CN115038790A - 3’-rna寡核苷酸的合成 - Google Patents

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Abstract

本披露涉及用于合成寡核苷酸的单体和方法，这些寡核苷酸包含至少一个包含3'‑羟基基团的核苷。

Description

3’-RNA寡核苷酸的合成
相关申请交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求于2019年11月27日提交的美国临时申请号62/941,153的利益，其内容通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及核酸化学和寡核苷酸的化学合成。更特别地，本发明涉及用于合成寡核苷酸的单体和方法，这些寡核苷酸包含至少一个包含3’-羟基基团的核苷。
背景技术
经修饰的寡核苷酸在分子生物学研究和治疗应用中具有重要价值。虽然经修饰的寡核苷酸的化学合成是常规的，但许多经修饰的寡核苷酸的容易性和产率低。例如，常用的保护基团对于为化学合成的寡核苷酸脱保护所采用的条件是不稳定的。这在制备包含至少一个包含3’-羟基基团的核苷的寡核苷酸时尤其成问题。因此，本领域仍然需要用于制备此类寡核苷酸的单体和方法。本披露至少部分地解决了这种需要。
发明内容
本披露提供了用于制备具有提高的产率和更低杂质的寡核苷酸的单体和方法，其中寡核苷酸具有至少一个(例如两个、三个、四个或更多)具有3’-羟基基团的核苷。通常，该方法包括将核苷或寡核苷酸上的游离羟基基团与具有三异丙基甲硅烷基醚(TIPS)保护的3’- 羟基基团的核苷亚磷酰胺单体偶联。偶联形成亚磷酸三酯中间体，该中间体可被氧化或硫化以形成磷酸三酯或硫代磷酸酯中间体。
可以通过该方法制备具有预定长度和序列的寡核苷酸。例如，可以使用本文所述的方法和单体制备包含从约6至约50个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施例中，该寡核苷酸包含从约10至约30个核苷酸。
在另一方面，本披露提供了单体，例如具有三异丙基甲硅烷基醚保护的3’-羟基基团的核苷亚磷酰胺单体。通常，该单体具有式(I)：
Figure BDA0003765811440000021
在式(I)中，B是经修饰的或未经修饰的核碱基；R1为酸不稳定的羟基保护基团；R2是-Si(R4)3；R3是-P(NR5R6)OR7；每个R4独立地为任选地被取代的烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、环烷基、烯基、环烯基、炔基或环炔基；R5和R6独立地为任选地被取代的烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、环烷基、烯基、环烯基、炔基或环炔基，或其中将 R5和R6连接以形成杂环基；并且R7为任选地被取代的烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、环烷基、烯基、环烯基、炔基或环炔基。
在一些具有式(I)的单体中，B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶；R1是二甲氧基三苯甲基；R4、R5和R6是异丙基；并且R7是β- 氰乙基。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。在请求并支付必要的费用后，官方将会提供带有一幅或多幅彩色附图的本专利或专利申请公开物的副本。
图1是用在乙醇中的氢氧化铵脱保护后在N17位具有U-2’-OTBS 的序列1(aUfcaaAf(U-2’-OTBS)CfAfcuuuAfuUfgaguuuc，SEQ ID NO: 1)的HPLC描记图，示出了FLP-2’-OTBS、FLP-OH和切割物(16mer) 的生成。
图2是用在乙醇中的氢氧化铵脱保护后在N17位具有U-3’-OTBS 的序列2(aUfcaaAf(U-3’-OTBS)CfAfcuuuAfuUfgaguuuc，SEQ ID NO: 2)的PLC描记图，示出了FLP-3’-OTBS、FLP-OH和切割物(16mer) 的生成。
图3是用在乙醇中的氢氧化铵脱保护后在N17位具有G-3’-OTBS 的序列3(aUfcaaAf(G-3’-OTBS)CfAfcuuuAfuUfgaguuuc，SEQ ID NO: 3)的HPLC描记图，示出了FLP-3’-OTBS、FLP-OH和切割物(16mer) 的生成。
图4是用在乙醇中的氢氧化铵脱保护后在N17位具有 U-2’-OTOM的序列4(aUfcaaAf(U-2’-OTOM)CfAfcuuuAfuUfgaguuuc， SEQ ID NO:4)的HPLC描记图，示出了FLP-2’-OTOM、FLP-OH和切割物(16mer)的生成。
图5是用在乙醇中的氢氧化铵脱保护后在N17位具有 U-3’-OTOM的序列5(aUfcaaAf(U-3’-OTOM)CfAfcuuuAfuUfgaguuuc， SEQ ID NO:5)的HPLC描记图，示出了FLP-3’-OTOM、FLP-OH和切割物(16mer)的生成。
图6是用在乙醇中的氢氧化铵脱保护后在N17位具有 U-3’-OTIPS的序列6(aUfcaaAf(U-3’-OTIPS)CfAfcuuuAfuUfgaguuuc， SEQ ID NO:6)的HPLC描记图，示出了FLP-3’-OTIPS、FLP-OH和切割物(16mer)的生成。
图7是用在乙醇和HF/吡啶中的氢氧化铵脱保护后在N17位具有 U-3’-OTIPS的序列6(aUfcaaAf(U-3’-OTIPS)CfAfcuuuAfuUfgaguuuc， SEQ ID NO:6)的HPLC描记图，示出了FLP-OH的生成。可以使用 HF/吡啶处理有效切割RNA中的3’-OTPS保护基团。
图8示出了在室温下用浓缩氢氧化铵水溶液脱保护过夜的序列8 (asCfsguuu(U2p)caaagcAfcUfuuauusgsa，SEQ ID NO:8)的解卷积质谱图。主峰对应于所希望的FLP(序列8)和3’-片段(序列9 (caaagcAfcUfuuauusgsa，SEQ ID NO:9))。大约14％的FLP仍保持单个N-2-异丁酰基保护基团(M＝7663)。
图9示出了在室温下用浓缩甲胺水溶液脱保护2小时过夜的序列 8(asCfsguuu(U2p)caaagcAfcUfuuauusgsa，SEQ ID NO:8)的解卷积质谱图。主峰对应于所希望的FLP(序列8)和3’-片段(序列9 (caaagcAfcUfuuauusgsa，SEQ ID NO:9))。
图10示出了在室温下用浓缩甲胺水溶液脱保护过夜的序列8 (asCfsguuu(U2p)caaagcAfcUfuuauusgsa，SEQ ID NO:8)的解卷积质谱图。主峰对应于所希望的FLP(序列8)、3’-片段(序列9 (caaagcAfcUfuuauusgsa，SEQ ID NO:9))和5’-片段(序列10，
图 11示出了一些示例性3’-三异丙基甲硅烷基醚(3’-TIPS)核苷单体的结构。
具体实施方式
在一个方面，本披露提供了用于制备包含至少一个具有3’-羟基基团的核苷的寡核苷酸的改进方法。将包含三异丙基甲硅烷基醚 (TIPS)保护的3’-羟基基团的核苷亚磷酰胺单体与核苷或寡核苷酸上的游离羟基偶联，该游离羟基是例如5’-OH、3’-OH或2’-OH，优选5’-OH。
用于将核苷亚磷酰胺单体与羟基基团偶联的方法和试剂在本领域中是众所周知的。因此，可以使用本领域技术人员已知的程序和设备来制备寡核苷酸。例如，可以适当地使用玻璃反应器例如烧瓶。优选地，使用固相合成程序，以及例如可控孔玻璃的固体支持物。甚至更优选地，本发明的方法可以使用自动DNA合成仪进行实施。合适的固相技术，包括自动化合成技术，描述于F.Eckstein(编辑), Oligonucleotides and Analogues,aPractical Approach[寡核苷酸和类似物，实用的方法],Oxford University Press[牛津大学出版社],纽约 (1991)。
此外，寡核苷酸可以小规模或大规模制备。例如，寡核苷酸可以以μmol规模或mg规模制备。
偶联步骤和氧化/硫化步骤可以在常见溶剂中进行。例如，偶联和氧化/硫化可以在乙腈中进行。
氧化步骤可以通过使亚磷酸三酯中间体与氧化试剂接触足以实现形成磷酸三酯官能团的时间来实施。用于本发明亚磷酸酯中间体氧化的合适溶剂体系包括两种或更多种溶剂的混合物。优选地，非质子溶剂与质子或碱性溶剂的混合物。优选的溶剂混合物包括乙腈与弱碱的混合物。例如，氧化步骤可以在弱碱的存在下实施。示例性碱包括但不限于吡啶、二甲基吡啶、甲基吡啶或三甲吡啶。在一些实施例中，氧化步骤可以在I2/H2O的存在下进行。
硫化(利用硫转移试剂的氧化)可以通过使亚磷酸三酯中间体与硫转移试剂接触足以实现形成硫代磷酸酯官能团的时间来实施。用于寡核苷酸合成的示例性硫转移试剂包括但不限于苯乙酰二硫化物、芳基乙酰二硫化物和被芳基取代的苯乙酰二硫化物。例如，硫转移试剂可以是3-(二甲基氨基亚甲基)氨基-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT) 或3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物(博凯奇试剂(Beaucage reagent))。
在合成完成后，可以将寡核苷酸脱保护，例如，使用方法和试剂去除寡核苷酸上的任何保护基团以获得所希望的产物。因此，在一些实施例中，该方法进一步包括用碱处理合成的寡核苷酸以去除该寡核苷酸上的任何非TIPS保护基团。用于去除寡核苷酸合成中使用的非 TIPS保护基团的示例性碱包括但不限于氢氧化铵、甲胺及其混合物。用碱处理可以适当地在室温或提升的温度下进行。“室温”包括从约 20℃至约30℃的环境温度。“提升的温度”包括高于30℃的温度。例如，提升的温度可以是在约32℃至约65℃之间的温度。在一些实施例中，用碱处理是在约35℃。处理时间大约为几分钟，诸如，例如5、10、15、20、25、30、45或60分钟，至几小时，诸如，例如2 小时、3小时、4小时、5小时、10小时、15小时、24小时或更长。在一些实施例中，用碱处理持续约15小时。在一些实施例中，用碱处理在约35℃持续约15小时。
在已经除去非TIPS保护基团后，可以通过用将TIPS保护的羟基基团有效转化为游离羟基的脱保护试剂处理部分脱保护的寡核苷酸来除去TIPS保护基团。用于去除含甲硅烷基的羟基保护基团的方法和试剂在本领域中是众所周知的。通常，脱保护试剂包含氟阴离子。用于去除TIPS保护基团的示例性脱保护试剂是HF吡啶。用于去除 TIPS基团的脱保护步骤可以适当地在室温或提升的温度下进行。例如，脱保护的步骤可以在约35℃至约65℃之间的温度进行。在一些实施例中，脱保护步骤在约50℃进行。脱保护时间大约为几分钟，诸如，例如5、10、15、20、25、30、45或60分钟，至几小时，诸如，例如2小时、3小时、4小时或5小时。在一些实施例中，寡核苷酸用脱保护试剂处理持续约1小时。
在脱保护后，可以使用本领域已知的用于分离和纯化寡核苷酸的方法来分离和纯化所希望的产物。此类方法包括，但不限于：过滤和 /或HPLC纯化。
在另一方面，本披露提供了具有三异丙基甲硅烷基醚(TIPS)保护的3’-羟基基团的核苷单体，例如具有式(I)结构的单体：
Figure BDA0003765811440000061
在具有式(I)的单体中，B是经修饰的或未经修饰的核碱基。任选地，核碱基可以包含一个或多个保护基团。示例性的核碱基包括但不限于：腺嘌呤；鸟嘌呤；胞嘧啶；尿嘧啶；胸腺嘧啶；肌苷；黄嘌呤；次黄嘌呤；水粉蕈素(nubularine)；异鸟苷；杀结核菌素(tubercidine)和被取代或被修饰的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶的类似物，例如2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，5-卤代尿嘧啶，5-(2- 氨基丙基)尿嘧啶，5-氨基烯丙基尿嘧啶，8-卤代、氨基、硫醇、硫代烷基、羟基和其他8-被取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-三氟甲基和其他5- 被取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤，5-被取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6被取代的嘌呤(包括2-氨基丙基腺嘌呤)， 5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶，二氢尿嘧啶，3-脱氮杂-5-氮杂胞嘧啶，2-氨基嘌呤，5-烷基尿嘧啶，7-烷基鸟嘌呤，5-烷基胞嘧啶， 7-脱氮腺嘌呤，N6,N6-二甲基腺嘌呤，2,6-二氨基嘌呤，5-氨基-烯丙基-尿嘧啶，N3-甲基尿嘧啶，被取代的1,2,4-三唑，2-吡啶酮，5-硝基吲哚，3-硝基吡咯，5-甲氧基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸，5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿嘧啶， 5-甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3羧丙基)尿嘧啶，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N4-乙酰胞嘧啶，2-硫胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤， N6-异戊基腺嘌呤，2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤，N-甲基鸟嘌呤或 O-烷基化碱基。其他的嘌呤和嘧啶包括在美国专利号3,687,808中披露的那些，在Concise Encyclopedia of Polymer Scienceand Engineering [聚合物科学与工程的简明百科全书],第858-859页,Kroschwitz,J.I.编辑.John Wiley&Sons[约翰威利父子公司],1990披露的那些，以及由Englisch等人,Angewandte Chemie[应用化学],国际版,1991,30, 613披露的那些。
在一些实施例中，核碱基可以选自由以下组成的组：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、水粉蕈素、异鸟苷、杀结核菌素、2-(卤基)腺嘌呤、2-(烷基)腺嘌呤、2-(丙基)腺嘌呤、2-(氨基)腺嘌呤、2-(氨基烷基)腺嘌呤、2-(氨基丙基)腺嘌呤、2-(甲硫基)-N6-(异戊烯基)腺嘌呤、6-(烷基)腺嘌呤、6-(甲基)腺嘌呤、7-(去氮)腺嘌呤、8-(烯基)腺嘌呤、8-(烷基)腺嘌呤、8-(炔基)腺嘌呤、8-(氨基)腺嘌呤、8-(卤基)腺嘌呤、8-(羟基)腺嘌呤、8-(硫代烷基) 腺嘌呤、8-(硫醇)腺嘌呤、N6-(异戊基)腺嘌呤、N6-(甲基)腺嘌呤、 N6,N6-(二甲基)腺嘌呤、2-(烷基)鸟嘌呤、2-(丙基)鸟嘌呤、6-(烷基)鸟嘌呤、6-(甲基)鸟嘌呤、7-(烷基)鸟嘌呤、7-(甲基)鸟嘌呤、7-(去氮) 鸟嘌呤、8-(烷基)鸟嘌呤、8-(烯基)鸟嘌呤、8-(炔基)鸟嘌呤、8-(氨基) 鸟嘌呤、8-(卤基)鸟嘌呤、8-(羟基)鸟嘌呤、8-(硫代烷基)鸟嘌呤、8-(硫醇)鸟嘌呤、N-(甲基)鸟嘌呤、2-(硫基)胞嘧啶、3-(去氮)-5-(氮杂)胞嘧啶、3-(烷基)胞嘧啶、3-(甲基)胞嘧啶、5-(烷基)胞嘧啶、5-(炔基)胞嘧啶、5-(卤基)胞嘧啶、5-(甲基)胞嘧啶、5-(丙炔基)胞嘧啶、5-(丙炔基) 胞嘧啶、5-(三氟甲基)胞嘧啶、6-(偶氮基)胞嘧啶、N4-(乙酰基)胞嘧啶、 3-(3-氨基-3-羧丙基)尿嘧啶、2-(硫基)尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫基)尿嘧啶、5-(甲氨基甲基)-2-(硫基)尿嘧啶、4-(硫基)尿嘧啶、5-(甲基)-4-(硫基)尿嘧啶、5-(甲氨基甲基)-4-(硫基)尿嘧啶、5-(甲基)-2,4-(二硫基)尿嘧啶、5-(甲氨基甲基)-2,4-(二硫基)尿嘧啶、5-(2-氨基丙基)尿嘧啶、 5-(烷基)尿嘧啶、5-(炔基)尿嘧啶、5-(烯丙基氨基)尿嘧啶、5-(氨基烯丙基)尿嘧啶、5-(氨基烷基)尿嘧啶、5-(胍烷基)尿嘧啶、5-(1,3-二唑-1- 烷基)尿嘧啶、5-(氰基烷基)尿嘧啶、5-(二烷基氨基烷基)尿嘧啶、5-(二甲基氨基烷基)尿嘧啶、5-(卤基)尿嘧啶、5-(甲氧基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸、5-(甲氧基羰基甲基)-2-(硫基)尿嘧啶、5-(甲氧基羰基-甲基) 尿嘧啶、5-(丙炔基)尿嘧啶、5-(丙炔基)尿嘧啶、5-(三氟甲基)尿嘧啶、 6-(偶氮基)尿嘧啶、二氢尿嘧啶、N3-(甲基)尿嘧啶、5-尿嘧啶(即假尿嘧啶)、2-(硫基)假尿嘧啶、4-(硫基)假尿嘧啶、2,4-(二硫基)假尿嘧啶、5-(烷基)假尿嘧啶、5-(甲基)假尿嘧啶、5-(烷基)-2-(硫基)假尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫基)假尿嘧啶、5-(烷基)-4-(硫基)假尿嘧啶、5-(甲基)-4-(硫基)假尿嘧啶、5-(烷基)-2,4-(二硫基)假尿嘧啶、5-(甲基)-2,4-(二硫基)假尿嘧啶、1-被取代的假尿嘧啶、1-被取代的2(硫基)- 假尿嘧啶、1-被取代的4-(硫基)假尿嘧啶、1-被取代的2,4-(二硫基) 假尿嘧啶、1-(氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1-(氨基羰基乙烯基)-2(硫基)-假尿嘧啶、1-(氨基羰基乙烯基)-4-(硫基)假尿嘧啶、1-(氨基羰基乙烯基)-2,4-(二硫基)假尿嘧啶、1-(氨基烷氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、 1-(氨基烷氨基-羰基乙烯基)-2(硫基)-假尿嘧啶、1-(氨基烷氨基羰基乙烯基)-4-(硫基)假尿嘧啶、1-(氨基烷氨基羰基乙烯基)-2,4-(二硫基)假尿嘧啶、1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-啡噻嗪-1-基、1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-啡噻嗪-1-基、7-被取代的1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪 -1-基、7-被取代的1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、7-被取代的1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-啡噻嗪-1-基、7-被取代的1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-啡噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)- 吩噁嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-啡噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-啡噻嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、7-(胍烷基-羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-啡噻嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-啡噻嗪-1-基、 1,3,5-(三氮杂)-2,6-(二氧杂)-萘、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、水粉蕈素、杀结核菌素、异鸟苷、肌苷基、2-氮杂-肌苷基、7-去氮-肌苷基、硝基咪唑基、硝基吡唑基、硝基苯并咪唑基、硝基吲唑基、氨基吲哚基、吡咯并嘧啶基、3-(甲基)异喹诺酮基、5-(甲基)异喹诺酮基、3-(甲基)-7-(丙炔基)异喹诺酮基、7-(氮杂)吲哚基、6-(甲基)-7-(氮杂)吲哚基、咪唑并吡啶基、9-(甲基)-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、异喹诺酮基、 7-(丙炔基)异喹诺酮基、丙炔基-7-(氮杂)吲哚基、2,4,5-(三甲基)苯基、 4-(甲基)吲哚基、4,6-(二甲基)吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、芪基、并四苯基、并五苯基、二氟甲苯基、4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑、4-(甲基)苯并咪唑、6-(偶氮基)胸腺嘧啶、2-吡啶酮、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、6-(氮杂)嘧啶、2-(氨基)嘌呤、2,6-(二氨基)嘌呤、5- 被取代的嘧啶、N2-被取代的嘌呤、N6-被取代的嘌呤、O6-被取代的嘌呤、被取代的1,2,4-三唑和其任何O-烷基化或N-烷基化衍生物。在一些实施例中，核碱基选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶组成的组。
R1是羟基保护基团。通常用于保护核苷5′-羟基的保护基团是4,4'- 二甲氧基三苯甲基(“DMT”)。然而，可以使用本领域已知的和用于寡核苷酸合成的任何羟基保护基团。此类保护基团包括但不限于：单甲氧基三苯甲基(“MMT”)、9-芴基甲基碳酸酯(“Fmoc”)、邻硝基苯基羰基、对苯基偶氮苯基羰基、苯基羰基、对氯苯基羰基和 5′-(α-甲基-2-硝基胡椒基)氧基羰基(“MeNPOC”)。优选地，R1是酸不稳定的羟基保护基团，例如DMT或MMT。在一些实施例中， R1是DMT。
每个R4都可以独立地选自由以下组成的组：烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、环烷基、烯基、环烯基、炔基或环炔基，它们中的每一个都可以任选地被例如1个、2个、3个、4个或更多个独立地选择的取代基取代。例如，每个R4可以独立地是任选地被取代的C1-C6烷基。 R4的示例性烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、2- 甲基丙基、叔丁基和戊基。在一些实施例中，每个R4是异丙基。
R3可以是H或-P(NR5R6)OR7。在一些实施例中，R3是H。在一些其他实施例中，R3是-P(NR5R6)OR7。当R3是P(NR5R6)OR7时，R5和R6可以独立地选自由以下组成的组：烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、环烷基、烯基、环烯基、炔基和环炔基，它们中的每一个可以任选地被例如1、2、3、4或更多个独立选择的取代基取代，或者R5和 R6可以连接形成杂环基，其可以任选地被例如1、2、3、4或更多个独立选择的取代基取代。例如，R5和R6可以独立地是任选地被取代的C1-C6烷基。R5和R6的示例性烷基包括但不限于：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、2-甲基丙基、叔丁基和戊基。在一些实施例中， R5和R6为异丙基。
R7是烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、环烷基、烯基、环烯基、炔基或环炔基，它们中的每一个可以任选地被例如1个、2个、3个、4 个或更多个独立地选择的取代基取代。例如，每个R7可以独立地是任选地被取代的C1-C6烷基。R7的示例性烷基包括但不限于：任选地被取代的甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、2-甲基丙基、叔丁基和戊基。在一些实施例中，R7是β-氰乙基。
在具有式(I)的单体的一些实施例中，B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶；R1是单甲氧基三苯甲基或二甲氧基三苯甲基；R4独立地是任选地被取代的C1-C6烷基；并且R3是H，以及R7是任选地被取代的C1-C6烷基。例如，B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶；R1是二甲氧基三苯甲基；R4独立地是异丙基；并且R3是H。
在具有式(I)的单体的一些实施例中，B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶；R1是单甲氧基三苯甲基或二甲氧基三苯甲基；R4独立地是任选地被取代的C1-C6烷基；R5和R6独立地是任选地被取代的C1-C6烷基或R5和R5连接以形成4-8元杂环基；并且R7是任选地被取代的C1-C6烷基。例如，B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶；R1是二甲氧基三苯甲基；R4、R5和R6是异丙基；并且R7是β-氰乙基。
示例性实施例可以通过以下编号的实施例来描述：
实施例1：一种用于合成具有至少一个带有3’-OH基团的核苷的寡核苷酸的方法，该方法包括：(i)将核苷或寡核苷酸上的游离羟基基团与具有三异丙基甲硅烷基醚(TIPS)保护的3’-羟基基团的核苷亚磷酰胺单体偶联，以形成亚磷酸三酯中间体；以及(ii)氧化或硫化所述亚磷酸三酯中间体以形成受保护的中间体。
实施例2：如实施例1所述的方法，其中所有合成步骤在自动寡核苷酸合成仪上进行。
实施例3：如实施例1或2所述的方法，其中寡核苷酸是以大规模合成的。
实施例4：如实施例1-3中任一项所述的方法，其中所述氧化在弱碱存在下进行。
实施例5：如实施例4所述的方法，其中所述弱碱是吡啶、二甲基吡啶、甲基吡啶或三甲吡啶。
实施例6：如实施例1-5中任一项所述的方法，其中所述氧化在 I2/H2O存在下进行。
实施例7：如实施例1-6中任一项所述的方法，其中所述硫化在硫转移试剂存在下进行。
实施例8：如实施例7所述的方法，其中所述硫转移试剂是3-(二甲基氨基亚甲基)氨基-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT)或3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物。
实施例9：如实施例1-8中任一项所述的方法，该方法进一步包括用碱使受保护的中间体脱保护的步骤。
实施例10：如实施例9所述的方法，其中所述碱是氢氧化铵、甲胺或氢氧化铵和甲胺的混合物。
实施例11：如实施例9或10所述的方法，其中所述用碱处理是在室温或提升的温度下进行。
实施例12：如实施例9-11中任一项所述的方法，其中所述用碱处理是在30℃或更高的温度下进行。
实施例13：如实施例9-12中任一项所述的方法，其中所述用碱处理持续至少30分钟。
实施例14：如实施例9-13中任一项所述的方法，其中所述用碱处理持续至少4小时。
实施例15：如实施例9-14中任一项所述的方法，该方法进一步包括用脱保护试剂处理经碱处理的中间体，该脱保护试剂可有效地将 TIPS保护的羟基基团转化为游离羟基基团。
实施例16：如实施例15所述的方法，其中该脱保护试剂包含氟阴离子。
实施例17：如实施例15或16所述的方法，其中该脱保护试剂是 HF吡啶。
实施例18：如实施例15-17中任一项所述的方法，其中所述用脱保护试剂处理是在30℃或更高的温度下进行。
实施例19：如实施例1-18中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸包含约6至约50个核苷酸。
实施例20：如实施例1-19中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸包含约10至约30个核苷酸。
实施例21：一种具有式(I)结构的核苷单体：
Figure BDA0003765811440000131
其中B是经修饰的或未经修饰的核碱基；R1是羟基保护基团； R2是-Si(R4)3；R3是H或-P(NR5R6)OR7；每个R4独立地为任选地被取代的烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、环烷基、烯基、环烯基、炔基或环炔基；R5和R6独立地为任选地被取代的烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、环烷基、烯基、环烯基、炔基或环炔基，或其中将R5和R6连接以形成杂环基；并且R7为任选地被取代的烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、环烷基、烯基、环烯基、炔基或环炔基。
实施例22：如实施例21所述的核苷单体，其中该羟基保护基团选自由以下组成的组：4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)、单甲氧基三苯甲基(MMT)、9-芴基甲基碳酸酯(Fmoc)、邻硝基苯基羰基、对苯基偶氮苯基羰基、苯基羰基、对氯苯基羰基和5′-(α-甲基-2-硝基胡椒基)氧基羰基(MeNPOC)。
实施例23：如实施例21或22所述核苷单体，其中每个R4独立地是任选地被取代的C1-C6烷基。
实施例24：如实施例21-23中任一项所述的核苷单体，其中每个 R4是异丙基。
实施例25：如实施例21-24中任一项所述的核苷单体，其中R5和R6独立地是任选地被取代的C1-C6烷基。
实施例26：如实施例21-25中任一项所述的核苷单体，其中R5和R6是异丙基。
实施例27：如实施例21-26中任一项所述的核苷单体，其中R7是任选地被取代的C1-C6烷基。
实施例28：如实施例21-27中任一项所述的核苷单体，其中R7是甲基或β-氰乙基。
实施例29：如实施例21-28中任一项所述的核苷单体，其中B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶；R1是单甲氧基三苯甲基或二甲氧基三苯甲基；R4独立地是任选地被取代的C1-C6烷基；R5和R6独立地是任选地被取代的C1-C6烷基或R5和R5连接以形成4-8 元杂环基；并且R7是任选地被取代的C1-C6烷基。
实施例30：如实施例1-29中任一项所述的核苷单体，其中B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶；R1是二甲氧基三苯甲基；R4、R5和R6是异丙基；并且R7是β-氰乙基。
一些选择的定义
为方便起见，本文在说明书、实例和所附权利要求中所使用的某些术语被收集在此。除非另有说明或从上下文中暗示，否则以下术语和短语包括以下提供的含义。除非另有明确说明或从上下文中显而易见，否则以下术语和短语不排除该术语或短语在其所属领域中已获得的含义。提供这些定义是为了帮助描述特定的实施例，并不旨在限制要求保护的发明，因为本发明的范围仅由权利要求限制。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数形式，复数术语应包括单数形式。
除非另有定义，否则本文中使用的所有科技术语皆具有与本发明所属领域的普通技术人员所一般理解的那些科技术语相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用任何已知的方法、装置和材料，但本文描述了这方面的方法、装置和材料。
此外，除非另有说明，否则本发明的实践可以采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。这些技术在文献中得到了充分解释，例如，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]”,第二版(Sambrook等人,1989)；“Oligonucleotide Synthesis[寡核苷酸合成]”(M.J.Gait,编辑,1984)；“Animal Cell Culture[动物细胞培养]”(R.I.Freshney,编辑,1987)；“Methods in Enzymology[酶学方法]”(Academic Press,Inc.[学术出版社公司])；“Current Protocols in Molecular Biology[当前分子生物学指南]”(F. M.Ausubel等人,编辑,1987,并且定期更新)；“PCR:The Polymerase ChainReaction[PCR：聚合酶链式反应]”,(Mullis等人，编辑，1994)；“A Practical Guide toMolecular Cloning[分子克隆实用指南]”(Perbal Bernard V.，1988)；“Phage Display:ALaboratory Manual [噬菌体展示：实验室手册]”(Barbas等人，2001)。
在提供数值范围的情况下，应理解的是，在该范围的上限和下限之间的每个中间值(至下限单位的十分之一，除非上下文另有明确规定)与该规定范围内的任何其他规定或中间值都涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在这些较小范围内并且也涵盖在本发明内，但受所述范围内任何特别排除的界限的限制。在所述范围包括一个或两个界限的情况下，排除那些包括的界限中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。
某些范围在本文中以术语“约”开头的数值呈现。术语“约”在本文中用于为其前面的确切数字以及接近或近似于该术语前面的数字的数字提供字面支持。在确定数字是否接近或近似于特定列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在其呈现的上下文中提供特定列举的数字的实质等效的数字。
如本文所用，术语“包含”(“comprising”或“comprises”) 用于指组合物、方法及其各自的一种或多种组分，它们对本发明是必不可少的，但还可以包括未指定的元素，无论是否是必要的。
除非上下文另有明确说明，否则单数术语“一”、“一个”和“该”包括复数指示物。类似地，除非上下文另有明确说明，否则“或”旨在包括“和”。还应注意的是，可以起草权利要求以排除任何可选要素。因此，这种陈述旨在作为使用此类与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独地”、“仅”等或使用“否定型”限制的前提基础(antecedent basis)。
如本文所用，术语“寡核苷酸”是指例如长度少于100、200、300 或400个核苷酸的核酸分子(RNA或DNA)。如本文所用，寡核苷酸还涵盖二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和七核苷酸。此外，如本文所用，术语“核苷酸、核苷、寡核苷酸或寡核苷”旨在包括本领域技术人员已知的天然存在的种类和非天然存在的或经修饰的种类。
术语“任选地被取代的”是指指定的基团或部分未被取代或被一个或多个(典型地1、2、3、4、5或6个)独立地选自以下“取代基”定义中所列的取代基的组的取代基或以其他方式指定的取代基取代。术语“取代基”是指在被取代基团的任何原子上被“取代”的基团。适合的取代基包括但不限于卤素、羟基、羧基(caboxy)、氧代、硝基、卤代烷基、烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳基、杂芳基、环基、杂环基、芳烷基、烷氧基、芳氧基、氨基、酰氨基、烷基羰酰基(alkylcarbanoyl)、芳基羰酰基、氨基烷基、烷氧基羰基、羧基、羟烷基、烷磺酰基、芳基磺酰基、烷磺酰胺基、芳基磺酰胺基、芳烷基磺酰胺基、烷基羰基、酰氧基、氰基或脲基。在某些情况下，两个取代基连同它们所附接的碳可以形成环。
如本文可互换使用的，术语“基本上”和“大体上”意指至少约 60％、或优选至少约70％或至少约80％、或至少约90％、至少约95％，至少约97％或至少约99％或更多，或70％和100％之间的任何整数的比例。在一些实施例中，术语“基本上”意指至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多，或90％至100％之间的任何整数的比例。在一些实施例中，术语“基本上”可以包括100％。
如本领域技术人员在阅读本披露后将显而易见的，本文描述和说明的各个方面中的每一者都具有分立的组成部分和特征，它们可以容易地与任何其他几个方面的特征分离或组合而不偏离本发明的范围或精神。任何列举的方法都可以按照列举的事件的顺序或任何其他逻辑上可行的顺序来进行。
本发明由以下实例进一步展示，这些实例不应被视为是进一步限制性的。本申请通篇引用的所有参考文献、申请中的专利申请及公开专利的内容在此以引用的方式明确地并入。
实例
以下实例说明了本发明的一些实施例和方面。对相关领域的技术人员将显而易见的是，在不改变本发明的精神或范围的情况下，可以进行各种修改、添加、替换等，并且此类修改和变化涵盖在如随后的权利要求中所定义的本发明的范围内。以下实例不以任何方式限制本发明。
实例1：具有TIPS保护基团的亚磷酰胺的合成
方案1
Figure BDA0003765811440000171
化合物2：向5'-ODMTr尿苷1(50g，91.48mmol)在无水吡啶 (450mL)中的搅拌溶液中，依次添加咪唑(24.91g，365.92mmol) 和氯(三异丙基)硅烷(47.0mL，220mmol)。在50℃搅拌24小时后，减压去除挥发物。将残余物与NaHCO3(400mL)和EtOAc(500mL) 的饱和水溶液合并，并搅拌5分钟。将混合物转移到分液漏斗中，分离各层，并将有机层用NaHCO3的饱和水溶液和盐水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干燥。将残余物通过ISCO自动柱纯化。溶解在最少的DCM中并加载到120g硅胶柱(使用己烷中的0-30％ EtOAc作为洗脱剂)上，以给出化合物2(26.1g，41％)。1H NMR (500MHz,乙腈-d3)δ7.70(d,J＝8.2Hz,1H),7.45-7.37(m,2H),7.35 -7.19(m,8H),6.93-6.84(m,4H),5.82(d,J＝3.9Hz,1H),5.37(d,J＝ 8.1Hz,1H),4.42(t,J＝5.4Hz,1H),4.17(td,J＝5.3,3.9Hz,1H),3.77 (s,6H),3.49(dd,J＝10.9,2.7Hz,1H),3.31-3.23(m,2H),1.06-0.90 (m,22H)。C39H50N2O8Si的LRMS(ESI)计算值为[M+H]+m/z＝ 703.34，实测值为703.4。
化合物3：在0℃下，将DIPEA(19.3mL，111mmol)、2-氰乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺(24.7mL，110.7mmol)和N-甲基咪唑(2.9mL，36.9mmol)依次添加到化合物2(25.93g，36.89mmol) 在无水EtOAc(600mL)的搅拌溶液中。去除冷浴，并将反应混合物搅拌1h。用三乙醇胺(2.7M,50mL)在MeCN/甲苯中的溶液淬灭反应并搅拌5min。将混合物用乙酸乙酯稀释，转移到分液漏斗中，分离各层，并将有机层依次用5％NaCl溶液和盐水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，并蒸发至干燥。将残余物预吸附在经三乙胺预处理的硅胶上。将柱用含有1％NEt3的己烷平衡。将残余物通过ISCO自动柱 (使用己烷中的0-40％EtOAc作为洗脱剂)纯化，以给出化合物3 (26.5g，79％)。1H NMR(500MHz,CD3CN)δ8.73(s,1H),7.59(d, J＝8.1Hz,1H),7.44-7.41(m,2H),7.36-7.28(m,7H),6.89-6.85(m, 4H),6.06(d,J＝5.4Hz,1H),5.51(d,J＝8.1Hz,1H),4.32-4.23(m, 2H),4.11-4.07(m,1H),3.84-3.67(m,10H),3.67-3.54(m,3H),3.46 (dd,J＝10.9,3.7Hz,1H),3.28(dd,J＝11.0,4.2Hz,1H),2.57(t,J＝6.2 Hz,2H),1.16-1.11(m,11H),1.04-0.95(m,23H)。31P NMR(202MHz, CD3CN)δ150.83,150.80,149.64,149.61。C48H67N4O9PSi的LRMS (ESI)计算值为[M+Na]+m/z＝902.44，实测值925.2。
方案2
Figure BDA0003765811440000181
化合物5：向化合物4(2.0g，3.0mmol，1当量)在无水吡啶(15.0 mL)中的搅拌溶液中依次添加咪唑(1.62g，23.7mmol，8当量)和氯(三异丙基)硅烷(1.52mL，7.12mol，2.4当量)。在50℃搅拌24 h后，添加NaHCO3饱和水溶液(50mL)和Et2O，并将所得混合物转移到分液漏斗中，分离各层，并将水层用Et2O(50mL x 2)萃取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干燥。将残余物通过ISCO自动柱(使用己烷中的0-40％EtOAc作为洗脱剂)纯化，以给出化合物5(0.78mg，31％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ 11.22(s,1H),8.64(d,J＝8.0Hz,2H),8.08-8.02(m,2H),7.67-7.61 (m,1H),7.57-7.52(m,2H),7.39-7.32(m,2H),7.28-7.16(m,8H), 6.88-6.80(m,4H),6.06(d,J＝5.5Hz,1H),5.50(d,J＝6.2Hz,1H),4.96(q,J＝5.6Hz,1H),4.65-4.59(m,1H),4.15(q,J＝4.6Hz,1H), 3.72(s,6H),3.41(dd,J＝10.5,4.6Hz,1H),3.20(dd,J＝10.5,5.1Hz, 1H),1.14-0.93(m,24H)。13C NMR(101MHz,DMSO)δ166.15, 158.59,152.51,151.85,151.01,145.26,144.51,135.91,135.88,133.87,132.92,130.16,128.98,128.94,128.22,128.09,127.15,126.62,113.60, 113.58,88.78,86.22,84.61,72.88,72.65,63.83,55.51,40.03,18.34, 18.11,18.01,12.27。C47H56N5O7Si的LRMS(ESI)计算值为[M+H]+ m/z＝830.39，实测值为830.4。
化合物6：向化合物5(201.5g，1.0当量)在无水DCM(10V) 中的搅拌溶液中添加吡啶(6.0当量)、2-氰乙基N,N,N′,N′-四异丙基亚磷酰胺(3.0当量)和DCI(2.0当量)。将混合物在25℃搅拌4 小时。在处理后，将有机层经Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干燥。将反应粗产物用DCM/hept沉淀，以给出化合物6(130g，52％)。31P NMR(202MHz,CDCl3)δ150.82,150.66。C56H73N7O8PSi的LRMS (ESI)计算值为[M+H]+m/z＝1031.49，实测值为1031.5。
方案3
Figure BDA0003765811440000201
化合物8：向化合物7(20.0g，30.5mmol)在无水吡啶(150.0mL) 中的搅拌溶液中依次添加咪唑(16.61g，0.24mol)和氯(三异丙基) 硅烷(26.1mL，0.12mol)。在50℃搅拌24小时后，减压去除挥发物。将残余物与NaHCO3(100mL)和EtOAc(500mL)的饱和水溶液合并，并搅拌10分钟。将混合物转移到分液漏斗中，分离各层，并将有机层用NaHCO3饱和水溶液(50mL)和盐水(50mL)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干燥。将残余物通过ISCO自动柱(使用己烷中的0-70％EtOAc作为洗脱剂)纯化，以给出化合物 8(9.85g，40％)。将柱用含有1％NEt3的己烷平衡。1H NMR (400MHz, CDCl3)δ11.96(s,1H),7.88-7.81(m,1H),7.54-7.48(m,1H),7.42- 7.36(m,1H),7.30-7.18(m,1H),6.85-6.76(m,1H),5.70(d,J＝6.3Hz, 1H),4.95-4.88(m,1H),4.62-4.57(m,1H),4.54-4.50(m,1H),4.17- 4.13(m,1H),3.77(d,J＝3.5Hz,9H),3.59-3.52(m,1H),3.27-3.16(m, 1H),3.14-3.05(m,1H),1.72-1.62(m,1H),1.33-1.20(m,1H),1.01- 0.88(m,1H),0.72(d,J＝6.9Hz,4H),0.60-0.45(m,3H)。 C44H57N5O8Si的LRMS(ESI)计算值为[M+H]+m/z＝811.40，实测值为812.2。
化合物9：向化合物8(140g，1.0当量)在无水DCM(1.4L) 中的搅拌溶液中添加2-氰乙基N,N,N′,N′-四异丙基亚磷酰胺(5.0当量)和DCI(3.0当量)。将混合物在25℃搅拌12小时。将反应物用10％NaHCO3(10x 1000mL)和盐水(2x 1000mL)洗涤，经Na2SO4干燥，然后在35℃浓缩，以得到呈浅黄色油状物的粗产物(387g)。将粗品(386g)在DCM/MTBE中沉淀数次(8次)，直到获得呈白色固体的化合物9(81g，46％)。31P NMR(202MHz,CDCl3)δ150.72,149.33。C53H75N7O9PSi的LRMS(ESI)计算值为[M+H]+m/z＝ 1012.5，实测值为1012.4。
方案4
Figure BDA0003765811440000211
化合物11：向化合物10(0.5g，0.85mmol，1当量)在无水CH2Cl2 (2.8mL)中的搅拌溶液中依次添加无水二异丙胺(0.72mL，5.1 mmol，6当量)和氯(三异丙基)硅烷(0.55mL，2.5mmol，3当量)。在室温搅拌4天后，添加甲醇(3mL)并将所得溶液搅拌15min。将混合物用DCM(10mL)稀释，并将各层分离。将有机层用水(10mL x 2)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干燥。将残余物通过ISCO 自动柱(柱用含有1％NEt3的己烷平衡，使用己烷中的0-60％EtOAc 作为洗脱剂)纯化，以给出化合物11(287mg，45％)。1H NMR (500 MHz,DMSO-d6)δ10.89(s,1H),8.36(d,J＝7.5Hz,1H),7.40-7.18(m, 10H),7.04(d,J＝7.5Hz,1H),6.89(dq,J＝8.3,3.2Hz,4H),5.84(d,J＝ 2.5Hz,1H),5.47(d,J＝5.7Hz,1H),4.28(dd,J＝7.1,4.8Hz,1H),4.12 -4.08(m,1H),4.07-4.04(m,1H),3.75(d,J＝0.8Hz,6H),3.54(dd,J＝11.0,2.9Hz,1H),3.24(dd,J＝11.0,3.8Hz,1H),2.10(s,3H),1.05- 0.82(m,24H)。13C NMR(101MHz,DMSO)δ170.97,170.30,162.35, 158.24,158.23,154.47,144.69,144.19,134.98,134.93,129.81,129.78, 127.82,126.91,113.17,113.13,95.34,91.03,86.20,82.34,74.15,70.29, 61.98,59.73,55.01,39.52,24.34,20.74,17.74,14.07,11.63。C41H53N3O8SiNa的LRMS(ESI)计算值为[M+Na]+m/z＝766.35，实测值766.3。
化合物12：向化合物11(1.0当量)在无水DCM(8V)中的搅拌溶液中添加吡啶(6.5当量)、2-氰乙基N,N,N′,N′-四异丙基亚磷酰胺(1.3当量)和DCI(1.2当量)。在25℃搅拌20h后，将混合物用饱和NaHCO3和盐水洗涤。在处理后，将有机层浓缩以得到粗化合物12，将其通过柱(使用在含1％吡啶的正庚烷中的0-50％EtOAc作为洗脱剂)纯化，以给出化合物12(产率：76.6％)。31P NMR(202MHz, CDCl3)δ151.96,148.56。C50H71N5O9PSi的LRMS(ESI)计算值为 [M+H]+m/z＝944.4，实测值为944.1。
实例2：具有3’-TOM和POM保护基团的尿苷的合成方案5
Figure BDA0003765811440000221
化合物13：用二丁基(二氯)锡烷(4.58g，14.46mmol，3.36mL) 处理含有化合物2(7g，13.1mmol)和N-乙基-N-异丙基-丙-2-胺(8.01 mL，46.01mmol)在THF(50mL)中的溶液，并在室温下搅拌1小时。将反应混合物加热至66℃，然后添加氯甲氧基(三异丙基)硅烷(4.13g，15.77mmol，4.31mL)，并在66℃搅拌40min。将反应混合物冷却至室温，减压去除挥发物。将粗残余物在DCM和NaHCO3饱和溶液之间分配，分离各层，并将有机层用NaHCO3水溶液、盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干燥。将残余物通过ISCO自动柱(使用己烷中的0-40％EtOAc作为洗脱剂)纯化，以给出化合物13(3.48g，37％)。1HNMR(400MHz,CDCl3) δ7.77(d,J＝8.2Hz,1H),7.39-7.22(m,1H),6.87-6.80(m,1H),5.96(d,J＝4.4Hz,1H),5.39(d,J＝8.1Hz,1H),5.06(d,J＝4.9Hz,1H), 4.90(d,J＝4.9Hz,1H),4.35-4.22(m,1H),3.80(s,6H),3.59-3.51(m, 1H),3.43-3.36(m,1H),2.05(s,2H),1.60(s,2H),1.13-1.01(m,2H)。 C40H52N2O9Si的LRMS(ESI)计算值为[M+Na]+m/z＝732.34，实测值755.4。
化合物14：在0℃下，将DIPEA(1.7mL，9.8mmol)、2-氰乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺(2.2mL，9.81mmol)和N-甲基咪唑(0.39 mL，4.9mmol)依次添加到化合物13(3.5g,4.9mmol)在无水EtOAc (100mL)中的搅拌溶液中。去除冷浴，并将反应混合物搅拌1h。用三乙醇胺(2.7M，11mL)在MeCN/甲苯中的溶液淬灭反应并搅拌 5min。将混合物用乙酸乙酯稀释，转移到分液漏斗中，分离各层，并将有机层依次用5％NaCl溶液和盐水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，并蒸发至干燥。将残余物预吸附在经三乙胺预处理的硅胶上。将柱用含有1％NEt3的己烷平衡。将残余物通过ISCO自动柱(使用己烷中的0-40％EtOAc作为洗脱剂)纯化，以给出化合物14(3.26g， 71％)。1H NMR(400MHz,CD3CN)δ7.69(dd,J＝9.7,8.2Hz,1H),7.46(dd,J＝7.2,1.1Hz,2H),7.36-7.21(m,7H),6.90(dd,J＝7.6,1.3Hz, 4H),6.00-5.96(m,1H),5.43-5.35(m,1H),5.12-4.96(m,2H),4.56- 4.48(m,1H),4.42-4.36(m,1H),4.33-4.25(m,1H),3.91-3.58(m, 11H),3.47-3.33(m,2H),2.68-2.61(m,2H),1.25-0.94(m,36H)。31P NMR(162MHz,CD3CN)δ150.61,150.55。C49H69N4O10PSi的LRMS (ESI)计算值为[M+H]+m/z＝932.45，实测值为955.5(M+Na)。
方案6
Figure BDA0003765811440000231
化合物15：向空的微波管中添加化合物2(2g，3.76mmol)，然后添加二丁基(氧代)锡(1.22g，4.88mmol，769.23uL)和四丁基溴化铵(1.57g，4.88mmol)。用橡胶隔片封闭该管，并用Ar冲洗系统5分钟。添加1,2-DCE(10mL)，并将所得悬浮液搅拌1min，然后添加新戊酸氯甲酯(1.41g，9.39mmol，1.35mL)。将隔片快速更换为微波管盖，并将管在微波中以300W加热至75℃，持续2.5h。为了总共6g的化合物2，用相同量的试剂再进行两次反应。合并三种合并的粗反应混合物并减压蒸发至干燥。将样品预吸附在用三乙胺预处理的二氧化硅上。将残余物通过ISCO自动柱(二氧化硅用NEt3预处理，使用己烷中的0-40％EtOAc作为洗脱剂)纯化，以给出化合物15(1.68g，23％)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.87(d,J＝8.1Hz, 1H),7.48-7.36(m,3H),7.35-7.22(m,4H),6.94-6.84(m,2H),5.89(d, J＝4.7Hz,1H),5.41(d,J＝6.5Hz,1H),5.37-5.27(m,1H),4.50-4.38 (m,2H),4.23-4.17(m,1H),3.54-3.39(m,1H),3.35-3.28(m,1H), 1.20-1.08(m,4H)。C36H40N2O10的LRMS(ESI)计算值为[M+H]+ m/z＝660.27，实测值为661.7。
化合物16：将DIPEA(1.1mL，6.2mmol)、2-氰乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺(1.4mL，6.2mmol)和N-甲基咪唑(0.19mL， 2.4mmol)在0℃依次添加到化合物15(1.6g，2.5mmol)在无水 EtOAc(50mL)中的搅拌溶液中。去除冷浴并将反应混合物搅拌1h。用三乙醇胺(2.7M，6mL)在MeCN/甲苯中的溶液淬灭反应并搅拌 5min。将混合物用乙酸乙酯稀释，转移到分液漏斗中，分离各层，并将有机层依次用5％NaCl溶液和盐水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，并蒸发至干燥。将残余物预吸附在经三乙胺预处理的硅胶上。将柱用含有1％NEt3的己烷平衡。将残余物通过ISCO自动柱(使用己烷中的0-60％EtOAc作为洗脱剂)纯化，以给出化合物16(1.517g， 74％)。1H NMR(500MHz,CD3CN)δ7.65-7.59(m,1H),7.46-7.41(m,1H),7.35-7.21(m,6H),6.93-6.83(m,3H),5.98-5.91(m,1H),5.46- 5.37(m,1H),5.34(d,J＝6.5Hz,1H),5.20(d,J＝6.4Hz,1H),4.61- 4.50(m,1H),4.47-4.38(m,1H),4.21-4.14(m,1H),3.67-3.57(m, 3H),3.40-3.31(m,2H),2.69-2.59(m,1H),1.19-1.16(m,6H),1.12(t,J＝6.4Hz,11H)。31P NMR(202MHz,CD3CN)δ150.84,150.47。
实例3：3’-OTIPS保护的核苷和亚磷酰胺的选择性合成方案7
Figure BDA0003765811440000251
通过在Vorbrüggen条件下将尿嘧啶安装在糖17的异头位置开始合成。将获得的化合物18用碳酸钾处理以切割乙酸酯基团，产生核苷19，其在5’-O位置用DMTCl保护以给出核苷2。在标准条件下使用2-氰乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺实现亚磷酰胺4的形成。
方案8
Figure BDA0003765811440000252
从核苷18开始，尿嘧啶核碱基在两步三唑化/氨解顺序中转化为胞嘧啶，以给出核苷20。用DMTCl保护伯羟基基团并在核碱基上选择性安装苯甲酸酯基团得到核苷21。在标准条件下使用2-氰乙基 -N,N-二异丙基氯亚磷酰胺实现亚磷酰胺22的形成。
方案9
Figure BDA0003765811440000261
在Vorbrüggen条件下使用N-苯甲酰基腺嘌呤然后在碱性条件下切割乙酸酯基团实现将糖17转化为核苷23。核苷23中的伯羟基被保护为DMT醚，以给出核苷5，核苷5随后在标准条件下转化为相应的亚磷酰胺6。
方案10
Figure BDA0003765811440000262
使用糖17作为起始材料，使用两步顺序安装鸟嘌呤部分获得核苷24。用异丁酸酐保护核碱基得到化合物25。乙酸酯基团在碱性条件下被切割，并且伯羟基基团被保护为DMT醚，以给出核苷8。在标准条件下使用2-氰乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺实现亚磷酰胺9的形成。
实例4.用3’-O-保护的核苷合成siRNA
寡核苷酸合成：使用下表中示出的参数进行代表性寡核苷酸的合成。本研究的目的是确定最佳的RNA保护基团，该保护基团将与我们当前的切割和脱保护方法(包括长时间暴露于水性碱)兼容，并将副反应(例如可能导致RNA水解/切割的保护基团过早脱落)降至最低。表1和表2给出了合成条件，用于这些研究的合成寡核苷酸的序列总结于表3。
表1.
Figure BDA0003765811440000271
表2.
Figure BDA0003765811440000272
Figure BDA0003765811440000281
表3.
Figure BDA0003765811440000282
Figure BDA0003765811440000291
切割和脱保护：这种脱保护用于评估合成的质量，更特别地用于鉴定源自RNA保护基团过早脱保护的杂质。根据合成的规模使用了两种不同的程序(用于小规模的程序1，用于大规模的程序2)。对于这两种程序，可以使用NH4OH、NH4OH/EtOH、MeNH2或氨/甲胺 (AMA)的混合物。
程序1：
1.合成后，将含有柱的板放入96深孔板上的切割夹盘中 2.将浓缩甲胺水溶液或浓缩氢氧化铵溶液(150μL)添加至每个柱中，并在室温下孵育30min。随后使用真空将溶液通过柱完全抽出
3.将步骤#2再重复一次，将板密封，并在室温下摇动指定的时间。
4.将粗品样品用RODI水稀释100倍，并使用LCMS进行分析
程序2：
1.合成后，将少量干燥支持物(约30mg)放入2mL玻璃螺旋盖小瓶中。
2.添加氢氧化铵溶液(1mL)，并将小瓶在35℃下保持 15h。(注意：在此阶段，将粗品冷却至室温，然后将样品等分，用 RODI水稀释30倍，然后通过HPLC分析以进行初步粗品分析)
3.对于脱甲硅基步骤：倾析粗溶液，并用0.5mL DMSO 洗涤树脂3次。涡旋小瓶，然后静置2分钟以使所有树脂沉降。倾析 DMSO溶液并与初始滤液合并到4mL闪烁瓶中，然后使用冰浴将其冷却至0℃。
4.将吡啶*HF(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)， 0.75mL)添加到混合物中(反应变浑浊)，并将小瓶在50℃下保持 1h。
5.将反应冷却至室温，用水(2.5mL)淬灭。涡旋小瓶以溶解所有固体。
6.将样品等分并用RODI水稀释30倍用于HPLC分析。
通过HPLC进行粗寡核苷酸混合物的分析：使用IPRP-LCMS用表4中所示的条件进行粗略分析。
表4.
Figure BDA0003765811440000301
结果：合成了七种不同的具有不同RNA保护基团的23mer寡核苷酸(表3)并使其经受各种切割和脱保护条件。在适用的情况下，在HF处理之前进行初始HPLC分析以确定各种保护基团在碱处理期间的稳定性。为简单起见，所有HPLC和MS的整合只针对四种目的种类进行；具有被甲硅烷基或其他基团保护的3’或2’羟基基团的完全脱保护的寡核苷酸(FLP-OX-X＝TBS、TOM、TIPS或新戊酰氧基甲基)、脱保护的寡核苷酸(FLP-OH)、切割的3’-片段，和切割的 5’-片段。如表5所示，尽管程度不同，但甲硅烷基保护基团(TBS 和TIPS)以及TOM保护基团在长时间碱处理中不稳定。含有TIPS 保护的RNA的23mer给出了最好的总体结果，只有3％的脱保护FLP 和1％的切割水解产物。使用过量的HF吡啶可以轻松去除保护基团(TIPS)(图7)以生成FLP-OH。此外，如表5和图8-图10所示，FLP-OH的生成和延长至碱性条件的处理可导致不同水平的链切割。
表5.
Figure BDA0003765811440000311
*来自表3的RNA序列。**X＝在3’或2’上的保护基团(TBS、 TOM、TIPS)；n.d.＝未检测到
出于描述和披露的目的，所标识的所有专利、专利申请和出版物都明确地通过引用并入本文，例如可能与本发明结合使用的此类出版物中描述的方法。仅提供这些出版物在本申请的提交日期之前的披露内容。这方面的任何内容都不应被解释为承认发明人由于在先发明或任何其他原因而无权优先于此类披露内容。所有关于这些文件日期的声明或关于这些文件内容的陈述都是基于申请人可获得的信息，并不构成对这些文件的日期或内容的正确性的承认。
可以根据以上详细说明对这些实施例作出这些以及其他改变。通常，在以下权利要求中，使用的术语不应该被解释为将权利要求限制为在本说明书中披露的具体实施例而应该将这些权利要求解释为包括所有可能的实施例连同这样的权利要求所要求的等效物的全部范围。因此，权利要求书不被该披露所限制。

Claims (30)

1.一种用于合成具有至少一个带有3’-OH基团的核苷的寡核苷酸的方法，该方法包括：
(i)将核苷或寡核苷酸上的游离羟基基团与具有三异丙基甲硅烷基醚(TIPS)保护的3’-羟基基团的核苷亚磷酰胺单体偶联，以形成亚磷酸三酯中间体；以及
(ii)氧化或硫化所述亚磷酸三酯中间体以形成受保护的中间体。
2.如权利要求1所述的方法，其中所有合成步骤在自动寡核苷酸合成仪上进行。
3.如权利要求1所述的方法，其中寡核苷酸是以大规模合成的。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述氧化在弱碱存在下进行。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述弱碱是吡啶、二甲基吡啶、甲基吡啶或三甲吡啶。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述氧化在I2/H2O存在下进行。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述硫化在硫转移试剂存在下进行。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述硫转移试剂是3-(二甲基氨基亚甲基)氨基-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT)或3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物。
9.如权利要求1所述的方法，该方法进一步包括用碱使该受保护的中间体脱保护的步骤。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述碱是氢氧化铵、甲胺或氢氧化铵和甲胺的混合物。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述用碱处理是在室温或提升的温度下进行。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述用碱处理是在30℃或更高的温度下进行。
13.如权利要求9所述的方法，其中所述用碱处理持续至少30分钟。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述用碱处理持续至少4小时。
15.如权利要求9所述的方法，该方法进一步包括用脱保护试剂处理经碱处理的中间体，该脱保护试剂可有效地将该TIPS保护的羟基基团转化为游离羟基基团。
16.如权利要求15所述的方法，其中该脱保护试剂包含氟阴离子。
17.如权利要求15所述的方法，其中该脱保护试剂是HF吡啶。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述用脱保护试剂处理是在30℃或更高的温度下进行。
19.如权利要求1所述的方法，其中该寡核苷酸包含约6至约50个核苷酸。
20.如权利要求10所述的方法，其中该寡核苷酸包含约10至约30个核苷酸。
21.一种具有式(I)结构的核苷单体：
Figure FDA0003765811430000031
其中：
B是经修饰的或未经修饰的核碱基；
R1是羟基保护基团；
R2是-Si(R4)3；
R3是H或-P(NR5R6)OR7；
每个R4独立地为任选地被取代的烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、环烷基、烯基、环烯基、炔基或环炔基；
R5和R6独立地为任选地被取代的烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、环烷基、烯基、环烯基、炔基或环炔基，或其中将R5和R6连接以形成杂环基；并且
R7为任选地被取代的烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、环烷基、烯基、环烯基、炔基或环炔基。
22.如权利要求21所述的核苷单体，其中该羟基保护基团选自由以下组成的组：4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)、单甲氧基三苯甲基(MMT)、9-芴基甲基碳酸酯(Fmoc)、邻硝基苯基羰基、对苯基偶氮苯基羰基、苯基羰基、对氯苯基羰基和5′-(α-甲基-2-硝基胡椒基)氧基羰基(MeNPOC)。
23.如权利要求21所述的核苷单体，其中每个R4独立地是任选地被取代的C1-C6烷基。
24.如权利要求21所述的核苷单体，其中每个R4是异丙基。
25.如权利要求21所述的核苷单体，其中R5和R6独立地是任选地被取代的C1-C6烷基。
26.如权利要求21所述的核苷单体，其中R5和R6是异丙基。
27.如权利要求6所述的核苷单体，其中R7是任选地被取代的C1-C6烷基。
28.如权利要求21所述的核苷单体，其中R7是甲基或β-氰乙基。
29.如权利要求6所述的核苷单体，其中B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶；R1是单甲氧基三苯甲基或二甲氧基三苯甲基；R4独立地是任选地被取代的C1-C6烷基；R5和R6独立地是任选地被取代的C1-C6烷基或R5和R5连接以形成4-8元杂环基；并且R7是任选地被取代的C1-C6烷基。
30.如权利要求29所述的核苷单体，其中B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶；R1是二甲氧基三苯甲基；R4、R5和R6是异丙基；
并且R7是β-氰乙基。
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