KR20240005930A - 포스포로티오에이트 및 보라노포스페이트를 포함하는 키메라형 핵산 올리고머 및 그 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
신규 핵산 올리고머 및 그의 제조 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 핵산 올리고머는 일반식 (1)로 표시되는 뉴클레오티드 단위 및 일반식 (2)로 표시되는 뉴클레오티드 단위를 포함하고, 일반식 (3)으로 표시되는 뉴클레오티드 단위를 포함하거나 포함하지 않는다. 일반식 (1), (2) 및 (3) 중, R1은 수소 원자, 수산기, 알콕시기, 알케닐옥시기, 아실옥시기, 트리알킬실릴옥시기, 알콕시알콕시기, 할로알콕시알콕시기, 또는 할로게닐기를 나타내고, R2는 수소 원자를 나타내거나, R1 및 R2는 서로 결합하여 치환기를 갖거나 갖지 않으며, 또한, 헤테로원자를 갖거나 갖지 않는 5원 이상의 환을 형성하고, Bs는 아데닌, 구아닌, 시토신, 5-메틸시토신, 티민, 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산 염기를 나타내고, 상기 핵산 염기는 핵산 염기의 보호기를 가져도 좋고, X+는 카운터 양이온을 나타낸다.
Description
본 발명은 핵산 올리고머 및 그 제조방법에 관한 것이다.
표적 핵산과 상보적인 염기 서열을 갖는 안티센스 분자는, 표적 핵산과 상보적인 이중사슬을 형성하여 표적 핵산으로부터의 단백질 생성을 저해할 수 있다. 표적 핵산으로서 질병 관련 유전자를 선택한 경우에는, 안티센스 분자는 질병 관련 유전자에 직접 작용하기 때문에 유전자 치료에 유효한 의약으로서 주목받고 있다.
안티센스 분자(핵산 올리고머)는 표적이 되는 단백질의 생성을 효율적으로 저해하는 관점에서 주로 세포막 투과성, 뉴클레아제 내성, 체내(예를 들어, pH 7.4의 환경하)에서의 화학적 안정성, 및 특정 염기 서열과만 안정한 이중사슬을 형성하는 성질을 갖는 것이 요구된다. 안티센스 분자로서는, 예를 들면, 포스포로티오에이트 화합물을 이용하여 얻어지는 핵산 올리고머(이하, 「포스포로티오에이트형 핵산 올리고머」라고 명명한다)(비특허문헌 1) 및 보라노포스페이트 화합물을 이용하여 얻어지는 핵산 올리고머(이하, 「보라노포스페이트형 핵산 올리고머」라고 명명한다)(비특허문헌 2)가 알려져있다.
Nucleic Acids Research, 2010, Vol.38, No.20, pp.7100-7111
Chem. Rev., 2007, Vol.107, pp.4746-4796
본 발명은 신규 핵산 올리고머 및 그의 제조방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
상기 과제를 해결하기 위한 구체적인 수단에는, 하기 실시태양이 포함된다.
＜1＞ 하기 일반식 (1)로 표시되는 뉴클레오티드 단위 및 하기 일반식 (2)로 표시되는 뉴클레오티드 단위를 포함하고, 하기 일반식 (3)으로 표시되는 뉴클레오티드 단위를 포함하거나 포함하지 않는 핵산 올리고머.
(일반식 (1), (2), 및 (3) 중, R1은 수소 원자, 수산기, 알콕시기, 알케닐옥시기, 아실옥시기, 트리알킬실릴옥시기, 알콕시알콕시기, 할로알콕시알콕시기, 또는 할로게닐기를 나타내고, R2는 수소 원자를 나타내거나, R1 및 R2는 서로 결합하여 치환기를 갖거나 갖지 않으며, 또한, 헤테로원자를 갖거나 갖지 않는 5원 이상의 환을 형성하고, Bs는 아데닌, 구아닌, 시토신, 5-메틸시토신, 티민 및 우라실로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 염기를 나타내고, 상기 핵산 염기는 핵산 염기의 보호기를 가져도 좋고, X+는 카운터 양이온을 나타낸다.)
＜2＞ R1은 수소 원자, 수산기, 알콕시기, 알케닐옥시기, 아실옥시기, 트리알킬실릴옥시기, 알콕시알콕시기, 할로알콕시알콕시기, 또는 할로게닐기를 나타내고, R2는 수소 원자를 나타내며, 또는, R1 및 R2는 서로 결합하여 하기 일반식 (4)로 표시되는 2가의 기를 형성하는 ＜1＞에 기재된 핵산 올리고머.
(일반식 (4) 중, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소 원자수 1∼10의 알킬기를 나타내거나, 또는 서로 결합하여 환을 형성하고, * 및 **는, 결합손을 나타내며, *로 표시되는 결합손은, 일반식 (1), (2), 또는 (3)에 있어서, R1이 직결하는 탄소 원자에 결합하고, **로 표시되는 결합손은, 일반식 (1), (2), 또는 (3)에 있어서, R2가 직결하는 탄소 원자에 결합한다.)
＜3＞ ＜1＞ 또는 ＜2＞에 기재된 핵산 올리고머의 제조 방법에 있어서,
하기 일반식 (5)로 표시되는 화합물 및 하기 일반식 (6)으로 표시되는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 모노머, 또는 하기 일반식 (5)로 표시되는 화합물, 하기 일반식 (6)으로 표시되는 화합물, 및 하기 일반식 (7)로 표시되는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 모노머를 순차적으로 축합시켜, 하기 일반식 (8)로 표시되는 뉴클레오티드 단위 및 하기 일반식 (9)로 표시되는 뉴클레오티드 단위를 포함하고, 하기 일반식 (10)으로 표시되는 뉴클레오티드 단위를 포함하거나 포함하지 않는 전구체 핵산 올리고머를 얻는 축합 공정과,
상기 전구체 핵산 올리고머를 산화제에 의해 산화하여, ＜1＞에 기재된 핵산 올리고머를 얻는 산화 공정,
을 포함하는 제조 방법.
(일반식 (5), (6), 및 (7) 중, R1, R2, Bs, 및 X+는 상기와 같고, R5는 수소 원자 또는 수산기의 보호기를 나타낸다.)
(일반식 (8), (9), 및 (10) 중, R1, R2, 및 Bs는 상기와 같다.)
＜4＞ 적어도 상기 축합 공정을, 고상 담체를 이용한 반응에 의해 수행하는 ＜3＞에 기재된 제조 방법.
본 발명에 의하면, 신규 핵산 올리고머 및 그의 제조방법을 제공할 수 있다.
도 1은 비교 합성예 또는 합성예에서 수행한 역상 HPLC의 차트를 나타내는 도면이다. (a) 비교 합성예 1, (b) 비교 합성예 2, (c) 합성예 2, (d) 합성예 3, (e) 합성예 6, (f) 합성예 7
도 2는 실시예 1의 핵산 올리고머에 대해 수행한 역상 HPLC의 차트를 나타내는 도면이다. (a) 분리 정제 전, (b) 분리 정제 후
도 3은 실시예 2의 핵산 올리고머에 대해 수행한 역상 HPLC의 차트를 나타내는 도면이다. (a) 분리 정제 전, (b) 분리 정제 후
도 4는 실시예 3의 핵산 올리고머에 대해 수행한 역상 HPLC의 차트를 나타내는 도면이다. (a) 분리 정제 전, (b) 분리 정제 후
도 5는 실시예 4의 핵산 올리고머에 대해 수행한 역상 HPLC의 차트를 나타내는 도면이다. (a) 분리 정제 전, (b) 분리 정제 후
도 6은 합성예 12에서 수행한 역상 HPLC의 차트를 나타내는 도면이다.
도 7은 실시예 5의 핵산 올리고머에 대해 수행한 역상 UHPLC의 차트를 나타내는 도면이다.
도 8은 실시예 6의 핵산 올리고머에 대해 수행한 역상 HPLC의 차트를 나타내는 도면이다. (a) 분리 정제 전, (b) 분리 정제 후
도 2는 실시예 1의 핵산 올리고머에 대해 수행한 역상 HPLC의 차트를 나타내는 도면이다. (a) 분리 정제 전, (b) 분리 정제 후
도 3은 실시예 2의 핵산 올리고머에 대해 수행한 역상 HPLC의 차트를 나타내는 도면이다. (a) 분리 정제 전, (b) 분리 정제 후
도 4는 실시예 3의 핵산 올리고머에 대해 수행한 역상 HPLC의 차트를 나타내는 도면이다. (a) 분리 정제 전, (b) 분리 정제 후
도 5는 실시예 4의 핵산 올리고머에 대해 수행한 역상 HPLC의 차트를 나타내는 도면이다. (a) 분리 정제 전, (b) 분리 정제 후
도 6은 합성예 12에서 수행한 역상 HPLC의 차트를 나타내는 도면이다.
도 7은 실시예 5의 핵산 올리고머에 대해 수행한 역상 UHPLC의 차트를 나타내는 도면이다.
도 8은 실시예 6의 핵산 올리고머에 대해 수행한 역상 HPLC의 차트를 나타내는 도면이다. (a) 분리 정제 전, (b) 분리 정제 후
이하, 본 발명의 실시 형태에 대해 설명한다. 또한, 본 발명은 이하의 실시 형태에 한정되지 않는다. 본 명세서에 있어서 「공정」이란 용어는, 독립한 공정뿐만 아니라, 다른 공정과 명확하게 구별할 수 없는 경우라도 그 공정의 소기의 목적이 달성되면, 본 용어에 포함된다. 또한, 본 명세서에 있어서 「∼」는, 그 전후에 기재되는 수치를 각각 최소값 및 최대값으로서 포함하는 범위를 나타내는 것으로 한다. 또한, 본 명세서에 있어서 조성물 중의 각 성분의 양은, 조성물 중에 각 성분에 해당하는 물질이 복수 존재하는 경우, 특별히 언급하지 않는 한, 조성물 중에 존재하는 상기 복수의 물질의 합계량 의미한다.
＜핵산 올리고머＞
본 실시형태에 따른 핵산 올리고머는, 하기 일반식 (1)로 표시되는 뉴클레오티드 단위 및 하기 일반식 (2)로 표시되는 뉴클레오티드 단위를 포함하고, 하기 일반식 (3)으로 표시되는 뉴클레오티드 단위를 포함하거나 포함하지 않는다.
일반식 (1), (2), 및 (3) 중, R1은 수소 원자, 수산기, 알콕시기, 알케닐옥시기, 아실옥시기, 트리알킬실릴옥시기, 알콕시알콕시기, 할로알콕시알콕시기, 또는 할로게닐기를 나타내고, R2는 수소 원자를 나타내거나, 또는, R1 및 R2는 서로 결합하여 치환기를 갖거나 갖지 않으며, 또한, 헤테로원자를 갖거나 갖지 않는 5원 이상의 환을 형성하고, Bs는 아데닌, 구아닌, 시토신, 5-메틸시토신, 티민, 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산 염기를 나타내고, 상기 핵산 염기는 핵산 염기의 보호기를 가져도 좋고, X+는 카운터 양이온을 나타낸다.
일반식 (1)로 표시되는 뉴클레오티드 단위를 포함하는 핵산 올리고머는, 표적 RNA와의 친화성, RNase H 유도 활성, 및 분해효소 내성이 우수하고, 혈중 체류성이 특히 우수한 경향이 있지만, 독성은 높아지기 쉽다. 일반식 (2)로 표시되는 뉴클레오티드 단위를 포함하는 핵산 올리고머는, 표적 RNA와의 친화성 및 RNase H 유도 활성이 우수하고, 분해효소 내성이 특히 우수한 경향이 있으며, 독성은 높아지기 어렵지만, 혈중 체류성이 우수한 경향이 있다는 것은 확인되지 않았다. 일반식 (3)으로 표시되는 뉴클레오티드 단위를 포함하는 핵산 올리고머는, 표적 RNA와의 친화성 및 RNase H 유도 활성이 특히 우수한 경향이 있으며, 독성은 높아지기 어렵지만, 분해효소 내성 및 혈중 체류성이 낮아지기 쉽다. 본 실시형태에 따른 핵산 올리고머는, 일반식 (1)로 표시되는 뉴클레오티드 단위 및 일반식 (2)로 표시되는 뉴클레오티드 단위를 포함하거나, 또는, 일반식 (1)로 표시되는 뉴클레오티드 단위, 일반식 (2)로 표시되는 뉴클레오타이드 단위, 및 일반식 (3)으로 표시되는 뉴클레오타이드 단위를 포함하기 때문에, 표적 RNA와의 친화성, RNase H 유도 활성, 분해 효소 내성, 및 혈중 체류성을 높게 유지하면서 독성이 낮게 억제되고 있는 것으로 기대된다.
본 실시형태에 관한 핵산 올리고머의 길이(염기 길이)로서는, 상기 핵산 올리고머가 2개 이상의 염기를 갖는 한 특별히 제한은 없고, 표적 핵산의 종류, 길이 등에 따라 원하는 길이를 적절하게 선택할 수 있다. 상기 핵산 올리고머의 길이는, 특별히 한정되지 않고, 안티센스 의약으로의 응용의 관점에서, 8∼50 염기인 것이 바람직하고, 10∼30 염기인 것이 보다 바람직하며, 10∼21 염기인 것이 보다 더 바람직하다.
핵산 올리고머의 염기 서열은 표적 핵산의 염기 서열에 기초하여 설정된다. 이중사슬 형성능의 관점에서, 핵산 올리고머의 염기 서열은, 표적 핵산의 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열이 되도록 적절히 선택되지만, 경우에 따라서, 상이한 염기를 1개 이상 포함하는 염기 서열이어도 좋다. 또한, 핵산 올리고머에 있어서, 일반식 (1)로 표시되는 뉴클레오티드 단위, 일반식 (2)로 표시되는 뉴클레오티드 단위, 및 일반식 (3)으로 표시되는 뉴클레오티드 단위의 비율은, 표적 RNA와의 친화성, RNase H 유도 활성, 분해 효소 내성 및 혈중 체류성을 높게 유지하면서 독성이 낮게 억제되도록 적절히 선택된다.
R1이 나타내는 알콕시기로서는, 탄소 원자수 1∼12의 알콕시기가 바람직하고, 탄소 원자수 1∼6의 알콕시기가 보다 바람직하며, 예를 들면, 메톡시기, 에톡시기, n-프로폭시기, i-프로폭시기, n-부톡시기, sec-부톡시기, tert-부톡시기, n-펜틸옥시기 등을 들 수 있다.
R1이 나타내는 알케닐옥시기로서는, 예를 들면, 비닐옥시기, 알릴옥시기, 1-프로페닐옥시기, 이소프로페닐옥시기, 2-메틸-1-프로페닐옥시기, 2-메틸알릴옥시기, 2-부테닐옥시기 등을 들 수 있다.
R1이 나타내는 아실옥시기로서는, 예를 들면 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬-카르보닐옥시기(예를 들면, 메틸카르보닐옥시기, 에틸카르보닐옥시기 등), 탄소 원자수 6 내지 10의 아릴-카르보닐옥시(예를 들면, 벤조일옥시기) 등을 들 수 있다.
R1이 나타내는 트리알킬실릴옥시기로서는, 예를 들면, 트리메틸실릴옥시기, 트리에틸실릴옥시기 등을 들 수 있다.
R1이 나타내는 알콕시알콕시기로서는, 예를 들면, 메톡시메톡시기, 메톡시에톡시기, 에톡시메톡시기, 에톡시에톡시기 등을 들 수 있다.
R1이 나타내는 할로알콕시알콕시기로서는, 예를 들면, (2-플루오로)에톡시메톡시기, (2,2-디플루오로)에톡시메톡시기, (2-클로로)메톡시에톡시기, (2,2-디클로로)에톡시메톡시기 등을 들 수 있다.
R1이 나타내는 할로게닐기로서는, 예를 들면 플루오로기, 클로로기, 브로모기 등을 들 수 있고, 플루오로기가 바람직하다.
R1으로서는, 이중사슬 형성능의 점에서, 상기 중에서도, 수소 원자, 수산기, 알콕시기, 트리알킬실릴옥시기, 알콕시알콕시기, 할로알콕시알콕시기, 및 할로게닐기가 바람직하다.
R1 및 R2는, 서로 결합하여 치환기를 갖거나 갖지 않고, 또한, 헤테로 원자를 갖거나 갖지 않는 5원 이상의 환을 형성해도 좋다. 상기 치환기로서는, 예를 들면 상기 환을 형성하고 있는 원자에 결합한 치환기를 들 수 있고, 구체적으로는 치환기를 갖거나 갖지 않는 알킬기, 옥소기(=O) 등을 들 수 있다. 상기 알킬기로서는, 예를 들면 메틸기, 에틸기 등을 들 수 있다. 상기 알킬기가 치환기를 갖는 경우, 상기 치환기로서는, 예를 들면 플루오로기, 클로로기, 브로모기 등의 할로게닐기, 아미노기, 이미노기 등을 들 수 있다. 헤테로 원자로서는, 예를 들면 산소 원자, 질소 원자, 황 원자 등을 들 수 있다. 상기 환의 원수는, 바람직하게는 5∼10원, 보다 바람직하게는 5∼8원, 보다 더 바람직하게는 5∼7원이다.
이중사슬 형성능의 점에서, R1 및 R2는, 서로 결합하여, 하기 일반식 (4)로 표시되는 2가의 기를 형성하는 것이 바람직하다.
일반식 (4) 중, R3 및 R4는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1∼10의 알킬기를 나타내거나, 또는 서로 결합하여 환을 형성하고, * 및 **는, 결합손을 나타내며, *로 표시되는 결합손은 일반식 (1), (2), 또는 (3)에서, R1이 직결하는 탄소 원자에 결합하고, **로 표시되는 결합손은 일반식 (1), (2) 또는 (3)에서, R2가 직결하는 탄소 원자에 결합한다.
R3 또는 R4가 나타내는 알킬기로서는, 예를 들면, 직쇄상 또는 분기쇄상의 탄소 원자수 1∼10의 알킬기를 들 수 있고, 구체적으로는, 예를 들면, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, i-프로필기, n-부틸기, t-부틸기, n-헥실기, 및 n-옥틸기 등을 들 수 있다. R3 및 R4가 서로 결합하여 환을 형성하는 경우, 상기 환으로서, 구체적으로는, 예를 들면, 시클로프로판환, 시클로부탄환, 시클로헥산환 등을 들 수 있다.
R1 및 R2는 서로 결합하여 치환기를 갖거나 갖지 않고, 또한, 헤테로 원자를 갖거나 갖지 않는 5원 이상의 환을 형성한 경우, 그 환의 구체예로서는 하기 식으로 표시되는 환을 들 수 있다.
(식 중, Bs는 상기와 같다.)
Bs는 아데닌, 구아닌, 시토신, 5-메틸시토신, 티민 및 우라실로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 염기를 나타내고, 상기 핵산 염기는 핵산 염기의 보호기를 가져도 좋다. 핵산 염기가 보호기를 갖는 경우, 보호기의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 보호기로서는, 예를 들면, 벤질기, 벤조일기, 4-메톡시벤조일기, 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기, 이소부티릴기, 페닐아세틸기, 페녹시아세틸기, 클로로아세틸기, 4-tert-부틸페녹시아세틸기, 4-이소프로필페녹시아세틸기, (디메틸아미노)메틸렌기 등을 들 수 있다.
X+는 카운터 양이온을 나타낸다. 카운터 양이온으로서는, 예를 들면, 암모늄 이온, 유기 아민 화합물 유래의 양이온, 또는 금속 양이온 등을 들 수 있다. 유기 아민 화합물 유래의 양이온으로서는, 유기 용매에의 용해도, 및 카운터 양이온의 휘발성의 관점에서, 예를 들어, 3급 알킬아민 화합물 유래의 양이온, 또는 제4급 암모늄 화합물 유래의 양이온을 들 수 있다. 3급 알킬아민 화합물 유래의 양이온으로서는, 예를 들면, 트리에틸아민 유래의 양이온 HNEt3 +(Et는 에틸기를 나타낸다.) 및 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데센 유래의 양이온을 들 수 있다. 제4급 암모늄 화합물 유래의 양이온으로서는, 예를 들어 테트라부틸암모늄 이온을 들 수 있다. 금속 양이온으로서는, Na+, Li+, K+ 등을 들 수 있다.
본 실시형태에 따른 핵산 올리고머는, 일반식 (1)로 표시되는 뉴클레오티드 단위, 일반식 (2)로 표시되는 뉴클레오티드 단위, 및 일반식 (3)으로 표시되는 뉴클레오티드 단위 이외의 뉴클레오티드 단위를 갖는 핵산 올리고머여도 좋다. 상기 핵산 올리고머에 있어서, 일반식 (1)로 표시되는 뉴클레오티드 단위, 일반식 (2)로 표시되는 뉴클레오티드 단위, 및 일반식 (3)으로 표시되는 뉴클레오티드 단위의 합계의 비율은, 특별히 한정되지 않으며, 이중사슬 형성능의 관점에서, 핵산 올리고머 중의 전체 뉴클레오티드 단위에 대하여, 40∼100몰%인 것이 바람직하고, 50∼100몰%인 것이 보다 바람직하며, 60∼100몰%인 것이 더욱 바람직하고, 70∼100몰%인 것이 특히 바람직하다.
본 실시형태에 따른 핵산 올리고머에 있어서, 5' 말단은 수산기 또는 수산기의 보호기여도 좋고, 3' 말단은 수산기 또는 수산기의 보호기여도 좋다. 수산기의 보호기로서는, 예를 들면, 아세틸기, 페닐아세틸기, 페녹시아세틸기, 클로로아세틸기, 피발로일기, 벤질기, 4-메톡시벤질기, 벤조일기, 4-메톡시벤조일기, 트리페닐메틸기, 4,4'-디메톡시트리틸(DMTr)기, 4-메톡시트리틸(MMTr)기, 9-페닐크산테닐기, t-부톡시카르보닐기, 트리메틸실릴기, t-부틸디메틸실릴기, t-부틸디페닐실릴기, 시아노메톡시메틸기, 2-(시아노에톡시)에틸기, 시아노에톡시메틸기 등을 들 수 있다.
＜핵산 올리고머의 제조 방법＞
본 실시형태에 따른 핵산 올리고머의 제조 방법은,
하기 일반식 (5)로 표시되는 화합물 및 하기 일반식 (6)으로 표시되는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 모노머, 또는 하기 일반식 (5)로 표시되는 화합물, 하기 일반식 (6)으로 표시되는 화합물, 및 하기 일반식 (7)로 표시되는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 모노머를 순차적으로 축합시켜, 하기 일반식 (8)로 표시되는 뉴클레오티드 단위 및 하기 일반식 (9)로 표시되는 뉴클레오티드 단위를 포함하고, 하기 일반식 (10)으로 표시되는 뉴클레오티드 단위를 포함하거나 포함하지 않는 전구체 핵산 올리고머를 얻는 축합 공정과,
상기 전구체 핵산 올리고머를 산화제에 의해 산화하여, 본 실시형태에 따른 핵산 올리고머를 얻는 산화 공정,
을 포함한다.
일반식 (5), (6), 및 (7) 중, R1, R2, Bs, 및 X+는 상기한 바와 같으며, R5는 수소 원자 또는 수산기의 보호기를 나타낸다. 수산기의 보호기로서는, 예를 들면, 아세틸기, 페닐아세틸기, 페녹시아세틸기, 클로로아세틸기, 피발로일기, 벤질기, 4-메톡시벤질기, 벤조일기, 4-메톡시벤조일기, 트리페닐메틸기, 4,4'-디메톡시트리틸(DMTr)기, 4-메톡시트리틸(MMTr)기, 9-페닐크산테닐기, t-부톡시카르보닐기, 트리메틸실릴기, t-부틸디메틸실릴기, t-부틸디페닐실릴기, 시아노메톡시메틸기, 2-(시아노에톡시)에틸기, 시아노에톡시메틸기 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 산성 조건하에서 용이하게 제거 가능하고, 고상 합성에서의 사슬 길이 신장에 적합한 점에서, 4,4'-디메톡시트리틸기가 바람직하다.
일반식 (8), (9), 및 (10) 중, R1, R2, 및 Bs는 상기한 바와 같다.
상기 축합 공정에서는, 일반식 (5)로 표시되는 화합물 및 일반식 (6)으로 표시되는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 모노머, 또는 일반식 (5)로 표시되는 화합물, 일반식 (6)으로 표시되는 화합물, 및 일반식 (7)로 표시되는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 모노머를 순차적으로 축합시켜, 일반식 (8)로 표시되는 뉴클레오티드 단위 및 일반식 (9)로 표시되는 뉴클레오티드 단위를 포함하고, 일반식 (10)으로 표시되는 뉴클레오티드 단위를 포함하거나 포함하지 않는 전구체 핵산 올리고머를 얻는다. 이 때, 핵산 올리고머의 뉴클레오시드 구조 중의 리보스 구조의 5' 위치의 탄소 원자에 결합하는 수산기와 모노머의 인산부가 축합한다.
상기 축합 공정에서는 축합제를 사용할 수 있다. 축합제로서는, 예를 들면, N,N-비스(2-옥소-3-옥사졸리디닐)포스핀산 클로라이드, 3-니트로-1,2,4-트리아졸-1-일-트리스(피롤리딘-1-일)포스포늄ㆍ헥사플루오로포스페이트(PyNTP), 또는 1,3,-디메틸-2-(3-니트로-1,2,4-트리아졸-1-일)-2-피롤리딘-1-일-1,3,2-디아자포스포리듐ㆍ헥사플루오로포스페이트(MNTP) 등을 들 수 있다. 이들 축합제는 고상 담체 상의 수산기와 부반응을 일으키기 어렵고, 장쇄의 핵산 올리고머 합성에 적합하다. 일반식 (5)로 표시되는 화합물은, 분자 내에 친핵성 원자로서 산소 원자와 황 원자를 갖는다. 산소 원자가 축합제와 반응하면 원하는 반응이 진행되지만, 황 원자가 축합제와 반응하면 부반응이 발생해버린다. 부반응을 억제하는 관점에서, 일반식 (5)로 표시되는 화합물을 축합시키는 경우에는, 축합제로서 PyNTP를 사용하는 것이 바람직하다. 일반식 (6)으로 표시되는 화합물 또는 일반식 (7)로 표시되는 화합물을 축합시키는 경우에는, 반응이 신속하게 완결되는 관점에서, 축합제로서 MNTP를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 축합 공정은, 추가로 염기성 화합물의 존재하에서 수행할 수 있다. 염기성 화합물로서는, 예를 들면 1,8-비스(디메틸아미노)나프탈렌(DMAN), 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘(TMP), 디이소프로필에틸아민(DIPEA), 2,6-루티딘, 2,4,6-트리메틸피리딘, 피리딘, 퀴놀린 등을 들 수 있다. 이 중, 부반응을 억제하는 관점에서, 일반식 (5)로 표시되고, 또한, Bs가 아데닌, 시토신, 또는 5-메틸시토신인 화합물을 축합시키는 경우에는, 퀴놀린이 바람직하고, 일반식 (6)으로 표시되는 화합물 또는 일반식 (7)로 표시되는 화합물을 축합시키는 경우에는 2,6-루티딘이 바람직하다. 또한, 부반응을 억제하는 관점에서 일반식 (5)로 표시되고, 또한, Bs가 구아닌, 티민 또는 우라실인 화합물을 축합시키는 경우에는 염기성 화합물의 부재하에서 상기 축합 공정을 수행하는 것이 바람직하다.
상기 축합 공정에서의 축합 반응은, 예를 들면, 빙냉하(0℃) 이상 실온(25℃) 이하, 바람직하게는 20℃ 이상 25℃ 이하의 범위에서, 예를 들면, 1분 이상 수시간 이하, 바람직하게는 3분 이상 1시간 이하의 범위에서 수행할 수 있다.
반응 용매로서는, 예를 들면 불활성 용매 등을 들 수 있다. 불활성 용매로서는, 예를 들면 아세토니트릴 등을 들 수 있다.
본 실시형태에 따른 핵산 올리고머의 제조 방법에서는, 적어도 상기 축합 공정을, 고상 담체를 사용한 반응에 의해 수행하는 것이 바람직하다(고상법). 구체적으로는, 상기 축합 공정 및 상기 산화 공정의 양쪽을, 고상 담체를 사용한 반응에 의해 수행해도 좋고, 상기 축합 공정을, 고상 담체를 사용한 반응에 의해 수행하고, 상기 산화 공정을 그 이외의 방법, 예를 들면, 액상중에서의 반응에 의해 수행해도 좋다. 고상 반응에 의해 핵산 올리고머를 제조하는 경우, 핵산 올리고머의 3' 말단의 염기를 포함하는 모노머는, 예를 들어 리보스 구조의 3' 위치의 탄소 원자에 결합하는 산소 원자를 통해 고상 담체에 결합할 수 있다. 이 경우, 모노머와 고상 담체 사이에는 필요에 따라 링커가 존재해도 좋다.
상기 고상 담체의 종류는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 정공(定孔) 유리, 옥살릴화-정공 유리, TentaGel 지지체-아미노폴리에틸렌글리콜 유도체화 지지체, 고가교 아미노메틸폴리스티렌, Pros-폴리스티렌/디비닐벤젠의 공중합체 등을 들 수 있다. 상기 고상 담체와 모노머의 연결에는 고상 담체 상의 아미노기를 이용할 수 있다. 상기 고상 담체 상의 아미노기로서는, 3-아미노프로필기, 장쇄 알킬아미노기(LCAA) 등을 들 수 있다. 상기 고상 담체와 모노머 사이에는 링커가 존재해도 좋다. 상기 링커로서는, 숙시닐기, 옥살릴기 등을 들 수 있다.
상기 산화 공정에서는, 축합 공정에서 얻어진 상기 전구체 핵산 올리고머를 산화제에 의해 산화하여, 본 실시형태에 따른 핵산 올리고머를 얻는다. 산화제로서는, 예를 들면, (+)-캄포릴술포닐옥사지리딘(CSO), (+)-(8,8-디클로로캄포릴술포닐)-옥사지리딘(DCSO), t-부틸히드로퍼옥사이드, 메틸에틸케톤 과산화물, 포지티브 할로겐 시약(사염화탄소, 사브롬화탄소, 요오드, N-클로로숙신이미드, N-브로모숙신이미드, N-요오도숙신이미드 등)과 물과의 조합 등을 들 수 있다. 산화 공정은 산화제로서 염기성 화합물의 존재하에서 수행하여도 좋다. 염기성 화합물로서는, 예를 들면 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민 등을 들 수 있다.
본 실시형태에 따른 핵산 올리고머의 제조 방법에 있어서의 축합 공정은, 핵산 올리고머의 뉴클레오티드 구조 중의 리보스 구조의 5' 위치의 탄소 원자에 결합하는 수산기와 모노머의 인산부가 축합하는 반응을 포함한다. 이 때문에, 5' 위치의 탄소 원자에 결합하는 수산기가 보호기를 갖는 경우, 예를 들면, 보호기와 탈보호 시약을 반응시켜 보호기를 탈리시키는 공정(제1 보호기 탈리 공정)을 포함한다. 제1 보호기 탈리 공정은 핵산 올리고머의 제조에 있어서의 축합 반응이 충분히 진행되는 한, 언제 수행하여도 좋고, 바람직하게는 상기 축합 반응 전에 수행한다. 상기 제1 보호기 탈리 공정에는 탈보호제를 사용할 수 있다. 제1 보호기 탈리 공정에서 사용할 수 있는 탈보호제로서는, 예를 들어 할로겐화 알킬카르복시산 등을 들 수 있다. 할로겐화 알킬카르복시산으로서는, 예를 들어 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 디클로로아세트산 등을 들 수 있다. 5' 위치의 탄소 원자에 결합하는 수산기가 갖는 보호기로서 트리페닐메틸기, 4,4'-디메톡시트리틸(DMTr)기, 4-메톡시트리틸(MMTr)기 등의 트리틸계의 보호기를 사용하는 경우, 제1 보호기 탈리 공정에서 발생하는 트리틸 양이온과 보라노기의 부반응을 피하기 위해, 양이온 포착제를 첨가하는 것이 바람직하다. 양이온 포착제로서는, 예를 들어 트리에틸실란을 들 수 있다. 보호기를 갖는 핵산 올리고머가 2∼100 당량의 탈보호제와 반응하는 것이 바람직하다.
또한, 핵산 올리고머의 제조 방법에 사용되는 모노머 중의 염기가 보호기를 갖는 경우, 상기 제조 방법은 염기의 보호기를 탈리시키는 공정(제2 보호기 탈리 공정)을 더 포함해도 좋다. 제2 보호기 탈리 공정은, 최종적으로 얻어지는 핵산 올리고머 중의 염기가 보호기를 갖지 않도록 하면, 어느 단계에서 수행하는지는 특별히 한정되지 않는다. 제2 보호기 탈리 공정에서는, 예를 들어, 모노머 또는 핵산 올리고머가 암모니아수로 처리된다. 제2 보호기 탈리 공정에서 사용되는 암모니아수로서는, 예를 들면, 25질량% 암모니아수 또는 25질량% 암모니아수-에탄올 혼합 용액(3:1, v/v)을 들 수 있다.
얻어진 핵산 올리고머는, 예를 들면, 역상 고속 액체 크로마토그래피(역상 HPLC), 이온 교환 HPLC, 컬럼 크로마토그래피, 재결정 등의 공지의 정제 방법에 의해 정제할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
각종 분석기는 이하에 나타낸 기종을 사용하였다.
1H-핵자기 공명 스펙트럼(1H-NMR): JEOL JNM-ECZ400S(400MHz)
31P-핵자기 공명 스펙트럼(31P-NMR): JEOL JNM-ECZ400S(162MHz)
또한, 1H-NMR에는 테트라메틸실란(TMS)을 내부 표준으로서 사용하고, 31P-NMR에는 85% H3PO4를 외부 표준으로서 사용하였다.
HRMS(ESI-TOF): Sciex X500R QTOF
이온 교환 HPLC: GE Healthcare AKTA purifier 10S
컬럼 크로마토그래피에 충전하는 실리카 겔에는 KANTO CHEMICAL의 Silica Gel 60N을 사용하였다.
역상 HPLC에 사용한 컬럼(분석): waters μ-BOUNDASPHERE, C18 5㎛, 100Å, 3.9mm×159mm
이온 교환 HPLC에 사용한 컬럼(분석ㆍ분취): GE Healthcare MiniQTM 4.6/50PE, 3㎛, 4.6mm×50mm)
역상 UHPLC: waters ACQUITY UPLC H-Class Bio
PDA: waters ACQUITY UPLC PDA eλ Detector
LRMS(ESI): waters ACQUITY QDa Detector
역상 UHPLC에 사용한 컬럼(분석): waters ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18 Column, 130Å, 1.7㎛, 2.1mm×100mm
또한, 특별히 언급이 없는 한, 「%」는 질량 기준이다. 실시예 중, DMTr은 4,4'-디메톡시트리틸을 나타내고, 다른 약어는 상기 설명 중의 것과 동일한 의미이다.
＜모노머의 합성 1＞
(H-포스포네이트 모노머 및 H-보라노포스포네이트 모노머의 합성)
H-포스포네이트 모노머 3a, 3c, 3g 및 3t 및 H-보라노포스포네이트 모노머 4a, 4c, 4g 및 4t는 공지된 방법에 의해 합성하였다(J. Org. Chem., 2019, Vol.84, pp.15032-15041; J. Org. Chem., 2014, Vol.79, pp.3465-3472).
(H-포스포노티오에이트 모노머의 합성)
공지된 방법을 참조하여(J. Org. Chem., 1990, Vol.55, pp.3503-3506), 하기 반응식에 따라 H-포스포노티오에이트 모노머를 합성하였다.
상기 반응식 좌단에 기재된 뉴클레오시드 유도체 1a, 1c, 1g, 또는 1t(A: 0.90g, 1.5mmol; C: 0.96g, 1.5mmol; G: 0.97g, 1.5mmol; 또는 T: 0.96g, 1.5mmol)와 트리에틸암모늄포스핀산 0.19mL(1.0mmol)를 아르곤 분위기하에서 피리딘(3ml×3회)으로 공비(共沸) 건조하여 피리딘(5mL)에 용해하였다. 얻어진 피리딘 용액을 빙욕하(0℃)에서 교반하면서 피발로일 클로라이드 0.17mL(1.5mmol)를 첨가하고, 15분간 교반하였다. 그 후, 반응 온도를 실온(25℃)으로 하고, 황 48mg(1.5mmol)을 첨가하여 추가로 1시간 교반하였다. 이 용액을 클로로포름 30mL로 희석한 후, 1M TEAB 완충 용액(pH 7.0, 30mL×3회)을 첨가하고, 세척하였다. 수층을 클로로포름(30mL×3회)으로 역추출하였다. 유기층 중의 수분을 무수황산나트륨을 이용하여 제거하였다. 이어서, 유기층의 용매를 증류 제거하고, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개용매 A:아세트산에틸-메탄올-트리에틸아민(100:0:1 - 100:4:1, v/v/v), 그 후, 클로로포름-메탄올-트리에틸아민(100:2:1, v/v/v); C:아세트산에틸-메탄올-트리에틸아민(100:0:1 - 100:4:1, v/v/v), 그 후, 클로로포름-메탄올-트리에틸아민(100:4:1, v/v/v); G:아세트산에틸-메탄올-트리에틸아민(100:2:1, v/v/v), 그 후, 클로로포름-메탄올-트리에틸아민(100:3:1 - 100:5:1, v/v/v); T:아세트산에틸-메탄올-트리에틸아민(100:0:1 - 100:1:1, v/v/v), 그 후 클로로포름-메탄올-트리에틸아민(100:0:1 - 100:3:1, v/v/v))으로 분리 정제하고, 0.2M DBU bicarbonate에 의한 염 교환을 수행하고, 유기층을 무수황산나트륨으로 건조시키며, 용매를 감압 증류 제거함으로써 목적 화합물(H-포스포노티오에이트 모노머 5a, 5c, 5g 또는 5t)을 얻었다. 수율 A: 0.88g, 0.95mmol, 95%; C: 0.89g, 0.99mmol, 99%; G: 0.58g, 0.64mmol, 64%; T: 0.64g, 0.65mmol, 65%.
H-포스포노티오에이트 모노머 5a
1H-NMR(400 MHz, CDCl3) δ11.9-11.7(br, 1H), 9.2-8.9(br, 1H), 8.71(s, 1H), 8.20(s, 1H), 8.17(d, J=574Hz, 0.5H), 8.13(d, J=574Hz, 0.5H), 8.01(d, J=7.3Hz, 2H), 7.62-7.57(m, 1H), 7.54-7.48(m, 2H), 7.46-7.38(m, 3H), 7.34-7.10(m, 6H), 6.79(d, J=8.7Hz, 4H), 6.65-6.57(m, 1H), 5.43-5.35(m, 1H), 4.57-4.54(m, 0.5H), 4.48-4.44(m, 0.5H), 3.76(s, 6H), 3.52-3.36(m, 8H), 2.98-2.84(m, 4H), 1.99(quintet, J=5.8Hz, 2H), 1.80-1.60(m, 6H)
31P-NMR (162MHz, CDCl3) δ53.0, 52.9.
H-포스포노티오에이트 모노머 5c
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ11.7-11.4(br, 1H), 8.8-8.5(br, 1H), 8.19(d, J=5.0Hz, 0.5H), 8.17(d, J=5.0Hz, 0.5H), 8.13(d, J=574Hz, 0.5H), 8.10(d, J=581Hz, 0.5H), 7.46-7.39(m, 2H), 7.13(d, J=6.0Hz, 0.5H), 7.11(d, J=6.0Hz, 0.5H), 6.90-6.81(m, 4H), 6.34-6.24(m, 1H), 6.30(t, J=6.0Hz, 0.5H), 6.29(t, J=6.0Hz, 0.5H), 5.37-5.29(m, 0.5H), 5.25-5.17(m, 0.5H), 4.48(q, J=3.0Hz, 0.5H), 4.36(q, J=3.3Hz, 0.5H), 3.80(s, 6H), 3.54-3.29(m, 8H), 2.92-2.82(m, 3H), 2.69-2.61(m, 1H), 2.38-2.26(m, 1H), 2.00(q, J=5.8Hz, 2H), 1.82-1. 60(m,7H), 1.25-1.17(m, 6H)
31P-NMR(162MHz, CDCl3) δ53.6, 52.6.
H-포스포노티오에이트 모노머 5g
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ8.12(d, J=581Hz, 0.5H), 8.05(d, J=574Hz, 0.5H), 7.82(s, 0.5H), 7.80(s, 0.5H), 7.44-7.31(m, 3H), 7.31-7.22(m, 4H), 7.22-7.13(m, 2H), 6.79-6.67(m, 4H), 6.18(t, J=6.0Hz, 1H), 6.18(t, J=6.4Hz, 1H), 5.75-5.62(m, 0.5H), 5.62-5.51(m, 0.5H), 4.37(q, J=3.7Hz, 0.5H), 4.26(q, J=3.7Hz, 0.5H), 3.75(s, 6H), 3.50-3.25(m, 7H), 3.02-2.83(m, 1H), 2.83-2.74(m, 2H), 2.74-2.58(m, 2H), 2.03-1.87(m, 2H), 1.83-1.53(m, 6H), 1.20-1.07(m, 6H)
31P-NMR(162MHz, CDCl3) δ52.8, 52.5.
H-포스포노티오에이트 모노머 5t
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ11.6-11.5(br, 1H), 8.13(d, J=572Hz, 0.5H), 8.08(d, J=578Hz, 0.5H), 7.92(d, J=8.2Hz, 2H), 7.78(s, 0.5H), 7.77(s, 0.5H), 7.64(t, J=7.3Hz, 1H), 7.53-7.39(m, 5H), 7.41(d, J=572Hz, 0.5H), 7.36(d, J=578Hz, 0.5H), 7.38-7.27(m, 5H), 7.26-7.18(m, 1H), 6.91-6.82(m, 4H), 6.44(t, J=8.7Hz, 0.5H), 6.43(t, J=8.9Hz, 0.5H), 5.51-5.41(m, 0.5H), 5.41-5.32(m, 0.5H), 4.41(d, J=1.4Hz, 0.5H), 4.30(d, J=2.3Hz, 0.5H), 3.79(s, 6H), 3.63-3.46(m, 1H), 3.45-3.31(m, 1H), 2.87-2.62(m, 3H), 2.54-2.38(m, 1H), 1.93(q, J=5.8Hz, 2H), 1.78-1.54(m, 6H), 1.37(d, J=6.9Hz, 3H)
31P-NMR(162MHz, CDCl3) δ54.5, 53.4.
(2'-OMe 수식된 H-보라노포스포네이트 모노머의 합성)
하기 반응식에 따라, 2'-OMe 수식된 H-보라노포스포네이트 모노머를 합성하였다.
상기 반응식 좌단에 기재된 뉴클레오시드 유도체 2a, 2c, 2g 또는 2t(A: 0.69g, 1.0mmol; C: 0.68g, 1.0mmol; G: 0.70g, 1.0mmol; 또는 U: 0.67g, 1mmol)와 피리디늄 H-보라노포스포네이트(0.28g, 2.0mmol)를 아르곤 분위기 하에서 피리딘(3mL×3회)으로 공비 건조하여 피리딘 25mL에 용해시켰다. 얻어진 피리딘 용액을 빙욕하에서 교반하면서 BopCl(0.51g, 2.0mmol)을 첨가하고, 그 후, 반응 온도를 실온으로 하고 1시간 교반하였다. 이 용액을 클로로포름 30mL로 희석한 후에, 유기층을 1.0M TEAB 완충 용액(pH 7.0)으로 세척하였다(30mL×3회). 수층을 클로로포름으로 역추출하였다(30mL×3회). 유기층을 모아 무수황산나트륨으로 수분을 제거한 후에, 유기층의 용매를 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리 정제하고(전개용매 A: 아세트산에틸-메탄올-트리에틸아민(100:0:1 - 100:4:1, v/v/v), 그 후, 클로로포름-메탄올-트리에틸아민(100:4:1, v/v/v); C: 아세트산에틸-메탄올-트리에틸아민(100:0:1 - 100:4:1, v/v/v), 그 후, 클로로포름-메탄올-트리에틸아민(100:4:1, v/v/v); G: 아세트산에틸-메탄올-트리에틸아민(100:2:1, v/v/v), 그 후, 클로로포름-메탄올-트리에틸아민(100:3:1 - 100:5:1, v/v/v); U: 아세트산에틸-메탄올-트리에틸아민(100:0:1, v/v/v), 그 후, 클로로포름-메탄올-트리에틸아민(100:0:1 - 100:1:1, v/v/v)), 1.0M TEAB 완충 용액(pH 7.0)과 클로로포름에 의한 추출 조작을 수행하였다(30mL×3회). 유기층 중에 포함되는 수분을 무수황산나트륨에 의해 제거하고, 용매를 감압 증류 제거함으로써 목적물(2'-OMe 수식된 H-보라노포스포네이트 모노머 6a, 6c, 6g, 또는 6u)를 얻었다. 수율 A: 0.81g, 0.95mmol, 95%; C: 0.75g, 0.90mmol, 90%; G: 0.78g, 0.92mmol, 92%; U: 0.62g, 0.74mmol, 74%
2'-OMe 수식된 H-보라노포스포네이트 모노머 6a
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ9.09(s, 1H), 8.70(s, 0.5H), 8.69(s, 0.5H), 8.24(s, 0.5H), 8.20(s, 0.5H), 8.02(d, J=7.8Hz, 2H), 7.9-7.8(br, 0.5H), 7.60(t, J=7.3Hz, 1H), 7.51(t, J=7.8Hz, 2H), 7.48-7.42(m, 2H), 7.36-7.31(m, 4H), 7.30-7.23(m, 2H), 7.23-7.17(m, 1H), 6.84-6.78(m, 4H), 6.27(t, J=5.0Hz, 0.5H), 6.27(t, J=5.0Hz, 0.5H), 5.09-5.02(m, 1H), 4.74-4.68(m, 1H), 4.55- 4.50(m, 1H), 3.77(s, 6H), 3.55-3.48(m, 5H), 2.99(q, J=7.3Hz, 6H), 1.27(t, J=7.3Hz, 9H), 0.9-0.1(br, 3H)
31P-NMR(162MHz, CDCl3) δ109-104(br).
2'-OMe 수식된 H-보라노포스포네이트 모노머 6c
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ8.65(d, J=7.8Hz, 0.5H), 8.59(d, J=7.3Hz, 0.5H), 7.95-7.86(m, 2H), 7.9-7.8(br, 0.5H), 7.60(t, J=6.9Hz, 1H), 7.51(t, J=7.8Hz, 2H), 7.44(dd, J=7.1,5.7Hz, 2H), 7.39-7.24(m, 7H), 7.2-7.0(br, 0.5H), 6.92-6.85(m, 4H), 6.05(s, 0.5H), 6.02(s, 0.5H), 5.05-4.92(m, 0.5H), 4.82-4.75(m, 0.5H), 4.40(dd, J=2.1,8.9Hz, 1H), 4.12-4.03(m, 1H), 3.83(s, 6H), 3.67(s, 3H), 3.63-3.53(m, 2H), 3.01(q, J=7.2Hz, 6H), 1.27(t, J=7.3Hz, 9H), 0.9-0.1(br, 3H)
31P-NMR(162MHz, CDCl3) δ112-102(br)
2'-OMe 수식된 H-보라노포스포네이트 모노머 6g
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ12.5-11.6(br, 1H), 10.5-9.7(br, 1H), 7.88(s, 0.5H), 7.87(s, 0.5H), 7.8-7.7(br, 0.5H), 7.53-7.36(m, 2H), 7.34-7.28(m, 4H), 7.26-7.13(m, 3H), 6.93-6.83(br, 0.5H), 6.83-6.66(m, 4H), 5.93(d, J=4.6Hz, 0.5H), 5.90(d, J=4.6Hz, 0.5H), 5.37-5.29(m, 0.5H), 5.29-5.20(m, 0.5H), 4.58(t, J=4.8Hz, 0.5H), 4.56(t, J=4.8Hz, 0.5H), 4.44-4.36(m, 0.5H), 4.36-4.28(m, 0.5H), 3.75, 3.75, 3.74(s, s, s, 6H), 3.54-3.37(m, 4H), 3.37-3.22(m, 1H), 3.00(q, J=7.2Hz, 6H), 2.62-2.40(m, 1H), 1.25(t, J=7.3Hz, 9H), 1.11(d, J=6.9Hz, 3H), 1.04(d, J=5.5Hz, 3H), 1.0-0.1(br, 3H)
31P-NMR(162MHz, CDCl3) δ108-103(br)
2'-OMe 수식된 H-보라노포스포네이트 모노머 6u
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ8.23(d, J=8.2Hz, 0.5H), 8.17(d, J=8.2Hz, 0.5H), 8.01-7.90(m, 2H), 7.65(t, J=7.3Hz, 1H), 7.51(t, J=7.8Hz, 2H), 7.47-7.38(m, 2H), 7.38-7.21(m, 7H), 6.87(m, 4H), 5.97(d, J=2.3Hz, 0.5H) 5.97(d, J=2.1Hz, 0.5H), 5.30(d, J=2.7Hz, 0.5H), 5.27(d, J=2.7Hz, 0.5H), 5.10-5.03(m, 0.5H), 4.95-4.86(m, 0.5H), 4.38-4.33(m, 1H), 4.08-4.05(m, 1H), 3.80(s, 6H), 3.67-3.58(m, 1H), 3.55(d, J=4.6Hz, 4H), 3.10(q, J=7.2Hz, 6H), 1.28(t, J=7.2Hz, 9H), 1.0-0.2(m, 3H)
31P-NMR(162MHz, CDCl3) δ113-103(br)
＜고상법에 의한 핵산 올리고머의 합성 1＞
이하, 인터 뉴클레오타이드 결합 중, 포스포로티오에이트 결합을 아래첨자의 PS에 의해, 보라노포스페이트 결합을 아래첨자의 PB에 의해, 인산디에스테르 결합을 아래첨자의 PO에 의해 표현한다.
(TPST의 고상 합성)
[비교 합성예 1]
숙시닐링커를 통해 고상 담체에 담지한 5'-디메톡시트리틸-N3-벤조일티미딘(0.5㎛ol)에 대하여 3% 디클로로아세트산/디클로로메탄 용액(5회×12s, 1mL/회)을 첨가하여, 탈트리틸화한 후에, 분자체로 건조시킨 아세토니트릴과 디클로로메탄으로 고상 담체를 세척하였다. 고상 담체를 10분간 건조시킨 후에 반응계 중에 H-포스포노티오에이트 모노머 5t 19.7mg(40당량, 20㎛ol)과 축합제로서 비특허문헌(Tetrahedron Lett. 2004, 45, 5803-5806.)에 따라 bis(2,6-디메틸페닐)포스포로클로리데이트(이하, 「(DMP)2CP」로 한다.)(16.2mg, 100당량, 50㎛ol)를 첨가하고, 아르곤 존재하에서, 염기로서 피리딘을 포함하는 아세토니트릴 용액(피리딘:아세토니트릴=1:4, v/v)을 반응 용매로서 첨가하여, 3분간 손으로 천천히 교반함으로써 축합하였다. H-포스포노티오에이트 모노머의 축합 후, 고상 담체를, 건조시킨 아세토니트릴(1mL×4회)과 디클로로메탄(1mL×4회)으로 세척한 후에 3% 디클로로아세트산/디클로로메탄-트리에틸실란(1:1, v/v) 용액에 의해 디메톡시트리틸기의 탈보호를 수행하였다(4회×15s, 1mL/회). 그 후, 고상 담체를, 건조시킨 아세토니트릴(1mL×4회)과 디클로로메탄(1mL×4회)으로 세척하고, 10분간 건조시켰다. 생성된 H-포스포노티오에이트 결합에 대해 0.1M 트리에틸아민/사염화탄소-2,6-루티딘-물(5:12.5:1, v/v/v) 용액을 첨가하여 90분간 산화를 수행하여 포스포로티오에이트 결합으로 전환하였다. 고상 담체를, 건조시킨 아세토니트릴(1mL×4회)과 디클로로메탄(1mL×4회)으로 세척한 후에 25% 암모니아수/에탄올(3:1, v/v, 5 mL) 용액으로 실온 조건 하 3시간 반응시킴으로써 핵산 염기부의 탈보호와 고상 담체로부터의 절단을 수행하였다. 반응 후, 반응 용액을 여과하고, 에탄올을 사용하여 세척하였다. 용매를 감압 증류 제거하고 조 생성물을 역상 HPLC로 분석하였다. 역상 HPLC는 0.1M TEAA 완충액(pH 7) 중에서, 0∼30% 아세토니트릴의 직선 농도 구배를 사용하여 60분간, 30℃에서 유속 0.5mL/min로 수행하였다. 결과를 표 1 및 도 1(a)에 나타낸다.
[비교 합성예 2] 비교 합성예 1의 대조 실험
H-포스포노티오에이트 모노머 5t를 첨가하지 않고 (DMP)2CP를 첨가한 점 이외에는 비교 합성예 1과 동일한 실험 조작을 수행하였다. 결과를 도 1(b)에 나타낸다.
[합성예 1]
축합제로서 (DMP)2CP 대신에 BOMP(23.3mg, 100당량, 50㎛ol)를 사용하고, 반응 용매로서 2,6-루티딘(염기, 0.6M, 120㎛ol)의 아세토니트릴 용액을 사용한 점 이외에는 비교 합성예 1과 동일한 조작을 수행하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.
[합성예 2]
축합제로서 BOMP 대신에 MNTP(22.3mg, 100당량, 50㎛ol)를 사용한 점 이외에는 합성예 1과 동일한 조작을 수행하였다. 결과를 표 1 및 도 1(c)에 나타낸다.
[합성예 3]
축합제로서 BOMP 대신에 PyNTP(25.0 mg, 100당량, 50㎛ol)를 사용한 점 이외에는 합성예 1과 동일한 조작을 수행하였다. 결과를 표 1 및 도 1(d)에 나타낸다.
[합성예 4]
축합 반응시에 첨가하는 염기로서, 2,6-루티딘 대신에 피리딘(0.6M, 120㎛ol)을 사용한 점 이외에는 합성예 3과 동일한 조작을 수행하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.
[합성예 5]
축합 반응시에 첨가하는 염기로서, 2,6-루티딘 대신에 퀴놀린(0.6M, 120㎛ol)을 사용한 점 이외에는 합성예 3과 동일한 조작을 수행하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.
[합성예 6]
축합 반응시에 첨가하는 염기로서, 2,6-루티딘 대신에 퀴놀린(1.8M, 355㎛ol)을 사용한 점 이외에는 합성예 3과 동일한 조작을 수행하였다. 결과를 표 1 및 도 1(e)에 나타낸다.
[합성예 7]
축합 반응시의 반응 용매로서, 염기를 첨가하지 않은 아세토니트릴만을 사용한 점 이외에는 합성예 3과 동일한 조작을 수행하였다. 결과를 표 1 및 도 1(f)에 나타낸다.
표 1 중, 화학 선택성은 HPLC 결과에서 부생성물인 TPOT와 목적물인 TPST의 면적비로부터 산출하였다. HPLC 수율은 HPLC 결과에서 면적비 TPST / (T + TPOT + TPST)로부터 산출하였다.
도 1에서, 비교 합성예 1 및 2와, 합성예 2, 3, 6 및 7의 역상 HPLC 분석 결과를 나타낸다. 비교 합성예 1과 비교하여 합성예 6 및 7 쪽이 목적물의 수율이 높은 결과가 되었다. 또한, 비교 합성예 1만 용출시간 28분 부근에 동정 불명의 피크가 확인되었다. 그래서, 비교 합성예 2에서, 축합 반응시에 모노머를 첨가하지 않는 대조 실험을 수행한 결과, 역상 HPLC에서 용출시간 28분에 피크가 보였다. 이것으로부터, 비교 합성예 1에서 용출시간 28분 부근에서 보여진 피크는, 수산기와 축합제가 반응한 것에 유래하는 부생성물인 것으로 생각할 수 있다. 상기 합성예 및 비교 합성예에서는, 2량체를 합성했지만, 올리고머의 합성시에 이러한 부반응이 진행되면, 반응 효율이 크게 저하할 것이 우려되기 때문에, 올리고머의 합성에는 합성예의 방법이 적합한 것으로 확인되었다.
(NPST의 고상 합성)
[합성예 8]
숙시닐링커를 통해 고상 담체에 담지한 5'-디메톡시트리틸-N3-벤조일티미딘(0.5㎛ol)에 대하여 3% 디클로로아세트산/디클로로메탄 용액(4회×15s, 1mL/회)을 첨가하여, 탈트리틸화한 후에, 분자체로 건조시킨 아세토니트릴과 디클로로메탄으로 고상 담체를 세척하였다. 고상 담체를 10분간 건조시킨 후에 반응계 중에 H-포스포노티오에이트 모노머 5a, 5c, 또는 5g(A:19.0mg(40당량, 20㎛ol); C:17.8mg(40당량, 20㎛ol); 또는 G:18.1 mg(40당량, 20㎛ol))와 PyNTP(100당량, 50㎛ol)를 첨가하고, 아르곤 존재하에서, 염기로서 퀴놀린(1.8M)을 포함하는 아세토니트릴 용액을 반응 용매로서 첨가하고, 3분간 손으로 천천히 교반함으로써 축합하였다. H-포스포노티오에이트 모노머의 축합 후, 고상 담체를, 건조시킨 아세토니트릴(1mL×4회)과 디클로로메탄(1mL×4회)으로 세척한 후에 3% 디클로로아세트산/디클로로메탄-트리에틸실란(1:1, v/v) 용액에 의해 디메톡시트리틸기의 탈보호를 수행하였다(4회×15s, 1mL/회). 그 후, 고상 담체를, 건조시킨 아세토니트릴(1mL×4회)과 디클로로메탄(1mL×4회)으로 세척하고, 10분간 건조시켰다. 형성된 H-포스포노티오에이트 결합에 대해 0.1M 트리에틸아민/사염화탄소-2,6-루티딘-물(5:12.5:1, v/v/v) 용액을 첨가하여 90분간 산화를 수행하여 포스포로티오에이트 결합으로 변환시켰다. 고상 담체를, 건조시킨 아세토니트릴(1mL×4회)과 디클로로메탄(1mL×4회)으로 세척한 후에 25% 암모니아수/에탄올(3:1, v/v, 5mL) 용액으로 하기 조건하에서 반응을 수행하고, 핵산 염기부의 탈보호와 고상 담체로부터의 절단을 수행하였다(APBT 및 CPBT: 실온 조건, 20h; GPBT: 50℃, 20h). 반응 후, 반응 용액을 여과하고, 에탄올을 사용하여 세척하였다. 용매를 감압 증류 제거하고, 조 생성물을 역상 HPLC로 전술한 바와 같이 분석하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.
[합성예 9]
반응 용매로서 염기를 첨가하지 않은 아세토니트릴만을 사용한 점 이외에는 합성예 8과 동일한 조작을 수행하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.
[합성예 10]
합성예 10은, H-포스포노티오에이트 모노머 5g을 사용하는 경우에 대해서만 실시하였다. 상기 모노머의 양을 36.2mg(80당량, 40㎛ol)으로 변경하고, PyNTP의 양을 50.0mg(200당량, 100㎛ol)으로 변경한 점 이외에는 합성예 9와 동일한 조작을 수행하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.
표 2 중, 화학 선택성은, HPLC의 결과에서, 부생성물인 dNPOT와 목적물인 dNPST의 면적비로부터 산출하였다. HPLC 수율은 HPLC 결과에서의 면적비 dNPST/(T + dNPOT + dNPST)로부터 산출하였다. 엔트리 1∼6에서는, 모노머의 당량이 40, PyNTP의 당량이 100인 점에 반해, 엔트리 7에서는, 모노머의 당량이 80, PyNTP의 당량이 200이었다. 엔트리 1, 3 및 5는 합성예 8의 결과를 나타내고, 엔트리 2, 4, 및 6은 합성예 9의 결과를 나타내며, 엔트리 7은 합성예 10의 결과를 나타낸다.
(N* PBT의 고상 합성)
[합성예 11]
이하, N*은 2'-OMe 수식된 뉴클레오타이드 단위를 나타낸다.
숙시닐링커를 통해 고상 담체에 담지한 5'-디메톡시트리틸-N3-벤조일티미딘(0.5㎛ol)에 대하여 3% 디클로로아세트산/디클로로메탄 용액(4회×15s, 1mL/회)을 첨가하여, 탈트리틸화한 후, 분자체로 건조시킨 아세토니트릴과 디클로로메탄으로 고상 담체를 세척하였다. 고상 담체를 10분간 건조시킨 후에 반응계 중에 2'-OMe 수식된 H-보라노포스포네이트 모노머 6a, 6c, 6g 또는 6u(A: 17.1mg(40당량, 20㎛ol); C: 16.7mg(40당량, 20㎛ol); G: 16.9mg(40당량, 20㎛ol); U: 16.7mg(40당량, 20㎛ol))과 MNTP(22.3mg, 100당량, 50㎛ol)를 가하고, 아르곤의 존재하에서, 염기로서 2,6-루티딘을 포함하는 아세토니트릴 용액을 반응 용매로서 첨가하고, 3분간 손으로 천천히 교반함으로써 축합하였다. 2'-OMe 수식된 H-보라노포스포네이트 모노머의 축합 후, 고상 담체를, 건조시킨 아세토니트릴(1mL×4회)과 디클로로메탄(1mL×4회)으로 세척한 후에 3% 디클로로아세트산/디클로로메탄-트리에틸실란(1:1, v/v) 용액에 의해 디메톡시트리틸기의 탈보호를 수행하였다(4회×15s, 1mL/회). 그 후, 고상 담체를, 건조시킨 아세토니트릴(1mL×4회)과 디클로로메탄(1mL×4회)으로 세척하고, 10분간 건조시켰다. 형성된 H-보라노포스포네이트 결합에 대해 0.1M 트리에틸아민/사염화탄소-2,6-루티딘-물(5:12.5:1, v/v/v) 용액을 첨가하여 90분간 산화를 수행하여 보라노포스페이트 결합으로 변환시켰다. 고상 담체를, 건조시킨 아세토니트릴(1mL×4회)과 디클로로메탄(1mL×4회)으로 세척한 후에 25% 암모니아수/에탄올(3:1, v/v, 5mL) 용액으로 하기 조건 하에서 반응을 수행하고, 핵산 염기부의 탈보호와 고상 담체로부터의 절단을 수행하였다(U* PBT: 실온 조건, 3h; A* PBT 및 C* PBT: 실온 조건, 20h; G* PBT: 50℃, 20h). 반응 후, 반응 용액을 여과하고, 에탄올을 사용하여 세척하였다. 용매를 감압 증류 제거하고, 조 생성물을 역상 HPLC로 전술한 바와 같이 분석하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.
표 3 중, HPLC 수율은, HPLC의 결과에 있어서의 면적비 N* PBT/(T+N* PBT)로부터 산출하였다.
[실시예 1] PB/PS/PO 키메라형 핵산 올리고머(12량체)의 합성
숙시닐링커를 통해 고상 담체에 담지한 5'-디메톡시트리틸-N3-벤조일티미딘(0.5㎛ol)에 대하여, 3% 디클로로아세트산/디클로로메탄 용액(1mL)을 15초간 반응시켜 보호기를 탈리시킨 후, 반응 용액을 제거하였다. 동일한 조작을 4회 반복한 후, 디클로로메탄(1mL)으로 4회, 아세토니트릴(1mL)로 4회 세척하고, 고상 담체의 진공 건조를 수행하였다. 다음으로, 이하의 (i) 공정과 (ii)의 조합을 11회 반복함으로써 올리고머의 사슬 길이 신장 반응을 수행하였다.
(i) 공정: 서열에 따라 선택된 모노머, MNTP 또는 PyNTP, 및 필요에 따라 2,6-루티딘 또는 퀴놀린을 아세토니트릴(0.2mL)로 혼합하고 3분간 반응시켰다. 3분 후, 반응 용액을 제거하고, 반응 후의 고상 담체를 아세토니트릴로 4회, 디클로로메탄으로 4회 세척하였다. 각종 모노머를 이용한 축합 조건을 이하에 나타낸다.
(ii) 공정: 상기 (i) 공정 후의 고상 담체를 3% 디클로로아세트산/디클로로메탄-트리에틸실란(1:1, v/v) 용액(1mL)과 15초간 반응시켰다. 동일한 조작을 4회 반복한 후, 디클로로메탄(1mL)으로 4회, 아세토니트릴(1mL)로 4회 세척을 행하고, 고상 담체를 진공 건조시켰다.
사슬 길이 연장 후의 고상 담체에, 0.1M 트리에틸아민/사염화탄소-2,6-루티딘-H2O(5:12.5:1, v/v/v) 용액을 0.5mL 첨가하고, 90분간 반응시켰다. 반응 후에, 고상 담체를 아세토니트릴(1mL)로 4회, 디클로로메탄(1mL)으로 4회 세척하였다.
그 후, 세척 후의 고상 담체에 대하여, 25% 암모니아수-에탄올(3:1, v/v)을 50℃에서 20시간 반응시킴으로써, 핵산 염기부의 탈보호와 고상 담체로부터의 핵산 올리고머의 절단을 수행하였다. 고상 담체를 여과 분리하고, 여과액을 회수한 후, 용매의 감압 증류 제거를 수행하였다.
얻어진 PB/PS/PO 키메라형 핵산 올리고머(12량체)를 포함하는 용액을 25% NH3-에탄올 수용액(3:1, v/v, 50℃, 20h)으로 처리하고, 에탄올(2ml×4회)로 세척하였다. 수용액을 감압하에서 용매를 증류 제거하였다. 그 후, 역상 HPLC로 분리 정제하였다. 역상 HPLC 및 분리 정제는, 60℃에서, 5∼40% 메탄올의 0.1M 헥사플루오로이소프로판올-0.008M 트리에틸아민 완충용액을 이동상으로서 사용하여 유속 0.5mL/분으로 20분간 수행하였다. 실시예 1에 있어서, 분리 정제 전 및 분리 정제 후에 수행한 역상 HPLC의 차트를 각각, 도 2(a) 및 도 2(b)에 나타낸다.
수율 6%. HRMS(ESI-TOF): Calcd for [M-6H]6-, 615.7786; found, 615.7767
얻어진 PB/PS/PO 키메라형 핵산 올리고머(12량체)는 d (CPSAPSGPSTPSCPBAPBGPBTPBCPOAPOGPOT) (서열번호 1)의 염기 서열을 갖는 핵산 올리고머이다.
[실시예 2] PB/PS/PO 키메라형 핵산 올리고머(apoB 서열 함유 12량체)의 합성
아포 B(apoB) 단백질(아포단백질 B-100: Nature, 2006, Vol. 441, pp111-114)을 코딩하는 mRNA의 일부(3'-rCGU AAC CAU AAG-5': 상보 사슬 RNA, 서열번호 2)를 표적 핵산으로 선택하였다. RNA의 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 PB/PS/PO 키메라형 핵산 올리고머를 합성하였다.
숙시닐링커를 통해 고상 담체에 담지한 5'-O-DMTr-N4-벤조일시티딘(0.5㎛ol)에 대하여 실시예 1과 동일한 조작에 의해, 상기 PB/PS/PO 키메라형 핵산 올리고머를 합성하였다. 얻어진 핵산 올리고머를 이온 교환 HPLC로 분리 정제하였다. 분리 정제는 실온 하, 0-0.5M NaCl, 30% 아세토니트릴의 10mM Tris-HCl 완충 용액(pH 7.5)을 사용하고, 유속 0.4mL/분, 40분간의 조건으로 수행하였다. 실시예 2에 있어서, 분리 정제 전 및 분리 정제 후에 수행한 역상 HPLC의 차트를 각각, 도 3(a) 및 도 3(b)에 나타낸다.
수율 19%. HRMS(ESI-TOF): Calcd for [M-6H]6-, 614.1138; found, 614.1136
얻어진 PB/PS/PO 키메라형 핵산 올리고머(12량체)는 d (GPBCPSAPBTPOTPOGPOGPOTPSAPBTPSTPBC) (서열번호 3)의 염기 서열을 갖는 안티센스 분자이다.
[실시예 3] PB/PS/PO-gapmer(12량체)의 합성
실시예 2와 동일하게 하여 표적 핵산(아포 B 단백질)의 염기 서열과 상보적인 서열이 되도록, 실시예 2에서 사용한 모노머에 더하여, N4-벤조일시토신, N6-벤조일아데닌, N2-이소부티릴구아닌, 또는 N3-벤조일티민을 염기로서 갖는 2'-OMe 수식된 보라노포스포네이트 화합물을 사용하여, 순차적으로, 보호기를 갖는 수산기의 탈보호 반응, 축합 반응을 12량체가 얻어질 때까지 반복한 후, 산화 반응 및 핵산 염기부의 탈보호 반응, 고상 담체로부터의 절단을 수행하여, PB/PS/PO-gapmer(12량체)를 얻었다.
얻어진 PB/PS/PO-gapmer(12량체)를 포함하는 용액을 25% NH3-에탄올 수용액(3:1, v/v, 50℃, 20h)으로 처리하고, 에탄올(2ml×4회)로 세척하였다. 수용액은 감압하에서 용매를 증류 제거하였다. 그 후, 역상 HPLC로 분리 정제하였다. 역상 HPLC 및 분리 정제는, 60℃에서, 5∼40% 메탄올의 0.1M 헥사플루오로이소프로판올-0.008M 트리에틸아민 완충 용액을 이동상으로서 사용하여 유속 0.5mL/분으로 20분간 수행하였다. 실시예 3에 있어서, 분리 정제 전 및 분리 정제 후에 수행한 역상 HPLC의 차트를 각각, 도 4(a) 및 도 4(b)에 나타낸다.
수율 13%. HRMS(ESI-TOF) Calcd for [M-6H]6-, 635.9695; found, 635.9670
얻어진 PB/PS/PO-gapmer(12량체)는, G* PBC* PBA* PBd (TPSTPOGPOGPOTPSAPB) U* PBU* PBC* (서열번호 4)의 염기 서열을 갖는 안티센스 분자이다. (N*는 2'-OMe 수식을 실시한 뉴클레오티드 단위를 나타낸다.)
[실시예 4] PB/PS 키메라형 핵산 올리고머(12량체)의 합성
실시예 2와 동일하게 하여 표적 핵산(아포 B 단백질)의 염기 서열과 상보적인 서열이 되도록 순차적으로, 보호기를 갖는 수산기의 탈보호 반응, 축합 반응을 12량체가 얻어질 때까지 반복하여 행한 후, 산화 반응 및 핵산 염기의 탈보호 반응, 고상 담체로부터의 절단을 수행하여, PB/PS 키메라형 핵산 올리고머(12량체)를 얻었다.
얻어진 PB/PS 키메라형 핵산 올리고머(12량체)를 포함하는 용액을 25% NH3-에탄올 수용액(3:1, v/v, 50℃, 20h)으로 처리하고, 에탄올(2ml×4회)로 세척하였다. 수용액을 감압하에 용매를 증류 제거하였다. 그 후, 역상 HPLC로 분리 정제하였다. 역상 HPLC 및 분리 정제는, 60℃에서, 5∼40% 메탄올의 0.1M 헥사플루오로이소프로판올-0.008M 트리에틸아민 완충 용액을 이동상으로서 사용하여 유속 0.5mL/분으로 20분간 수행하였다. 실시예 4에 있어서, 분리 정제 전 및 분리 정제 후에 행한 역상 HPLC의 차트를 각각, 도 5(a) 및 도 5(b)에 나타낸다.
수율 5%. HRMS(ESI-TOF) Calcd for [M-6H]6-, 618.6194; found, 618.6175
얻어진 PB/PS 키메라형 핵산 올리고머(12량체)는 d (GPBCPSAPBTPSTPSGPBGPBTPSAPBTPSTPBC) (서열번호 5)의 염기 서열을 갖는 안티센스 분자이다.
＜모노머의 합성 2＞
(2'-O-4'-C-Locked-H-보라노포스포네이트 모노머 7a 또는 7c의 합성)
이하, 2'-O-4'-C-Locked-H-보라노포스포네이트 모노머를 Locked Nucleic Acid(이하, 「LNA」라고 한다.) 수식된 H-보라노포스포네이트 모노머라고도 한다.
상기 반응식 좌단에 기재된 뉴클레오시드 유도체(A: 0.69g, 1.0mmol; 또는 mC: 0.77g, 1.1mmol; mC는 5-메틸시토신을 나타낸다)와 피리디늄 H-보라노포스포네이트(A: 0.41g, 2.0mmol; 또는 mC: 0.47g, 2.3mmol)를 아르곤 분위기 하에서 피리딘(3mL×3회)으로 공비 건조하여 피리딘(A: 10mL; 또는 mC: 11mL)에 용해하였다. 얻어진 피리딘 용액을 빙욕하에서 교반하면서 BopCl(A: 0.51g, 2.0mmol; 또는 mC: 0.58g, 2.3mmol)을 첨가하고, 그 후, 반응 온도를 실온으로 하여 1시간 교반하였다. 이 용액을 클로로포름 60mL로 희석한 후에, 유기층을 1.0M TEAB 완충용액(pH 7.0)으로 세척하였다(80mL×3회). 수층을 클로로포름으로 역추출하였다(40mL×3회). 유기층을 모아 무수황산나트륨으로 수분을 제거한 후, 유기층의 용매를 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리 정제하고(전개용매 A: 아세트산에틸-메탄올-트리에틸아민) (99:0.5:0.5, v/v/v), 그 후 클로로포름-메탄올-트리에틸아민(98:2:0.5 - 96:4:0.5, v/v/v); mC: 아세트산에틸-메탄올-트리에틸아민(99.5:0.5:0.5, v/v/v), 그 후, 클로로포름-메탄올-트리에틸아민(99:1:0.5, v/v/v)), 용매를 감압 증류 제거하여 LNA 수식된 H- 보라노포스포네이트 모노머 7a 또는 7c를 얻었다. 7a: 수득량 0.79g, 0.92mmol, 수율 92%; 7c: 수득량 0.60g, 0.67mmol, 수율 59%
LNA 수식된 H-보라노포스포네이트 모노머 7a
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ9.50-9.10(br, 1H), 8.78(s, 0.5H), 8.77(s, 0.5H), 8.40(s, 0.5H), 8.40(s, 0.5H), 8.06-7.96(m, 2H), 7.84-7.68(br, 0.5H), 7.64-7.42(m, 5H), 7.38-7.19(m, 7H), 6.89-6.83(m, 4H), 6.79-6.73(br, 0.5H), 6.17 (s, 0.5H), 6.14(s, 0.5H), 4.95-4.89(m, 1H), 4.73(d, J=7.8Hz, 1H), 4.12-3.95(m, 2H), 3.83-3.73(m, 6H), 3.65-3.49(m, 2H), 2.91(q, J=7.5Hz, 6H), 1.19(t, J=7.5Hz, 9H), 1.0-0.0(br, 3H)
31P-NMR(162MHz, CDCl3)δ110-103(br)
LNA 수식된 H-보라노포스포네이트 모노머 7c
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ8.35-8.28(m, 2H), 7.90-7.86(m, 1H), 7.55-7.42(m, 5H), 7.41-7.30(m, 6H), 7.27-7.22(m, 1H), 6.89-6.81(m, 4H), 6.84-6.78(br, 0.5H) 5.69(s, 0.5H), 5.65(s, 0.5H), 4.89(d, J=6.4Hz, 0.5H), 4.70(s, 0.5H), 4.67(s, 0.5H), 4.58(d, J=8.0Hz, 0.5H), 3.98-3.96(m, 1H), 3.82-3.78(m, 6H), 3.56-3.44(m, 2H), 2.84(q, J=7.2Hz, 6H), 1.87-1.82(m, 3H), 1.18(t, J=7.3Hz, 9H), 1.0-0.1(3H)
31P-NMR(162MHz, CDCl3) δ111-104(br)
(2'-O-4'-C-Locked-H-보라노포스포네이트 모노머 7g의 합성)
2'-O-4'-C-Locked-guanosine(0.443g, 1.5mmol)을 아르곤 분위기 하 피리딘 5mL에 용해하고, 4-디메틸아미노피리딘(0.189g, 1.5mmol), 이소부티르산 무수물(1.25mL, 7.5mmol)을 순차적으로 첨가하고, 110℃에서 9시간 동안 반응시켰다. 혼합물에 클로로포름(20mL)을 첨가하고, 1M 염산(20mL)으로 세척하고, 수층을 클로로포름(20mL)으로 역추출하였다. 수집된 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액(40mL)으로 2회 세척하고, 수층을 클로로포름(40mL)으로 역추출하였다. 수집한 유기층을 황산나트륨으로 건조한 후, 여과하고, 용매를 감압 증류 제거하였다. 더 이상의 정제 조작을 행하지 않고 다음 반응에 사용하였다. 혼합물을 아르곤 분위기 하에서 피리딘(4mL)에 용해하고, 디이소프로필에틸아민(0.4mL, 2.25 mmol), 디페닐카바모일 클로라이드(0.69g, 3.0mmol)를 순차적으로 첨가하여, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 메탄올(5mL)을 첨가하여 반응을 정지하고, 클로로포름(20mL)을 첨가하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액(20mL)으로 3회 세척하였다. 수집된 수층을 클로로포름(20mL)으로 역추출하였다. 수집한 유기층을 황산나트륨으로 건조한 후, 여과하고, 용매를 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개용매: 아세트산에틸-헥산(40:60 - 50:50, v/v))에 의해 정제함으로써, 2'-O-4'-C-Locked-3',5'-O-디이소부티릴-2-N-이소부티릴-6-O-디페닐카바모일-구아노신(0.859 g, 1.23 mmol, 82%)을 얻었다.
얻어진 2'-O-4'-C-Locked-3',5'-O-디이소부티릴-2-N-이소부티릴-6-O-디페닐카바모일-구아노신 전량을, 피리딘-메탄올 혼합 용매(1:1, v/v, 21mL)에 용해하고, 0℃에서 나트륨 메톡시드(26.4mg, 0.488mmol)를 단계적으로 4회로 나누어 첨가하고, 14시간 교반하였다. 또한 실온까지 승온하고, 4.5 시간 교반 후, 양이온 교환 수지를 첨가함으로써 반응을 정지하고, 양이온 교환 수지를 여과로 제거한 후, 용매를 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개용매: 클로로포름-메탄올(100:0 - 100:4, v/v))에 의해 정제함으로써, 2'-O-4'-C-Locked-2-N-이소부티릴-6-O-디페닐카바모일-구아노신(0.401g, 0.715mmol, 58%)을 얻었다.
얻어진 2'-O-4'-C-Locked-2-N-이소부티릴-6-O-디페닐카바모일-구아노신의 전량을, 아르곤 분위기 하 피리딘(7mL)에 용해하고, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(0.266g, 0.79mmol)를 첨가하고, 실온에서 1.5시간 교반 후, 추가로 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(61mg, 0.18mmol)를 첨가하고, 40분간 교반하였다. 메탄올(5 mL)을 첨가하여 반응을 정지하고, 클로로포름(20mL)을 첨가하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액(20mL)으로 3회 세척하였다. 수집된 수층을 클로로포름(20mL)으로 역추출하였다. 수집한 유기층을 황산나트륨으로 건조한 후, 여과하고, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개용매: 클로로포름-메탄올-피리딘(100:0:0.5 - 100:1.5:0.5, v/v/v))로 정제하고, 2'-O-4'-C-Locked-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2-N-이소부티릴-6-O-디페닐카바모일-구아노신(0.617g, 0.451mmol, 63%)을 얻었다.
상기 반응식 좌단에 기재된 LNA 수식된 구아노신 유도체(0.39g, 0.45mmol)와 피리디늄 H-보라노포스포네이트(0.19g, 0.90mmol)를 아르곤 분위기 하에서 피리딘(3mL×3회)으로 공비 건조하여 피리딘(5mL)에 용해하였다. 얻어진 피리딘 용액을 빙욕하에서 교반하면서 BopCl(0.23g, 0.90mmol)을 첨가하고, 그 후, 반응 온도를 실온으로 하여 1시간 교반하였다. 이 용액을 클로로포름(30mL)으로 희석한 후에, 유기층을 1.0M TEAB 완충 용액(pH 7.0)으로 세척하였다(30mL×3회). 수층을 클로로포름으로 역추출하였다(30mL×3회). 유기층을 모아 무수 황산마그네슘으로 수분을 제거한 후, 유기층의 용매를 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리 정제하고(전개용매: 아세트산에틸-트리에틸아민(100:0.5, v/v), 그 후, 클로로포름-메탄올-트리에틸아민(98:2:0.5, v/v/v)), 용매를 감압 증류 제거함으로써 LNA 수식된 H-보라노포스포네이트 모노머 7g(0.35g, 0.92mmol, 92%)을 얻었다.
LNA 수식된 H-보라노포스포네이트 모노머 7g
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ8.74(s, 0.5H), 8.68(s, 0.5H), 8.23(s, 0.5H), 8.20(s, 0.5H), 7.84-7.64(m, 0.5H), 7.44-7.41(m, 5H), 7.38-7.28(m, 10H), 7.26-7.18(m, 4H), 6.91-6.75(m, 4H), 6.76-6.70(br, 0.5H), 6.00(s, 0.5H), 6.00(s, 0.5H), 5.17(d, J=6.4Hz, 0.5H), 4.96(s, 0.5H), 4.89(s, 0.5H), 4.82(d, J=8.5Hz, 0.5H), 4.14-4.07(m, 1.5H), 3.99-3.95(m, 0.5H), 3.80-3.73(m, 6H), 3.59-3.44(m, 2H), 3.30-3.21(m, 1H), 2.86(q, J=7.3Hz, 6H), 1.27-1.19(m, 6H), 1.12(t, J=7.3Hz, 9H)
31P-NMR(162MHz, CDCl3) δ110-101(br)
(2'-O-4'-C-Locked-H-보라노포스포네이트 모노머 7t의 합성)
2'-O-4'-C-Locked-H-보라노포스포네이트 모노머 7t는 문헌(The Journal of Organic Chemistry, 2014년, 79권, 3465-347)에 기재된 합성법에 의해 합성하였다.
(2'-O-MOE 수식된 H-보라노포스포네이트 모노머의 합성)
하기 반응식에 따라, 2'-O-MOE 수식된 H-보라노포스포네이트 모노머를 합성하였다.
상기 반응식 좌단에 기재된 구아노신 유도체 8g(0.722g, 1.0mmol)을 아르곤 분위기 하에서 피리딘(3mL×3회)으로 공비 건조하여 피리디늄 H-보라노포스포네이트(0.30g, 2.0 mmol)과 함께 피리딘 25mL에 용해하였다. 얻어진 피리딘 용액을 빙욕하에서 교반하면서 BopCl(0.51g, 2.0mmol)을 첨가하고, 그 후, 반응 온도를 실온으로 하여 6시간 교반하였다. 이 용액을 클로로포름 30mL로 희석한 후에, 유기층을 1.0M TEAB 완충용액(pH 7.0)으로 세척하였다(30mL×3회). 수층을 클로로포름에 의해 역추출하였다(30mL×3회). 유기층을 모아 무수황산나트륨에 의해 수분을 제거한 후, 유기층의 용매를 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리 정제하고(전개용매: 아세트산에틸-메탄올-트리에틸아민(100:0:1, v/v/v), 그 후, 클로로포름-메탄올-트리에틸아민(100:10:1, v/v/v)), 용매를 감압 증류 제거함으로써 2'-O-MOE 수식된 H-보라노포스포네이트 모노머 9g을 얻었다. 수득량 0.57g, 0.60mmol, 수율 60%
2'-O-MOE 수식된 H-보라노포스포네이트 모노머 9g
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ11.4-10.5(br, 1H), 7.90(s, 0.5H), 7.89(s, 0.5H), 7.80-7.68(br, 0.5H) 7.42(d, J=7.8Hz, 2H), 7.30(d, J=8.2Hz, 4H), 7.24-7.14(m, 3H), 6.93-6.87(br, 0.5H), 6.78-6.74(m, 4H), 5.97(d, J=4.1Hz, 0.5H), 5.93(d, J=4.6Hz, 0.5H), 5.40-5.27(m, 1H), 4.82(t, J=4.3Hz, 0.5H), 4.80(t, J=4.3Hz, 0.5H), 4.43-4.34(m, 1H) 3.93-3.85(m, 1H), 3.76-3.71(m, 6H), 3.51-3.41(m, 2H), 3.23(d, J=7.3Hz, 3H), 2.91(q, J=7.3Hz, 6H), 2.63-2.49(m, 1H), 1.19(t, J=7.3Hz, 9H), 1.14-1.03(m, 6H), 0.9-0.2(br, 3H)
31P-NMR(162MHz, CDCl3) δ108-103(br)
＜고상법에 의한 핵산 올리고머의 합성 2＞
(N# PBT의 고상 합성)
[합성예 12]
이하, N#은 2'-O-MOE 수식된 뉴클레오타이드 단위를 나타낸다.
숙시닐링커를 통해 고상 담체에 담지한 5'-디메톡시트리틸-N3-벤조일티미딘(0.5㎛ol)에 대하여 3% 디클로로아세트산/디클로로메탄 용액(4회×15s, 1mL/회)을 첨가하여, 탈트리틸화한 후에, 분자체로 건조시킨 아세토니트릴과 디클로로메탄으로 고상 담체를 세척하였다. 고상 담체를 10분간 건조시킨 후에 반응계 중에 2'-O-MOE 수식된 H-보라노포스포네이트 모노머 9g(18.9mg, 40당량, 20㎛ol))과 MNTP(22.3mg, 100당량, 50㎛ol)을 첨가하고, 아르곤 존재하에서, 염기로서 2,6-루티딘을 포함하는 아세토니트릴 용액 0.2mL를 반응 용매로서 첨가하고, 3분간 손으로 천천히 교반함으로써 축합하였다. 2'-O-MOE 수식된 H-보라노포스포네이트 모노머의 축합 후, 고상 담체를, 건조시킨 아세토니트릴(1mL×4회)과 디클로로메탄(1mL×4회)으로 세척한 후에 3% 디클로로아세트산/디클로로메탄-트리에틸실란(1:1, v/v) 용액에 의해 디메톡시트리틸기의 탈보호를 수행하였다(4회×15s, 1mL/회). 그 후, 고상 담체를, 건조시킨 아세토니트릴(1mL×4회)과 디클로로메탄(1mL×4회)으로 세척하고, 10분간 건조시켰다. 형성된 H-보라노포스포네이트 결합에 대해 0.1M 트리에틸아민/사염화탄소-2,6-루티딘-물(5:12.5:1, v/v/v) 용액을 첨가하여 90분간 산화를 수행하여 보라노포스페이트 결합으로 변환시켰다. 고상 담체를, 건조시킨 아세토니트릴(1mL×4회)과 디클로로메탄(1mL×4회)으로 세척한 후에 25% 암모니아수/에탄올(3:1, v/v, 5mL) 용액으로 하기 조건 하에서 반응을 행하여, 핵산 염기부의 탈보호와 고상 담체로부터의 절단을 수행하였다(G# PBT: 50℃, 20h). 반응 후, 반응 용액을 여과하고, 에탄올을 사용하여 세척하였다. 용매를 감압 증류 제거하고, 조 생성물을 역상 HPLC로 전술한 바와 같이 분석하였다. 결과를 표 5 및 도 6에 나타낸다.
표 5 중, HPLC 수율은 HPLC 결과에서의 면적비 G# PBT/(T+G# PBT)로부터 산출하였다.
[실시예 5] PB/PS-LNA-gapmer(12량체)의 합성
실시예 2와 동일하게 하여 표적 핵산(아포 B 단백질)의 염기 서열과 상보적인 서열이 되는 핵산 올리고머를 합성하였다. 고상 담체로서는 5'-디메톡시트리틸기를 갖는 유니링커(Universal UnyLinker Support 1000A(ChemGenes), 0.5㎛ol)를 사용하였다. 또한, 실시예 2에서 사용한 모노머에 첨가하여, N4-벤조일-5-메틸시토신, N6-벤조일아데닌, N2-이소부티릴-O6-디페닐카바모일 구아닌, 또는 N3-벤조일티민을 염기로서 갖는 LNA 수식된 H-보라노포스포네이트 화합물을 사용하였다. 1염기째만, 이하의 (A) 공정에 나타내는 자동 합성기(M-4(일본 테크노서비스))를 이용한 포스포로아미다이트법에 의해 도입하였다.
(A) 공정: 고상 담체를 충전시킨 고상 합성용 컬럼에 3% 트리클로로아세트산/디클로로메탄 용액을 4회 통액시키고, 40초간(10초/회) 반응시킴으로써 탈트리틸화를 수행하였다. 반응 완료 후, 고상 담체를 아세토니트릴로 세척한 후, 이어서 아르곤 가스로 통기 건조시켰다. 다음으로, 염기부에 N4-벤조일-5-메틸시토신, 당부분에 LNA 수식을 갖는 5'-디메톡시트리틸-3'-시아노에틸포스포로아미다이트 유닛(N4-벤조일-5-메틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-4'-C-Locked-시티딘-3'-시아노에틸 포스포로아미다이트)가 0.1mol/L이 되도록 용해시킨 아세토니트릴 용액(이하, 「아미다이트 용해 용액」이라고 한다.)을 컬럼에 4회 통액시키고, 24분간(6분/회) 반응시킴으로써 고상 담체에 LNA 수식된 5-메틸시티딘 유도체를 도입하였다. 이때, 활성화제로서 0.25mol/L의 5-벤질티오-1-H-테트라졸-아세토니트릴 용액도 컬럼 내로 동시에 통액하였다. 아미다이트 용해 용액과 활성화제의 비는 40:60(v/v)이었다. 반응 완료 후, 고상 담체를 아세토니트릴로 세척하고, 이어서 아르곤 가스로 통기 건조시켰다. 계속해서, 산화제(테트라히드로퓨란-물-피리딘-요오드(66:12:22:0.6, v/v/v/w))를 4회 통액시키고, 36초간(9초/회) 반응시킴으로써, 인산부의 산화를 수행하였다. 반응 완료 후, 고상 담체를 아세토니트릴로 세척하고, 이어서 아르곤 가스로 통기 건조시켰다. 다음으로 캡 A 용액(테트라히드로퓨란-무수아세트산-피리딘(8:1:1, v/v/v))과 캡B 용액(16% N-메틸이미다졸-테트라히드로퓨란)의 1:1(v/v) 혼합 용액을 4회 통액시키고, 80초간(20초/회) 반응시킴으로써, 미반응의 유니링커의 수산기의 캡핑을 수행하였다. 마지막으로, 고상 담체를 아세토니트릴로 세척한 후, 아르곤 가스로 통기 건조시킴으로써 목적으로하는 고상 담체를 얻었다.
(B) 공정: 그 후, 2염기째 이후는 실시예 2와 동일한 방법으로 순차적으로, 보호기를 갖는 수산기의 탈보호 반응, 축합 반응을 12량체가 얻어질 때까지 반복하여 수행하였다. 단, 본 서열 내, LNA 수식된 H-보라노포스포네이트 모노머를 사용한 축합용 축합제에는 MNTP를 사용하고, 2'-데옥시리보핵산형의 H-보라노포스포네이트-모노머를 사용한 축합용 축합제에는 PyNTP를 사용하였다(각종 모노머의 축합 조건을 표 6에 나타낸다). 마지막으로 산화 반응을 수행하여 PB/PS-LNA-gapmer(12 량체)를 포함하는 고상 담체를 얻었다.
얻어진 PB/PS-LNA-gapmer(12량체)를 포함하는 고상 담체에 대하여 28% NH3수-에탄올(3:1, v/v)을 25℃(실온)에서 6.5시간 반응시키고 고상 담체로부터의 절단을 실시하였다. 고상 담체를 0.45㎛ 필터로 여과 분리한 후, 여과액을 55℃에서 8시간 더 반응시킴으로써, 핵산 염기부의 탈보호를 실시하였다. 얻어진 용액으로부터 감압하에 용매를 증류 제거하고, 그 후, 역상 UHPLC-MS에 의한 분석을 실시하였다. 역상 UHPLC에 의한 분석은 60℃에서 5∼30% 메탄올의 0.1M 헥사플루오로이소프로판올-0.008M 트리에틸아민 완충 용액을 이동상으로서 사용하여 유속 0.2mL/분으로 20분간 수행하였다. 실시예 5에서 수행한 역상 UHPLC의 차트를 도 7에 나타낸다.
순도 18.7%(용출 시간: 11.3분). LRMS(ESI-MS) Calcd for [M-4H]4-, 977.71; found, 977.89. [M-5H]5-, 781.97; found, 781.87
얻어진 PB/PS-LNA-gapmer(12량체)는 G† PBmC† PBA† PBd (TPSTPSGPSGPSTPSAPB) T† PBT† PBmC†(서열번호 6)의 염기 서열을 갖는 안티센스 분자이다. (N†은 LNA 수식을 실시한 뉴클레오티드 단위를 나타낸다.)
[실시예 6] PB/PS/PO-mixmer(12량체)의 합성
실시예 2와 동일하게 하여 표적 핵산(아포 B 단백질)의 염기 서열과 상보적인 서열이 되도록, 실시예 2에서 사용한 모노머에 더하여, N2-이소부틸릴구아닌을 염기로서 갖는 2'-O-MOE 수식된 H-보라노포스포네이트 화합물 9g을 사용하여, 순차적으로, 보호기를 갖는 수산기의 탈보호 반응, 축합 반응(각종 모노머의 축합 조건을 표 7에 나타낸다.)을 12량체가 얻어질때 까지 반복한 후, 산화 반응을 수행하였다. 다음으로 25% NH3수-에탄올(3:1, v/v, 50℃, 20h)로 처리함으로써 핵산 염기부의 탈보호 반응, 고상 담체로부터의 절단을 수행하고, 에탄올(2ml×3회)로 세척하고, 감압하에 용매를 증류 제거함으로써, PB/PS/PO-mixmer(12량체)를 얻었다.
그 후, 역상 HPLC로 분리 정제하였다. 역상 HPLC에 의한 분석 및 분리 정제는 60℃에서 10∼45% 메탄올의 0.4M 헥사플루오로이소프로판올-0.008M 트리에틸아민 완충용액을 이동상으로 사용하여 유속 0.5mL/분으로 20분간 실시하였다. 실시예 6에 있어서, 분리 정제 전 및 분리 정제 후에 실시한 역상 HPLC의 차트를 각각, 도 8(a) 및 도 8(b)에 나타낸다.
수율 20%. HRMS(ESI-TOF) Calcd for [M-4H]4-, 975.9717; found, 975.9670
얻어진 PB/PS/PO-mixmer(12량체)는 G# PBd(CPOAPSTPBTPO)G# PBG# PBd (TPBAPSTPSTPBC) (서열번호 7)의 염기 서열을 갖는 안티센스 분자이다.
SEQUENCE LISTING
<110> TOKYO UNIVERSITY OF SCIENCE FOUNDATION
<120> PHOSOPHOROTHIOATE AND BORANOPHOSPHATE-INCLUDING CHIMERIC NUCLEIC
ACID OLIGOMER AND METHOD FOR PRODUCING SAME
<130> RKF-070PCT
<150> JP 2021-092873
<151> 2021-06-02
<160> 7
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence for demonstration
<400> 1
cagtcagtca gt 12
<210> 2
<211> 12
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
gaauaccaau gc 12
<210> 3
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisence oligomer for apoB (PB/PS/PO chimera)
<400> 3
gcattggtat tc 12
<210> 4
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisence oligomer for apoB (PB/PS/PO-gapmer)
<220>
<223> DNA/RNA chimera
<400> 4
gcattggtau uc 12
<210> 5
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisence oligomer for apoB (PB/PS chimera)
<400> 5
gcattggtat tc 12
<210> 6
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisence oligomer for apoB (PB/PS-LNA-gapmer)
<220>
<223> DNA/RNA chimera
<400> 6
gcattggtat tc 12
<210> 7
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisence oligomer for apoB (PB/PS/PO-mixmer)
<220>
<223> DNA/RNA chimera
<400> 7
gcattggtat tc 12
Claims (4)
- 하기 일반식 (1)로 표시되는 뉴클레오티드 단위 및 하기 일반식 (2)로 표시되는 뉴클레오티드 단위를 포함하고, 하기 일반식 (3)으로 표시되는 뉴클레오티드 단위를 포함하거나 포함하지 않는 핵산 올리고머.
[화학식 1]
(일반식 (1), (2), 및 (3) 중, R1은 수소 원자, 수산기, 알콕시기, 알케닐옥시기, 아실옥시기, 트리알킬실릴옥시기, 알콕시알콕시기, 할로알콕시알콕시기, 또는 할로게닐기를 나타내고, R2는 수소 원자를 나타내며, 또는 R1 및 R2는 서로 결합하여 치환기를 갖거나 갖지 않으며, 또한, 헤테로원자를 갖거나 갖지 않는 5원 이상의 환을 형성하고, Bs는 아데닌, 구아닌, 시토신, 5-메틸시토신, 티민 및 우라실로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 염기를 나타내고, 상기 핵산 염기는 핵산 염기의 보호기를 가져도 좋고, X+는 카운터 양이온을 나타낸다.) - 제1항에 있어서,
R1은 수소 원자, 수산기, 알콕시기, 알케닐옥시기, 아실옥시기, 트리알킬실릴옥시기, 알콕시알콕시기, 할로알콕시알콕시기, 또는 할로게닐기를 나타내고, R2는 수소 원자를 나타내며, 또는, R1 및 R2는 서로 결합하여 하기 일반식 (4)로 표시되는 2가의 기를 형성하는 핵산 올리고머.
[화학식 2]
(일반식 (4) 중, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소 원자수 1∼10의 알킬기를 나타내거나, 또는 서로 결합하여 환을 형성하고, * 및 **는, 결합손을 나타내며, *로 표시되는 결합손은, 일반식 (1), (2), 또는 (3)에 있어서, R1이 직결하는 탄소 원자에 결합하고, **로 표시되는 결합손은, 일반식 (1), (2), 또는 (3)에 있어서, R2가 직결하는 탄소 원자에 결합한다.) - 제1항 또는 제2항에 기재된 핵산 올리고머의 제조 방법에 있어서,
하기 일반식 (5)로 표시되는 화합물 및 하기 일반식 (6)으로 표시되는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 모노머, 또는 하기 일반식 (5)로 표시되는 화합물, 하기 일반식 (6)으로 표시되는 화합물, 및 하기 일반식 (7)로 표시되는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 모노머를 순차적으로 축합시켜, 하기 일반식 (8)로 표시되는 뉴클레오티드 단위 및 하기 일반식 (9)로 표시되는 뉴클레오티드 단위를 포함하고, 하기 일반식 (10)으로 표시되는 뉴클레오티드 단위를 포함하거나 포함하지 않는 전구체 핵산 올리고머를 얻는 축합 공정과,
상기 전구체 핵산 올리고머를 산화제에 의해 산화하여 제1항 또는 제2항에 기재된 핵산 올리고머를 얻는 산화 공정,
을 포함하는 제조 방법.
[화학식 3]
(일반식 (5), (6), 및 (7) 중, R1, R2, Bs, 및 X+는 상기와 같고, R5는 수소 원자 또는 수산기의 보호기를 나타낸다.)
[화학식 4]
(일반식 (8), (9), 및 (10) 중, R1, R2, 및 Bs는 상기와 같다.) - 제3항에 있어서,
적어도 상기 축합 공정을, 고상 담체를 사용한 반응에 의해 수행하는 제조 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JPJP-P-2021-092873 | 2021-06-02 | ||
| JP2021092873 | 2021-06-02 | ||
| PCT/JP2022/022556 WO2022255469A1 (ja) | 2021-06-02 | 2022-06-02 | ホスホロチオエート及びボラノホスフェートを含むキメラ型核酸オリゴマー、及びその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240005930A true KR20240005930A (ko) | 2024-01-12 |
Family
ID=84324314
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020237042502A KR20240005930A (ko) | 2021-06-02 | 2022-06-02 | 포스포로티오에이트 및 보라노포스페이트를 포함하는 키메라형 핵산 올리고머 및 그 제조 방법 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4349846A1 (ko) |
| JP (1) | JPWO2022255469A1 (ko) |
| KR (1) | KR20240005930A (ko) |
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-
2022
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- 2022-06-02 WO PCT/JP2022/022556 patent/WO2022255469A1/ja active Application Filing
- 2022-06-02 EP EP22816214.5A patent/EP4349846A1/en active Pending
- 2022-06-02 KR KR1020237042502A patent/KR20240005930A/ko unknown
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Chem. Rev., 2007, Vol.107, pp.4746-4796 |
| Nucleic Acids Research, 2010, Vol.38, No.20, pp.7100-7111 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117412983A (zh) | 2024-01-16 |
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