にイソシアン酸シクロヘキシル（90.5μＬ,0.69mmol）を加え、50℃で5時間反応させた。反応終了後、酢酸エチル（１０ｍＬ）を用いて反応溶媒を希釈した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム（１０ｍＬ）で3回抽出操作を行った後、有機層を集め溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに展開溶媒（クロロホルム／メタノール系）（１００：２，v/v）で精製し、３’，５’−Ｏ− (テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル)−４−Ｎ−シクロヘキシルカルバモイルシチジンを得た（336mg,89%）。
¹H NMR (500 MHz, DMSO)δ0.96−1.07(28H,m),1.23−1.37(5H,m),1.51(1H,m),1.64(2H, m) ,1.79(2H,m),3.57(1H,m),3.91−3.94(1H,m),4.02−4.06(3H,m),4.18−4.20(1H,m), 5.72(1H,m),6.28(1H,m),7.96(1H,m),7.97(1H,m),9.78(1H,m)

実施例２
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（脱水）190mlにデオキシシチジン塩酸塩（5.0g ,19mmol）を加え、次いでトリエチルアミン2.63ml,19mmol）及びイソシアン酸シクロヘキシル（2.47ml,19mmol）を加え、50℃で5時間反応させた。反応終了後、溶媒を減圧下留去し、クロロホルム/イソプロピルアルコール（3 : 1）（１００ｍＬ）を用いて反応溶媒を希釈した。有機層を水（１００ｍＬ）で3〜4回抽出操作を行った後、有機層を集め溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに展開溶媒（クロロホルム / メタノール系）（１００：５，v/v）で精製し、４−Ｎ−シクロヘキシルカルバモイルデオキシシチジンを得た（5.94g 89%）。
¹H NMR(500MHz,DMSO)δ1.23−1.34(5H,m),1.50(1H,m),1.63(2H,m),1.78(2H,m), 1.96−2.08(1H,m),2.20−2.25(1H,m),3.21−3.28(1H,m),3.31−3.41(1H,m),3.55−3.59(1H,m), 3.82(1H,m),4.21(1H,m),5.25(1H,m),6.08−6.11(1H,m),6.24(1H,m),8.14−8.15(1H,m), 9.78(1H,m)

上述のようにして得られた４−Ｎ−シクロヘキシルカルバモイルデオキシシチジン（1.0g,2.84mmol）にピリジン（脱水）（５ｍＬ）を加えて共沸した後、ピリジン（脱水）28.4mlに溶解させた。得られた溶液に４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（1.15g,3.41mmol）を加え、室温で3時間反応させた。反応終了後、メタノールでクエンチした後、溶媒を減圧下留去し、酢酸エチル（５０ｍＬ）で反応溶媒を希釈した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム（５０ｍＬ）で3回抽出操作を行い、有機層を集め硫酸ナトリウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー0.5%のピリジンを添加した展開溶媒（クロロホルム／メタノール系）（１００：３，v/v）で精製し、５’−Ｏ− (４，４’−ジメトキシトリチル)−４−Ｎ−クロヘキシルカルバモイルデオキシシチジンを得た（1.45g ,78%）。
¹H NMR(500 MHz,DMSO)δ1.22−1.34(5H,m),1,50−1.51(1H,m),1.64−1.65(2H,m),1.79−1.81(2H,m),2.08−2.14(1H,m),2.28−2.33(1H,m),3.25(1H,m),3.33−3.36(1H,m), 3.58−3.59(1H,m),3.72−3.74(6H,m),3.93−3.95(1H,m),4.26−4.28(1H,m),5.34(1H,m), 6.10−6.12(2H,m),6.88−6.90(4H,m),7.22−7.38(9H,m),7.95−7.97(1H,m),9.81(1H,m)

上述のようにして得られた５’−Ｏ− (４，４’−ジメトキシトリチル)−４−Ｎ−クロヘキシルカルバモイルデオキシシチジン（200mg,0.305mmol）を、ピリジン（脱水）、トルエン（脱水）、ジクロロメタン（脱水）の順で各々3回ずつ共沸した後、ジクロロメタン（脱水）3.05mlに溶解させた。得られた溶液にテトラゾール（12.8mg,0.183mol,0.6equiv）、ジイソプロピルアミン（25.9μl,0.183mmol,0.6equiv）及び２−シアノエチル−ビス(Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル)−ホスホロアミダイト（242.3μl,0.763mmol,2.5equiv）を加え、室温で2.5時間反応させた。水でクエンチした後、溶媒を減圧下留去し、酢酸エチル（１０ｍＬ）で反応溶媒を希釈した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム（１０ｍＬ）で3回抽出操作を行った後、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を展開溶媒としてクロロホルムを用いてリサイクルで精製し、式（８）で表わされる化合物、５’−Ｏ− (４，４’−ジメトキシトリチル)−４−Ｎ−シクロヘキシルカルバモイルデオキシシチジンを得た（106.5g,41%）。
¹H NMR(500MHz,DMSO)δ1.02−1.15(12H,m),1.18−1.26(5H,m),1,51−1.53(1H,m),1.64 (2H,m),1.84(2H,m),2.10−2.13(1H,m),2.37(1H,m),2.57−2.66(2H,m),3.27−3.29(1H,m), 3.35−3.37(1H,m),3.40−3.41(2H,m),3.58(1H,m),3.67−3.69(2H,m),3.72−3.74.(6H,m), 4.16(1H,m),4.46−4.54(1H,m),6.16−6.19(2H,m),6.58(1H,m),6.77(4H,m),7.14−7.33 (9H,m),7.90−8.00(1H,m),10.81(1H, m)、³¹P NMR(500 MHz,DMSO)δ149.2,150.2

実施例３
ｖ公知の化合物である５’−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−３’−Ｏ− (t−ブチルジメチルシリル)チミジン（3.0g,4.56mmol）をテトラヒドロフラン45.6mlに溶解した。得られた溶液水素化ナトリウム（131mg,5.46mmol）を加え、室温で1時間反応させた。累で、ブロモ酢酸エチル（680μl,6.10mmol）を加え室温で4時間反応させた。メタノールでクエンチした後、酢酸エチル（１００ｍＬ）で反応溶媒を希釈した。有機層を飽和食塩水（１００ｍＬ）で3回抽出操作を行い、有機層を集め硫酸ナトリウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに0.5%のトリエチルアミンを添加した展開溶媒（ヘキサン／クロロホルム系）（１００：２，v/v）で精製し、５’−Ｏ− (４、４’−ジメトキシトリチル)−３’−Ｏ− (t-ブチルジメチルシリル)−３−Ｎ−エトキシカルボニルメチルチミジンを得た（2.4g,71%）。
¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ0.06(6H,m),0.85−0.86(9H,m),1.32−1.35(3H,m),1.55(3H,m), 2.25−2.29(1H,m),2.36−2.40(1H,m),3.29−3.31(1H,m),3.52−3.53(1H,m),3.83(6H,m), 4.00(1H,m),4.24−4.29(2H,m),4.54−4.57(1H,m),4.74(2H,m),6.38−6.41(1H,m),6.86− 6.90(4H,m),7.27−7.36(7H,m),7.44−7.46(2H,m),7.75(1H,m)

上述のようにして得られた５’−Ｏ− (４、４’−ジメトキシトリチル)−３’−Ｏ− (t-ブチルジメチルシリル)−３−Ｎ−エトキシカルボニルメチルチミジン（500mg,0.67mmol）を1.2M 水酸化ナトリウム水溶液：エタノール＝1：3の混合溶媒（１０ｍＬ）に溶解させ、室温で30分間反応させた。反応終了後、酢酸エチル（２０ｍＬ）で反応溶媒を希釈し、さらにトリエチルアミンを5ml加えた。この有機層を水で１回抽出操作を行い、有機層を集め溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに0.5%のトリエチルアミンを添加した展開溶媒（クロロホルム系／メタノール）（１００：５，v/v）で精製し、５’−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−３’−Ｏ− (t−ブチルジメチルシリル)−３−Ｎ−カルボキシメチルチミジントリエチルアミン塩を得た（473mg,86%）。
¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ0.06(6H,m),0.87(9H,m),1.29−1.32(9H,m),1.57(3H,m), 2.26−2.30(1H,m),2.35−2.37(1H,m),3.08−3.12(6H,m),3.27−3.30(1H,m),3.50−3.54(1H,m), 3.84(6H,m),3.98(1H,m),4.54−4.59(1H,m),4.62−4.66(2H,m),6.42−6.44(1H,m),6.87− 6.90(4H,m),7.30−7.36(7H,m),7.46−7.48(2H,m),7.71(1H, m)

上述のようにして得られた５’−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−３’−Ｏ− (t−ブチルジメチルシリル)−３−Ｎ−カルボキシメチルチミジントリエチルアミン塩（373mg,0.457mmol）をジクロロメタン4.57mlに溶解させた後、シクロヘキシルアミン（1.23ml,10.8mmol）、及びＮ，Ｎ−ビス−(２−オキソ−３−オキサゾリジニル)−ホスフィン酸クロリド（1.40g,5.48mmol）を加え、室温で6時間反応させた。水でクエンチした後、酢酸エチル（１０ｍＬ）で反応溶媒を希釈し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム（１０ｍＬ）で２回抽出操作を行った。有機層を集め溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに0.5%のトリエチルアミンを添加した展開溶媒（ヘキサン／酢酸エチル系）（３０：７０，v/v）で精製し、５’−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−３’−Ｏ−(t−ブチルジメチルシリル)−３−Ｎ− (シクロヘキシルカルバモイルメチル)チミジンを得た（236mg , 65%）。
¹H NMR (500 MHz, CDCl₃)δ0.06 (6H, m) , 0.85−0.87 (9H, m) ,1.19−1.23 (3H, m), 1.29−1.37 (3H, m) , 1.55 (3H, m) , 1.61−1.63 (2H, m) , 1.73−1.75 (2H, m), 2.24−2.29 (1H, m), 2.37−2.40(1H, m) , 3.29−3.30 (1H, m) , 3.52−3.53 (1H, m) , 3.82−3.84 (6H, m), 3.99 (1H, m), 4.55 (1H, m) , 4.60 (2H, m) , 5.56−5.58 (1H, m), 6.39−6.41(1H, m), 6.88−6.89(4H,m), 7.27−7.36 (7H, m), 7.44−7.46(2H, m), 7.74 (1H, m)

上述のようにして得られた５’−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−３’−Ｏ−(t−ブチルジメチルシリル)−３−Ｎ− (シクロヘキシルカルバモイルメチル)チミジン（290mg, 0.363mmol）にピリジン（脱水）（５ｍＬ）を加えて3回共沸した後、ピリジン（脱水）3.63mlに溶解させた。得られた溶液にトリエチルアミントリヒドロフルオリド（118.2μＬ,0.73mmol）及びトリエチルアミン（100.6μＬ, 0.73mmol）を加え、室温で24時間反応させた。水でクエンチした後、酢酸エチル（１０ｍＬ）で反応溶媒を希釈した。有機層を飽和食塩水で3回抽出操作を行い、有機層を集め硫酸ナトリウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに0.5%のトリエチルアミンを添加した展開溶媒（ヘキサン／酢酸エチル系）（１０：９０，v/v）で精製し、５’−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−３−Ｎ− (シクロヘキシルカルバモイルメチル)チミジンを得た（234.2mg , 94%）。
¹H NMR (500 MHz, CDCl₃)δ1.14−1.22 (3H, m), 1.30−1.39 (3H, m) , 1.51 (3H, m) , 1.61−1.64 (2H, m) , 1.70−1.73 (2H, m) , 2.35−2.40 (1H, m), 2.45−2.49 (1H, m) , 3.39−3.40 (1H, m) , 3.50−3.51(1H, m), 3.83 (6H, m) , 4.08 (1H, m) , 4.55−4.61 (3H, m) , 5.86−5.88(1H, m) , 6.46-6.47 (1H, m) , 6.87−6.89 (4H, m), 7.25−7.35 (7H, m) , 7.44−7.45 (2H, m), 7.69 (1H, m)

上述のようにして得られた５’−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−３−Ｎ− (シクロヘキシルカルバモイルメチル)チミジン（243.2mg , 0.343mmol）をピリジン（脱水）（５ｍＬ）、トルエン（脱水）（５ｍＬ）、ジクロロメタン（脱水）（５ｍＬ）の順で各々3回ずつ共沸した後、ジクロロメタン（脱水）3.43mlに溶解させた。これにテトラゾール（14.4mg , 0.206mol）、ジイソプロピルアミン（29.0μＬ, 0.206mmol）及び２−シアノエチル−ビス(Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト（180μＬ, 0.567mmol）を加え、室温で20時間反応させた。水でクエンチした後、酢酸エチルで反応溶媒を希釈した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで3回抽出操作を行った後、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに0.5%のトリエチルアミンを添加した展開溶媒（ヘキサン/酢酸エチル系）で粗精製した。残った試薬残渣を取り除くために、これをジエチルエーテルで溶解し、５％炭酸ナトリウムで3回抽出操作を行い、溶媒を減圧下留去して、式（９）で表わされる化合物、５’−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−３−Ｎ− (シクロヘキシルカルバモイルメチル)チミジン３‘−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト)を得た（208.5mg , 69%）。
1H NMR (500 MHz, CDCl₃)δ1.13−1.16 (12H, m) , 1.21−1.25 (3H, m) , 1.29−1.38 (3H, m) , 1.44 (3H, m) , 1.58−1.60 (2H, m) , 1.68−1.71 (2H, m) , 2.32−2.41 (1H, m) , 2.47−2.56 (1H, m) , 3.31 (1H, m) , 3.47−3.50 (1H, m) , 3.72-3.84 (6H, m) , 4.13−4.16 (1H, m) , 4.55 (2H, m) , 4.63 (1H, m) , 5.55 (1H, m) , 6.40−6.42 (1H, m) , 6.83 (4H, m) , 7.24-7.30 (7H, m) , 7.36-7.40 (2H, m) , 7.65−7.69 (1H, m)
³¹P NMR (500 MHz, CDCl₃)δ149.1 , 149.6

実施例４
実施例３の中間物質として得られた、５’−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−３’−Ｏ− (t−ブチルジメチルシリル)−３−Ｎ−カルボキシメチルチミジントリエチルアミン塩（500mg, 0.612mmol）をジクロロメタン6.12mlに溶解させた後、ジシクロヘキシルアミン（486μＬ,2.44mmol）及びＮ，Ｎ−ビス−(２−オキソ−３−オキサゾリジニル)−ホスフィン酸クロリド（155.8mg, 0.612mmol）を加え、30℃で20時間反応させた。水でクエンチした後、酢酸エチル（１０ｍＬ）で反応溶媒を希釈し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで２回抽出操作を行った。有機層を集め硫酸ナトリウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに0.5%のトリエチルアミンを添加した展開溶媒（ヘキサン／酢酸エチル系）（３０：７０，v/v）で精製し、５’−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−３’−Ｏ− (t−ブチルジメチルシリル)−３−Ｎ− (ジシクロヘキシルカルボバモイルメチル)チミジンを得た（268mg , 50%）。
¹H NMR (500 MHz, CDCl₃)δ0.04−0.06 (6H, m), 0.86 (9H, m), 1.03−1.10(6H, m), 1.27−1.33 (6H, m) , 1.54 (3H, m) , 1.58−1.66 (4H, m) , 1.71−1.80 (4H, m) , 2.28−2.32 (1H, m) , 2.38−2.40 (1H, m) , 3.29−3.30 (1H, m), 3.53−3.54 (1H, m) , 3.82 (6H, m) , 3.98 (1H, m) , 4.59 (1H, m) , 4.78 (2H, m) , 6.42 (1H, m) , 6.88−6.89 (4H, m), 7.27−7.37 (7H, m) , 7.45−7.47 (2H, m) , 7.77 (1H, m)

上述のようにして得られた５’−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−３’−Ｏ− (t−ブチルジメチルシリル)−３−Ｎ− (ジシクロヘキシルカルボバモイルメチル)チミジン（268mg , 0.304mmol）にピリジン（脱水）（５ｍＬ）を加えて3回共沸した後、ピリジン（脱水）3.04mlに溶解させた。得られた溶液にトリエチルアミントリヒドロフルオリド（99.2μＬ,0.609mmol）及びトリエチルアミン（84.4μＬ, 0.609mmol）を加え、室温で2.5時間反応させた。水でクエンチした後、酢酸エチルで反応溶媒を希釈した。有機層を飽和食塩水で3回抽出操作を行い、有機層を集め硫酸ナトリウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに0.5%のトリエチルアミンを添加した展開溶媒（ヘキサン／酢酸エチル系）（１０：９０，v/v）で精製し、５’−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−３−Ｎ− (ジシクロヘキシルカルバモイルメチル)チミジンを得た（210.0mg , 90%）。
¹H NMR (500 MHz, CDCl₃)δ1.09-1.20 (6H, m), 1.31−1.33 (6H, m) , 1.48 (3H, m) , 1.51−1.55 (4H, m) , 1.71−1.73 (4H, m) , 2.32−2.35 (1H, m) , 2.36−2.39 (1H, m) , 3.33−3.36 (1H, m) , 3.46−3.49 (1H, m) , 3.79 (6H, m) , 4.01 (1H, m) , 4.54 (1H, m) , 4.71 (2H, m) , 6.41−6.44 (1H, m) , 6.83−6.84 (4H, m) , 7.23−7.31 (7H, m) , 7.39−7.41 (2H, m) , 7.62 (1H, m)

上述のようにして得られた５’−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−３−Ｎ− (ジシクロヘキシルカルバモイルメチル)チミジン（210mg, 0.274mmol）をピリジン（脱水）、トルエン（脱水）、ジクロロメタン（脱水）の順で各々3回ずつ共沸した後、ジクロロメタン（脱水）2.74mlに溶解させた。得られた溶液にテトラゾール（11.5mg, 0.165mol）、ジイソプロピルアミン（23.3μＬ, 0.165mmol）及び２−シアノエチル−ビス(Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル)−ホスホロアミダイト（95.9μＬ, 0.302mmol）を加え、室温で24時間反応させた。水でクエンチした後、酢酸エチル（１０ｍＬ）で反応溶媒を希釈した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで3回抽出操作を行った後、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに0.5%のトリエチルアミンを添加した展開溶媒（ヘキサン／酢酸エチル系）（４０：６０，v/v）で精製し、式（１０）で表わされる化合物、５’−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−３−Ｎ− (ジシクロヘキシルカルバモイルメチル)チミジン３’−(２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）を得た（134mg , 51%）。
¹H NMR (500 MHz, CDCl₃)δ1.04(12H, m) , 1.09−1.20 (6H, m) , 1.30−1.33 (6H, m) , 1.44 (3H, m), 1.50−1.56 (4H, m), 1.67−1.75 (4H, m), 2.31−2.39 (1H, m), 2.46−2.54 (1H, m), 3.28−3.31 (1H, m), 3.47−3.49 (1H, m), 3.79−3.83 (6H, m), 4.10−4.14 (1H, m), 4.61−4.65 (1H, m), 4.72 (2H, m), 6.43−6.45 (1H, m), 6.84 (4H, m), 7.24−7.30 (7H, m), 7.40 (2H, m) , 7.64-7.68 (1H, m)
³¹P NMR (500 MHz, DMSO)δ149.0 , 149.6

実施例５
公知の化合物３’−５’−Ｏ−ビス−(t−ブチルジメチルシリル)デオキシシチジン（2g, 4.39mmol）をジクロロメタン43.9mlに溶解させた後、ピリジン（531.9μＬ, 6.59mmol）、クロロ炭酸フェニル（660μＬ, 5.27mmol）を加え、室温で30分間反応させた。反応終了後、クロロホルム（５０ｍＬ）で反応溶媒を希釈し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで3回抽出操作を行い、有機層を集め硫酸ナトリウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去し中間体を得た。次いで、ピリジン（脱水）（５ｍＬ）を加えて１回共沸した後、ピリジン（脱水）219.5mlに溶解させた。得られた溶液に１，５−ジアミノナフタレン（3.47g , 22.0mmol）を加え、70℃で1時間反応させた。反応終了後、溶媒を減圧下留去し、クロロホルム（２５０ｍＬ）で反応溶媒を希釈した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで3回抽出操作を行い、有機層を集め硫酸ナトリウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をNHシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒（ヘキサン／酢酸エチル系）（５０：５０，v/v）で精製し、３’−５’−Ｏ−ビス-(t-ブチルジメチルシリル)−４−Ｎ−[Ｎ− (アミノナフタレン−５−イル)カルバモイル]デオキシシチジンを得た（1.13g , 40%）。
¹H NMR (500 MHz, CD₃OD)δ0.13−0.17 (12H, m) , 0.93−0.96 (18H, m) , 2.20−2.25 (1H, m) , 2,48−2.53 (1H, m) , 3.85−3.87 (1H, m) , 3.96−4.03 (2H, m) , 4.49−4.52 (1H, m) , 6.24−6.26 (1H, m) , 6.29−6.30 (1H, m) , 6.87−6.88 (1H, m) , 7.37−7.42 (2H, m) , 7.67−7.69 (1H, m) , 7.84−7.86 (1H, m) , 8.00−8.01 (1H, m) , 8.33−8.35 (1H, m)

上述のようにして得られた３’−５’−Ｏ−ビス−(t−ブチルジメチルシリル)−４−Ｎ−[Ｎ−(アミノナフタレン−５−イル)カルバモイル]デオキシシチジン（630mg, 0.984mmol）にピリジン（脱水）（５ｍＬ）を加えて3回共沸した後、ピリジン（脱水）9.84mlに溶解させた。得られた溶液にシクロヘキサンカルボニルクロリド（129μＬ, 0.984mmol）を加え、室温で30分間反応させた。水でクエンチした後、酢酸エチル（３０ｍＬ）で反応溶媒を希釈した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで3回抽出操作を行い、有機層を集め硫酸ナトリウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去し、中間体を得た。次いで、ピリジン（脱水）（５ｍＬ）を加えて3回共沸した後、ピリジン（脱水）9.84mlに溶解させた。得られた溶液にトリエチルアミントリヒドロフルオリド（962μＬ, 5.9mmol）及びトリエチルアミン（818μＬ, 5.9mmol）を加え、室温で16時間反応させた。水でクエンチした後、クロロホルム（３０ｍＬ）で反応溶媒を希釈した。有機層を飽和食塩水で3回抽出操作を行い、有機層を集め硫酸ナトリウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。この際に析出してくる結晶を吸引ろ過し、さらにジエチルエーテルで洗いこみを行い、４−Ｎ−[Ｎ−（Ｎ−シクロヘキサンカルボニルアミノナフタレン−５−イル)カルバモイル]デオキシシチジンを得た（330mg, 64%）。
¹H NMR (500 MHz, CD₃OD)δ1.31−1.36 (1H, m), 1.41−1.49 (2H, m), 1.60−1.67 (2H, m), 1.76−1.78 (1H, m) , 1.88−1.91 (2H, m), 2.03−2.05 (2H, m), 2.49−2.54 (1H, m), 2.58−2.63 (1H, m), 3.76−3.77 (1H, m), 3.84−3.87 (1H, m), 4.02−4.03 (1H, m), 4.40−4.41 (1H, m), 6.29−6.30 (2H, m), 7.51−7.54 (1H, m), 7.60−7.64 (2H, m), 7.80−7.82 (1H, m), 8.09−8.11 (1H, m), 8.25−8.27 (1H, m), 8.42−844 (1H, m)

上述のようにして得られた４−Ｎ−[Ｎ−（Ｎ−シクロヘキサンカルボニルアミノナフタレン−５−イル)カルバモイル]デオキシシチジン（330mg , 0.633mol）にピリジン（脱水）（５ｍＬ）を加えて3回共沸した後、ピリジン（脱水）6.33mlに溶解させた。得られた溶液に４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（257mg , 0.760mmol）を加え、室温で2時間反応させた。メタノールでクエンチした後、酢酸エチル（２０ｍＬ）で反応溶媒を希釈した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで3回抽出操作を行い、有機層を集め硫酸ナトリウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに0.5%のトエチルアミンを添加した展開溶媒（クロロホルム／メタノール系）（１００：１．５，v/v）で精製し、５’−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−４−Ｎ−[Ｎ−（Ｎ−シクロヘキサンカルボニルアミノナフタレン−５−イル)カルバモイル]デオキシシチジンを得た（430mg, 82%）。
¹H NMR (500 MHz, CD₃OD)δ1.31−1.36 (1H, m), 1.41−1.49(2H, m) , 1.60−1.67 (2H, m) , 1.76−1.78 (1H, m) , 1.89−1.91 (2H, m) , 2.03−2.05 (2H, m) , 2.36−2.38 (1H, m) , 2.59−2.64 (2H, m) , 3.49 (2H, m) , 3.78 (6H, m) , 4.12 (1H, m) , 4.53 (1H, m) , 6.01−6.02 (1H, m) , 6.24 (1H, m) , 6.89 (4H, m) , 7.24−7.26 (1H, m) , 7.30−7.33 (6H, m) , 7.42−7.43 (2H, m) , 7.51−7.54 (1H, m) , 7.59−7.62 (2H, m) , 7.80−7.82 (1H, m) , 8.08 (1H, m) , 8.25−8.29 (2H, m)

上述のようにして得られた、５’−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−４−Ｎ−[Ｎ−（Ｎ−シクロヘキサンカルボニルアミノナフタレン−５−イル)カルバモイル]デオキシシチジン（430mg , 0.522mmol）をピリジン（脱水）、トルエン（脱水）、ジクロロメタン（脱水）の順で各々3回ずつ共沸した後、ジクロロメタン（脱水）5.22mlに溶解させた。これにテトラゾール（21.9mg , 0.313mol）、ジイソプロピルアミン（44.2μＬ, 0.313mmol）及び２−シアノエチル−ビス(Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル)−ホスホロアミダイト（182μl , 0.574mmol）を加え、室温で3時間反応させた。水でクエンチした後、ジエチルエーテル（３０ｍＬ）で反応溶媒を希釈した。有機層を5％炭酸ナトリウムで7回抽出操作を行った後、有機層を集め溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を展開溶媒としてアセトニトリルを用いて精製し、５’−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−４−Ｎ−[Ｎ−（Ｎ−シクロヘキサンカルボニルアミノナフタレン−５−イル)カルバモイル]デオキシシチジン３’−(２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）を得た（420mg , 78%）。
¹H NMR (500 MHz, CD₃OD)δ1.15−1.20 (12H, m), 1.31−1.36 (1H, m) , 1.41−1.49 (2H, m) , 1.62−1.65 (2H, m) , 1.76−1.78 (1H, m), 1.90 (2H, m), 2.03−2.05 (2H, m), 2.50 (1H, m), 2.59−2.62 (2H, m) , 2.67−2.73 (2H, m), 3.45−3.47 (1H, m) , 3.54(1H, m), 3.60−3.67 (2H, m), 3.21−3.76 (2H, m), 3.78 (6H, m), 4.19−4,24 (1H, m), 4.74−4.76 (1H, m), 5.99 (1H, m), 6.02−6.25 (1H, m) , 6.89 (4H, m), 7.23−7.26 (1H, m), 7.33 (6H, m), 7.44 (2H, m), 7.52 (1H, m), 7.60−7.62 (2H, m), 7.80 (1H, m), 8.09 (1H, m), 8.26 (1H, m), 8.328.35 (1H, m) ³¹P NMR (500 MHz, CD₃OD) δ149.9

実施例６
実施例２で得られたホスホロアミダイトユニット（５’−Ｏ− (４，４’−ジメトキシトリチル)−４−Ｎ−シクロヘキシルカルバモイルデオキシシチジン）を３’末端、および５’末端に用いて、ABI DNA/RNA synthesized 392を用いて、標準のRNA合成プロトコールに従ってオリゴヌクレオチドを製造した。天然型塩基をもつホスホロアミダイトユニットはGlen Research Incより購入した。実施例２で得られたホスホロアミダイトユニットを無水アセトニトリルに0.1Ｍの濃度となるよう溶解し、上記DNA自動合成機を用いて、Ｚ₁ＵＡＵＡＣＡＡＣＣＵＡＣＵＡＣＣＺ₂（配列番号：１）の配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。Ｚ_１及びＺ_２は実施例２で得られたホスホロアミダイトユニット残基である（以下の実施例において同様である）。固相担体としてはGlen research Incより購入した Universal Support II（０．１μmol)を用いた。合成したオリゴヌクレオチドの脱保護および切り出しは、２Ｍアンモニア／メタノールを用いて２時間行った後、固相担体を濾過にて取り除いた後、ろ液を濃縮し、改めて２８％アンモニア水を加え、８時間放置することにより行った。
なお、合成したオリゴヌクレオチドの構造は以下のようにMALDI TOF質量分析法により決定した。
MALDI-TOF 質量分析 calcd. 6019.22, Found 6014.04

実施例７
実施例３で得られたホスホロアミダイトユニット（５’−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−３−Ｎ− (シクロヘキシルカルバモイルメチル)チミジン３‘−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト)）を３’末端、及び５’末端に用いて、実施例６と同様に操作を行い、Ｚ₁ＵＡＵＡＣＡＡＣＣＵＡＣＵＡＣＣＺ₂（配列番号：２）の配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。合成したオリゴヌクレオチドの構造は以下のようにMALDI TOF質量分析法により決定した。
MALDI-TOF 質量分析 calcd. 6077.25, Found 6081.35.

実施例８
実施例４で得られたホスホロアミダイトユニット（５’−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−３−Ｎ− (シクロヘキシルカルバモイルメチル)チミジン３‘−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト)）を３’末端、及び５’末端に用いて、実施例６と同様に操作を行い、Ｚ₁ＵＡＵＡＣＡＡＣＣＵＡＣＵＡＣＣＺ₂（配列番号：３）の配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。合成したオリゴヌクレオチドの構造は以下のようにMALDI TOF質量分析法により決定した。
MALDI-TOF 質量分析 calcd. 6241.41, Found 6244.58

実施例９
実施例６で得られたオリゴヌクレオチドと、下記配列番号：４、又は配列番号：５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを、各オリゴヌクレオチドの濃度が２μＭになるように、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）−１ＭＮａＣｌ中に溶解した。得られた溶液を、９０℃に加温し、２０分間９０℃に維持した後、１分間に１℃の割合で５℃まで冷却し、再度同じ速度で９０℃まで加温した。温度を加温する間の２６０ｎｍのＵＶ吸収を測定し、ＵＶ−融解曲線を得た。得られたＵＶ融解曲線を微分し、極大値を与える温度をＴｍ値とした。
配列番号：４
５’−ＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＡＴＡ−３’
配列番号：５
５’−ＡＴＴＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＡＴＡＴＡＡ−３’

実施例６で得られたオリゴヌクレオチドと、配列番号：４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとのＴｍ値は６３．６℃であり、配列番号：１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号：５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとのＴｍ値は６２．９℃であった。
実施例６で得られたオリゴヌクレオチドと配列番号：４とは、塩基の数が同じであり、配列番号：５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは、実施例６で得られたオリゴヌクレオチドよりも塩基長は長いものであり、それぞれのＴｍ値は０．７℃異なっていた。

一方、実施例６で得られたオリゴヌクレオチドの３’末端及び５’末端にＺ_１及びＺ_２を有しないオリゴヌクレオチドを用いて同様にＴｍ値の測定を行ったところ、配列番号：４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのＴｍ値は６０．３℃であり、配列番号：５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのＴｍ値は６２．１℃であった。すなわち、Ｚ_１及びＺ_２を有しないオリゴヌクレオチドを用いた場合は、鎖長の長いオリゴヌクレオチドの方がターゲットのより強く結合することがわかった。これに対し、実施例６で得られたオリゴヌクレオチドの場合は、鎖長の長いオリゴヌクレオチドの方が親和性が低下していることがわかった。

Claims

一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体。

（上記式中、Ｒは水素、アルキル基、又は水酸基の保護基を表し、ｎは１〜５０の整数を表し、Ｂ^ｎは天然又は非天然の核酸塩基を表わし、Ｘは、水素原子、水酸基、又は置換基を有していてもよい炭素数１〜５のアルコキシ基を表し、Ｗ^１及びＷ^２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、嵩高い置換基を表す。）
一般式（１）において、Ｗ^１及びＷ^２が、下記一般式（２）〜（６）からなる群から選択される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。

（上記式中、Ｒ^１及びＲ^２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ^１とＲ^２が結合して環を形成していてもよく、Ｒ^３は水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ^４は置換基を有していてもよい炭素数６〜５０のアルキル基、シクロアルキル基、ビシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基又はヘテロアリール基を表し、Ｘ^１は酸素原子又は硫黄原子を表す。）

（上記式中、Ｒ^５及びＲ^６は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ^７は、置換基を有していてもよい炭素数６〜５０のアルキル基、シクロアルキル基、ビシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基又はヘテロアリール基を表し、Ｘ^１は酸素原子又は硫黄原子を表す。）

（上記式中、Ｒ^８及びＲ^９は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ^１０は、置換基を有していてもよい炭素数６〜５０のアルキル基、シクロアルキル基、ビシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基又はヘテロアリール基を表し、Ｘ^１は酸素原子又は硫黄原子を表す。）

（上記式中、Ｒ^１１は水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ^１２は、置換基を有していてもよい炭素数６〜５０のアルキル基、シクロアルキル基、ビシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基又はヘテロアリール基を表しす。）

（上記式中、Ｒ^１３は、水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ^１４及びＲ^１５は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ置換基を有していてもよい炭素数６〜５０のアルキル基、シクロアルキル基、ビシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基又はヘテロアリール基を表し、Ｒ^１４及びＲ^１５は少なくとも１個が水素でなく、Ｘ^１は酸素原子又は硫黄原子を表す。）
Ｒが、置換基を結合していてもよいトリチル基である、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
一般式（７）で表わされる化合物。

（式中、Ｒ^１６は水酸基の保護基を表し、Ｒ^１７及びＲ^１８は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ^１９はリン酸基の保護基を表し、Ｘ^２は、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜５のアルコキシ基、ケイ素原子上に炭素数１〜５のアルキル基を３個有するシリルオキシ基を表し、Ｗ^３は嵩高い置換基を表す。）
一般式（７）において、Ｗ^３が、下記一般式（２）〜（６）からなる群から選択される、請求項４「に記載の化合物。

（上記式中、Ｒ^１及びＲ^２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ^１とＲ^２が結合して環を形成していてもよく、Ｒ^３は水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ^４は置換基を有していてもよい炭素数６〜５０のアルキル基、シクロアルキル基、ビシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基又はヘテロアリール基を表し、Ｘ^１は酸素原子又は硫黄原子を表す。）

（上記式中、Ｒ^５及びＲ^６は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ^７は、置換基を有していてもよい炭素数６〜５０のアルキル基、シクロアルキル基、ビシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基又はヘテロアリール基を表し、Ｘ^１は酸素原子又は硫黄原子を表す。）

（上記式中、Ｒ^８及びＲ^９は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ^１０は、置換基を有していてもよい炭素数６〜５０のアルキル基、シクロアルキル基、ビシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基又はヘテロアリール基を表し、Ｘ^１は酸素原子又は硫黄原子を表す。）

（上記式中、Ｒ^１１は水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ^１２は、置換基を有していてもよい炭素数６〜５０のアルキル基、シクロアルキル基、ビシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基又はヘテロアリール基を表しす。）

（上記式中、Ｒ^１３は、水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ^１４及びＲ^１５は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ置換基を有していてもよい炭素数６〜５０のアルキル基、シクロアルキル基、ビシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基又はヘテロアリール基を表し、Ｒ^１４及びＲ^１５は少なくとも１個が水素でなく、Ｘ^１は酸素原子又は硫黄原子を表す。）
Ｒ^１６が、ジメトキシトリチル基である、請求項５に記載の化合物。